ES2943149T3 - Procedimiento para el sexado in ovo de pollitos - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a un método para la identificación sexual in ovo de pollitos, que comprende los siguientes pasos: extraer una solución de muestra de líquido alantoideo de un huevo; unir la solución de muestra extraída del huevo con un anticuerpo específico de derivado de estrona y una solución conjugada con un conjugado que se une al anticuerpo; e identificar la concentración de derivado de estrona del fluido alantoideo extraído por medio del conjugado unido al anticuerpo. Para acelerar la identificación de la concentración del derivado de estrona, el anticuerpo específico del derivado de estrona se une a la superficie. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para el sexado in ovo de pollitos
La presente invención se refiere a un procedimiento para el sexado in ovo de pollitos. Un procedimiento genérico se conoce, por ejemplo, por la tesis doctoral de la Dra. Anne Weissmann, Universidad de Leipzig, del año 2014, titulada "in-ovo-Geschlechterbestimmung bei Legehybriden mittels endokriner Analyse der Allantoisflüssigkeit". A. WEISSMANN ET AL: "Sexing domestic chicken before hatch: A new method for in ovo gender identification", THERIOGENOLOGY, vol. 80, n.° 3, agosto de 2013 (08/2013), páginas 199-205, divulga también un procedimiento genérico de este tipo.
Aproximadamente 40 millones de pollitos macho de un día de vida son sacrificados cada año en Alemania, ya que la producción de gallinas ponedoras es el único objetivo de los híbridos ponedores y, por lo tanto, los pollitos machos no tienen más utilidad.
La tesis doctoral descrita anteriormente de Anne Weissmann propone determinar el sexo correspondiente de los pollitos en desarrollo en el huevo respectivo por medio de la concentración de sulfato de estrona en la orina embrionaria.
Para ello, sin dañar ni destruir el huevo, se extraen aproximadamente 50 pl de líquido alantoideo del huevo entre el día 7 y 10 de incubación utilizando una jeringa de 1 ml (jeringa de insulina: Omnican 40; B. Braun, Melsungen, Alemania) y se determina la concentración de sulfato de estrona contenida en el líquido alantoideo.
Por medio de la concentración de sulfato de estrona determinada de este modo, se puede deducir el sexo del pollito en el huevo y el huevo, dado el caso, en la medida en que la concentración de sulfato de estrona indique que se trata de un pollito macho, puede eliminarse antes de que el pollito comience a sentir dolor, aproximadamente en el día 11. La tesis doctoral demostró que se forman concentraciones de sulfato de estrona significativamente diferentes en los huevos a partir del día 9 de incubación y, en particular también el día 10 de incubación cuando en ellos hay un pollito embrionario hembra o macho.
Esto se representa en la figura 1, que se ha extraído de la tesis doctoral descrita anteriormente.
En la figura 1, las barras correspondientes en los diagramas muestran las concentraciones medidas de sulfato de estrona en huevos con embriones hembra (barras gris claro) así como las concentraciones de sulfato de estrona en huevos con embriones macho (barras gris oscuro).
En el día 9, la concentración promedio de sulfato de estrona en embriones macho se encuentra entre 0,125 (mediana) y en embriones hembra es de 0,169 ng/ml.
En el día 10 de incubación, la concentración promedio de sulfato de estrona en embriones macho se encuentra entre 0,193 (mediana) y en embriones hembra es de 0,667 ng/ml. Las tolerancias de error correspondientes también están marcadas en la figura 1.
El procedimiento descrito en la tesis doctoral se explica a continuación.
La detección de la concentración de sulfato de estrona se basa en el denominado inmunoensayo enzimático (ELISA) a través de la técnica de doble anticuerpo con el uso de placas de 96 pocillos.
A este respecto, las placas de microtitulación (placas de 96 pocillos) se recubren con 100 pl de anticuerpo no específico de sulfato de estrona (IgG de cabra anti-conejo). Este líquido se incuba durante la noche y a continuación se lava la placa de microtitulación.
Después tiene lugar el análisis real del medio (alantoides).
Este ELISA se basa en la técnica de doble anticuerpo; a este respecto un complejo de sulfato de estrona-anticuerpo marcado con enzima (el producto de reacción es sulfato de estrona del medio que se va a determinar (por ejemplo, alantoides), al que se une el anticuerpo específico de sulfato de estrona y entonces la enzima) reacciona con un anticuerpo no específico de sulfato de estrona unido a una superficie (por ejemplo, el fondo de la placa de titulación). A este respecto, el anticuerpo no específico de sulfato de estrona es una IgG de cabra anti-conejo.
El líquido alantoideo extraído se diluye con un tampón y se mezcla con una solución enzimática y una solución con un anticuerpo específico de sulfato de estrona (E1S).
Como anticuerpo específico de sulfato de estrona se usa anti-glucurónido de estrona.
Como enzima se usa glucurónido de estrona-peroxidasa, que se une al anticuerpo específico de sulfato de estrona. El sulfato de estrona en el medio que se va a determinar (por ejemplo, alantoides) se une asimismo al anticuerpo específico de sulfato de estrona al que está unida la enzima.
Después de la reacción en la superficie (de las placas de microtitulación), se enjuaga. Esto garantiza que únicamente permanezca el sulfato de estrona (marcado con enzima) unido a anticuerpos de la muestra y de la solución estándar, porque está unido a la superficie.
La enzima usada es capaz de activar una reacción cromática. A continuación, la intensidad de la coloración se puede utilizar para determinar la concentración de sulfato de estrona en el líquido alantoideo extraído mediante una medición de extinción en un fotómetro.
La intensidad de la coloración está relacionada con concentraciones conocidas (= curva estándar).
Los puntos de la curva estándar se encuentran entre 0,0125 y 5,0 ng/ml.
La solución enzimática añadida a la muestra (por ejemplo, alantoides) que contiene el sulfato de estrona y el anticuerpo específico de sulfato de estrona (E1S) presenta una concentración de 1:100.000.
Durante el tiempo de reacción de 3 horas, el producto de reacción (complejo de sulfato de estrona marcado con enzima-anticuerpo) se une al anticuerpo no específico de hormona unido a la superficie.
El procedimiento descrito anteriormente para la determinación de sulfato de estrona en el líquido alantoideo funciona utilizando tecnología de doble anticuerpo y los resultados finales, si se trata de un embrión macho o hembra, están disponibles después de 4 horas.
La solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona (E1S) que se añade a la muestra que contiene sulfato de estrona y a la solución enzimática presenta una concentración de 1:125.000.
El procedimiento descrito anteriormente es bastante complejo y lleva bastante tiempo, hasta que finalmente se puedan determinar las concentraciones de sulfato de estrona correspondientemente altas en el líquido alantoideo extraído.
Con ello, el procedimiento no es aplicable de forma rutinaria para uso industrial a gran escala, donde se requiere un alto rendimiento y un análisis rápido de una gran cantidad de huevos.
Por consiguiente, es objetivo de la presente invención mejorar el procedimiento antes mencionado para que pueda aplicarse a gran escala.
La invención propone para ello un procedimiento con las características de la reivindicación 1.
Este procedimiento perfecciona el procedimiento previamente descrito conocido por la tesis doctoral en el sentido de que el anticuerpo específico de derivado de estrona está unido a la superficie. En consecuencia, existe un denominado recubrimiento directo con el anticuerpo específico de hormona. Por lo tanto, la denominada técnica de doble anticuerpo descrita anteriormente para el estado de la técnica tampoco puede usarse necesariamente. Dado que el anticuerpo específico de derivado de estrona no reacciona en primer lugar en solución con el derivado de estrona, sino que ya se presenta unido a una superficie, el procedimiento para determinar la concentración de derivados de estrona puede acelerarse significativamente. Sorprendentemente, los experimentos han demostrado que es posible unir el anticuerpo específico de derivado de estrona a una superficie. En total, la determinación de la concentración de derivado de estrona se puede llevar a cabo en un máximo de 2 horas.
La determinación de la concentración de derivado de estrona se describe en general a continuación. Un ejemplo de un derivado de estrona específico es el sulfato de estrona. La determinación de la concentración de sulfato de estrona se describe específicamente como ejemplo de la determinación de la concentración de un derivado de estrona específico. Cualquier producto de degradación de estrona o la propia estrona puede usarse como derivado de estrona. Al determinar la concentración de derivado de estrona, se puede hacer una distinción entre embriones macho y hembra. Un anticuerpo específico de derivado de estrona es suficiente para unir el derivado de estrona. Si se utiliza como ejemplo la determinación de la concentración de sulfato de estrona, puede usarse como anticuerpo un anticuerpo específico de estrona.
Además de los anticuerpos específicos estándar (no modificados), también se entiende por anticuerpos específicos los denominados conjugados de anticuerpo específicos. Dichos conjugados de anticuerpo presentan una modificación en comparación con los anticuerpos específicos estándar (no modificados), a través de la cual, por ejemplo, se puede unir o conjugar otro grupo (un conjugado). Sin embargo, estos conjugados de anticuerpo específicos siguen siendo específicos para el derivado de estrona correspondiente. En consecuencia, el término se entiende funcionalmente y no excluye modificaciones adicionales. Se pueden usar anticuerpos monoclonales o policlonales como anticuerpos.
Pueden obtenerse anticuerpos policlonales en diferentes especies animales (conejo, cabra u oveja) contra el correspondiente sulfato de estrona o sus derivados. La técnica del hibridoma en conejos o roedores se usa para crear los anticuerpos monoclonales.
Se entiende por conjugado en el presente caso un grupo que se une al anticuerpo (modificado o no modificado) además del derivado específico para el que el anticuerpo es específico. Una unión de este tipo se puede unir, por ejemplo, a través de puentes por medio de glucurónido, también son posibles otros enlazadores. Este conjugado puede tener un color diferente, catalizar una reacción de color de forma diferente o formar un complejo con un color diferente, dependiendo de si un derivado de estrona adicionalmente está unido a este anticuerpo. Esto puede usarse, por ejemplo, para determinar la concentración del derivado de estrona. La coloración únicamente ha de entenderse como un ejemplo. Es suficiente que la concentración del derivado de estrona se pueda determinar con la ayuda del conjugado. También puede hacerse mediante análisis de vídeo, que detecta un cambio de estado. Dependiendo del derivado de la estrona unido al anticuerpo, el conjugado o el complejo total de conjugado, anticuerpo y derivado de la estrona puede presentar una actividad diferente. Esto permite determinar la concentración correspondiente de derivado de estrona.
De acuerdo con la invención, el anticuerpo específico de derivado de estrona se encuentra unido directamente a una superficie. El anticuerpo específico de derivado de estrona se une directamente a una superficie. De este modo, a diferencia del estado de la técnica, no se interpone ningún anticuerpo inespecífico entre la superficie y el anticuerpo específico.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, el conjugado puede contener un marcador coloidal. Dicho marcador coloidal puede ser oro coloidal, látex coloidal u otra sustancia coloidal. Este marcador coloidal puede formar el propio conjugado o solo puede ser parte del conjugado. Cuando se usa oro como marcador coloidal, se habla de conjugación de inmunooro. Debido a la coloración intensa del oro coloidal por un lado y las propiedades de unión específicas de los anticuerpos por otro lado, los conjugados de oro-anticuerpo se pueden usar para determinar la concentración de derivado de estrona. Los conjugados de oro (el anticuerpo al que está conjugado directa o indirectamente el oro coloidal) presentan una estabilidad adecuada, dado que la unión entre proteína y partículas de oro es relativamente fuerte. Por lo tanto, se logra una mayor sensibilidad. También pueden usarse conjugados de látex que contengan coloides de látex o que sean un coloide de látex, dado que la etiqueta puede hacerse prácticamente a medida. Las partículas de látex se pueden producir en cualquier color.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso según la reivindicación 3, el conjugado puede seleccionarse del siguiente grupo de compuestos: compuesto de esteroide-proteína marcado con oro, oro coloidal, compuesto de esteroide-proteína de marcado con látex, látex coloidal. Compuestos de esteroide-proteína son, por ejemplo, enzimas o enzimas modificadas. Las enzimas están, por ejemplo, químicamente modificadas de tal manera que el marcador coloidal puede unirse mejor a ellas. Sin embargo, también es concebible cualquier otra modificación. Ejemplos de compuestos de esteroide-proteína son: estrona-glucurónido peroxidasa, estrona-carboximetil-oxima, estronacarboximetil-éter.
Este conjugado puede unirse entonces al anticuerpo. Estos conjugados se encuentran, por ejemplo, en disolución. Las mezclas coloidales también se denominan soluciones en este contexto.
De acuerdo con la invención, la superficie que se va a recubrir con el anticuerpo específico de derivado de estrona es una superficie de vidrio, fibra de vidrio, papel o polipropileno.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, el anticuerpo específico de derivado de estrona puede ser un anticuerpo específico de sulfato de estrona para determinar la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoideo extraído. Como se describió previamente, esta variante es un subgrupo del anticuerpo específico de derivado de estrona. Como lo siguiente se refiere al anticuerpo específico de sulfato de estrona, esto también se aplica en general al anticuerpo específico de derivado de estrona (en forma modificada o no modificada para la conjugación con el conjugado) y/o también no solo al sulfato de estrona sino a cualquier derivado de estrona.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, la solución de conjugado puede ser una solución enzimática con una enzima, que es capaz de activar un colorante añadido y que la determinación de la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoideo extraído se lleva a cabo por medio de determinación fotométrica de la concentración del colorante activado por medio de la enzima.
Como se describió previamente, esta variante en la que se usa una enzima como conjugado es un subgrupo de la forma general del conjugado. También se puede unir a la enzima un marcador coloidal. En la medida en que a continuación se haga referencia a la "enzima" en relación con las reivindicaciones dependientes, también puede usarse cualquier otro conjugado. Las concentraciones o ventajas también se aplican en forma general para los conjugados usados.
El anticuerpo específico de sulfato de estrona también está unido a la superficie. En consecuencia, existe un denominado recubrimiento directo con el anticuerpo específico de hormona. Por lo tanto, no es necesario usar la denominada técnica de doble anticuerpo descrita anteriormente para el estado de la técnica. Debido al hecho de que el anticuerpo específico de sulfato de estrona no reacciona en primer lugar en disolución con el sulfato de estrona, sino que ya se presenta unido a una superficie, el procedimiento para determinar la concentración de sulfato de estrona puede acelerarse significativamente. Sorprendentemente, los experimentos han demostrado que es posible unir el anticuerpo específico de sulfato de estrona a una superficie. En total, la determinación de la concentración de sulfato de estrona se puede llevar a cabo en un máximo de 2 horas.
A continuación, con respecto a los perfeccionamientos, se describe la variante en la que el derivado de estrona es sulfato de estrona, y por consiguiente el anticuerpo es un anticuerpo específico de sulfato de estrona; en donde se usa una enzima como conjugado, que es capaz de activar un colorante añadido y que la determinación de la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoideo extraído se lleva a cabo por medio de determinación fotométrica de la concentración del colorante activado por medio de la enzima.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, la solución de muestra de líquido alantoideo y la solución enzimática que presenta una dilución de entre 1:60.000 y 1:90.000, se añaden al anticuerpo específico de sulfato de estrona unido a la superficie.
Debido a la menor dilución (mayor concentración) de la solución enzimática en el recubrimiento directo en comparación con el estado de la técnica antes mencionado (técnica de doble anticuerpo), se ha demostrado que cuando la solución de muestra (líquido alantoideo), y la solución enzimática se ponen en contacto con la superficie recubierta con el anticuerpo específico de sulfato de estrona, tiene lugar una reacción más rápida y, por lo tanto, más eficaz entre enzima o sulfato de estrona de la muestra y el anticuerpo específico de hormona.
Como anticuerpo específico de sulfato de estrona se usa preferentemente -glucurónido de estrona. Para la inmunización (producción de anticuerpos), se acopla preferentemente una molécula portadora BSA (albúmina bovina) a la estrona por medio de glucurónido. Por consiguiente, el anticuerpo específico de sulfato de estrona se produce preferentemente contra el glucurónido de estrona.
Como enzima se usa preferentemente glucurónido de estrona peroxidasa. Los intervalos preferidos de dilución de la solución enzimática pueden estar entre 1:70.000 y 1:80.000, en particular aproximadamente 1:75.000 /- 1.000. En la medida en que se utilice una dilución de la solución enzimática, esta dilución se puede realizar con agua (preferentemente desmineralizada) o con una solución tampón.
De acuerdo con un perfeccionamiento no de acuerdo con la invención, se pueden extraer del huevo de 2 pl a 50 pl de líquido alantoideo. Otro intervalo de cantidades no de acuerdo con a la invención es de 5 pl a 20 pl.
Sorprendentemente, se ha demostrado que las diferentes concentraciones de sulfato de estrona pueden determinarse de forma fiable incluso con una cantidad de extracción inferior en comparación con el estado de la técnica.
Cuanto menor era la cantidad de líquido alantoideo extraída (por ejemplo, < 50 pl), menor o nulo era el deterioro observado en la tasa de eclosión en comparación con los huevos de los que no se tomaron muestras.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso según la reivindicación 10, el líquido alantoideo extraído del huevo se puede reunir sin diluir con el anticuerpo específico de sulfato de estrona y la enzima.
Las muestras (alantoides) se utilizan sin diluir en el método de recubrimiento directo correspondientemente a la invención. Por lo tanto, el líquido alantoideo puede utilizarse esencialmente tal y como se extrae del huevo. En esencia, tal como está no excluye la filtración mecánica. Preferentemente, sin embargo, también se omite dicha filtración, dado que se ha comprobado notablemente que incluso una muestra sin filtrar y sin diluir no afecta negativamente a la reacción posterior.
Este líquido alantoideo sin diluir se puede aplicar entonces a la superficie recubierta junto con la enzima.
De acuerdo con un perfeccionamiento no de acuerdo con la invención, se pueden combinar entre 2 pl y 50 pl de solución de muestra y entre 30 pl y 70 pl de solución enzimática. Otros valores están entre 5 pl y 20 pl, en particular 50 pl. Preferentemente, se mezclan cantidades iguales de solución de muestra y solución enzimática y se ponen en contacto con la superficie recubierta.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso según la reivindicación 12, se añade sobre la superficie que se va a recubrir una solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona en una dilución de 1:90.000 a 1:150.000.
Los intervalos preferidos de dilución del anticuerpo específico de sulfato de estrona pueden estar entre 1:100.000 y 1:130.000, en particular aproximadamente 1:125.000 /- 1.000.
Para que el anticuerpo específico de sulfato de estrona se inmovilice sobre la superficie, la concentración, en comparación con el estado de la técnica, será significativamente mayor que cuando la solución de anticuerpo se usa únicamente para una reacción in situ.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, para recubrir la superficie con el anticuerpo específico de sulfato de estrona, la solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona puede actuar durante 4 a 14 horas sobre la superficie que se va a recubrir. Se ha demostrado que se pueden conseguir los mejores resultados de inmovilización cuando la solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona actúa durante 8 a 13 horas sobre la superficie. A continuación de este recubrimiento, se puede llevar a cabo preferentemente un post-recubrimiento con una solución de BSA al 0,1 % (albúmina de suero bovino). Esto se puede llevar a cabo de la siguiente manera, en particular si la superficie que se va a recubrir es una placa de microtitulación: 280 pl /- 50 pl de solución de BSA (fracción V, de la compañía Serva) se incuban durante aproximadamente 30 minutos por cavidad, luego vaciado.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, después de la acción de la solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona y dado el caso BSA, la superficie recubierta se lava únicamente una vez con solución de polisorbato 80. Si la superficie que se va a recubrir es la cavidad de una placa de microtitulación, es suficiente un único enjuague con aproximadamente 300 pl por cavidad de la placa de microtitulación. Se puede llevar a cabo un lavado con una cantidad de 50 pl a 300 pl.
El polisorbato 80 es un compuesto polioxietilado derivado del sorbitol y del ácido oleico. El polisorbato 80 también se conoce con el nombre TWEEN 80.
Se ha demostrado que, tras un único lavado, puede eliminarse esencialmente todo el anticuerpo específico de sulfato de estrona no inmovilizado y, además, sigue estando presente suficiente anticuerpo específico de sulfato de estrona en forma inmovilizada y no se ha lavado.
De acuerdo con la invención, la superficie que se va a recubrir puede ser una cavidad de una microplaca de ensayo o un velo.
Tales microplacas de ensayo son generalmente conocidas y presentan una pluralidad de cavidades (también llamadas pocillos, en las que se pueden mezclar la solución de muestra y la solución enzimática.
Estas cavidades sirven como microrreactores en la determinación. Pueden usarse preferentemente microplacas de ensayo de 96 pocillos, de 384 pocillos (de la compañía nunc).
Alternativamente, en lugar de usar tales cavidades, también se puede usar un velo que entonces se puede instalar en un casete de ensayo.
Tal procedimiento es una modificación de la técnica conocida como técnica de flujo lateral.
De acuerdo con la invención la solución de muestra y la solución enzimática se pueden añadir a la cavidad recubierta de la microplaca de ensayo y la mezcla de reacción verterse después de la reacción.
Las cavidades recubiertas con anticuerpos específicos de sulfato de estrona preferentemente se mezclan directamente con las cantidades correspondientes de solución de muestra y solución enzimática.
Se ha demostrado que las microplacas de ensayo con las cavidades recubiertas pueden incluso almacenarse durante meses a temperaturas inferiores a -17 °C, en particular a aproximadamente de -17 a -23 °C, sin cambiar desfavorablemente con respecto a la reacción posterior con el sulfato de estrona.
Por lo tanto, por primera vez es posible preparar las microplacas de ensayo con las cavidades recubiertas mucho antes de la determinación.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, después de una reacción entre anticuerpos específicos de sulfato de estrona, sulfato de estrona en la muestra y enzima, el producto de reacción inmovilizado generado se puede lavar únicamente dos veces con polisorbato 80.
Se ha demostrado que lavar dos veces es suficiente para eliminar cualquier molécula no deseada que no esté unida al anticuerpo específico de sulfato de estrona, de modo que la concentración del sulfato de estrona combinado se puede determinar con mucha precisión. Si la superficie que se va a recubrir es la cavidad de una placa de microtitulación, son suficientes dos enjuagues con hasta 300 pl, en particular 300 pl por cavidad de la placa de microtitulación.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso el producto de reacción inmovilizado lavado se puede reunir con una solución que contiene un colorante activable por medio de la enzima, y la concentración de colorante determinarse fotométricamente después de un tiempo predeterminado.
Un colorante de este tipo, que puede ser activado por medio de la enzima unida, se puede hacer de la siguiente manera. Una sustancia A de H2 O2 -urea/Na2 -HPO4/ácido cítrico se mezcla con una sustancia B de tetrametilbencidina/DMSO/ácido cítrico, respectivamente en partes iguales, se añade a la superficie recubierta, en particular la cavidad. La enzima cataliza una reacción cromática que se puede utilizar para sacar conclusiones sobre la concentración de enzima y, por lo tanto, indirectamente sobre la concentración de sulfato de estrona.
La concentración de colorante relativa se puede determinar con referencia a los puntos estándar (0,125 - 1,0 ng/ml) usando métodos fotométricos.
Los puntos estándar (soluciones de muestras de referencia) se preparan con concentraciones conocidas de sulfato de estrona (0,125 -1,0 ng/ml), que reaccionan de la misma manera que el líquido alantoideo extraído con la enzima y el anticuerpo específico de sulfato de estrona inmovilizado. Se crea una curva de calibración a partir de los datos fotométricos medidos (absorción). Los datos fotométricos (absorción) medidos para la muestra que se va a examinar se comparan con la curva de calibración para determinar la concentración del sulfato de estrona.
La determinación fotométrica procede preferentemente de la siguiente manera:
La enzima (por ejemplo, glucurónido de estrona peroxidasa) de la solución enzimática se une al anticuerpo unido a la superficie.
La enzima unida al anticuerpo da la lectura de absorbancia más alta en el fotómetro después de la reacción cromática cuando no hay sulfato de estrona (de la serie de calibración o de la muestra de alantoides) unido al anticuerpo. A medida que aumenta la concentración de sulfato de estrona, se une menos enzima al anticuerpo unido a la superficie, por lo que la extinción disminuye en la posterior reacción cromática.
A partir de esto, se puede determinar la concentración de sulfato de estrona, preferentemente por medio de una evaluación por ordenador.
En consecuencia, la coloración (extinción medida) es inversamente proporcional a la curva de calibración.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, se puede llevar a cabo la medición fotométrica de la reacción cromática para la determinación de la concentración de colorante en la cavidad de la microplaca de ensayo.
Esto puede acelerar aún más el procedimiento.
De acuerdo con un perfeccionamiento ventajoso, la microplaca de ensayo puede contener una pluralidad de cavidades y el líquido alantoide extraído de diferentes huevos se puede añadir a diferentes cavidades, y determinarse de manera automatizada la concentración de sulfato de estrona en los distintos huevos, teniendo lugar de manera automatizada la medición fotométrica en las diferentes cavidades y/o teniendo lugar de manera automatizada la etapa de combinar enzima, solución de muestra en la cavidad recubierta.
Esto puede acelerar aún más el procedimiento.
En los perfeccionamientos adicionales, se describe la variante general del procedimiento que ya se ha explicado con más detalle. Las concentraciones correspondientes y el control de procedimiento pueden ser ligeramente diferentes en comparación con la variante especial. Esta variante no se limita a una determinación fotométrica, sino que se puede usar cualquier procedimiento con el que se puede deducir la concentración del derivado de estrona con la ayuda del conjugado. También es concebible un método en el que se usa una cámara de vídeo para determinar las propiedades dependientes de la concentración.
Perfeccionamientos ventajosos de la invención resultan de los ejemplos discutidos a continuación en combinación con el dibujo.
En este muestran
la figura 1 concentraciones medidas conocidas por el estado de la técnica de sulfato de estrona en huevos con embriones hembra así como las concentraciones de sulfato de estrona en huevos con embriones macho,
la figura 2 una ilustración esquemática de una envoltura embrionaria de un pollo en el día 10 a 11 de incubación,
la figura 3 la extracción del líquido alantoideo por medio de una jeringa de insulina, y
la figura 4 una curva de calibración para determinar el contenido de sulfato de estrona de acuerdo con la presente invención.
La figura 2 muestra una envoltura embrionaria de un pollo en el día 10 a 11 de incubación.
El huevo representado esquemáticamente en su vista transversal presenta una cáscara calcárea 1 con una piel de cáscara, dentro de la cáscara calcárea 1 se encierra una cámara de aire 2 y clara de huevo 3.
El llamado corion 4 se almacena en la clara de huevo, en el que se aloja el pollito embrionario 5 y el alantoides 6. Los productos metabólicos del embrión se excretan principalmente en forma de urea amónica y ácido úrico. Otro producto de degradación es el sulfato de estrona descrito anteriormente. Incluso si la concentración de sulfato de estrona se determina en el estado de la técnica, cualquier producto de degradación de estrona o la propia estrona puede utilizarse para diferenciar entre embriones macho y hembra. Por lo tanto, la reivindicación 1 define únicamente un anticuerpo específico de derivado de estrona. Por lo tanto, el procedimiento de acuerdo con la invención también se describe en general para derivados de estrona.
A continuación, únicamente se describe la variante como un ejemplo especial, en el que el derivado de estrona es sulfato de estrona, y por consiguiente el anticuerpo es un anticuerpo específico de sulfato de estrona; en donde se usa una enzima como conjugado, que es capaz de activar un colorante añadido y que la determinación de la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoideo extraído se lleva a cabo por medio de determinación fotométrica de la concentración del colorante activado por medio de la enzima.
Sin embargo, esta descripción también se aplica a cualquier derivado de estrona, o cualquier conjugado, y puede usarse cualquier procedimiento para determinar la concentración de derivado de estrona. No es imprescindible una medición fotométrica.
En la figura 3 se representa un huevo, en el que se ha insertado una jeringa de insulina 7 en una posición tal que se puede extraer el líquido correspondiente del alantoides.
A continuación se describen ejemplos de cada componente.
Preparación de la solución de prueba
En un ejemplo, que no es parte de la invención, se extraen por medio de una jeringa de 2 pl a 50 pl, o de 5 pl a 20 pl de muestra de líquido alantoideo del huevo.
El líquido alantoideo extraído se usa sin diluir y, por lo tanto, forma la solución de muestra que se lleva a la superficie recubierta con la solución enzimática.
Preparación de la solución enzimática
En el presente caso, se usó como enzima glucurónido de estrona peroxidasa.
El sulfato de estrona en la muestra se une al anticuerpo específico de sulfato de estrona al que también se une la enzima.
Los intervalos preferidos de dilución de la solución enzimática pueden estar entre 1:60.000 y 1:90.000, preferentemente entre 1:70.000 y 1:80.000, en particular aproximadamente 1:75.000 /- 1.000.
La enzima se diluyó con tampón.
La solución tampón contenía 7,12 g de hidrogenofosfato de sodio (Merck Alemania), 8,5 g de cloruro de sodio (Merck, Alemania), 1,0 g de albúmina de suero bovino (Serva, Alemania) y 1000 ml de agua. La solución tampón presentaba un valor de pH de 7,2.
Recubrimiento de superficie/almacenamiento
Una solución de anticuerpo específico de sulfato de estrona se puede añadir a una dilución de 1:90.000 a 1:150.000, preferentemente entre 1:100.000 y 1:130.000, en particular 1:125.000 /-1.000 sobre la superficie que se va a recubrir. Como anticuerpo específico de sulfato de estrona se puede usar preferentemente anti-glucurónido de estrona, es decir, el anticuerpo está dirigido contra el glucurónido de estrona(-BSA) y se obtuvo en conejos.
La superficie que se va a recubrir era una cavidad de una microplaca de ensayo. Pueden usarse preferentemente microplacas de ensayo de 96 pocillos, de 384 pocillos (de la compañía nunc).
Como alternativa a las microplacas de ensayo, también se puede utilizar un velo al que se une el anticuerpo específico de sulfato de estrona, y las soluciones se pueden añadir sobre el velo en casetes. A este respecto se trata de una modificación de la técnica conocida como ensayo de flujo lateral, que representa un sistema de ensayo competitivo. La superficie que se va a recubrir puede ser una superficie de vidrio, fibra de vidrio, papel o polipropileno.
En este caso, las soluciones se aplican en superficies de vidrio, fibra de vidrio, papel-polipropileno o velo para iniciar la reacción. Con este sistema, no es necesario un proceso de lavado como el que se describe a continuación. Tras la adición de la solución marcadora, se produce un cambio de color que se documenta. Entre 50 pl y 150 pl, en particular una solución de 100 pl del anticuerpo específico de sulfato de estrona se añadió a cada cavidad y se dejó toda la noche a temperatura ambiente.
Después de esto, se vaciaron las cavidades de las microplacas de ensayo con entre 100 pl y 500 pl, en particular, 300 pl de tampón de ensayo agitado durante 30 minutos a 150 rpm.
Después, el tampón de ensayo se vació de la placa de microtitulación.
Las cavidades de las placas están ahora recubiertas con el anticuerpo específico de sulfato de estrona.
Estas placas se pueden almacenar sin daños a al menos -17 °C, en particular a aproximadamente de -17 a -23 °C, durante meses antes de su uso.
Reacción
La solución de muestra y la solución enzimática se añadieron a las cavidades recubiertas y se incubaron durante 75 minutos con agitación. Después de este tiempo, todo había reaccionado estequiométricamente y el sulfato de estrona estaba unido al anticuerpo específico de sulfato de estrona en la superficie. Se combinaron cantidades iguales de entre 2 pl y 50 pl de solución de muestra y entre 30 pl y 70 pl de solución enzimática en cada caso. Los valores de acuerdo con la invención están entre 5 pl y 15 pl.
Después de la reacción, la microplaca de ensayo se vació y se lavó 2 veces con solución de TWEEN 80.
Procedimiento para determinar la concentración de sulfato de estrona
El producto de reacción inmovilizado lavado se reunió con una solución que contiene un colorante activable por medio de la enzima, y la concentración de colorante se determinó fotométricamente después de un tiempo predeterminado. Un colorante de este tipo, que puede ser activado por medio de la enzima unida, se puede hacer de la siguiente manera.
Una sustancia A de H2 O2 -urea/Na2 -HPO4 /ácido cítrico se mezcla con una sustancia B de tetrametilbencidina/DMSO/ácido cítrico, respectivamente en partes iguales y se añade a la superficie recubierta. La enzima cataliza una reacción cromática que se puede utilizar para sacar conclusiones sobre la concentración de hormona y, por lo tanto, indirectamente sobre la concentración de sulfato de estrona.
La concentración relativa de colorante se puede determinar utilizando métodos fotométricos.
Las soluciones estándar se preparan con concentraciones conocidas de sulfato de estrona que reaccionan de la misma manera que el líquido alantoideo extraído con la enzima y el anticuerpo específico de sulfato de estrona inmovilizado. Se crea una curva de calibración a partir de los datos fotométricos medidos (absorción). Los datos fotométricos (absorción) medidos para la muestra que se va a examinar se comparan con la curva estándar para determinar la concentración del sulfato de estrona.
Para determinar la concentración de sulfato de estrona, se prepararon muestras de calibración a partir de cantidades conocidas de sulfato de estrona y se trataron de la misma manera que se describió anteriormente. A partir de los datos medidos para estas muestras de calibración, se obtuvo la curva de calibración mostrada en la figura 4.
Comparando los resultados de la medición fotométrica de las muestras con un contenido de sulfato de estrona desconocido con la curva de calibración, se puede deducir la concentración de sulfato de estrona en la muestra. Como espectrómetro se usó un contador multilabel Viktor 21420, los valores medidos se determinaron con el software "Workout" (Perkin Elmer).
Concentración de sulfato de estrona para determinar el sexo
Con el procedimiento descrito anteriormente, se pueden distinguir diferencias en la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoide a partir de 0,1 ng/ml, lo cual no es posible con el procedimiento previamente conocido.
En consecuencia, se puede llevar a cabo una determinación más precisa entre embriones hembra y macho.
Este hecho se muestra en las Tablas 1 y 2 siguientes para aclaración. En este sentido, la tabla 1 muestra las concentraciones de sulfato de estrona o estradiol, en las muestras de líquido alantoideo extraídas en diferentes periodos de incubación.
Tabla 1: Concentraciones de sulfato de estrona o estradiol en muestras de líquido alantoideo extraídas en diferentes periodos de incubación.
Figure imgf000010_0001
En la Tabla 1 anterior, mediana, P25 y P75, que son respectivos cuantiles entre P25 y P75, muestran el 50 % de los valores de la distribución medida.
Por ejemplo, la mediana de la concentración de sulfato de estrona en embriones macho en el día 7 de incubación asciende a 0,11 ng de sulfato de estrona por ml de muestra extraída. La mediana de la concentración de sulfato de estrona en embriones hembra femeninos en el día 7 de incubación asciende a 0,12 ng de sulfato de estrona por ml de muestra extraída.
Por ejemplo, la mediana de la concentración de sulfato de estrona en embriones macho en el día 9 de incubación asciende a 0,14 ng de sulfato de estrona por ml de muestra extraída. La mediana de la concentración de sulfato de estrona en embriones hembra femeninos en el día 8 de incubación asciende a 0,21 ng de sulfato de estrona por ml de muestra extraída.
En la tabla también se indican las concentraciones correspondientes para el estradiol.
La Tabla 2 muestra los valores límite de las concentraciones de sulfato de estrona que indican un embrión macho y un embrión hembra, respectivamente.
Tabla 2: Valores límite de las concentraciones de sulfato de estrona que indican un embrión macho y un embrión hembra, respectivamente.
Figure imgf000010_0002
La Tabla 2 anterior muestra las diferencias en la concentración de sulfato de estrona en función de los días de incubación.
En el día 7 de incubación, todavía no se puede determinar ninguna diferencia con el procedimiento de acuerdo con la invención.
En el día 8 de incubación, el valor límite para embriones macho asciende a 0,10 ng/ml o menos de sulfato de estrona en líquido alantoideo. En el caso de una concentración de más de 0,10 ng/ml de sulfato de estrona se trata de un embrión hembra.
Mediante el procedimiento de acuerdo con la invención, una diferencia en la concentración de sulfato de estrona puede detectarse incluso antes y la determinación también puede llevarse a cabo más rápidamente.
Lista de referencias
cáscara calcárea 1
cámara de aire 2
clara de huevo 3
corion 4
pollito embrionario 5
alantoides 6
jeringa de insulina 7

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para el sexado in ovo de pollitos que contiene las etapas:
extraer una solución de muestra de líquido alantoideo de un huevo;
reunir la solución de muestra extraída del huevo con un anticuerpo específico de derivado de estrona y una solución de conjugado con un conjugado que se une al anticuerpo; y
determinar la concentración de derivado de estrona del líquido alantoideo extraído con ayuda del conjugado unido al anticuerpo;
caracterizado por que
el anticuerpo específico de derivado de estrona se encuentra unido directamente a una superficie, en donde la superficie que se va a recubrir con el anticuerpo específico de derivado de estrona es una superficie de velo, vidrio, fibra de vidrio, papel o polipropileno o una cavidad de una microplaca de ensayo, en donde
se extraen entre 5 pl y 15 pl de solución de muestra del huevo y la solución de muestra se reúne sin diluir con el anticuerpo específico de derivado de estrona y la solución enzimática.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que el conjugado contiene un marcador coloidal; y/o por que el conjugado se selecciona del siguiente grupo de compuestos: compuesto de esteroide-proteína marcado con oro, oro coloidal, compuesto de esteroide-proteína marcado con látex, látex coloidal.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el anticuerpo específico de derivado de estrona es un anticuerpo específico de sulfato de estrona y se determina la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoideo extraído.
4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que la solución de conjugado es una solución enzimática, con una enzima, que es capaz de activar un colorante añadido, y por que la determinación de la concentración de sulfato de estrona del líquido alantoideo extraído se lleva a cabo por medio de determinación fotométrica de la concentración del colorante activado por medio de la enzima.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado por que la solución de muestra y la solución enzimática, que presenta una dilución de entre 1:60.000 y 1:90.000, se añaden al anticuerpo específico de sulfato de estrona unido a la superficie.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, caracterizado por que se añade sobre la superficie que se va a recubrir una solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona en una dilución de 1:90.000 a 1:150.000; y/o
por que para recubrir la superficie con el anticuerpo específico de sulfato de estrona, la solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona actúa durante 4 a 14 horas sobre la superficie que se va a recubrir; y/o
por que después de la acción de la solución del anticuerpo específico de sulfato de estrona, la superficie recubierta se lava únicamente una vez con solución de polisorbato 80.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado por que la solución de muestra y la solución enzimática se añaden a la cavidad recubierta de la microplaca de ensayo y la mezcla de reacción se vierte después de la reacción; y/o
por que después de la reacción entre anticuerpo específico de sulfato de estrona, sulfato de estrona y enzima, el producto de reacción inmovilizado generado se lava únicamente dos veces con polisorbato 80; y/o
por que el producto de reacción inmovilizado lavado se reúne con una solución que contiene un colorante activable por medio de la enzima, y la concentración de colorante se determina fotométricamente después de un tiempo predeterminado; y/o
por que se lleva a cabo la medición fotométrica de la reacción cromática para la determinación de la concentración de colorante en la cavidad de la microplaca de ensayo.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado por que la microplaca de ensayo contiene una pluralidad de cavidades, y la solución de muestra extraída de diferentes huevos se añade a diferentes cavidades, y se determina de manera automatizada la concentración de sulfato de estrona en los distintos huevos, teniendo lugar de manera automatizada la medición fotométrica en las diferentes cavidades y/o teniendo lugar de manera automatizada la etapa de combinar solución enzimática y solución de muestra en la cavidad recubierta.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que la solución de muestra y la solución de conjugado, que presenta una dilución de entre 1:20.000 y 1:100.000, se añaden al anticuerpo específico de derivado de estrona unido a la superficie.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2 así como según la reivindicación 9, caracterizado por que se añade sobre la superficie que se va a recubrir una solución del anticuerpo específico de derivado de estrona en una dilución de 1:90.000 a 1:150.000; y/o
por que para recubrir la superficie con el anticuerpo específico de derivado de estrona, la solución del anticuerpo específico de derivado de estrona actúa durante 4 a 14 horas sobre la superficie que se va a recubrir; y/o
por que después de la acción de la solución del anticuerpo específico de derivado de estrona, la superficie recubierta se lava únicamente una vez con solución de polisorbato 80.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores 4 a 8, caracterizado por que la solución de muestra y la solución enzimática se añaden a la cavidad recubierta de la microplaca de ensayo y la mezcla de reacción se vierte después de la reacción.
12. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado por que después de la reacción entre anticuerpo específico de sulfato de estrona, sulfato de estrona y enzima, el producto de reacción inmovilizado generado se lava únicamente dos veces con polisorbato 80.
13. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que después de un tiempo predeterminado se lleva a cabo una medición fotométrica para la determinación de la concentración de derivado de estrona.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado por que se lleva a cabo la medición fotométrica de la reacción cromática para la determinación de la concentración de colorante en la cavidad de la microplaca de ensayo.
15. Procedimiento según una de las reivindicaciones 14 o 15, caracterizado por que la microplaca de ensayo contiene una pluralidad de cavidades, y la solución de muestra extraída de diferentes huevos se añade a diferentes cavidades, y se determina de manera automatizada la concentración de derivado de estrona en los distintos huevos, teniendo lugar de manera automatizada la medición fotométrica en las diferentes cavidades y/o teniendo lugar de manera automatizada la etapa de combinar solución de conjugado y solución de muestra en la cavidad recubierta.
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