CN108603874A

CN108603874A - 用于鸡卵内性别鉴定的方法

Info

Publication number: CN108603874A
Application number: CN201680080473.4A
Authority: CN
Inventors: 阿尔穆特·艾因施帕尼尔
Original assignee: Olympic Co
Current assignee: Ovando LLC
Priority date: 2015-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2018-09-28
Also published as: IL260194B; ES2943149T3; CA3009282C; WO2017109133A1; EP3394610B1; DE102015226490A1; EP3394610A1; IL260194A; US20190011464A1; AU2016375020B2; CA3009282A1; PL3394610T3; AU2016375020A1

Abstract

本发明涉及一种用于鸡卵内性别鉴定的方法，包括以下步骤：从卵中抽取尿囊液的样品溶液；将从卵中抽取的样品溶液与雌酮衍生物特异性抗体和具有与抗体结合的缀合物的缀合物溶液合并；并通过与抗体结合的缀合物确定抽取的尿囊液的雌酮衍生物浓度。为了加速雌酮衍生物浓度的确定，雌酮衍生物特异性抗体是表面结合的。

Description

用于鸡卵内性别鉴定的方法

本发明涉及一种用于鸡卵内性别鉴定的方法。

例如，一种通用方法是从来自莱比锡大学的Anne Weissmann博士2014年题为“in-ovo sex identification in laying hybrids by endocrine analysis of theallantoic fluid”的论文中获知的。

目前，德国每年有约4000万只雄性日龄鸡被杀，因为只有产蛋母鸡的生产与产蛋杂交鸡处于前景中，因此，雄性鸡没有进一步的用途。

上述Anne Weissmann的论文表明，使用胚胎尿液中硫酸雌酮的浓度来鉴定对应卵中发育的鸡的相应性别。

为此，在不损坏或破坏卵的情况下，使用1mL注射器(胰岛素注射器：Omnican 40；B.Braun，Melsungen，Germany)在第7和第10个孵化日之间从卵中抽取大约50μL尿囊液并确定包含在尿囊液中的硫酸雌酮的浓度。

基于如此确定的硫酸雌酮浓度，然后可以鉴定卵中鸡的性别，并且如果合适的话，可以在约第11天鸡感觉到疼痛之前处理硫酸雌酮浓度达到指示雄鸡的程度的卵。

在该论文中，已经示出了从第9个孵化日开始，特别是在第10个孵化日，如果卵中包含雌性或雄性胚胎鸡，则在其中产生显著不同的硫酸雌酮浓度。

这在摘自前述论文的图1中显示。

在图1中，图中的相应条示出了测量的具有雌性胚胎的卵中硫酸雌酮的浓度(淡灰色条)，以及具有雄性胚胎的卵中硫酸雌酮的浓度(深灰色条)。

因此，在第9天，硫酸雌酮的平均浓度在雄性胚胎的0.125(中值)和雌性胚胎的0.169ng/mL之间。

在第10个孵化日，硫酸雌酮的平均浓度在雄性胚胎中的0.193(中值)和雌性胚胎中的0.667ng/mL之间。图1中还标出了相应的误差容限(error tolerance)。

下面解释在论文中描述的方法

硫酸雌酮浓度的检测基于通过使用96孔板的双抗体技术的所谓酶免疫测定(ELISA)。

微量滴定板(96孔板)包被100μL硫酸雌酮非特异性抗体(山羊抗兔IgG)。该流体经历过夜温育并且随后清洗微量滴定板。

之后，对介质(尿囊)进行实际分析。

所述ELISA基于双抗体技术；酶标记的硫酸雌酮抗体复合物(来自待鉴定的介质(例如尿囊)的硫酸雌酮与硫酸雌酮特异性抗体结合然后和酶结合的反应产物)与结合于表面(例如滴定板基板)的硫酸雌酮非特异性抗体反应。

硫酸雌酮非特异性抗体是山羊抗兔IgG。

用缓冲溶液稀释抽取的尿囊液，并与酶溶液和硫酸雌酮特异性抗体(E1S)溶液混合。

使用抗雌酮葡糖苷酸作为硫酸雌酮特异性抗体。

使用的酶是雌酮葡糖苷酸过氧化物酶，其与硫酸雌酮特异性抗体结合。待鉴定的介质(例如尿囊)中的硫酸雌酮也结合与酶结合的硫酸雌酮特异性抗体。

在表面(微量滴定板)上的反应结束之后，将其冲洗。这确保了只有来自样品和标准溶液的(酶标记的)抗体结合的硫酸雌酮被保留，因为其与表面结合。

所用的酶能够激活显色反应。然后通过光度计中的消光值测量能够使用染色强度来确定抽取的尿囊液中的硫酸雌酮浓度。

染色强度与已知浓度(＝标准曲线)相关。

标准曲线的点在0.0125和5.0ng/mL之间。

与含有硫酸雌酮的样品(例如尿囊)和硫酸雌酮特异性抗体(E1S)合并的酶溶液具有1:100,000的浓度。

在3小时的反应时间期间，反应产物(酶标记的硫酸雌酮抗体复合物)与表面结合的激素非特异性抗体结合。

上述用于鉴定尿囊液中硫酸雌酮的方法通过双抗体技术运行，并且在4小时后可得到关于胚胎是雄性还是雌性的最终结果。

与含有硫酸雌酮的样品和酶溶液结合的硫酸雌酮特异性抗体(E1S)的溶液具有1:125,000的浓度。

上述方法相当复杂，需要相当长的时间直到抽取的尿囊液中相应高的硫酸雌酮浓度能够被最终确定。

因此，该方法通常不适用于需要高通量和快速分析大量卵的大规模工业应用。

因此，本发明的目的是改进上述方法，使其也能够在工业规模上应用。

为此，本发明提出了具有权利要求1的特征的方法。

该方法将从论文中已知的上述方法进一步发展到雌酮衍生物特异性抗体表面结合的程度。据此，激素特异性抗体的所谓的直接包被可供使用。因此，不必使用上述用于现有技术的所谓的双抗体技术。由于雌酮衍生物特异性抗体不首先在溶液中与雌酮衍生物反应，而是提供已经结合到表面的雌酮衍生物特异性抗体，因此能够显著加速用于确定雌酮衍生物浓度的过程。值得注意的是，测试示出了可以将雌酮衍生物特异性抗体结合到表面。这样，大体上可以在最多2小时内确定雌酮衍生物浓度。

雌酮衍生物浓度的确定大体描述如下。雌酮衍生物的具体实例是硫酸雌酮。特别描述了硫酸雌酮浓度的确定作为确定特定雌酮衍生物浓度的实例。任何雌酮降解产物或雌酮本身都可以被用作雌酮衍生物。在确定雌酮衍生物浓度的基础上，可以区分雄性胚胎和雌性胚胎。雌酮衍生物特异性抗体足以结合雌酮衍生物。就所指作为实例的硫酸雌酮浓度的鉴定而言，雌酮特异性抗体可以被用作抗体。

除了标准(未修饰的)特异性抗体之外，特异性抗体也被称为特异性抗体缀合物。与标准(未修饰的)抗体相比，所述抗体缀合物具有特定的修饰，由此，例如，另一基团(缀合物)可以被结合和/或缀合。然而，这些特异性抗体缀合物对相应的雌酮衍生物仍然是特异性的。因此，该术语在功能上是可理解的，并且不排除进一步的修饰。单克隆或多克隆抗体可以被用作抗体。能够在不同的动物物种(兔，山羊或绵羊)中产生抗相应的硫酸雌酮或其衍生物的多克隆抗体。兔或啮齿动物中的杂交瘤技术被用于产生单克隆抗体。

在目前的情况下，缀合物被理解为除了抗体特异性的特定衍生物之外与(修饰或未修饰的)抗体结合的基团。所述结合可以是例如通过与葡糖苷酸桥结合，其他接头也是可能的。根据雌酮衍生物是否与该抗体另外结合，该缀合物可以具有不同的颜色，不同地催化显色反应，和/或形成具有不同颜色的复合物。例如，这可以用来确定雌酮衍生物的浓度。染色仅作为实例来理解。借助缀合物能够确定雌酮衍生物的浓度就足够了。这还可以通过检测状态变化的视频分析来完成。根据与抗体结合的雌酮衍生物，缀合物或缀合物、抗体和雌酮衍生物的整体复合物可能具有不同的活性。这允许确定雌酮衍生物的相应浓度。

根据根据权利要求2的优选实施方式，雌酮衍生物特异性抗体可以直接与表面结合而存在。雌酮衍生物特异性抗体直接结合到表面。因此，与现有技术相比，在表面和特异性抗体之间不提供非特异性抗体。

根据根据权利要求3的优选实施方式，缀合物可以含有胶体标记物。所述胶体标记物可以是胶体金、胶体乳胶或其他胶体物质。该胶体标记物本身可以形成缀合物或者可以仅仅是缀合物的一部分。如果金被用作胶体标记物，则称其为免疫金缀合物。由于一方面胶体金的强染性和另一方面抗体的特异性结合特性，抗体-金缀合物能够很好地用于确定雌酮衍生物的浓度。金缀合物(胶体金直接或间接结合的抗体)表现出良好的稳定性，因为蛋白质和金颗粒之间的结合相对较强。因此，实现了更高的灵敏度。因为标记可以实际上定制，所以还可以使用包含乳胶胶体或作为乳胶胶体的乳胶缀合物。乳胶粒子能够以任何颜色产生。

根据根据权利要求3的优选实施方式，缀合物可选自下列化合物组：金标记的类固醇-蛋白质化合物、胶体金、乳胶标记的类固醇-蛋白质化合物、胶体乳胶。类固醇-蛋白质化合物是例如酶或修饰的酶。酶是例如化学修饰的以使胶体标记物可以更好地与它们结合。但是，任何其他修饰也是可以想象的。类固醇-蛋白质化合物的实例是：雌酮葡糖苷酸过氧化物酶、雌酮羧甲基肟、雌酮羧甲基醚。然后该缀合物能够与抗体结合。例如，这些缀合物可以以溶液形式获得。在这种情况下，胶体混合物也被称为溶液。

根据根据权利要求4的优选实施方式，待用雌酮衍生物特异性抗体包被的表面可以是玻璃、玻璃纤维、纸或聚丙烯表面。

根据根据权利要求5的优选实施方式，雌酮衍生物特异性抗体可以是用于确定抽取的尿囊液中硫酸雌酮浓度的硫酸雌酮特异性抗体。如前所述，该变体是雌酮衍生物特异性抗体的亚组。由于它涉及下面的硫酸雌酮特异性抗体，这通常也应用于雌酮衍生物特异性抗体(以修饰或未修饰的形式用于与缀合物缀合)和/或不仅应用于硫酸雌酮，而且应用于任何雌酮衍生物。

根据根据权利要求6的优选实施方式，缀合物溶液可以包含有能够激活添加的染料的酶的酶溶液，并且所抽取尿囊液的硫酸雌酮浓度的确定通过光度法确定由酶激活的染料浓度来进行。

如上所述，其中酶被用作缀合物的这种变体是缀合物一般形式的亚组。胶体标记物也可以与酶结合。如就下文提及的与从属权利要求相关的“酶”而言，也可使用任何其他缀合物。一般形式的浓度和/或优点也适用于所使用的缀合物。

硫酸雌酮特异性抗体也是表面结合的。据此，具有激素特异性抗体的所谓的直接包被可供使用。因此，没有必要使用用于现有技术的上述所谓的双抗体技术。由于硫酸雌酮特异性抗体不首先在溶液中与硫酸雌酮反应，而是已经与表面结合，因此可以显著加速确定硫酸雌酮浓度的过程。值得注意的是，测试示出了可以将硫酸雌酮特特异性抗体与表面结合。这样，可以在最多2小时内确定硫酸雌酮浓度。

以下，对于从属权利要求8至20，描述了雌酮衍生物为硫酸雌酮并相应地该抗体为硫酸雌酮特异性抗体的变体；其中能够活化添加的染料的酶被用作缀合物，并且通过光度法确定被该酶活化的染料的浓度来进行抽取的尿囊液的硫酸雌酮浓度的确定。

根据根据权利要求8的优选实施方式，可以将尿囊液样品溶液和稀释度在1:60,000和1:90,000之间的酶溶液添加到表面结合的硫酸雌酮特异性抗体中。

由于与上述现有技术(双抗体技术)相比，直接包被中的酶溶液的稀释度较低(浓度较高)，已经示出了当使得样品溶液(尿囊液)和酶溶液与包被硫酸雌酮特异性抗体的表面接触时，酶或来自样品的硫酸雌酮和激素特异性抗体之间会发生快速并且因此更有效的反应。

优选抗雌酮葡糖苷酸用作硫酸雌酮特异性抗体。为了免疫(抗体产生)，载体分子BSA(牛白蛋白)优选地通过葡糖苷酸偶联到雌酮上。因此，硫酸雌酮特异性抗体优选地抗雌酮葡糖苷酸产生。

优选雌酮葡糖苷酸过氧化物酶用作酶。酶溶液稀释的优选范围可以在1:70,000和1:80,000之间，特别是大约为1:75,000+/-1,000。就所指酶溶液的稀释而言，该稀释可以借助于水(优选去矿物质的)或缓冲溶液进行。

根据根据权利要求9的优选实施方式，可以从卵中抽取2μL至50μL的尿囊液。另一个优选的数量范围为5μL至20μL。

令人惊讶的是，已经示出了即使在与权利要求3中描述的技术水平相比较低的抽取量下，仍然能够可靠地鉴别不同的硫酸雌酮浓度。

抽取的尿囊液越少(例如<50μL)，与没有采样的卵相比，可以检测到孵化率恶化越低或没有恶化。

根据根据权利要求10的优选实施方式，从卵中抽取的尿囊液可以不经稀释就与硫酸雌酮特异性抗体和酶合并。

因此，在直接包被方法中优选样品(尿囊)不经稀释地使用。因此，可以使用基本上如从卵中抽取的尿囊液。本质上不排除机械过滤。然而，优选地，这种过滤也被省略，因为明显证明了即使未过滤和未稀释的样品也不会不利地影响随后的反应。

然后可以将该未稀释的尿囊液与酶一起施加于包被的表面。

根据根据权利要求11的优选实施方式，可以将2μL和50μL之间的样品溶液与30μL和70μL之间的酶溶液合并。其他优选值在5μL和20μL之间，特别是50μL。优选地，将等量的样品溶液和酶溶液混合并且使其与包被的表面接触。

根据根据权利要求12的优选实施方式，可以将硫酸雌酮特异性抗体溶液以1:90,000至1:150,000的稀释度施加到待包被的表面。

硫酸雌酮特异性抗体的优选稀释范围可以在1:100,000和1:130,000之间，特别是大约1:125,000+/-1,000。

为了能够将硫酸雌酮特异性抗体固定化在表面上，其浓度应该明显高于如果抗体溶液仅用于原位反应的情况。

根据根据权利要求13的优选实施方式，为了用硫酸雌酮特异性抗体包被表面，硫酸雌酮特异性抗体的溶液可作用于待包被的表面4至14小时。已经表明，如果硫酸雌酮特异性抗体的溶液作用于该表面8至13小时，则可以实现最佳的固定结果。

在该包被之后，可以优选用0.1％BSA溶液(牛血清白蛋白)进行随后的包被。这可以如下进行，特别是如果待包被的表面是微量滴定板：将280μL+/-50μL BSA溶液(组分V，Serva公司)在每个腔中温育约30分钟，然后排空。

根据根据权利要求14的优选实施方式，在硫酸雌酮特异性抗体溶液和必要时的BSA作用后，包被的表面可以仅用聚山梨酯80溶液洗涤一次。如果待包被的表面是微量滴定板的腔，则微量滴定板的每腔用大约300μL单次冲洗就足够了。冲洗可以以50μL到300μL的量进行。

聚山梨酯80是由山梨糖醇和油酸衍生的聚氧乙烯化合物。聚山梨酯80还被称为吐温80。

已经表明，在单次洗涤后，基本上所有未固定化的硫酸雌酮特异性抗体都可以被除去，并且足够的硫酸雌酮特异性抗体也以固定化形式存在并且不被洗出。

根据根据权利要求15的优选实施方式，待包被的表面可以是微测试板的腔或膜。

所述微测试板是众所周知的并且具有可以在其中混合样品溶液和酶溶液的各种腔(也称为孔)。

这些腔作为微反应器用于鉴定。优选地，可以使用96孔、384孔微测试板(nunc公司)。

或者，也可以使用膜，而不使用这种腔，然后该膜能够安装在测试盒中。

所述程序是对被称为侧向流动技术(lateral-flow technique)的技术的修改。

根据根据权利要求16的优选实施方式，可以将样品溶液和酶溶液添加到微测试板的包被的腔中，并且在反应后倒出反应混合物。

优选地，将硫酸雌酮特异性抗体包被的腔直接与相应量的样品溶液和酶溶液混合。

结果表明，具有包被的腔的微测试板即使在-17℃以下也能储存几个月，特别是在约-17℃至-23℃，而不发生对于随后与硫酸雌酮反应不利的变化。

因此，可以在首次准备具有包被的腔的微测试板之后很久再鉴定。根据根据权利要求17的优选实施方式，在硫酸雌酮特异性抗体、样品中的硫酸雌酮和酶之间的反应后，所产生的固定化反应产物可以仅用聚山梨酯80洗涤两次。

已经表明了，两次洗涤足以除去所有不结合硫酸雌酮特异性抗体的不需要的分子，从而可以非常精确地确定结合的硫酸雌酮的浓度。如果待包被的表面是微量滴定板的腔，则用300μL——特别是微量滴定板的每个腔用300μL——冲洗两次就足够了。

根据根据权利要求18的优选实施方式，洗过的固定化反应产物可以与包含可以被酶活化的染料的溶液合并，并且可以在预定时间之后通过光度法确定染料浓度。

可以被结合的酶活化的所述染料可以如下产生。将物质A H₂O/脲素/Na₂HPO₄/柠檬酸与物质B四甲基联苯胺/DMSO/柠檬酸各自等量混合在一起，并施加到包被的表面，特别是腔。该酶催化显色反应，通过该显色反应可以得出酶浓度，从而间接地得出硫酸雌酮的浓度。

通过光度法，参照标准点(0.125-1.0ng/mL)能够确定对应的染料浓度。

制备已知浓度的硫酸雌酮(0.125-1.0ng/mL)的标准点(参考溶液)，以与抽取的尿囊液相同的方式，使已知浓度的硫酸雌酮与酶和固定化硫酸雌酮特异性抗体反应。根据测量的光度数据(吸光度)创建校准曲线。将测量的待检测样品的光度数据(吸光度)与校准曲线进行比较以确定硫酸雌酮的浓度。

光度鉴定优选如下进行：

来自酶溶液的酶(例如雌酮葡糖苷酸过氧化物酶)与表面结合的抗体结合。

显色反应后，如果没有硫酸雌酮(来自校准系列或尿囊样品)与抗体结合，则抗体结合的酶在光度计中产生最高的消光测量值。

随着硫酸雌酮浓度的增加，较少的酶结合到表面结合的抗体上，由此伴随之后显色反应的消光值降低。

由此，优选通过计算机评估，能够确定硫酸雌酮的浓度。

因此，染色(测量的消光值)与校准曲线成反比。

根据根据权利要求19的优选实施方式，可以进行显色反应的光度测量以确定微测试板腔中的染料浓度。

这可以进一步加速该方法。

根据根据权利要求20的优选实施方式，微测试板可以包含多个腔，并且从不同卵中抽取的尿囊液可以被放置在不同腔中，并且通过自动化不同腔中的光度测量和/或自动化将酶和样品溶液结合到包被的腔中的步骤，可以自动地确定不同卵中的硫酸雌酮浓度。

这可以进一步加速该方法。

从属权利要求21至33描述了关于权利要求1至6进一步解释的方法的一般变体。与特定变体相比，相应的浓度和程序可以略有不同。该变体不限于光度鉴定，而是可以使用任何通过缀合物的帮助能够推断雌酮衍生物浓度的方法。还可以设想使用摄像机来确定浓度依赖特性的方法。

本发明进一步优选的实施方式由下面实施例结合附图讨论得出。

其中：

图1示出了根据现有技术已知的具有雌性胚胎的卵中硫酸雌酮的测量浓度和具有雄性胚胎的卵中硫酸雌酮的测量浓度，

图2示出了第10-11孵化日鸡胚胎膜的示意图，

图3示出了通过胰岛素注射器抽取尿囊液，和

图4示出了根据本发明用于确定硫酸雌酮含量的校准曲线。

图2示出了第10至第11孵化日的鸡胚胎外层。

以其横截面视图示意性示出的卵具有带有壳皮的钙质壳1，气室2和蛋白质3被封闭在钙质壳1内。

在其中容纳胚胎鸡5和尿囊6的所谓的绒毛膜4储存在卵清中。

胚胎的代谢产物主要以尿素铵和尿酸的形式排泄。另一种降解产物是上述硫酸雌酮。即使硫酸雌酮的浓度通过现有技术被确定，但任何雌酮降解产物或雌酮本身都可用于区分雄性胚胎和雌性胚胎。因此，权利要求1中仅定义了一种雌酮衍生物特异性抗体。因此，本发明方法也普遍地描述了雌酮衍生物。

在下文中，如具体实施例仅描述了雌酮衍生物为硫酸雌酮，因此抗体为硫酸雌酮特异性抗体的变体；其中能够活化添加的染料的酶用作缀合物，并且通过光度法确定由该酶活化的染料的浓度来进行抽取的尿囊液的硫酸雌酮浓度的确定。

然而，该描述还适用于任何雌酮衍生物或缀合物，以及可以确定雌酮衍生物浓度的任何方法。光度测量不是必需的。

图3示出一个卵，胰岛素注射器7已经在其一位置插入，使得能够将合适的流体从尿囊中抽出。

下面描述了单独部分的实施例。

样品溶液的制备

通过尖端从卵中抽取2μL至50μL，优选5μL至20μ的尿囊液样品。

抽取的尿囊液未经稀释而使用，因此形成样品溶液，将样品溶液和酶溶液施加到包被的表面。

酶溶液的制备

这里使用的酶是雌酮葡糖苷酸过氧化物酶。

样品中的硫酸雌酮结合到酶也结合的硫酸雌酮特异性抗体。

酶溶液稀释的优选范围可以在1:60,000和1:90,000之间，优选在1:70,000和1:80,000之间，特别是约为1:75,000+/-1,000。

用缓冲溶液稀释酶。

该缓冲溶液包含7.12g磷酸氢二钠(Merck，德国)、8.5g氯化钠(Merck，德国)、1.0g牛血清白蛋白(Serva，德国)和1000mL水。缓冲溶液具有7.2的pH值。

表面包被/储存

硫酸雌酮特异性抗体的溶液可以以1:90,000至1:150,000，优选1:100,000与1:130,000之间，特别是大约1:125,000+/-1,000的稀释度施加到待包被的表面。

抗雌酮葡糖苷酸，即该抗体针对雌酮葡糖苷酸(-BSA)并且在兔中获得，能够优选地被用作硫酸雌酮特异性抗体。

待包被的表面是微测试板的腔。优选地，可以使用96孔、384孔微测试板(nunc公司)。

作为微测试板的替代，还可以使用硫酸雌酮特异性抗体结合的膜，并且可以将溶液置于盒中的膜上。这是对竞争性检测系统——被称为侧向流测定(Lateral flow assay)的技术的修改。待包被的表面可以是玻璃、玻璃纤维、纸或聚丙烯。

在这种情况下，将溶液施加于玻璃、玻璃纤维、纸、聚丙烯或膜表面以开始反应。该系统不需要如下所述的冲洗过程。添加标记溶液后，会发生颜色变化，并记录。

将在50μL和150μL之间，特别是100μL的硫酸雌酮特异性抗体溶液置于每个腔中并在室温下放置过夜。

之后，将微测试板的腔用100μL和500μL之间，特别是300μL测定缓冲液以150/min的速率排空30分钟。

然后将测定缓冲液从微量滴定板中排空。

现在，板的腔包被有硫酸雌酮特异性抗体。

在使用之前，这些板可以至少在-17℃，特别是-17至-23℃下保存数月而无损坏。

反应

将样品溶液和酶溶液置于包被的腔中并在振荡的同时温育75分钟。在这段时间之后，所有物质按照化学计量反应并且硫酸雌酮与表面上的硫酸雌酮特异性抗体结合。

将等量的2μL和50μL之间的样品溶液以及30μL和70μL之间的酶溶液加在一起。其他优选值在5μL和15μL之间，特别是50μL。

反应后，将微测试板排空并用吐温80溶液洗涤两次。

用于确定硫酸雌酮浓度的方法

将洗过的固定化反应产物与包含可被酶活化的染料的溶液合并，并在预定时间后用光度法测定染料浓度。

所述可以被结合的酶活化的染料可以如下产生。

将物质A(H₂O/脲素/Na₂HPO₄/柠檬酸)与物质B(四甲基联苯胺/DMSO/柠檬酸)各自等量混合，并置于冲洗过的表面上。该酶催化显色反应，通过该反应可以得出激素浓度，从而间接地得出硫酸雌酮的浓度。

对应的染料浓度可以通过光度法测定。

制备已知浓度的硫酸雌酮的标准溶液，以与抽取的尿囊液相同的方式，已知浓度的硫酸雌酮与酶和固定化硫酸特异性抗体反应。根据测量的光度数据(吸光度)创建校准曲线。将测量的待检测样品的光度数据(吸光度)与校准曲线进行比较，以确定硫酸雌酮的浓度。

为了确定硫酸雌酮的浓度，制备已知量硫酸雌酮的校准样品并且按照与上述相同的方式进行处理。图4所示的校准曲线是从这些校准点(calibration robes)的测量数据中获得的。

通过比较具有未知硫酸雌酮含量的样品的光度测量结果与校准曲线，能够得出样品中的硫酸雌酮浓度。

所使用的光谱仪是所谓的Viktor 21420多标记计数器，测量值用“Workout”软件(Perkin Elmer)确定。

硫酸雌酮的浓度用于性别鉴定

利用上述方法，可以区分尿囊液中0.1ng/mL的硫酸雌酮浓度的差异，这在先前已知的方法中是不可能的。

这意味着可以在雌性胚胎和雄性胚胎之间进行更精确的鉴定。

为了澄清，在下面的表1和2中示出。由此表1示出了在不同孵育时间抽取的尿囊液样品中硫酸雌酮或雌二醇的浓度。

表1：在不同孵育时间抽取的尿囊液样品中硫酸雌酮或雌二醇的浓度。

在上面的表1中，中值、P25和P75显示了P25和P75之间各自的分位数为测量分布值的50％。

例如，第7孵化日的雄性胚胎中硫酸雌酮浓度的中值是0.11ng硫酸雌酮每mL抽取的样品。在第7孵化日的雌性胚胎中硫酸雌酮浓度的中值是0.12ng硫酸雌酮每mL抽取的样品。

例如，第9孵化日的雄性胚胎中硫酸雌酮浓度的中值是0.14ng硫酸雌酮每mL抽取的样品。在第8孵化日的雌性胚胎中硫酸雌酮浓度的中值是0.21ng硫酸雌酮每mL抽取的样品。

表中还给出了雌二醇的相应浓度。

表2示出了指示雄性胚胎或雌性胚胎的硫酸雌酮浓度的极限值。

表2：指示雄性胚胎或雌性胚胎的硫酸雌酮浓度的极限值。

上表2表明硫酸雌酮浓度的差别取决于孵化天数。

在第7孵化日，用根据本发明的方法确定没有差异。

在第8孵化日，雄性胚胎的极限为尿囊液中0.10ng/mL或更少的硫酸雌酮。浓度大于0.10ng/mL硫酸雌酮的是雌性胚胎。

使用根据本发明的方法，可以更早地检测硫酸雌酮的浓度差异，并且还可以更快地进行鉴定。

参考符号列表：

钙质壳 1

气室 2

卵清 3

绒毛膜 4

胚胎鸡 5

尿囊 6

胰岛素注射器 7

Claims

1.一种用于鸡卵内性别鉴定的方法，包括以下步骤：

从卵中抽取尿囊液的样品溶液；

将从所述卵中抽取的所述样品溶液与雌酮衍生物特异性抗体和具有与所述抗体结合的缀合物的缀合物溶液合并；以及

通过与所述抗体结合的所述缀合物确定所述抽取的尿囊液的所述雌酮衍生物浓度；

其特征在于

所述雌酮衍生物特异性抗体是表面结合的。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雌酮衍生物特异性抗体直接结合于表面存在。

3.根据前述权利要求中一项所述的方法，其特征在于，所述缀合物包含胶体标记物。

4.根据权利要求1或2中一项所述的方法，其特征在于，所述缀合物选自以下化合物组：金标记的类固醇-蛋白质化合物、胶体金、乳胶标记的类固醇-蛋白质化合物、胶体乳胶。

5.根据前述权利要求中一项所述的方法，其特征在于，待用所述雌酮衍生物特异性抗体包被的所述表面可以是膜、玻璃、玻璃纤维、纸或聚丙烯表面。

6.根据前述权利要求中一项所述的方法，其特征在于，所述雌酮衍生物特异性抗体是硫酸雌酮特异性抗体，并且从所述抽取的尿囊液确定所述硫酸雌酮的浓度。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述缀合物溶液是包含能够激活添加的染料的酶的酶溶液，并且所述抽取的尿囊液的所述硫酸雌酮浓度的确定通过光度测定法确定被所述酶激活的所述染料的浓度来进行。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，可以将所述样品溶液和具有1:60,000和1:90,000之间的稀释度的所述酶溶液添加至所述表面结合的硫酸雌酮特异性抗体。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，从所述卵中抽取2μL至50μL样品溶液。

10.根据权利要求7至9中一项所述的方法，其特征在于，将所述样品溶液不经稀释与所述硫酸雌酮特异性抗体和所述酶溶液合并。

11.根据权利要求7至10中一项所述的方法，其特征在于，将2μL和50μL之间的样品溶液与30μL和70μL之间的酶溶液合并。

12.根据权利要求7至11所述的方法，其特征在于，可以将所述硫酸雌酮特异性抗体的溶液以1:90,000至1:150,000的稀释度施加到待包被的所述表面。

13.根据权利要求7至12中一项所述的方法，其特征在于，为了用所述硫酸雌酮特异性抗体包被所述表面，可以将所述硫酸雌酮特异性抗体的所述溶液作用于待包被的所述表面4至14小时。

14.根据权利要求7至13中一项所述的方法，其特征在于，在所述硫酸雌酮特异性抗体溶液的暴露之后，所述包被的表面用聚山梨酯80溶液仅洗涤一次。

15.根据权利要求7至14中一项所述的方法，其特征在于，待包被的所述表面是微测试板的腔或膜。

16.根据权利要求7至15中一项所述的方法，其特征在于，将所述样品溶液和所述酶溶液添加到所述微测试板的包被的腔中，并且在反应后倒出所述反应混合物。

17.根据权利要求7至16中一项所述的方法，其特征在于，在硫酸雌酮特异性抗体、硫酸雌酮和酶之间的反应后，生成的固定化反应产物用聚山梨酯80仅洗涤两次。

18.根据权利要求7至17中一项所述的方法，其特征在于，将所述洗过的固定化反应产物与包含可被所述酶活化的染料的溶液合并，并且在预定时间后用光度法确定所述染料浓度。

19.根据权利要求7至18中一项所述的方法，其特征在于，进行所述显色反应的所述光度测量以确定所述微测试板的所述腔中的所述染料浓度。

20.根据权利要求7至18所述的方法，其特征在于，所述微测试板包含多个腔，并且从不同的卵抽取的所述样品溶液放置在不同的腔中，并且通过自动化所述不同腔中的所述光度测量和/或自动化将酶、样品溶液合并到所述包被的腔的步骤，自动确定所述不同卵中的所述硫酸雌酮浓度。

21.根据权利要求1至5中一项所述的方法，其特征在于，将所述样品溶液和具有1:20,000和1:100,000之间稀释度的所述缀合物溶液添加至所述表面结合的雌酮衍生物特异性抗体。

22.根据权利要求1至6以及21中一项所述的方法，其特征在于，从所述卵中抽取2μL至50μL样品溶液。

23.根据权利要求1至5以及21和22中一项所述的方法，其特征在于，所述样品溶液不经稀释与所述硫酸雌酮特异性抗体和所述酶合并。

24.根据权利要求1至6中一项以及权利要求21至23中一项所述的方法，其特征在于，将2μL至50μL之间的样品溶液和30μL至70μL之间的缀合物溶液合并。

25.根据权利要求1至5中一项以及根据权利要求21至24中一项所述的方法，其特征在于，将所述硫酸雌酮特异性抗体的溶液以1:90,000到1:150,000的稀释度施加于待包被的所述表面。

26.根据权利要求1至5中一项以及根据权利要求21至25中一项所述的方法，其特征在于，为了用雌酮衍生物特异性抗体包被所述表面，所述雌酮衍生物特异性抗体的溶液作用于待包被的所述表面4至14小时。

27.根据权利要求1至6中一项以及根据权利要求21至26中一项所述的方法，其特征在于，在所述雌酮衍生物特异性抗体的溶液作用之后，所述包被的表面用聚山梨酯80溶液仅洗涤一次。

28.根据权利要求1至6中一项以及根据权利要求21至27中一项所述的方法，其特征在于，待包被的所述表面是微测试板的腔或膜。

29.根据权利要求1至6中一项以及根据权利要求21至28中一项所述的方法，其特征在于，将所述样品溶液和所述酶溶液施加到所述微测试板的所述腔中并且在所述反应后将所述反应混合物倒出。

30.根据权利要求7至16中一项以及根据权利要求21至29中一项所述的方法，其特征在于，在硫酸雌酮特异性抗体、硫酸雌酮和酶之间的反应后，产生的固定化所述反应产物用聚山梨酯80仅洗涤两次。

31.根据权利要求1至6中一项以及根据权利要求21至30中一项所述的方法，其特征在于，在预定时间之后进行光度测量用于确定所述雌酮衍生物的浓度。

32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，进行所述显色反应的所述光度测量用于确定所述微测试板的所述腔中的所述染料浓度。

33.根据权利要求31或32中一项所述的方法，其特征在于，所述微测试板包含多个腔，并且从不同卵抽取的所述样品溶液放置在不同腔中，并且通过自动化在所述不同腔中的所述光度测量和/或自动化将缀合物、样品溶液合并到所述包被的腔中的步骤，自动确定所述不同卵中的所述硫酸雌酮浓度。