ES2937841A1 - Terapia para el tratamiento de la leishmaniosis visceral que comprende nifuratel - Google Patents

Abstract

La presente invención describe el compuesto nifuratel (5- [(metiltio)metil]-3-[[(5-nitro-2-furanil)metilen]amino]-2-oxazolidinona) (NFT) para uso en el tratamiento de leishmaniosis, concretamente leishmaniosis visceral. Además, se describen composiciones farmacéuticas que comprenden NFT y un fármaco leishmanicida, preferiblemente seleccionado entre miltefosina (MTF) y paromomicina (PMM). Estas composiciones mejoran la vía de administración de los fármacos, disminuyendo e incluso eliminando la administración intramuscular, y permiten la reducción de las dosis efectivas de los fármacos en monoterapia, lo que disminuye los efectos secundarios asociados al tratamiento y la aparición de resistencias.

Description

DESCRIPCIÓN

TERAPIA PARA EL TRATAMIENTO DE LA LEISHMANIOSIS VISCERAL QUE

COMPRENDE NIFURATEL

SECTOR DE LA TÉCNICA

La presente invención se encuadra en el sector farmacéutico y en particular se refiere a la combinación de principios activos para el tratamiento de la leishmaniosis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La leishmaniosis es un conjunto de enfermedades parasitarias zoonósicas transmisibles, producidas por protozoos pertenecientes al género Leishmania. La leishmaniosis es una enfermedad vectorial digenética transmitida por la picadura de insectos flebótomos (moscas areneras) que afecta severamente a poblaciones empobrecidas de áreas tropicales y subtropicales del planeta (Ahluwalia y col., 2003). La OMS clasifica a la leishmaniosis dentro de las 20 enfermedades endémicas más desatendidas causadas por patógenos (virus, bacterias, protozoos y helmintos) en países tropicales de bajos ingresos de África, Asia y América (https://www.who.int/news-room/q-a-detail/neglected-tropical-diseases). La leishmaniosis es la segunda enfermedad más desatendida en términos epidemiológicos, con una incidencia de entre 0,7 y 1 millón de casos anuales y más de mil millones de personas en riesgo de transmisión (Mann y col., 2021).

El ciclo biológico de Leishmania spp consiste en una fase parasitaria que vive en los insectos (forma promastigote) y coloniza el intestino medio del flebótomo. La fase parasitaria que vive y prolifera en el hospedador es el amastigote, que coloniza los macrófagos del hospedador infectado, causándole la enfermedad. Esta forma es la patológicamente relevante (McGwire y Satoskar, 2014).

Existen varias presentaciones de la enfermedad, que difieren en sintomatología, etiología, gravedad y área geográfica. De acuerdo con la OMS, la presentación más grave es la leishmaniosis visceral, responsable de entre 20.000 y 30.000 muertes al año (https://www.who.int/leishmaniasis/burden/en/), de las que más del 90 % ocurren en cinco países del África subsahariana (Somalia, Kenia, Sudán, Sudán del Sur y Etiopia) (Burza y col., 2018).

La leishmaniosis visceral humana puede ser letal en individuos no tratados y se caracteriza por numerosos signos clínicos cutáneos y viscerales. Las lesiones encontradas en pacientes se asocian a una reacción inflamatoria que incluye linfoadenopatía periférica y hepatoesplenomegalia (Wilhelm, 2019). La enfermedad renal es grave y puede evolucionar de un síndrome nefrótico a una insuficiencia renal crónica. Todos estos signos clínicos aparecen en proporciones variables, aunque en la gran mayoría de los casos la enfermedad comienza con la forma cutánea y evoluciona hacia la visceral después de un período de latencia no definido (van Griensven y Diro, 2012).

En Europa, sólo los países del sur, incluida España, padecen la enfermedad, por lo que fue incluida como enfermedad de declaración obligatoria en 1982, y en 1995 se incluyó como enfermedad endémica de ámbito regional. No obstante, a pesar de la escasa incidencia en España, se registraron brotes serios en 2008 con más de 800 casos (Horrillo y col., 2015). A pesar de que en España la enfermedad tiene un impacto limitado en humanos, la incidencia de esta enfermedad en especies domésticas, como el perro es muy alta, y aparte de la mortalidad que puede causar, limita su erradicación al actuar como reservorio (Reguera y col., 2016).

El carácter desatendido de la leishmaniosis no solo es atribuible al marco geográfico y la escasez de recursos, sino también a la falta de interés en desarrollar nuevos tratamientos por parte de la industria farmacéutica (Loregian y Palú, 2013).

No existe en la actualidad una vacuna que pueda prevenir la leishmaniosis visceral y las medidas de salud pública consisten fundamentalmente en el control de los vectores y otras medidas de higiene que pueden resultar ineficaces (Wilson y col., 2020).

A falta de vacunas para humanos, el tratamiento farmacológico es actualmente la única opción aceptable. El tratamiento actual es complicado y todos los fármacos existentes hasta la fecha tienen efectos secundarios o son tóxicos (Balana-Fouce y col., 1998). Los fármacos utilizados en la actualidad incluyen los derivados del antimonio pentavalente (SSG) (Glucantime® y Pentostam®), la miltefosina (MTF), antifúngicos como las formulaciones de anfotericina B (AMB) y el antibiótico paromomicina (PMM) (Barbosa Gomes de Carvalho y col, 2020). Con excepción de la MTF que puede administrarse por vía oral, el resto de los fármacos precisan de una administración continuada por vía parenteral (intramuscular o subcutánea) e incluso endovenosa (AMB), lo que supone un riesgo elevado de pérdida de adherencia al tratamiento y de la aparición de resistencias (Singh-Phulgenda y col., 2021).

El tratamiento actual de la leishmaniosis visceral en los 5 países con mayor incidencia en África subsahariana se basa en la administración intramuscular de antimoniales pentavalentes SSGs (por ejemplo, Glucantime® y Pentosam®) a una dosis de 20 mg/kg de Sb5+ diario durante 30 días, cuya eficacia estimada es del 91%. Sin embargo, la presencia de Sb5+ en su composición provoca dolor en el lugar de la inyección, cardiotoxicidad, pancreatitis y hepatotoxicidad, por lo que se recomienda no usarlos en ciertas franjas de edad (Balaña-Fouce y col, 1998). El uso de antimoniales pentavalentes también es un problema en las infecciones leves y en ciertas franjas de edad debido a su toxicidad iatrogénica intrínseca (Henderson y Jolliffe, 1985). Además, la posología prolongada de este tratamiento (30 días en el caso de monoterapia y 17 días en el caso de una terapia combinada con PMM), son responsables en la mayoría de los casos de la interrupción del tratamiento (Barbosa Gomez de Carvalho y col., 2020).

La miltefosina (MTF) en monoterapia tiene aproximadamente un 90 - 93 % de efectividad. La dosis de este fármaco es 2.0 - 2.5 mg/kg durante 28 días. A estas dosis, el tratamiento tiene los inconvenientes de generar nefrotoxicidad, hepatotoxicidad y teratogenia.

La AMB es un potente antifúngico poliénico utilizado con éxito en el tratamiento de la leishmaniosis visceral (Rodrigo y col., 2018). La formulación liposomal de AMB es el tratamiento de elección en muchos países debido a que, a pesar de su administración (2 veces a la semana por infusión endovenosa durante 3 semanas) y de su potencial nefrotoxicidad, tiene una eficacia de > 90%, sin riesgo de recidivas (Botero y Restrepo, 2015). Sin embargo, este fármaco tiene una serie de inconvenientes: (i) tras la administración pueden aparecer escalofríos, dolor de espalda y nefrotoxicidad (Tragiannidis y col, 2021); (ii) La administración por infusión endovenosa supone una preparación más compleja del preparado en el lugar de aplicación y la hospitalización del paciente; (iii) las formulaciones de AMB precisan de una cadena de frío para evitar que el fármaco de degrade (Van Griensen y Diro, 2019); y (iv) las formulaciones de AMB son muy caras y difícilmente pueden ser soportadas por las depauperadas economías de los países en los que la enfermedad es endémica (Silva Ferreira de Carvalho y col., 2020). Estas condiciones suponen un problema en la mayoría de los países de África, en los que la enfermedad es endémica, donde los enfermos no pueden desplazarse con facilidad a los centros hospitalarios y es muy complicado mantener el medicamento siempre por debajo de 25 grados. Es por lo tanto necesario un tratamiento que pueda ser aplicado en todo el mundo, independientemente de las características del país en el que residen los enfermos.

La paromomicina (PMM), por su parte, se administra vía intramuscular y su eficacia depende del país en el que se administra, dependiendo de la cepa endógena del país. Su eficacia varía desde menos del 50 % hasta el 95 % y su dosis es de 15 mh/kg al día en un tratamiento de 21 días. La administración en monoterapia de este antibiótico son su nefrotoxicidad y hepatotoxicidad.

La terapia combinada de fármacos con diferente mecanismo de acción es una opción utilizada frente a la leishmaniosis visceral en África e implementada por organizaciones supranacionales como la OMS y DNDi (Drugs for Neglected Tropical Diseases initiative https://dndi.org) para evitar la aparición de resistencias y disminuir la toxicidad de los fármacos en monoterapia. DNDi ha implementado en África subsahariana la combinación de antimoniales PMM frente a la leishmaniosis visceral (Kimutai y col., 2017). La combinación de Glucantime® (20 mg/kg de Sb5+ diario) con PMM (15 mg/kg diarios) durante 17 días, reduce los riesgos del antimonio manteniendo la eficacia, pero añade la nefrotoxicidad de la PMM. Esta combinación tiene como ventaja principal la reducción del tiempo de administración de 30 a 17 días, aunque la administración intramuscular de ambos fármacos supone un riesgo de falta de adherencia al tratamiento (Burza y col., 2018). A estos problemas hay que añadir la existencia de pérdida de eficacia (sobre todo en ciertas regiones de la India) y la aparición de resistencias cruzadas con el arsénico, descritas en Bangladesh, donde los niveles de este elemento son muy elevados en el agua de bebida.

La DNDi también está promoviendo la combinación de MTF PMM, debido a la buena biodisponibilidad oral de la MTF (https://dndi.org/wpcontent/uploads/2020/12/DNDi-RD-Portfolio-December-2020.pdf). Este tratamiento se encuentra en fase III y combina la MTF a una dosis de 150 mg/día durante 28 días y PMM a una dosis de 15 mg/kg/día durante 10 días. La eficacia de la combinación es del 90% y tiene como inconvenientes la irritación gástrica, hepatotoxicidad y nefrotoxicidad, aparte de los efectos teratogénicos de la MTF, dado que no se reduce su dosis respecto al tratamiento en monoterapia.

Es por lo tanto necesario un tratamiento en eficaz, seguro y corto para el tratamiento de la leishmaniosis visceral en cualquier lugar del mundo, especialmente en los países en los que la enfermedad es endémica. Es necesario encontrar nuevas entidades farmacológicamente activas que solas o combinadas sirvan para erradicar esta enfermedad en los próximos años.

Breve descripción de la invención

En un primer aspecto, la invención se refiere al compuesto nifutarel (NFT) de Fórmula (I):

para uso en un método de tratamiento de leishmaniosis, preferiblemente la leishmaniosis visceral.

En un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y un fármaco leishmanicida para uso como medicamento.

En un tercer aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y un fármaco leishmanicida para uso en un método de tratamiento contra la leishmaniosis, preferiblemente la leishmaniosis es leishmaniosis visceral.

Descripción de las figuras

Figura 1. Efecto de NFT in vitro y ex vivo. (A) Efecto del NFT en promastigotes (forma flagelada) de IRFP L.infantum BCN 150 (MCAN/ES/96/BCN 150) (O) y comparación con otras especies de Leishmania; L. donovani LV9 (MHOM/ET/67/HU3) (□) y L. major LV39c5 (RHO/SU/59/P) (A). (B) Efecto del NFT sobre amastigotes axénicos de IRFP+L.infantum, obtenidos de medula ósea ratones Balb/c infectados 8 semanas antes con promastigotes IRFP+L. infantum. (C) Efecto del NFT sobre amastigotes intramacrofágicos de IRFP+L.infantum obtenidos de explantes de bazo de ratones Balb/c infectados 8 semanas antes con promastigotes IRFP+L. infantum.

Figura 2. Efecto de la combinación NFT MTF in vitro. (A) Curvas dosis respuesta a MTF, NFT y a la terapia combinada MTF NFT. Efecto del MFT (panel de la izquierda) y del NFT (panel central) y de la combinación MTF NFT (panel de la derecha, MTF (O), NFT (□), MTF NFT (A)). (B) La gráfica de la izquierda muestra el cálculo de la EC50 de MTF (O), NFT (□) y de la combinación MTF NFT (A). Fa (mortalidad de los amastigotes), Fu (amastigotes vivos), D (dosis). En la gráfica central se determina el índice de combinación entre ambos fármacos y la gráfica de la derecha es un isobolograma que muestra el efecto sinérgico de la combinación MTF NFT (MTF (O), NFT (□), MTF NFT (A). La dosis A se refiere a la dosis de MTF y la dosis B a la dosis NFT.

Figura 3. Efecto de la combinación NFT MTF ex vivo. (A) Curvas dosis respuesta a MTF, NFT y a la terapia combinada MTF NFT. Efecto del MFT (panel de la izquierda) y del NFT (panel central) y de la combinación MTF NFT (panel de la derecha) en explantes esplénicos murinos (panel de la derecha, MTF (O), NFT (□), MTF NFT (A)). (B) La gráfica de la izquierda muestra el cálculo de la EC50 de MTF (O), NFT (□) y de la combinación MTF NFT (A). Fa (mortalidad de los amastigotes), Fu (amastigotes vivos), D (dosis). En la gráfica central se determina el índice de combinación entre ambos fármacos y la gráfica de la derecha es un isobolograma que muestra el efecto sinérgico de la combinación MTF NFT (MTF (O), NFT (□), MTF NFT (A). La dosis A se refiere a la dosis de MTF y la dosis B a la dosis NFT.

Figura 4. Efecto de la combinación PMM NFT in vitro. (A). Curvas dosis respuesta a PMM (panel de la izquierda), NFT (panel central) y a la terapia combinada PMM NFT (panel de la derecha, NFT (O), PMM (□), PMM NFT (A)). (B) La gráfica de la izquierda muestra el cálculo de la EC50 de NFT (O), PMM (□) y de la combinación PMM NFT (A). Fa (mortalidad de los amastigotes), Fu (amastigotes vivos), D (dosis). En la gráfica central se determina el índice de combinación entre ambos fármacos y la gráfica de la derecha es un isobolograma que muestra el efecto sinérgico de la combinación PMM NFT (NFT (O), PMM (□), PMM NFT (A). La dosis A se refiere a la dosis de NFT y la dosis B a la dosis PMM.

Figura 5. Efecto de la combinación PMM NFT ex vivo. (A). Curvas dosis respuesta a NFT, PMM y a la terapia combinada PMM NFT. Efecto del NFT (panel de la izquierda), del PMM (panel central) y de la combinación NFT PMM (panel de la derecha) en explantes esplénicos murinos (panel de la derecha, NFT (O), PMM (□), NFT PMM (A)). (B) La gráfica de la izquierda muestra el cálculo de la EC50 de NFT (O), PMM (□) y de la combinación NFT PMM (A). Fa (mortalidad de los amastigotes), Fu (amastigotes vivos), D (dosis). En la gráfica central se determina el índice de combinación entre ambos fármacos y la gráfica de la derecha es un isobolograma que muestra el efecto sinérgico de la combinación NFT PMM (NFT (O), PMM (□), NFT PMM (A). La dosis A se refiere a la dosis de NFT y la dosis B a la dosis PMM.

Explicación detallada de la invención

La presente invención pretende dar solución a los problemas planteados con anterioridad mediante una nueva combinación de fármacos de diferente mecanismo de acción.

En primer lugar, la presente invención de refiere al compuesto nifuratel (NFT) para uso en un método de tratamiento de leishmaniosis. En una realización preferida, el compuesto es para uso en el tratamiento de leishmaniosis visceral.

El NFT, 5-[(Metiltio)metil]-3-[[(5-nitro-2-furanil)metilen]amino]-2-oxazolidinona (CAS 4936-47­ 4), (MacMiror® Polychem, Suiza), es un derivado del nitrofurano con una fuerte actividad tricomonicida y un amplio espectro antibacteriano que actúa tanto sobre organismos Gramnegativos como Gram-positivos, también es activo contra Chlamydia trachomatis y Mycoplasma spp.

Este compuesto se utiliza actualmente para el tratamiento de las infecciones vulvovaginales y la erradicación del Helicobacter pylori. NFT tiene un perfil toxicológico muy seguro siendo no tóxico en pruebas agudas en ratones y ratas y es bien tolerado tras la administración oral e intravaginal repetida. Dado que no se han observado efectos teratogénicos, el NFT está indicado también durante el embarazo. Hasta el momento no se han descrito usos del NFT sólo o combinado frente a la leishmaniosis de cualquier tipo.

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) para uso en un método de tratamiento de leishmaniosis. En una realización preferida, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de leishmaniosis visceral.

En tercer lugar, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y otro fármaco leishmanicida para uso como medicamento. Esta combinación de fármacos no ha sido nunca descrita con anterioridad y no sería obvio, a la luz de las características del NFT, combinarlo con un fármaco leishmanicida en una composición farmacéutica.

En cuarto lugar, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y un fármaco leishmanicida para uso en un método de tratamiento contra la leishmaniosis. En una realización preferida, la composición farmacéutica es para uso en el tratamiento de leishmaniosis visceral.

A efectos de la presente invención, un fármaco leishmanicida se define como un compuesto con actividad frente a cualquier especie del género Lesishmania y que se emplee en las terapias actuales frente a la leishmaniosis. En una realización preferida, el fármaco leishmanicida se selecciona del grupo que consiste en antimoniato de meglumina, antimonial pentavalente, alopurinol, miltefosina (MTF), domperidona, anfotericina B (ANFB) o paromicina (PMM). En una realización más preferida, el fármaco leishmanicida se selecciona entre miltefosina (MTF) y paromicina (PMM).

Otro aspecto de la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y otro fármaco seleccionado entre miltefosina (MTF) y paromomicina (PMM) para uso en el tratamiento de leishmaniosis visceral.

La invención también se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende nifuratel para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la leishmaniosis visceral.

En una realización particular, la invención se refiere al uso de una composición farmacéutica que comprende nifuratel y un fármaco leishmanicida, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la leishmaniosis visceral. En una realización preferida. El medicamento leishmanicida se selecciona del grupo que consiste en antimoniato de meglumina, antimonial pentavalente, alopurinol, miltefosina (MTF), domperidona, anfotericina B (ANFB) o paromicina (PMM). En una realización todavía más preferida, el fármaco leishmanicida se selecciona entre miltefosina (MTF) y paromicina (PMM).

La presente invención muestra que la combinación de NFT con otros fármacos leishmanicidas como MTF o PMM es sinérgica y tiene un potente efecto frente a diferentes especies de Leishmania. De esta forma, la coadministración reduce la cantidad de fármacos administrados y con ello sus efectos secundarios y la potencial aparición de resistencias a los mismos.

Hasta la fecha, no existe ninguna vacuna para la leishmaniosis visceral ni para ninguna otra forma de leishmaniosis humana. En las zonas endémicas, la mayoría de los infectados no desarrollan síntomas clínicos y la infección pasada produce una sólida inmunidad contra la reinfección (Pacheco-Fernandez y col., 2021). Por lo tanto, a pesar de que el desarrollo de que una vacuna contra Leishmania es un objetivo realista de salud pública, no es en la actualidad una prioridad de ninguna empresa farmacéutica. Por este motivo, la presente invención proporciona una combinación de fármacos con diferentes mecanismos de acción. Además, se usa un fármaco de reposicionamiento (NFT) para el que por primera vez se describe su efecto leishmanicida.

La sustitución de los compuestos actuales usados en el tratamiento de leishmaniosis visceral por unos fármacos menos agresivos, con menos efectos secundarios y que además puedan administrarse por vía oral, es una necesidad urgente para mantener la adherencia de los pacientes al tratamientos y evitar posologías incompletas que pueden dar lugar al fracaso terapéutico y aparición de resistencias. En la presente invención se demuestra que el NFT por vía oral tiene efecto leishmanicida, lo que permitiría eliminar la ruta parenteral de al menos uno de los fármacos de la combinación, mejorando la administración del tratamiento y su adhesión.

La combinación NFT PMM tiene como ventajas la eliminación del antimonio y la introducción de un segundo fármaco por vía oral, lo que aumenta la adherencia al tratamiento al eliminar completamente las inyecciones intramusculares. Además, se reduciría la dosis del PMM, lo que disminuiría sus efectos secundarios.

La administración combinada NFT y MTF reduce significativamente la cantidad de MTF en la combinación, lo que supone una ventaja al disminuir significativamente el riesgo de los efectos teratogénicos del MTF cuando se administra como único tratamiento. Además, ambos fármacos en esta combinación tienen administración oral, lo que permite que el paciente pueda tomar el tratamiento en cualquier lugar. La combinación de fármacos orales soluciona el problema de la preparación/mantenimiento/desplazamiento de los enfermos a los centros hospitalarios especializados, dado que la combinación NFT MTF se administra por vía oral (Grüneberg y Leakeay, 1976). Además, tanto la combinación NFT MTF como NFT PMM son químicamente estables a en condiciones climáticas adversas y no necesitan de cadena de frío. Además, su precio es significativamente menor al de otros fármacos como por ejemplo AMB (formulaciones encapsuladas en liposomas).

Todas las terapias actuales frente a la leishmaniosis visceral en los países endémicos incumplen los requisitos de la OMS y DNDi para ser aceptables:

- Combinación Antimonial PMM: efectos dañinos del antimonio pentavalente. Las combinaciones NFT MTF / NFT PMM solucionan este problema.

- Problemas de adhesión al tratamiento: se debe reducir/eliminar el uso de medicamentos inyectables para fidelizar a los enfermos en el tratamiento. La combinación NFT MTF soluciona este problema.

- Teratogenicidad: la administración en monoterapia de MTF tiene efectos perjudiciales, por lo que una reducción de la dosis en el tratamiento sin perder efectividad es deseable. Las combinaciones NFT MTF / NFT PMM solucionan este problema.

- Administración endovenosa y estabilidad del fármaco: Las combinaciones NFT MTF / NFT PMM solucionan este problema.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: selección de fármacos para el tratamiento de Leishmania

El primer objetivo fue buscar compuestos con efectos farmacológicos alternativos frente a leishmaniosis visceral. El reposicionamiento de fármacos es una estrategia ideal para encontrar tratamiento a las enfermedades desatendidas debido a que 1) favorece la reducción del tiempo y los costes para que el medicamento llegue al mercado; 2) favorece la posibilidad de combinarlo con otros fármacos para encontrar un tratamiento más eficaz; 3) el reposicionamiento podría facilitar el descubrimiento de nuevos mecanismos de acción para fármacos antiguos y nuevas clases de medicamentos.

A partir de una plataforma de bioimagen (Calvo-Álvarez E y col., 2015) para el cribado masivo de fármacos de reposicionamiento ex vivo de IRFP L. infantum, se identificaron 16 moléculas con un índice selectivo (IS) > 50, lo que indicaba una seguridad terapéutica excelente, se contaba con datos farmacocinéticos en roedores que indicaban que la concentración plasmática de los compuestos superaba significativamente la EC50 calculada frente a Leishmania (EC50 < 3 pM), y su biodisponibilidad por via oral. De estos 16 compuestos, se seleccionaron el fungicida nifuratel (NFT), los antitumorales paclitaxel y docetaxel y el coccidiostático salinomicina. De estos cinco compuestos al menos el NFT y la salinomicina eran biodisponibles para su administración por vía oral. Se continuó con el NFT ya que la salinomicina es un fármaco de uso veterinario y la AEMPS restringe su uso a dicho ámbito.

Ejemplo 2: Efecto in vitro y ex vivo de NFT en un modelo de leishmaniosis

A continuación, se analizó in vitro y ex vivo del efecto de NFT en un modelo de leishmaniosis crónica en ratón, con diferentes formas del parásito. Se emplearon ratones infectados con promastigotes (formas flageladas) de tres especies de Leishmania: IRFP L. infantum BCN 150 (MCAN/ES/96/BCN 150) responsable de la leishmaniosis visceral en los países de la Cuenca mediterránea, L. donovani LV9 (MHOM/ET/67/HU3) responsable de la leishmaniosis visceral en África y Asia y máxima responsable de la letalidad de esta especie y L. major LV39c5 (RHO/SU/59/P), responsable de la leishmaniosis cutánea, una afección no letal pero desfigurante de países del Oriente próximo.

Los promastigotes se cultivaron de forma rutinaria en medio M199 (Gibco) suplementado con 40 mM de HEPES pH 7,2, 0,1 mM adenina, 0,0005 % (p/v) hemina, 2 ng/mL biopterina, 0,0001 % (p/v) biotina, 10 % (v/v) suero fetal bovino inactivado por calor y mezcla antibiótica a 26 °C. La Figura 1A compara el efecto del NFT en promastigotes de tres espacies de Leishmania (L. infantum (O) IC50 = 0.30 pM, L. donovani (□) IC50 = 0.21 pM, L. major (A) IC50 = 0.24 pM). Se observó que en el fármaco tiene un efecto similar en las tres especies, cumpliendo con una de las condiciones más importantes del “Target Product Profile” (TPP) de cualquier fármaco para esta enfermedad.

Para demostrar la efectividad del NFT en la forma infectiva del parásito, se obtuvieron amastigotes axénicos (forma no flagelada, en ausencia de células del hospedador) de ratones Balb/c previamente infectados con IRFP+L.infantum. Después de 6 - 8 semanas de infección, se extrajo la médula ósea del canal medular de los huesos largos de los ratones en condiciones estériles, de los que se obtuvieron los amastigotes. Estos se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 23 pM ácido fólico, 100 pM adenosina, 22 mM glucosa, 4 mM L-glutamina, 25 mM MES, mezcla de antibióticos y 7,5 % suero fetal bovino pH5.5. La Figura 1B muestra el efecto del NFT in vitro frente a los amastigotes axénicos extraídos de médula ósea. De esta figura se obtuvo un valor EC50 para el NFT de 0,05 pM, lo que demuestra la efectividad del fármaco en la forma infecciosa del parásito. En esta misma figura se representa el efecto citotóxico del NFT en células HEP-G2 (línea rosa) para la determinación del Índice Selectivo (IS), como el cociente entre el valor IC50 del NFT en HEP-G2 y su respectivo valor de EC50 en amastigotes axénicos.

Como paso previo a los estudios in vivo se comprobó además la efectividad del NFT en explantes esplénicos (amastigotes que infectan los macrófagos del bazo del hospedador) procedentes de ratones Balb/c previamente infectados con IRFP+ L. infantum. Después de 6 - 8 semanas de infección, se extrajo el bazo en condiciones estériles, y se procesó para obtener un cultivo primario que contenía los macrófagos infectados con los amastigotes. Los cultivos de amastigotes intramacrofágicos (explantes esplénicos) crecieron en medio RPMI1640 suplementado con 20 % suero fetal bovino, 1 mM de piruvato de sodio, 1x vitaminas RPMI, 10 mM HEPES y mezcla de antibióticos. La Figura 1C muestra el efecto del NFT ex vivo frente a la forma intramacrofágica de Leishmania usando explantes de bazo infectados. De esta figura se obtuvieron valores de EC50 para el NFT > 0,2 pM lo que supone una efectividad muy relevante en cultivos fácilmente trasladables a la realidad. Además, en esta misma figura observamos el efecto del NFT sobre cultivos primarios de células de bazo no infectadas (línea rosa) con el fin de calcular la toxicidad del fármaco sobre las células del hospedador mediante la determinación del Índice Selectivo (IS).

En los tres casos, el efecto del NFT sobre los parásitos se determinó añadiendo distintas diluciones del compuesto por cultivo en placas de 96 pocillos que se incubaron 72 - 96 h a 26 °C (promastigotes) o placas de 384 pocillos incubadas 72 - 96 h a 37 °C (amastigotes axénicos o explantes de bazo). Se usó DMSO 0,1% (v/v) como control negativo y la AMB 10 pM como control positivo. La seguridad del NFT se determinó en explantes no infectados de bazo aislados a los que se añadió NFT a concentraciones crecientes. La relación del CC50 (no infectado) y del ^{e c} 50 (infectado) sirve para determinar el IS del NFT.

Ejemplo 3: Efecto in vitro de composiciones farmacéuticas que comprenden nifuratel y miltefosina

Después de comprobar que NFT solo tenía actividad en la reducción de la carga parasitaria, se decidió analizar combinaciones de NGT con otros fármacos leishmanicidas. En primer lugar, se seleccionó el MTF, que eliminaría los problemas de iatrogénicos de otros compuestos como el SSG y además permitiría administrar la combinación de fármacos enteramente por vía oral. Se realizaron ensayos in vitro y ex vivo.

La cepa transgénica IRFP L. infantum tiene integrada el gen que codifica la proteína infrarroja iRFP bajo el control del promotor del gen que codifica el rRNA 18S. Las células viables de esta línea celular son capaces de emitir fluorescencia en el infrarrojo cercano, lo que permite su rastreo en condiciones de laboratorio. La cepa creció en medio Schneider complementado con 20 % de suero fetal bovino inactivado, con mezcla de antibióticos y presión antibiótica específica (puromicina 200 pM) para mantener la integración del plásmido en la cepa transgénica. El cultivo se incubó a 26 °C en agitación (100 rpm). Diariamente se hizo una monitorización de su crecimiento en coulter por la fluorescencia emitida. Una vez que el cultivo alcanzó su estado estacionario, y antes de que aparecieran células muertas, los parásitos se recogieron por centrifugación a 4 °C en tubos estériles a 4000 x g durante 15 minutos. El pellet se resuspendió a una densidad de 1,5 x 109 parásitos/200 pL de PBS. Esta carga parasitaria se depositó en jeringas con agujas 29 G, que se usaron para infectar vía intraperitoneal a ratones Balb/c.

Entre las semanas 6 - 8 post-infección, los ratones se sacrificaron eutanásicamente en una atmósfera de CO2 y se procedió a la extracción de su médula ósea. Para obtener una suspensión de amastigotes, se diseccionan los huesos largos de las patas traseras de los ratones en condiciones estériles y se extrajo la médula ósea con una jeringa. Su contenido se depositó en una criba de nylon de 100 pm colocada sobre un tubo estéril. Las células de la médula ósea que contienen los amastigotes se lavaron y sembraron en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 23 pM ácido fólico, 100 pM adenosina, 22 mM glucosa, 4 mM L-glutamina, 25 mM MES, mezcla de antibióticos y 7,5 % suero fetal bovino pH 5.5. Los amastigotes axénicos se cultivaron en frascos ventilados a 37 °C en una atmósfera con 5 % de CO2. Se añadieron 30.000 amastigotes en 40 pL en cada uno de los 384 pocillos de una placa de microtitulación. A estas suspensiones se añadieron los compuestos (MTF, NFT o la combinación MTF NFT) disueltos en medio de amastigotes partiendo de una concentración pM máxima óptima de cada compuesto (Miltefosina: 15 micromolar y Nifuratel: 1.5 micromolar) y se hicieron hasta siete diluciones consecutivas. La viabilidad de los amastigotes se evaluó diariamente registrando la emisión de fluorescencia de las células a 708 nm en un sistema de imágenes infrarrojas Odyssey (Li-Cor). Como control negativo se usa DMSO al 0,1% y como control positivo anfotericina B a una concentración de 10 pM. Los índices de combinación de MTF NFT se determinaron usando una relación MTF/NFT 30/1.

Los resultados de la Figura 2 muestran el efecto por separado de la MTF y el NFT y su combinación. La Figura 2A en la parte superior muestra las curvas dosis/respuesta de MTF, NFT y a la terapia combinada MTF NFT. La gráfica de la izquierda en la Figura 2B muestra el cálculo de la EC50 de MTF (O), NFT (□) y de la combinación MTF NFT (A). Se determinó que los valores de EC50 de 1,74 pM (MTF) y 0,05 pM (NFT). Fa, es la fracción afectada (en este caso mortalidad de los amastigotes). Es la terminología usada por el software de análisis, el cual se basa en el método Chou y Talalay. Se observan las curvas dosis-respuesta de los compuestos individuales y de la combinación, es decir mortalidad de los amastigotes frente a las concentraciones crecientes de los compuestos solos o en combinación. Para conseguir los ajustes de la gráfica, el software lineariza los datos calculando los log del cociente Fracción afectada/Fracción no afectada y los representa frente al logaritmo de la dosis. Con las curvas ajustadas, el software (Compusyn (doi: 10.1016/0065-2571(84)90007-4.) calcula el índice de combinación (CI), según el método Chou y Talalay si CI = 1 la combinación es aditiva, si CI < 1 la combinación es sinérgica y si CI > 1 implica antagonismo. Al representar el log de CI frente a la fracción afectada, siempre que la gráfica esté por debajo de cero, eso implica sinergia. (CI 0,5 es el índice de combinación cuando la mortalidad de los amastigotes es del 50%).

Con los datos del panel central se determinó el índice de combinación entre ambos fármacos en las condiciones MTF/NFT 30/1y se realizó un isobolograma que demostró el efecto sinérgico in vitro de la combinación de fármacos.

Se realizó el análisis ex vivo en explantes esplénicos murinos infectados con IRFP L.infantum obtenidos de ratones Balb/c infectados 6 - 8 semanas antes con promastigotes de la cepa infrarroja. Los ratones se sacrificaron eutanásicamente y su bazo se diseccionó en condiciones estériles. Los bazos fueron troceados en pequeñas porciones con la ayuda de un bisturí sobre una placa de petri estéril de 35 mm. Las secciones de bazo se incubaron con 2 mL de colagenasa D (Roche) a 2 mg/mL en tampón (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCb) durante 20 min a 37 °C. La suspensión celular y los fragmentos de tejido restantes se filtraron a través de una criba de 100 gm para eliminar los fragmentos de tejido. Los glóbulos rojos se lisaron con tampón de lisis de eritrocitos en frio durante 4 minutos. Después de la lisis de los eritrocitos, los esplenocitos se lavaron 3 veces por centrifugación con PBS (500 x g 7 min a 4 °C). Finalmente, se resuspendieron en 5 mL de medio esplenocito (RPMI-1640 suplementado con 20 % suero fetal bovino, 1 mM de piruvato de sodio, 1x vitaminas RPMI, 10 mM HEPES y mezcla de antibióticos. La cantidad de explante necesario para realizar el experimento se calcula midiendo la emisión de fluorescencia infrarroja del mismo, establecida en trabajos previos, en 200.000 UA medidas en un equipo Odyssey. Para ello se colocaron por duplicado distintos volúmenes (40, 30, 20, 10, 5 gL) en placas negras de 384 pocillos con fondo claro. Se midió la emisión de fluorescencia y se estableció una curva estándar de emisión de fluorescencia. Los compuestos y las nuevas combinaciones terapéuticas se dispensan en las placas mediante un robot ASSISTANT/INTEGRA en placas de 384 pocillos. Se utilizaron 10 diluciones seriadas desde una concentración inicial y un volumen fijo de 40 qL. La adición del explante esplénico a la placa de 384 pocillos estuvo igualmente robotizada. A estos cultivos se añadieron los compuestos (MTF, NFT) o sus combinaciones (MTF NFT) disueltos en medio de cultivo partiendo de una concentración qM máxima óptima de cada compuesto tal y como se indica en el análisis in vitro, y hasta siete diluciones consecutivas. Las placas contenían dos columnas con controles positivos (anfotericina B, 10 qM) y negativos (0,2%, DMSO), distribuidos de forma alternativa. Estos controles permiten la validación estadística del ensayo mediante el factor Z-prima. La placa se incubó a 37 °C y 5 % CO2 durante 96 h, recogiéndose medidas de fluorescencia cada 24 h en un lector de fluorescencia Odyssey (LiCor). Los índices de combinación de MTF NFT se determinaron usando una relación MTF/NFT 30/1.

Tanto para los amastigotes axénicos in vitro como para los explantes esplénicos ex vivo, la estimación de la concentración inhibitoria (EC50) a los distintos tiempos 24, 48, 72 y 92 h se realizó mediante la representación de los valores de concentraciones de los fármacos frente a los valores de fluorescencia en el infrarrojo, utilizando el software estadístico SigmaPlot 14.5 (Systat Software, Inc). Para determinar el efecto aditivo, antagónico y/o sinérgico de las combinaciones de compuestos, se utilizó la aplicación informática de acceso libre Compusyn (https://www.combosyn.com) que aplica el método de Chou-Talalay para la combinación de fármacos y que se basa en la ecuación del efecto medio, derivada del principio de la ley de acción de masas, que es la teoría unificada que proporciona el vínculo común entre la entidad única y las entidades múltiples, y la dinámica de primer orden y de orden superior (doi: 10.1016/0065-2571 (84)90007-4).

La Figura 3A muestra el efecto de la MFT (panel de la izquierda) y del NFT (panel central) solos y de la combinación terapéutica MTF NFT (panel de la derecha) en los explantes esplénicos. Las curvas dosis-respuesta determinaron unos valores de EC50 de 3,25 qM y 0,25 qM, respectivamente. Se observó claramente un efecto mayor del NFT en la forma intramacrofágica comparada con los amastigotes de médula ósea in vitro. La Figura 3B muestran el cálculo de la EC50 de MTF (O), NFT (□), MTF NFT (A) usando la aplicación Compusyn en las condiciones MTF/NFT 30/1; en el panel central determinó el índice de combinación entre ambos fármacos y el panel de la derecha es un isobolograma que muestra el efecto sinérgico de la combinación NFT MTF de la misma forma que en el caso del análisis in vitro.

Todos estos resultados demuestran el efecto sinérgico in vitro y ex vivo de la terapia combinada MTF NFT que puede servir para sustituir al SSG de la terapéutica actual de la leishmaniosis visceral.

Ejemplo 5: Efecto in vitro de composiciones farmacéuticas que comprenden nifuratel y paromomicina

Es necesaria una formulación terapéutica que no use MTF para mujeres en edad fértil que puedan quedar gestantes y para que sea efectiva en niños preadolescentes, para los que el MTF pudiera ser una amenaza. Siguiendo el mismo procedimiento experimental que el descrito en el Ejemplo 4, se analizó el efecto in vitro y ex vivo de la combinación de fármacos NFT y PMM.

Los resultados de la Figura 4 muestran el efecto por separado de la PMM y el NFT y su combinación. Los índices de combinación de PMM NFT se determinaron usando una relación PMM/NFT 100/1. Los paneles izquierdo y central (fila superior) de la Figura 4A muestran curvas dosis/respuesta para PMM y NFT. Se determinó que los valores de EC50 de 100 pM y 0,05 pM, respectivamente. Los paneles de la Figura 4B muestran el cálculo de la EC50 de la NFT (O), PMM (□), PMM NFT (A) usando la aplicación Compusyn (doi: 10.1016/0065-2571(84)90007-4.) en las condiciones PMM/NFT 100/1; con el panel central se determinó el índice de combinación entre ambos fármacos y además se realizó un isobolograma que demostró el efecto sinérgico in vitro de la combinación de fármacos.

Se realizó también el análisis ex vivo en explantes esplénicos murinos infectados. Los índices de combinación de PMM NFT se determinaron usando una relación PMM/NFT 100/1. Igual que en ejemplo anterior, (Figura 5A) se muestran curvas dosis/respuesta para la PMM y el NFT con las que se han determinado valores de EC50 de 27 pM y 0,25 pM respectivamente. La curva de la combinación PMM NFT se refiere a una relación PMM/NFT 100/1. La Figura 5B muestran el cálculo de la EC50 de la NFT (O), PMM (□), NFT PMM (A) usando la aplicación Compusyn en las condiciones PMM/NFT 100/1; el panel central sirve para determinar el índice de combinación entre ambos fármacos y el panel de la derecha es un isobolograma que muestra el efecto sinérgico de la combinación PMM MTF.

Se observó claramente un efecto mayor del NFT en la forma intramacrofágica comparada con los amastigotes de médula ósea in vitro.

Todos estos resultados muestran el efecto sinérgico in vitro y ex vivo de la combinación PMM NFT, de forma que la PMM podría sustituir a la MTF en aquellas franjas poblacionales donde la eficacia de la MTF pueda estar comprometida.

La Tabla 1 muestra un resumen de los resultados in vitro (amastigotes axénicos de médula ósea) y ex vivo (explantes esplénicos obtenidos de bazo de ratón Balb/c) de las combinaciones de la invención (NFT MTF y NFT PMM) sobre la cepa transgénica IRFP L.infantum. Los resultados muestran los valores de EC50 para cada compuesto y combinación, así como los IS respectivos.

Tabla 1.

IS1: Amastigotes axénicos / HEP-G2.

IS2: Amastigotes intramacrofágicos / esplenocitos

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Compuesto nifutarel (NFT) de Fórmula (I):

Formula (I)

para uso en un método de tratamiento de leishmaniosis.

2. El compuesto de la reivindicación 1 para uso, caracterizado porque la leishmaniosis es leishmaniosis visceral.

3. Composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y un fármaco leishmanicida para uso como medicamento.

4. Composición farmacéutica que comprende nifuratel (NFT) y un fármaco leishmanicida para uso en un método de tratamiento contra la leishmaniosis.

5. Composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque la leishmaniosis es leishmaniosis visceral.

6. Composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque el fármaco leishmanicida se selecciona del grupo que consiste en entre antimoniato de meglumina, antimonial pentavalente, alopurinol, miltefosina (MTF), domperidona, anfotericina B (ANFB) o paromicina (PMM). En una realización más preferida, el fármaco se selecciona entre miltefosina (MTF) y paromicina (PMM).

7. Composición farmacéutica para uso de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizada porque el fármaco leishmanicida se selecciona entre miltefosina (MTF) y paromicina (PMM).