ES2938361T3 - Composiciones de bacterias diseñadas - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y métodos para tratar una disbiosis gastrointestinal utilizando un número limitado de especies bacterianas definidas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones de bacterias diseñadas

En el presente documento se describen composiciones bacterianas útiles para tratar una disbiosis, por ejemplo, en un ser humano.

Antecedentes

La disbiosis se ha relacionado con una serie de enfermedades, incluyendo infecciones, tales como infección por Clostridium diffiále y enterococos resistentes a fármacos, así como con enfermedades metabólicas tales como la diabetes. Los métodos para tratar una afección relacionada con disbiosis han incluido el trasplante de microbioma fecal (FMT, por sus siglas en inglés), que puede proporcionar microorganismos al tracto gastrointestinal (GI, por sus siglas en inglés). Sin embargo, el trasplante fecal presenta una serie de problemas, incluidos los relacionados con la seguridad y los métodos de suministro, tal como los métodos basados en suministro naso-duodenal, transcolonoscópicos o en enemas que generalmente requieren procedimientos en centros médicos y pueden dar lugar a eventos adversos. Los tratamientos que utilizan FMT tienen la probabilidad de ser intrínsecamente inconsistentes debido a la variabilidad entre los individuos que donan las heces para el trasplante. Los métodos de FMT también presentan un riesgo de infección por organismos patógenos, incluyendo virus, bacterias, hongos y protistas en el material de origen. Asimismo, puede haber problemas relacionados con la estabilidad y el almacenamiento de las heces donadas, por ejemplo, relacionados con la supervivencia de las especies bacterianas. Algunos tratamientos que usan bacterias fecales suministradas en cápsulas han requerido que los pacientes ingieran una gran cantidad de cápsulas, lo que puede ser difícil para las personas con enfermedades gastrointestinales y puede reducir el cumplimiento del tratamiento completo. En consecuencia, hay una necesidad de composiciones que suministren un producto consistente que contenga bacterias cultivadas que sean de suficiente complejidad para tratar de manera eficaz una disbiosis o una afección relacionada con la disbiosis, por ejemplo, infección por Clostridium diffiále, por ejemplo, prevenir o inhibir una infección, o, prevenir o inhibir la recurrencia de la infección. Como se usa en el presente documento, el tratamiento y la prevención pueden incluir una reducción de los signos o síntomas de la enfermedad.

Sumario

La presente divulgación se refiere al descubrimiento de composiciones bacterianas, por ejemplo, composiciones de esporas bacterianas que contienen un consorcio de tipos de bacterias definidos, que son útiles para tratar una disbiosis. Dicho consorcio se denomina en el presente documento composición bacteriana diseñada (DBC, por sus siglas en inglés).

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende una población viable de bacterias, en donde la población comprende Clostridium innocuum, Clostridium bolteae, Blautia producta, Murimonas intestini y Eubacterium contortum.

En unas realizaciones, el Clostridium inocuum comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 41-45, en donde Clostridium bolteae comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 6-10, en donde Blautia producta comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 1-5, en donde Murimonas intestini comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 85-89, y/o en donde Eubacterium contortum comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 70-73. En unas realizaciones, al menos el 75 % de la población de bacterias viables son esporas.

En otro aspecto, la invención proporciona una formulación que comprende la composición de la invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En unas realizaciones, el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende glicerol, polietilenglicol o manteca de cacao. En unas realizaciones, la formulación es una cápsula o un comprimido.

También se proporciona una composición o formulación de la invención para su uso en la prevención o el tratamiento de una disbiosis en un sujeto en riesgo o diagnosticado con una disbiosis. Además se proporciona una composición o formulación de la invención para su uso en el tratamiento de una infección por C. diffiále o en la prevención de una infección por C. diffiále, o en prevención de la recurrencia de una infección por C. diffiále en un sujeto que lo necesite.

En unas realizaciones, la concentración total de bacterias en la composición es de 10e1 a 10e9. En unas realizaciones, las bacterias de la composición se proporcionan en 1, 2, 3, 4 o 5 cápsulas. En unas realizaciones, el sujeto ha recibido un tratamiento antibiótico antes de la administración de la composición.

De forma más general, la presente divulgación proporciona composiciones que incluyen poblaciones viables de bacterias, conteniendo las poblaciones viables las especies bacterianas de DBC 1, DBC 2, DBC 3, DBC 4, DBC 5, DBC 6, DBC 7, DBC 8, o DBC 9 de la tabla 3; o DBC S1, DBC S2, DBC S4, DBC S5, DBC S6, DBC S7, DBC S8, DBC S9, DBC S10, DBC S11, DBC S12, DBC S13, DBC S14, DBC S15, DBC S16, DBC S17, DBC S18, DBC S19, DBC S20, DBC S21, DBC S22, DBC S23 o DBC S24 de la tabla 4. La composición de la invención comprende una población viable de bacterias que contiene las especies bacterianas de DBC S12. Opcionalmente, el ADNr 16S de una o más (p. ej., cada una) especies bacterianas en la DBC tiene al menos un 97 % (p. ej., al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 %) de identidad con al menos una secuencia de ADNr 16S en la figura 1.

En determinados casos, las composiciones de la divulgación consisten en una población viable de especies bacterianas de DBC 1, DBC 2, DBC 3, DBC 4, DBC 5, DBC 6, DBC 7, DBC 8, DBC 9, DBC S1, DBC S2, DBC S4, DBC S5, DBC S6, DBC S7, DBC S8, DBC S9, DBC S10, DBC S11, DBC S12, DBC S13, DBC S14, DBC S15, DBC S16, DBC S17, DBC S18, DBC S19, DBC S20, DBC S21, DBC S22, DBC S23 o DBC S24, como se define en el presente documento. Opcionalmente, el ADNr 16S de una o más (p. ej., cada una) especies bacterianas en la DBC tiene al menos un 97 % (p. ej., al menos un 98 %, al menos un 99 % o un 100 %) de identidad con al menos una secuencia de ADNr 16S en la figura 1.

En algunos casos, las poblaciones de especies bacterianas pueden utilizar al menos un 90 % (por ejemplo, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 %) de las fuentes de carbono enumeradas en la figura 4.

La divulgación también proporciona composiciones que incluyen poblaciones de al menos cinco (por ejemplo, al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) especies bacterianas viables, en donde al menos una (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) de las especies de la población tiene una o más (por ejemplo, 1, 2, 3 o 4) características seleccionadas del grupo que consisten en: (i) utilización de una o más fuentes de carbono utilizadas por un microorganismo patógeno, (ii) producción de un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC), (iii) producción de indol u otros metabolitos de triptófano, y (iv) producción de una enzima que actúa en la regulación de ácidos biliares.

En diversos ejemplos, el microorganismo patógeno es C. diffiále y la población incluye una o más (p. ej., al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) especies de bacterias viables que pueden utilizar al menos cinco (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) fuentes de carbono de C. diffiále diferentes. Por ejemplo, las fuentes de carbono de C. diffiále pueden incluir o seleccionarse del grupo que consiste en: taurocolato, glicocolato, glicoquenodesoxicolato, tauroquenodesoxicolato, colato, quenodesoxicolato y desoxicolato.

En ejemplos adicionales, las poblaciones incluyen una o más (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) especies de bacterias viables que producen un inhibidor de HDAC, por ejemplo, un inhibidor de HDAC seleccionado del grupo que consiste en: butirato, isovalerato, isobutirato, propionato y 2-metilbutirato.

En ejemplos adicionales, las poblaciones incluyen una o más (por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20) especies que producen una o más ( p.ej., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) enzimas que actúan en la regulación de los ácidos biliares, por ejemplo, seleccionadas del grupo que consiste en hidrolasa biliar (BSH, por sus siglas en inglés), 3-a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (3-a-HSDH, por sus siglas en inglés), 7-ahidroxiesteroide deshidrogenasa (7-a-HSDH, por sus siglas en inglés) y 12-a-hidroxiesteroide deshidrogenasa (12-a-HSDH, por sus siglas en inglés).

La divulgación proporciona además composiciones que incluyen al menos una especie de cada uno de los clados 86, 90, 101, 139, 195, 197, 206, 233, 238, 241, 244 y 290 y, opcionalmente, una especie de la reivindicación 202. En diversos ejemplos, las composiciones incluyen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 especies de bacterias. Asimismo, en diversos ejemplos, al menos un 75 % (por ejemplo, al menos un 80 %, 85 %, 90 % o un 95 %) de las bacterias de las composiciones están en forma de esporas.

La divulgación también proporciona formulaciones que incluyen una composición como se describe en el presente documento y un excipiente farmacéuticamente aceptable (p. ej., un excipiente farmacéuticamente aceptable que incluye glicerol, polietilenglicol o manteca de cacao). Las formulaciones pueden estar opcionalmente en una cápsula o comprimido para, por ejemplo, suministro oral.

La presente divulgación proporciona además una cantidad farmacéuticamente eficaz de una composición como se describe en el presente documento para su uso en la prevención (por ejemplo, la disminución de la probabilidad) o el tratamiento de una disbiosis en un sujeto en riesgo o diagnosticado con una disbiosis. En diversos ejemplos, la concentración total de bacterias en la composición es de 10e1 a 10e9. Asimismo, las bacterias de la composición se pueden proporcionar opcionalmente en 1, 2, 3, 4 o 5 cápsulas.

Además, la divulgación proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición como se describe en el presente documento para su uso en el tratamiento de una infección por C. diffiále, o en la prevención (p. ej., disminuir la probabilidad de) una infección por C. diffiále, o en la prevención de (p. ej., disminuir la probabilidad de) la recurrencia de una infección por C. diffiále.

En algunos casos, las composiciones son útiles para prevenir la recurrencia de una infección, por ejemplo, una infección por C. diffiále. En algunos casos, la composición es útil para disminuir la presencia gastrointestinal de un patógeno, por ejemplo, la presencia de C. diffiále o la presencia de Enterococcus resistentes a vancomicina.

Definiciones

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de una composición bacteriana diseñada (DBC) descrita en el presente documento puede variar según factores tales como la patología, edad, sexo y peso del individuo y de la capacidad de la DBC para desencadenar una respuesta deseada en el individuo, por ejemplo, mejora de al menos un signo o síntoma de un trastorno (y opcionalmente, el efecto de cualquier agente adicional que se administre). En algunos casos, una cantidad terapéuticamente eficaz de una DBC puede prevenir o reducir el riesgo de al menos un signo o síntoma de un trastorno. Por ejemplo, en algunos casos, una DBC puede reducir el riesgo de recurrencia de una infección asociada con una disbiosis. La disbiosis puede incluir la pérdida de la función que un microbioma saludable le confiere a un hospedador, incluyendo, sin limitación, la resistencia a la colonización, protección contra la infección, regulación de la homeostasis inmunitaria, funciones metabólicas, síntesis de metabolitos esenciales y vitaminas, la modulación de la motilidad intestinal o la función neurológica, o cualquier serie de propiedades diferentes que están asociadas ahora con un microbioma saludable y el mantenimiento de la barrera intestinal. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una donde cualquier efecto tóxico o perjudicial de la composición se ve superados por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una composición como se describe en el presente documento se administra generalmente en una cantidad terapéuticamente eficaz.

"Presencia" significa la condición de albergar un microorganismo en o sobre el organismo de un sujeto, por ejemplo, presencia de un patógeno tal como C. diffiále.

Las referencias a métodos de tratamiento en los siguientes párrafos de la presente descripción deben interpretarse como referencias a las composiciones, formulaciones y medicamentos de la divulgación para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante cirugía o terapia (o para diagnóstico).

Las características y ventajas adicionales de la invención se describen más particularmente a continuación.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un conjunto ilustrativo de secuencias de ADNr 16S de longitud completa asociadas con bacterias útiles en una DBC (SEQ ID NO: 1-124).

La figura 2 es un dibujo que representa un diseño experimental usando un modelo murino de infección por C. diffiále resultante de la disbiosis inducida por antibióticos.

La figura 3 es un gráfico de barras que representa los resultados de experimentos que prueban composiciones bacterianas diseñadas (DBC) en un modelo murino de disbiosis. Los datos representan el peso corporal mínimo por grupo experimental de ratones en comparación con el valor inicial previo a la infección.

La figura 4 es una tabla que muestra los perfiles de utilización de fuentes de carbono de especies seleccionadas de la DBC, basándose en DO600 en medio con fuente de carbono indicada, normalizados para DO600 en medio base sin fuente de carbono. Una célula vacía indica un resultado negativo. Las células completas indican la utilización de las fuentes de carbono enumeradas. De las 59 fuentes de carbono analizadas, solamente se presentan las 29 utilizadas por C. diffiále.

La figura 5 es una tabla que muestra las actividades enzimáticas de ácidos biliares de especies seleccionadas de la DBC.

La figura 6 es un gráfico de barras que muestra los resultados del ensayo HDAC para sobrenadantes de cultivo puro cultivados en PYG.

La figura 7 es un gráfico de barras que muestra una comparación de la actividad de inhibición de HDAC y las concentraciones de butirato por GC.

Descripción detallada

Según se informa, un microbioma gastrointestinal (GI) saludable en un mamífero tiene entre 300 y 1000 especies bacterianas diferentes. Sorprendentemente, el presente solicitante ha descubierto que las composiciones bacterianas diseñadas, denominadas en el presente "DBC", que contienen un número limitado de especies bacterianas definidas, algunas de los cuales están presentes en los microbiomas humanos en cantidades relativas muy bajas, son capaces de proporcionar la recuperación o mejora del daño al tracto GI de un animal, por ejemplo, recuperación o mejora de una infección por Clostridium diffiále (CDI, por sus siglas en inglés). En algunos casos, tales composiciones pueden inhibir la recurrencia de una infección asociada con una disbiosis, por ejemplo, reduciendo o eliminando la presencia de un organismo patógeno inducida por disbiosis antes de la infección.

Asimismo, el presente solicitante ha descubierto nuevas especies presentes en niveles extremadamente bajos en un microbioma GI humano sano, por ejemplo, detectadas en las heces de un ser humano sano en menos del 2 %, por ejemplo, menos del 1 %, menos del 0,5%, menos del 0,1 %, menos del 0,01 %, menos del 0,001 %, menos del 0,0001 % o menos del 0,00001 % de las bacterias totales. En ejemplos particulares, la nueva especie puede estar presente en una cantidad inferior a 1e9 UFC/gramo de heces, 1e6 UFC/gramo de heces, inferior a 1e5 UFC/gramo de heces, inferior a 1e4 UFC/gramo de heces, o inferior a 1e3 UFC/gramo de heces. A pesar de sus niveles extremadamente bajos en los microbiomas humanos, sorprendentemente, estas especies pueden contribuir a la utilidad terapéutica o profiláctica de las DBC, por ejemplo, una DBC terapéuticamente eficaz. Las DBC proporcionan una mejora con respecto a los métodos de tratamiento de una disbiosis que utilizan, por ejemplo, preparaciones procedentes directamente de heces humanas. Por ejemplo, debido a que los seres humanos tienen microbiomas gastrointestinales variables, puede haber problemas con la consistencia en el número o proporción de organismos presentes en las preparaciones de heces humanas. Asimismo, dichas preparaciones tienen el riesgo de infectar al paciente que recibe dichos tratamientos con un patógeno. Las DBC del solicitante abordan el problema de la diversidad de pacientes mediante la inclusión de organismos filogenéticamente diversos en las composiciones terapéuticas que aumentan la probabilidad de proporcionar las características funcionales necesarias para promover la resistencia a la colonización en una amplia gama de pacientes.

Las DBC descritas en el presente documento proporcionan soluciones a estos problemas con el tratamiento de una disbiosis, así como a otros problemas con el tratamiento de un trastorno asociado con la disbiosis.

Composiciones

Las composiciones divulgadas en el presente documento comprenden al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 20, 25 o 30 tipos de bacterias. Un tipo bacteriano puede ser una familia, género, clado, especie o cepa. En un ejemplo, una composición comprende al menos una especie de cada uno de los clados 86, 90, 101, 139, 195, 197, 206, 233, 238, 241, 244 y 290, y opcionalmente, el clado 202, ejemplos de los cuales se proporcionan en la tabla 2, infra. En algunos casos, la composición consiste en al menos una especie de cada uno de los clados 86, 90, 101, 139, 195, 197, 202, 206, 233, 238, 241, 244 y 290.

En algunos casos, una composición comprende al menos una especie de bacteria de cada una de las familias Erysipelatrichaceae, Lachnospiraceae, Peptostreptococaceae, Clostridiaceae, y del género Flavonifractor.

En algunos casos, las especies en una composición se seleccionan de aquellas identificadas en la tabla 1 y/o en la tabla 2. Los clados son especies bacterianas que están relacionadas evolutivamente y, por lo tanto, tienen una alta probabilidad de compartir características funcionales. Los clados se definen en función de la topología de un árbol filogenético que se construye a partir de secuencias 16S de longitud completa utilizando métodos de máxima verosimilitud familiares para los expertos en materia de filogenética. Los clados se construyen para garantizar que todas las OTU (unidades taxonómicas operativas, OTU, por sus siglas en inglés) en un clado determinado se encuentren: (i) dentro de un número específico de nodos compatibles con un muestreo entre sí, y (ii) dentro del 5 % de similitud genética. Las OTU que están dentro del mismo clado se pueden distinguir como genética y filogenéticamente distintas de las ^o T^u en un clado diferente según los datos de secuencia de 16S-V4, mientras que las OTU que se encuentran dentro del mismo clado están estrechamente relacionadas. Las OTU que se encuentran dentro del mismo clado están evolutivamente estrechamente relacionadas. Miembros del mismo clado, debido a su relación evolutiva, desempeñan papeles funcionales similares en una ecología microbiana como la que se encuentra en el intestino humano. Es probable que las composiciones que sustituyen una especie por otra del mismo clado tengan una función ecológica conservada y, por lo tanto, son útiles en la presente divulgación. En algunos casos, la composición comprende una, dos o tres especies de cada clado de la tabla 1 o la tabla 2.

Un ejemplo de una composición de la divulgación es una composición que incluye 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 especies de bacterias seleccionadas de la tabla 1 y/o la tabla 2. En algunos casos, una composición consiste en 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15 especies de bacterias seleccionadas de la tabla 1 y/o la tabla 2. En algunos casos, una especie bacteriana se identifica por homología con el ADNr 16S. En la figura 1 se proporciona un listado ilustrativo de dichas secuencias de ADNr 16S.

Tabla 1

continuación

Tabla 2: Especies b ri n i i n l r i

(continuación)

(continuación)

(continuación)

En la tabla 3 se proporcionan ejemplos no limitantes de composiciones que usan especies bacterianas enumeradas en la tabla 1.

T l : E m l m i i n i ñ DB

continuación

Las composiciones DBC adicionales (DBC S1 - DBC S24) se enumeran a continuación, en la tabla 4. La tabla 4 muestra las composiciones bacterianas de DBC S1 a DBC S24 y muestra las características de DBC S1 a DBC S24 en las condiciones analizadas. Las características son las siguientes: Cluster IV: ninguna de las especies está en el Cluster IV de clostridios; No son del Cluster IV o XIVa: ninguna de las especies está en los Cluster IV o XIVa de clostridios; Alto injerto, Alta prevalencia: en experimentos con una composición compleja de esporas aisladas de heces de seres humanos sanos, estos son ejemplos de especies bacterianas que generaron injertos altos (especies que estaban en la composición compleja de esporas que después se detectaron en sujetos que recibieron dosis de la composición de esporas) y especies que tuvieron una alta prevalencia (especies que se encuentran comúnmente en el conjunto de datos de HMP); Actividad HDAC: todas las especies producen un ácido graso de cadena corta (butirato y/o propionato, y/o isobutirato e isovalerato) capaz de inhibir la actividad histona desacetilasa; Sin actividad HDAC: ninguna de las especies produce un ácido graso de cadena corta (butirato y/o propionato y/o isobutirato e isovalerato) capaz de inhibir la actividad histona desacetilasa; Actividad BSH: todas las especies tienen actividad hidrolasa de sales biliares; Sin actividad BSH: ninguna de las especies tiene actividad hidrolasa de sales biliares; Actividad 7a-HSDH: todas las especies tienen actividad 7-a-hidroxiesteroide deshidrogenasa; Sin actividad 7-a-HSDH: ninguna de las especies tiene actividad 7-a-hidroxiesteroide deshidrogenasa; Actividad 3-a o 12-a-HSDH: todas las especies tienen actividad 3-a/12 a-hidroxiesteroide deshidrogenasa; Crecimiento en los aminoácidos alanina, arginina, asparagina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, ornitina, fenilalanina, serina y valina: todas las especies pueden utilizar estos aminoácidos como fuente de carbono; Sin cultivo en aminoácidos alanina, arginina, asparagina, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, ornitina, fenilalanina, serina y valina: ninguna de las especies utilizó estos aminoácidos como fuente de carbono; Producción de indol: todas las especies pueden producir indol o un derivado de indol; Sin producción de indol: ninguna de las especies puede producir indol; Crecimiento en alcoholes de azúcar: todas las especies pueden utilizar alcoholes de azúcar como fuente de carbono; Sin crecimiento en alcoholes de azúcar: ninguna de las especies puede utilizar alcoholes de azúcar como fuente de carbono; Crecimiento en fucosa: todas las especies pueden utilizar fucosa como fuente de carbono; Sin crecimiento en fucosa: ninguna de las especies puede utilizar fucosa como fuente de carbono; Crecimiento en NAG: todas las especies pueden usar N-acetilglucosamina (NAG) como fuente de carbono; Sin crecimiento en NAG: se predijo que ninguna de las especies podría usar NAG como fuente de carbono. Las predicciones se basaron en los resultados de ese experimento/selección específicos.

Tabla 4

continuación

continuación

continuación

En algunos casos, todos los organismos en una DBC son anaerobios obligados. En algunos casos, las bacterias en una composición son especies que se pueden cultivar in vitro para formar esporas y dichas esporas pueden germinarse in vitro. En algunos casos, las bacterias en una composición son esporas. En algunos casos, las bacterias en una composición están en forma vegetativa. Debe entenderse que una composición de esporas bacterianas o una composición de bacterias vegetativas significa que mientras que la mayoría de las bacterias están en la forma especificada (es decir, esporas o vegetativas), un pequeño número puede estar en una forma diferente, por ejemplo, en el caso de las esporas, algunas células en una composición pueden ser vegetativas, mientras que en el caso de las bacterias vegetativas, algunas células pueden estar en forma de esporas. Por ejemplo, la composición puede ser al menos el 100 %, al menos el 99 %, al menos el 97 %, al menos el 95 %, al menos el 90 %, al menos el 85 %, al menos el 80 %, o al menos el 75 % de esporas, o la composición puede ser al menos el 100 %, al menos el 99 %, al menos el 97 %, al menos el 95 %, al menos el 90 %, al menos el 85 %, al menos el 80 %, o al menos el 75 % de bacterias vegetativas. En algunos casos, las especies individuales están presentes como una mezcla de bacterias vegetativas y esporas en una relación, por ejemplo, 74:26, 70:30, 60:40, 50:50, 40:60, 30:70 y 26:74. Por lo general, las relaciones se evalúan utilizando unidades formadoras de colonias (ufc), aunque también pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica. La evaluación del porcentaje de bacterias en una forma específica vegetativa o de esporas se puede hacer con referencia a la fecha de preparación de la composición en una forma farmacéutica o a la fecha de administración de la forma farmacéutica.

Una DBC de la divulgación puede incluir al menos dos organismos de la tabla 1 y uno o más de los siguientes: Lachnospiraceae bacterium A4, Lachnospiraceae bacterium 5157FAA, y Ruminococcus lactaris.

Otro ejemplo de composiciones de la divulgación son composiciones que contienen 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 de las siguientes especies: Clostridium glicolicum, Clostridium mayombei, Clostridium hylemonae, Clostridium bolteae, Clostridium disporicum, Clostridium innocuum, Flavonifractor plautii, Clostridium orbiscindens, Blautia producta, Turicibacter sanguinis, Eubacterium contortum, Murimonas intestini, Lachnospiraceae bacterium A4, Lachnospiraceae bacterium 11041, y Clostridium oroticum. Como se ha indicado anteriormente, la composición de la invención comprende una población viable de bacterias que comprende Clostridium inocuum, Clostridium bolteae, Blautia producta, Murimonas intestini y Eubacterium contortum.

Sorprendentemente, el presente solicitante ha encontrado que no es necesario proporcionar organismos en proporciones que reflejen las de un microbioma saludable o que se encuentran de otro modo en la naturaleza; el presente solicitante descubrió que eran eficaces las dosis de ^d B^c que contenían aproximadamente el mismo número de cada especie de bacteria (p. ej., el mismo número de esporas germinables in vitro), aunque la composición no contenga organismos en proporciones naturales. Asimismo, el presente solicitante no tiene conocimiento de ningún ser humano individual que tenga niveles detectables de todos los organismos en ninguna de las DBC proporcionadas en las tablas 3 y 4, es decir, el presente solicitante cree que las composiciones no se producen de forma natural.

El presente solicitante también señala que el número total de bacterias eficaces en un tratamiento está muy por debajo del número total de organismos en el tracto gastrointestinal de un ser humano sano, es decir, no es necesario administrar un microbioma completo y sano para lograr un efecto terapéutico, no sólo en términos de la diversidad de las especies proporcionadas en una composición, sino también en el número total de organismos proporcionados.

Debe entenderse que "que consiste en" en estos ejemplos se refiere a los tipos de bacterias que están presentes en una composición. Una formulación bacteriana puede contener materiales no bacterianos adicionales, tal como uno o más excipientes (incluidos, por ejemplo, una o más cápsulas), un medio acuoso o no acuoso (por ejemplo, glicerol, polietilenglicol, manteca de cacao, agua y/o tampón), así como uno o más prebióticos o fármacos de molécula pequeña.

Especies utilizadas en las composiciones

En general, las especies utilizadas en una DBC se identifican dentro de un clado seleccionado en función de su secuencia de ADNr 16S (p. ej., secuencia de longitud completa o una o más secuencias de región variable (V1-V9, por ejemplo, secuencia V4, o secuencia V6)).

En algunos casos, una especie útil en una DBC es una especie que tiene un ADNr 16S de longitud completa con al menos un 95 % de identidad de secuencia ("identidad") con el ADNr 16S de una especie de referencia, por ejemplo, una especie identificada en la tabla 1 o la tabla 2. En algunos casos, una especie útil en una DBC es una especie que tiene un ADNr 16S de longitud completa con al menos un 97 % de identidad de secuencia ("identidad") con el ADNr 16S de una especie de referencia, por ejemplo, una especie en la tabla 1 o la tabla 2. En algunos casos, una especie útil tiene ADNr 16S de la región V4 que tiene un 95 % de identidad con una región V4 de ADNr 16S de una especie de referencia, por ejemplo, una especie identificada en la tabla 1 o la tabla 2. En algunos casos, una especie útil tiene ADNr 16S de la región V4 que tiene un 97% de identidad con una región V4 de ADNr 16S de una especie de referencia, por ejemplo, una especie identificada en la tabla 1 o la tabla 2. En algunos casos, una especie útil tiene una secuencia genómica que tiene al menos un 95 % de identidad con el ADN genómico de longitud completa de una especie de referencia, por ejemplo, una especie identificada en la tabla 1 o la tabla 2. En algunos casos, una especie útil tiene una secuencia genómica que tiene al menos un 97 % de identidad con la secuencia genómica de longitud completa de una especie de referencia, por ejemplo, una especie identificada en la tabla 1 o la tabla 2. En caso de que no se proporcione una secuencia en el presente documento, por ejemplo, una secuencia V4, los métodos son bien conocidos en la técnica para identificar dichas secuencias. La figura 1 proporciona ejemplos no limitantes de secuencias de ADNr 16S de longitud completa que pueden usarse como secuencias de referencia. En general, identidad o porcentaje de identidad con una especie de referencia significa identidad o porcentaje de identidad con al menos una secuencia de ADNr 16S descubierta en un organismo.

En algunos casos, se pueden obtener cepas de especies bacterianas útiles en la divulgación, por ejemplo, especies divulgadas en el presente documento, de un centro público de recursos biológicos como la ATCC (atcc.org), el DSMZ (dsmz.de), o el Richland Bioresource Center (en.brc.rich.jp). Las secuencias de ADNr 16s útiles para identificar especies u otros aspectos de la divulgación se pueden obtener de bases de datos públicas, por ejemplo, el sitio web del Human Microbiome Project (HMP) o GenBank.

Se conocen en la técnica métodos para determinar la identidad de secuencia y se proporcionan ejemplos infra.

Especies/información de nombres

Los nombres y la clasificación de las bacterias están sujetos a cambios que pueden no estar reflejados en la bibliografía. Por conveniencia, se proporcionan nombres alternativos para algunas especies bacterianas, en el presente documento, pero no pretenden ser un conjunto completo de nombres alternativos. En algunos casos, las especies se identifican por la identidad de secuencia de la totalidad o una parte de una secuencia de ADNr 16S, por ejemplo, al menos el 90 %, 93 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % de identidad.

Determinación de la identidad

Los clados, unidades taxonómicas operativas (OTU, por sus siglas en inglés), especies y cepas se identifican, en algunos casos, por su secuencia de ADNr 16S. La relación de los clados, OTU, especies y cepas puede determinarse por el porcentaje de identidad entre clados, OTU, especies o cepas. El porcentaje de identidad entre una secuencia de referencia y de consulta se puede determinar utilizando métodos conocidos en la técnica. A continuación se proporcionan ejemplos no limitantes de métodos para dichas determinaciones. Como se usa en el presente documento, la relación entre dos secuencias de nucleótidos se describe mediante el parámetro "identidad".

En un caso, el grado de identidad de secuencia entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia se determina 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación predeterminada y la penalización por hueco predeterminada, 2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es aquella en la que el programa de alineación ha identificado un nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en la alineación y 3) dividir el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia de referencia.

En otro caso, el grado de identidad de secuencia entre una secuencia de consulta y una secuencia de referencia se determina 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación predeterminada y la penalización por hueco predeterminada, 2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es aquella en la que el programa de alineación ha identificado un nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en la alineación y 3) dividir el número de coincidencias exactas por la longitud de la secuencia más larga de las dos secuencias.

En otro caso, el grado de identidad de secuencia entre la secuencia de consulta y la secuencia de referencia se determina 1) alineando las dos secuencias mediante cualquier programa de alineación adecuado utilizando la matriz de puntuación predeterminada y la penalización por hueco predeterminada, 2) identificando el número de coincidencias exactas, donde una coincidencia exacta es aquella en la que el programa de alineación ha identificado un aminoácido o nucleótido idéntico en las dos secuencias alineadas en una posición dada en la alineación y 3) dividir el número de coincidencias exactas por la "longitud de alineación", donde la longitud de la alineación es la longitud de toda la alineación, incluidos los huecos y las partes protuberantes de las secuencias.

Las comparaciones de identidad de secuencia se realizan, generalmente, con la ayuda de un programa de comparación de secuencias. Estos programas informáticos disponibles pública o comercialmente utilizan algoritmos de comparación complejos para alinear dos o más secuencias que mejor reflejen los eventos evolutivos que podrían haber dado lugar a la una o más diferencias entre las dos o más secuencias. Por lo tanto, estos algoritmos funcionan con un sistema de puntuación que recompensa la alineación de aminoácidos idénticos o similares y penaliza la inserción de huecos, extensiones por hueco y alineación de aminoácidos no similares. El sistema de puntuación de los algoritmos de comparación incluye:

i) asignación de una puntuación de penalización cada vez que se inserta un hueco (puntuación de penalización por hueco),

ii) asignación de una puntuación de penalización cada vez que se amplía un espacio existente con una posición adicional (puntuación de penalización por ampliación),

iii) asignación de puntuaciones altas tras la alineación de aminoácidos idénticos, y

iv) asignación de puntuaciones variables tras la alineación de aminoácidos no idénticos.

En general, los valores predeterminados del programa de alineación se utilizan para las comparaciones de secuencias. Los programas informáticos adecuados útiles para determinar la identidad incluyen, por ejemplo, BLAST (blast.ncbi.nlm.nih.gov).

En un caso de la presente divulgación, el programa de alineación optimiza la alineación en toda la longitud de las secuencias seleccionadas, por ejemplo, secuencia de ADNr 16S V4 o V6 de longitud completa. Por ejemplo, el programa de alineación global se basa en el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J Mol Biol 48: 443-53). Ejemplos no limitantes de dichos programas son los programas EMBOSs Needle y EMBOSS Stretcher, disponibles en ebi.ac.uk/Tools/psa/.

En un caso, las secuencias se alinean mediante un programa de alineación global y la identidad de la secuencia se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa divididas por la "longitud de la alineación". donde la longitud de la alineación es la longitud de toda la alineación, incluidos los huecos y las partes protuberantes de las secuencias. En un caso adicional, el programa de alineación global utiliza el algoritmo de Needleman-Wunsch y la identidad de la secuencia se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa divididas por la "longitud de la alineación", donde la longitud de la alineación es la longitud de toda la alineación, incluidos los huecos y las partes protuberantes de las secuencias.

En otro caso adicional más, el programa de alineación global se selecciona del grupo que consiste en EMBOSS Needle y EMBOSS stretcher y la identidad de secuencia se calcula identificando el número de coincidencias exactas identificadas por el programa dividido por la "longitud de alineación", donde la longitud de la alineación es la longitud de toda la alineación, incluidos los huecos y las partes protuberantes de las secuencias.

Una vez que el programa informático ha producido una alineación, es posible calcular el porcentaje (%) de similitud y el porcentaje de identidad de secuencia.

Métodos de prueba de una DBC candidata

Métodos in vivo

Las DBC candidatas se pueden analizar utilizando modelos animales de enfermedades asociadas con una disbiosis, por ejemplo, Hutton et al. (2014, FEMS Microbiol. Lett. 352:140-149), Best et al. (2012, Gut Microbes 3:145-167) and Chen et al. (2008, Gastroenterology 135:1984-92). El uso de uno de estos modelos se describe en los ejemplos, infra. Una DBC candidata que mejora un signo o síntoma en dicho modelo es útil como DBC para tratar una disbiosis, por ejemplo, en un ser humano.

Características de las composiciones

Como se describe en el presente documento, una DBC generalmente se analiza para determinar la capacidad, de inhibir in vivo y/o in vitro el crecimiento de un organismo patógeno, la capacidad de destruir un organismo patógeno, la capacidad de prevenir o mejorar los efectos de un organismo patógeno u otra actividad adecuada. En algunos casos, las bacterias en una ^d B^c se seleccionan por las características que presentan en la composición, en una subcomposición o como bacterias individuales. Ejemplos de dichas características incluyen la capacidad de inhibir la histona desacetilasa, metabolizar los ácidos biliares, utilizar fuentes de nutrientes (p. ej., fuentes de nutrientes utilizadas por un organismo patógeno específico) y metabolizar triptófano para producir indol y otros metabolitos de triptófano. Los detalles de estas características se establecen a continuación y en los ejemplos, a continuación.

Actividad histona desacetilasa

Las histona desacetilasas (HDACS) son una familia de enzimas que pueden eliminar restos de acetilo de sitios específicos en el extremo aminoterminal de las histonas, que forman parte de la estructura de la cromatina del ADN en las células eucariotas (revisado en Davie). El estado estacionario de la acetilación de histonas es el resultado del equilibrio de la acetilación por las enzimas histona acetiltransferasa (HAT, por sus siglas en inglés) y la desacetilación por las HDAC. Cuando las HDAC se inhiben pero la actividad de las ^hA^t continúa, las histonas se hiperacetilan, alterando así la estructura de la cromatina de alto orden y estimulando la transcripción por la ARN polimerasa III. El efecto de la inhibición de HDAC en la expresión génica no está generalizado, ya que solo el 2 % de los genes de mamíferos se ven afectados por la inhibición de HDAC.

Algunos ácidos grasos de cadena corta (SCFA, por sus siglas en inglés) producidos por el microbioma humano intestinal son inhibidores de HDAC. El butirato en particular se ha identificado como un inhibidor de HDAC in vitro e in vivo, que da lugar a la acumulación de histonas h 3 y H4 hiperacetiladas (Candid et al. 1978 Celda 14:105-113; Boffa et al. 1978 J Biol Chem 253:3364-3366; Vidali et al. 1978 Proc Natl Acad Sci USA 75:2239-2243; Davie. 2003 J Nutrition 133:2485S-2493S). Otros SCFA, propionato, isobutirato, isovalerato, valerato, lactato y acetato también inhiben la desacetilación de histonas, aunque se informa que son menos efectivos que el butirato (Sealy y Chalkley.

1978 Cell 14:115-121; Latham et al. Nucl Acids Res 40:4794-4803, Waldecker et al. 2008 J Nutr Biochem 19:587-593). Según se informa, determinados efectos terapéuticos del butirato están mediados, al menos en parte, por inhibición de las HDAC. Dichos estudios demuestran claramente un papel importante de HDAC en áreas terapéuticas y vinculan directamente los SCFA butirato y propionato, que se producen por el microbioma humano, a resultados funcionales deseables a través de la inhibición de HDAC.

En algunos casos, se somete a ensayo la actividad HDAC de las bacterias consideradas para la asignación a una DBC. Dichas bacterias son útiles en las DBC en las que es deseable la inhibición de HDAC para lograr un resultado terapéutico o en las que se ha identificado un papel para un SCFA. En los ejemplos se proporcionan ejemplos de métodos para tales selecciones.

El presente solicitante ha demostrado que la capacidad de una especie bacteriana para inhibir HDAC está influenciada por la fuente de nutrientes proporcionada a las bacterias. En consecuencia, en algunas indicaciones, se puede proporcionar un prebiótico como parte del uso terapéutico de una DBC. El prebiótico se selecciona, al menos en parte, en función de la capacidad de las bacterias en la DBC para usar el prebiótico como fuente de nutrientes para aumentar la producción de SCFA.

Metabolismo de indoles y triptófano

El indol y sus derivados se han implicado en la fisiología del hospedador (revisado en Zhang y Davies, 2016 Genome Medicine 8:46). Por ejemplo, el indol y el indol-3-aldehído son agonistas del receptor de hidrocarburos de arilo (AhR, por sus siglas en inglés), que, según se informa, inducen la expresión de IL-22 y aumentan la actividad de Th-17. También se ha informado que el indol aumenta la resistencia de las uniones estrechas epiteliales, la producción de mucina y la resistencia a la colonización (Bansal et al. 2010 Proc Nat Acad Sci 107:228-233). El indol-3-acetato, la triptamina y el escatol también son ligandos de (Hubbard et al. 2015. Drug Metabolism and Disposition 43:1522-35) y, por lo tanto, pueden desempeñar funciones similares en la biología del hospedador. El indol-3-propionato, también un producto del metabolismo del triptófano por bacterias comensales, es un ligando para el receptor de pregnano H (PXR). La activación de PXR disminuye el TNFa y aumenta las proteínas de unión estrecha, lo que promueve la homeostasis inmunitaria y mejora la función de la barrera intestinal (Venkatesh et al. 2014. Immunity 41:296-310 and Romagnoli et al. 2016. J Immunol 196 Suppl. 67.10). Asimismo, se ha informado que un agonista de AhR mejora el impacto de la infección por C. difficile en un modelo murino (Julliard et al., Ann. Srg. PMID 27280500). Asimismo, en un estudio en el que se usaron esporas bacterianas procedentes de heces de seres humanos sanos para tratar infecciones recurrentes por C. difficile, se observó un aumento del metabolismo del triptófano; la concentración fecal de triptófano disminuyó y hubo un aumento en algunos derivados del indol (datos no mostrados).

En consecuencia, el presente solicitante ha descubierto que las bacterias seleccionadas son capaces de metabolizar triptófano y, por lo tanto, son adiciones útiles a una DBC. El ejemplo 8, infra, proporciona un ejemplo de un método para identificar y caracterizar dichas bacterias así como también proporciona ejemplos específicos de dichas bacterias.

Utilización de fuentes de carbono

Otra característica útil de una DBC útil para tratar o prevenir un trastorno asociado con la presencia de un patógeno es la competencia por la fuente de carbono, por ejemplo, la inclusión de bacterias en una d Bc que pueden utilizar una o más fuentes de carbono en común con las utilizadas por el patógeno, por ejemplo, un C. difficile. Los ejemplos 3A y 3B proporcionan ejemplos de cómo se puede identificar esta característica y proporcionan ejemplos de especies bacterianas que son útiles, por ejemplo, para tratar o prevenir CDI, y son adecuados para su uso en una DBC.

Formulaciones

En algunos casos, el tratamiento incluye administrar una DBC de la divulgación a un sujeto (por ejemplo, un paciente en riesgo de, recientemente tratado de o que se ha diagnosticado con una infección por C. difficile), comprendiendo la composición la DBC y un transportador farmacéuticamente aceptable. En algunos casos, la DBC es una forma farmacéutica oral. En algunos casos, la DBC comprende, como componente activo, un consorcio de bacterias como se describe en el presente documento en combinación con uno o más transportadores (excipientes) farmacéuticamente aceptables. En la fabricación de las composiciones de la divulgación, la DBC se mezcla normalmente con un excipiente, se diluye con un excipiente o se encierra dentro de dicho transportador en forma de, por ejemplo, una cápsula, sobre, papel u otro recipiente. Cuando el excipiente sirve como diluyente, puede ser un material sólido, semisólido o líquido, que actúa como un vehículo, transportador o medio para el principio activo. Así, una formulación puede estar en forma de comprimido, pastilla, polvo, pastilla para chupar, sobre, sello, elixir, suspensión, emulsión, solución, jarabe, aerosol (como en un medio sólido o líquido), ungüento que contienen, por ejemplo, hasta el 10 % en peso del componente activo, cápsula blanda, cápsula dura, cápsula de gel, comprimido, supositorio, solución o polvo envasado. Los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, PBS, glicerol, manteca de cacao o polietilenglicol.

Al preparar una formulación, la DBC puede molerse para proporcionar el tamaño de partícula apropiado antes de combinarse con los demás ingredientes.

Las composiciones descritas pueden formularse para proporcionar una liberación rápida, sostenida o retardada del componente activo después de la administración al paciente, por ejemplo, para su liberación en el colon, empleando métodos y formas conocidos en la técnica.

Se pueden formular una DBC como forma farmacéutica unitaria, conteniendo cada forma farmacéutica de aproximadamente 102 a aproximadamente 109 esporas, por ejemplo, de aproximadamente 104 a aproximadamente 108 esporas. La expresión "formas farmacéuticas unitarias" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de componente activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado. En algunos casos, más de una forma farmacéutica unitaria constituye una dosis. Por ejemplo, una dosis única puede ser una forma farmacéutica unitaria, dos formas farmacéuticas unitarias, tres formas farmacéuticas unitarias, cuatro formas farmacéuticas unitarias, cinco formas farmacéuticas unitarias o más. En algunos casos, el número de formas farmacéuticas unitarias que constituyen una dosis única es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25 o 30 formas farmacéuticas unitarias. Una sola dosis puede ser, por ejemplo, de 103 a aproximadamente 109 esporas, por ejemplo, de aproximadamente 104 a aproximadamente 108 esporas. En un ejemplo, una dosis es de 1,2, 3 o 4 cápsulas que contienen un total de entre 10e2 y 10e8 esporas en la dosis. En el caso de una sola dosis que tenga múltiples formas farmacéuticas, las formas farmacéuticas generalmente se suministran dentro de un período prescrito, por ejemplo, en 1 hora, 2 horas, 5 horas, 10 horas, 15 horas o 24 horas.

Una composición descrita en el presente documento puede ser eficaz a lo largo de un amplio intervalo de dosificación y se administra generalmente en una cantidad farmacéuticamente eficaz.

Un comprimido o píldora que comprende una composición descrita en el presente documento se puede recubrir o combinar de otro modo para proporcionar una forma farmacéutica, por ejemplo, para facilitar el suministro (por ejemplo, mejorando la deglución) o para mejorar el suministro a un área específica del tracto gastrointestinal como el colon.

En algunos casos, el comprimido o píldora comprende un componente interno que rodea la composición y un componente externo, sirviendo este último como una envoltura sobre el primero. Los dos componentes pueden estar separados por una capa de recubrimiento entérico que sirva para resistir la desintegración en el estómago y permita que el componente interno pase intacto al duodeno o retarde la liberación.

En algunos casos, una formulación que comprende una DBC se administra por vía nasogástrica, por endoscopia u otro método adecuado para suministrar la formulación en o cerca de un sitio deseado, por ejemplo, el tracto intestinal superior (p. ej., estómago y/o duodeno) o el tracto intestinal inferior (p. ej., intestino delgado y/o intestino grueso). Las dosis eficaces pueden extrapolarse a partir de las curvas dosis-respuesta obtenidas de sistemas de ensayo in vitro o con modelos animales o de estudios clínicos.

Asimismo, las formulaciones se pueden administrar opcionalmente en combinación con antiácidos que se conocen en la técnica.

Métodos de tratamiento de una disbiosis

Las DBC como se describen en el presente documento son útiles para la administración a un sujeto, por ejemplo, un mamífero como un ser humano que necesita tratamiento, por ejemplo, para prevenir o tratar una disbiosis. En algunos casos, el sujeto mamífero es un sujeto humano que tiene uno o más síntomas de una disbiosis, incluyendo pero sin limitación, crecimiento excesivo de un patógeno no deseado o un taxón no deseado tal como Enterobacteriaceae o Enterococcus resistentes a vancomicina, representación reducida de uno o más taxones bacterianos clave, como Bacteroidetes o Firmicutes o géneros o especies de los mismos, o diversidad reducida de especies microbianas en comparación con un individuo sano, abundancia total reducida de bacterias anaerobias, o abundancia total reducida de bacterias capaces de llevar a cabo una función particular, por ejemplo, el metabolismo de los ácidos biliares. Como se usa en el presente documento, "tratar una disbiosis" incluye, por ejemplo, tratar una enfermedad asociada a disbiosis, tal como infección por C. diffiále, prevenir infecciones recurrentes por C. diffiále o tratar o prevenir infección por Enterococcus resistentes a vancomicina (VRE, por sus siglas en inglés). Se entiende que prevenir puede significar reducir el riesgo de una disbiosis.

En algunos casos, el sujeto recibe un tratamiento antibiótico antes de la administración de la DBC. En algunos casos, el sujeto recibe un tratamiento antibiótico y no recibe la DBC hasta que han transcurrido al menos un día, dos días, tres días, 5 días, una semana, dos semanas, tres semanas o cuatro semanas desde el tratamiento con antibióticos y antes de la administración de la DBC. En algunos casos, el sujeto recibe múltiples dosis de DBC para asegurar la cobertura del período de dosificación. En algunos casos, el sujeto tiene síntomas de una disbiosis antes de la administración de la DBC. En otros casos, el sujeto no presenta síntomas de disbiosis antes de la administración de la DBC, por ejemplo, la DBC se administra profilácticamente para reducir el riesgo de que una disbiosis provoque síntomas clínicos, por ejemplo, infección con un patógeno.

En algunos casos, la DBC se administra para mejorar los efectos de una enfermedad, trastorno o afección gastrointestinal, por ejemplo, infección por C. diffiále, enteropatía inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), trastorno del intestino irritable u otro trastorno asociado con una disbiosis GI. En algunos casos, la DBC se administra a un sujeto que presenta diarrea u otro síntoma causado por, por ejemplo, C. diffiáile incluyendo infecciones recurrentes por C. diffiále, enteropatía inflamatoria (por ejemplo, colitis ulcerosa, enfermedad de Crohn) o colitis.

En algunos casos, la DBC se administra solo una vez antes de la mejora de la enfermedad, trastorno o afección. En algunos casos, la composición terapéutica se administra a intervalos superiores a dos días, tal como una vez cada tres, cuatro, cinco o seis días, o cada semana o con menos frecuencia que cada semana, por ejemplo, cada dos semanas, cada tres semanas, cada 4 semanas, cada seis semanas, cada ocho semanas, cada doce semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada cuatro meses, o una vez cada seis meses. En algunos casos, la DBC se administra de forma intermitente según un horario establecido, por ejemplo, una vez al día, una vez a la semana, o una vez al mes, o cuando el sujeto recae de la enfermedad primaria. En otro caso, la DBC se administra a largo plazo a personas que están en riesgo de infección o que pueden ser portadoras de estos patógenos, incluidas las personas que se someterán a un procedimiento médico invasivo (como una cirugía), aquellos que van a ser hospitalizados, quienes viven en un centro de atención o rehabilitación a largo plazo, quienes están expuestos a patógenos debido a su profesión (trabajadores de procesamiento de ganado y animales), o quienes podrían ser portadores de patógenos (incluidos los trabajadores de hospitales como médicos, enfermeras y otros profesionales de la salud). En algunos casos, la DBC se administra después del uso de antibióticos para prevenir la aparición de una disbiosis y sus síntomas, tal como diarrea asociada a antibióticos.

También se divulgan en el presente documento métodos para tratar o prevenir un sujeto que sufre o está en riesgo de padecer una enfermedad metabólica y un trastorno o afección seleccionados del grupo que consiste en diabetes, síndrome metabólico, obesidad, cardiopatía, enfermedad autoinmunitaria, enfermedad hepática y autismo usando las composiciones terapéuticas proporcionadas en el presente documento.

En unos casos, la composición de esporas bacterianas generalmente se administra por vía entérica. Por ejemplo, la administración puede ser administración oral a través de una forma para deglución (por ejemplo, una píldora, sobre, cápsula, jarabe o similar), o por una sonda oral o nasal (incluyendo nasogástrica, nasoyeyunal, oral gástrica u oral yeyunal). En otros casos, la administración incluye la administración rectal (por ejemplo, por enema, supositorio o colonoscopia). La DBC se puede administrar en al menos una región del tracto gastrointestinal, incluyendo la boca, esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso o recto. Una DBC se puede administrar por vía oral en forma de un medicamento tal como un polvo, una o más cápsulas, uno o más comprimidos, un gel o un líquido. Una DBC también se puede administrar en forma de gel o líquido por vía oral o a través de una sonda nasogástrica, o por vía rectal en forma de gel o líquido, por enema o instilación a través de un colonoscopio o mediante un supositorio.

El sujeto puede tener una preparación de limpieza de colon antes de la administración de una DBC. Los métodos de limpieza del colon son conocidos en la técnica, como los que se usan para preparar a un sujeto para una colonoscopia. También, el sujeto puede tratarse opcionalmente con un antiácido o un agente tamponador para aumentar el pH del estómago en el momento de la administración de DBC, como se conoce en la técnica y se determina que es apropiado para el sujeto.

Para evaluar a un sujeto, los signos o síntomas de una disbiosis se evalúan después del tratamiento desde 1 día hasta 6 meses después de la administración de la DBC. Un método de evaluación implica la obtención de material fecal del sujeto y la evaluación de los microbios presentes en el tracto gastrointestinal, por ejemplo, utilizando ADNr 16S o análisis de secuenciación metagenómica de escopeta u otros análisis conocidos en la técnica. La población del tracto gastrointestinal por especies bacterianas presentes en la DBC, así como el aumento de microbios comensales que no están presentes en la DBC, se puede utilizar para indicar una mejora en la disbiosis. En caso de infección, se puede utilizar para indicar la eficacia del tratamiento con una DBC una disminución en el nivel de la entidad infecciosa, por ejemplo, C. diffiále, después del tratamiento con una DBC en comparación con el nivel de la entidad infecciosa antes del tratamiento.

Las realizaciones y casos en la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de las realizaciones y no se deben interpretar como limitantes en su alcance. El experto en la materia reconoce fácilmente que se abarcan muchas otras realizaciones. Se apreciará que la presente divulgación incluye, y proporciona contexto para, la invención tal y como se expone en las reivindicaciones adjuntas. En la medida en que el material de las publicaciones y patentes citadas en el presente documento contradiga o sea inconsistente con la presente memoria descriptiva, la memoria descriptiva prevalecerá frente a cualquiera de dicho material. La cita de cualquier referencia en el presente documento no es una admisión de que dichas referencias sean el estado de la técnica.

EQUIVALENTES

Todas las características técnicas se pueden combinar individualmente en todas las combinaciones posibles de dichas características.

Las realizaciones anteriores deben considerarse en todos los aspectos ilustrativas en lugar de limitantes de la invención descrita en el presente documento.

Ejemplos

Tal como se ha indicado anteriormente, las composiciones de la presente invención contienen las especies bacterianas de DBC S12, es decir, Clostridium innocuum, Clostridium bolteae, Blautia producta, Murimonas intestini y Eubacterium contortum. Los siguientes ejemplos no limitantes, que incluyen otras composiciones y cepas, ilustran adicionalmente casos de la divulgación descrita en el presente documento.

Ejemplo 1: Modelo murino de infección por Clostridium difficile (CDI)

La eficacia de las composiciones de prueba se investigó utilizando un modelo de CDI en ratones expuestos (Chen et al., 2008, Gastroenterology 135:1984-1992). El modelo de CDI en ratones se utiliza para demostrar la prevención de la infección. En este modelo, los ratones reciben un tratamiento previo con antibióticos para crear una disbiosis en el intestino que aumenta la susceptibilidad a la CDI. Cuando se exponen con esporas de C. difficile administradas por vía oral, los ratones presentan síntomas de CDI, incluida la pérdida de peso corporal, diarrea y letargo con enfermedad máxima entre los días 2 y 3 después de la inoculación con C. difficile. La infección puede ser letal y la muerte de produce durante el pico de la enfermedad. En los ratones que sobreviven a la infección, los síntomas se resuelven principalmente el día 6 después de la inoculación. Los animales se mantienen en una sala limpia de bioBubble o una instalación equivalente durante la duración del experimento.

Brevemente, del día -14 al -6, los animales (ratones hembra C57BL/6, de nueve a diez semanas de edad) recibieron un cóctel de antibióticos en el agua potable que consistía en un glucosa al 1 %, kanamicina (0,5 mg/ml), gentamicina (0,044 mg/ml), colistina (1062,5 U/ml), metronidazol (0,269 mg/ml), ciprofloxacino (0,156 mg/ml), ampicilina (0,1 mg/ml) y vancomicina (0,056 mg/ml). El día -3, los animales recibieron una dosis de clindamicina de 10 mg/kg por sonda oral. El día -1, los artículos del ensayo, una preparación de esporas derivadas de heces humanas (control de eficacia del estudio; HBS) y FSV (control de FMT humano) se descongelaron en hielo, se centrifugaron durante cinco minutos a 12.100 RCF, se decantaron para eliminar el sobrenadante y se resuspendieron en PBS estéril. Los artículos del ensayo (DBC) se diseñaron con consorcios de bacterias. El control para un inóculo del artículo del ensayo fue PBS estéril. A los animales se les dosificó por sonda oral con un volumen de 0,2 ml del tratamiento apropiado. La figura 2 proporciona un esquema del diseño del estudio.

El día 0, se expuso a los ratones a la administración de aproximadamente 4,5 log10 esporas de C. difficile o PBS estéril (para el grupo de control sin exposición previa) a través de sonda oral. La infección y sus consecuencias se evaluaron mediante la evaluación diaria de la mortalidad, pérdida de peso y signos y síntomas clínicos (la puntuación clínica; puntuación de letargo, aseo, cola/abdomen húmedo e hipotermia).

Ejemplo 2: Artículos de ensayo

El presente solicitante ha analizado aproximadamente 100 DBC diferentes. En un ejemplo de dicho un experimento, el modelo murino descrito en el ejemplo 1 se usó para evaluar la eficacia de varias preparaciones de esporas microbianas administradas por vía oral para tratar/prevenir una infección por Clostridium difficile (CDI). Se analizaron nueve composiciones a dosis estimadas que oscilaban entre 1e2 y 1e5 por especie individual en una composición. Las estimaciones del número de bacterias se basaron en ensayos de unidades formadoras de colonias de esporas (SCFU, por sus siglas en inglés) (es decir, el número de colonias procedentes de esporas cultivadas en una placa a partir de una solución madre). Los métodos para realizar dichos ensayos se conocen en la técnica, que incluyen normalmente un germinante apropiado para la especie a cultivar. Algunas composiciones analizadas se proporcionan en la tabla 3. (supra). Los controles negativos incluyeron PBS solo como tratamiento y animales sin exposición previa (no infectados con C. difficile). Los controles positivos incluyeron el tratamiento con una suspensión de heces de seres humanos sanos (FSV) y el tratamiento con una población de esporas bacterianas derivadas de heces humanas (HBS).

La mortalidad en el grupo no tratado de ratones expuestos a C. difficile era al menos el 20 %. Sorprendentemente, se encontró que algunas composiciones de prueba eran al menos tan efectivas para inhibir/prevenir CDI en el modelo murino como una composición preparada a partir de heces de seres humanos sanos o una preparación de esporas bacterianas preparada a partir de heces de seres humanos sanos (HBS). En general, las composiciones analizadas variaron en su capacidad para mejorar los efectos de la infección por C. difficile en el modelo murino, por ejemplo, disminución máxima del peso corporal desde el valor inicial previo al tratamiento (figura 3), letalidad y signos clínicos. Se observó que algunas composiciones eran eficaces en un amplio intervalo de concentraciones (1e2 a 1e5 SCFU por especie de la composición por ratón). Ejemplos de composiciones eficaces incluyen DBC 4, DBC 6 y DBC 9.

En experimentos adicionales, se demostró que una DBC fue capaz de prevenir la mortalidad relacionada con CDI, prevenir los síntomas relacionados con CDI y disminuir significativamente el cambio negativo en el peso corporal en comparación con los ratones tratados con p Bs expuestos a C. difficile.

En consecuencia, en algunos casos de la divulgación, una DBC puede prevenir o inhibir eficazmente una variedad de características causadas por la infección CDI, por ejemplo uno o más de pérdida de peso, diarrea y mortalidad.

Estos datos demuestran que una composición bacteriana diseñada que contiene un número relativamente limitado de especies bacterianas específicas puede usarse como tratamiento para la prevención de una disbiosis, como se demuestra mediante el tratamiento de CDI en un modelo murino.

Ejemplo 3A: Utilización de carbono

Se sabe que los antibióticos alteran la microflora intestinal, lo que provoca la pérdida de la resistencia a la colonización y prepara el escenario para las infecciones por patógenos, incluido C. difficile (revisado por Keeney et al. 2014 Ann Rev Microbiol, 2 de junio de 2014. doi:10.1146/annurev-micro-091313-103456). La contribución de la competencia de nutrientes a la resistencia a la colonización por C. difficile se sugirió en los primeros experimentos en modelos de flujo continuo en los que se identificaron como fuentes de carbono de C. difficile glucosa, N-acetilglucosamina y un ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) que eran de disponibilidad limitada debido al catabolismo de otros organismos intestinales (Wilson y Perini, 1988 Infection and Immunity 56: 2610-14). Más recientemente, en un modelo de ratón, se asoció la utilización de ácido siálico por C. difficile con mayores niveles de C. difficile (Ng et al. 2013 Nature advance online publication (1 de septiembre de 2013). doi:10.1038/nature12503). En consecuencia, una característica útil de una DBC son las bacterias que tienen la capacidad de utilizar fuentes de carbono que se superponen con las utilizadas por una o más cepas de C. difficile (p. ej., cepas de C. difficile toxigénicas).

En algunos casos de la divulgación, la selección de composiciones incluye la selección de cepas, OTU, o especies que utilizan al menos una fuente de carbono que es utilizada por un patógeno diana. Para demostrar esto, las especies utilizadas en una DBC eficaz para inhibir o prevenir una infección por C. difficile se analizaron para determinar la utilización de fuentes de carbono utilizadas por C. difficile, denominadas en el presente documento "fuentes de carbono de C. difficile". En estos experimentos, se determinó un perfil de utilización de fuentes de carbono para las cepas en una DBC. Se sometió a ensayo el crecimiento en un panel de 59 fuentes de carbono en un formato de placa de 96 pocillos midiendo la densidad óptica de los cultivos. Brevemente, se prepararon soluciones al 1 % de 59 fuentes de carbono y se esterilizaron por filtración. Se llenaron placas de 96 pocillos profundos con 0,4 ml de medio base MCB 2X por pocillo (composición 1X: 10 g/l de extracto de carne de vacuno, 3 g/l de extracto de levadura, 10 g/l de peptona, 5 g/l de NaCl, 6,8 g/l de KH2PO4, 2 mM de MgSO4, CaCl20,5 mM, MgCh 0,1 mM, 0,25 g/l de cisteína (añadida antes de la inoculación, véase a continuación, 10 mg/l de hemina, 1 mg/l de menadiona, 10,5 g/l de MOPS, pH 7). Cada fuente de carbono se añadió a 3 pocillos. Se prepararon dos placas para cada cepa. Cada placa contenía 29 fuentes de carbono, glucosa y 3 pocillos con medio base solamente. Se añadieron 8 pl de solución de cisteína al 2,5 % a cada pocillo antes de la inoculación.

Las cepas bacterianas que se van a utilizar para la inoculación se sembraron a partir de soluciones madre congeladas en placas de infusión de cerebro y corazón (BHI) y se incubaron durante 24 horas a 37 °C. Se transfirió un asa cargada completa de material celular a 5 ml de PBS reducido previamente y se resuspendió.

Se añadieron 8 pl de inóculo a 95 pocillos de cada placa. 1 pozo en cada placa era un control que no recibía células. Las placas se cubrieron con una membrana transpirable y se incubaron a 37 °C en un paquete ziplock durante 72 horas. Se transfirieron 0,2 ml de cada pocillo a una placa transparente de fondo plano de 96 pocillos y se midió la DO600 (densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm) en un espectrofotómetro. La DO600 para cada pocillo se corrigió por el valor de los pocillos inoculados con medio base únicamente. La DO600 promedio se calculó para cada fuente de carbono para cada cepa. Un resultado se consideró positivo si la DO600 promedio corregida era >15 % de la máxima DO600 corregida registrada para una cepa determinada.

Cada cepa creció en múltiples fuentes de carbono (entre 10 y 30 fuentes). Todas las cepas fueron sacarolíticas, usando de 10 a 24 azúcares o alcoholes de azúcar diferentes de los 29 analizados, con la excepción de una cepa, que utilizó sólo 3 azúcares en el panel. Todas las cepas utilizaron glucosa. Siete cepas pudieron usar al menos un aminoácido (de los 15 analizados) como fuente de carbono. Los datos de estos experimentos se muestran en la figura 4.

Se demostró que las cepas de DBC seleccionadas eran capaces de utilizar 26 de las 29 (90 %) fuentes de carbono analizadas utilizadas por C. diffiále, que comprende 19 de las 19 (100%) fuentes de carbohidratos y ácidos carboxílicos analizadas. En consecuencia, en algunos casos, una DBC útil para tratar C. diffiále comprende tipos de bacterias capaces de utilizar fuentes de carbono utilizadas también por C. diffiále, por ejemplo, al menos el 90 % del panel de fuentes de carbono divulgadas en el presente documento.

En consecuencia, en algunos casos, una DBC incluye bacterias no patógenas que pueden utilizar aminoácidos y otros materiales (por ejemplo, azúcares, alcoholes de azúcar, carbohidratos y ácidos carboxílicos) como fuentes de carbono.

Ejemplo 3B: Utilización adicional de carbono

Se realizaron experimentos que complementan los descritos en el ejemplo 3A para ampliar el conocimiento de las fuentes de carbono que pueden utilizar las cepas de C. diffiále y el repertorio de utilización de carbono para bacterias que pueden ser útiles en una DBC.

Tres cepas de C. diffiále y 12 cepas bacterianas que no son C. diffiále se perfilaron utilizando un panel de fuentes de carbono. Como se usa en el presente documento, a menos que se indique otra cosa, las fuentes de carbono incluyen todas las fuentes analizadas como sustratos de cultivo en los experimentos del presente documento. Las tres cepas de C. diffiále fueron Clostridium diffiále ATCC 9689, Clostridium difficile ATCC 43593, y Clostridium diffiále ATCC 43255, disponibles todos ellas en la American Type Culture Collection (ATCC).

El crecimiento de las cepas se analizó en 87 fuentes de carbono diferentes en un formato de placa de 96 pocillos. El panel contenía 34 fuentes de carbono que la bibliografía informa que utiliza C. difficile (Hafiz y Oakley. 1976 J Med Microbiol 9:129-36.; Wilson y Perini. 1988 Infection and Immunity 56:2610-14; Bergey y Holt. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: Williams & Wilkins, 1994; Sebaihia et al. 2006 Nature Genetics 38:779-786) incluyendo amino ácidos, mono, di, tri y polisacáridos, glucósidos y alcoholes de azúcar. Se añadieron fuentes de carbono al 0,5 % en tres medios base diferentes (composición SSNC del medio base 1: 1 g/l de extracto de carne de vacuno, 2 g/l de extracto de levadura, 6 g/l de soytone bacto, 4 g/l de NaCl, 5,44 g/l de KH2PO4, MgSO42 mM, CaCh 1 mM, MnCl20,1 mM, 0,25 g/l de clorhidrato de cisteína, 10 mg/l de hemina, 1 mg/l de menadiona, 6,3 g/l de MOPS, pH 7; Composición del medio base 2 SPOSCR: 1 g/l de extracto de carne de vacuno, 2 g/l de extracto de levadura, 6 g/l de soytone bacto, 4 g/l de NaCl, 5,44 g/l de KH2PO4, MgSO42 mM, CaCl2 1 mM, MnCh 0,1 mM, 0,25 g/l de clorhidrato de cisteína, 10 mg/l de hemina, 1 mg/l de menadiona, 8,4 g/l de MOPS, NaHCO3 al 0,4 %, pH 7; Medio base 3 YCFA: 10 g/l de casitona, 2,5 g/l de extracto de levadura, 1 g/l de clorhidrato de cisteína, 10 mg/l de hemina, 10 ml/l de solución vitamínica de la ATCC, 10 ml/l de solución de oligoelementos de la ATCC, 0,45 g/l K2HPO4, 0,45 g/l de KH2PO4, 0,9 g/l de (NH4)2SO4, 90 mg/l de MgSO4x7H2O, 90 mg/l de CaCl2, ácido acético 33 mM, ácido propiónico 9 mM, ácido isobutírico 1 mM, ácido isovalérico 1 mM, ácido valérico 1 mM, pH 7).

El crecimiento positivo se calificó midiendo la densidad óptica a 600 nm y comparándolo con el crecimiento en medio base sin fuente de carbono añadida. Para dos, la producción de ácido del medio base también se calificó midiendo la densidad óptica a 558 nm de rojo fenol indicador de pH mezclado con medio utilizado de cada cultivo.

Las tres cepas de C. difficile metabolizaron una variedad de fuentes de carbono; 53 de las 87 fuentes de carbono analizadas se utilizaron por al menos una cepa (tabla 5). Las tres cepas eran sacarolíticas, usando diferentes azúcares o alcoholes de azúcar, y las tres cepas usaron aminoácidos como fuente de carbono (tabla 5 y tabla 6). Cuatro de las fuentes de carbono indicadas como que C. difficile las utiliza, tal como se ha indicado anteriormente, no tuvieron resultado con las tres cepas de C. difficile analizadas en este ensayo (almidón, sacarosa, glucógeno y dulcitol), Otras 23 fuentes de carbono en el panel tuvieron al menos un resultado para al menos una de las tres cepas de C. difficile, dando lugar a un número total de fuentes de carbono de C. difficile detectadas de 53.

De 53 fuentes de carbono utilizadas por C. difficile en este ensayo, las cepas bacterianas individuales probadas utilizaron de 16 a 29 en al menos un medio base. Los patrones de utilización de fuentes de carbono de cepas que no son de C. difficile diferían de las de las cepas de C. difficile con fuentes de carbono superpuestas que oscilan entre el 30 y el 55 %. Todas las cepas bacterianas analizadas juntas pueden utilizar 52 de las 53 (98 %) fuentes de carbono utilizadas por C. difficile. Estos datos demuestran que la cepas bacterianas que no son C. difficile pueden utilizar múltiples fuentes de carbono de C. difficile. Esta característica de las bacterias que pueden competir por múltiples fuentes de carbono con un patógeno es útil para diseñar una DBC, por ejemplo, mediante la inclusión de bacterias en una DBC que pueden utilizar múltiples fuentes de carbono que también pueden sutilizarse por C. difficile.

Los datos de la tabla 6 indican que una característica útil de una DBC es la inclusión de bacterias que juntas pueden utilizar una variedad de fuentes de carbono, particularmente dada la variabilidad en el uso de fuentes de carbono por diferentes cepas de C. difficile.

Las fuentes de carbono indicadas como que las utiliza C. difficile pero negativas en este experimento se utilizan cada una por al menos cuatro de las cepas que no son C. difficile. Por lo tanto, incluso cuando se caracterizan múltiples cepas de un patógeno mediante la utilización de fuentes de carbono, puede ser deseable una DBC que tiene un amplio perfil de utilización de carbono que cubre incluso algunas fuentes no utilizadas por las cepas de C. difficile del ensayo.

Estos datos muestran que las cepas bacterianas seleccionadas pueden utilizar múltiples fuentes de carbono de C. difficile, incluyendo mono, di, tri y polisacáridos, alcoholes de azúcar, glucósidos, ácidos carboxílicos, alcoholes, sales biliares y aminoácidos. Se ha informado que los azúcares del hospedador liberados por la microbiota, como el ácido siálico, facilitan la expansión de C. difficile en modelos de infección en animales. La etanolamina es otro compuesto derivado del hospedador que puede dar a los patógenos una ventaja competitiva en el entorno GI, y C. difficile tiene un operón para la utilización de etanolamina (Ng et al. Nature advance online publication (1 de septiembre de 2013). doi:10.1038/naturaleza12503; Garsin Nat Rev Microbiol. 8 de abril de 2010; 8(4): 290-5. doi: 10.1038/nrmicro2334). En estos experimentos, se confirmó que C. difficilemetaboliza tanto ácido siálico como etanolamina. En consecuencia, en algunos casos, son útiles cepas de DBC que pueden utilizar, por ejemplo, ácido siálico y/o etanolamina. Ocho y tres cepas de las 12 cepas seleccionadas también pudieron utilizar ácido siálico y etanolamina, respectivamente. Estos datos respaldan un modelo en el que la competencia por las fuentes de carbono puede contribuir al mecanismo de eficacia contra C. difficile de una DBC que incluye bacterias que tienen la capacidad de utilizar ácido siálico y etanolamina.

Tabla 5. Fuentes de carbono utilizadas por las tres cepas de C. difficile analizadas y el número de cepas que dieron positivo para una fuente de carbono determinada.

Tabla 6: Comparación del perfil de utilización de fuentes de carbono de C. difficile y cepas bacterianas que no son C. difficile seleccionadas. La columna de la izquierda indica la fuente de carbono. "+" y "w" se refieren a la utilización "positiva" y "débil" de la fuente de carbono, respectivamente. De las 87 fuentes de carbono analizadas, se presentan 53 utilizadas por C. difficile. Los cuadros en blanco indican que no hay crecimiento detectable; todas las fuentes de carbono se analizaron para todas las cepas.

continuación

Ejemplo 4: Metabolismo de ácidos biliares/Análisis cromatográficos de capa fina

La producción de ácidos biliares secundarios y terciarios es el resultado de la modificación secuencial de los ácidos biliares primarios a través de una serie de reacciones catalizadas por enzimas bacterianas específicas (p. ej., Ridlon et al., 2006, J Lipid Res 47: 241-259). Para causar enfermedad, las esporas de C. diffiále germinan primero en el tracto GI del hospedador y la germinación de las esporas de C. diffiále puede promoverse por determinados ácidos biliares. Además, el crecimiento vegetativo de C. diffiále está limitado por ciertos metabolitos de ácidos biliares. En consecuencia, una característica funcional útil de una DBC es la capacidad de catalizar la conversión de grupos de ácidos biliares que promueven la germinación de C. diffiále a grupos que no promueven la germinación y/o inhiben la germinación o el crecimiento de C. diffiále. Por ejemplo, en algunos casos, se incluyen en una DBC bacterias que pueden expresar enzimas que convierten los ácidos biliares que promueven C. diffiále en ácidos biliares que no promueven la germinación de C. diffiále. Las composiciones que incluyen dichas bacterias son útiles para tratar o prevenir una infección por C. diffiále; por ejemplo, para prevenir la recurrencia de infecciones por C. diffiále. En un ejemplo, las bacterias seleccionadas para una DBC pueden expresar al menos una, dos o tres actividades enzimáticas que son clave en la regulación de los ácidos biliares, por ejemplo, hidrolasa de sales biliares (BSH), hidroxiesteroide deshidrogenasa (7, 3 o 12 a-HSDH) y 7a-deshidroxilasa. Los métodos para identificar dichas bacterias se proporcionan en ejemplos no limitantes, infra.

Selección de actividad de hidrolasa de sales biliares (BSH) mediante cromatografía de capa fina (TLC, por sus siglas en inglés)

La desconjugación de ácidos biliares conjugados está catalizada por hidrolasas de sales biliares (BSH), que expresan algunas especies bacterianas aisladas del tracto GI humano y animal. Especies bacterianas tan diversas como Clostridia, Bacteroides, Bifidobacteria, y Lactobacilli pueden expresar una BSH funcional. La desconjugación es una etapa necesaria para el procesamiento posterior de los ácidos biliares conjugados por el microbioma Gl y, por lo tanto, desempeña un papel importante en la configuración de la composición de ácidos biliares del tracto Gl. Se ha demostrado que algunos ácidos biliares conjugados promueven la germinación de las esporas de C. diffiále y, por lo tanto, puede ser beneficioso disminuir su concentración.

En experimentos para analizar la capacidad de las bacterias de DBC candidatas para demostrar la actividad BSH, las bacterias se cultivaron durante 24 a 48 horas para generar suficiente biomasa. Para las cepas bacterianas seleccionadas, las placas de siembra en estrías se generaron en agar de infusión de cerebro y corazón (BHI) o en agar de sangre de brucella (BBA, por sus siglas en inglés), dependiendo de la cepa que se esté analizando. Los céspedes bacterianos se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para crear una suspensión homogénea que luego se usó para el ensayo de BSH. Para analizar la actividad BSH, las suspensiones bacterianas se incubaron por separado con cuatro ácidos biliares conjugados diferentes, cada ácido biliar a una concentración de 5 mg/ml. Las cepas se incubaron con los correspondientes ácidos biliares durante 4 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. Los ácidos biliares analizados en este ensayo incluyen ácido glicocólico (glicolato; gCA), ácido taurocólico (taurocolato; tCA), ácido glucoquenodesoxicólico (glucocenodesoxicolato; gCDCA) y ácido tauroquenodesoxicólico (tauroquenodesoxicolato; tCDCA).

Después de la incubación, las placas se centrifugaron para sedimentar bacterias y el sobrenadante de cada pocillo se cargó en placas de TLC recubiertas de sílice. Las muestras se sometieron a cromatografía en tampón (benceno:isopropanol:ácido acético; 30:30:1) y se revelaron con tinción con p-anisaldehído utilizando métodos conocidos en la técnica. La actividad BSH se determinó mediante la formación de productos de ácidos biliares desconjugados que aparecen como bandas adicionales en las placas de TLC. Los ácidos biliares se verificaron por comparación con patrones conocidos ejecutados en paralelo en cada placa de TLC.

Selección de actividad hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSDH) mediante cromatografía de capa fina (TLC)

Los ácidos biliares secundarios desconjugados se modifican aún más en lo que algunos denominan ácidos biliares terciarios mediante reacciones catalizadas por enzimas bacterianas. Esto incluye la oxidación de los ácidos biliares a sus formas cetogénicas a través de la actividad de las enzimas HSDH bacterianas específicas de los grupos 7, 3 o 12-hidroxilo. Las enzimas HSDH pueden estar presentes en varias especies de bacterias intestinales, entre ellas, por ejemplo, Clostridia, Ruminococci y Eggerthella (Tanaka et al., 1999, J Dairy Sci 82:2530-2535; Baron et al., 1991, J Bact 173:4559-4569).

Ensayo de actividad 7a-HSDH usando TLC

Los candidatos bacterianos seleccionados para su inclusión en una DBC se cultivaron y resuspendieron como se describe supra. Para analizar la actividad 7a-HSDH, las suspensiones bacterianas se incubaron en condiciones aerobias con ácido cólico (colato; CA) o ácido quenodesoxicólico (quenodesoxicolato; CDCA), cada uno a una concentración de 200 pM, durante 4 horas a 37 °C. Cada ácido biliar se analizó por separado con cada cepa.

Después de la incubación, las placas se centrifugaron para sedimentar bacterias y el sobrenadante de cada pocillo se cargó en placas de TLC recubiertas de sílice. Las muestras se sometieron a cromatografía en tampón (benceno:dioxano:ácido acético; 70:20:4) y se revelaron con una tinción de cerio-amonio-molibdato utilizando métodos conocidos en la técnica. La actividad HSDH se determinó mediante la formación de productos de ácido 7-oxo-biliar previstos que aparecían como bandas adicionales en las placas de TLC. Los ácidos biliares se verificaron por comparación con patrones conocidos ejecutados en paralelo en cada placa de TLC. Los resultados se ilustran en la figura 5.

Ensayo de actividad 3a-HSDH usando TLC

Las bacterias se cultivaron en placas con medios apropiados durante 24 a 48 horas para generar suficiente biomasa. Para las cepas bacterianas candidatas, las placas de siembra en estrías se cultivaron en agar BHI. Los céspedes bacterianos se resuspendieron en PBS para crear una suspensión homogénea que luego se usó para el ensayo de HSDH. Para analizar la actividad 3a-HSDH, las suspensiones bacterianas se incubaron en condiciones aerobias con ácido cólico, ácido desoxicólico (desoxicolato; DCA) o ácido quenodesoxicólico, cada uno a una concentración de 100 pM, durante 18-24 horas a 37 °C. Cada ácido biliar se analizó por separado con cada cepa.

Después de la incubación, las placas se centrifugaron para sedimentar bacterias y el sobrenadante de cada pocillo se cargó en placas de TLC recubiertas de sílice. Las muestras se sometieron a cromatografía en tampón (benceno:dioxano:ácido acético) y primero se revelaron con una tinción de ácido fosfomolíbdi

formación de productos de ácidos oxo-biliares utilizando métodos conocidos en la técnica. Las cepas candidatas que mostraron actividad HSDH se analizaron de manera específica para determinar la actividad 3-oxo HSDH utilizando una segunda ejecución en placas de TLC recientes. El segundo juego de placas se reveló con tinción con p-anisaldehído para distinguir los ácidos biliares 3-oxo (teñidos de rosa) de otras bandas (Devlin et al., 2015, Nat Chem Biol DOI:1-.1038/NCHEMBIO.1864). La formación de productos de ácidos 3-oxo-biliares previstos que aparecieron como bandas adicionales en las placas de TLC confirmó la presencia de actividad 3a-HSDH en una cepa. Los ácidos biliares se verificaron por comparación con patrones conocidos ejecutados en paralelo en cada placa de TLC. Los resultados se ilustran en la figura 5.

Resultados

En conjunto, diez de las doce especies bacterianas analizadas en los ensayos de actividad de ácidos biliares mostraron al menos una de las tres clases de actividad metabolizadora de ácidos biliares, es decir, actividad BSH, 7a-HSDH o 3a-HSDH (figura 5) mediante TLC. En la figura 5, los recuadros oscuros representan un resultado positivo para la actividad que metaboliza el sustrato específico indicado. Los cuadros de color claro representan la ausencia de un resultado positivo detectable utilizando este método. El presente solicitante señala que el uso de métodos más sensibles como LCMS, como se demuestra en el ejemplo 5, infra, puede revelar actividades adicionales con niveles inferiores.

Sorprendentemente, estos datos también indican que puede haber especificidades de sustrato variables dentro de cada tipo de actividad enzimática. Por ejemplo, solamente T. sanguinis demostró la capacidad de desconjugar los cuatro ácidos biliares conjugados que se analizaron y M. intestini fue la única especie analizada que demostró actividad 3a-HSDH con los tres ácidos biliares analizados.

Estos datos demuestran métodos que se pueden usar para seleccionar un consorcio de bacterias para incluir en una DBC que proporcionará un alto nivel de una o más actividades de metabolización de ácidos biliares, alterando así el grupo de ácidos biliares disponibles para promover la germinación de C. difficile, o para inhibir la germinación o crecimiento de C. difficile.

Se pueden usar otros métodos para evaluar las actividades de los ácidos biliares, por ejemplo, métodos LCMS.

Ejemplo 5: Metabolismo de ácidos biliares/analizado usando LC-MS

Para mejorar la sensibilidad de detección de la actividad enzimática relacionada con el metabolismo de los ácidos biliares en comparación con el método de TLC, se utilizó un método que usa cromatografía líquida con espectroscopia de masas (LCM^s , por sus siglas en inglés). Los ácidos biliares y otras moléculas pequeñas se pueden identificar y cuantificar con precisión utilizando un enfoque basado en cromatografía liquida-espectrometría de masas (LC-MS) (Kakiyama et al. 2014 J Lipid Res 55: 978-990). Para la mayoría de los ácidos biliares, el ensayo de TLC demuestra un límite inferior de detección en el intervalo de 10-50 pM, mientras que el enfoque de LC-MS prolonga este intervalo inferior de detección a 50-100 nM, aumentando la sensibilidad en 100 veces o más en muchos casos.

Evaluación del metabolismo secundario de los ácidos biliares en el microbioma GI

Selección por LC-MS para determinar actividad hidrolasa de sales biliares (BSH)

La producción de ácidos biliares secundarios y terciarios es el resultado de la modificación secuencial de los ácidos biliares primarios a través de una serie de reacciones catalizadas por enzimas bacterianas específicas. La primera etapa de este proceso, que da como resultado la eliminación de los grupos glicina o taurina de los ácidos biliares primarios para liberar ácidos biliares no conjugados libres, se denomina desconjugación. La desconjugación de los ácidos biliares primarios está catalizada por hidrolasas de sales biliares (BSH). La desconjugación es una etapa necesaria para el procesamiento posterior de los ácidos biliares secundarios por parte del microbioma intestinal y, por lo tanto, desempeña un papel importante en la configuración de la composición de ácidos biliares del intestino.

Para realizar el ensayo, brevemente, las bacterias se cultivaron en placas con medio de agar permisivo durante 24 a 48 horas para generar suficiente biomasa para realizar los ensayos. Los céspedes bacterianos se resuspendieron en PBS para crear una suspensión homogénea que luego se usó para el ensayo de BSH. Para analizar la actividad BSH, se incubaron suspensiones bacterianas con dos mezclas separadas de cuatro ácidos biliares conjugados distintos, cada uno a una concentración de 150 pg/ml, durante 4 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. A continuación, la mezcla de reacción se extrajo con un volumen igual de acetonitrilo, se centrifugó para sedimentar bacterias y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 pM para generar una muestra para el análisis por LC-MS. Los ácidos biliares se determinaron utilizando HPLC con Agilent 1260 acoplado a un Bruker Compact de qTOF MS. Las muestras se procesaron en una columna bidentada C18 usando un sistema tampón de acetonitrilo:agua para separar los ácidos biliares que luego se ionizaron en modo negativo y se identificaron usando qTOF-MS. La actividad BSH se determinó mediante la formación de productos de ácidos biliares desconjugados que se verificaron por comparación con patrones conocidos y se cuantificaron, en caso necesario, utilizando curvas patrón. Los ácidos biliares primarios analizados en este ensayo incluyeron ácido glico/taurocólico, ácido glico/tauro-quenodesoxicólico y ácido glico/tauro-muricólico.

Selección por LC-MS para determinar actividad hidroxiesteroide deshidrogenasa (HSDH)

Los ácidos biliares secundarios desconjugados se modifican aún más en ácidos biliares terciarios a través de reacciones catalizadas por enzimas bacterianas. Esto incluye la oxidación de los ácidos biliares a sus formas cetogénicas a través de la actividad de las enzimas HSDH bacterianas específicas de los grupos 7, 3 o 12-hidroxilo.

Para analizar la actividad HSDH, ase prepararon suspensiones bacterianas como se describe anteriormente para el ensayo con LC-MS de BSH. Para analizar la actividad HSDH, las suspensiones bacterianas se incuban primero con una mezcla de ácido cólico, ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico y ácido litocólico a 75 pg/ml cada uno durante 18 a 24 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. Después, las placas de ensayo se retiraron de la cámara anaeróbica y se incubaron en condiciones aerobias a 37 °C durante 4 horas para promover la oxidación de los ácidos biliares. Una vez finalizada la incubación, la mezcla de reacción se extrajo con un volumen igual de acetonitrilo, se centrifugó para sedimentar bacterias y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 pM para generar una muestra lista para el análisis por LC-MS. Los ácidos biliares en las muestras se sometieron a ensayo como se describe anteriormente para el ensayo con LC-MS de BSH. La actividad HSDH se determinó mediante la formación de productos de ácidos cetobiliares que se verificaron por comparación con patrones conocidos y se cuantificaron, en caso necesario, utilizando curvas patrón.

Selección por LC-MS para la actividad de 7a-deshidroxilación (7a-OH)

Además de la oxidación, los ácidos biliares secundarios también pueden modificarse mediante la eliminación del grupo hidroxilo en la posición 7a, dando como resultado la generación de ácidos biliares terciarios. Esto incluye la conversión de ácido cólico en ácido desoxicólico y la conversión de ácido quenodesoxicólico en ácido litocólico. La reacción de 7a-deshidroxilación está catalizada por un proceso de varias etapas, incluyendo una serie de enzimas que permanecen sin caracterizar.

Las suspensiones bacterianas se prepararon como se describe anteriormente para las selecciones con LC-MS de BSH. Para analizar la actividad de deshidroxilación, las suspensiones bacterianas se incubaron con una mezcla de ácido cólico y ácido quenodesoxicólico a 150 pg/ml cada uno durante 18 a 24 horas a 37 °C en condiciones anaerobias. Esta etapa es necesaria para la inducción de enzimas implicadas en la reacción. Después, las placas de ensayo se retiraron de la cámara anaeróbica y se incubaron en condiciones aerobias a 37 °C durante 4 horas para promover la deshidroxilación de los ácidos biliares. Después de haber finalizado la incubación, la mezcla de reacción se extrajo con un volumen igual de acetonitrilo, se centrifugó para sedimentar bacterias y el sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,2 pM para generar una muestra lista para el análisis por LC-MS. Los ácidos biliares se analizaron usando LC-MS como se describe anteriormente. La actividad 7a-OH se determinó mediante la formación de ácido desoxicólico y ácido litocólico, se verificó por comparación con patrones conocidos, y se cuantificó en caso necesario utilizando curvas patrón.

Resultados

Las tablas 7 y 8 proporcionan los resultados de los análisis de LC-MS de la producción de ácidos biliares por varias cepas bacterianas. La tabla 7 enumera los resultados del análisis de ácidos biliares por LC-MS para el subconjunto de cepas mencionadas en la tabla 9, demostrando la mayor sensibilidad y cobertura disponible con un ensayo basado en LC-MS. La tabla 8 describe la actividad de los ácidos biliares de varias cepas adicionales, en función del análisis por LC-MS. En las tablas, '+' indica un aumento de más de 50 veces en los niveles de ácidos biliares del producto, sugiriendo una fuerte actividad, '+/-' indica un cambio de < 50 veces en los niveles de ácidos biliares del producto, sugiriendo actividad débil, mientras que '-' indica una completa falta de actividad en las condiciones analizadas. Se usaron cepas con actividad conocida/publicada como controles para monitorizar cada tipo de reacción.

En general, los datos generados usando LC-MS para analizar el metabolismo de los ácidos biliares por especies bacterianas fueron consistentes con los datos obtenidos usando TLC. Sin embargo, la mayor sensibilidad del método LC-MS reveló actividades adicionales; por ejemplo se demostró que C. glycolicum no tiene actividad BSH sobre gCDCA por TLC, pero la mayor resolución del análisis LC-MS mostró que la bacteria conserva la actividad BSH sobre gCDCA. Además, el enfoque de LC-MS permitió la caracterización de una actividad adicional, 7a-deshidroxilación, que anteriormente era difícil de resolver por TLC.

Estos datos demuestran que el uso del ensayo de LC-MS para identificar las actividades de metabolización de ácidos biliares de las especies bacterianas proporciona una mayor precisión al diseñar una composición bacteriana, tales como el diseño de una DBC para tener una amplia gama de actividades de metabolización de ácidos biliares. Por ejemplo, el tratamiento con esta DBC puede disminuir los niveles de ácidos biliares primarios que promueven la germinación de C. diff al mismo tiempo que aumenta los ácidos biliares secundarios que inhiben el crecimiento de C. diff. Seleccionar preferentemente cepas que maximicen estas actividades en una DBC puede aumentar la eficacia de una composición para tratar infecciones por C. diff. En algunos casos, el uso del ensayo LC-MS u otro ensayo con sensibilidad equivalente puede facilitar el diseño de una composición bacteriana que cubra una gama de actividades de metabolización de ácidos biliares con menos especies de las que se usarían en una composición si se usara un ensayo menos sensible. La minimización del número de especies en una composición puede ser una característica útil, por ejemplo, porque puede reducir la cantidad de bacterias que deben suministrarse, lo que hace que la dosis sea más fácil de suministrar (por ejemplo, como una forma farmacéutica oral) y puede ser más eficiente para la fabricación, así como los costes de composición, ya que se deben realizar menos fermentaciones por separado. Además, cuando se realiza el ensayo in vitro, las mezclas de bacterias pueden mostrar actividades de metabolización biliar que las cepas individuales no tienen. Esto puede permitir la modulación de las composiciones y el tamaño de la composición, ya que las mezclas pueden tener actividades que las cepas individuales no tienen.



Ejemplo 6: Composiciones bacterianas seleccionadas por características funcionales

Diseño experimental

Para investigar más a fondo la funcionalidad de una DBC, se diseñaron DBC adicionales que poseían o no poseían características seleccionadas. La eficacia de las composiciones de prueba adicionales se investigó usando el modelo de CDI por exposición en ratones esencialmente como se describe supra (Chen et al., 2008, Gastroenterology 135:1984-1992). El modelo de CDI en ratones se utiliza para demostrar la prevención de la infección. En este modelo, los ratones reciben un tratamiento previo con antibióticos para crear una disbiosis en el intestino que aumenta la susceptibilidad a la CDI. Cuando se exponen con esporas de C. difficile administradas por vía oral, los ratones presentan síntomas de CDI, incluida la pérdida de peso corporal, diarrea y letargo con enfermedad máxima entre los días 2 y 3 después de la inoculación con C. difficile. La infección puede ser letal y la muerte de produce durante el pico de la enfermedad. En los ratones que sobreviven a la infección, los síntomas se resuelven principalmente el día 6 después de la inoculación. Los animales se mantienen en una sala limpia de bioBubble o una instalación equivalente durante la duración del experimento.

Brevemente, en estos experimentos, del día -14 al -6, los animales (ratones hembra C57BL/6, de nueve a diez semanas de edad) recibieron un cóctel de antibióticos en el agua potable que consistía en un glucosa al 1 %, kanamicina (0,5 mg/ml), gentamicina (0,044 mg/ml), colistina (1062,5 U/ml), metronidazol (0,269 mg/ml), ciprofloxacino (0,156 mg/ml), ampicilina (0,1 mg/ml) y vancomicina (0,056 mg/ml). El día -3, los animales recibieron una dosis de clindamicina de 10 mg/kg por sonda oral. El día -1, los artículos de ensayo se centrifugaron durante cinco minutos a 12.100 RCF para sedimentar bacterias, se decantaron para eliminar el sobrenadante y se resuspendieron en PBS estéril. Los artículos de prueba incluyeron FSV (un control de FMT humano), SC (una composición de esporas microbianas de origen humano para comparar la eficacia del estudio entre estudios) y consorcios de bacterias diseñados (DBC). El control para los inóculos de los artículos de prueba fue PBS estéril. A los animales se les dosificó por sonda oral con un volumen de 0,2 ml del tratamiento apropiado. La figura 2 proporciona un esquema del diseño del estudio.

El día 0, se expuso a los ratones a la administración de aproximadamente 4,5 log10 esporas de C. difficile o PBS estéril (para el grupo de control sin exposición previa) a través de sonda oral. La infección y sus consecuencias se evaluaron mediante la evaluación diaria de la mortalidad, pérdida de peso y signos y síntomas clínicos (la puntuación clínica; puntuación de letargo, aseo, cola/abdomen húmedo e hipotermia).

Artículos de ensayo

Como se describe en el ejemplo 2, el presente solicitante ha analizado DBC adicionales usando el modelo murino descrito en los ejemplos 1 y 2, supra para evaluar la eficacia de varias preparaciones de esporas microbianas administradas por vía oral para tratar/prevenir infección por Clostridium difficile(CDI). Se analizaron veinticuatro composiciones adicionales como se describe en este ejemplo a dosis estimadas de 1e5 unidades formadoras de colonias de esporas (SCFU) por especie individual en una composición. Veinte de estas composiciones se seleccionaron de manera que en cada uno de los diez pares, todas las cepas en una composición compartían un fenotipo seleccionado mientras que en la composición correspondiente, todas las cepas carecían de ese fenotipo. Algunas composiciones analizadas se proporcionan en la tabla 4. Los controles negativos incluyeron PBS solo como tratamiento y animales sin exposición previa (no infectados con C. difficile). Los controles positivos incluyeron el tratamiento con una suspensión de heces de seres humanos sanos (FSV) y el tratamiento con una población de esporas bacterianas procedentes de heces humanas (SC) con dosis de 1E4 a 1E7 SporQ por ratón.

Resultados

Los resultados de este experimento se presentan en la tabla 9. La mortalidad en el grupo de ratones sin tratar expuestos con C. difficile fue del 20% y su peso relativo mínimo promedio fue de 0,81. Sorprendentemente, se descubrió que algunas composiciones eran eficaces para inhibir/prevenir la CDI en el modelo murino y algunas eran al menos tan eficaces como una composición preparada a partir de heces de ratones sanos o una preparación de esporas bacterianas preparada a partir de heces de seres humanos sanos (SC). En general, las composiciones analizadas variaron en su capacidad para mejorar los efectos de la infección por C. difficile en el modelo murino, por ejemplo, cambio en el cuerpo mínimo, letalidad y signos clínicos. En algunos casos, una DBC eficaz para tratar o prevenir la CDI es una DBC que tiene un valor P de peso relativo mínimo con respecto al control de PBS de <0,0001. Los ejemplos no limitantes de tales composiciones incluyen DBC S1, DBC S2, DBC S4, DBC S6 y DBC S7. En otros casos, una DBC eficaz para tratar o prevenir la CDI es una DBC que tiene un valor P de peso relativo mínimo con respecto al control de PBS de <0,05. Otros casos incluyen una DBC que tiene una característica específica que generalmente tiene una puntuación de mortalidad acumulada baja (por ejemplo, DBC S6, que se compone de especies bacterianas que se informó que tienen una alta tasa de injerto en un estudio Ph 1b/2 de sujetos con CDI recurrente múltiple que recibieron una preparación de esporas microbianas complejas procedentes de heces de seres humanos sanos y una alta prevalencia en microbiota de seres humanos sanos (cohorte HMP). En algunos casos, una DBC útil tiene una característica específica y una mortalidad acumulada baja en comparación con una DBC que carece de la característica, por ejemplo, DBC S19 (seleccionada por la característica de crecimiento en alcoholes de azúcar) y DBC S17 (seleccionada por la característica de producción de indol), DBC S7 (seleccionada por actividad HDAC, que es indicativa de la producción de SCFA) y DBC S4 (cepas en el cluster XlVa de clostridios).

En algunos casos, los pares diseñados para tener características de contraste fueron efectivos. Por ejemplo, DBC S21 y DBC S22 se diseñaron para que tuvieran la capacidad de usar fucosa como fuente de nutrientes y la incapacidad de usar fucosa como fuente de nutrientes, respectivamente. El presente solicitante señala que la capacidad de una composición que carece de una característica para ser eficaz no indica que la característica no sea útil, sino simplemente que puede haber funciones alternativas y vías disponibles para aquellas especies que dan como resultado el fenotipo de mejorar una infección por C. difficile. En algunos casos, la selección de especies para una DBC que tienen tantas capacidades múltiples es útil, por ejemplo, para limitar el número de tipos bacterianos (p. ej., especies) necesarios para proporcionar múltiples funciones.

Un ejemplo de un par de composiciones que tuvo resultados discordantes fue DBC S19 y DBC S20, diseñadas de tal manera que todos los miembros de DBC S19 pudieran utilizar los alcoholes de azúcar que se analizaron y todos los miembros de DBC S20 no pudieran utilizar esos alcoholes de azúcar. En este caso, DBC S19 fue eficaz para prevenir los síntomas de CDI y DBC S20 no; una comparación de las dos DBC mostró que eran estadísticamente diferentes entre sí con respecto al peso relativo mínimo (p < 0,0001). Por lo tanto, puede ser ventajoso incluir una o más especies bacterianas que puedan utilizar alcoholes de azúcar en una composición, por ejemplo, una composición para tratar o prevenir una infección por C. difficile.

Otro ejemplo de un par de DBC discordantes es DBC S17 (productora de indol) y DBS S18 (no productora de indol). Los datos de este par indican que la inclusión de al menos una bacteria productora de indol en una DBC es útil en una composición, por ejemplo, una composición para tratar o prevenir una infección por C. difficile. Los resultados del par de actividad HDAC frente a sin actividad HDAC son consistentes con los datos proporcionados en el ejemplo 7, infra. Además, las bacterias HDAC más (actividad), así como las bacterias productoras de indol, fueron eficaces para prevenir la pérdida de peso asociada con C. difficile (pérdida de peso máxima para DBC HDAC positiva e indol positiva no significativamente diferente del control con PBS que no se había expuesto a C. difficile ). De forma análoga, la inclusión de una cepa de cluster XIVa de clostridios puede ser una característica útil para dichas composiciones. Aunque no es un efecto tan sólido como algunos (P = 0,82 para BSH en comparación con sin BSH), la presencia de actividad BSH dio lugar a resultados ventajosos y, en consecuencia, puede ser útil la inclusión de una o más bacterias que tengan actividad BSH. El presente solicitante señala que estas son guías útiles para la inclusión de bacterias en el diseño de una DBC, pero no deben interpretarse como una base para excluir bacterias que no tienen dichas características.

En consecuencia, en algunos casos de la divulgación, una DBC que tiene determinadas características definidas puede tratar o prevenir de manera eficaz una variedad de características asociadas con la infección por CDI, por ejemplo uno o más de pérdida de peso, diarrea y mortalidad. En algunos casos, los fenotipos seleccionados discriminan entre las composiciones que son eficaces y las que no lo son, mientras que en otros casos, los pares de composiciones que contienen cepas con fenotipos de contraste son eficaces.

Estos datos demuestran que una composición bacteriana diseñada que contiene un número relativamente limitado de especies bacterianas específicas puede usarse como tratamiento para la prevención de una disbiosis, como se demuestra mediante el tratamiento de CDI en un modelo murino.

Asimismo, se pueden utilizar dichas composiciones de DBC seleccionadas por determinadas características y que se ha demostrado que tienen una actividad deseada, por ejemplo, mejora de la CDI, como base para una composición más compleja a la que se añaden especies bacterianas adicionales, incluyendo aquellas que tienen características seleccionadas adicionales. DBC4, DBC6 y DBC9 son ejemplos no limitantes de dichas composiciones como lo son otras composiciones divulgadas en el presente documento y que pueden construirse usando la orientación proporcionada en el presente documento.

 Ejemplo 7: Propiedades funcionales de las especies de DBC; actividad histona desacetilasa (HDAC) en especies de DBC

El presente solicitante ha identificado la inhibición de la actividad histona desacetilasa a través de la producción de SCFA como una función útil de algunas DBC. En consecuencia, el presente solicitante sometió a ensayo a varias bacterias para determinar su capacidad para inhibir la actividad HDAC.

El ensayo de inhibición de HDAC puede detectar SCFA in vitro

Para determinar si un sistema de detección de HDAC disponible comercialmente era útil para analizar la inhibición de HDAC por SCFA, se probó el kit de ensayo HDAC-Glo I/II de Promega (véase, Halley et al. 2011 J Biomol Screen 16:1227-35). Para este experimento, el extracto nuclear de HeLa proporcionado en el kit se utilizó como fuente de enzimas HDAC. Se eligió el kit HDAC-Glo I/II porque se ha informado que el butirato inhibe la mayoría de las enzimas de la familia HDAC I y II, con la excepción de HDAC6 y HDAC10 (Davie 2003 J Nutrition 133:2485S-2493S). En este ensayo, la desacetilación del sustrato proporcionado por HDAC da como resultado una señal de luminiscencia que se detecta con un lector de placas adecuado (Spectramax m5). La inhibición de HDAC disminuye la señal de luminiscencia en comparación con el control sin inhibidor. El experimento se llevó a cabo según las instrucciones del fabricante de la siguiente manera: se mezclaron 50 pl de extracto nuclear HeLa diluido 1:3000 en tampón de ensayo con 50 pl de solución inhibidora (diluciones en serie de SCFA en tampón de ensayo) y se incubaron durante 30 minutos. Se añadieron 100 pl de solución reveladora a cada pocillo y se midió la luminiscencia después de 45 minutos de incubación a temperatura ambiente. Los resultados (no mostrados) demostraron que el butirato y el propionato son potentes inhibidores de HDAC con CI50 de 0,8 y 2,4 mM, respectivamente, en condiciones de ensayo. El lactato y el acetato tenían una actividad de inhibición de HDAC mínima a la concentración más alta analizada (3,75 mM).

Ensayo de inhibición de HDAC para medir la producción de butirato en sobrenadantes de cultivo

Para examinar la correlación entre un ensayo HDAC y el ensayo de un SCFA, se evaluaron doce microbiomas bacterianos aislados de donantes humanos sanos (cepas HHD) y dos cepas disponibles públicamente que no se sabe que produzcan butirato, Escherichia coliy Bifidobacterium adolescentis, para determinar su capacidad para inhibir la actividad HDAC y para la producción de butirato por cromatografía de gases. Los cultivos de todas las cepas se cultivaron en medio de glucosa para levaduras con peptona (PYG, Anaerobe Systems) a 37 °C durante 5 días por triplicado. Se incluyeron como controles un cultivo en blanco (medio estéril sin inocular) y un cultivo estéril enriquecido con butirato 15 mM. Después de 5 días de incubación, las células microbianas se eliminaron por centrifugación (4000 rpm durante 15 minutos) y los sobrenadantes (medio de crecimiento bacteriano) se filtraron a través de un filtro de 0,22 pM (Millipore). Los sobrenadantes se enviaron para la medición de butirato por cromatografía de gases (GC-FID por MRL, Woburn MA) y se analizó la inhibición de HDAC utilizando el kit de ensayo HDAC-Glo I/II (Promega). Para este ensayo, se incubaron 10 pl de sobrenadante de cultivo, 40 pl de tampón de ensayo y 50 pl de extracto nuclear HeLa diluido (dilución 1:3000) durante 30 minutos antes de añadir 100 pl de reactivo revelador. La luminiscencia se midió después de 45 minutos a temperatura ambiente. Los resultados indicaron que los sobrenadantes de cultivo de tres cepas, así como el sobrenadante enriquecido con butirato 15 mM, tenía una reducción significativa en la luminiscencia derivada de HDAC en estas condiciones, es decir, se demostró la inhibición de HDAC (figura 6). El ensayo es coherente como lo indicó la pequeña desviación típica entre los replicados biológicos. Debido a que este ensayo no es específico para ningún inhibidor de HDAC en particular, es útil para determinar la capacidad general de una especie bacteriana o composición bacteriana y puede ser útil, por ejemplo, para identificar esta capacidad incluso si la bacteria produce un inhibidor de HDAC no típico (que no sea butirato).

Como se ha indicado anteriormente, se sometieron a ensayo los sobrenadantes bacterianos para determinar las concentraciones de butirato usando GC. La comparación de los resultados de inhibición de HDAC con las concentraciones de butirato medidas por GC mostró una correlación significativa para las doce cepas HHD (figura 7). Estos resultados indican que el ensayo de inhibición de HDAC realizado como se describe puede detectar concentraciones de butirato tan bajas como 6 mM en sobrenadantes bacterianos en estas condiciones. En algunos casos de la divulgación, se utilizan más de 10 pl de sobrenadante en una reacción, dando como resultado un menor nivel de detección, por ejemplo, 1 mM, 5 pM, o 1 pM.

Actividad de inhibición de HDAC en sobrenadantes de cultivos cultivados en diferentes fuentes de carbono

Para determinar si la inhibición de HDAC se veía afectada por el tipo y el nivel de fuente de carbono disponible para una especie bacteriana, se determinó la inhibición de HDAc por sobrenadantes procedentes de una selección de especies bacterianas utilizadas en DBC. En estos experimentos, las bacterias se cultivaron en una variedad de fuentes de carbono, incluyendo mono, di, polisacáridos y mucina porcina. Brevemente, se inocularon 600 pl de cultivos bacterianos en peptona/medio de extracto de levaduras (PY, por sus siglas en inglés) complementado con 0,5 % de las fuentes de carbono seleccionadas en 96 placas de pocillos profundos, se dejaron crecer durante 4 días, después, las células microbianas se sedimentaron mediante centrifugación y se usaron 15 pl del medio de cultivo (sobrenadante) para el ensayo de HDAC con extracto nuclear de HeLa como se ha descrito anteriormente. Debido a que la actividad HDAC se reduce a pH bajo (Latham et al. 2012 Nucl Acid Res 40:4794-803) y los cultivos microbianos tenían un pH tan bajo como 5, para asegurarse de que el pH final del ensayo no se redujera por la adición de sobrenadante, se añadieron 10 |jl de una solución de Tris 1 M pH 8 por pocilio para alcanzar la concentración final de tampón Trisun valor de 75 mM. Así, los ensayos se realizaron con 15 j l de sobrenadante, 10 j l de Tris 1 M pH 8, 25 j l de tampón de ensayo y 50 j l de extracto nuclear HeLa diluido, que se incubaron previamente durante 30 minutos antes de añadir el reactivo de revelado. La luminiscencia se midió después de 30 minutos.

Los resultados de estos experimentos se proporcionan en la tabla 10, a continuación. En las condiciones experimentales, un sobrenadante estéril enriquecido con butirato 15 mM dio como resultado una inhibición de HDAC del 62%. Usando una inhibición de HDAC del 25 % como punto de corte (butirato 1,8 mM en las condiciones experimentales), como se ha indicado anteriormente, solamente Clostridium inocuum y Clostridium orbiscindens mostraron actividad de inhibición de HDAC cuando se cultivaron en medio de glucosa. Sin embargo, cuando se analizan fuentes alternativas de nutrientes, 4 cepas adicionales fueron positivas para la inhibición de HDAC: Clostridium glicolicum, Clostridium bolteae, Clostridium disporicum y Eubacterium contortum. Los sobrenadantes de Murimonasintestinii y Clostridium oroticum también mostraron inhibición de HDAC aunque ligeramente por debajo del límite del 25 %. Estos datos demuestran que para comprender la capacidad de una especie para producir inhibidores de HDAC, es importante que los ensayos de inhibición de HDAC se realicen con una variedad de fuentes de carbono.

Asimismo, estos datos indican que puede ser ventajoso proporcionar una composición que pueda usar una amplia gama de fuentes de carbono, aumentando así la probabilidad de que, cuando se administra como tratamiento para una indicación en la que es deseable la inhibición de HDAC, la composición producirá inhibidores de HDAC. Tales indicaciones incluyen aquellas en las que es deseable la producción de ácidos grasos de cadena corta, por ejemplo, para el tratamiento o prevención de una infección por C. difficile. Estos datos también respaldan el uso de un prebiótico que es una fuente de nutrientes para una o más especies en una DBC.

T l 1 : A ivi inhi i i n HDA n liv liv n iv r f n r n

Perfil SCFA de cepas bacterianas

Los mismos sobrenadantes de cultivos bacterianos utilizados para los ensayos de inhibición de HDAC descritos supra se sometieron a análisis GC-MS para determinar qué SCFA subyacen a la inhibición de HDAC observada. El método empleado (MSOmics, Dinamarca) mide formato, acetato, propionato, butirato, isobutirato (2-metil-propionato), isovalerato (3-metilbutirato), valerato (pentanoato), 4-metil-pentanoato, caproato (hexanoato) y heptanoato. Los resultados de GC-MS (tabla 11) demuestran que existe una excelente correlación entre los resultados de inhibición de HDAC y la producción de SCFA asociada con la inhibición de HDAC en la bibliografía. Los números en la tabla 11 indican la concentración de SCFA detectada. B = butirato; P = propionato; IB=isobutirato y IV=isovalerato.

Clostridium innocuum y Flavonifractor plautii produjeron butirato en todos los medios analizados. Para Clostridium innocuum, la concentración de butirato fue mayor en sacarosa, pectina y FOS/inulina que en el medio basal, lo que indica que esta cepa puede producir butirato a partir de estos polisacáridos complejos. Flavonifractor plautii produjo butirato adicional en FOS/inulina, almidón y mucina y, en menor medida, con glucosa. En consecuencia, la inclusión de ambas especies en una composición permitirá la producción de butirato a partir de una amplia gama de sustratos complejos.

C. glicolicum produjo isovalerato, isobutirato y propionato. El isobutirato y el isopropionato son ácidos grasos de cadena ramificada (BCFA) producidos en el metabolismo disimilatorio de aminoácidos ramificados (valina y leucina respectivamente), y se ha demostrado que muestran actividad inhibidora de HDAC en células HeLa (Waldecker et al., 2008 J Nutritional Biochem 19:587-593). La inclusión de dichas cepas, por ejemplo, como en DBC6, para la que C. glycolicum es la única cepa que ha demostrado ser capaz de utilizar valina y leucina como fuente de carbono (supra) y por lo tanto puede proporcionar una cepa que puede competir con C. difficile por estos sustratos mientras modula la actividad HDAc . El presente solicitante señala que 2-metil-butirato, el producto del metabolismo de la isoleucina, no formó parte del panel de SCFA en estos experimentos. Sin embargo, C. glycolicum también puede usar Ile como fuente de carbono como lo hicieron las cepas de C. difficile analizadas en el panel de fuentes de carbono. Por lo tanto, C. glycolicum también se puede utilizar en una DBC como fuente de 2-metil-butirato.

C. bolteae, C. disporicum, Eubacterium contortum, Murimonas intestini, and C. oroticum produjeron propionato, pero solo cuando se suministró fucosa como fuente de carbono. La fucosa es un componente importante de los glucanos en la luz del epitelio intestinal y las secreciones mucosas. La fucosa intestinal se ha identificado como un mediador de la simbiosis hospedador-microbioma (Pickard y Chervonsky 2015 J Immunol 194:5588-5593). En consecuencia, incluir al menos una especie que utiliza fucosa en una DBC puede ayudar a la colonización del hospedador por dichas bacterias, y la utilización de propionato cerca de la superficie epitelial puede tener efectos beneficiosos significativos en la función de barrera epitelial.

El crecimiento de F. plautii en PY (basal) complementado con glucosa, FOS/In, almidón o mucina dan como resultado mayores niveles de butirato en comparación con los niveles producidos cuando se cultivan solo en el medio basal. De forma análoga, C. innocuum cultivado en un medio complementado con glucosa o pectina y, en menor medida, en sacarosa o FOS/In, producen mayores niveles de butirato.

En algunos casos, una especie produce menos de un SCFA cuando el medio basal se complementa con una fuente de carbono. Sin comprometerse con ninguna teoría en particular, puede ser que en tales casos, la fuente de carbono complementaria sea una fuente preferida en la medida en que las bacterias cambian su metabolismo al uso de la fuente de carbono complementaria y, por lo tanto, producen menos del SCFA detectado cuando únicamente se usa el medio basal para el crecimiento.

Estos datos indican que las especies seleccionadas pueden usarse para aumentar la probabilidad de que se produzca un SCFA cuando se administra una bacteria en una DBC. Asimismo, los datos relacionados con la inhibición de HDAC y la producción de SCFA utilizando varias fuentes de carbono respaldan el uso de DBC en lugar de composiciones de una sola especie para tratamientos en los que es deseable expresar moléculas inhibidoras de HDAC, por ejemplo, SCFA u otras moléculas no identificadas producidas por una bacteria.

Tabla 11: Perfiles de SCFA de especies bacterianas cultivadas en diversas fuentes de carbono. Los números indican la concentración medida (mM) en sobrenadantes de cultivo para butirato (B), propionato (P), isobutirato (IB) o isovalerato (IV). Los límites de detección (LOD, por sus siglas en inglés) fueron 0,3 mM (B), 0,2 mM (P), 0,3 mM (IB) mM IV . L l v í in i n l n n r i n r l L D.

Ejemplo 8. Propiedades funcionales de las especies de DBC; producción de indol y otros metabolitos de triptófano

Como se muestra en el ejemplo 6, una composición bacteriana que puede producir indol o derivados de indol fue eficaz en la mejora de infección por C. diffiále en comparación con una composición bacteriana que no produce dichos índoles. A la vista de este descubrimiento, el presente solicitante creó un ensayo para la producción de indol y metabolitos de indol que se puede usar para analizar bacterias para estas actividades y pudo identificar especies bacterianas que tienen la actividad. Dichas especies son adiciones útiles para construir una DBC que se puede usar, por ejemplo, para tratar o prevenir una infección por C. difficile.

Ensayo para la producción de indol y metabolitos de indol en sobrenadantes bacterianos SER-262

Para el análisis de indol, se añadió una gota de Reactivo Indol (Anaerobe Systems, Morgan Hill, CA) a 100 pl de cultivos bacterianos de cepas bacterianas cultivadas en ocho fuentes de carbono diferentes por duplicado. De las 12 cepas analizadas, solamente Clostridium glicolicum y Flavonifractor plautii dieron positivo en el análisis de indol en estas condiciones (datos no mostrados). Los cultivos de F. plautii complementados con cada una de las 8 fuentes de carbono utilizadas en el ejemplo 7 se volvieron azul oscuro, lo cual es característico de la presencia de indol. C. glycolicum se volvió rojo (se han descrito diferentes colores para distintos derivados de indol en este análisis (Lombard y Dowell, 1983 J Clin Microbiol 18:609-613)) en todas las fuentes de C excepto glucosa, pectina y FOS/inulina. Para estas cepas, el patrón del fenotipo de indol por fuente de carbono es idéntico al de los fenotipos HDAC y SCFA y no está correlacionado con la biomasa, sugiriendo una regulación superpuesta. Los sobrenadantes también se sometieron a ensayo de nuevo utilizando una prueba puntual (4 pl de sobrenadante colocados en un papel empapado con Indol Reagent (Anaerobe Systems, Morgan Hill, CA) junto con indol purificado, 3-metil-indol, ácido indol-3-butírico, triptamina y ácido indol-3-propiónico como controles positivos). El indol y el sobrenadante de F. plautii produjeron color azul claro, mientras que el de C. innocuum, ácido indol-3-propiónico, 3-metil-indol, ácido indol-3-butírico y triptamina produjeron puntos morados. Estos resultados implican que F. plautii es un productor de indol mientras que Clostridium inocuum es un productor de un derivado de indol que no se puede especificar con este método. En la bibliografía se ha informado sobre la evidencia del papel de los indoles en la inmunomodulación y la función de la barrera epitelial. En vista de esto y de los datos presentados en el presente documento, es útil incluir al menos una o ambas de estas dos cepas en una DBC diseñada para tratar o prevenir infecciones, por ejemplo, una infección por C. diffiále. Sin comprometerse con ninguna teoría en particular, el presente solicitante cree que la inclusión de dichas especies en una DBC es útil para la inmunomodulación y restauración de la función de la barrera epitelial.

Ejemplo 9: Ensayo clínico de DBC

Se lleva a cabo un ensayo clínico utilizando una DBC en sujetos humanos diagnosticados con un episodio primario (primer) de CDI. Un ejemplo de dicho ensayo se describe en clinicaltrials.gov, número de prueba NCT02830542.

Una DBC eficaz reduce la recurrencia de uno o más signos y/o síntomas de CDI en esta población.

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende una población viable de bacterias, en donde la población comprende Clostridium innocuum, Clostridium bolteae, Blautia producta, Murimonas intestini y Eubacterium contortum.

2. La composición de la reivindicación 1, en donde Clostridium inocuum comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 41-45, en donde Clostridium bolteae comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 6-10, en donde Blautia producta comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97% idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 1-5, en donde Murimonas intestini comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 85-89, y/o en donde Eubacterium contortum comprende una secuencia de ADNr 16S que es al menos un 97 % idéntica a una secuencia de ADNr 16S expuesta en las SEQ ID NO: 70-73.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2, en donde al menos el 75 % de la población de bacterias viables son esporas.

4. Una formulación que comprende la composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

5. La formulación de la reivindicación 4, en donde el excipiente farmacéuticamente aceptable comprende glicerol, polietilenglicol o manteca de cacao.

6. La formulación de la reivindicación 4 o 5, en donde la formulación está en una cápsula o comprimido.

7. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, para su uso en la prevención o el tratamiento de una disbiosis en un sujeto en riesgo o diagnosticado con una disbiosis.

8. La composición o formulación para el uso de la reivindicación 7, en donde la concentración total de bacterias en la composición es de 10e1 a 10e9.

9. La composición o formulación para el uso de la reivindicación 7 u 8, en donde las bacterias de la composición se proporcionan en 1, 2, 3, 4 o 5 cápsulas.

10. Una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 para su uso en el tratamiento de una infección por C. difficile o en la prevención de una infección por C. difficile o en la prevención de la recurrencia de una infección por C. difficile en un sujeto que lo necesite.

11. La composición o formulación para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, en donde el sujeto ha recibido un tratamiento antibiótico antes de la administración de la composición.