ES2938736T3

ES2938736T3 - Composiciones de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y métodos de controlar patógenos de plantas

Info

Publication number: ES2938736T3
Application number: ES19797861T
Authority: ES
Inventors: Der Lelie Daniel Van; Safiyh Taghavi; Anthony Andrew Devine; Jaeheon Lee
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 2018-09-28
Filing date: 2019-09-27
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2039-09-27
Also published as: US20200100504A1; HUE061530T2; EP3855919A1; CL2021000711A1; IL281620B1; CR20210152A; CN116250545A; US11528910B2; TW202034771A; EP4197335A1; ZA202101901B; KR20210071010A; PE20211401A1; CN113271780A; PL3855919T3; PT3855919T; IL281620B2; MX2021003474A; BR112021005899A2; EP3855919B1

Abstract

La presente solicitud describe un método para controlar patógenos de plantas, por ejemplo, patógenos fúngicos y bacterianos, en una planta, en el que se aplica a la planta una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 depositada como ATCC No. PTA-122162, en particular sobre suelo. partes de la planta. La composición puede comprender iturina y fengicina en una relación de peso relativo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0. La solicitud también describe una composición agrícola que comprende la cepa, un vehículo, un agente tensioactivo y, opcionalmente, un tampón y un concentrado correspondiente. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y métodos de controlar patógenos de plantas

CAMPO TÉCNICO

La materia objeto descrita en esta memoria se refiere a composiciones que comprenden una cepa FCC1256 de Bacillus amyloliquefaciens aislada para su aplicación a plantas o al suelo que rodea las plantas para tratar enfermedades de plantas provocadas por patógenos de plantas.

ANTECEDENTES

Patógenos fúngicos de plantas (fitopatógenos), que incluyen, pero no se limitan a Botrytis spp, Fusarium spp, Flhizoctonia spp. son un tipo de plaga vegetal que puede provocar graves pérdidas económicas en las industrias agrícola y hortícola. Pueden utilizarse agentes químicos para controlar fitopatógenos fúngicos, pero el uso de agentes químicos adolece de desventajas que incluyen alto costo, falta de eficacia, aparición de cepas resistentes de los hongos e impactos medioambientales indeseables. Además, tratamientos químicos de este tipo tienden a ser indiscriminados y pueden afectar negativamente a las bacterias, los hongos y artrópodos beneficiosos, además del patógeno de plantas al que fijan como objetivo los tratamientos. Un segundo tipo de plaga vegetal son los patógenos bacterianos de plantas, que incluyen, pero no se limitan a Erwinia spp., Xanthomonas spp. y Pseudomonas spp. que provocan graves pérdidas económicas en las industrias agrícola y hortícola. De manera similar a los hongos patógenos, el uso de agentes químicos para tratar estos patógenos bacterianos adolece de desventajas. Por lo tanto, son deseables los microorganismos que se pueden aplicar como bioplaguicidas para controlar hongos y bacterias patógenos en las plantas y tienen una gran demanda para mejorar la sostenibilidad agrícola.

Algunos miembros de la especie Bacillus han sido reseñados como cepas de control biológico y algunos se han aplicado en productos comerciales. Por ejemplo, las cepas que se utilizan actualmente en productos comerciales de biocontrol incluyen: Bacillus velezensis QST713, utilizado como ingrediente activo de Serenade®, producido por Bayer Crop Science, y Bacillus amyloliquefaciens D747, utilizado como ingrediente activo en Double Nickel producido por Certis. Además, las cepas de Bacillus que se utilizan actualmente en productos bioestimulantes comerciales incluyen: Bacillus velezensis FZB42 utilizado como ingrediente activo en RhizoVital® 42, producido por ABiTEP GmbH.

Además, el documento WO 2016/109396 A1 describe Bacillus amyloliquefaciens RTI472 para uso en beneficio del crecimiento de las plantas y para el tratamiento de enfermedades de las plantas tales como infecciones fúngicas y bacterianas.

Además, el documento WO 2016/109395 A1 describe Bacillus amyloliquefaciens RTI301 para uso en beneficio del crecimiento de las plantas y para tratar enfermedades de las plantas tales como infecciones fúngicas y bacterianas. También, el documento WO 2015/023662 A1 describe, entre otros, una cepa de Bacillus amyloliquefaciens para inhibir el crecimiento y/o la actividad de patógenos fúngicos de plantas.

Sin embargo, a pesar de la disponibilidad de determinados plaguicidas biológicos, existe la necesidad en la técnica de mejorar la especificidad frente a las enfermedades diana y sus respectivos patógenos causales. Además, existe la necesidad de mejorar la eficacia y la potencia de los plaguicidas biológicos que pueden verse afectados por diversos factores bióticos y abióticos. La presente invención aborda la necesidad en la técnica al proporcionar nuevas composiciones microbianas y métodos para su uso para controlar el crecimiento de patógenos de plantas y, con ello, aliviar o prevenir enfermedades de las plantas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención reside en el aislamiento de una nueva cepa de Bacillus amyloliquefaciens a partir de suelo de plantas de fresa. La cepa FCC1256 de Bacillus amyloliquefaciens ha sido depositada en la ATCC bajo el número de Acceso de Patente PTA-122162, véase el Ejemplo 1.

En al menos una realización, la presente invención se refiere a métodos para controlar patógenos de plantas en una planta, comprendiendo los métodos la etapa de aplicar una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar en el que la planta o parte de la planta crece o se va a plantar.

En otra realización, la presente invención se refiere a un método para controlar patógeno(s) fúngico(s) de plantas y/o patógeno(s) bacteriano(s) de plantas en una planta, comprendiendo el método la etapa de aplicar una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 a partes molidas de la planta.

En una realización, se proporciona una composición agrícola que comprende a) Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y b) un medio de formulación adecuado para la agricultura, p. ej., que comprende un soporte adecuado, un agente tensioactivo y, opcionalmente, un tampón. La composición agrícola es particularmente útil para su aplicación para proteger plantas contra patógenos o para tratar una infección patógena en una planta susceptible, p. ej., de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria. En algunas realizaciones, la composición comprende iturina y fengicina en una relación relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0, tal como de 1,5:1,0 a 2,8:1,0, respectivamente.

En realizaciones adicionales, se proporciona un concentrado para una composición agrícola, comprendiendo el concentrado: a) Bacillus amyloliquefaciens FCC1256, y b) un medio de formulación adecuado para la agricultura, p. ej., un medio que comprende un soporte adecuado, un agente tensioactivo y, opcionalmente, un tampón.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Habiendo descrito así la materia objeto de la presente divulgación en términos generales, se hará ahora referencia a las Figuras adjuntas que se describen a continuación:

La Figura 1 muestra los resultados del ensayo de Disco de Hoja de Pimiento Separada que compara la actividad de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 con los controles no tratados, así como con el producto comercial Serenade® Optimum.

La Figura 2 muestra las relaciones típicas de iturina, surfactina, fengicina y ericina A/S de cultivos de FCC1256 y RTI472, respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Tal como se utiliza en esta memoria, las designaciones “Bacillus amyloliquefaciens FCC1256” y “FCC1256” se refieren a un cultivo biológicamente puro de la cepa bacteriana FCC1256 de Bacillus amyloliquefaciens depositada bajo el N° de Acceso de Patente PTA-122162, véase el Ejemplo 1. En los métodos, composiciones, etc. descritos en esta memoria, la cepa puede estar presente en una o una combinación de formas: como esporas aisladas de la mancha bacteriana, como un caldo de fermentación que comprende esporas de la cepa bacteriana, como un producto de fermentación procesado que comprende esporas de la cepa bacteriana, como células vegetativas aisladas de la cepa bacteriana, como un caldo de fermentación que comprende células vegetativas de la cepa bacteriana y como un producto de fermentación procesado que comprende células vegetativas de la cepa bacteriana.

La expresión "cultivo biológicamente puro" se refiere a un cultivo de laboratorio o de fermentación que contiene una única especie de organismo, es decir, en el presente caso, virtualmente de manera exclusiva una cepa bacteriana de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256. Esto significa que cualquier otro microorganismo implicado en el caldo de fermentación del cultivo puro se considera contaminación, que solo existe en una cantidad despreciable y que no provoca cambios mensurables en las composiciones físicas y químicas del caldo.

La expresión "producto de fermentación procesado" se refiere a una forma procesada aguas abajo del mismo, que incluye, pero no se limita a un concentrado del caldo de fermentación, sólidos de un caldo de fermentación filtrado, un concentrado de caldo de fermentación reconstituido y un caldo de fermentación seco (p. ej., liofilizado o secado por pulverización).

En algunas realizaciones, FCC1256 está presente como un caldo de fermentación que comprende esporas de FCC1256 o un producto de fermentación procesado que comprende esporas de FCC1256, tal como un concentrado de un caldo de fermentación o un caldo de fermentación secado por pulverización.

El hecho de que se incluya un cultivo biológicamente puro de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 en las composiciones y métodos descritos en esta memoria no excluye que las composiciones y los métodos, respectivamente, puedan incluir otras cepas microbianas definidas, en particular otras cepas microbianas biológicamente puras.

Los términos “un”, “una” y “el”, “la” se refieren a “uno/una o más” cuando se utilizan en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones. Así, por ejemplo, la referencia a “una planta” incluye una pluralidad de plantas, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, los términos "comprenden", "comprende" y la expresión "que comprende" se utilizan en un sentido no exclusivo, excepto cuando el contexto requiera lo contrario. Del mismo modo, el término "incluyen" y sus variantes gramaticales pretenden no ser limitativos, de modo que la recitación de elementos en una lista no excluya otros elementos similares que puedan sustituirse o añadirse a los elementos enumerados.

A los efectos de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, el término "aproximadamente" cuando se utiliza en relación con uno o más números o intervalos numéricos, debe entenderse que se refiere a todos esos números, incluyendo todos los números en un intervalo y modifica ese intervalo al extender los límites por encima y por debajo de los valores numéricos recogidos. La recitación de intervalos numéricos por puntos finales incluye todos los números, p. ej., números enteros, incluidas sus fracciones, subsumados dentro de ese intervalo (por ejemplo, la recitación de 1 a 5 incluye 1, 2, 3, 4 y 5, así como fracciones del mismo, p. ej., 1,5, 2,25, 3,75, 4,1 y similares) y cualquier intervalo dentro de ese intervalo.

A los efectos de esta memoria descriptiva y reivindicaciones, los términos "metabolito" y "metabolitos" se utilizan en relación con compuestos con actividad antimicrobiana producidos por Bacillus amyloliquefaciens FCC1256, tal como iturina, fengicina y surfactina. Los metabolitos a los que se alude como “iturina”, “fengicina” y “surfactina” representan cada uno una clase de estructuras moleculares bastante similares. En la medida en que se haga referencia a cantidades o relaciones de incluir iturina, fengicina y surfactina, se pretende que la cantidad/relación se refiera a la cantidad total (peso) del metabolito respectivo. La cantidad se puede determinar por análisis HPLC utilizando patrones comerciales adecuados.

Métodos de la invención

En determinadas realizaciones de la presente invención, se proporcionan composiciones y métodos que incluyen Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 para aplicación a una planta para conferir protección contra una infección patógena en una planta susceptible. Mediante los métodos de la presente invención, el control de un patógeno de plantas puede reflejarse en una infección patógena reducida, resistencia mejorada a patógenos de plantas (p. ej., resistencia a ataques posteriores), vigor mejorado de las plántulas, desarrollo radicular mejorado, crecimiento vegetal mejorado, salud mejorada de las plantas, aumento del rendimiento, aspecto mejorado o una combinación de los mismos.

Por lo tanto, la presente invención se refiere, entre otros, a un método para controlar patógeno(s) de plantas en una planta, comprendiendo el método la etapa de aplicar una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar en el que la planta o parte de la planta crece o se ha de plantar.

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "patógeno de plantas" se refiere a organismos que provocan enfermedades infecciosas en plantas, incluyendo hongos, bacterias, virus, viroides, organismos similares a virus, oomicetos, fitoplasmas, protozoos, nematodos y plantas parásitas. En algunas realizaciones, los patógenos de plantas se seleccionan de hongos y bacterias. En una variante, los patógenos de plantas se seleccionan de patógenos de plantas fúngicos. En otra variante, los patógenos de plantas se seleccionan de patógenos de plantas bacterianos.

En otra realización, el método incluye aplicar la composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar en el que la planta o parte de la planta crece o se ha de plantar para controlar patógenos de plantas seleccionados del grupo formado que consiste en un hongo de la roya, una Botrytis spp. (tal como Botrytis cinerea, Botrytis squamosal), una Erwinia spp. (tal como Erwinia carotovora, Erwinia amylovora), una Dickeya spp. (tal como Dickeya dadantii, Dickeya solani), una Agrobacterium spp. (tal como Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium tumefaciens), una Xanthomonas spp. (tal como Xanthomonas axonopodis, Xanthomonas campestris pv. carotae, Xanthomonas pruni, Xanthomonas arboricola, Xanthomonas oryzae pv. oryzae), una Xylella spp. (tal como Xylella fastidiosa), una Candidatus spp. (tal como Candidatus liberibacter), una Fusarium spp. (tal como Fusarium colmorum, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Fusarium virguliforme), una Sclerotinia spp. (tal como Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia minor, Sclerotinia homeocarpa), una Cercospora/Cercosporidium spp., una Uncinula spp. (tal como Uncinula necator), una Podosphaera spp. (tal como Podosphaera leucotricha, Podosphaera clandestine), una Phomopsis spp. (tal como Phomopsis viticola), una Alternaría spp. (tal como Alternaria tenuissima, Alternaria porri, Alternaria alternate, Alternaria solani, Alternaria tenuis), una Pseudomonas spp. (tal como Pseudomonas syringae pv. Tomato), una Phytophthora spp. (tal como Phytophthora infestans, Phytophthora parasitica, Phytophthora sojae, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamon, Phytophthora fragariae, Phytophthora ramorum, Phytophthora palmivara, Phytophthora nicotianae), una Phakopsora spp. (tal como Phakopsora pachyrhizi, Phakopsora meibomiae), una Aspergillus spp. (tal como Aspergillus flavus, Aspergillus niger), una Uromyces spp. (tal como Uromyces appendiculatusi), una Cladosporium spp. (tal como Cladosporium herbarum), una Rhizopus spp. (tal como Rhizopus arrhizus), una Rhizoctonia spp. (tal como Rhizoctonia solani, Rhizoctonia zeae, Rhizoctonia oryzae, Rhizoctonia caritae, Rhizoctonia cerealis, Rhizoctonia crocorum, Rhizoctonia fragariae, Rhizoctonia ramicola, Rhizoctonia rubi, Rhizoctonia leguminicola), una Macrophomina spp. (tal como Macrophomina phaseolina), una Magnaporthe spp. (tal como Magnaporthe grisea, Magnaporthe oryzae), una Mycosphaerella spp. (tal como Mycosphaerella graminocola, Mycosphaerella fijiensis (sigatoga negra), Mycosphaerella pomi, Mycosphaerella citri), una Monilinia spp. (tal como Monilinia fruticola, Monilinia vacciniicorymbosi, Monilinia laxa), una Colletotrichum spp. (tal como Colletotrichum gloeosporiodes, Colletotrichum acutatum, Colletotrichum Candidum),

una Diaporthe (spp. Diaporthe citri), una Corynespora spp. (tal como Corynespora Cassiicola), una Gymnosporangium spp. (tal como Gymnosporangium juniperi-virginianae), una Schizothyrium spp. (tal como Schizothyrium pomi), una Gloeodes spp. (tal como Gloeodes pomigena), una Botryosphaeria spp. (tal como Botryosphaeria dothidea), una Neofabraea spp., una Wilsonomyces spp. (tal como Wilsonomyces carpophilus), una Sphaerotheca spp. (tal como Sphaerotheca macularis, Sphaerotheca pannosa), una Erysiphe spp., una Stagonospora spp. (tal como Stagonospora nodorum), una Pythium spp. (tal como Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Pythium irregularum, Pythium ulosum, Pythium lutriarium, Pythium sylvatium), una Venturia spp. (tal como Venturia inaequalis), una Verticillium spp., una Ustilago spp. (tal como Ustilago nuda, Ustilago maydis, Ustilago scitaminea), una Claviceps spp. (tal como Claviceps puprrea), una Tilletia spp. (tal como Tilletia tritici, Tilletia laevis, Tilletia horrid, Tilletia controversa), una Phoma

spp. (tal como Phoma glycinicola, Phoma exigua, Phoma lingam), una Cocliobolus spp. (tal como Cocliobolus sativus), una Gaeumanomyces spp. (Gaeumanomyces gaminis), una Colleototricum spp., una Rhychosporium spp. (tal como Rhychosporium secalis), una Biopolaris spp., una Helminthosporium spp. (tal como Helminthosporium secalis, Helminthosporium maydis, Helminthosporium solai, Helminthosporium triticirepentis), y combinaciones de los mismos, incluyendo cualquier subespecie variante de los mismos.

En algunas realizaciones, el método se adapta para controlar uno o más patógenos de plantas seleccionados de Botrytis squaomas, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium viguliforme, Phytophthora infestans, Phytophthora parasítica, Phytophthora sojae, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamon, Phytophthora fragariae, Phytophthora ramorum, Phytophthora palmivara, Phytophthora nicotianae, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia minor, Sclerotinia homeocarpa, Aspergillus favus, Pseudomonas syringae pv. Tomato, Erwinia amylovara, Rhizoctonia solani, Xanthomonas euvesicatoria, y cualquier combinación de los mismos, incluyendo cualesquiera variantes de subespecies de los mismos.

En algunas realizaciones, los métodos de la invención utilizan una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 para controlar enfermedades provocadas por patógenos de plantas, tales como moho gris del pimiento (Botrytis cinerea), tizón Phytophthora del pimiento (Phytophthora capsica), pudrición de la corona del tomate por Fusarium (Fusarium sp.), fuego bacteriano del manzano (Erwinia amylovora), mota bacteriana del tomate (Pseudomonas syringae), enfermedad de la mancha bacteriana del pimiento (Xanthomonas euvesicatoria), marchitamiento de la soja (Rhizoctonia solani).

Tal como se utiliza en esta memoria, la expresión "control de patógeno(s) de plantas" en el contexto de los métodos y composiciones de la presente invención pretende significar una reducción de al menos un 10 % del crecimiento de los patógenos de plantas en comparación con las condiciones correspondientes, en que los métodos o las composiciones no se utilizan, p. ej., en algunas realizaciones, una reducción de al menos el 30 %, o una reducción de al menos el 50 %, o una reducción de al menos el 70 %, o una reducción de al menos el 80 %, o una reducción de al menos el 90 %, o esencialmente una eliminación del crecimiento. En este último caso, la eliminación del crecimiento puede resultar en la eliminación visual del o de los patógenos de la planta. Los Ejemplos 3, 5, 6 y 7 demuestran tipos de metodologías para la determinación del grado de control de diversos patógenos de plantas utilizando Bacillus amyloliquefaciens FCC1256.

Los métodos y las composiciones de acuerdo con la invención son útiles para prevenir o tratar enfermedades provocadas por patógenos de plantas en una amplia gama de plantas incluyendo, pero no limitadas a maíz, maíz dulce, semilla de maíz, maíz para ensilaje, maíz de campo, arroz, trigo, cebada, sorgo, espárragos, arándano, mora, frambuesa, loganberry, arándano azul, arándano rojo, grosella espinosa, bayas de saúco, grosellas, zarzamora, bayas de arbusto, brócoli, repollo, coliflor, coles de Bruselas, berza, col rizada, mostaza castaña, colirrábano, pepino, cantalupo, melón, Cucumis melo, calabacín, sandía, calabaza, berenjena, cebolla, ajo, chalotes, naranja, pomelo, limón, mandarina, tangelo, pomelo, pimiento, tomate, capulina, tomatillo, okra, uva, lechuga, apio, espinaca, perejil, radicchio, habas, judías verdes, habichuelas, habas con cáscara, soja, habas secas, garbanzos, habas lima, guisantes, habas de garbanzo, guisantes partidos, lentejas, canola, ricino, coco, algodón, lino, aceite de palma, aceituna, cacahuete, colza, cártamo, sésamo, girasol, soja, manzana, manzano silvestre, pera, membrillo, may haw, zanahoria, patata, boniato, mandioca, remolacha, jengibre, rábano picante, rábano, ginseng, nabo, albaricoque, cereza, nectarina, melocotón, ciruela, ciruela pasa, fresa, almendra, pistacho, pacana, nuez, avellanas, castaña, anacardo, haya, nuez moscada, macadamia, kiwi, plátano, agave (azul), hierba, césped, flor de Pascua, castañas, roble, arce, caña de azúcar y remolacha azucarera.

En algunas realizaciones, la planta es soja, frijol, habichuela, trigo, algodón, maíz, pimiento, tomate, patata, mandioca, uva, fresa, plátano, cacahuete, calabacín, calabaza, berenjena y pepino.

En otras realizaciones, la planta se selecciona de manzanas, espárragos, arrayán, gayuba, zarzamora, zarzamora alta y baja, cerezo silvestre, capulín, grosella, bayas del saúco, grosella espinosa, arándano rojo, arándano rojo, loganberry, mora blanca, cerezo de fuego, frambuesa, baya Salaberry, baya de Saskatoon, espino amarillo y frambuesa silvestre, mora o frambuesa, uvas, fresa, kiwi fuzzy, brócoli, brócoli chino, brócoli raab, coles de Bruselas, repollo, coliflor, brócoli, col rizada, berza, colinabo, mizuna, hojas de mostaza, mostaza, espinaca japonesa y colza, cebollas, ajo, puerros, chalotes y cebollines, apio, melón, calabaza china, pepino, calabaza comestible, melón, Cucumis melo, calabaza, calabacín, sandía, berenjena, capulina, okra, pimientos, tomatillos y tomate.

En aún otras realizaciones, la planta se selecciona de pimiento, pepinos, manzanas, espárrago, plátanos, cítricos, kiwi, melones, melocotones, peras, piñas, pomos, granada, apio, cebollas, ajo, uvas, espárragos, chalotes, cebollinos, brócoli, repollo, coliflor, cucurbitáceas, tomates, patatas, trigo, arroz o soja.

En al menos una realización de los métodos de la invención, la composición se aplica a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar en el que la planta o parte de la planta crece o se ha de plantar, p. ej., follaje de la planta, corteza de la planta, fruto de la planta, flores de la planta, semilla de la planta, raíces de la planta, un esqueje de la planta, un injerto de la planta, suelo o medio de crecimiento que rodea la planta; suelo o medio de crecimiento antes de sembrar semillas de la planta en el suelo o medio de crecimiento; o suelo o medio de crecimiento antes de plantar la planta, cortar la planta o injertar la planta en el suelo o medio de crecimiento.

En una variante, la invención se refiere a un método para controlar patógeno(s) fúngico(s) de plantas y/o patógeno(s) bacteriano(s) de plantas en una planta, comprendiendo el método aplicar una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 depositada como ATCC N° PTA-122162 para partes superficiales de la planta.

Tal como se utiliza en esta memoria, la frase “aplicando [..] a partes superficiales de una planta" y similares, se refiere a la aplicación de la composición a la planta apuntando al (a los) tallo(s), la(s) hoja(s), la(s) flor(es) y/o el (los) fruto(s) de la planta. En otras realizaciones, la aplicación está dirigida al lugar en el que la planta o las partes de la planta crecen o se han de plantar, p. ej., al sistema radicular de la planta o al suelo alrededor del sistema radicular de la planta, o al suelo en el que la planta (o partes de la planta) se ha de plantar; a esto se alude colectivamente como "aplicar[.. ] al suelo alrededor de la planta".

La aplicación de una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar en el que la planta o parte de la planta crece o se ha de plantar se puede lograr por cualquier medio convencional, p. ej., mediante aplicación por pulverización, por goteo, por pulverización (aplicación de polvo), por aplicación de una espuma (aplicación de espuma), etc.

Para aplicaciones en partes superficiales de una planta, la aplicación por pulverización o aplicación en polvo puede resultar particularmente interesante.

Para aplicaciones al suelo alrededor de la planta, pueden ser interesantes la aplicación por pulverización, la aplicación por goteo, la aplicación de polvo y la aplicación de espuma. En una variante, la aplicación al suelo alrededor de una planta es por aplicación en surco por goteo o aplicación de espuma en relación con la plantación de semillas.

En algunas realizaciones, la infección patógena puede ser provocada por uno o una combinación de:

Hongos de la roya de la soja (Phakopsora pachyrhizi , Phakopsora meibomiae) y la planta es la soja; Moho gris (Botrytis cinerea) y la planta es uva, fresa o pimiento;

Alternaria spp. (p. ej., Alternaria solani) y la planta es tomate o patata;

Roya (Uromyces appendiculatus) y la planta es haba común;

Microsphaera diffusa (cenicilla) y la planta es soja;

Mycosphaerella fijiensis (sigatoga negra) o Fusariurn oxysporum f sp. cubense (enfermedad de Panamá) y la planta es banano;

Xanthomonas spp. o Xanthomonas oryzae pv. oryzae y la planta es arroz;

Xanthomonas axonopodis y la planta es mandioca;

Xanthomonas campestris y la planta es tomate;

Cenicilla y la planta es una cucurbitácea;

Moho blanco del sur y la planta comprende cacahuete;

Mancha foliar (Cercospora/Cercosporidium) y la planta es cacahuete;

Fusarium graminearum (fusariosis de la espiga del trigo) y la planta es trigo;

Mycosphaerella graminicola (mancha por Septoria tritici) y la planta es trigo;

Stagonospora nodorum (mancha de gluma y mancha de Septoria nodorum), y la planta es trigo;

Erwinia amylovora, y la planta se selecciona de manzana, pera y otros frutos de pepita;

Venturia inaequalis, y la planta se selecciona de manzana, pera y otras frutas de pepita;

Sclerotinia sclerotiorum (moho blanco) y la planta es ejote o patata;

Sclerotinia homeocarpa (mancha de dólar) y la planta comprende césped; o

Rhizoctonia solani y la planta se selecciona de cultivos de trigo, arroz, césped, soja, maíz, legumbres y hortalizas.

En una variante de la realización arriba mencionada, el o los patógenos de la planta se controlan mediante la aplicación de la composición a las partes superficiales de la planta.

En realizaciones de esta memoria, la composición se aplica en una cantidad eficaz. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de la composición que es suficiente para controlar al menos un patógeno de plantas. En realizaciones, la composición se aplica de manera que la tasa de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está en el intervalo de 4,0 x 109 UFC/ha a 4,0 x 1017 UFC/ha, tal como 4,0 x 1010 UFC/ha a 4,0 x 1016 UFC/ha. Típicamente, Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 se aplica en forma de esporas del mismo, en lugar de células vegetativas. En algunas realizaciones del método de la invención, la composición está en forma líquida, y Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en la composición a una concentración de 1,0 x 106 UFC/mL a 1,0 x 1012 UFC/mL, tal como de 1,0 x 107 UFC/mL a 1,0 x 1011 UFC/mL.

En realizaciones en las que la composición aplicada está en forma líquida, la composición puede estar en forma de una formulación líquida seleccionada de suspensiones, concentrados de suspensión (SC), dispersiones de aceite (OD) y espumas.

En otras realizaciones del método de la invención, la composición está en forma sólida, y el Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en la composición a una concentración de 1,0 x 106 UFC/g a 1,0 x 1012 UFC/g, tal como de 1,0 x 107 UFC/g a 1,0 x 1011 UFC/g.

En realizaciones en las que la composición aplicada está en forma sólida, la composición puede estar en forma de una formulación seleccionada de polvos espolvoreables (DP), gránulos dispersables en agua (WG) y polvos humectables (WP).

En algunas realizaciones, la composición aplicada comprende iturina y fengicina en una relación ponderal relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0, tal como de 1,5:1,0 a 2,8:1,0 y todas las medidas dentro de intervalos de este tipo. La naturaleza, realizaciones y variantes de la composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 utilizada en el método de la invención se describirán con más detalle más adelante bajo el título “Composiciones agrícolas de la invención".

Composiciones agrícolas de la invención

La composición tal como se describe en esta memoria y las realizaciones de la misma detalladas en lo que sigue son particularmente útiles en el método arriba descrito en esta memoria, pero no se limitan a una aplicación de este tipo. Las composiciones descritas bajo el presente encabezamiento pretenden ser composiciones listas para usar. En algunas realizaciones, puede ser conveniente preparar composiciones concentradas adecuadas para la dilución antes del uso para llegar a las composiciones agrícolas listas para usar, p. ej., para reducir los costos de transporte o para prolongar la vida útil, etc. Formulaciones concentradas de este tipo se describen más adelante bajo el encabezamiento "Concentrados para composiciones agrícolas".

Por lo tanto, la presente invención se refiere, entre otros, a una composición agrícola que comprende: a) Bacillus amyloliquefaciens, y b) un medio de formulación adecuado en agricultura.

La expresión "adecuado en agricultura" pretende significar que el medio de formulación como tal (es decir, sin inclusión deliberada alguna de otros ingredientes activos) no debe tener efectos perjudiciales significativos en la planta o plantas a las que se pretende aplicar la composición agrícola. Por consiguiente, "medio de formulación adecuado en agricultura" incluye cualquier medio de formulación en el que se pueda colocar Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 para facilitar el transporte de una cantidad eficaz a aplicar a la parte de la planta de interés, y que sea adecuado para uso agrícola.

El medio de formulación puede incluir un soporte líquido o sólido, así como uno o más componentes adicionales seleccionados de agentes tensioactivos, conservantes, humectantes, desecantes, agentes antiespumantes, agentes anticongelantes, dispersantes, aglutinantes, emulsionantes, colorantes, protectores contra la luz ultravioleta, agentes de control de deriva, auxiliares de deposición por pulverización, agentes de flujo libre, tampones y espesantes, y combinaciones de los mismos.

Ejemplos de soportes líquidos incluyen agua, aceites animales y derivados, aceites minerales y derivados, aceites vegetales y derivados, alcoholes, polioles, triglicéridos, polímeros naturales y sintéticos y derivados no iónicos de los mismos. Ejemplos de soportes sólidos incluyen minerales, arcillas, sílices, sales inorgánicas y orgánicas, azúcares, almidón, ceras, caparazones de animales molidos, material botánico incluyendo fibras, caparazones de cáscaras y harina.

En realizaciones, el medio de formulación comprende un soporte adecuado y un agente tensioactivo. En variantes del mismo, el medio de formulación comprende, además, un tampón.

En alguna realización, la composición agrícola comprende iturina y fengicina en una relación ponderal relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0, tal como de 1,5:1,0 a 2,8:1,0, incluyendo todas las medidas dentro de intervalos de este tipo.

En algunas realizaciones, la composición puede estar en forma de una formulación seleccionada de suspensiones, concentrados de suspensión (SC), dispersiones de aceite (OD), espumas, polvos espolvoreables (DP), gránulos dispersables en agua (WG) y polvos humectables (WP).

Típicamente, Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 se incluye en formulaciones adecuadas en forma de esporas del mismo, en lugar de en forma de células vegetativas. Por ejemplo, las formulaciones pueden incluir una parte alícuota de un caldo de fermentación que comprende esporas de FCC1256 o un producto de fermentación procesado que comprende esporas de FCC1256, tal como un concentrado de un caldo de fermentación o un caldo de fermentación secado por pulverización.

En algunas realizaciones, la composición agrícola está en forma líquida y Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en la composición a una concentración de 1,0 x 106 UFC/mL a 1,0 x 1012 UFC/mL, tal como de 1,0 x 107 UFC/mL a 1,0 x 1011 UFC/mL.

En realizaciones en las que la composición agrícola está en forma líquida, la composición puede estar en forma de una formulación seleccionada de suspensiones, concentrados en suspensión (SC), dispersiones de aceite (OD) y espumas.

En otras realizaciones, la composición agrícola está en forma sólida, y Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en la composición a una concentración de 1,0 x 106 UFC/g a 1,0 x 1012 UFC/g, tal como de 1,0 x 107 UFC/g a 1,0 x 1011 UFC/g.

En realizaciones en las que la composición agrícola está en forma sólida, la composición puede estar en forma de una formulación seleccionada de polvos espolvoreables (DP), gránulos dispersables en agua (WG) y polvos humectables (WP).

En los métodos para suministrar FCC1256 en combinación con un insecticida, fungicida, nematicida, bactericida o regulador del crecimiento vegetal microbiano, biológico o químico, la composición puede estar en forma de un líquido, una dispersión de aceite, un polvo, un polvo humectable seco, un gránulo untable o un gránulo humectable seco.

En algunas realizaciones, las composiciones agrícolas pueden incluir, además del medio de formulación, además uno o una combinación de un insecticida, fungicida, nematicida, bactericida, regulador del crecimiento vegetal o promotor del crecimiento microbiano o químico, p. ej.:

Insecticidas: A0) diversos insecticidas, incluidos agrigata, fosfuro de al, amblyseius, aphelinus, aphidius, aphidoletes, artimisinina, autographa califomica NPV, azocyclotin, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis spp. aizawai, Bacillus thuringiensis spp. kurstaki, Bacillus thuringiensis, Beauveria bassiana, beta-ciflutrina, bisultap, broflutrinato, bromofos-e, bromopropilato, capsaicina, cartap, extracto de celastrus, clorbenzuron, cloretoxifos, clorfluazuron, cnidiadina, criolita, cianofos, cihalotrina, cihexatina, cipermetrina, dacnusa, DCIP, dicloropropeno, dicofol, diglifus, diglifus+dacnusa, dimetacarb, emamectina, encarsia, EPN, eretmocerus, dibromuro de etileno, eucaliptol, fenazaquin, fenobucarb (BPMC), fenpiroximato, flubrocitrinato, flufenzina, formetanato, formotion, furatiocarb, gamma-cihalotrina, jugo de ajo, virus de la granulosis, harmonia, heliothis armigera NPV, ácido indol-3-ilbutírico, yodometano, hierro, isocarbofos, isofenfos, isofenfos-m, isoprocarb, isotioato, lindano, liuyangmicina, matrina, mefosfolán, metaldehído, metarhizium-anisopliae, metamidofos, metolcarb (MTMC), mirex, m-isotiocianato, monosultap, myrothecium verrucaria, naled, neochrysocharis formosa, nicotina, nicotinoides, ometoato, orius, oximatrina, paecilomyces, paratión-e, pasteuria, feromonas, ácido fosforoso, photorhabdus, phoxim, phytoseiulus, pirimiphos-e, Plutella xylostella GV, virus de la polihedrosis, extractos de polifenoles, oleato de potasio, profenofos, prosuler, protiofos, piraclofos, piretrinas, piridafentión, pirimidifeno, piriproxifeno, extracto de quillay, quinometionato, rotenona, saponina, saponozit, fluosilicato de sodio, sulfluramida, azufre, tebupirimfos, teflutrina, temefos, tetradifon, tiofanox, tiometon, transgénicos (p. ej., Cry3Bb1), triazamato, tricoderma, tricogramma, triflumuron, verticillium, vertrine, kappa-bifentrina, kappa-teflutrina, dicoromezotiaz, broflanilida, piraziflumid; A1) la clase de carbamatos, incluyendo aldicarb, alanicarb, benfuracarb, carbarilo, carbofuran, carbosulfan, metiocarb, metomilo, oxamilo, pirimicarb, propoxur y tiodicarb; A2) la clase de organofosforados, incluyendo acefato, azinfos-etilo, azinfos-metilo, clorfenvinfos, clorpirifos, clorpirifos-metilo, demetón-S-metilo, diazinón, diclorvos/DDVP, dicrotofos, dimetoato, disulfotón, etión, fenitrotión, fentión, isoxatión, malatión, metamidafos, metidatión, mevinfos, monocrotofos, oximetoato, oxidemetón-metilo, paratión, paratión-metilo, fentoato, forato, fosalona, fosmet, fosfamidón, pirimifosmetilo, quinalfos, terbufos, tetraclorvinfos, triazofos y triclorfón; A3) la clase de compuestos organoclorados de ciclodieno tales como endosulfán; A4) la clase de fiproles, incluyendo etiprol, fipronil, pirafluprol y piriprol; A5) la clase de neonicotinoides, incluyendo acetamiprid, clotianidina, dinotefurano, imidacloprid, nitenpiram, tiacloprid y tiametoxam; A6) la clase de espinosinas, tales como spinosad y spinetoram; A7) activadores del canal de cloruro de la clase de las mectinas, incluyendo abamectina, benzoato de emamectina, ivermectina, lepimectina y milbemectina; A8) imitadores de hormonas juveniles, tales como hidropreno, kinopreno, metopreno, fenoxicarb y piriproxifeno; A9) bloqueadores selectivos de la alimentación de homópteros, tales como pimetrozina, flonicamid y pirifluquinazon; A10) inhibidores del crecimiento de ácaros, tales como clofentezina, hexitiazox y etoxazol; A11) inhibidores de la ATP sintasa mitocondrial, tales como diafentiurón, óxido de fenbutatina y propargita; desacopladores de la fosforilación oxidativa tales como clorfenapir; A12) bloqueadores del canal del receptor nicotínico de acetilcolina, tales como bensultap, hidrocloruro de cartap, tiociclam y tiosultap sódico; A13) inhibidores de la biosíntesis de quitina tipo 0 de la clase de las benzoilureas, incluyendo bistrifluron, diflubenzuron, flufenoxuron, hexaflumuron, lufenuron, novaluron y teflubenzuron; A14) inhibidores de la biosíntesis de quitina tipo 1 tales como buprofezina; A15) disruptores de la muda tales como ciromazina; A16) agonistas del receptor de ecdisona, tales como metoxifenozida, tebufenozida, halofenozida y cromafenozida; A17) agonistas del receptor de octopamina tales como amitraz; A18) inhibidores del transporte de electrones del complejo mitocondrial piridaben, tebufenpirad, tolfenpirad, flufenerim, cienopirafen, ciflumetofen, hidrametilnona, acequinocil o fluacripirim; A19) bloqueadores del canal de sodio dependientes de la tensión, tales como indoxacarb y metaflumizone; A20) inhibidores de la síntesis de lípidos, tales como espirodiclofeno, espiromesifeno y espirotetramat; A21) moduladores de los receptores de rianodina de la clase de las diamidas, incluyendo flubendiamida, los compuestos de ftalamida (R)-3-cloro-N1-{2-metil-4-[1,2,2,2-tetrafluor-1 - (trifluormetil)etil]fenil}-N2-(1 -metil-2-metilsulfoniletil)ftalamida y (S)-3-cloro-N1 -{2-metil-4-[1,2,2,2-tetrafluor-1 -(trifluormetil)etil]fenil}-N2-(1 -metil-2-metilsulfoniletil)ftalamida, clorantraniliprol y ciantraniliprol; A22) compuestos de modo de acción desconocido o incierto, tales como azadiractina, amidoflumet, bifenazato, fluensulfona, butóxido de piperonilo, piridalilo, sulfoxaflor; o A23) moduladores del canal de sodio de la clase de los piretroides, incluyendo acrinatrina, aletrina, bifentrina, ciflutrina, lambda-cihalotrina, cipermetrina, alfacipermetrina, beta-cipermetrina, zeta-cipermetrina, deltametrina, esfenvalerato, etofenprox, fenpropatrina, fenvalerato, flucitrinato, tau-fluvalinato, permetrina, silafluofen y tralometrina.

Fungicidas/bacteriocidas: B0) benzovindiflupir, anitiperonosporico, ametoctradina, amisulbrom, sales de cobre (p. ej., hidróxido de cobre, oxicloruro de cobre, sulfato de cobre, persulfato de cobre), boscalid, tiflumazida, flutianil, furalaxil, tiabendazol, benodanil, mepronil, isofetamid, fenfuram, bixafen, fluxapiroxad, penflufen, sedaxano, coumoxiestrobina, enoxaestrobina, flufenoxiestrobina, piraoxiestrobina, pirametoestrobina, triclopiricarb, fenaminestrobina, metominoestrobina, piribencarb, meptildinocap, acetato de fentin, cloruro de fentin, hidróxido de fentin, oxitetraciclina, clozolinato, cloroneb, tecnazeno, etridiazol, yodocarb, protiocarb, Bacillus subtilis, extracto de Melaleuca alternifolia, extracto de Lupinus albus doce, polipéptido BLAD, pirisoxazol, oxpoconazol, etaconazol, fenpirazamina, naftifina, terbinafina, validamicina, pirimorfo, valifenalato, ftalida, probenazol, isotianil, laminarina, extracto de Reynoutria sachalinensis, ácido fosforoso y sales, tecloftalam, triazóxido, piriofenona, aceites orgánicos, bicarbonato de potasio, clorotalonil, fluoroimida; B1) azoles, incluyendo bitertanol, bromuconazol, ciproconazol, difenoconazol, diniconazol, enilconazol, epoxiconazol, fluquinconazol, fenbuconazol, flusilazol, flutriafol, hexaconazol, imibenconazol, ipconazol, metconazol, miclobutanilo, penconazol, propiconazol, protioconazol, simeconazol, triadimefón, triadimenol, tebuconazol, tetraconazol, triticonazol, procloraz, pefurazoato, imazalil, triflumizol, ciazofamid, benomilo, carbendazim, tiabendazol, fuberidazol, etaboxam, etridiazol e himexazol, azaconazol, diniconazol-M, oxpoconazol, paclobutrazol, uniconazol, 1 -(4-cloro-fenil)-2-([1,2,4]triazol-1 -il)-cicloheptanol y sulfato de imazalil; B2) estrobilurinas, incluyendo azoxiestrobina, dimoxiestrobina, enestroburina, fluoxaestrobina, kresoxim-metil, metominoestrobina, orisaestrobina, picoxiestrobina, piracloestrobina, trifloxiestrobina, enestroburina, (2-cloro-5-[1-(3-metilbenciloxiimino)etil]bencil)carbamato de metilo, (2-cloro-5-[1-(6-metilpiridin-2-ilmetoxiimino)etil]bencil)carbamato de metilo y 2-(orto-(2,5-dimetilfeniloximetileno)-fenil)-3-metoxiacrilato de metilo, 2-(2-(6-(3-cloro-2-metil-fenoxi)-5-fluoro-pirimidin-4-iloxi)-fenil)-2-metoxiimino-N-metilacetamida y éster metílico del ácido 3-metoxi-2-(2-(N-(4-metoxi-fenil)-ciclopropanocarboximidoilsulfanilmetil)-fenilo)-acrílico; B3) carboxamidas, incluyendo carboxina, benalaxil, benalaxil-M, fenhexamida, flutolanil, furametpir, mepronil, metalaxil, mefenoxam, ofurace, oxadixil, oxicarboxina, pentiopirad, isopirazam, tifluzamida, tiadinil, 3,4-dicloro-N-(2- cianofenil)isotiazol-5-carboxamida, dimetomorf, flumorf, flumetover, fluopicolida (picobenzamid), zoxamida, carpropamid, diclocimet, mandipropamid, N-(2-(4-[3-(4-clorofenil)prop-2-iniloxi]-3-metoxifenil)etil)-2-metanosulfonil-amino-3-metilbutiramida, N-(2-(4-[3-(4-cloro-fenil)prop-2-iniloxi]-3-metoxi-fenil)etil)-2-etanosulfonilamino-3-metilbutiramida, 3-(4-clorofenil)-3-(2-isopropoxicarbonil-amino-3-metil-butirilamino)propionato de metilo, N-(4’-bromobifenil-2-il)-4-difluorometil-metiltiazol-5-carboxamida, N-(4’-trifluorometil-bifenil-2-il)-4-difluorometil-2-metiltiazol-5-carboxamida, N-(4’-cloro-3’-fluorobifenil-2-il)-4-difluorometil-2-metil-tiazol-5-carboxamida, N-(3\4’-dicloro-4-fluorobifenil-2-il)-3-difluoro-metil-1-metil-pirazolo-4-carboxamida, N-(3’,4’-dicloro-5-fluorobifenil-2-il)-3-difluorometil-1-metilpirazolo-4-carboxamida, N-(2-ciano-fenil)-3,4-dicloroisotiazol-5-carboxamida, 2-amino-4-metiltiazol-5-carboxanilida, 2-cloro-N-(1,1,3-trimetil-indan-4-il)-nicotinamidi, N-(2-(1,3-dimetilbutil)-fenil)-1,3-dimetil-5-fluoro-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(4’-cloro-3’,5-difluoro-bifenil-2-il)-3-difluorometil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(4’-cloro-3’,5-difluoro-bifenil-2-il)-3-trifluorometil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(3’,4’-dicloro-5-fluoro-bifenil-2-il)-3-trifluorometil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(3’,5-difluoro-4’-metil-bifenil-2-il)-3-difluorometil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(3’,5-difluoro-4’-metil-bifenil-2-il)-3-trifluorometil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(cis-2-biciclopropil-2-il-fenil)-3-difluorometil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, N-(trans-2-biciclopropil-2-il-fenil)-3-difluoro-metil-1 -metil-1 H-pirazolo-4-carboxamida, fluopiram, N-(3-etil-3,5-5-trimetil-ciclohexil)-3-formilamino-2-hidroxibenzamida, oxitetraciclina, siltiofam, N-(6-metoxi-piridin-3-il) ciclopropanocarboxamida, 2-yodo-N-fenil-benzamida, N-(2-biciclo-propil-2-il-fenil)-3-difluormetil-1 -metilpirazol-4-ilcarboxamida; B4) compuestos heterocíclicos, incluyendo fluazinam, pirifenox, bupirimato, ciprodinil, fenarimol, ferimzona, mepanipirim, nuarimol, pirimetanil, triforina, fenpiclonil, fludioxonil, aldimorf, dodemorf, fenpropimorf, tridemorf, fenpropidin, iprodiona, procimidona, vinclozolina, famoxadona, fenamidona, octilinona, probenazol, 5-cloro-7-(4-metil-piperidin-1-il)-6-(2,4,6-trifluorofenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirimidina, anilazina, diclomezina, piroquilon, proquinazid, triciclazol, 2-butoxi-6-yodo-3-propilcromen-4-ona, acibenzolar-S-metil, captafol, captan, dazomet, folpet, fenoxanil, quinoxifen, N,N-dimetil-3-(3-bromo-6-fluoro-2-metilindol-1 -sulfonil)-[1,2,4]triazol-1 -sulfonamida, 5-etil-6-octil-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirimidin-2,7-diamina, 2,3,5,6-tetracloro-4-metanosulfonil-piridina, 3,4,5-tricloro-piridina-2,6-di-carbonitrilo, N-(1 -(5-bromo-3-cloropiridin-2-il)-etil)-2,4-dicloro-nicotinamida, N-((5-bromo-3-cloropiridin-2-il)-metil)-2,4-dicloro-nicotinamida, diflumetorim, nitrapirin, acetato de dodemorf, fluoroimid, blasticidin-S, quinometionato, debacarb, difenzoquat, difenzoquatmetilsulfato, ácido oxolínico y piperalina; B5) carbamatos, incluyendo mancozeb, maneb, metam, metasulfocarb, metiram, ferbam, propineb, tiram, zineb, ziram, dietofencarb, iprovalicarb, bentiavalicarb, propamocarb, hidrocloruro de propamocarb, N-(1-(1-(4-cianofenil)-etanosulfonil)but-2-il)carbamato de 4-fluorofenilo, 3-(4-cloro-fenil)-3-(2-isopropoxicarbonilamino-3-metil-butirilamino)propanoato de metilo; o B6) otros fungicidas, incluyendo guanidina, dodina, base libre de dodina, iminoctadina, guazatina, kasugamicina, oxitetraciclina y sus sales, estreptomicina, polioxina, validamicina A, binapacril, dinocap, dinobuton, ditianona, isoprotiolano, sales de fentina, edifenfos, iprobenfos, fosetil, fosetil-aluminio, ácido fosforoso y sus sales, pirazofos, tolclofos-metil, diclofluanida, flusulfamida, hexaclorobenceno, ftalida, pencicuron, quintozeno, tiofanato, tiofanato-metil, tolilfluanida, ciflufenamida, cimoxanil, dimetirimol, etirimol, furalaxil, metrafenona y espiroxamina, acetato de guazatina, triacetato de iminoctadina, tris(albesilato) de iminoctadina, hidrocloruro de kasugamicina hidrato, diclorofen, pentaclorofenol y sus sales, N-(4-cloro-2-nitro-fenil)-N-etil-4-metil-bencenosulfonamida, dicloran, nitrotal-isopropilo, tecnazen, bifenili, bronopol, difenilamina, mildiomicina, oxicobre, prohexadiona calcio, N-(ciclopropilmetoxi-imino-(6-difluorometoxi-2,3-difluorofenil)-metil)-2-fenil acetamida, N’-(4-(4-cloro-3-trifluorometil-fenoxi)-2,5-dimetil-fenil)-N-etil-N-metil formamidina, N’-(4-(4-fluoro-3-trifluorometil-fenoxi)-2,5-dimetil-fenil)-N-etil-N-metil formamidina, N’-(2-metil-5-trifluormetil-4-(3-trimetilsilanil-propoxi)-fenil)-N-etil-N-metilformamidina, N’-(5-difluormetil-2-metil-4-(3-trimetilsilanil-propoxy)-fenil)-N-etil-N-metil formamidina y fluindapir.

Nematicidas: C1) Benomilo, cloetocarb, aldoxicarb, tirpato, diamidafos, fenamifos, cadusafos, diclofentiona, etoprofos, fensulfotiona, fostiazato, heterofos, isamidofof, isazofos, fosfocarb, tionazin, imiciafos, mecarfon, acetoprol, benclotiaz, cloropicrina, dazomet, fluensulfona, 1,3-dicloropropeno (telona), disulfuro de dimetilo, metam sodio, metam potasio, sal de metam (todos los generadores MITC), bromuro de metilo, enmiendas biológicas del suelo (p. ej., semillas de mostaza, extractos de semillas de mostaza), fumigación con vapor de suelos, isotiocianato de alilo (AITC), sulfato de dimetilo, furfual (aldehído).

Reguladores del crecimiento vegetal: D1) Antiauxinas, tales como ácido clofíbrico, ácido 2,3,5-tri-yodobenzoico; D2) Auxinas, tales como 4-CPA, 2,4-D, 2,4-D^b, 2,4-DEP, diclorprop, fenoprop, IAA, IBA, naftalenoacetamida, ácidos anaftalenoacéticos, 1-naftol, ácidos naftoxiacéticos, naftenato de potasio, naftenato de sodio, 2,4,5-T; D3) citoquininas, tales como 2iP, benciladenina, alcohol 4-hidroxifenetílico, kinetina, zeatina; D4) defoliantes, tales como cianamida cálcica, dimetipina, endotal, etefón, merfos, metoxuron, pentaclorofenol, tidiazuron, tribufos; D5) inhibidores de etileno, tales como aviglicina, 1-metilciclopropeno; D6) liberadores de etileno, tales como ACC, etacelasil, etefón, glioxima; D7) gametocidas, tales como fenridazón, hidrazida maleica; D8) giberelinas, tales como giberelinas, ácido giberélico; D9) inhibidores del crecimiento, tales como ácido abscísico, ancimidol, butralina, carbarilo, clorfonio, clorprofam, dikegulac, flumetralina, fluoridamida, fosamina, glifosina, isopirimol, ácido jasmónico, hidrazida maleica, mepiquat, piproctanilo, prohidrojasmón, profam, tiaojiean, ácido 2,3,5-triyodobenzoico; D10) morfactinas, tales como clorflureno, clorflurenol, diclorflurenol, flurenol; D11) retardadores del crecimiento, tales como clormequat, daminozida, flurprimidol, mefluidida, paclobutrazol, tetciclacis, uniconazol; D12) estimuladores del crecimiento, tales como brasinolida, brasinolida-etilo, DCPTA, forclorfenuron, himexazol, prosuler, triacontanol; D13) reguladores del crecimiento vegetal no clasificados, tales como bachmedesh, benzofluor, buminafos, carvona, cloruro de colina, ciobutida, clofencet, cianamida, ciclanilida, cicloheximida, ciprosulfamida, epocoleona, etillozato, etileno, fufentiourea, furalano, heptopargil, holosulf, inabenfida, karetazan, arseniato de plomo, metasulfocarb, prohexadiona, pidanon, sintofen, triapentenol, trinexapac.

Promotores del crecimiento vegetal: E1).

Concentrados para composiciones agrícolas

La presente invención también se refiere a un concentrado para una composición agrícola, comprendiendo el concentrado: a) Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y b) un medio de formulación adecuado en agricultura, p. ej., que comprende un soporte adecuado, un agente tensioactivo y, opcionalmente, un tampón.

Las formulaciones agrícolas pueden obtenerse mediante la dilución adecuada de los concentrados con un soporte líquido adecuado como se especifica más arriba para las composiciones agrícolas, en particular un soporte acuoso. La expresión “soporte acuoso” significa un soporte líquido predominantemente basado en agua y que comprende hasta 5 % en peso de constituyente(s) no acuoso(s). En algunas realizaciones, la dilución se realiza utilizando agua solamente.

Típicamente, la dilución es a una relación ponderal de concentrado a soporte de 1:10 a 1:5000, tal como de 1:20 a 1:1000.

En realizaciones, el concentrado es una formulación seleccionada de concentrados de suspensión (SC o SD), suspensiones de volumen ultrabajo (SU), suspensiones de tratamiento de semillas (FS), dispersiones de aceite (OD), pastas (PA), geles (GD), gránulos dispersables en agua (WG), polvos espolvoreables (DP), tabletas dispersables en agua (WT), polvos dispersables en agua para tratamiento de lodos (WS) y polvos humectables (WP).

En algunas realizaciones, el concentrado está en forma líquida y Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en el concentrado a una concentración de 1,0 x 108 UFC/mL a 1,0 x 1014 UFC/mL, tal como de 1,0 x 109 UFC/mL a1,0 x 1013 UFC/mL.

En realizaciones en las que el concentrado está en forma líquida, el concentrado puede estar en forma de una formulación seleccionada de concentrados en suspensión (SC o SD), suspensiones de volumen ultrabajo (SU), suspensiones de tratamiento de semillas (FS), dispersiones de aceite (OD ), pastas (PA), geles (GD), en particular, concentrados en suspensión (SC) y dispersiones de aceite (OD).

En otras realizaciones, el concentrado está en forma sólida, y Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en el concentrado a una concentración de 1,0 x 108 UFC/g a 1,0 x 1014 UFC/g, tal como de 1,0 x 109 UFC/g a 1,0 x 1013 UFC/g.

En realizaciones en las que el concentrado está en forma sólida, el concentrado puede estar en forma de una formulación seleccionada de gránulos dispersables en agua (WG), polvos espolvoreables (DP), tabletas dispersables en agua (WT), polvos dispersables en agua para el tratamiento en suspensión (WS) y polvos humectables (WP), en particular polvos humectables (WP) y gránulos dispersables en agua (WG).

En algunas realizaciones, el concentrado comprende iturina y fengicina en una relación ponderal relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0, tal como de 1,5:1,0 a 2,8:1,0, incluyendo todas las medidas dentro de intervalos de este tipo.

EJEMPLOS

Los siguientes Ejemplos se han incluido para proporcionar una guía a un experto ordinario en la técnica para poner en práctica realizaciones representativas de la materia objeto descritas en esta memoria. Considerando la presente invención y el nivel general de experiencia en la técnica, los expertos pueden apreciar que los siguientes Ejemplos pretenden ser solo ilustrativos y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la presente materia objeto descrita.

Métodos

Identificación de iturína, fengicina y surfactina

Se analizaron muestras mediante LC-DAD de fase inversa utilizando una columna C18 con un gradiente de selección que permitió la detección simultánea de las tres familias de lipopéptidos. Las fases móviles consistieron en agua y acetonitrilo premezclados con ácido fórmico al 0,1 %. Los compuestos se identificaron en función de sus tiempos de retención y espectros UV en comparación con patrones auténticos.

Determinación de unidades formadoras de colonias (UFC)

Las UFC de una muestra (expresadas como UFC/mL para muestras líquidas y como UFC/g para muestras sólidas) se pueden determinar de acuerdo con BS EN 15784:2009 ("Animal feeding stuffs. Isolation and enumeration of presumptive Bacillus spp.

Ejemplo 1

Identificación de un Aislado Bacteriano como Bacillus amyloliquefaciens mediante Análisis de la Secuencia

Se aisló una cepa bacteriana asociada a plantas, designada aquí como Bacillus amyloliquefaciens FCC1256, de suelo de planta de fresa de Autryville, NC, EE.UU. La cepa de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 fue depositada el 12 de mayo de 2015 bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patentes en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en Manassas, Virginia, EE.UU. y lleva el N° de Acceso de Patente PTA-122162.

Inicialmente, se extrajeron los datos de la secuencia del genoma completo de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 para identificar los genes marcadores fenotípicos centrales que se utilizan rutinariamente para la asignación filogenética. Los genes que se eligen para este análisis son ambos de una sola copia, solo existe una copia del gen en el genoma y tiene una función constitutiva central para la célula. Los seis genes que se eligieron del archivo de anotaciones RAST fueron la subunidad beta de la ARN polimerasa dirigida por ADN (rpoB), la recombinasa A de reparación de ADN (recA 2), la proteína S de reparación de errores de emparejamiento de ADN (mutS), la proteína facilitadora de la absorción de glicerol (glpF), la subunidad B de ADN girasa (gyrB) y chaperona K de ADN (dnaK). Para cada uno de los genes seleccionados, se utilizaron cepas representativas de genomas para el género Bacillus (agregado de Bacillus subtilis y agregado de Bacillus cereus) para comparación. Para tal fin, FCC1256 se identificó como una nueva cepa de Bacillus amyloliquefaciens a través del análisis de las secuencias de ARNr 16S y genes rpoB altamente conservados.

También se incluye para cada uno de los genes una secuencia de grupo externo. Estas secuencias de grupos externos se extraen de genomas de bacterias filogenéticamente divergentes para proporcionar una indicación de la solidez de los cálculos filogenéticos.

Cada uno de los genomas de referencia se descargó primero de NCBI y se anotó en la tubería de anotación RAST. Cada una de las tablas de anotación generadas se buscó posteriormente para identificar cada uno de los genes constitutivos seleccionados y las secuencias de cada uno de los genes se copiaron y pegaron en un nuevo alineamiento de nucleótidos en el programa de software MEGA 5.2. Una vez que cada una de las secuencias de genes se cargó en el alineamiento, todas las secuencias de genes específicas se alinearon utilizando el algoritmo de alineamiento ClustalW. Después de alinear cada uno de los grupos de genes, las secuencias se recortaron para garantizar que cada secuencia tuviera el mismo número de nucleótidos. Después de la etapa de recorte, las secuencias alineadas se utilizaron para crear árboles filogenéticos.

Cada uno de los árboles filogenéticos se replicó 1000 veces para evaluar la solidez de la agrupación filogenética. Para cada uno de los árboles, FCC1256 se alinea y se agrupa en árboles con otras cepas de Bacillus amyloliquefaciens, tales como DSM7, RTI301 y RTI472. Estos resultados indican con gran confianza que FCC1256 es de hecho un Bacillus amyloliquefaciens.

También se determinó el efecto antagónico de FCC1256 contra un cierto número de patógenos. La Tabla 1 que figura a continuación proporciona un resumen de los resultados.

Tabla 1. Propiedades antagónicas de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 contra los principales patógenos de plantas

Además, se realizaron experimentos para determinar las actividades antagónicas de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 in vitro y en diversas plantas bajo condiciones variables. Los resultados experimentales se proporcionan en los Ejemplos 3, 5, 6 y 7 que figuran más adelante.

Los experimentos demuestran, entre otros, la capacidad de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 de conferir protección contra o controlar la infección patógena de las plantas en comparación con Serenade^®disponible comercialmente (Bayer CropScience, Inc.) que contiene como ingrediente activo Bacillus velezensis QS T713. Ejemplo 2

Fermentación de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256

Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 se sembró por primera vez a partir de una reserva de glicerol en un medio sólido 869, que contenía (en 1 L): 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura, 1 g de D-glucosa, 0,3 g de CaCl²y 15 g de agar en polvo. Después de incubar a 30 °C durante la noche, se recogió una sola colonia para inocular un matraz de agitación de 250 mL con 50 mL de medio que contenía (en 1 L): 10 g de peptona, 6 g de extracto de levadura, 2 g de KCl y 0,1 g de MgSÜ4-7H2O. Después de someter en autoclave, se añadieron al medio las siguientes soluciones: 5 mL de glucosa al 20 %, 1 mL de CaCl²1 M, 1 mL de MnCl²0,1 M y 10 pL de FeSO40,1 M. El matraz de agitación se incubó en una incubadora de agitación a 30 °C y 200 rpm hasta que la DO600 alcanzó 1,0. Los sedimentos celulares se recogieron para la inoculación de fermentadores (volumen de trabajo 1,5 L, Bioflo 320, Eppendorf). La fermentación se realizó a 30°C, la velocidad de agitación fue de 800 rpm y la tasa de suministro de aire fue de 2 L/min. Se tomaron muestras durante la fermentación para controlar el crecimiento celular, la esporulación celular y las concentraciones de metabolitos. Después de 168 horas de fermentación, la mayor parte de las células de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 habían esporulado y se recogió la mezcla de cultivo completa. Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y la cepa de referencia QST713 (una cepa de Bacillus velezensis obtenida de un producto comercial Serenade^®) se fermentaron en el medio de cultivo mencionado anteriormente. Utilizando la medición de DO600, se midieron los niveles de biomasa durante la fermentación. Una comparación de los perfiles de metabolitos de la cepa Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y QST713 demostró que FCC1256 produjo iturina a una tasa significativamente mayor que QST713 en las mismas condiciones.

Una evaluación adicional de los concentrados de metabolitos reveló que FCC1256 tenía una relación ponderal de iturina:fengicina:surfactina de aproximadamente 3,3:1,4:1, lo que, en potencia, contribuiría en las actividades antagónicas de la cepa contra los patógenos de las plantas.

Ejemplo 3

Propiedades Antimicrobianas de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256

Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y QST713 se sembraron en placas y se cultivaron en placas TSA durante la noche (16-18 h) a 30 ^°C. A continuación, se transfirió una única colonia en medio (medio de crecimiento H²O, 914,3 mL; NH⁴NO³, 8 g; Na2HPO4, 7,15 g; KH²PO⁴, 6,8 g; extracto de levadura, 0,5 g; ajustado a 7,5 con 4 mL de KOH 4 M; 45 mL del medio de crecimiento se transfirieron a matraces con deflectores de 250 mL y se sometieron a autoclave a 121 °C durante 15 min. Después de someter en autoclave a cada uno de los matraces se añadieron las siguientes soluciones: CaCl²0,1 M 5 pL, MnCl²0,1 M 5 pL, FeSO40,1 M 35 pL, ZnCl²0,1 M 5 pL, MgSO4 1 M 100 pL, glucosa sol. al 50 % (conc. final 40 g/L) 4 mL) y se incubó durante 168 h a 30 ^°C y bajo agitación continua (220 rpm). Las cepas se cultivaron en matraces con deflectores de 250 mL con rosca ^gL 45 (Duran^®, Alemania) y un volumen de trabajo final de 50 mL.

En total, se utilizaron 14 patógenos de plantas foliares (12 hongos y 2 bacterias) durante este estudio. Las especificaciones de los patógenos, las condiciones de crecimiento y los medios utilizados se muestran en la Tabla 2. Todos los patógenos foliares utilizados para este experimento se testaron en medio sólido de patata dextrosa agar (PDA, por sus siglas en inglés), excepto Pseudomonas syringae y Xanthomonas axonopodis, que se testaron en medio sólido de agar de soja tripticasa (TSA, por sus siglas en inglés). El tiempo de incubación de cada uno de los patógenos antes del tratamiento varió de 3 a 5 días. En el caso de Pseudomonas syringae y Xanthomonas axonopodis, en que se utilizan planchas de césped para la prueba, se preparó un cultivo durante la noche en medio 869 mientras se cultivaba Septoria tritici en caldo de patata dextrosa durante 5 días antes de la preparación del césped.

La actividad se evaluó mediante la aplicación de 20 pL de células. Todas las aplicaciones se realizaron por triplicado para todos los patógenos utilizando el material fermentado sin filtrar. Los tiempos de calificación para los patógenos fúngicos varían según la especie. El tiempo debe corresponder a que el borde de la colonia alcance un radio de aproximadamente 25 mm en las placas del punto de control. Para la evaluación se utilizó un método semicuantitativo, véase el siguiente sistema de 4 escalas (0-3), en que: 0: no se observa efecto antimicrobiano alguno; 1: efecto leve provocado pero sin zona despejada obvia; 2: una zona despejada es obvia; 3: hay una gran zona despejada. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2. Propiedades antimicrobianas de FCC1256 contra patógenos foliares

Ejemplo 4

Rasgos fenotípicos de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256

Además de las propiedades antagónicas, también se midieron diversos rasgos fenotípicos para Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 y los datos se muestran a continuación en la Tabla 3. Los ensayos se realizaron de acuerdo con los procedimientos descritos en el texto que figura a continuación de la Tabla 3.

Tabla 3. Ensayos Fenotípicos: producción de fitohormonas, acetoína y ácido indolacético (IAA, por sus siglas en inglés) y ciclo de nutrientes de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256.

Test de Acetoína. Se transfirieron 20 |uL de un cultivo iniciador en medio a 1 mL de medio Rojo de Metilo Voges Proskauer (Sigma Aldrich 39484). Los cultivos se incubaron durante 2 días a 30 °C a 200 rpm. Se mezclaron 0,5 mL de cultivo con 0,3 mL de alfa-naftol al 5 % (Sigma Aldrich N1000) seguido de 0,1 mL de kOh al 40 %. Las muestras se interpretaron después de 30 min de incubación. El desarrollo de un color rojo indicó la producción de acetoína. Se utilizaron medios no inoculados como control negativo (Sokol et al, 1979, Journal of Clinical Microbiology 9: 538 540).

Actividad de quitinasa. Se añadió quitina coloidal al 10 % en peso húmedo a medio de agar PVK modificado (10 g de glucosa, 0,2 g de cloruro de potasio, 0,5 g de sulfato de amonio, 0,2 g de cloruro de sodio, 0,1 g de sulfato de magnesio heptahidrato, 0,5 g de extracto de levadura, 2 mg de sulfato de manganeso, 2 mg de sulfato de hierro y 15 g de agar por litro, pH 7, sometido a autoclave). Las bacterias se sembraron en estas placas de quitina; zonas despejadas indicaron actividad de quitinasa (N. K. S. Murthy & Bleakley, 2012. "Simplified Method of Preparing Colloidal Chitin Used for Screening of Chitinase Producing Microorganisms". The Internet Journal of Microbiology 10(2)).

Ácido Indol-3-acético. Se transfirieron 20 |uL de un cultivo iniciador en medio a 1 mL de medio 1/10 869 complementado con 0,5 g/L de triptófano (Sigma Aldrich T0254). Los cultivos se incubaron durante 4-5 días en la oscuridad a 30°C, 200 rpm. Las muestras se centrifugaron y se mezclaron 0,1 mL de sobrenadante con 0,2 mL de reactivo de Salkowski (ácido perclórico al 35 %, FeCta 10 mM). Después de incubar durante 30 min en la oscuridad, las muestras que dieron como resultado un color rosa se registraron como positivas para la síntesis de IAA. Se utilizaron diluciones de IAA (Sigma Aldrich 15148) como comparación positiva; se utilizó medio no inoculado como control negativo (Taghavi, et al., 2009, Applied and Environmental Microbiology 75: 748-757).

Actividad de Proteasa. Las bacterias se sembraron en placas en medio 869 complementado con leche al 10%. Las zonas despejadas indicaron la capacidad de descomponer proteínas que sugerían actividad de proteasa (Sokol et al, 1979, Journal of Clinical Microbiology 9: 538-540).

Test de Solubilización de Fosfatos. Las bacterias se sembraron en medio de agar Pikovskaya (PVK) que consistía en 10 g de glucosa, 5 g de trifosfato de calcio, 0,2 g de cloruro de potasio, 0,5 g de sulfato de amonio, 0,2 g de cloruro de sodio, 0,1 g de sulfato de magnesio heptahidrato, 0,5 g de extracto de levadura, 2 mg de sulfato de manganeso, 2 mg de sulfato de hierro y 15 g de agar por litro, pH 7, sometido a autoclave. Las zonas despejadas eran indicativas de bacterias solubilizadoras de fosfato (Sharma et al., 2011, Journal of Microbiology and Biotechnology Research 1: 90-95).

Ejemplo 5

Antagonismo de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 sobre moho gris del pimiento (Botrytis cinerea)

Se realizaron estudios en el invernadero en pimientos para determinar la capacidad de FCC1256 de prevenir y/o mejorar los efectos del patógeno vegetal moho gris del pimiento (Botrytis cinerea).

Formulaciones:

Se formularon esporas aisladas de FCC1256 en caldo de fermentación agotado (SFB, por sus siglas en inglés) al 100 % a una concentración de 1 x 108 UFC/mL (es decir, un concentrado de caldo de fermentación reconstituido). Se preparó una formulación similar de FCC1256, pero con nutrientes añadidos (2 g de sacarosa 1,5 g de extracto de levadura 0,2 g de MgS04-7H2O por litro).

Esporas aisladas de Bacillus amyloliquefaciens RTI472 se formularon de manera similar en caldo de fermentación agotado (SFB) al 100 % a una concentración de 1x108 UFC/mL. Se preparó una formulación RTI472 similar con nutrientes añadidos (como anteriormente para FCC1256).

Se aplicó Serenade® Optimum (Bayer CropScience, Inc.) a una concentración de esporas de 1 x 108 UFC/mL. Se aplicó Horizon (Horizon AG-Products) a razón de 50 g de i.a./ha (Tebuconazol).

Método de Aplicación del Tratamiento:

Se utilizó un rociador de orugas para inocular plantas de pimiento de 28 días en un invernadero con cada una de las formulaciones arriba descritas. El rociador de orugas tenía una sola boquilla superior (TeeJet SS8001E Flat Fan) a una presión de 276 kPa (40 psi). La altura de la boquilla era de 36 cm (14“) por encima de las hojas de la planta de pimiento. El volumen de aplicación fue de 200 L/ha y el número de repeticiones del experimento fue de seis. Las plantas de tratamiento se inocularon una sola vez junto con las plantas de control que no recibieron tratamiento alguno.

Tasa de infección:

Un día después de la aplicación del tratamiento, las plantas de prueba se infectaron con Botrytis cinerea a una tasa de infección de 500.000 conidios/mL.

Tres días después de la infección con moho gris del pimiento (Botrytis cinerea), se evaluó el porcentaje de control de la enfermedad (media) para cada una de las formulaciones arriba descritas.

Los resultados del experimento se muestran en la Tabla 4 que figura a continuación e indican un control superior del moho gris del pimiento (Botrytis cinerea) en comparación con RTI472 y Serenade® Optimum cuando se aplica a la misma dosis.

Tabla 4. Resultados del control del moho gris del pimiento (Botrytis cinerea) con B. amyloliquefaciens FCC1256 en comparación con Serenade® Optimum y otras referencias.

Ejemplo 6

Antagonismo de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 en el Tizón del Pimiento Phytophthora

Se realizaron estudios en el invernadero en pimiento para determinar la capacidad de FCC1256 de prevenir y/o mejorar los efectos del patógeno de plantas Tizón del Pimiento (Phytophthora capsici).

Formulaciones:

Se formularon esporas aisladas de FCC1256 en caldo de fermentación agotado (SFB) al 100 % a una concentración de 1 x 108 UFC/mL (es decir, un concentrado de caldo de fermentación reconstituido). Se preparó una formulación similar de FCC1256, pero con nutrientes añadidos (2 g de sacarosa 1,5 g de extracto de levadura 0,2 g de MgSO4-7H2O por litro).

Se aplicó Serenade® Soil (Bayer CropScience, Inc.) a una concentración de esporas de 1 x 108 UFC/mL.

Ridomil Gold (Syngenta, Inc.) se aplicó a una tasa de 0,5 lb i.a./acre (0,56 kg i.a./ha) (mefenoxam).

Método de Aplicación del Tratamiento:

El suelo de plantas de pimiento de 28 días de edad se empapó con 10 mL de agua que contenía cada una de las formulaciones arriba descritas. El número de repeticiones en cada experimento fue igual a seis. Las plantas de tratamiento se inocularon una sola vez junto con las plantas de control que no recibieron tratamiento alguno.

Tasa de infección:

Para cada uno de los estudios, el mismo día de la aplicación del tratamiento, las plantas de prueba fueron infectadas con Phytophthora capsici FF157 a razón de 1 mL de 1000 zoosporas/mL.

Ocho días después de la infección de las plantas con Tizón del Pimiento Phytophthora (Phytophthora capsici) se evaluó el porcentaje de control de la enfermedad para cada uno de los tratamientos. La puntuación de gravedad de la enfermedad fue de 9,8 (0 = sano; 10 = muerto) a los 8 días después de la infección.

Los resultados demostraron un control estadísticamente superior del Tizón del Pimiento por Phytophthora con FCC1256 en comparación con Serenade® Soil cuando se aplicó a la misma dosis.

Tabla 5. Resultados del control por Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 de Tizón del Pimiento Phytophthora en comparación con Serenade® Optimum.

Ejemplo 7

Ensayo de Disco de Hoja de Pimiento desprendido que compara la actividad de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 con controles no tratados, así como con el producto comercial Serenade® Optimum.

Se cultivaron plantas de pimiento (Piper capsicum) en un invernadero a 20-25 °C con 14-16 horas de luz diurna durante 6-7 semanas. De cada una de las plantas se cosecharon cuatro hojas completamente expandidas de la parte media y se colocaron en placas de Petri con papel de filtro húmedo. Las hojas se rociaron con agua (control no tratado) o suspensión de Serenade® Optimum (control positivo) o fermentados FCC1256 (dos lotes diferentes). Luego se taparon las placas de Petri y se colocaron para la incubación en una cámara de crecimiento ajustada aprox. a las mismas condiciones de crecimiento que el invernadero.

Al día siguiente se inocularon las hojas mediante aspersión con una suspensión de esporas de Botrytis cinerea, ajustada a 500.000 esporas/mL. Luego, las placas de Petri se volvieron a colocar en la cámara de crecimiento y se evaluaron después de 4 días, 6 días y 9 días para seguir la progresión de la enfermedad.

Los resultados se muestran en la Figura 1. La Columna 1 muestra la referencia Serenade® Optimum (equivalente a la aplicación de 2,8 kg/ha); la Columna 2 muestra el control inoculado sin tratar; la Columna 3 muestra el control no inoculado, sin tratar, las Columnas 4 y 5 muestran Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 de dos lotes de fermentación diferentes. Las filas 1 y 2 muestran los resultados 4 días después de la inoculación. Las filas 5 y 6 muestran las mismas hojas, pero 6 días después de la inoculación y las filas 3 y 4 muestran nuevamente las mismas hojas, pero 9 días después de la inoculación.

Mediante inspección visual se ve claramente que las hojas del control inoculado sin tratar (columna 2) estaban muy dañadas incluso después de 4 días, y que las hojas del control no inoculado, sin tratar (columna 3) permanecieron frescas durante los 9 días del experimento. La referencia Serenade^®Optimum mostró cierto control de patógenos después de 3 días, ya que las hojas estaban muy dañadas después de 6 y 9 días. Por otro lado, los fermentados FCC1256 mostraron muy buen control de patógenos a los 4 y 6 días, y un control aceptable a los 9 días.

Ejemplo 8

(a) Concentrado de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256

Se preparó un concentrado de FCC1256 de la siguiente manera: se mezcló 20 % de concentrado de fermentado de FCC1256, 45 % de agua, 30 % de glicerol (al 86,5 %), 5 % de Marasperse AG (lignosulfonato de sodio; dispersante aniónico), el pH se ajustó a 6,0-7,5 utilizando un tampón HK²PO⁴H²O/KH²PO⁴. El contenido de esporas (FCC1256) de la composición final estaba típicamente en el intervalo de 1,0 x 10¹⁰UFC/mL a 1,0 x 10¹²UFC/mL.

(b) Concentrado de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256

Se preparó una composición de FCC1256 de la siguiente manera: se mezcló 50 % de concentrado de fermento de FCC1256, 4,8 % de agua, 40 % de glicerol (al 86,5 %), 5 % de Marasperse AG (lignosulfonato de sodio; dispersante aniónico), 0,1 % de antiespumante y 0,1 % de Kelzan (espesante), el pH se ajustó a 6,0-7,5 utilizando un tampón HK²PO⁴H²O/KH²PO⁴. El contenido de esporas (FCC1256) de la composición final estaba típicamente en el intervalo de 1,0 x 10¹⁰UFC/mL a 1,0 x 10¹²UFC/mL.

(c) Composición agrícola de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256

Un concentrado de (a) o (b) como se especifica arriba se diluyó con agua en una relación de 1:12 para producir una composición agrícola. La composición era aplicable para la aplicación a una tasa de, por ejemplo, 200-600 L/ha. Ejemplo 9

Ensayo de Pimiento de planta completa que compara la actividad antifúngica de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 contra el moho gris del pimiento (Botrytis cinerea) con controles no tratados, así como con otras cepas de Bacillus amyloliquefaciens

Cuatro cepas diferentes de Bacillus amyloliquefaciens, FCC1256, DSM7, RTI472 y RTI301, se fermentaron en condiciones similares (véase el Ejemplo 2), excepto que las fermentaciones se realizaron en menor escala utilizando matraces de agitación de 500 mL con 60 mL de cultivo. La temperatura de crecimiento fue de 28 °C, la agitación fue de 200 rpm y el tiempo de incubación fue de 144 horas. Cada una de las fermentaciones proporcionó una concentración de esporas del orden de 1 x 10⁷UFC/mL.

Se produjeron plantas de pimiento (Piper capsicum variedad Lamuyo F1) en macetas de plástico de 7 x 7 x 7 cm, utilizando sustrato suelo Agrofino 201. Las plantas tenían una edad de 6 semanas en el momento de la prueba. El riego de las plantas se realizó cada dos días mediante fertilización de N:P:K=20:20:20 a 160 ppm. Se utilizaron seis réplicas por modalidad testada, cada una de las réplicas consistía en 1 planta (1 maceta).

Cada una de las plantas fue tratada dentro de un rociador de laboratorio utilizando un brazo de 3 boquillas a un volumen estimado de 1000 L/ha. Cada una de las cuatro cepas diferentes de Bacillus amyloliquefaciens, FCC1256, DSM7, RTI472 y RTI301, se utilizaron a una dosis de 20 mL de caldo de fermentación diluido en 100 mL de agua desmineralizada y se mezcló con 0,2 % vol/vol de una mezcla adyuvante. También se evaluó como referencia el medio de fermentación con la mezcla adyuvante al 0,2 % vol/vol y sin cepa de Bacillus.

Después de la aplicación, las plantas se almacenaron en una cámara de crecimiento a 20 °C, 70 % de HR y fotoperíodo de 16 horas. La inoculación se realizó 24 horas después de la aplicación del fungicida, mediante aspersión manual de inóculo de Botrytis cinerea sobre las plantas tratadas hasta escurrimiento. La concentración de inóculo fue de 50.000 esporas/mL dentro del medio PDB (cepa de Botrytis cinerea FF248). Después de la inoculación, las plantas se almacenaron durante 48 horas en una cámara de rocío a 20 °C (sin luz) para favorecer la infección. Luego, las plantas se colocaron en una cámara de crecimiento a 20 °C, 70 % de HR y 16 horas de fotoperíodo, hasta el índice de enfermedad.

La evaluación de la enfermedad se realizó tres días después de la inoculación, evaluando el % de gravedad en cuatro hojas completamente desarrolladas por planta. Luego se calculó el % de gravedad promedio por maceta (informado en la Tabla 6) y la eficacia de las cepas testadas se calculó utilizando la fórmula de Abott:

% control A = 100 * ((% gravedad A - % gravedad no tratado) / % gravedad no tratado)

Tabla 6. Resultados del control de Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 del moho gris del pimiento (Botrytis cinerea) en comparación con las cepas de Bacillus amyloliquefaciens RTI301, DSM7 y RTI472.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para controlar patógenos de plantas en una planta, comprendiendo el método la etapa de aplicar una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 depositada como ATCC N° PTA-122162 a la planta, a una parte de la planta y/o a un lugar en el que la planta o parte de la planta crece o se ha de plantar.

2. Un método para controlar patógenos fúngicos de plantas y/o patógenos bacterianos de plantas en una planta, comprendiendo el método la etapa de aplicar una composición que comprende Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 depositada como ATCC N° PTA-122162 sobre partes superficiales de la planta.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición está en forma líquida, y en el que Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en la composición a una concentración de 1,0 x 106 UFC/mL a 1,0 x 1012 UFC/mL.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición está en forma de una formulación líquida seleccionada de suspensiones, concentrados de suspensión (SC), dispersiones de aceite (OD) y espumas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la composición está en forma sólida, y en el que Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 está presente en la composición a una concentración de 1,0 x 101456 UFC/g a 1,0 x 1012 UFC/g.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 5, en el que la composición está en forma de una formulación sólida seleccionada de polvos espolvoreables (DP), gránulos dispersables en agua (WG) y polvos humectables (WP).

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición se aplica a una tasa de 4,0 x 109 UFC/ha a 4,0 x 1017 UFC/ha.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que los patógenos de plantas se seleccionan del grupo que consiste en Botrytis cinerea, Botrytis squaomas, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Fusarium viguliforme, Phytophthora infestans, Phytophthora parasítica, Phytophthora sojae, Phytophthora capsici, Phytophthora cinnamon, Phytophthora fragariae, Phytophthora ramorum, Phytophthora palmivara, Phytophthora nicotianae, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia minor, Sclerotinia homeocarpa, Aspergillus Favus, Pseudomonas syringae pv. Tomato, Erwinia amylovara, Rhizoctonia solani, Xanthomonas euvesicatoria, y cualquier combinación de los mismos.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la planta se selecciona de pimiento, pepinos, manzanas, espárrago, bayas, plátanos, cítricos, kiwi, melones, melocotones, peras, piña, frutos de pepita, granada, apio, cebolla, ajo, uvas, puerros, chalotes, cebolletas, brócoli, repollo, coliflor, cucurbitáceas, tomates, patatas, trigo, arroz y soja.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende iturina y fengicina en una relación ponderal relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la composición comprende, además, un medio de formulación adecuado en agricultura que comprende un soporte adecuado, un agente tensioactivo y, opcionalmente, un tampón.

12. Una composición agrícola que comprende:

a) Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 depositado como ATCC N° PTA-122162, y

b) un medio de formulación adecuado en agricultura, que comprende un soporte adecuado, un agente tensioactivo y, opcionalmente, un tampón.

13. La composición de la reivindicación 12, que comprende iturina y fengicina en una relación ponderal relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0.

14. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde la composición es una formulación seleccionada de suspensiones, concentrados de suspensión (SC), dispersiones de aceite (OD), espumas, polvos espolvoreables (DP), gránulos dispersables en agua (WG) y polvos humectables (WP).

15. Un concentrado para una composición agrícola, comprendiendo el concentrado:

a) Bacillus amyloliquefaciens FCC1256 depositado como ATCC N° PTA-122162, y

16. El concentrado de la reivindicación 15, que está en forma de una formulación seleccionada de concentrados en suspensión (SC o SD), suspensiones de volumen ultra bajo (SU), suspensiones de tratamiento de semillas (FS), dispersiones de aceite (OD), pastas (PA), geles (GD), gránulos dispersables en agua (WG), polvos espolvoreables (DP), tabletas dispersables en agua (WT), polvos dispersables en agua para tratamiento de lodos (WS) y polvos humectables (WP).

17. El concentrado de una cualquiera de las reivindicaciones 15-16, que comprende iturina y fengicina en una relación ponderal relativa en el intervalo de 1,3:1,0 a 3,0:1,0.