ES2935372T3

ES2935372T3 - Polipéptidos sensibles al factor de crecimiento transformante beta y sus métodos de uso

Info

Publication number: ES2935372T3
Application number: ES16860930T
Authority: ES
Inventors: Yvonne Yu-Hsuan Chen; Zenan Li Chang
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2015-10-30
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2023-03-06
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: EP3368571B1; JP2022141761A; JP7104624B2; EP3368571A4; HRP20230239T1; LT3368571T; DK3368571T3; CN108884155B; KR20180092947A; RS64053B1; SI3368571T1; EP3368571A1; PT3368571T; PL3368571T3; WO2017075433A1; US11014980B2; US20210277099A1; HUE061424T2; CN115960264A; FI3368571T3

Abstract

Los aspectos de la divulgación se relacionan con polipéptidos que comprenden un péptido señal, un dominio de unión a antígeno que se une específicamente a TGF-β, un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio. Cuando se expresan en una célula, los polipéptidos son capaces no solo de neutralizar el TGF-β sino también de desencadenar específicamente la activación de las células T en presencia de TGF-β. La activación de las células T estimula a la célula inmunitaria a producir citoquinas inmunoestimuladoras y proliferar, convirtiendo así al TGF-β de una señal inmunosupresora en un estímulo activador. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Polipéptidos sensibles al factor de crecimiento transformante beta y sus métodos de uso

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los campos de la biotecnología y la medicina. De manera más particular, se trata de polipéptidos y células que contienen los polipéptidos útiles para estimular una respuesta inmunitaria en presencia de TGF-p.

2. Antecedentes

El TGF-p es una citocina pleiotrópica que se encuentra en niveles elevados en una variedad de estados patogénicos, incluyendo tumores sólidos, fibrosis y heridas desreguladas. El diseño terapéutico para tumores sólidos se ha orientado a neutralizar el TGF-p en el microambiente tumoral. Si bien existen muchos anticuerpos anti-TGF-p, los anticuerpos como agentes terapéuticos tienen algunos inconvenientes. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser grandes en comparación con otras moléculas de unión a antígeno y son proteínas multicatenarias codificadas por múltiples genes. Ambos aspectos dan lugar a mayores costes de producción. También se han identificado sustancias químicas que inhiben TGF-p, pero por lo general vienen acompañados de problemas de toxicidad derivados de subproductos metabólicos en el hígado. El documento WO 2013/123061 se refiere a un receptor de antígeno quimérico biespecífico. El documento WO 2005/097832 se refiere a un anticuerpo contra TGF-p. El documento WO 2014/172584 se refiere a receptores de linfocitos T quiméricos con un dominio específico para TGF-p extracelular.

Se han explorado estrategias que utilizan terapia adoptiva de linfocitos T con linfocitos T insensibles a TGF-p que expresan un receptor de TGF-p dominante negativo. Sin embargo, la mera neutralización de la señal de TGF-p puede no ser suficiente, y la reversión de la señal de TGF-p a partir de un inmunosupresor a un inmunoestimulante puede proporcionar estrategias terapéuticas más prometedoras.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de terapias más efectivas que contrarresten la acción de TGF-p y proporcionen también el beneficio de una producción más rentable.

Sumario de la invención

La invención se define en las reivindicaciones independientes. Los aspectos y realizaciones preferentes adicionales se definen en las reivindicaciones dependientes. Cualquier aspecto, realización y ejemplo de la presente divulgación que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención y se proporciona meramente con fines ilustrativos. Las referencias a los métodos de tratamiento en los párrafos siguientes de la presente descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

La invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR, por sus siglas en inglés) que comprende un péptido señal, un dominio de unión al antígeno TGF-p con una región variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo, un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio que transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una el antígeno; en donde el dominio de unión al antígeno TGF-p se une de manera específica al TGF-p soluble y en donde: (a) la región VH comprende la SEQ ID NO: 5 como HCDR1, la SEQ ID NO: 6 como HCDR2; y la SEQ ID NO: 7 como HCDR3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 8 como LCDR1, la SEQ ID NO: 9 como LCDR2; y la SEQ ID NO: 10 como LCDR3; o (b) la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 como HCDR1, la SEQ ID NO: 12 como HCDR2; y la SEQ ID NO: 13 como HCDR3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 14 como LCDR1, la SEQ ID NO: 15 como LCDR2; y la SEQ ID NO: 16 como LCDR3; o (c) la región VH comprende la SEQ ID NO: 21 como HCDR1, la SEQ ID NO: 22 como HCDR2; y la SEQ ID NO: 23 como HCDR3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 24 como LCDR1, la SEQ ID NO: 25 como LCDR2; y la SEQ ID NO: 26 como LCDR3; y en donde el CAR tiene la estructura: S-X-PL-Y-PS-T-E o S-Y-PL-X-PS-T-E en donde S es el péptido señal, X es VH, PL es un enlazador peptídico, Y es VL, PS es el espaciador peptídico, T es el dominio transmembrana y E es el endodominio.

La presente invención también proporciona un ácido nucleico aislado que codifica un CAR de la invención.

La presente invención proporciona además una célula que comprende un CAR de la invención o un ácido nucleico de la invención, en donde: (A) opcionalmente, la célula comprende además un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de cáncer y, opcionalmente, el CAR específico de cáncer se une de manera específica a: (i) Her2 o (ii) se une de manera específica a CD19 o CD20, en donde opcionalmente la célula es una célula inmunitaria; y (B) opcionalmente: (a) la célula es un linfocito T, opcionalmente un linfocito T CD4+ o CD8+; o un linfocito T regulador; o (b) la célula es un linfocito citolítico natural.

La presente invención proporciona además una célula de la invención para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula de la invención con TGF-p, en donde opcionalmente: (i) estimular una respuesta inmunitaria comprende aumentar la expresión y/o secreción de citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes, en donde opcionalmente las citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes son una o más de TNF-a, IFN-p, IFN-^y, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; o (ii) estimular una respuesta inmunitaria comprende aumentar la proliferación de células inmunitarias, opcionalmente en donde las células inmunitarias son linfocitos T.

La presente invención también proporciona una célula de la invención, para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula de la invención con TGF-p, en donde se encuentra la célula in vivo en un sujeto que necesita estimulación inmunitaria y, opcionalmente, el TGF-p es un TGF-p endógeno producido en el sujeto que necesita estimulación inmunitaria, en donde opcionalmente: (i) el sujeto humano tiene cáncer, fibrosis, o una herida abierta, en donde opcionalmente el cáncer es melanoma; (ii) el sujeto humano tiene una neoplasia maligna de linfocitos B; o (iii) el sujeto humano tiene un tumor sólido; y en donde, opcionalmente: (iv) el método comprende además administrar la célula a un sujeto humano; y/o (v) el método comprende además administrar TGF-p al sujeto.

La presente invención proporciona además un método para detectar TGF-p ex vivo en una solución que comprende poner en contacto las células de la invención con la solución y medir la estimulación inmunitaria; en donde un aumento en la estimulación inmunitaria indica la presencia de TGF-p y ningún aumento en la estimulación inmunitaria indica la ausencia de TGF-p, en donde opcionalmente: (i) la estimulación inmunitaria comprende la expresión de citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes, en donde opcionalmente las citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes son una o más de TNF-a, IFN-p, IFN-^y, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; o (ii) la estimulación inmunitaria comprende un aumento en la proliferación de células inmunitarias, en donde opcionalmente las células inmunitarias son linfocitos T.

La presente invención proporciona además un método para producir el CAR de la invención que comprende expresar un nucleótido que codifica el CAR en una célula.

La presente invención también proporciona un método para expandir linfocitos T in vitro, comprendiendo el método ponerse en contacto con un linfocito T de la invención in vitro con una composición que comprende TGF-p, en donde opcionalmente la composición: (a) comprende de 1-50 ng/ml de TGF-p; y/o (b) comprende IL-2 y opcionalmente la composición comprende 20-400 U/ml de IL-2, en donde opcionalmente: (a) (i) el método comprende además poner en contacto las células con células alimentadoras, en donde opcionalmente se irradian las células alimentadoras; o (ii) el método excluye poner en contacto los linfocitos T con las células alimentadoras; y/o (b) el linfocito T es un linfocito T regulador, en donde opcionalmente los linfocitos T reguladores expandidos comprenden menos del 10 % de linfocitos T no reguladores.

La presente invención proporciona además una célula de la invención para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección patológica en un paciente, en donde opcionalmente: (a) la célula es un linfocito T regulador, en donde opcionalmente la enfermedad es: una enfermedad autoinmunitaria; o (b) la enfermedad es cáncer; en donde opcionalmente el método comprende además expandir las células in vitro mediante un método que comprende poner en contacto in vitro la célula con una composición que comprende TGF-p;, en donde opcionalmente: (a) la composición comprende 1-50 ng/ml de TGF-p; y/o (b) la composición comprende además IL-2, y opcionalmente la composición comprende 20-400 U/ml de IL-2; en donde opcionalmente: (a) el método comprende además poner en contacto las células con células alimentadoras, en donde opcionalmente se irradian las células alimentadoras; o (b) el método excluye poner en contacto los linfocitos T con las células alimentadoras; en donde opcionalmente el linfocito T es un linfocito T regulador, en donde opcionalmente los linfocitos T reguladores expandidos comprenden menos del 10 % de linfocitos T no reguladores; en donde opcionalmente la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide; y en donde opcionalmente el método comprende además la administración de TGF-p al paciente.

SUMARIO DE LAS ENSEÑANZAS TÉCNICAS

Los polipéptidos descritos en el presente documento satisfacen la necesidad en la técnica proporcionando polipéptidos que, cuando se expresan en una célula, son capaces no solo de neutralizar el TGF-p sino también de desencadenar de manera específica la activación de linfocitos T en presencia de TGF-p. La activación de los linfocitos T estimula a las células inmunitarias a producir citocinas inmunoestimulantes y proliferar, convirtiendo así al TGF-p de una señal inmunosupresora a un estímulo activador. En consecuencia, los aspectos de la divulgación se refieren a polipéptidos que comprenden un péptido señal, un dominio de unión a antígeno con una región variable pesada (VH) y variable ligera (VL), un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio; en donde el dominio de unión a antígeno se une de manera específica a TGFp.

En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende un péptido señal, un dominio de unión a antígeno con una región variable pesada (VH) y variable ligera (VL), un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio; en donde la región VH comprende la SEQ ID NO: 5 (HCDR1), la SEQ ID NO: 6 (HCDR2); y la SEQ ID NO: 7 (HCDR3) y la región VL comprende la SEQ ID NO: 8 (LCDR1), la SEQ ID NO: 9 (LCDR2); y la SEQ ⁱD NO: 10 (LCDR3). En algunas realizaciones, la VH comprende la SEQ ID NO: 1 y la VL comprende la S^eQ ID NO: 2.

En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende un péptido señal, un dominio de unión a antígeno con una región variable pesada (VH) y variable ligera (VL), un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio; en donde la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 (HCDR1), la SEQ ID NO: 12 (HCDR2); y la SEQ ID NO: 13 (HCDR3) y la región VL comprende la SEQ ID NO: 14 (LCDR1), la SEQ ID NO: 15 (LCDR2); y la SEQ ID NO: 16 (LCD^r3). En algunas realizaciones, la VH comprende la S^eQ ID NO: 3 y la VL comprende la SEQ ID NO: 4.

En algunos aspectos, la divulgación se refiere a un polipéptido que comprende un péptido señal, un dominio de unión a antígeno con una región variable pesada (VH) y variable ligera (VL), un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio; en donde la región VH comprende la SEQ ID NO: 21 (HCDR1), la SEQ ID NO: 22 (HCDR2); y la SEQ ID NO: 23 (HCDR3) y la región VL comprende la SEQ ID NO: 24 (LCDR1), la SEQ ID NO: 25 (LCDR2); y la SEQ ID NO: 26 (LCDR3). En algunas realizaciones, la VH comprende la SEQ ID NO: 19 y la VL comprende la SEQ ID NO: 20.

Los polipéptidos descritos anteriormente y en el presente documento son polipéptidos que son una cadena sencilla continua.

Un polinucleótido o región polinucleotídica (o un polipéptido o región polipeptídica) tiene un determinado porcentaje (por ejemplo, un 60 %, un 65 %, un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 98 % o un 99 %, o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos) de "identidad de secuencia" u "homología" con otra secuencia significa que, cuando se alinean, ese porcentaje de bases (o aminoácidos) es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el porcentaje de homología o identidad de secuencia se pueden determinar usando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo los descritos en Ausubel et al., eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology.

Los polipéptidos de la divulgación actual pueden tener una región, dominio, enlazador, espaciador, etc. que tiene al menos, como máximo, o exactamente un 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100 % de identidad ( o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos) a la totalidad o a una parte de las secuencias de aminoácidos descritas en el presente documento. En determinados aspectos, los polipéptidos descritos a lo largo de esta divulgación se aíslan, lo que significa que no se encuentran en el medio celular. En algunos casos, se purifican, lo que significa que están en su mayoría, si no completamente, separados de polipéptidos que tienen una secuencia de aminoácidos y/o fórmula química diferentes.

En algunos aspectos, la VH y VL están separadas por un enlazador peptídico. Se contempla que un enlazador peptídico pueda separar cualquier dominio/región descritos en los polipéptidos de la divulgación. En algunos aspectos, el enlazador peptídico es un péptido compuesto únicamente de restos de glicina y serina (un enlazador de glicinaserina). En algunos aspectos, el enlazador peptídico tiene al menos, como máximo, o exactamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, o 200 aminoácidos (o cualquier intervalo que pueda derivarse de los mismos). En algunos aspectos, el enlazador peptídico se conoce en la técnica o se describe en el presente documento.

El CAR de la presente invención tiene la estructura: S-X-PL-Y-PS-T-E o S-Y-PL-X-PS-T-E en donde S es el péptido señal, X es VH, PL es un enlazador peptídico, Y es VL, PS es el espaciador peptídico, T es el dominio transmembrana y E es el endodominio. En algunos aspectos, un polipéptido tiene la estructura: S-X-Y-PS-T-E o S-Y-X-PS-T-E, en donde S, X, Y, PS, T y E se definen como anteriormente. Cuando se hace referencia a péptidos y polipéptidos en el presente documento, las secuencias y estructuras se escriben e interpretan como si procedieran del extremo N al extremo C, que es la práctica convencional en la técnica.

En algunos aspectos, el polipéptido comprende además una región coestimuladora. En algunos aspectos, la región coestimuladora se encuentra entre el dominio transmembrana y el endodominio. En algunos aspectos, los polipéptidos comprenden al menos, como máximo, o exactamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o cualquier intervalo que pueda derivarse de las mismas) regiones coestimuladoras. En algunos aspectos, la región coestimuladora es una conocida en la técnica o descrita en el presente documento.

En algunos aspectos, el dominio transmembrana comprende una porción transmembrana de CD28. En algunos aspectos, el dominio transmembrana es la totalidad o parte de un dominio transmembrana conocido en la técnica o descrito en el presente documento.

En algunos aspectos, el endodominio comprende un dominio de señalización de CD28 o CD3-zeta o ambos. En algunos aspectos, el endodominio es la totalidad o parte de un endodominio conocido en la técnica o descrito en el presente documento. En algunos aspectos, el endodominio es un dominio de señalización CD3-zeta. En algunos aspectos, el endodominio comprende uno o más, tales como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 porciones de endodominios adecuados descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, el espaciador peptídico comprende una región bisagra. En algunos aspectos, la bisagra es la región bisagra de una molécula de IgG. En algunos aspectos, la bisagra es una región de bisagra conocida en la técnica o descrita en el presente documento. En algunos aspectos, el espaciador peptídico comprende o comprende además una región CH²CH³de una molécula de IgG. En algunos aspectos, el espaciador peptídico comprende uno o más de una región bisagra, región CH¹, CH²y CH³. En algunos aspectos, el espaciador peptídico procede de una región bisagra, CH¹, CH², y/o CH³o de otra región de una IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, o IgM de un ser humano, ratón, rata, perro, burro, cabra o conejo. En algunos aspectos, el espaciador peptídico comprende la región bisagra y CH²CH³de una molécula de IgG. En algunos aspectos, la región CH²CH³de una molécula de IgG tiene mutaciones adicionales L235E/N297Q o L235D/N297Q para evitar la unión al receptor de Fc. En algunos aspectos, el espaciador peptídico consiste en la región bisagra de una molécula de IgG. En algunos aspectos, el espaciador peptídico tiene menos de 30, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 aminoácidos. En algunos aspectos, el espaciador peptídico tiene menos de, más de, o exactamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 225, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 450, 500, 550, 600 o 700 aminoácidos (o cualquier intervalo que pueda derivarse de los mismos). En algunos aspectos, el espaciador peptídico comprende menos de 50 aminoácidos. En algunos aspectos, el espaciador peptídico comprende más de 50 aminoácidos.

En algunos aspectos, el polipéptido comprende además un péptido de detección. En algunos aspectos, el péptido de detección es un péptido de SEQ ID NO: 17, una etiqueta HA (SEQ ID NO: 94), o una etiqueta cMyc (SEQ ID No : 95). En algunos aspectos, el péptido de detección está flanqueado por enlazadores. En algunos aspectos, un enlazador (por ejemplo, un enlazador peptídico como se describe en el presente documento) está en la porción amino del péptido de detección. En algunos aspectos, un enlazador (por ejemplo, un enlazador peptídico como se describe en el presente documento) está en la porción carboxi del péptido de detección. En algunos aspectos, un enlazador está en la porción amino y carboxi del péptido de detección. En algunos aspectos, el péptido de detección está en la porción amino de las regiones VH y v L. En algunos aspectos, el péptido de detección está entre el péptido señal y el dominio de unión a antígeno.

En algunos aspectos, el péptido señal comprende la SEQ ID NO: 18. En algunos aspectos, el péptido señal es uno conocido en la técnica o descrito en el presente documento.

En algunos aspectos, el polipéptido comprende además un dominio de unión a antígeno específico de molécula de cáncer. Por ejemplo, el polipéptido puede ser un receptor de antígeno quimérico (CAR) biespecífico en donde el polipéptido comprende un dominio de unión a antígeno para TGF-p y un dominio de unión a antígeno para una molécula de cáncer o antígeno de cáncer. Los dominios de unión a antígeno pueden estar separados por un espaciador/enlazador peptídico. En algunos aspectos, la molécula de cáncer comprende Her2. En algunos aspectos, la molécula del cáncer comprende CD19 o CD20. En algunos aspectos, la molécula de cáncer o el antígeno del cáncer es uno conocido en la técnica o descrito en el presente documento.

El dominio de unión a antígeno se une de manera específica al TGF-p soluble. Anteriormente se desconocía que polipéptidos similares a los de la divulgación podrían unirse a antígenos solubles y transducir señales en respuesta a antígenos solubles.

Los polipéptidos descritos en el presente documento pueden incluir 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100 o más aminoácidos variantes en al menos o como máximo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 300, 400, 500, 550, 1000 o más aminoácidos contiguos, o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos, de SEQ ID NO: 1-95.

Otros aspectos de la divulgación se refieren a ácidos nucleicos que codifican un polipéptido descrito en el presente documento. En algunos aspectos, la divulgación se refiere a una célula que comprende uno o más polipéptidos descritos en el presente documento. En algunos aspectos, la célula comprende además un CAR específico de cáncer En algunos aspectos, el CAR específico de cáncer es un polipéptido separado del TGF-p CAR (CAR para TGF-p). En algunos aspectos, el CAR específico de cáncer se une de manera específica a Her2. En algunos aspectos, el CAR específico de cáncer se une de manera específica a CD19 o CD20. En algunos aspectos, el CAR específico de cáncer se une de manera específica a una molécula o antígeno de cáncer conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento. En algunos aspectos, la célula es una célula inmunitaria. En algunos aspectos, la célula es una célula progenitora o célula madre. En algunos aspectos, la célula progenitora o madre se diferencia in vitro en una célula inmunitaria. En algunos aspectos, la célula es un linfocito T. En algunos aspectos, la célula es un linfocito T CD4+ o CD8+. En algunos aspectos, la célula es un linfocito citolítico natural. En algunos aspectos, la célula está ex vivo. La expresión células inmunitarias incluye células del sistema inmunitario que participan en la defensa del organismo contra tanto enfermedades infecciosas como materiales extraños. Las células inmunitarias pueden incluir, por ejemplo, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos citolíticos naturales, linfocitos tales como linfocitos B y linfocitos T, y monocitos. Las células pueden incluir, por ejemplo, linfocitos T auxiliares CD4+, CD8+, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T ^y6, linfocitos T reguladores, linfocitos T supresores y linfocitos T citolíticos naturales. En un aspecto específico, el linfocito T es un linfocito T regulador.

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a métodos para estimular una respuesta inmunitaria que comprenden poner en contacto una célula de la divulgación (es decir, una célula que comprende un polipéptido de unión a antígeno descrito en el presente documento) con TGF-p. En algunos aspectos, estimular una respuesta inmunitaria comprende aumentar la expresión y/o secreción de citocinas y/o moléculas estimulantes inmunitarias. En algunos aspectos, la citocina y/o molécula es una citocina o molécula proinflamatoria. En algunos aspectos, las citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes son una o más de TNF-a, IFN-p, IFN-^y, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos. En algunos aspectos, estimular una respuesta inmunitaria comprende aumentar la proliferación de células inmunitarias. En algunos aspectos, las células inmunitarias son linfocitos T. En algunos aspectos, el TGF-p es TGF-p endógeno producido en un sujeto humano que necesita estimulación inmunitaria. En algunos aspectos, el sujeto humano tiene cáncer, fibrosis o una herida abierta. En algunos aspectos, el sujeto humano tiene una neoplasia maligna de linfocitos B. En algunos aspectos, el sujeto humano tiene un tumor sólido. Un tumor sólido es una masa de tejido anómala que habitualmente no contiene quistes o áreas líquidas. Los tumores sólidos pueden ser benignos (no cancerosos) o malignos (cancerosos). Los diferentes tipos de tumores sólidos se nombran por el tipo de células que los forman. Son ejemplos de tumores sólidos sarcomas, carcinomas y linfomas. En algunos aspectos, los métodos son para tratar a una persona con una indicación, en donde la indicación se caracteriza por un nivel patogénico de expresión de TGF-p. En algunos aspectos, las células y polipéptidos descritos en el presente documento se pueden usar para tratar cáncer, heridas desreguladas, fibrosis, heridas abiertas, tumores sólidos, etc... donde la etiología de la afección, al menos en parte, está basada en la expresión de TGF-p. En algunos aspectos, la célula (es decir, la célula de la divulgación que comprende el polipéptido de unión a antígeno) está en el sujeto humano que necesita estimulación inmunitaria. En algunos aspectos, el método comprende además administrar una célula descrita en el presente documento que comprende los polipéptidos o ácidos nucleicos de la divulgación a un sujeto humano.

Otros aspectos del método se refieren a un método para detectar TGF-p en una solución que comprende poner en contacto las células de la divulgación y medir la estimulación inmunitaria; en donde un aumento en la estimulación inmunitaria indica la presencia de TGF-p y ningún aumento en la estimulación inmunitaria indica la ausencia de TGF-p. En algunos aspectos, la estimulación inmunitaria comprende la expresión de citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes. En algunos aspectos, las citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes son una o más de TNF-a, IFN-p, IFN-^y, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos. En algunos aspectos, la estimulación inmunitaria comprende un aumento de la proliferación de células inmunitarias. En algunos aspectos, las células inmunitarias son linfocitos T. En algunos aspectos, las células están ex vivo.

Un aumento en la expresión o proliferación como se describe en el presente documento puede ser al menos, como máximo, o exactamente un aumento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 50, 100, 200, 300, 500 o 1000 veces sobre un nivel de expresión de referencia, tal como un control (control sin enfermedad, sin TGF-p o sin polipéptido de unión a antígeno).

Aspectos adicionales de la divulgación se refieren a métodos para producir los polipéptidos de la divulgación que comprenden expresar un nucleótido que codifica el polipéptido en una célula. Otros aspectos se refieren a las células cultivadas, células congeladas, células suspendidas o células adheridas que comprenden un polipéptido descrito en el presente documento.

Los aspectos de la divulgación se refieren a un método para tratar una enfermedad o afección patológica que comprende administrar una célula de la divulgación a un paciente. En algunos aspectos, el paciente es un paciente humano.

En algunos aspectos, la célula es un linfocito T regulador (es decir,, linfocito T regulador que comprende los polipéptidos de unión a TGF-p descritos en el presente documento). En algunos aspectos, la enfermedad es una enfermedad autoinmunitaria. En algunos aspectos, la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide. En algunos aspectos, la enfermedad autoinmune es una de las descritas en el presente documento.

En algunos aspectos de los aspectos del método, el método comprende además la administración de TGF-p al sujeto.

En algunos aspectos, el método comprende o comprende además expandir y/o inducir la proliferación de linfocitos T in vitro, comprendiendo el método poner en contacto el linfocito T de la divulgación con una composición que comprende TGF-p in vitro. En algunos aspectos, el linfocito T es un linfocito regulador. En algunos aspectos, el linfocito T es un linfocito T descrito en el presente documento. En algunos aspectos, los linfocitos T reguladores expandidos comprenden menos del 10 % de los linfocitos T no reguladores. En algunos aspectos, los linfocitos T reguladores expandidos comprenden menos de un 0,5, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48 o 50 % o cualquier intervalo que pueda derivarse de los mismos.

En algunos aspectos, la composición comprende 1-50 ng/ml de TGF-p. En algunos aspectos, la composición comprende al menos, como máximo o aproximadamente 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 ng/ml de TGF-p (o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos).

En algunos aspectos, la composición comprende además IL-2. En algunos aspectos, la composición comprende 20 400 U/ml de lL-2. En algunos aspectos, la composición comprende al menos, como máximo o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 405, 410, 415, 420, 425, 430, 435, 440, 445, 450, 455, 460, 465, 470, 475, 480, 485, 490, 495, 500, 505, 510, 515, 520, 525, 530, 535, 540, 545, 550, 555, 560, 565, 570, 575, 580, 585, 590, 595, 600 U/ml de IL-2 (o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos).

En algunos aspectos, el método comprende además poner en contacto las células con células alimentadoras. En algunos aspectos, las células alimentadoras están irradiadas. Las células alimentadoras o las células de soporte pueden incluir, por ejemplo, fibroblastos, fibroblastos embrionarios de ratón, células JK1, células SNL 76/7, células epiteliales fetales humanas, fibroblastos humanos y fibroblastos de prepucio humano.

En algunos aspectos, el método excluye el contacto de linfocitos T con células alimentadoras. En algunos casos, las células alimentadoras excluidas son de una especie animal diferente a los linfocitos T.

En un aspecto de los métodos descritos en el presente documento, el sujeto es un sujeto humano. Los términos "individuo", "sujeto", "hospedador", y "paciente", utilizados indistintamente en el presente documento, se refieren a un mamífero, que incluye, pero sin limitación, múridos (por ejemplo, ratas, ratones), lagomorfos (por ejemplo, conejos), primates no humanos, seres humanos, cánidos, félidos, ungulados (por ejemplo, équidos, bóvidos, óvidos, suidos, cápridos), etc.

Cuando se proporciona un intervalo de valores, se entiende que la divulgación abarca cada valor intermedio, hasta la décima parte de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de dicho intervalo y cualquier otro valor indicado o intermedio en dicho intervalo indicado. Los límites superior e inferior de estos intervalos más pequeños pueden incluirse independientemente en los intervalos más pequeños y también se abarcan dentro de la divulgación, sujetos a cualquier límite de manera específica excluido en el intervalo establecido. Cuando el intervalo indicado incluye uno o ambos límites, también se incluyen en la divulgación los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de esos límites incluidos.

Breve descripción de los dibujos

Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente divulgación. La divulgación puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos junto con la descripción detallada de aspectos específicos presentados en el presente documento.

La figura 1 muestra que los scFv de TGF-p neutralizan TGF-p humano. Las cantidades indicadas de TGF-p y scFv anti-TGF-p se añadieron a células HepG2 en cultivo durante 30 min. La neutralización de TGF-p está indicada por una pérdida en la respuesta de fosfo-SMAD2, según lo detectado por transferencia western.

La figura 2 muestra que los TGF-p CAR se expresan en la superficie celular. Se creó un TGF-p CAR usando scFv n.° 2. La tinción de superficie y la citometría de flujo muestran que los TGF-p CAR se presentan en la superficie celular de los linfocitos T CD4+ y CD8+. El dominio extracelular del receptor contiene el epítopo FLAG. EGFRt es un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado que es un indicador de la transducción celular.

La figura 3A-B demuestra que los TGF-p CAR bloquean la señalización de TGF-p endógeno en linfocitos T CD8+ (A) y CD4+ (B). La expresión de TGF-p CAR en los linfocitos T bloquea la señalización de TGF-p a través de la vía SMAD. los linfocitos T que expresan el receptor indicado se incubaron con TGF-p durante 30 min y se sondearon para detectar fosfo-SMAD2 mediante transferencia Western. La expresión scFv-less se refiere a un CAR que carece de cualquier dominio scFv de unión a ligando (antígeno), EGFRt se refiere a un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado que es irrelevante para los otros componentes aquí.

La figura 4A-C. (A) Las células Jurkat que expresan de manera estable TGF-p CAR y un indicador NFAT (EGFP expresado a partir de un promotor inducible por NFAT) muestran una mayor activación en respuesta a concentraciones crecientes de TGF-p. (B,C) Los linfocitos T CD4+ humanos primarios que expresan de forma estable TGF-p CAR aumentan (B) la expresión de CD69 y (C) la producción de citocinas Th1 en respuesta a la estimulación con TGF-p. El aumento de CD69 se controló mediante tinción superficial después de un día de incubación con o sin TGF-p. La producción de citocinas se detectó aplicando el inhibidor del transporte de proteínas Brefeldina A y realizando una tinción intracelular después de un día de incubación con o sin TGF-p. "Simulado" indica linfocitos T transducidos con una construcción irrelevante. "La expresión scFv-less" indica linfocitos T que expresan un CAR que es idéntico al TGF-p CAR excepto que carece del dominio scFv y, por lo tanto, no puede unirse a TGF-p. "d Nr " es el receptor de TGF-p dominante negativo, que es una cadena 2 truncada del receptor de TGF-p que carece del dominio de señalización citoplasmático. Los valores que se muestran son la media de triplicados con barras de error que indican ± 1 desviación estándar (d.e.). * p < 0,05; ** p < 0,005, *** p < 0,0005, ***** p < 0,0005.

La figura 5 muestra que el receptor de TGF-p dominante negativo no puede desencadenar la producción de citocinas. Si bien se ha informado que el receptor de TGF-p dominante negativo también inhibe la señalización de TGF-p, no desencadenar acciones inmunoestimuladoras como la producción de TNF-a. Tp corto y Tp largo son dos TGF-p CAR diferentes, Dom-Neg se refiere al receptor de TGF-p dominante negativo, y scFv-less se refiere a un CAR que carece de cualquier dominio scFv de unión a ligando. Tp corto se refiere al polipéptido TGF-p CAR con un espaciador peptídico que consiste únicamente en la región bisagra de IgG4. Tp largo se refiere al polipéptido TGF-p ^cA^rcon un espaciador peptídico que contiene las regiones bisagra de IgG4 y CH²CH³.

La figura 6 demuestra que los linfocitos T-TGF-p CAR proliferan en respuesta a TGF-p.

La figura 7 muestra la inhibición de la señalización de TGF-p/SMAD murino. Se aplicaron cantidades indicadas de scFv y TGF-p1 de ratón a fibroblastos NIH3T3 durante 30 min. Las células se lisaron y se sondaron para determinar la fosforilación de SMAD2.

Figura 8. Las células Jurkat que expresan de manera estable TGF-p CAR y un indicador NFAT (EGFP expresado a partir de un promotor inducible por NFAT) muestran una mayor activación en respuesta a una mayor entrada de TGF-pi murino, lo que indica que el TGF-p CAR modificadas por ingeniería genética para reconocer el TGF-p humano también reacciona de forma cruzada con el TGF-p murino.

Figura 9. El TGF-p CAR se presenta en la superficie celular de manera más eficiente que el receptor de TGF-p dominante negativo.

Figura 10. La función de TGF-p CAR se puede ajustar mediante la elección del dominio coestimulador.

Figura 11. El TGF-p desencadena constantemente la producción de TNF-a de manera dependiente de la dosis en células de diferentes donantes.

Figura 12. La longitud del espaciador peptídico de los TGF-p CAR modula el umbral de activación.

Figura 13. La señalización de los CAR requiere dimerización de los CAR mediada por ligando, pero no hay ningún requisito de que el ligando o el propio CAR existan previamente como un dímero. La tinción de superficie con CD69 se realizó en líneas celulares Jurkat que portan el uno o más CAR indicados. GFP CAR n.° 1 y GFP CAR n.° 3 existen predominantemente como homodímeros, y los dos CAR se unen a diferentes epítopos en EGFP y pueden unirse simultáneamente a una molécula monomérica de EGFP. GFP CAR n.° 1 y GFP CAR n.° 2 se unen al mismo epítopo en EGFP, pero CAR n.° 2 existe como monómero en lugar de como homodímero.

Figura 14. Las moléculas de antígeno dimérico solubles pueden desencadenar la señalización mediante la unión de receptores en diferentes células.

Figura 15. TGF-p CAR puede activarse tanto de manera dependiente como independiente del contacto célulacélula.

Figura 16. Los linfocitos T-TGF-p CAR pueden activarse en ausencia de contacto célula-célula.

Descripción de aspectos ilustrativos

Los polipéptidos, células y métodos descritos en el presente documento se pueden utilizar para neutralizar TGF-p y activar de manera específica la activación de linfocitos T en presencia de TGF-p.

I. Definiciones

Los péptidos de la divulgación se refieren a péptidos que comprenden CAR o receptores de antígeno quiméricos. Los CAR son receptores modificados por ingeniería genética, que injertan una especificidad arbitraria en una célula efectora inmunitaria. Normalmente, estos receptores se usan para injertar la especificidad de un anticuerpo monoclonal en un linfocito T. Los receptores se llaman quiméricos porque están compuestos por partes de diferentes fuentes.

Los términos "proteína", "polipéptido", y "péptido" se usan indistintamente en el presente documento cuando se refieren a un producto génico.

"Homología", "identidad", o "similitud" se refieren a la similitud de la secuencia entre dos péptidos o entre dos moléculas de ácido nucleico. La identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear a efectos de comparación. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base o aminoácido, entonces las moléculas comparten identidad de secuencia en esa posición. El grado de identidad entre secuencias depende del número de posiciones coincidentes u homólogas compartidas por las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del 40 % de identidad, o menos del 25 % de identidad, con una de las secuencias de la actual divulgación.

Las expresiones "porción amino", "extremo N", "extremo amino", y similares como se usan en el presente documento, se usan para referirse al orden de las regiones del polipéptido. Por otra parte, cuando algo es aminoterminal para una región, no está necesariamente en el extremo (o al final) de todo el polipéptido, sino justo en el término de la región o dominio. Análogamente, las expresiones "porción carboxi", "extremo C", "extremo carboxilo", y similares, tal como se usan en el presente documento, se usan para referirse al orden de las regiones del polipéptido, y cuando algo es carboxiterminal para una región, no está necesariamente en el extremo (o al final) de todo el polipéptido, sino justo en el término de la región o dominio.

Las expresiones "polinucleótido", "ácido nucleico", y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los siguientes son ejemplos no limitantes de polinucleótidos: un gen o fragmento génico (por ejemplo, una sonda, cebador, marcador EST o SAGE), exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, ARNbc, ARNip, miARN, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos. En caso de estar presentes, pueden impartirse modificaciones a la estructura de los nucleótidos antes o después del ensamblaje del polinucleótido. La secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleotídicos. Un polinucleótido puede modificarse adicionalmente después de la polimerización, tal como mediante conjugación con un componente de marcaje. El término también se refiere a moléculas bicatenarias y monocatenarias. A menos que se especifique o requiera lo contrario, cualquier aspecto de la presente divulgación que sea un polinucleótido abarca tanto la forma bicatenaria como cada una de las dos formas complementarias monocatenarias conocidas o previstas para formar la forma bicatenaria.

El término "sujeto", "individuo", o "paciente" se usa indistintamente en el presente documento y se refiere a un vertebrado, por ejemplo un primate, un mamífero o preferentemente un ser humano. Los mamíferos incluyen, pero sin limitación, a équidos, cánidos, bóvidos, óvidos, múridos, ratas, simios, seres humanos, animales de granja, animales de deporte y mascotas.

La expresión "sin xeno (XF, por sus siglas en inglés)" o "sin componentes animales (ACF, por sus siglas en inglés)" o "sin animales", cuando se usa en relación a un medio, una matriz extracelular, o una condición de cultivo, se refiere a un medio, una matriz extracelular, o una condición de cultivo que está esencialmente exento de componentes derivados de animales heterogéneos. Para el cultivo de células humanas, cualquier proteína de un animal no humano, tal como un ratón, serían componentes xeno. En determinados aspectos, la matriz sin xeno puede estar esencialmente sin ningún componente derivado de animales no humanos, por lo tanto, se excluyen las células alimentadoras de ratón o Matrigel™. Matrigel™ es una preparación de membrana basal solubilizada extraída del sarcoma de ratón Engelbreth-Holm-Swarm (EHS), un tumor rico en proteínas de matriz extracelular para incluir laminina (un componente principal), colágeno IV, proteoglicanos de sulfato de heparina y entactina/nidogen. En algunos aspectos, las composiciones descritas en el presente documento o las células de la divulgación se cultivan y/o preparan en/con medio sin xeno o sin componente animal o sin animal.

Las células están "sustancialmente exentas" de ciertos reactivos o elementos, tales como suero, inhibidores de la señalización, componentes animales o células alimentadoras, elementos genéticos exógenos o elementos de vector, como se usa en el presente documento, cuando tienen menos del 10 % del uno o más elementos, y están "esencialmente exentas" de ciertos reactivos o elementos cuando tienen menos del 1 % del uno o más elementos. Sin embargo, incluso más deseables son las poblaciones celulares en las que menos del 0,5 % o menos del 0,1 % de la población celular total comprende elementos genéticos exógenos o elementos de vector.

Un cultivo, matriz o medio están "esencialmente exentos" de ciertos reactivos o elementos, tales como suero, inhibidores de la señalización, componentes animales o células alimentadoras, cuando el cultivo, matriz o medio respectivamente tienen un nivel de estos reactivos inferior a un nivel detectable utilizando métodos de detección convencionales conocidos por un experto en la materia o estos agentes no se han añadido extrínsecamente al cultivo, matriz o medio. El medio sin suero puede estar esencialmente exento de suero.

Un "gen", "polinucleótido", "región codificante", "secuencia", "segmento", "fragmento", o "transgén" que "codifica" una proteína en particular, es una molécula de ácido nucleico que se transcribe y, opcionalmente, también se traduce en un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, in vitro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladores apropiadas. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, la molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria (es decir, la cadena con sentido) o bicatenaria. Los límites de la región codificante se determinan mediante un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de parada de traducción en el extremo 3' (carboxi). Un gen puede incluir, pero sin limitación, ADNc de ARNm procariota o eucariota, secuencias de ADN genómico de ADN procariota o eucariota y secuencias de ADN sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción normalmente se ubicará en 3' con respecto a la secuencia del gen.

El término "célula" se usa en el presente documento en su sentido más amplio en la técnica y se refiere a un organismo vivo que es una unidad estructural de tejido de un organismo multicelular, está rodeada por una estructura de membrana que la aísla del exterior, tiene la capacidad de autorreplicarse, y tiene información genética y un mecanismo para expresarla. Las células utilizadas en el presente documento pueden ser células naturales o células modificadas artificialmente (por ejemplo, células de fusión, células modificadas genéticamente, etc.).

Como se usa en el presente documento, la expresión "célula madre" se refiere a una célula capaz de autorreplicación y pluripotencia o multipotencia. Normalmente, las células madre pueden regenerar un tejido lesionado. Las células madre en el presente documento pueden ser, pero sin limitación, células madre embrionarias (ES, por sus siglas en inglés), células madre pluripotentes inducidas o células madre tisulares (también denominadas células madre específicas de tejido o células madre somáticas).

Las "células madre embrionarias (ES)" son células madre pluripotentes procedentes de embriones tempranos. Se estableció una célula ES por primera vez en 1981, que también se ha aplicado a la producción de ratones con supresión génica desde 1989. En 1998, se estableció una célula ES humana, que actualmente está disponible para medicina regenerativa.

A diferencia de las células ES, las células madre tisulares tienen un potencial de diferenciación limitado. Las células madre tisulares están presentes en lugares particulares de los tejidos y tienen una estructura intracelular indiferenciada. Por lo tanto, la pluripotencialidad de las células madre tisulares suele ser baja. Las células madre tisulares tienen una relación núcleo/citoplasma más alta y tienen pocos orgánulos intracelulares. La mayoría de las células madre tisulares tienen baja pluripotencialidad, un ciclo celular largo y capacidad proliferativa más allá de la vida del individuo. Las células madre tisulares se separan en categorías, en función de los sitios de los que proceden las células, tal como el sistema dérmico, el sistema digestivo, el sistema de médula ósea, el sistema nervioso, y similares. Las células madre tisulares en el sistema dérmico incluyen células madre epidérmicas, células madre de folículos pilosos, y similares. Las células madre tisulares en el sistema digestivo incluyen células madre pancreáticas (comunes), células madre hepáticas, y similares. Las células madre tisulares en el sistema de la médula ósea incluyen células madre hematopoyéticas, células madre mesenquimales, y similares. Las células madre tisulares del sistema nervioso incluyen neurocitoblastos, células madre retinianas, y similares.

"Células madre pluripotenciales inducidas", comúnmente abreviado como células iPS o iPSC (por sus siglas en inglés), se refiere a un tipo de célula madre pluripotente preparada artificialmente a partir de una célula no pluripotente, normalmente una célula somática adulta, o célula terminalmente diferenciada, tales como fibroblasto, una célula hematopoyética, un miocito, una neurona, una célula epidérmica, o similar, introduciendo ciertos factores, denominados factores de reprogramación.

"Pluripotencia" se refiere a una célula madre que tiene el potencial de diferenciarse en todas las células que constituyen uno o más tejidos u órganos, o en particular, cualquiera de las tres capas germinales: endodermo (revestimiento interior del estómago, tracto gastrointestinal, los pulmones), mesodermo (músculo, huesos, sangre, urogenital), o ectodermo (tejidos epidérmicos y sistema nervioso). Las "células madre pluripotentes" utilizadas en el presente documento se refieren a células que pueden diferenciarse en células procedentes de cualquiera de las tres capas germinales, por ejemplo, descendientes directas de células totipotentes o células pluripotentes inducidas.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "tratamiento", "que trata", y similares, se refieren a obtener un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en lo referente a prevenir completa o parcialmente una enfermedad o un síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en lo referente a una cura parcial o completa para una enfermedad y/o un efecto adverso atribuible a la enfermedad. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, por ejemplo, en un ser humano e incluye: (a) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que pueda tener predisposición a la enfermedad, pero al que aún no se le haya diagnosticado; (b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; y (c) aliviar la enfermedad, es decir, provocar la regresión de la enfermedad.

En algunos aspectos, los métodos son útiles para reducir el tamaño y/o el número de células de un tumor sólido. En algunos aspectos, el método de la divulgación es útil para inhibir el crecimiento de tumores, tales como tumores sólidos, en un sujeto.

El término "antígeno" se refiere a cualquier sustancia que hace que un sistema inmunitario produzca anticuerpos contra ella, o a la que responde un linfocito T. En algunos aspectos, un antígeno es un péptido que tiene de 5-50 aminoácidos de longitud o tiene al menos, como máximo, o exactamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 250 o 300 aminoácidos, o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, dímeros, multímeros, anticuerpos multiespecíficos y fragmentos de anticuerpos que pueden ser humanos, de ratón, humanizados, quiméricos o derivados de otra especie. Un "anticuerpo monoclonal" es un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos que se dirige contra un sitio antigénico específico.

"Anticuerpo o fragmento funcional del mismo" significa una molécula de inmunoglobulina que se une de manera específica a, o es inmunitariamente reactiva con un antígeno o epítopo en particular, e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. El término anticuerpo incluye formas de inmunoglobulinas modificadas por ingeniería genética o de otro modo, tales como intracuerpos, pepticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos completamente humanos, anticuerpos humanizados y anticuerpos heteroconjugados (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos, triacuerpos y tetracuerpos). La expresión fragmento de anticuerpo funcional incluye fragmentos de unión a antígeno de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, fragmentos Fab', F(ab')2, Fab, Fv, rlgG y scFv. El término scFv se refiere a un anticuerpo FV monocatenario en el que los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera de un anticuerpo tradicional bicatenario se han unido para formar una cadena.

El uso de un fragmento variable monocatenario (scFv) es de particular interés. Los scFv son moléculas recombinantes en las que las regiones variables de las cadenas de inmunoglobulinas ligeras y pesadas que codifican los dominios de unión a antígeno se modifican por ingeniería genética en un único polipéptido. Generalmente, las secuencias V^hy V^lestán unidas por una secuencia enlazadora. Véase, por ejemplo, Ahmad (2012) Clinical and Developmental Immunology Article ID 980250.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de un agente o a las cantidades combinadas de dos agentes, que, cuando se administra a un mamífero u otro sujeto para tratar una enfermedad, es suficiente para realizar dicho tratamiento contra la enfermedad. La "cantidad terapéuticamente eficaz" variará dependiendo de los agentes, la enfermedad y su gravedad y la edad, el peso, etc., del sujeto que se va a tratar.

Como se usa en el presente documento, en la memoria descriptiva, "un" o "uno/a" puede significar uno/a o más. Como se utiliza en el presente documento en la una o más reivindicaciones, cuando se utilizan junto con la expresión "que comprende", las palabras "un" o "uno/a" pueden significar uno/a o más de uno/a.

El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para dar a entender "y/o" a menos que se indique explícitamente para referirse únicamente a alternativas o que las alternativas sean mutuamente excluyentes, aunque la divulgación respalda una definición que se refiere únicamente a alternativas y a "y/o". Como se usa optionally whereinen el presente documento, "otro/a" puede significar al menos un/a segundo/a o más.

A lo largo de la presente solicitud, el término "aproximadamente" se usa para indicar que un valor incluye la variación de error inherente para el dispositivo, el método que se está empleando para determinar el valor, o la variación que existe entre los sujetos de estudio.

II. Polipéptidos

A. Péptidos señal

Un "péptido señal" se refiere a una secuencia peptídica que dirige el transporte y la localización de la proteína dentro de una célula, por ejemplo a un determinado orgánulo celular (tal como el retículo endoplásmico) y/o la superficie celular. Un péptido señal dirige la proteína naciente hacia el retículo endoplásmico. Esto es esencial si el receptor debe glicosilarse y anclarse en la membrana celular. Generalmente, se usa el péptido señal unido de forma natural al componente más aminoterminal (por ejemplo, en un scFv con orientación cadena ligera - enlazador - cadena pesada, se usa la señal natural de la cadena ligera). En algunos aspectos, el péptido señal es la SEQ ID NO: 18.

En algunos aspectos, el péptido señal se escinde después del paso por el retículo endoplásmico (ER, por sus siglas en inglés), es decir, es un péptido señal escindible. En algunos aspectos, un sitio de restricción está en el extremo carboxi del péptido señal para facilitar la escisión.

B. Dominio de unión a antígeno

El dominio de unión a antígeno es un fragmento variable monocatenario (scFv) basado en anticuerpos contra TGF-p. Los fragmentos de anticuerpo "Fv monocatenario" o "scFv" comprenden los dominios V^hy V^lde un anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una única cadena polipeptídica. En algunos aspectos, el dominio de unión a antígeno comprende además un enlazador peptídico entre los dominios V^hy V^l, que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno.

Las regiones variables de los dominios de unión a antígeno de los polipéptidos de la divulgación pueden modificarse mediante la mutación de restos de aminoácidos en las regiones CDR1, CDR2 y/o CDR3 de VH y/o VL, para mejorar una o más propiedades de unión (por ejemplo, afinidad) del anticuerpo. El término "CDR" se refiere a una región determinante de la complementariedad que se basa en una parte de las cadenas variables en inmunoglobulinas (anticuerpos) y receptores de linfocitos T, generados por linfocitos B y linfocitos T respectivamente, donde estas moléculas se unen a su antígeno específico. Debido a que la mayoría de las variaciones de secuencia asociadas con las inmunoglobulinas y los receptores de linfocitos T se encuentran en las CDR, estas regiones se denominan a veces regiones hipervariables. Pueden introducirse mutaciones por mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR y el efecto sobre la unión de anticuerpos u otra propiedad funcional de interés, puede evaluarse en ensayos in vitro o in vivo adecuados. Preferentemente, se introducen modificaciones conservativas y, por lo general, no se alteran más de uno, dos, tres, cuatro o cinco restos en una región CDR. Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o eliminaciones de aminoácidos.

Se pueden hacer modificaciones en el marco de los anticuerpos para disminuir la inmunogenicidad, por ejemplo, mediante la "retromutación" de uno o más restos del marco a la secuencia de la línea germinal correspondiente.

También se contempla que el dominio de unión a antígeno pueda ser multiespecífico o multivalente multimerizando el dominio de unión a antígeno con pares de regiones VH y VL que se unen al mismo antígeno (multivalente) o a un antígeno diferente (multiespecífico).

Como se usa en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a la constante de equilibrio para la unión reversible de dos agentes y se expresa como una constante de disociación (Kd). La afinidad puede ser al menos 1 vez mayor, al menos 2 veces mayor, al menos 3 veces mayor, al menos 4 veces mayor, al menos 5 veces mayor, al menos 6 veces mayor, al menos 7 veces mayor, al menos 8 veces mayor, al menos 9 veces mayor, al menos 10 veces mayor, al menos 20 veces mayor, al menos 30 veces mayor, al menos 40 veces mayor, al menos 50 veces mayor, al menos 60 veces mayor, al menos 70 veces mayor, al menos 80 veces mayor, al menos 90 veces mayor, al menos 100 veces mayor, o al menos 1000 veces mayor, o más (o cualquier intervalo que pueda derivarse de los mismos), que la afinidad de un anticuerpo por secuencias de aminoácidos no relacionadas. Como se usa en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la resistencia de un complejo de dos o más agentes a la disociación después de la dilución. Las expresiones "inmunorreactivo" y "se une preferentemente" se usan indistintamente en el presente documento con respecto a anticuerpos y/o fragmentos de unión a antígeno.

El término "unión" se refiere a una asociación directa entre dos moléculas, debido a, por ejemplo, interacciones covalentes, electrostáticas, hidrófobas e iónicas y/o de enlace de hidrógeno, incluyendo interacciones tales como puentes de sal y puentes de agua.

C. Espaciador peptídico

Una región espaciadora une el dominio de unión a antígeno con el dominio transmembrana. Debe ser lo suficientemente flexible como para permitir que el dominio de unión a antígeno se oriente en diferentes direcciones para facilitar el reconocimiento del antígeno. La forma más simple es la región bisagra de IgG. Las alternativas incluyen la región CH²CH³de inmunoglobulina y partes de CD3. En algunos aspectos, la región CH²CH³puede tener modificaciones L235E/N297Q o L235D/N297Q, o al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con respecto a la región CH²CH³. Para la mayoría de las construcciones basadas en scFv, basta la bisagra de IgG. Sin embargo, el mejor espaciador se debe determinar con frecuencia de manera empírica. En algunos aspectos, el espaciador es de IgG4.

Como se usa en el presente documento, el término "bisagra" se refiere a una región polipeptídica enlazadora flexible (también citada en el presente documento como "región bisagra" o "espaciador") que proporciona flexibilidad y espaciado estructural a regiones polipeptídicas flanqueantes y puede consistir en polipéptidos naturales o sintéticos. Una "bisagra" derivada de una inmunoglobulina (por ejemplo, IgGl) se define generalmente como la extensión de Glu216 a Pro230 de IgGl humana (Burton (1985) Molec. Immunol., 22: 161-206). Las regiones bisagra de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgGI colocando los restos de cisteína primero y último que forman enlaces disulfuro (S-S) entre cadenas pesadas en las mismas posiciones. La región bisagra puede ser de origen natural o de origen no natural, incluyendo, pero sin limitación, una región bisagra alterada como se describe en la Patente de los Estados Unidos n.° 5.677.425. La región bisagra puede incluir una región bisagra completa procedente de un anticuerpo de una clase o subclase diferente a la del dominio CH¹. El término "bisagra" también puede incluir regiones procedentes de CD8 y otros receptores que proporcionan una función similar para proporcionar flexibilidad y espaciado a las regiones flanqueantes.

El espaciador peptídico puede tener una longitud de al menos, como máximo o exactamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 201,202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 325, 350, o 400 aminoácidos (o cualquier intervalo que pueda derivarse de los mismos). En algunos aspectos, el espaciador peptídico consiste o comprende una región bisagra de una inmunoglobulina. Se conocen en la técnica secuencias de aminoácidos de regiones bisagra de inmunoglobulina; véanse, por ejemplo, Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 162; y Huck et al. (1986) Nucl. Acids Res.

La longitud de un espaciador peptídico puede tener efectos sobre la respuesta al TGF-p y/o las propiedades de expansión. En algunos aspectos, un espaciador más corto tal como de menos de 50, 45, 40, 30, 35, 30, 25, 20, 15 o 10 aminoácidos puede tener la ventaja de una disminución en la concentración de TGF-p requerida para una respuesta de activación efectiva. En algunos aspectos, un espaciador más largo, tal como uno que tenga al menos 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 260, 270, 280 o 290 aminoácidos pueden tener la ventaja de una mayor expansión in vivo o in vitro.

Como ejemplos no limitantes, una región bisagra de inmunoglobulina puede incluir una de las siguientes secuencias de aminoácidos: DKTHT (SEQ ID NO: 27); CPPC (SEQ ID NO: 28); CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO: 29); ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO:30); KSCDKTHTCP (SEQ ID NO:31); KCCVDCP (SEQ ID NO:32); KYGPPCP (SEQ ID NO:33); EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 34) (bisagra de IgGI humana); ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 35) (bisagra de IgG2 humana); ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 36) (bisagra de IgG3 humana); SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO:37); ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 98) o ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 99) (basado en bisagra de IgG4 humana) y similares. En algunos aspectos, la bisagra es la SEQ ID NO: 98 o SEQ ID NO: 99. En algunos aspectos, la bisagra es la SEQ ID NO: 99.

La región bisagra puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región bisagra de IgGI, IgG2, IgG3 o IgG4 humana. La región bisagra puede incluir una o más sustituciones y/o inserciones y/o eliminaciones de aminoácidos en comparación con una región bisagra de tipo silvestre (de origen natural). Por ejemplo, se puede sustituir la His229 de la bisagra de IgGl humana con Tyr, de tal forma que la región bisagra comprende la secuencia EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO: 38).

La región bisagra puede comprender una secuencia de aminoácidos procedente de CD8 humano; por ejemplo, la región bisagra puede comprender la secuencia de aminoácidos: TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO:39) o una variante de la misma.

D. Dominio transmembrana

El dominio transmembrana es una hélice alfa hidrófoba que se extiende por la membrana. Generalmente, se usa el dominio transmembrana del componente más proximal a la membrana del endodominio. Diferentes dominios transmembrana dan como resultado una estabilidad del receptor diferente.

El dominio transmembrana se interpone entre el espaciador peptídico y el endodominio. En algunos aspectos, el dominio transmembrana se interpone entre el espaciador peptídico y una región coestimuladora. En algunos aspectos, un enlazador está entre el dominio transmembrana y una región coestimuladora o endodominio.

Es adecuado para su uso cualquier dominio transmembrana que posibilite la inserción de un polipéptido en la membrana celular de una célula eucariota (por ejemplo, de mamífero). Como ejemplo no limitante, puede usarse la secuencia transmembrana IYIWAPLAGTc Gv LLLSLVITLYC (SEQ iD NO: 48). En algunos aspectos, el dominio transmembrana es procedente de CD8 beta: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (S^eQ ID NO: 49); procedente de CD4: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (SEQ ID NO: 50); procedente de CD3 zeta: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (SEQ ID NO: 51); procedente de CD28: WVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 52); procedente de CD134 (OX40): VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQ ID NO: 53); o procedente de CD7: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (SEQ ID NO: 54).

E. Endodominio

Después del reconocimiento del antígeno, los receptores se agrupan y se transmite una señal a la célula a través del endodominio y/o el dominio coestimulador. En algunos aspectos, los dominios coestimuladores descritos en el presente documento son parte del endodominio. El componente de endodominio más utilizado es CD3-zeta, que contiene 3 ITAM. Este transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una al antígeno. CD3-zeta puede no proporcionar una señal de activación completamente competente y es necesaria una señalización coestimuladora adicional. Por ejemplo, pueden usarse CD28 y OX40 quiméricos con CD3-Zeta para transmitir una señal proliferativa/de supervivencia, o pueden usarse los tres en conjunto.

Otros endodominios adecuados para su uso en los polipéptidos de la divulgación incluyen cualquier dominio de señalización deseado que proporcione una señal distinta y detectable (por ejemplo, aumento de la producción de una o más citocinas por parte de la célula; cambio en la transcripción de un gen diana; cambio en la actividad de una proteína; cambio en el comportamiento celular, por ejemplo, muerte celular; proliferación celular; diferenciación celular; supervivencia celular; modulación de respuestas de señalización celular; etc.) en respuesta a la activación mediante la unión del antígeno al dominio de unión a antígeno. En algunos aspectos, el endodominio incluye al menos un (por ejemplo, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, etc.) motivo ITAM como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, el endodominio incluye cadenas de señalización de tipo DAP10/CD28.

Los endodominios adecuados para su uso en los polipéptidos de la divulgación incluyen polipéptidos de señalización intracelular que contienen motivos tirosínicos de activación de receptor inmunitario (ITAM, por sus siglas en inglés). Un motivo ITAM es YX¹X²(L/I), donde X ¹y X²son independientemente cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 64). En algunos casos, el endodominio comprende 1, 2, 3, 4 o 5 motivos ITAM. En algunos casos, un motivo ITAM se repite dos veces en un endodominio, estando separados entre sí los casos primero y segundo del motivo ITAM por de 6 a 8 aminoácidos, por ejemplo, (YX¹X²(L/I))(X3)ⁿ(YX¹X²(L/I)), donde n es un número entero de 6 a 8 y cada uno de los 6-8 X³pueden ser cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 65).

Un endodominio adecuado puede ser una porción que contiene un motivo ITAM que procede de un polipéptido que contiene un motivo ITAM. Por ejemplo, un endodominio adecuado puede ser un dominio que contiene un motivo ITAm procedente de cualquier proteína que contiene motivos ITAM. Por tanto, no es necesario que un endodominio adecuado contenga la secuencia completa de la proteína completa de la que procede. Los ejemplos de polipéptidos que contienen motivos ITAM adecuados incluyen, pero sin limitación: DAP12; FCER1G (cadena gamma I del receptor Fc épsilon); CD3D (CD3 delta); CD3E (CD3 épsilon); CD3G (CD3 gamma); CD3Z (CD3 zeta); y CD79A (cadena alfa de proteína asociada a complejo de receptor de antígeno).

En algunos casos, el endodominio procede de DAP12 (también conocido como TYROBP; proteína de unión a proteína tirosina cinasa TYRO; KARAP; PLOSL; proteína 12 de activación de AX; proteína asociada a KAR; proteína de unión a proteína tirosina cinasa TYRO; proteína asociada a receptor de activación de destrucción; proteína asociada a receptor de activación de destrucción; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAE AATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 66);

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAE ATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 67);

MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETE SPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 68); o MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEATRKORITETES PYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 69).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de DAP12 de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con ESPYOELOGORSDVYSDLNTO (SEQ ID NO: 70).

En algunos aspectos, el endodominio procede de FCER1G (también conocido como FCRG; cadena gamma I del receptor Fc épsilon; cadena gamma del receptor de Fc; fc-épsilon RI-gamma; FcRgamma; FceRI gamma; subunidad gamma del receptor épsilon de inmunoglobulina de alta afinidad; receptor E de inmunoglobulina, cadena gamma de alta afinidad; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con

MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLK HEKPPQ (SEQ ID NO: 71).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de FCERIG de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con DGVYTGLSTRNOETYETLKHE (SEQ ID NO: 72).

En algunos aspectos, el endodominio procede de la cadena delta de la glucoproteína de la superficie de los linfocitos T CD3 (también conocida como CD3D; CD3-DELTA; T3D; antígeno CD3, subunidad delta; CD3 delta; antígeno CD3d, polipéptido delta (complejo TiT3); OKT3, cadena delta; cadena delta del receptor T3 de linfocitos T; cadena delta de la glucoproteína de la superficie de linfocitos T CD3; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 170 aa, de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (2 isoformas): MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKD KESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLLLALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAO YSHLGGNWARNK (SEQ ID NO: 73) o MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKD KESTVOVHYRTADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAQ YSHLGGNWARNK (SEQ ID NO: 74).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 delta de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con DOVYOPLRDRDDAOYSHLGGN (SEQ ID NO: 75).

En algunos aspectos, el endodominio procede de la cadena épsilon de la glucoproteína de superficie de los linfocitos T CD3 (también conocida como CD3e, cadena épsilon del antígeno de superficie de los linfocitos T T3/Leu-4, cadena épsilon de la glucoproteína de la superficie de linfocitos T CD3, AI504783, CD3, CD3epsilon, T3e, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 205 aa, de la siguiente secuencia de aminoácidos:

MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNI GSDEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYW

SKNRKAKAKPVTRGAGAGGRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO: 76).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 épsilon de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (SEQ ID NO: 77).

En algunos aspectos, el endodominio procede de la cadena gamma de la glicoproteína de superficie de los linfocitos T CD3 (también conocida como CD3G, cadena gamma T3 del receptor de linfocitos T, CD3-GAMMA, T3G, polipéptido gamma (complejo TiT3), etc.). Por ejemplo, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 180 aa, de la siguiente secuencia de aminoácidos:

MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSN AKDPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGODGVROSRASDKOTL LPNDOLYOPLKDREDDQ YSHLQGNQLRRN (SEQ ID NO: 78).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 gamma de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con DOLYOPLKDREDDOYSHLOGN (SEQ ID NO: 79).

En algunos aspectos, el endodominio procede de la cadena zeta de la glicoproteína de superficie de los linfocitos T CD3 (también conocida como CD3Z, cadena zeta T3 del receptor de linfocitos T, CD247, CD3-ZETA, CD3H, CD3Q, T3Z, TCRZ, etc.). Por ejemplo, un polipéptido de dominio de señalización intracelular adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 140 aa, de aproximadamente 140 aa a aproximadamente 150 aa o de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 160 aa, de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (2 isoformas): MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELO KDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 80) o MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNEL OKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR( SEQ ID NO: 81).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD3 zeta de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con cualquiera de las secuencias de aminoácidos siguientes: RVKFSRSADAPAYOQGONOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPOEGLYNELOKDKMAEAYSEIG MKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALP PR (SEQ ID NO: 82); NOLYNELNLGRREEYDVLDKR (SEQ ID NO: 83); EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (SEQ ID NO: 84); o DGLYOGLSTATKDTYDALHMO (SEQ ID NO: 85).

En algunos aspectos, el endodominio procede de CD79A (también conocido como cadena alfa de proteína asociada al complejo de receptor de antígenos de linfocitos B; antígeno CD79a (alfa asociado a inmunoglobulinas); glucoproteína de membrana MB-1; Ig-alfa; proteína asociada a inmunoglobulina unida a membrana; proteína de superficie asociada a IgM; etc.). Por ejemplo, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 100 aminoácidos a aproximadamente 110 aminoácidos (aa), de aproximadamente 110 aa a aproximadamente 115 aa, de aproximadamente 115 aa a aproximadamente 120 aa, de aproximadamente 120 aa a aproximadamente 130 aa, de aproximadamente 130 aa a aproximadamente 150 aa, de aproximadamente 150 aa a aproximadamente 200 aa o de aproximadamente 200 aa a aproximadamente 220 aa, de cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos (2 isoformas): MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGN ESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAWPGTLLLFRKRWO NEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLOGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO: 86); o MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIIL LFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYE DISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP

(SEQ ID NO: 87).

En algunos aspectos, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una porción que contiene un motivo ITAM procedente de la secuencia de aminoácidos de CD79A de longitud completa. Por tanto, un polipéptido de endodominio adecuado puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la siguiente secuencia de aminoácidos: ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (SEQ ID NO: 88).

En algunos aspectos, los endodominios adecuados pueden comprender una cadena de señalización de tipo DAP10/CD28. Un ejemplo de una cadena de señalización de DAP 10 es la secuencia de aminoácidos: RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 89). En algunos aspectos, un endodominio adecuado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de longitud completa RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 90).

Un ejemplo de una cadena de señalización de CD28 es la secuencia de aminoácidos FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 91) . En algunos aspectos, un endodominio adecuado comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de longitud completa FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 92) .

Otros endodominios adecuados para su uso en los polipéptidos de la divulgación incluyen un polipéptido ZAP70, por ejemplo, un polipéptido incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 %, al menos un 99 %, o un 100 %, de identidad de secuencia de aminoácidos con una serie contigua de aproximadamente 300 aminoácidos a aproximadamente 400 aminoácidos, de aproximadamente 400 aminoácidos a aproximadamente 500 aminoácidos o de aproximadamente 500 aminoácidos a 619 aminoácidos, de la siguiente secuencia de aminoácidos: MPDPAAHLPFFYGSIS RAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAG GKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQ TWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGK FLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKA DGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSP DKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRM RKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVME MAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLV NRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYG VTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWE DRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA (SEQ ID NO: 93).

F. Péptidos de detección

Los péptidos de detección adecuados incluyen hemaglutinina (HA; por ejemplo, YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 94); FLAG (por ejemplo, DYKDDDDK (SEQ ID NO: 17); c-myc (por ejemplo, EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 95) y similares. En la técnica se conocen otros péptidos de detección adecuados.

G. Enlazadores peptídicos

En algunos aspectos, los polipéptidos de la divulgación incluyen enlazadores peptídicos (a veces denominados enlazadores). Un enlazador peptídico puede estar separando cualquiera de las regiones/dominios peptídicos descritos en el presente documento. A modo de ejemplo, un enlazador puede estar entre el péptido señal y el dominio de unión a antígeno, entre la VH y VL del dominio de unión a antígeno, entre el dominio de unión a antígeno y el espaciador peptídico, entre el espaciador peptídico y el dominio transmembrana, flanqueando la región coestimuladora o en la región N o C de la región coestimuladora, y/o entre el dominio transmembrana y el endodominio. El enlazador peptídico puede tener cualquiera de una diversidad de secuencias de aminoácidos. Los dominios y las regiones se pueden unir mediante un enlazador peptídico que generalmente es de naturaleza flexible, aunque no se excluyen otros enlaces químicos. Un enlazador puede ser un péptido de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 40 aminoácidos de longitud o de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 25 aminoácidos de longitud. Estos enlazadores pueden producirse usando oligonucleótidos sintéticos que codifican los enlazadores para acoplar las proteínas.

Pueden usarse enlazadores peptídicos con cierto grado de flexibilidad. Los enlazadores peptídicos pueden tener prácticamente cualquier secuencia de aminoácidos, teniendo en cuenta que los enlazadores peptídicos adecuados tendrán una secuencia que dé como resultado un péptido generalmente flexible. El uso de aminoácidos pequeños, tales como glicina y alanina, es útil para crear un péptido flexible. La creación de dichas secuencias es habitual para los expertos en la materia.

Los enlazadores adecuados pueden seleccionarse fácilmente y pueden tener una longitud cualquiera que sea adecuada, tal como de 1 aminoácido (por ejemplo, Gly) a 20 aminoácidos, de 2 aminoácidos a 15 aminoácidos, de 3 aminoácidos a 12 aminoácidos, incluyendo de 4 aminoácidos a 10 aminoácidos, de 5 aminoácidos a 9 aminoácidos, 6 aminoácidos a 8 aminoácidos, o 7 aminoácidos a 8 aminoácidos, y pueden tener 1,2, 3, 4, 5, 6 o 7 aminoácidos.

Los enlazadores peptídicos ilustrativos incluyen polímeros de glicina (G)ⁿ, polímeros de glicina-serina (incluyendo, por ejemplo, (GS)n, (GSGGS)ⁿ(SEQ ID NO: 40) y (GGGS)ⁿ(SEQ ID NO: 41), siendo n un número entero de al menos uno), polímeros de glicina-alanina, polímeros de alanina-serina y otros enlazadores flexibles conocidos en la técnica. Pueden usarse polímeros de glicina y de glicina-serina; tanto Gly como Ser están relativamente desestructuradas y, por lo tanto, pueden servir como anclaje neutro entre componentes. Pueden usarse polímeros de glicina; la glicina tiene acceso a un espacio phi-psi significativamente mayor incluso que la alanina y está menos restringida que los restos con cadenas laterales más largas. Los espaciadores ilustrativos pueden comprender secuencias de aminoácidos que incluyen, pero sin limitación, GGSG (SEQ ID NO: 42), GGSGG (SEQ ID NO: 43), GSGSG (SEQ ID NO: 44), GSGGG (SEQ ID NO: 45), GGGSG (SEQ ID NO: 46), GSSSG (SEQ ID NO: 47) y similares.

H. Región coestimuladora

Los ejemplos no limitantes de regiones coestimuladoras adecuadas incluyen, pero sin limitación, polipéptidos de 4-1BB (CD137), CD28, ICOS, OX-40, BTLA, CD27, CD30, GITR y HVEM.

Una región coestimuladora puede tener una longitud de al menos, como máximo, o exactamente 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o 300 aminoácidos o cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos.

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana 4-1BB (también conocida como TNFRSF9; CD137; 4-1BB; CDwl37; ILA, etc.). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 55).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana CD28 (también conocida como Tp44). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 56).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana ICOS (también conocida como AILIM, CD278 y CVID1). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO: 57).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana OX-40 (también conocida como TNFRSF4, RP5-902P8.3, ACT35, CD134, OX40, TXGP1L). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 58).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana BTLA (también conocida como BTLA1 y CD272). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con

CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLE

ENKPGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 59).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana CD27 (también conocida como S 152, T14, TNFRSF7 y Tp55). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO: 60).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana CD30 (también conocida como TNFRSF8, D1S166E y Ki-1). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con

RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLES LPLQDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPH YPEQETEPPLGSCSDVMLSVEE EGKEDPLPTAASGK (SEQ ID NO: 61).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana GITR (también conocida como TNFRSF18 y RP5-902P8.2, AITR, CD357 y GITR-D). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO: 62).

En algunos aspectos, la región coestimuladora procede de una porción intracelular de la proteína transmembrana HVEM (también conocida como TNFRSF14 y RP3-395M20.6, ATAR, CD270, HVEA, HVEM, LIGHTR y TR2). Por ejemplo, una región coestimuladora adecuada puede comprender una secuencia de aminoácidos que tenga al menos un 75 %, al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o un 100 % de identidad de secuencia de aminoácidos con

CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSP NH (SEQ ID NO: 63).

I. Modificaciones Adicionales

Adicionalmente, los polipéptidos de la divulgación pueden modificarse químicamente. La glucosilación de los polipéptidos puede alterarse, por ejemplo, modificando uno o más sitios de glucosilación dentro de la secuencia polipeptídica para aumentar la afinidad del polipéptido por el antígeno (Patentes de los Estados Unidos N.° 5.714.350 y 6.350.861).

Los polipéptidos de la divulgación se pueden pegilar para aumentar la semivida biológica al hacer reaccionar el polipéptido con polietilenglicol (PEG) o un éster reactivo o un derivado aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al polipéptido. La pegilación del polipéptido se puede llevar a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero reactivo análogo soluble en agua). Como se usa en el presente documento, el término "polietilenglicol" pretende incluir cualquiera de las formas de PEG que se han usado para derivatizar otras proteínas, tales como mono (C1-C10) alcoxi o ariloxipolietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y se pueden aplicar a los polipéptidos de la divulgación (documentos EP 0154316 y EP 0401 384).

Adicionalmente, los polipéptidos pueden modificarse químicamente conjugando o fusionando el polipéptido a proteína sérica, tal como seroalbúmina humana, para aumentar la semivida de la molécula resultante. Este enfoque se describe, por ejemplo, en los documentos EP 0322094 y EP 0486525.

Los polipéptidos de la divulgación pueden conjugarse con un agente de diagnóstico o terapéutico y usarse para diagnóstico, por ejemplo, para monitorizar la aparición o progresión de una enfermedad y determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Los polipéptidos también pueden conjugarse con un agente terapéutico para proporcionar una terapia en combinación con el efecto inmunoestimulador del polipéptido. Los ejemplos de agentes de diagnóstico incluyen enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones e iones metálicos paramagnéticos no radiactivos. La sustancia detectable puede acoplarse o conjugarse ya sea de manera al polipéptido o de manera indirecta, a través de un enlazador utilizando técnicas conocidas en la técnica. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, betagalactosidasa o acetilcolinesterasa. Los ejemplos de complejos con grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina. Los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina. Un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol. Los ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina y aecuorina. Los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen .sup.125I, .sup.131I, Indio-111, Lutecio-171, Bismuto-212, Bismuto-213, Astatina-211, Cobre-62, Cobre-64, Cobre-67, Itrio-90, Yodo-125, Yodo-131, Fósforo-32, Fósforo-33, Escandio-47, Plata-111, Galio-67, Praseodimio-142, Samario-153, Terbio-161, Disprosio-166, Holmio-166, Renio-186, Itenio-188, Renio-189, Plomo-212, Radio-223, Actinio-225, Hierro-59, Selenio-75, Arsénico-77, Estroncio-89, Molibdeno-99, Rodio-1105, Paladio-109, Praseodimio-143, Prometio-149, Erbio-169, Iridio-194, Oro-198, Oro-199 y Plomo-211. Los agentes quelantes pueden unirse a través de fracciones (Meares et al., 1984 Anal. Biochem. 142: 68-78); grupos sulfhidrilo (Koyama 1994 Chem. Abstr. 120: 217262t) de restos de aminoácidos y grupos de carbohidratos (Rodwell et al. 1986 PNAS USA 83: 2632-2636; Quadri et al. 1993 Nucl. Med. Biol. 20: 559-570).

Los polipéptidos también pueden conjugarse con un agente terapéutico para proporcionar una terapia en combinación con el efecto inmunoestimulador del polipéptido.

Las moléculas conjugadas adecuadas adicionales incluyen ribonucleasa (RNasa), DNasa I, un ácido nucleico antisentido, una molécula inhibidora de ARN tal como una molécula de ARNip, un ácido nucleico inmunoestimulador, aptámeros, ribozimas, moléculas formadoras de triple hélice y secuencias guía externas. Los aptámeros son pequeños ácidos nucleicos que varían de 15-50 bases de longitud que se pliegan en estructuras secundarias y terciarias definidas, tal como bucles fuertes o cuartetos G, y pueden unir moléculas pequeñas, tales como ATP (patente de los Estados Unidos n.° 5.631.146) y teofilina (patente de los Estados Unidos n.° 5.580.737), así como moléculas grandes, tales como transcriptasa inversa (patente de los Estados Unidos n.° 5.786.462) y trombina (patente de los Estados Unidos n.° 5.543.293). Las ribozimas son moléculas de ácido nucleico capaces de catalizar una reacción química, ya sea intramolecular o intermolecularmente. Las ribozimas suelen escindir los sustratos de ácido nucleico mediante el reconocimiento y la unión del sustrato diana con la subsiguiente escisión. Las moléculas de ácido nucleico con función de formación de triples hélices pueden interactuar con ácidos nucleicos de doble cadena o de cadena sencilla formando una triple hélice, en la que tres hebras de ADN forman un complejo que depende del apareamiento de bases tanto de Watson-Crick como de Hoogsteen. Las moléculas de triple hélice pueden unirse a regiones diana con alta afinidad y especificidad.

Las moléculas de ácido nucleico funcional pueden actuar como efectores, inhibidores, moduladores y estimuladores de una actividad específica que posea una molécula diana, o las moléculas de ácido nucleico funcionales pueden poseer una actividad de novo independiente de cualquier otra molécula.

J. Receptores de antígeno quiméricos específicos de cáncer

En algunos aspectos, las células pueden comprender además un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de cáncer. La expresión "específico de cáncer" en el contexto de los CAR se refiere a los CAR que tienen una especificidad de unión a antígeno para una molécula específica de cáncer, tal como un antígeno específico de cáncer.

En algunos aspectos, el CAR específico de cáncer está en una célula con un TGF-p CAR. En algunos aspectos, los CAR y TGF-p específicos de cáncer están en polipéptidos separados. En algunos aspectos, el CAR es un CAR biespecífico que se une al antígeno para una molécula específica del cáncer y para el TGF-p. Por ejemplo, un CAR biespecífico puede tener un péptido de señalización, un scFv específico de una molécula de cáncer, opcionalmente un enlazador/espaciador peptídico, seguido de un scFv contra TGF-p, seguido de un espaciador, un dominio transmembrana y un dominio coestimulador. En algunos aspectos, el CAR biespecífico comprende uno o más segmentos peptídicos adicionales descritos en el presente documento.

En algunos aspectos, los polipéptidos de la divulgación pueden comprender un scFv contra CD20. Un scFv contra CD20 ilustrativo comprende lo siguiente:

DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTIS

RVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGGGSGGGSGGGGSSEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCK ASGYTFTSYNMHVWKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCA RSNYY GSSYWFFDVWGAGTTVTVSS (SEQ ID NO: 100).

En algunos aspectos, los polipéptidos de la divulgación pueden comprender un scFv contra CD19. Un scFv contra CD19 ilustrativo comprende lo siguiente:

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTIS

NLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSG VSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYG GSYA MD YWGQGTSVTVSS (SEQ ID NO: 101)

Otras moléculas específicas de cáncer (además de CD19 y CD20) pueden incluir CAIX, CD33, CD44v7/8, CEA, EGP-2, EGP-40, erb-B2, erb-B3, erb-B4, FBp, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, Her2/neu, IL-13R-a2, KDR, cadena ligera k, LeY, molécula de adhesión de células L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, ligandos de NKG2D, antígeno oncofetal (h5T4), PSCA, PSMA, TAA dirigido por mAb IgE, TAG-72 y VEGF-R2. En algunos aspectos, la molécula específica de cáncer comprende Her2.

III. Células

Ciertos aspectos se refieren a células que comprenden polipéptidos o ácidos nucleicos de la divulgación. En algunos aspectos, la célula es una célula inmunitaria o un linfocito T. "Linfocito T" incluye todos los tipos de células inmunitarias que expresan CD3, incluyendo linfocitos T auxiliares (células CD4+), linfocitos T citotóxicos (células CD8+), linfocitos T reguladores (Treg) y linfocitos T gamma-delta. Una "célula citotóxica" incluye linfocitos T CD8+, linfocitos citolíticos naturales (NK) y neutrófilos, siendo capaces estas células de mediar respuestas de citotoxicidad.

Las células de mamífero adecuadas incluyen células primarias y líneas celulares inmortalizadas. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen líneas celulares humanas, líneas celulares de primate no humano, líneas celulares de roedor (por ejemplo, ratón, rata) y similares. Las líneas celulares de mamífero adecuadas incluyen, pero sin limitación, células HeLa (por ejemplo, American Type Culture Collection (ATCC) N.° CCL-2), células CHO (por ejemplo, ATCC n.° CRL9618, CCL61, CRL9096), células 293 de riñón embrionario humano (HEK) (por ejemplo, At Cc N° CRL-1573), células Vero, células NIH 3T3 (por ejemplo, ATCC N.° CRL-1658), células Huh-7, células BHK (por ejemplo, ATCC N.° CCL10), células PC12 (ATCC N.° CRL1721), células COS, células COS-7 (ATCC N.° CRL1651), células RATI, células L de ratón (ATCC N° CCLI.3), células HLHepG2, Hut-78, Jurkat, HL-60, líneas de células NK (por ejemplo, NKL, NK92 e Yt S) y similares.

En algunos casos, la célula no es una línea celular inmortalizada, sino que es una célula (por ejemplo, una célula primaria) obtenida de un individuo. Por ejemplo, en algunos casos, la célula es una célula inmunitaria obtenida de un individuo. A modo de ejemplo, la célula es un linfocito T obtenido de un individuo. Como otro ejemplo, la célula es una célula citotóxica obtenida de un individuo. Como otro ejemplo, la célula es una célula madre o una célula progenitora obtenida de un individuo.

IV. MÉTODOS

Los aspectos de la divulgación actual se refieren a métodos para estimular una respuesta inmunitaria. La estimulación de la respuesta inmunitaria puede realizarse in vitro, in vivo, o ex vivo. En algunos aspectos, los métodos se refieren a células capaces de estimular una respuesta inmunitaria en presencia de TGF-p. El método implica generalmente modificar genéticamente una célula de mamífero con un vector de expresión o un ARN (por ejemplo, ARN transcrito in vitro), que comprende secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de la divulgación o que transfieren directamente el polipéptido a la célula. La célula puede ser una célula inmunitaria (por ejemplo, un linfocito T o una célula NK), una célula madre, una célula progenitora, etc. En algunos aspectos, la célula es una célula descrita en el presente documento.

En algunos aspectos, la modificación genética se lleva a cabo ex vivo. Por ejemplo, se obtiene un linfocito T, una célula madre o una célula NK ( o célula descrita ene l presente documento) de un individuo; y la célula obtenida del individuo se modifica genéticamente para expresar un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, la célula modificada genéticamente se activa ex vivo (es decir, el TGF-p se pone en contacto con las células ex vivo). En otros casos, la célula modificada genéticamente se introduce en un individuo (por ejemplo, el individuo del que se obtuvo la célula); y la célula modificada genéticamente se activa in vivo (es decir, por TGF-p producido endógenamente).

En algunos aspectos, los métodos comprenden adicionalmente la administración de agentes terapéuticos adicionales, tales como acopladores biespecíficos de linfocitos T (BITE, por sus siglas en inglés). Dichos agentes terapéuticos pueden administrarse en forma de péptido al paciente o expresarse en células de la divulgación, tal como las que comprenden el TGF-p CAR. El BITE puede tener especificidad de antígeno para un antígeno de cáncer/molécula de cáncer conocidos en la técnica y/o descritos en el presente documento y también puede tener especificidad de antígeno para una molécula de linfocitos T tal como CD3.

En algunos aspectos, los métodos se refieren a la administración de las células o péptidos descritos en el presente documento para el tratamiento de un cáncer o la administración a una persona con cáncer. En algunos aspectos, el cáncer es cáncer suprarrenal, cáncer anal, cáncer del conducto biliar, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, tumores cerebrales/del SNC en niños o adultos, cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, cáncer de colon/recto, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, cáncer ocular, cáncer de vesícula biliar, tumores carcinoides gastrointestinales, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), enfermedad trofoblástica gestacional, enfermedad de Hodgkin, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer de laringe e hipofaringe, leucemia, leucemia linfocítica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mieloide crónica, leucemia mielomonocítica crónica, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, tumor carcinoide pulmonar, linfoma, mesotelioma maligno, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma no de Hodgkin, cáncer de la cavidad oral u orofaríngeo, osteosarcoma, cáncer de ovario, cáncer de páncreas, cáncer de pene, tumores de hipófisis, cáncer de próstata, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de las glándulas salivales, cáncer de piel, sarcoma, cáncer de piel basal, cáncer de piel de células escamosas, melanoma, cáncer de piel de células de Merkel, cáncer del intestino delgado, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de timo, cáncer de tiroides, sarcoma uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom o tumor de Wilms.

Los aspectos se pueden usar para tratar o mejorar una serie de enfermedades inmunomediadas, inflamatorias o autoinmunitarias-inflamatorias, por ejemplo, alergias, asma, diabetes (por ejemplo, diabetes de tipo 1), rechazo de injerto, etc. Los ejemplos de tales enfermedades o trastornos también incluyen, pero sin limitación, artritis (artritis reumatoide, tal como artritis aguda, artritis reumatoide crónica, gota o artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inmunitaria aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis inducida por colágeno de tipo II, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriásica, enfermedad de Still, artritis vertebral, y artritis reumatoide sistémica de inicio juvenil, artrosis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, y espondilitis anquilosante), enfermedades cutáneas inflamatorias hiperproliferativas, psoriasis tales como psoriasis en placas, psoriasis en gota, psoriasis pustular, y psoriasis de las uñas, atopía, incluidas las enfermedades atópicas tales como la fiebre del heno y el síndrome de Job, dermatitis incluyendo dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis exfoliativa, dermatitis alérgica, dermatitis alérgica de contacto, dermatitis herpetiforme, dermatitis numular, dermatitis seborreica, dermatitis no específica, dermatitis de contacto irritante primaria, y dermatitis atópica, síndrome de hiper IgM vinculado a X, enfermedades inflamatorias intraoculares alérgicas, urticaria tal como urticaria alérgica crónica y urticaria idiopática crónica, incluyendo urticaria crónica autoinmunitaria, miositis, polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis epidérmica tóxica, escleroderma (incluyendo escleroderma sistémico), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (EM) tal como la EM espinodorsal, EM primaria progresiva (EMPP), y EM en remisión con recaída (EMRR), esclerodermia generalizada, ateroesclerosis, arteriesclerosis, esclerosis diseminada, esclerosis atáxica, neuromielitis óptica (NMO), enteropatía inflamatoria (EII) (por ejemplo, enfermedades gastrointestinales mediadas de forma autoinmunitaria, colitis tal como colitis con úlceras, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrosante, y colitis transmural, enteropatía inflamatoria autoinmunitaria), inflamación del intestino, pioderma gangrenoso, eritema nodular, colangitis esclerosante primaria, síndrome de dificultad respiratoria, incluido el síndrome de estrés respiratorio en el adulto o agudo (SDRA), meningitis, inflamación de toda o parte de la úvea, iritis, coroiditis, un trastorno hematológico autoinmunitario, espondilitis reumatoide, sinovitis reumatoide, angioedema hereditario, lesión de los nervios craneales, como en la meningitis, herpes gestacional, penfigoide gestacional, prurito del escroto, insuficiencia ovárica prematura autoinmunitaria, pérdida súbita de la audición debida a una dolencia autoinmunitaria, enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y rinitis atópica, encefalitis tal como encefalitis de Rasmussen y la encefalitis líbica o del pedúnculo cerebral, uveítis, tal como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior o uveítis autoinmunitaria, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda tal como GN primaria, GN inmunomediada, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membranoproliferativa o proliferativa membranosa (MPGn ), incluidos el Tipo I y el Tipo II, y la Gn rápidamente progresiva, nefritis proliferativa, insuficiencia endocrina poliglandular autoinmunitaria, balanitis incluida balanitis plasmacelular circunscrita, balanopostitis, eritema anular centrífugo, eritema discrómico persistente, eritema multiforme, granuloma anular, liquen nítido, liquen esclerósico y atrófico, liquen simple crónico, liquen espinoso, liquen plano, ictiosis laminar, hiperqueratosis epidermolítica, queratosis premaligna, pioderma gangrenoso, dolencias y respuestas alérgicas, reacción alérgica, eczema incluido el eczema alérgico o atópico, eczema esteatótico, eczema dishidrótico, y eczema vesicular palmoplantar, asma tal como asma bronquial, asma bronquial, y asma autoinmunitario, afecciones que implican la infiltración de linfocitos T y respuestas inflamatorias crónicas, reacciones inmunitarias contra antígenos extraños tales como los grupos sanguíneos fetales A-B-O durante el embarazo, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmunitaria, deficiencia de adhesión de leucocitos, lupus, incluida nefritis lúpica, cerebritis lúpica, lupus pediátrico, lupus no renal, lupus extrarrenal, lupus discoide y lupus eritematoso discoide, lupus con alopecia, lupus eritematoso sistémico (LES) tal como LES cutáneo o LES cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (SLN), y lupus eritematoso diseminado, diabetes mellitus de inicio juvenil (Tipo I), incluida la diabetes mellitus insulinodependiente pediátrica (DMID) y la diabetes mellitus del adulto (diabetes de tipo II) y la diabetes autoinmunitaria. También se contemplan respuestas inmunitarias asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y linfocitos T, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis, vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de células gigantes (de Takayasu)), vasculitis de los vasos intermedios (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nodosa/periarteritis nodosa), poliarteritis microscópica, inmunovasculitis, vasculitis del SNC, vasculitis cutánea, vasculitis por hipersensibilidad, vasculitis necrosante tal como vasculitis necrosante sistémica, y la vasculitis relacionada con ANCA, tal como la vasculitis o síndrome de Churg-Strauss (SCS) y vasculitis de vasos pequeños relacionada con ANCA, arteritis de células gigantes, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmunitaria, anemia positiva de Coombs, anemia de Blackfan-Diamond, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmunitaria que incluye anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI), enfermedad de Addison, neutropenia autoinmunitaria, pancitopenia, leucopenia, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, trastornos inflamatorios del SNC, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, síndrome de lesión multiorgánica tal como la secundaria a septicemia, traumatismo o hemorragia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, neuritis alérgica, enfermedad/síndrome de Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Raynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide, tal como penfigoide ampolloso y penfigoide cutáneo, pénfigo (incluidos pénfigo vulgar, pénfigo filiar, pénfigo mucoso-penfigoide de la membrana, y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunitarias, enfermedad o síndrome de Reiter, lesión térmica, preeclampsia, un trastorno del complejo inmunitario tal como nefritis del complejo inmunitario, nefritis mediada por anticuerpos, polineuropatías, neuropatía crónica tales como neuropatías de IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia autoinmunitaria o mediada por el sistema inmunitario, tal como púrpura trombocitopénica idiopática (PTI), incluyendo PTI crónica o aguda, escleritis tal como ceratoescleritis idiopática, episcleritis, enfermedad autoinmunitaria del testículo y ovario incluyendo orquitis y ooforitis autoinmunitaria, hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunitarias incluyendo tiroiditis tal como tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (tiroiditis de Hashimoto), o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Grave, síndromes poliglandulares tales como síndromes poliglandulares autoinmunitarios (o síndromes poliglandulares endocrinopáticos), síndromes paraneoplásicos, incluyendo síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como el síndrome miasténico de Lambert-Eaton el síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o de la persona rígida, encefalomielitis tales como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), encefalomielitis autoinmunitaria experimental, miastenia grave, tal como miastenia grave asociada con tioma, degeneración cerebelar, neuromiotonía, opsoclono o síndrome opsoclono mioclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica o hepatitis activa crónica autoinmunitaria, neumonitis intersticial linfoide (LIP), bronquiolitis obliterante (sin trasplante) frente a NSIP, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía por IgA idiopática, dermatosis por IgA lineal, dermatosis neutrofílica febril aguda, dermatosis pustular subcorneal, dermatitis acantolítica transitoria, cirrosis tal como cirrosis biliar primaria y pneumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmunitaria, enfermedad celiaca o celiaquía, celiaquía (enteropatía por gluten), esprúe resistente al tratamiento, esprúe idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiotrófica (ELA; enfermedad de Lou Gehrig), arteriopatía coronaria, enfermedad auditiva autoinmunitaria, tal como la enfermedad del oído interno autoinmunitaria (AIED), pérdida de la audición autoinmunitaria, policondritis tal como policondritis resistente al tratamiento, con recaídas o recidiva, proteinosis pulmonar alveolar, síndrome de Cogan/queratitis intersticial no sifilítica, parálisis de Bell, enfermedad/síndrome de Sweet, rosacea autoinmunitaria, dolor asociado con zóster, amiloidosis, linfocitosis no cancerosa, linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis de linfocitos B monoclonales (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significación indeterminada, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canelopatías tales como epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del SNC, autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal o segmentaria o glomeruloesclerosis focal segmentaria (GEFS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, corioretinitis, trastorno hepatológico autoinmunitario, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como las enfermedades desmielinizantes autoinmunitarias y la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, síndrome de Dressler, alopecia areata, alopecia total, síndrome CREST (calcinosis, fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodáctilo) y telangiectasia), infertilidad autoinmunitaria masculina y femenina, por ejemplo, debida a anticuerpos contra espermatozoides, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome posterior a cardiotomía, síndrome de Cushing, neumopatía de los avicultores, angiitis granulomatosa alérgica, angiitis linfocítica benigna, síndrome de Alport, alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a transfusiones, lepra, paludismo, enfermedades parasitarias tal como leishmaniasis, quipanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevado persistente, eritroblastosis fetal, fascitis eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis tal como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónica, iridociclitis (aguda o crónica), o ciclitis de Fuch, púrpura de Henoch-Schonlein, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), IDCG, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), infección por ecovirus, septicemia, endotoxemia, pancreatitis, tiroxicosis, infección por parvovirus, infección por el virus de la rubeola, síndromes posteriores a la vacunación, infección por rubeola congénita, infección por el virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia gonadal autoinmunitaria, corea de Sydenham, nefritis postestreptocócica, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsal, corioiditis, polimialgia de linfocitos T gigantes, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambio mínimo, lesión isquémica familiar benigna y por reperfusión, reperfusión de órgano trasplantado, autoinmunidad retiniana, inflamación de las articulaciones, bronquitis, enfermedad pulmonar/de las vías respiratorias obstructiva crónica, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioescleróticos, asperniogenesis, hemolisis autoinmunitaria, enfermedad de Boek, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren, endoftalmia facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nodular leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de Hamman-Rich, pérdida de la audición sensoneural, hemoglobinuria paroxísmica, hipogonadismo, ileítis regional, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversal, mixedema idiopático primario, nefrosis, oftalmia simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, timoma no maligno, vitíligo, síndrome de choque tóxico, intoxicación alimentaria, dolencias que implican la infiltración de linfocitos T, deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunitarias asociadas con una hipersensibilidad aguda y retrasada mediada por citocinas y linfocitos T, enfermedades que implican diapédesis leucocitaria, síndrome de lesión multiorgánica, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunitarias, ooforitis, mixedema primario, gastritis atrófica autoinmunitaria, oftalmia simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, síndrome poliglandular autoinmunitario de tipo I, hipoparatiroidismo idiopático de inicio en el adulto (AOIH), miocardiopatía tal como la miocardiopatía dilatada, epidermolisis ampollosa adquirida (EAA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, etmoides, sinusitis frontal, maxilar o esfenoide, y trastorno relacionado con eosinófilos tal como eosinofilia, infiltración pulmonar de eosinófilos, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinófila crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiloma, o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxia, espondiloartritis seronegativa, enfermedad autoinmunitaria poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerótica, epiesclerótica, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, síndrome de ataxia telangiectasia, angiectasia, trastornos autoinmunitarios relacionados con enfermedades del colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, linfoadenitis, reducción en la respuesta de la tensión arterial, disfunción vascular, lesión tisular, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia renal, isquemia cerebral, y enfermedades que acompañan la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, diversas glomerulonefritis, lesión por reperfusión, trastorno de reperfusión isquémica, lesión del miocardio o de otros tejidos por reperfusión, traqueobronquitis linfomatosa, dermatosis inflamatoria, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, fallo multiorgánico, enfermedades ampollosas, necrosis de la corteza renal, meningitis purulenta aguda u otros trastornos inflamatorios del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios oculares y orbitales, síndromes asociados a transfusión de granulocitos, toxicidad inducida por citocinas, narcolepsia, inflamación grave aguda, inflamación crónica intratable, pielitis, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulitis, enfermedad de injerto contra hospedador, hipersensibilidad por contacto, hiperreacción asmática de las vías respiratorias y endometriosis.

V. Composiciones farmacéuticas

La presente divulgación incluye métodos para modular las respuestas inmunitarias en un sujeto que lo necesite. La divulgación incluye células que pueden estar en forma de una composición farmacéutica que puede usarse para inducir o modificar una respuesta inmunitaria.

La administración de las composiciones según la divulgación actual se realizará normalmente a través de cualquier vía común. Esto incluye, pero sin limitación, inyección parenteral ortotópica, intradérmica, subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intranasal o intravenosa.

Normalmente, las composiciones de la divulgación se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea terapéuticamente eficaz y modificadora del sistema inmunitario. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar. Las cantidades exactas de principio activo requeridas para su administración dependen del criterio del facultativo.

La forma de aplicación puede variar ampliamente. Son aplicables cualquiera de los métodos convencionales para la administración de composiciones farmacéuticas que comprenden componentes celulares. La dosificación de la composición farmacéutica dependerá de la vía de administración y variará según el tamaño y la salud del sujeto.

En muchos casos, será deseable tener administraciones múltiples de como máximo aproximadamente o al menos aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Las administraciones pueden oscilar entre intervalos de 2 días a 12 semanas, más generalmente de intervalos de una a dos semanas. El curso de las administraciones puede seguirse mediante ensayos de respuestas inmunitarias alorreactivas y actividad de linfocitos T.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" o "farmacológicamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y a composiciones que no producen una reacción adversa, alérgica o de otro tipo, cuando se administran a un animal o a un ser humano. Como se usa en el presente documento, un "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos de disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares. En la técnica se conoce bien el uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con los principios activos, se contempla su uso en composiciones inmunogénicas y terapéuticas. Las composiciones farmacéuticas de la divulgación actual son composiciones farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones de la divulgación pueden formularse para administración parenteral, por ejemplo, formularse para inyección por vías intravenosa, intramuscular, subcutánea o incluso intraperitoneal. Normalmente, dichas composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea en forma de soluciones o suspensiones líquidas; también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para su uso en la preparación de soluciones o suspensiones tras la adición de un líquido antes de la inyección; y, las preparaciones también pueden emulsionarse.

Las formas farmacéuticas adecuadas para su uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles; formulaciones que incluyen aceite de sésamo, aceite de cacahuete o propilenglicol acuoso. También debería ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe protegerse frente a la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.

Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando los principios activos (es decir, las células de la divulgación) en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con varios de los diferentes ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diversos principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente.

La cantidad eficaz de una composición se determina en función del objetivo previsto. La expresión "dosis unitaria" o "dosificación" se refiere a unidades físicamente separadas que son adecuadas para su uso en un sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de la composición calculada para producir las respuestas deseadas analizadas en el presente documento en asociación con su administración, es decir, la vía y el régimen adecuados. La cantidad a administrar, tanto según el número de tratamientos como de la dosis unitaria, depende del resultado y/o protección deseada. Las cantidades exactas de la composición también dependen del criterio del facultativo y son peculiares para cada individuo. Los factores que influyen en la dosis incluyen el estado físico y clínico del sujeto, la vía de administración, el objetivo del tratamiento previsto (alivio de los síntomas o curación) y de la fuerza, estabilidad y toxicidad de la composición particular. Tras la formulación, las soluciones se administrarán de una manera compatible con la formulación farmacéutica y en una cantidad tal que sea terapéutica o profilácticamente eficaz. Las formulaciones se administran fácilmente en una diversidad de formas farmacéuticas, tales como el tipo de soluciones inyectables descritas anteriormente.

VI. Secuencias

Los dominios de unión a antígeno de la divulgación incluyen las siguientes regiones VH (variable pesada) y VL (variable ligera):

VH de scFv n.°1:

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYAFTNYLIEWVRQAPGKGLEWVGVINPGSGGSNYNEKFKGRATISADN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARSGGFYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPS (SEQ ID NO: 1)

VL de scFv n.°1:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVLYSSNQKNYLAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRESGVPSRFSGSGSG TDFTLTISSLQPEDFATYYCHQYLSSDTFGQGTKVEIKRTVA (SEQIDNO: 2)

VH de scFv n.° 2:

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSNVISWVRQAPGQGLEWMGGVIPIVDIANYAQRFKGRVTITADES TSTTYMELSSLRSEDTAVYYCALPRAFVLDAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 3)

VL de scFv n.° 2:

ETVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSLGSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRAPGIPDRFSGSGSGTDFTLTI SRLEPEDFAVYYCQQYADSPITFGQGTRLEIK (SEQ ID NO: 4)

VH de scFv n.° 3:

EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKELEWVAVISYDGSnCYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTGEYSGYDTDPQYSWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 19)

VL de scFv n.° 3:

EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQGIGDDLGWYQQKPGKAPILLIYGTSTLQSGVP SRFSGSGSGTDFTLTINSLQPEDFATYYCLQDSNYPLTFGGGTRLEIK (SEQ ID NO: 20)

Las CDR correspondientes de las regiones VH y VL de scFv n.° 1 son las siguientes secuencias de aminoácidos HCDR1 de scFv n.° 1: GYAFTNYLIE (SEQ ID NO: 5); HCDR2 de scFv n.° 1: VINPGSGGSNYNEKFKG (SEQ ID NO 6); HCDR3 de scFv n.° 1: SGGFYFDY (SEQ ID NO: 7); LCDR1 de scFv n.° 1: RASQSVLYSSNQKNYLA (SEQ ID NO 8); LCDR2 de scFv n.° 1: WASTRES (SEQ ID NO: 9); LCDR3 de scFv n.° 1: HQYLSSDT (SEQ ID NO: 10).

Las CDR correspondientes de las regiones VH y VL de scFv n.° 2 son las siguientes secuencias de aminoácidos HCDR1 de scFv n.° 2: SNVIS (SEQ ID NO: 11); HCDR2 de scFv n.° 2: GVIPIVDIANYAQRFKG (SEQ ID NO: 12) HCDR3 de scFv n.° 2: PRAFVLDAMDY (SEQ ID NO: 13); LCDR1 de scFv n.° 2: RASQSLGSSYLA (SEQ ID NO: 14) LCDR2 de scFv n.° 2: GASSRAP (SEQ ID NO: 15); y LCDR3 de scFv n.° 2: QQYADSPIT (SEQ ID NO: 16)

Las CDR correspondientes de las regiones VH y VL de scFv n.° 3 son las siguientes secuencias de aminoácidos HCDR1 de scFv n.° 3: SYGMH (SEQ ID NO: 21); HCDR2 de scFv n.° 3: VISYDGSIKYYADSVKG (SEQ ID NO: 22) HCDR3 de scFv n.° 3: TGEYSGYDTDPQYS (SEQ ID NO: 23); LCDR1 de scFv n.° 3: RSSQGIGDDLG (SEC ID NO 24); LCDR2 de scFv n.° 3: GTSTLQS (SEQ ID NO: 25); y LCDR3 de scFv n.° 3: LQDSNYPLT (SEQ ID NO: 26).

Los péptidos de detección de la divulgación pueden incluir, por ejemplo, HA: YPYDVPDYA (SEQ ID NO: 94); FLAG: DYKDDDDK (SEQ ID NO: 17); y c-myc: EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 95).

Un péptido señal ilustrativo incluye: METTDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO: 18). Otros péptidos señal ilustrativos incluyen: MLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDT (SEQ ID NO: 94) o MGTSLLCWMALCLLGADHADG (SEQ ID NO: 95).

Regiones bisagra espaciadoras de péptidos ilustrativas incluyen: DKTHT (SEQ ID NO: 27), CPPC (SEQ ID NO: 28), CPEPKSCDTPPPCPR (SEQ ID NO: 29), ELKTPLGDTTHT (SEQ ID NO: 30), KSCDKTHTCP (SEQ ID NO: 31), KCCVDCP (SEQ ID NO: 32), KYGPPCP (SEQ ID NO: 33), EPKSCDKTHTCPPCP (SEQ ID NO: 34; bisagra de IgGl humana), ERKCCVECPPCP (SEQ ID NO: 35; bisagra de IgG2 humana), ELKTPLGDTTHTCPRCP (SEQ ID NO: 36; bisagra de IgG3 humana), SPNMVPHAHHAQ (SEQ ID NO:37); ESKYGPPCPPCP (SEQ ID NO: 98), ESKYGPPCPSCP (SEQ ID NO: 99) (basada den bisagra de IgG4 humana), EPKSCDKTYTCPPCP (SEQ ID NO: 38), y TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD (SEQ ID NO: 39)

Los enlazadores peptídicos ilustrativos incluyen, por ejemplo, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 40); (GGGS)ⁿ(SEQ ID NO: 41); GGSG (SEQ ID NO: 42); GGSGG (SEQ ID NO: 43); GSGSG (SEQ ID NO: 44); GSGGG (SEQ ID NO: 45); GGGSG (SEQ ID NO: 46); y GSSSG (SEQ ID NO: 47).

Los dominios transmembrana ilustrativos incluyen IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC (SEQ ID NO: 48), procedente de CD8 beta: LGLLVAGVLVLLVSLGVAIHLCC (SEQ ID NO: 49), procedente de CD4: ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFFCVRC (SEQ ID NO: 50), procedente de CD3 zeta: LCYLLDGILFIYGVILTALFLRV (SEQ ID NO: 51), procedente de CD28: WVLVWGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (SEQ ID NO: 52), procedente de CD134 (OX40): VAAILGLGLVLGLLGPLAILLALYLL (SEQ ID NO: 53), y procedente de CD7: ALPAALAVISFLLGLGLGVACVLA (SEQ ID NO: 54).

Las regiones coestimuladoras ilustrativas incluyen: KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL (SEQ ID NO: 55), FWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 56), TKKKYSSSVHDPNGEYMFMRAVNTAKKSRLTDVTL (SEQ ID NO: 57), RRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKI (SEQ ID NO: 58), CCLRRHQGKQNELSDTAGREINLVDAHLKSEQTEASTRQNSQVLLSETGIYDNDPDLCFRMQEGSEVYSNPCLEENK PGIVYASLNHSVIGPNSRLARNVKEAPTEYASICVRS (SEQ ID NO: 59), HQRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP (SEQ ID NO: 60), RRACRKRIRQKLHLCYPVQTSQPKLELVDSRPRRSSTQLRSGASVTEPVAEERGLMSQPLMETCHSVGAAYLESLPL QDASPAGGPSSPRDLPEPRVSTEHTNNKIEKIYIMKADTVIVGTVKAELPEGRGLAGPAEPELEEELEADHTPHYPEQ ETEPPLGSCSDVMLSVEE EGKEDPLPTAASGK (SEQ ID NO: 61), HIWQLRSQCMWPRETQLLLEVPPSTEDARSCQFPEEERGERSAEEKGRLGDLWV (SEQ ID NO: 62), and CVKRRKPRGDVVKVIVSVQRKRQEAEGEATVIEALQAPPDVTTVAVEETIPSFTGRSP NH (SEQ ID NO: 63).

En algunos aspectos, el endodominio comprende un motivo ITAM. Un motivo ITAM es YXⁱX2(L/I), donde X ⁱy X²son independientemente cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 64). En algunos casos, un motivo ITAM se repite dos veces en un endodominio, estando separados entre sí los casos primero y segundo del motivo ITAM por de 6 a 8 aminoácidos, por ejemplo, (YX¹X²(L/I))(X³)ⁿ(YX¹X²(L/I)), donde n es un número entero de 6 a 8 y cada uno de los 6-8 X³pueden ser cualquier aminoácido (SEQ ID NO: 65).

Los endodominios ilustrativos incluyen polipéptidos de: MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAA TRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 66), MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSGLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAT RKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 67); MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKORITETESP YOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 68); MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVP RGRGAAEATRKORITETESPYOELOGORSDVYSDLNTQRPYYK (SEQ ID NO: 69); ESPYOELOGORSDVYSDLNTO (SEQ ID NO: 70); MIPAVVLLLLLLVEQAAALGEPQLCYILDAILFLYGIVLTLLYCRLKIQVRKAAITSYEKSDGVYTGLSTRNQETYETLKHE KPPQ (SEQ ID NO: 71); DGVYTGLSTRNOETYETLKHE (SEQ ID NO: 72); MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKD KESTVQVHYRMCQSCVELDPATVAGIIVTDVIATLL LALGVFCFAGHETGRLSGAADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAOYSHLGGNWAR NK (SEQ ID NO: 73); MEHSTFLSGLVLATLLSQVSPFKIPIEELEDRVFVNCNTSITWVEGTVGTLLSDITRLDLGKRILDPRGIYRCNGTDIYKD KESTVOVHYRTADTOALLRNDOVYOPLRDRDDAQ YSHLGGNWARNK (SEQ ID NO: 74); DOVYOPLRDRDDAOYSHLGGN (SEQ ID NO: 75); MQSGTHWRVLGLCLLSVGVWGQDGNEEMGGITQTPYKVSISGTTVILTCPQYPGSEILWQHNDKNIGGDEDDKNIGS DEDHLSLKEFSELEQSGYYVCYPRGSKPEDANFYLYLRARVCENCMEMDVMSVATIVIVDICITGGLLLLVYYWSKNR KAKAKPVTRGAGAG GRQRGQNKERPPPVPNPDYEPIRKGQRDLYSGLNQRRI (SEQ ID NO: 76); NPDYEPIRKGQRDLYSGLNQR (SEQ ID NO: 77); MEQGKGLAVLILAIILLQGTLAQSIKGNHLVKVYDYQEDGSVLLTCDAEAKNITWFKDGKMIGFLTEDKKKWNLGSNAK DPRGMYQCKGSQNKSKPLQVYYRMCQNCIELNAATISGFLFAEIVSIFVLAVGVYFIAGODGVROSRASDKOTLLPND OLYOPLKDREDDQ YSHLQGNQLRRN (SEQ ID NO: 78); DOLYOPLKDREDDOYSHLOGN (SEQ ID NO: 79); MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRR GKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR (SEQ ID NO: 80); MKWKALFTAAILQAQLPITEAQSFGLLDPKLCYLLDGILFIYGVILTALFLRVKFSRSA DAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNEL OKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALPPR( SEQ ID NO: 81); RVKFSRSADAPAYOQGONOLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPO EGLYNELOKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYOGLSTATKDTYDALHMQALP PR (SEQ ID NO: 82); NOLYNELNLGRREEYDVLDKR (SEQ ID NO: 83); EGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK (SEQ ID NO: 84); DGLYOGLSTATKDTYDALHMO (SEQ ID NO: 85); MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNGTLIIQNVNKSHGGIYVCRVQEGN ESYQQSCGTYLRVRQPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIILLFCAVVPGTLLLFRKRWO NEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYEDISRGLOGTYQDVGSLNIGDVQLEKP (SEQ ID NO: 86); MPGGPGVLQALPATIFLLFLLSAVYLGPGCQALWMHKVPASLMVSLGEDAHFQCPH NSSNNANVTWWRVLHGNYTWPPEFLGPGEDPNEPPPRPFLDMGEGTKNRIITAEGIIL LFCAVVPGTLLLFRKRWQNEKLGLDAGDEYEDENLYEGLNLDDCSMYE DISRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEKP

(SEQ ID NO: 87); ENLYEGLNLDDCSMYEDISRG (SEQ ID NO: 88); RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 89); RPRRSPAQDGKVYINMPGRG (SEQ ID NO: 90); FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 91); FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQP YAPPRDFAAYRS (SEQ ID NO: 92); y MPDPAAHLPFFYGSIS RAEAEEHLKLAGMADGLFLLRQCLRSLGGYVLSLVHDVRFHHFPIERQLNGTYAIAG GKAHCGPAELCEFYSRDPDGLPCNLRKPCNRPSGLEPQPGVFDCLRDAMVRDYVRQ TWKLEGEALEQAIISQAPQVEKLIATTAHERMPWYHSSLTREEAERKLYSGAQTDGK FLLRPRKEQGTYALSLIYGKTVYHYLISQDKAGKYCIPEGTKFDTLWQLVEYLKLKA DGLIYCLKEACPNSSASNASGAAAPTLPAHPSTLTHPQRRIDTLNSDGYTPEPARITSP DKPRPMPMDTSVYESPYSDPEELKDKKLFLKRDNLLIADIELGCGNFGSVRQGVYRM RKKQIDVAIKVLKQGTEKADTEEMMREAQIMHQLDNPYIVRLIGVCQAEALMLVME MAGGGPLHKFLVGKREEIPVSNVAELLHQVSMGMKYLEEKNFVHRDLAARNVLLV NRHYAKISDFGLSKALGADDSYYTARSAGKWPLKWYAPECINFRKFSSRSDVWSYG VTMWEALSYGQKPYKKMKGPEVMAFIEQGKRMECPPECPPELYALMSDCWIYKWE DRPDFLTVEQRMRACYYSLASKVEGPPGSTQKAEAACA (SEQ ID NO: 93) o porciones de los mismos.

VII. Ejemplos

Ejemplo 1

La presente divulgación describe fragmentos variables monocatenarios (scFv) que neutralizan el TGF-p humano y de ratón, así como receptores de antígeno quiméricos (CAR) sensibles al TGF-p humano y de ratón. El nivel de conservación de TGF-p en los mamíferos sugiere que los scFv y los CAR descritos pueden usarse para unirse a la mayoría de los TGF-p de mamíferos. Se construyen dos scFv a partir de anticuerpos anti-TGF-p conectando el dominio variable de cadena pesada (VH) al dominio variable de cadena ligera (VL) con un enlazador (G4S)3 de modo que la orientación final sea extremo-N-VH - (G4S)3-VL-extremo-C. Estos scFv se pueden producir transfectando células eucariotas con secuencias de ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de scFv indicadas en la siguiente tabla:

Cada scFv se puede etiquetar con el péptido líder (es decir, señal) de la cadena ligera kappa murina para que los scFv se secreten y se puedan recoger directamente del medio en el que se cultivan las células productoras. Los scFv también se pueden etiquetar en el extremo aminoterminal (después del péptido líder pero antes de la secuencia VH) con marcadores tal como el epítopo DYKDDDDK (SEQ ID NO: 17), etiqueta HA o etiqueta cMyc flanqueada por enlazadores GGS. Cada scFv se puede administrar directamente para neutralizar el TGF-p humano o de ratón. Los fragmentos scFv n.° 1 y n.° 2 son superiores a scFv n.° 3 (Figuras 1 y 7). Por otra parte, cada scFv puede usarse para construir un CAR sensible a TGF-p. Los CAR son proteínas de fusión compuestas por un dominio de unión a antígeno extracelular, un espaciador extracelular, un dominio transmembrana, regiones de señalización coestimuladoras (cuyo número varía dependiendo del diseño de CAR específico), y un dominio/endodominio de señalización CD3-zeta. Los TGF-p CAR se pueden construir usando los scFv descritos anteriormente como el dominio de unión a antígeno extracelular. Las células inmunitarias, incluyendo los linfocitos T y linfocitos citolíticos naturales (NK), pueden modificadas por ingeniería genética para expresar TGF-p CAR mediante una variedad de métodos, incluyendo la transducción viral, nucleofección de ADN y nucleofección de ARN. La unión de TGF-p al TGF-p CAR puede activar los linfocitos T humanos, redirigiendo así la señalización de TGF-p de una respuesta inmunosupresora a una respuesta inmunoestimuladora. El TGF-p CAR también se puede utilizar como receptor accesorio para contrarrestar la inmunosupresión y potenciar las respuestas mediadas por linfocitos T en todas las terapias adoptivas de linfocitos T, ya sea basándose en linfocitos infiltrantes de tumores, modificación por ingeniería genética de receptores de linfocitos T u otros CAR.

Como se muestra en la figura 2, los TGF-p CAR se expresan eficazmente en la superficie de los linfocitos T humanos primarios. Se creó un TGF-p CAR usando scFv n.° 2. La tinción de superficie y la citometría de flujo muestran que los TGF-p CAR se presentan en la superficie de los linfocitos T CD4+ y CD8+ humanos primarios. El dominio extracelular del receptor contiene un epítopo FLAG aminoterminal. EGFRt es un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado que es un indicador de la transducción celular. Se encontró además que TGF-p CAR se presenta en la superficie celular más eficientemente que el receptor de TGF-p dominante negativo (Figura 9). Se ha informado que un receptor de TGF-p dominante negativo (DNR) que comprende una cadena II de receptor de TGF-p truncado que carece del dominio de señalización intracelular inhibe la señalización de TGF-p y mejora la función efectora de los linfocitos T. Sin embargo, el DNR no se expresa eficientemente en la superficie celular mientras que el TGF-p CAR sí lo hace. Los datos mostrados en la figura 9 son de la transducción de linfocitos T CD4+ humanos primarios con lentivirus que codifican TGF-p CAR etiquetados con FLAG o DNR etiquetados con FLAG. Cada receptor está etiquetado a través de un péptido de escisión T2A en el receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt), de manera que las células transducidas pueden identificarse mediante tinción con EGFRt, mientras que la expresión de la superficie del receptor puede identificarse mediante tinción con FLAG. Los resultados de la figura 9 indican que los TGF-p CAR se expresan mucho más eficientemente en las superficies de los linfocitos T que los DNR

La figura 3 muestra que los TGF-p CAR bloquean la señalización de TGF-p endógeno. La expresión de TGF-p CAR en linfocitos T humanos primarios bloquea la señalización de TGF-p a través de la vía SMAd . los linfocitos T que expresan el receptor indicado se incubaron con TGF-p a la concentración indicada durante 30 min y se sondearon para detectar fosfo-SMAD2 mediante transferencia Western. EGFRt se refiere a los linfocitos T que expresan un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado y sirve como un control "sin CAR"; scFv-less se refiere a los linfocitos T que expresan un CAR que carece de cualquier dominio scFv de unión a ligando pero que, por lo demás, es idéntico al TGF-p CAR largo. Las etiquetas "largo" y "corto" detrás de los TGF-p CAR se refieren a la longitud de sus espaciadores peptídicos extracelulares. Como se muestra en la figura 6, los linfocitos T-TGF-p CAR proliferan en respuesta a TGF-p. Los linfocitos T que expresan TGF-p CAR convierten el TGF-p de una citocina inhibidora del crecimiento a una citocina promotora del crecimiento.

También se encontró que los TGF-p CAR activan los linfocitos T y desencadenan la producción de citocinas (figura 4). Como se muestra en la figura 4, los linfocitos T-TGF-p CAR aumentan la expresión del marcador de activación CD69 y producen las citocinas inmunoestimuladoras IFN-y y TNF-a en respuesta a la exposición a TGF-p. El aumento de CD69 se controló mediante tinción superficial después de una incubación de 24 horas con o sin TGF-p. La producción de citocinas se detectó aplicando el inhibidor del transporte de proteínas Brefeldina A y realizando una tinción intracelular después de una incubación de 24 horas con o sin TGF-p. El término "scFv-less" se refiere a un CAR que carece de cualquier dominio scFv de unión a ligando.

A diferencia de los TGF-p CAR, el receptor de TGF-p dominante negativo no puede desencadenar la producción de citocinas. Si bien se ha informado que el receptor de TGF-p dominante negativo también inhibe la señalización de TGF-p, no desencadena acciones inmunoestimuladoras tal como la producción de TNF-a (figura 5). "Tp corto" y "Tp largo" son dos TGF-p CAR diferentes, "Dom-Neg" se refiere al receptor de TGF-p dominante negativo, y "scFv-less" se refiere a un CAR que carece de cualquier dominio scFv de unión a ligando.

Además, se descubrió que la función TGF-p CAR se puede ajustar mediante la elección del dominio coestimulador. Como se muestra en la figura 10, el cambio entre los dominios coestimuladores CD28 y 4-1BB altera los niveles de producción de citocinas en respuesta a TGF-p. Por otra parte, se encontró que el TGF-p desencadena constantemente la producción de TNF-a de una manera dependiente de la dosis en células con TGF-p CAR de diferentes donantes, lo que sugiere que el rendimiento del CAR es lo suficientemente sólido como para confiar en él para aplicaciones clínicas (figura 11).

Se encontró además que la longitud del espaciador de TGF-p CAR modula el umbral de activación. El aumento de la longitud del espaciador extracelular aumenta el umbral de TGF-p de activación de CAR (figura 12). Esto sugiere que se puede personalizar la sensibilidad de CAR a las necesidades de la aplicación alterando el acoplamiento entre el dominio de unión al ligando y los dominios de señalización intracelular. El "espaciador corto" comprende la porción de bisagra de la IgG4 humana; "espaciador largo" comprende bisagra-CH2-CH3 de IgG4.

A continuación, se descubrió que la dimerización de CAR mediada por ligando soluble desencadena la señalización de CAR. En la figura 13 se muestran líneas de células Jurkat que llevan los CAR indicados. GFP CAR n.° 1 y GFP CAR n.° 3 existen predominantemente en forma de homodímero, y los dos CAR se unen a diferentes epítopos en EGFP y pueden unirse simultáneamente a una molécula de EGFP individual. GFP CAR n.° 1 y GFP CAR n.° 2 se unen al mismo epítopo en EGFP, pero CAR n.° 2 existe como monómero en lugar de como homodímero. Los resultados indican que la señalización de CAR puede facilitarse mediante la dimerización de CAR mediada por ligando, pero no hay ningún requisito de que el ligando o el propio CAR existan previamente como dímero (figura 13). Un posible mecanismo por el cual los ligandos solubles pueden desencadenar la señalización de CAR es uniendo receptores en dos células diferentes, formando así una sinapsis inmunitaria. Este mecanismo es coherente con la observación de que las células Jurkat que expresan un solo tipo de GFP CAR pueden activarse mediante EGFP dimérico pero no monomérico. También es coherente con la observación de que una mezcla de dos líneas celulares Jurkat, expresando cada una un GFP CAR diferente, puede activarse tanto por EGFP dimérico como monomérico. En este caso, EGFP monomérico también puede desencadenar la unión célula-célula ya que los CAR en las dos líneas celulares Jurkat se unen a dos epítopos diferentes en la misma molécula de EGFP (figura 14).

Se descubrió que TGF-p CAR puede activarse tanto de manera dependiente como independiente del contacto célulacélula. Aunque el contacto célula-célula es un posible mecanismo por el cual los ligandos solubles como EGFP y TGF-p pueden desencadenar la señalización de CAR, la activación de los linfocitos CAR-T también puede desencadenarse mediante un ligando soluble en ausencia de contacto célula-célula. En la figura 15, se siembran células Jurkat que expresan de forma estable TGF-p CAR y un indicador EGFP expresado a partir de un promotor NFAT a varias densidades celulares y se incuban con o sin 5 ng/ml de TGF-p. Incluso a densidades celulares muy bajas, donde las células existen predominantemente como aislados de células sueltas, se observa una clara señal de EGFP en presencia de TGF-p. Por otra parte, para un intervalo de 10 veces en la densidad celular (de 500 a 5000 células/cmA2), no hay aumento en la producción de EGFP por la densidad celular (figura 15). Estos resultados indican que el TGF-p soluble puede desencadenar la activación de linfocitos T independientemente del contacto célula-célula. Sin embargo, el aumento de EGFP aumenta significativamente más allá de un umbral de densidad celular, confirmando la contribución del contacto célula-célula a niveles más altos de densidad celular. Para probar esto de manera adicional, los linfocitos T CD4+ humanos primarios que expresan TGF-p CAR se marcaron con el indicador de calcio Fluo-4-AM y se tomaron imágenes mediante microscopía de fluorescencia. Las señales de fluo-4-AM observadas después de la adición de TGF-p en ausencia de contacto célula-célula confirman que los linfocitos T-TGF-p CAR pueden activarse mediante ligandos solubles sin unión célula-célula (figura 16).

El TGF-p CAR aborda la necesidad de que las células inmunitarias contrarresten el papel del TGF-p como impulsor de la inmunosupresión en el microambiente tumoral. Si bien la terapia con linfocitos T-CAR ha producido resultados clínicos notables contra las neoplasias malignas de linfocitos B, su eficacia contra tumores sólidos ha sido significativamente más limitada. Se sabe que los tumores sólidos generan un microambiente altamente inmunosupresor a través de la sobreproducción de TGF-p y otras citocinas, dando como resultado finalmente a la inactivación de los linfocitos T. El TGF-p CAR otorga a los linfocitos T la capacidad no solo de contrarrestar la inmunosupresión al reducir la señalización a través de la vía endógena del TGF-p, sino también al desencadenar de manera específica la activación de linfocitos T en presencia de TGF-p. La activación de los linfocitos T estimula a las células inmunitarias a producir citocinas inmunoestimulantes y proliferar, convirtiendo así al TGF-p de una señal inmunosupresora a un estímulo activador que fortalece la respuesta inmunitaria antitumoral.

Ejemplo 2: Modificación por ingeniería genética de la terapia multifuncional con linfocitos T reguladores para enfermedades autoinmunitarias

Este ejemplo describe métodos que se pueden usar para modificar por ingeniería genética linfocitos T reguladores (Treg) que expresan receptores de antígeno quiméricos (CAR) que pueden activarse mediante el factor de crecimiento tumoral beta (TGF-p) para expandirse selectivamente ex vivo, mantener una función supresora potente in vivo, y secretar fragmentos variables monocatenarios (scFv) contra el receptor alfa de interleucina 6 (IL-6Ra) para reducir eficazmente la inflamación en un modelo de artritis reumatoide (AR) en ratones. Se contempla que otras enfermedades autoinmunitarias, tales como las conocidas en la técnica y/o descritas en el presente documento, también puedan tratarse mediante métodos descritos en este ejemplo y divulgación.

La terapia adoptiva con linfocitos T que utiliza linfocitos T convencionales (T conv) que expresan receptores de antígeno quiméricos (CAR) ha demostrado una eficacia clínica notable contra los cánceres refractarios, particularmente neoplasias malignas de linfocitos B. Sin embargo, la aplicación de la terapia con linfocitos T-CAR para el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias aún está en pañales.

Los Treg suprimen la función Tconv a través de múltiples mecanismos, uno de los cuales es la secreción de TGF-p, una potente citocina inmunosupresora que inhibe las funciones de los linfocitos T efectores y de los linfocitos citolíticos naturales. Los inventores han creado un TGF-p CAR que activa de manera específica Tconv en presencia de TGF-p (figura 4), y han confirmado que los linfocitos T-TGF-p CAR responden a TGF-p tanto en forma soluble como inmovilizada. Los Tconv CD4+ y CD8+ humanos que expresan TGF-p CAR desencadenan una señalización fuerte de NFAT y producen citocinas Th2 en presencia de TGF-p, a pesar de que el TGF-p es normalmente un agente altamente inmunosupresor (figura 4).

Se contempla que el TGF-p CAR sería especialmente adecuado para la terapia con Treg por las siguientes razones: 1) Se sabe que TGF-p promueve la diferenciación de Treg, por lo tanto, la expansión mediada por TGF-p de linfocitos T que expresan CAR presenta un método para expandir selectivamente Treg mientras evita el crecimiento de Tconv contaminantes. Se ha observado que TGF-p impulsa la proliferación potente de Tconv que expresan TGF-p CAR, pero sólo en presencia de células alimentadoras irradiadas. En ausencia de células alimentadoras, la proliferación de Tconv-TGF-p CAR se inhibe de manera específica por la presencia de TGF-p, y la inhibición es significativamente más fuerte contra Tconv-TGF-p CAR en comparación con Tconv no modificados o Tconv que expresan CAR no TGFP. Los resultados experimentales de los inventores sugieren que TGF-p, que existe como un homodímero natural, puede causar la conjugación entre dos linfocitos T que expresan el TGF-p CAR. Esta conjugación célula-célula puede dar lugar a toxicidad fratricida entre Tconv. Esta toxicidad puede ser más que compensada por la respuesta proliferativa que es resultado de la señalización de CAR, pero solo con el soporte de células alimentadoras irradiadas. A diferencia de Tconv, los Treg no presentan citotoxicidad mediada por granzimas y no se suprimen por la señalización endógena de TGF-p. Por lo tanto, se contempla que, en ausencia de soporte de células alimentadoras, los Treg que expresan TGF-p CAR pueden expandirse selectivamente sobre los Tconv contaminantes en un protocolo de expansión impulsado por TGF-p ex vivo, abordando así uno de los principales obstáculos en la producción de Treg terapéuticos.

2) Los Treg activados producen de manera natural TGF-p, proporcionando así un mecanismo para la activación autosostenida de Treg-TGF-p CAR in vitro e in vivo. Se ha demostrado que los Treg específicos de antígeno son más eficaces que los Treg policlonales en la inmunosupresión. Por otro lado, también se ha demostrado que una vez activados, los Treg pueden ejercer una función supresora de manera no específica de antígeno. Por otra parte, se ha demostrado que los Treg policlonales activados previamente inhiben la artritis inducida por colágeno en ratones. Considerados en conjunto, estos resultados sugieren que los Treg específicos de antígeno pueden ser más eficaces porque es más probable que se activen que los Treg no específicos de antígeno, y que la especificidad hacia la célula diana, aunque probablemente ventajosa, no es esencial para la función terapéutica. Naturalmente, los linfocitos Treg específicos de antígeno son difíciles de aislar y expandir en cantidades suficientemente grandes para aplicaciones terapéuticas. Aunque la introducción de receptores transgénicos de linfocitos T (TCR) proporciona una alternativa atractiva, cada enfermedad requeriría su propio TCR específico y la disponibilidad de una diana antigénica adecuada, habiéndose reconocido esta última como un cuello de botella importante en la creación de terapias con linfocitos T. Debido a que la producción de TGF-p es una salida natural de Treg independientemente de la especificidad de TCR, el TGF-p CAR presenta una estrategia generalizable para permitir la activación autosostenida de Treg, lo que podría apoyar la supresión mediada por Treg contra una amplia variedad de dianas de enfermedades sin la necesidad de receptores específicos de enfermedades.

Este ejemplo proporciona metodologías novedosas y productos de Treg específicos para inmunoterapia basada en células contra enfermedades autoinmunitarias, siendo la AR el modelo de enfermedad para los estudios iniciales. El objetivo general es establecer un enfoque generalizable para la generación de Treg terapéuticos con una función terapéutica sostenida y demostrar la utilidad de los Treg modificados por ingeniería genética en un modelo de artritis inducida por colágeno en ratones.

A. Crear un protocolo de expansión mediado por TGF-p ex vivo para una propagación potente de Treg

Los Treg humanos primarios se pueden aislar de muestras de sangre de donantes sanos utilizando un kit de enriquecimiento de linfocitos T CD4+ RosetteSep seguido de un enriquecimiento basado en perlas magnéticas de células CD127- y CD25+. Las células aisladas pueden activarse con Dynabeads de CD3/CD28 y cultivarse en medio completo (RPMI suero bovino fetal inactivado por calor al 10 %) complementado con 300 U/ml de IL-2 durante 2 días antes de la transducción lentiviral. Los vectores lentivirales que codifican el TGF-p CAR etiquetado (a través de un péptido de escisión T2A) con un receptor del factor de crecimiento epidérmico truncado (EGFRt) ya se han construido y validado mediante transducción en Tconv humanos primarios. Las células que expresan c Ar se pueden aislar mediante clasificación basada en perlas magnéticas para células EGFRt+. Este esquema de clasificación evita la necesidad de una unión directa de anticuerpos al CAR y reduce la probabilidad de activación de linfocitos T improductivos. Los T reg-CAR clasificados se pueden expandir en placas de 96 pozos en una variedad de condiciones de cultivo: (a) 300 U/ml de IL-2 solamente, (b) TGF-p solo en un gradiente de concentraciones (1 - 20 ng/ml), (c) un gradiente de IL-2 (50 - 300 U/ml) más TGF-p (1 - 20 ng/ml), y (d) un gradiente de concentraciones de IL-2 y TGF-p más células alimentadoras irradiadas ( TM-LCL) a una relación de 1:7 de linfocitos T:TM-LCL. Los recuentos de células viables se pueden cuantificar mediante citometría de flujo durante un período de 3 semanas. Por otra parte, los niveles de expresión de Foxp3 se pueden cuantificar mediante tinción intracelular durante todo el proceso de preparación de células, comenzando con células CD4+/CD25+/CD127- recién aisladas. Se ha construido un "scFv-less" CAR que es idéntico al TGF-p CAR excepto que carece del dominio scFv de unión a TGF-p y puede incluirse como control negativo.

A través de los estudios descritos en este ejemplo, se puede determinar lo siguiente: (1) si la expresión de TGF-p CAR confiere a los linfocitos Treg la capacidad de proliferar de manera específica en respuesta a la adición de TGF-p y (2) identificar la combinación óptima de IL-2, TGF-p y/o células alimentadoras para expansión de Treg ex vivo con alta eficiencia (definida por un gran factor de expansión) y elevada pureza (definida por una presencia mínima de Tconv contaminantes). Los presentes inventores han creado múltiples TGF-p CAR con diferentes propiedades estructurales y han observado distintos umbrales de señalización de estos CAR en respuesta a TGF-p. Dos TGF-p CAR diferentes, uno con un espaciador extracelular corto (12 aminoácidos) y otro con un espaciador extracelular largo (229 aminoácidos) pueden evaluarse para determinar la construcción óptima para las aplicaciones de Treg.

B. Optimizar la función supresora de Treg TGF-p CAR-Tregs in vitro e in vivo

Las funciones supresoras de Treg que expresan de manera estable el TGF-p CAR pueden investigarse más a fondo. Los Treg estarán aislados, transducidos y clasificados como se ha descrito anteriormente. Se pueden evaluar tanto los TGF-p CAR de espaciador largo como los de espaciador corto. Como control negativo, puede transducirse una fracción de los linfocitos T CD4+ (antes del enriquecimiento para el fenotipo CD127-/CD25+) y clasificarse para proporcionar una comparación de Tconv-TGF-p CAR frente a los linfocitos Treg modificados por ingeniería genética. Como segundo control negativo, los Treg transducidos con el scFv-less CAR descrito anteriormente pueden incluirse en el estudio. Los Treg-CAR clasificados se pueden expandir en medios completos complementados con 300 U/ml de IL-2, ya que se ha informado que esta concentración de IL-2 respalda la supervivencia y proliferación de Treg ex vivo y es una concentración intermedia entre las indicadas en estudios publicados. El procedimiento de expansión se puede actualizar a la condición determinada para soportar la expansión de Treg óptima. Los Tconv se expandirán en medios completos suplementados con 50 U/ml de IL-2 y 1 ng/ml de IL-15.

La función supresora de los Treg-TGF-p CAR puede evaluarse en cocultivos con Tconv diana. Los Tconv diana serán linfocitos T CD4+ transducidos mediante lentivirus para expresar el CD19 CAR. Para someter a ensayo la función de Treg, los Treg-TGF-p CAR se pueden incubar junto con Tconv-CD19 CAR marcados con CFSE y células de linfoma Raji CD19+ en presencia o ausencia de TGF-p soluble. La proliferación de los Tconv-CD19 CAR se puede evaluar mediante la dilución CFSE, así como el recuento de células viables mediante citometría de flujo. El ensayo de proliferación basado en CFSE se puede realizar en lugar del ensayo de incorporación de 3H-timidina más utilizado para distinguir claramente la proliferación de Treg frente a Tconv en este entorno de cultivo conjunto. Las células marcadas con CFSE se pueden cuantificar con precisión mediante citometría de flujo a partir de puntos de tiempo tempranos, mientras que los picos de dilución de CFSE revelarán la dinámica de división celular durante un período de 7 días. Como controles negativos, los Tconv-TGF-p CAR o los Treg-scFv-less CAR pueden reemplazar a los Treg-TGF-p CAR en las muestras de incubación conjunta. Se espera que los Treg scFv less-CAR muestren alguna función supresora, pero que los Treg-TGF-p CAR mostrarán una supresión potenciada debido a la producción de TGF-p y la posterior activación autocrina de Treg a través de TGF-p CAR. Por otra parte, se anticipa que la adición de TGF-p exógeno fortalecerá aún más la función supresora de los Treg TGF-p CAR, lo que da como resultado una expansión mínima de Tconv-CD19 CAR a pesar de la presencia de células diana CD19+.

Tras la verificación de la función supresora de Treg-TGF-p CAR in vitro, puede evaluarse la capacidad de los Tregs modificados por ingeniería genética para ejecutar la función supresora in vivo. Para estudios con animales, se aislarán linfocitos T reg CD4+/CD25+ murinos de los ganglios linfáticos y bazos de ratones DBA/1 mediante clasificación celular basada en perlas magnéticas. Las células clasificadas pueden activarse con Dynabeads de CD3/CD28 murinos y transducirse, expandirse y clasificarse para determinar la expresión de TGF-p CAR como se describió previamente para Treg humanos. Aunque el TGF-p CAR está construido con un scFv que se dirige al TGF-p humano, los presentes inventores han confirmado que este receptor reacciona de forma cruzada con el TGF-p murino con alta eficacia (figura 8). Para desencadenar la artritis inducida por colágeno (AIC), a los ratones DBA/1 se les puede inyectar en la base de la cola una emulsión de 100 pl que contiene adyuvante completo de Freund mezclado en relación 1:1 con 2 mg/ml de colágeno de tipo II de pollo disuelto en PBS con ácido acético 0,1 M. Se puede administrar un millón de Treg mediante inyección en la vena de la cola un día antes de la inmunización para AlC o dos semanas después de la inmunización para AlC para evaluar el rendimiento de los Treg en diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. Los Treg-TGF-p CAR se pueden comparar con los Treg-scFv-less CAR-Treg y un control "sin Treg" (es decir, sin administración de T reg después de la inmunización para AlC) en cuanto a su capacidad para prevenir o mejorar la artritis. Los ratones se pueden evaluar para detectar artritis clínica en las patas según una escala de 4 puntos como se describió previamente por Kelchtermans, H. et al. (Arthritis Res Ther 7, R402-415 (2005)). Se pueden incluir diez animales para cada condición de prueba (40 animales en total). El tamaño de la muestra n = 10 proporcionará un poder del 92 % para detectar una diferencia de 1,5 desviaciones estándar en la puntuación de la artritis en una prueba t bilateral con a = 0,05. Basándose en la bibliografía disponible, se anticipa que los Treg-scFv-less CAR lograrán una supresión notable de los síntomas artríticos en el modelo de AlC. Sin embargo, se anticipa que la adición de TGF-p CAR dará como resultado una funcionalidad de Treg potenciada, lo que da lugar a una inhibición más eficaz de la AlC. Queda por ver si el CAR de espaciador largo o el de espaciador corto presentarán una funcionalidad superior in vivo en el modelo de AlC.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende un péptido señal, un dominio de unión al antígeno TGF-p con una región variable pesada (VH) y variable ligera (VL) de un anticuerpo, un espaciador peptídico, un dominio transmembrana y un endodominio que transmite una señal de activación al linfocito T después de que se una el antígeno; en donde el dominio de unión al antígeno TGF-p se une de manera específica al TGF-p soluble y en donde:

(a) la región VH comprende la SEQ ID NO: 5 como HCDR1, la SEQ ID NO: 6 como HCDR2; y la SEQ ID NO: 7 como HCDR3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 8 como LCDR1, la SEQ ID NO: 9 como LCDR2; y la SEQ ID NO: 10 como LCDR3; o

(b) la región VH comprende la SEQ ID NO: 11 como HCDR1, la SEQ ID NO: 12 como HCDR2; y la SEQ ID NO: 13 como HCDR3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 14 como LCDR1, la SEQ ID NO: 15 como LCDR2; y la SEQ ID NO: 16 como LCDR3; o

(c) la región VH comprende la SEQ ID NO: 21 como HCDR1, la SEQ ID NO: 22 como HCDR2; y la SEQ ID NO: 23 como HCDR3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 24 como LCDR1, la SEQ ID NO: 25 como LCDR2; y la SEQ ID NO: 26 como LCDR3; y

en donde el CAR tiene la estructura: S-X-PL-Y-PS-T-E o S-Y-PL-X-PS-T-E en donde S es el péptido señal, X es VH, PL es un enlazador peptídico, Y es VL, PS es el espaciador peptídico, T es el dominio transmembrana y E es el endodominio.

2. El CAR de la reivindicación 1(a), en donde la región VH comprende la SEQ ID NO: 1 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 2.

3. El CAR de la reivindicación 1, en donde:

(a) la región VH de la reivindicación 1(b) comprende la SEQ ID NO: 3 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 4; o

(b) la región VH de la reivindicación 1(c) comprende la SEQ ID NO: 19 y la región VL comprende la SEQ ID NO: 20.

4. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde:

(a) la región VH y la región VL están separadas por un enlazador peptídico; y/o

(b) el CAR comprende además una región coestimuladora, opcionalmente en donde la región coestimuladora está entre el dominio transmembrana y el endodominio; y/o

(c) el dominio transmembrana comprende un dominio transmembrana de CD28; y/o

(d) el endodominio comprende un dominio de señalización CD28 o CD3 zeta; en donde opcionalmente el enlazador peptídico es un enlazador de glicina-serina.

5. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 (b), 1 (c), 2, 3 o 4, en donde el enlazador peptídico tiene al menos 4 aminoácidos.

6. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde:

(a) el endodominio es un dominio de señalización CD3-zeta; y/o

(b) el espaciador peptídico comprende: (i) menos de 50 aminoácidos; o (ii) más de 50 aminoácidos; y/o

(c) el espaciador peptídico comprende la región bisagra de una molécula de IgG; y/o

(d) el espaciador peptídico comprende la región bisagra y CH2CH3 de una molécula de IgG, en donde opcionalmente el espaciador peptídico consiste en la región bisagra de una molécula de IgG; y/o

(e) el CAR comprende además un péptido de detección, en donde opcionalmente el péptido de detección es un péptido de SEQ ID NO: 17, 94 o 95: y opcionalmente: (i) el péptido de detección está flanqueado por enlazadores; y/o (ii) el péptido de detección es aminoterminal para las regiones VH y VL; y/o (iii) el péptido de detección está entre el péptido señal y el dominio de unión a antígeno.

7. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde:

(a) el péptido señal comprende la SEQ ID NO: 18; y/o

(b) el c Ar comprende además un dominio de unión a antígeno específico de una molécula de cáncer, en donde opcionalmente la molécula de cáncer comprende Her2 o comprende CD19 o CD20; o

(c) el CAR comprende además un dominio de unión a antígeno específico de una molécula de cáncer, en donde opcionalmente el dominio de unión a antígeno específico de la molécula de cáncer se une a CAIX, CD33, CD44v7/8, CEA, EGP-2, EGP-40, erb-B2, erb-B3, erb-B4, FBP, receptor de acetilcolina fetal, GD2, GD3, Her2/neu, IL-13Ralfa2, KDR, cadena ligera k, LeY, molécula de adhesión de células L1, MAGE-A1, mesotelina, MUC1, ligandos de NKG2D, antígeno oncofetal (h5T4), PSCA, PSMA, TAA dirigido por mAb IgE, TAG-72 o VEGF-R2.

8. Un ácido nucleico aislado que codifica el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Una célula que comprende el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el ácido nucleico de la reivindicación 8, en donde:

(A) opcionalmente, la célula comprende además un receptor de antígeno quimérico (CAR) específico de cáncer y, opcionalmente, el CAR específico de cáncer se une de manera específica a: (i) Her2 o (ii) se une de manera específica a CD19 o CD20, en donde opcionalmente la célula es una célula inmunitaria; y

(B) opcionalmente: (a) la célula es un linfocito T, opcionalmente un linfocito T CD4+ o CD8+; o un linfocito T regulador; o (b) la célula es un linfocito citolítico natural.

10. Una célula de la reivindicación 9 para su uso en un método para estimular una respuesta inmunitaria, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula de la reivindicación 9 con TGF-p, en donde opcionalmente:

(i) estimular una respuesta inmunitaria comprende aumentar la expresión y/o secreción de citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes, en donde opcionalmente las citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes son una o más de TNF-a, IFN-p, IFN-y, IL-1, IL-2, lL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; o (ii) estimular una respuesta inmunitaria comprende aumentar la proliferación de células inmunitarias, opcionalmente en donde las células inmunitarias son linfocitos T.

11. Una célula de la reivindicación 9 para su uso en un método de estimulación de una respuesta inmunitaria, comprendiendo dicho método poner en contacto la célula de la reivindicación 9 o de la reivindicación 10 con TGF-p, en donde se encuentra la célula in vivo en un sujeto que necesita estimulación inmunitaria y, opcionalmente, el TGF-p es un TGF-p endógeno producido en el sujeto que necesita estimulación inmunitaria, en donde opcionalmente: (i) el sujeto humano tiene cáncer, fibrosis, o una herida abierta, en donde opcionalmente el cáncer es melanoma; (ii) el sujeto humano tiene una neoplasia maligna de linfocitos B; o (iii) el sujeto humano tiene un tumor sólido; y en donde, opcionalmente:

(iv) el método comprende además administrar la célula a un sujeto humano; y/o (v) el método comprende además administrar TGF-p al sujeto.

12. Un método ex vivo para detectar TGF-p en una solución que comprende poner en contacto las células de la reivindicación 9 con la solución y medir la estimulación inmunitaria; en donde un aumento en la estimulación inmunitaria indica la presencia de TGF-p y ningún aumento en la estimulación inmunitaria indica la ausencia de TGF-p, en donde opcionalmente:

(i) la estimulación inmunitaria comprende la expresión de citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes, en donde opcionalmente las citocinas y/o moléculas inmunoestimulantes son una o más de TNF-a, IFN-p, IFN-y, IL-1, IL-2, lL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-18 y factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos; o (ii) la estimulación inmunitaria comprende un aumento en la proliferación de células inmunitarias, en donde opcionalmente las células inmunitarias son linfocitos T.

13. Un método para preparar el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que comprende expresar un nucleótido que codifica el CAR en una célula.

14. Un método para expandir linfocitos T in vitro, comprendiendo el método poner en contacto el linfocito T de la reivindicación 9B con una composición que comprende TGF-p, en donde opcionalmente la composición: (a) comprende de 1-50 ng/ml de TGF-p; y/o (b) comprende IL-2 y opcionalmente la composición comprende 20-400 U/ml de IL-2,

en donde opcionalmente:

(a) (i) el método comprende además poner en contacto las células con células alimentadoras, en donde opcionalmente se irradian las células alimentadoras; o (ii) el método excluye poner en contacto los linfocitos T con las células alimentadoras; y/o

(b) el linfocito T es un linfocito T regulador, en donde opcionalmente los linfocitos T reguladores expandidos comprenden menos del 10 % de linfocitos T no reguladores.

15. Una célula según la reivindicación 9B para su uso en un método para tratar una enfermedad o afección patológica en un paciente,

en donde opcionalmente: (a) la célula es un linfocito T regulador, en donde opcionalmente la enfermedad es: una enfermedad autoinmunitaria; o (b) la enfermedad es cáncer;

en donde opcionalmente el método comprende además expandir las células in vitro mediante un método que comprende poner en contacto la célula in vitro con una composición que comprende TGF-p;, en donde opcionalmente: (a) la composición comprende 1-50 ng/ml de TGF-p; y/o (b) la composición comprende además IL-2, y opcionalmente la composición comprende 20-400 U/ml de IL-2;

en donde opcionalmente: (a) el método comprende además poner en contacto las células con células alimentadoras, en donde opcionalmente se irradian las células alimentadoras; o (b) el método excluye poner en contacto los linfocitos T con las células alimentadoras;

en donde opcionalmente el linfocito T es un linfocito T regulador, en donde opcionalmente los linfocitos T reguladores expandidos comprenden menos del 10 % de linfocitos T no reguladores;

en donde opcionalmente la enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide; y

en donde opcionalmente el método comprende además la administración de TGF-p al paciente.