ES2934846T3 - Inhibidores de CDK para tratamiento de PAH - Google Patents

Abstract

La hipertensión arterial pulmonar se puede tratar mediante la administración de una dosis eficaz de un inhibidor de CDK4/CDK6, incluidos palbociclib, ribociclib y abemaciclib, o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de CDK para tratamiento de PAH

Campo de invención

La hipertensión arterial pulmonar puede tratarse administrando una dosis eficaz de un inhibidor de CDK, que es un inhibidor de CDK4 y CDK6.

Antecedentes de la invención

La hipertensión pulmonar (PH) se ha clasificado previamente como primaria (idiopática) o secundaria. Recientemente, the World Health Organization (WHO) ha clasificado la hipertensión pulmonar en cinco grupos: Grupo 1: hipertensión arterial pulmonar (PAH); Grupo 2: PH con cardiopatía izquierda; Grupo 3: PH con enfermedad pulmonar y/o hipoxemia; Grupo 4: PH debida a enfermedad trombótica y/o embólica crónica; y Grupo 5: afecciones diversas (por ejemplo, sarcoidosis, histiocitosis X, linfangiomatosis y compresión de vasos pulmonares).

La hipertensión arterial pulmonar (PAH) es una enfermedad grave, compleja, progresiva y potencialmente mortal de la bascularla pulmonar, caracterizada por una vasoconstricción profunda y una proliferación anormal de células de músculo liso en las paredes de las arterias pulmonares. El estrechamiento severo de los vasos sanguíneos en los pulmones conduce a presiones arteriales pulmonares muy altas. Estas altas presiones dificultan que el corazón bombee sangre a través de los pulmones para oxigenarse. Los pacientes con ^pA^h sufren de extrema dificultad para respirar mientras el corazón lucha por bombear contra estas altas presiones. Los pacientes con PAH por lo general desarrollan aumentos significativos en la resistencia vascular pulmonar (PVR) y elevaciones sostenidas de la presión de la arteria pulmonar (PAP), que finalmente conducen a insuficiencia ventricular derecha y muerte. Los pacientes diagnosticados de PAH tienen un pronóstico desfavorable y una calidad de vida igualmente comprometida, con una esperanza de semivida de 2 a 5 años desde el momento del diagnóstico si no se tratan.

Los procedimientos actuales de tratamiento de la PAH se centran en reducir los síntomas y prolongar la vida útil del paciente y potenciar la calidad de vida. Tales procedimientos terapéuticos incluyen la administración de: vasodilatadores tales como prostaciclina, epoprostenol y sildenafil; antagonistas del receptor de endotelina, tal como bosentán; bloqueadores de los canales de calcio tales como amlodipino, diltiazem y nifedipino; anticoagulantes tales como warfarina; oxigenoterapia suplementaria y diuréticos. Cuando el tratamiento médico falla, la opción terapéutica final es el trasplante de pulmón y/o corazón-pulmón. Cada uno de estos procedimientos, sin embargo, adolece de uno o múltiples inconvenientes, tales como falta de eficacia, efectos secundarios graves, escasa conformidad del paciente y la incapacidad de prevenir la PAH. De acuerdo con lo anterior, se necesitan mejores procedimientos de tratamiento de la PAH. La presente invención aborda estas necesidades.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un inhibidor de CDK para uso en un procedimiento de tratamiento de PAH en el que el inhibidor de C^d K es un inhibidor de CDK4 y CDK6.

Dos tipos de células clave implicadas en la progresión hacia la PAH son las células del músculo liso arterial pulmonar (PASMC) y los fibroblastos adventicios de la arteria pulmonar (PAAF). La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que palbociclib afectó significativamente los efectos antiproliferativos en PASMC de rata y humana y PAAF humanos. El palbociclib también afectó significativamente los cambios en la hemodinámica, la proliferación de células vasculares pulmonares, la morfología de la arteria pulmonar y la hipertrofia del ventrículo derecho en los modelos de PAH.

El palbociclib es un inhibidor potente y selectivo de CDK4 y CDK6, que tiene la estructura:

El palbociclib se describe en WHO Drug Information, Vol. 27, No. 2, página 172 (2013). Palbociclib y las sales y formulaciones aceptables para uso farmacéutico del mismo se desvelan en la Publicación Internacional Núm. ^w O 2003/062236 y las Patentes de los Estados Unidos Núm. 6.936.612, 7.208.489 y 7.456.168; la Publicación Internacional Núm. WO 2005/005426 y las Patentes de los Estados Unidos Núm. 7.345.171 y 7.863.278; la Publicación Internacional Núm. WO 2008/032157 y la Patente de los Estados Unidos Núm. 7.781.583; la Publicación Internacional Núm. WO 2014/128588; y la Solicitud Internacional Núm. PCT/IB2016/053040.

El palbociclib está aprobado en los Estados Unidos para el tratamiento del cáncer de mama metastásico o avanzado negativo para el factor de crecimiento epidérmico humano 2 (HER2), positivo para receptor hormonal (HR) en combinación con letrozol como terapia endocrina inicial en mujeres posmenopáusicas o combinación con fulvestrant después de la progresión de la enfermedad en terapia endocrina.

De acuerdo con la invención, un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 se administra a un individuo diagnosticado con o con riesgo de desarrollar PAH que incluye, pero limitación, PAH idiopática, PAH hereditaria o familiar. En una realización, al sujeto se le diagnostica PAH idiopática o PAH hereditaria. En algunas realizaciones, el sujeto con riesgo de desarrollar PAH tiene una mutación en el gen que codifica el receptor de tipo 2 de la proteína morfogenética ósea.

La presente invención también incluye un kit para el tratamiento o prevención de la hipertensión arterial pulmonar. El kit comprende un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 y un dispositivo de administración. El dispositivo de administración se puede diseñar para administración pulmonar, tal como inhaladores, nebulizadores, insufladores, goteros y aerosoles. En otras realizaciones, el dispositivo de administración se puede diseñar para administración intravenosa o intraarterial, tal como un catéter. El inhibidor de CDK se puede formular opcionalmente para almacenamiento en el dispositivo de administración. El kit puede comprender además instrucciones para administrar el inhibidor de CDK a un individuo (por ejemplo, un ser humano) para tratar o prevenir PAH u otras enfermedades discutidas en la presente memoria. En una realización, las instrucciones elaboran y califican el modo de administración, por ejemplo, especificando los días de administración del inhibidor de CDK durante un ciclo de 28 días.

Breve descripción del (los) dibujo (s)

FIG. 1. Proliferación celular: Se realizaron ensayos de incorporación de BrdU para medir las tasas de síntesis y proliferación de ADN celular, después de que las células se trataron con palbociclib diluido en serie. Las curvas dosis-respuesta muestran que palbociclib reprimió de forma eficaz la proliferación de PASMC humanas (FIG. 1a y 1b), PAAF humana (FIG. 1c), PASMC de rata (FIG. 1d). Se realizaron ensayos de incorporación de EdU para medir las tasas de síntesis y proliferación de ADN celular, después de que las células se trataron ya sea con palbociclib diluido en serie u otro inhibidor de CDK conocido. Las curvas dosisrespuesta muestran una proliferación reprimida de las PASMC humanas (FIG. 1e), PAAF humana (FIG. 1f), y PASMC de rata (FIG. 1g).

FIG. 2. Fosforilación de Rb: Efectos de palbociclib sobre la fosforilación del producto del gen del retinoblastoma. Palbocliclib bloqueó de forma eficaz la fosforilación de Rb (fosfo-Rb) en las serinas 807 y 811 inducida por un 5% de FBS (F iG. 2a) o por PDGF-BB (FIG. 2b) en las Pa Sm C primarias humanas, mientras que tuvo escaso efecto sobre los niveles totales de Rb. Inhibición de fosfo-RB en PASMC primarias humanas para inhibidores de CDK conocidos inducidos por FBS al 10 % (FIG. 2c). 2c.

FIG. 3. Cambios hemodinámicos y estructurales asociados con la patología de la PAH en el modelo de monocrotalina de rata (MCT). FIG. 3a muestra la frecuencia de administración de los fármacos estudiados. Los resultados experimentales se muestran como presión arterial pulmonar media (MPAP; FIG. 3b), presión arterial pulmonar sistólica (SPAP; FIG. 3h), y presión arterial pulmonar diastólica (DPAP; FIG. 3i), índice de Fulton (RV/(LV+S); FIG. 3c), Espesor de la pared vascular (FiG. 3d), Densidad de los vasos intraacinares muscularizados (FIG. 3e), histopatología (FiG. 3f), puntuaciones de gravedad de la enfermedad (FIG. 3g), y peso del corazón (FIG. 3j).

FIG. 4. Cambios hemodinámicos y mejora estructural significativa en la vasculatura pulmonar en el modelo de SuHx PAH de rata. FIG. 4a muestra la frecuencia de administración de los fármacos estudiados (FIG. 4a). Los resultados experimentales se muestran como presión arterial pulmonar media (MPAP; FIG. 4b), SPAP (FIG. 4h), DPAP (FIG. 4i), índice de Fulton (RV/(LV+S); FIG. 4c), Espesor de la pared vascular (FIG. 4d), Densidad de los vasos intraacinares muscularizados (FIG. 4e), histopatología (FIG. 4f), puntuaciones de gravedad de la enfermedad (FIG. 4g), y peso del corazón (FIG. 4j).

FIG. 5. Proliferación celular evaluada en la vasculatura pulmonar. IHC de la tinción dual de aSMA/Ki67 (FIG.

5a) y CD31/fosfoRb (FIG. 5b) en secciones de pulmón de rata. Resultados experimentales pRb; mostrados como Ki67 (FIG. 5c) y fosforilación de la proteína Retinoblastoma asociada a los vasos (FIG. 5d).

Descripción detallada de la invención

La hipertensión pulmonar, como la hipertensión sistémica, no es una enfermedad única sino un grupo de enfermedades, que comparten el elemento definitorio de una presión arterial pulmonar media > 25 mm Hg. La PH se ha clasificado y dividido en 5 grupos (Galie et al. ERJ (2009) Dec.; 34(6);1219-63). Esta invención se refiere generalmente, pero no se limita a, el tratamiento del grupo 1 de the World Health Organization (WHO), o grupo de PAH, enfermedades caracterizadas por presión arterial pulmonar elevada y resistencia al flujo sanguíneo elevada debido a una microangiopatía pulmonar precapilar.

Una característica clave en el pulmón de PAH es la proliferación celular anormal, que conduce a la obliteración progresiva de la luz de la vasculatura pulmonar, dando como resultado aumentos patológicos en la resistencia vascular. La remodelación vascular pulmonar es un procedimiento activo de cambio estructural intrínsecamente ligado a modificaciones en el crecimiento celular, muerte celular, migración celular, diferenciación celular y la síntesis o degradación de la matriz extracelular. Schermuly, R.T., et al. Mecanismos de la enfermedad: hipertensión arterial pulmonar. Reseñas de la naturaleza. Cardiology 8, 443-455 (2011). Si bien ya existen un número de clases farmacológicas como terapias aprobadas en la PAH clínica, principalmente inducen vasorrelajación y reducen así, la resistencia vascular pulmonar. Además, la monoterapia puede ser inadecuada a la luz de las diferencias individuales de los pacientes. Humbert, M. & Ghofrani, H.A. Los objetivos moleculares de los tratamientos aprobados para la hipertensión arterial pulmonar. Thorax 71, 73-83 (2016). Por lo tanto, estas terapias no abordan la complejidad de la remodelación vascular.

Los cambios en la vasculatura pulmonar implican PASMC, PAAF y células endoteliales arteriales pulmonares (PAEC). Guignabert, C, et al. Pathogenesis of pulmonary arterial hypertension: lessons from cancer. European respiratory review : an official journal of the European Respiratory Society 22, 543-551 (2013). Una revisión reciente de la investigación sobre PAH discutió los "centros" de señalización de proliferación para dirigir a múltiples vías de transducción de señales. Pullamsetti, SS, et al. American journal of respiratory and critical care medicine (2016), publicado por primera vez en línea el 14 de septiembre de 2016 como DOI: 10.1164/rccm. 201606-1226PP. Otra revisión contempló la relación entre los cambios en el flujo sanguíneo pulmonar, los cambios similares al cáncer en las células endoteliales de la pared vascular pulmonar. Heppe, C.M., et al. Vascular Pharmacology 83 (2016) 17-25.

Los nuevos enfoques se han centrado en dirigirse al fenotipo pro-proliferativo que sustenta la remodelación vascular pulmonar en pacientes con PAH, con el objetivo de lograr una eficacia mejorada y una supervivencia potenciada. Ha habido algunos ejemplos en los que los fármacos oncológicos demostraron ser eficaces para ralentizar la progresión de la enfermedad de PAH en estudios preclínicos. Véase Savai, R., et al. Pro-proliferative and inflammatory signaling converge on FoxO1 transcription factor in hipertensión pulmonar. Nature medicine 20, 1289-1300 (2014); Ciuclan, L., et al. Imatinib attenuates hypoxiainduced pulmonary arterial hypertension pathology via reduction in 5-hydroxytryptamine through inhibition of tryptophan hydroxylase 1 expression. American journal of respiratory and critical care medicine 187, 78-89 (2013); y Schermuly, R.T., et al. Reversal of experimental hipertensión pulmonar by PDGF inhibition. The Journal of clinical investigation 115, 2811-2821 (2005).

Las quinasas dependientes de ciclina y las proteínas quinasas de serina/treonina relacionadas son enzimas celulares importantes que realizan funciones esenciales en la regulación de la división y proliferación celular. Las unidades catalíticas de quinasas dependientes de ciclina se activan mediante subunidades reguladoras conocidas como ciclinas. Se han identificado al menos dieciséis ciclinas de mamíferos (Johnson DG, Walker CL. Cyclins and Cell Cycle Checkpoints. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. (1999) 39:295312). Ciclina B/CDK1, Ciclina A/CDK2, Ciclina E/CDK2, Ciclina D/CDK4, Ciclina D/CDK6, y probablemente otros heterodinos incluyendo CDK3 y CDK7 son importantes reguladores de la progresión del ciclo celular. Las funciones adicionales de los heterodinos Ciclina/CDK incluyen la regulación de la transcripción, reparación del ADN, diferenciación y apoptosis (Morgan DO. Cyclin dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. (1997) 13:261 291).

La complejidad de la remodelación vascular pulmonar proporciona muchas vías de investigación tales como dirigirse al ciclo celular de proliferación que implica proteínas conocidas como quinasas dependientes de ciclina (CDK). Estas CDK se asocian con ciclinas específicas para formar un complejo de holoenzimas necesario para la actividad. Para cada etapa del ciclo proliferativo, se requieren diferentes ciclinas, y la expresión relativa de cada proteína ciclina aumenta y/o disminuye para activar periódicamente su CDK específica. Charron, T., et al. The cell cycle: a critical therapeutic target to prevent vascular proliferative disease. The Canadian journal of cardiology 22 Suppl B, 41B-55B (2006).

La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los inhibidores de CDK (CDKi) inhiben los efectos proliferativos de mitógenos en las PASMC de rata y humanas y PAAF humano, y reducen las elevaciones en hemodinámica, proliferación de células vasculares pulmonares, morfología de la arteria pulmonar e hipertrofia del ventrículo derecho en modelos de PAH.

La presente invención se basa además, en parte, en el descubrimiento de que palbociclib afectó significativamente los efectos antiproliferativos en las PASMC humanas y de rata y los PAAF humanos y afectó significativamente los cambios en la hemodinámica, la proliferación de células vasculares pulmonares, la morfología de la arteria pulmonar, y la hipertrofia del ventrículo en modelos de PAH.

Otra realización de la invención incluye un inhibidor de CDK para uso en un procedimiento de tratamiento de PAH que comprende administrar a un individuo necesitado de dicho tratamiento una cantidad eficaz de un inhibidor de CDK seleccionado de:

1. Ribociclib (7-ciclopentil-N,N-dimetil-2-((5-(piperazin-1-il)piridin-2-il)amino)-7H-pirrolo[2,3-d]pirimidin-6-carboxamida), o sales aceptables para uso farmacéutico del mismo: Un CDKi dirigido a las vías del ciclo celular ciclina D1/CDK4 y ciclina D3/CDK6, con potencial actividad antineoplásica. Ribociclib inhibe específicamente CDK4 y 6; o

2. Abemaciclib (2-pirimidinamina, N-(5-((4-etiM-piperazinil)metil)-2-piridinil)-5-fluoro-4-(4-fluoro-2-metiM-(1-metiletil)-1H-benzimidazol-6-il)), o sales aceptables para uso farmacéutico del mismo: Un CDKi dirigido a las vías del ciclo celular CDK4 y Cd K6.

Los inhibidores de CDK se desvelan en los documentos: WO03/062236, WO07140222, WO10075074, WO10020675, WO16015598, WO16015597, WO16015605, WO16015 604, WO2012/066508, WO04004632, WO11026911, WO11026904, WO 2011/101409, WO2006/074985, WO2012/061156, WO1000913, WO10009155 y WO0183469.

Se examinó palbociclib para determinar su actividad en PDGF-BB o la proliferación inducida por suero de PASMC humanas y de rata. Véase el ejemplo 1. Palbociclib inhibió de forma eficaz la proliferación inducida por PDGF-BB de PASMC primarias humanas con una IC⁵⁰ de 7,4 nM, promedio de 3 (FIG. 1a) obtenida por BrdU y expresada como unidades de fluorescencia relativa (rFU). La proliferación de PASMC primarias tanto humanas como de rata inducida por suero bovino fetal (FBS) al 5 % se inhibió de manera similar mediante el tratamiento con palbociclib (IC⁵⁰ = 7,4 nM y 27,4 nM, respectivamente, cada una es un promedio de 3) (FIG 1b y FIG. 1d. Palbociclib también fue muy potente contra otro tipo de células implicadas en la remodelación vascular, el fibroblasto adventicial (PAAF). Se inhibió la proliferación de PAAF primarios humanos inducida por suero con una IC⁵⁰ de 21,6 nM, promedio de 3 (FIG. 1c).

Para demostrar que los efectos antiproliferativos de los inhibidores de CDK sobre PASMC y PAAF se lograron mediante la inhibición farmacológica de la actividad de CDK, se perfilaron tres compuestos adicionales (abemaciclib, dinaciclib y ribociclib) en paralelo a palbociclib. La Tabla 1 proporciona los valores de IC⁵⁰ en base al % de efecto de proliferación como se presenta en la FIG. 1e, 1f y 1g.

Cabe señalar que, debido a la logística experimental, las células donantes PASMC humanas asociadas a la FIG. 1a y 1b, y FIG. 2a y 2b se generaron utilizando células de un donante, y los datos asociados a la FIG. 1e y FIG. 2c se generaron a partir de un donante diferente. Del mismo modo, el PAAf humano que sustenta la FIG. 1c y 1f procede de células donantes diferentes. Por último, las preparaciones de PASMC de rata para FIG. 1d y 1g se generaron a partir de preparaciones celulares derivadas de animales diferentes. También hubo diferencias entre los ensayos como se discutió en el ejemplo 1.

Tabla 1: Inhibición de la proliferación en hPASMC, hPAAF y rPASMC

A continuación, se examinó palbociclib para determinar sus efectos sobre la fosforilación de Rb en PASMC humanas usando análisis de western en célula. Véase el ejemplo 1. palbociclib inhibió de forma eficaz la fosforilación de PDGF-BB o Rb inducida por suero con una IC⁵⁰ de 5,2 nM (FIG. 2b) y 14,9 nM (FIG. 2a), respectivamente. . De este modo, palbociclib es muy eficaz para bloquear la proliferación de los tipos de células clave implicados en la remodelación vascular patológica en la PAH.

En estudios adicionales, en los que palbociclib se ejecutó en paralelo con abemaciclib, dinaciclib y ribociclib, se indujo la proliferación usando FBS al 10 %, y todos los inhibidores de CDK demostraron inhibición de la fosforilación de Rb inducida. Véase la Tabla 2 con base en los datos presentados en la FIG. 2c, en la cual el efecto porcentual se calcula de manera similar al efecto porcentual para la proliferación.

Tabla 2: Inhibición de la fosforilación de Rb en hPASMC

Se ha demostrado que MCT induce lesión vascular pulmonar principalmente después de la generación hepática del metabolito tóxico, monocrotalina pirrol. El modelo MCT ofrece la ventaja de varios aspectos clave de la PAH humana, incluida la remodelación vascular, la proliferación de las células del músculo liso, la disfunción endotelial, la regulación positiva de las citocinas inflamatorias y la insuficiencia del ventrículo derecho (RV). Stenmark, K.R., et al. Animal models of pulmonary arterial hypertension: the hope for etiological discovery and pharmacological cure. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology 297, L1013-1032 (2009). Para las figuras 3 y 4, Palbo es palbociclib, Sild es sildenafil, Rio es riociguat y Veh es un vehículo. En el modelo de MCT PAH descrito en el ejemplo 3, las ratas expuestas a MCT desarrollaron constantemente hipertensión pulmonar, con un aumento de las presiones arteriales pulmonares media (MPAP), sistólica (SPAP) y diastólica (DPAP). El índice de Fulton también se incrementó después de la exposición a MCT. El índice de Fulton es la siguiente relación en base al peso de:

Ventrículo derecho [RV] / (ventrículo izquierdo [LV] septo [S])

Para estos estudios, se consideró que un agente se administraba profilácticamente cuando el agente se administró por primera vez el día 0, el mismo día en el que también se administró un segundo agente, por ejemplo, MCT, para provocar el desarrollo de síntomas de PAH en el modelo. Sin embargo, se consideró que un agente se administraba terapéuticamente cuando el agente se administraba después de que el animal había desarrollado síntomas de PAH, por ejemplo, el agente se administró por primera vez el día 14 del estudio.

Como se esperaba, sildenafil (50 mg/kg/dosis; PO BID), cuando se dosificó profilácticamente (día 0-28), redujo significativamente los aumentos de MPAP relacionados con PAH (FIG. 3b), S^pA^p (FIG. 3h), DPAP (FIG. 3i), Índice de Fulton (FIG. 3c) y peso del corazón (FIG. 3j. Cuando se administra terapéuticamente (día 14-28); sin embargo, el sildenafil, una terapia aprobada para la PAH, solo demostró una reducción pequeña y no significativa en MPAP, SPAP, DPAP, índice de Fulton y peso del corazón en este estudio.

Palbociclib (100 mg/kg/día; PO; QD), cuando se administró terapéuticamente (días 14-28), superó con creces las expectativas. FIG. 3a muestra la frecuencia de administración de los fármacos estudiados. El palbociclib no solo igualó sino que superó los efectos hemodinámicos y fisiológicos positivos del sildenafil cuando se dosificó profilácticamente.

En términos histomorfométricos, palbociclib, pero no sildenafil, mejoró drásticamente y en algunos casos normalizó completamente los cambios estructurales en la vasculatura pulmonar (FIG. 3f). El grupo al que se le administró palbociclib (día 14-28) tuvo un espesor promedio de la pared del vaso significativamente menor (hasta 0,58x MCT) (tinción de elastina) tanto para intraacinar (< 50 m de diámetro externo) como para preacinar (51-100 m de diámetro externo) en las arterias pulmonares en comparación con el grupo al que se le administró vehículo/MCT, excediendo los efectos beneficiosos de sildenafil (día 0-28) (0,76x MCT), mientras que el grupo de sildenafil (día 14-28) tuvo poco efecto en estas mediciones. (FIG. 3d). Palbociclib (día 14-28) también provocó una mayor reducción de la densidad de los vasos intraacinares completamente muscularizados que sildenafil, que sólo fue eficaz cuando se dosificó del día 0 al 28 (tinción con SMA; FIG. 3e). Además, el grupo al que se le administró palbociclib (día 14-28) también tuvo puntuaciones de gravedad de la enfermedad significativamente más bajas (intervalo 0-2; media 1) en comparación con el grupo al que se le administró vehículo/MCT (intervalo 1-4; media 3), nuevamente superando el grupo tratado con sildenafil (día 0-28; intervalo 1-4; media 2,5) (F ⁱG. 3g).

La hipoxia crónica más el bloqueo del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Semaxinib/Su5416) provocan PAH grave en ratas. Stenmark, K.R., infra. En el modelo de Su5416/Hx PAH, como se describe en el ejemplo 4, se evaluó palbociclib (100 mg/kg/día; PO; QD) frente a dos fármacos comúnmente usados para tratar pacientes con PAH: sildenafil (30 mg/kg/dosis; PO; BID) y riociguat (10 mg/kg/día, PO; QD). Lang, M., et al. The soluble guanylate cyclase stimulator riociguat ameliorates pulmonary hypertension induced by hypoxia and SU5416 in rats. PloS one 7, e43433 (2012). Los tres fármacos se administraron desde los días 7 a 28 (FIG. 4a). Aunque el tratamiento profiláctico con sildenafil redujo significativamente la MPAP (FIG. 4b), SPAP (FIG. 4h) y DPAP (FIG. 4i), y el tratamiento profiláctico con riociguat redujo significativamente la MPAP y la DPAP como se esperaba, el tratamiento terapéutico con cualquiera de los agentes resultó en sólo una ligera reducción en el índice de Fulton en este estudio, y ningún cambio en el peso de los pulmones o el corazón en comparación con el grupo vehículo/Su5416/Hx. Palbociclib, sin embargo, restauró los criterios de valoración hemodinámicos más cercanos al grupo de control no enfermo, reemplazando tanto asildenafil como a riociguat (FIG. 4b que compara los resultados de MPAP y la FIG. 4c que compara los valores del índice de Fulton). Al observar los tratamientos terapéuticos, sólo el grupo de palbociclib mostró una reducción significativa en el índice de Fulton (FIG. 4c) y el peso del corazón (FIG, 4j).

En términos histomorfométricos, palbociclib, pero no sildenafil o riociguat, mejoró drásticamente y en algunos casos normalizó completamente los cambios estructurales en la vasculatura pulmonar (FIG. 4f). El análisis histomorfométrico mostró que palbociclib, pero no riociguat o sildenafil, redujo significativamente el espesor promedio de la pared de los vasos para los vasos intraacinares y preacinares (FIG. 4d). El grupo al que se le administró palbociclib también tuvo una densidad de vasos intraacinares muscularizados significativamente menor (0,68x Su5416/Hx) en comparación con el grupo con vehículo/Su5416/Hx. Las medias de los grupos con a los que se administró de sildenafil y riociguat no fueron estadísticamente significativamente diferentes del grupo de vehículo/SuHx (FIG. 4e). Además, el grupo al que se administró palbociclib tuvo puntuaciones de gravedad de la enfermedad casi completamente normalizadas (intervalo 0-1,5; media 0,25) en comparación con el grupo de vehículo/Su5416/Hx (intervalo 3-4; media 3,65), superando los grupos dosificados con sildenafil y riociguat (FIG. 4g). Sorprendentemente, el tratamiento con palbociclib dio como resultado una supresión casi completa de los cambios hemodinámicos y una mejora estructural significativa en la vasculatura pulmonar en el modelo de Su5416/Hx PAH de rata, superando tanto al sildenafil como al riociguat.

El análisis de IHC de secciones de pulmón de rata con tinción dual aSMA/Ki67- y dual CD31/phosphoRb (FIG. 5a y FIG. 5b) de los estudios in vivo mostró que MCT provocaba un aumento significativo de las células proliferantes K¡67+ asociadas a los vasos (FIG. 5c) y una tendencia al aumento del número de células foshoRb+ asociadas a los vasos (FIG. 5d. Véase el ejemplo 5. Estos criterios de valoración específicos de la diana se redujeron drásticamente a niveles de control mediante la administración de palbociclib (FIG. 5c). De manera similar, el tratamiento con Su5416/combinado con hipoxia indujo aumentos significativos en las células Ki67+ y pRb+ asociadas a los vasos en la vasculatura pulmonar. El palbociclib revirtió completamente estos aumentos; mientras que el sildenafil o el riociguat no mostraron ningún efecto beneficioso significativo sobre estos biomarcadores. El palbociclib suprimió la proliferación celular en la vasculatura pulmonar en modelos de enfermedad PAH.

La invención incluye un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 para uso en un procedimiento de tratamiento de PAH en el que el procedimiento incluye el uso del inhibidor de CDK palbociclib como monoterapia o también en una terapia de combinación en la cual a un paciente necesitado de dicho tratamiento se le administra palbociclib en combinación con uno o más fármacos (denominados también agente activo) aprobados para el tratamiento de PAH, o para el tratamiento de un trastorno relacionado divulgado en la presente memoria, o como una combinación de los mismos. Por ejemplo, un agente activo adicional puede incluir, pero no se limita a, una prostaglandina (por ejemplo, epoprostenol, treprostinil, iloprost, selexipag), un antagonista del receptor de endotelina (por ejemplo, bosentán, ambrisentán, macitentán), un inhibidor de guanilato ciclasa (por ejemplo, riociguat), vasodilatadores (por ejemplo, prostaciclina y sildenafil), bloqueadores de los canales de calcio (por ejemplo, amlodipino, diltiazem y nifedipino); anticoagulantes (por ejemplo, warfarina) y diuréticos. La referencia a un fármaco, por ejemplo, sildenafil, incluye sildenafil y todas las sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, citrato de sildenafil.

En otro aspecto, un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 se utiliza en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de PAH. En diversas realizaciones, el medicamento se formula para administración oral, incluidas formulaciones farmacéuticas tanto de liberación inmediata como de liberación sostenida. En otras realizaciones, el medicamento se formula para su administración por inhalación. En todas estas realizaciones, la invención proporciona formas de dosis unitarias del medicamento

La presente invención también incluye el uso de inhibidores de CDK marcados isotópicamente, que son inhibidores de CDK4 y CDK6, en los que uno o más átomos se sustituyen por un átomo que tiene una masa atómica o número másico diferente de la masa atómica o número másico que se encuentra habitualmente en la naturaleza. Los ejemplos de isótopos que se pueden incorporar a los compuestos de la presente invención incluyen isótopos de hidrógeno, carbono, nitrógeno, oxígeno, fósforo, azufre, flúor y cloro, tales como 2H, 3H, 13C, 11C, 14C, 15N, 18O, 17O, 31P, 32P, 35S, 18F y 36Cl, respectivamente. Los compuestos de la presente invención, y las sales aceptables para uso farmacéutico de dichos compuestos que contienen los isótopos mencionados anteriormente y/u otros isótopos de otros átomos están dentro del alcance de esta invención. Ciertos compuestos marcados isotópicamente de la presente invención, por ejemplo aquellos en los que se incorporan isótopos radiactivos tales como 3H y 14C, son útiles en ensayos de distribución de fármacos y/o sustratos en tejidos. Los isótopos tritiados, es decir, 3H, y carbono-14, es decir, 14C, son particularmente preferidos por su facilidad de preparación y detectabilidad. Además, la sustitución con isótopos más pesados tal como deuterio, es decir, 2H, puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas que resultan de una mayor estabilidad metabólica, por ejemplo, una semivida in vivo aumentada o requisitos de dosificación reducidos y, por consiguiente, puede ser preferente en algunas circunstancias. Los inhibidores de CDK marcados isotópicamente generalmente se pueden preparar llevando a cabo los procedimientos desvelados en los esquemas y/o en los ejemplos y preparaciones a continuación, sustituyendo un reactivo marcado isotópicamente fácilmente disponible por un reactivo no marcado isotópicamente.

Cuando se hace referencia a palbociclib en la presente memoria, incluye 6-acetil-8-ciclopentil-5-metil-2-{[5-(piperazin-1-il)piridin-2il]amino}pirido[2,3-d]pirimidin-7(8H)-ona, o las sales farmacéuticamente aceptables de la misma que forman formulaciones farmacéuticamente aceptables que comprenden sales, que incluyen, pero no se limitan a, sales de adición de ácido, solvatos y N-óxidos de palbociclib. Véase el documento WO 03/062236.

El término "sujeto", como se usa en la presente memoria, se refiere a un ser humano, un primate, animales de compañía (incluido un gato o un perro). El término "sujeto" incluye un paciente.

El término "tratar", como se usa en la presente memoria, se refiere a revertir, aliviar, inhibir el progreso o prevenir el trastorno o afección a la que se aplica dicho término, o prevenir uno o más síntomas de tal afección o trastorno. El término "tratamiento", como se usa en la presente memoria, se refiere al acto de tratar, como "tratar" se define inmediatamente anteriormente.

Un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 se puede formular y administrar en una amplia variedad de formas de dosificación oral y parenteral, incluyendo la administración transdérmica y rectal. Los expertos en la técnica reconocerán que las siguientes formas de dosificación pueden comprender como el componente activo, el inhibidor de CDK o una sal o solvato aceptable para uso farmacéutico correspondiente del inhibidor de CDK.

Esta invención también comprende una formulación farmacéutica que comprende una cantidad eficaz para uso terapéutico de un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 junto con un vehículo, diluyente o excipiente aceptable para uso farmacéutico del mismo. Para preparar composiciones farmacéuticas con los compuestos de la presente invención, los portadores farmacéuticamente aceptables pueden ser sólidos o líquidos. Las preparaciones en forma sólida incluyen polvos, comprimidos, píldoras, cápsulas, sellos, supositorios y gránulos dispensables. Un portador sólido puede ser una o más sustancias que también pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, aglutinantes, conservantes, agentes desintegradores de comprimidos o un material encapsulante. Para las formas de dosificación en comprimidos, dependiendo de la dosis, el inhibidor de CDK puede constituir desde 1 % en peso a 80 % en peso de la forma de dosificación, típicamente de 5 % en peso a 60 % en peso, más típicamente de aproximadamente 10 % en peso a aproximadamente 35 % en peso, o incluso más típicamente de aproximadamente 15 % en peso a aproximadamente 25 % en peso de la forma de dosificación. En realizaciones específicas, el inhibidor de CDK comprende aproximadamente 20 % en peso de la forma de dosificación en peso.

En las formas de dosificación sólidas de la invención, el portador puede comprender una variedad de excipientes farmacéuticamente aceptables, que incluyen, por ejemplo, diluyentes, desintegrantes, aglutinantes, lubricantes, deslizantes y agentes de la superficie activa. Las formulaciones también pueden incluir excipientes tales como conservantes, antioxidantes, aromatizantes y colorantes, así como otros excipientes conocidos en la técnica.

Las formas de dosificación sólidas, tales como los comprimidos, contienen por lo general diluyentes, por ejemplo, lactosa (monohidrato, monohidrato secado por pulverización, anhidro y similares), manitol, xilitol, dextrosa, sacarosa, sorbitol, azúcar comprimible, celulosa microcristalina, celulosa en polvo, almidón, almidón pregelatinizado, dextratos, dextrano, dextrina, dextrosa, maltodextrina, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, fosfato de calcio tribásico, sulfato de calcio, carbonato de magnesio, óxido de magnesio, poloxámeros, óxido de polietileno, hidroxipropilmetilcelulosa y mezclas de los mismos. Pueden ser apropiados diferentes tipos de celulosa microcristalina para su uso en las formulaciones descritas en la presente memoria. Los ejemplos de celulosa microcristalina incluyen los tipos Avicel®: PH101, PH102, PH103, PH105, PH112, PH113, PH200, PH301, y otros tipos de celulosa microcristalina, tales como la celulosa microcristalina silicificada (SMCC). En algunas realizaciones, el diluyente se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, lactosa monohidrato, manitol, sorbitol, xilitol, carbonato de magnesio, fosfato cálcico dibásico, fosfato cálcico tribásico o mezclas de los mismos. En determinadas realizaciones, el diluyente comprende celulosa microcristalina. En algunas realizaciones, el diluyente comprende uno o más tipos de celulosa microcristalina, por ejemplo Avicel® PH105, Avicel® PH200 o mezclas de los mismos. En algunas de tales realizaciones, el diluyente excluye lactosa monohidrato. En otras de tales realizaciones, el diluyente comprende celulosa microcristalina y además comprende lactosa monohidrato. Los diluyentes comprenden frecuentemente desde aproximadamente el 25 % en peso hasta aproximadamente el 75 % en peso de la forma de dosificación sólida, y preferiblemente desde aproximadamente el 50 % en peso hasta aproximadamente el 75 % en peso de la forma de dosificación.

Las formas de dosificación sólidas contienen frecuentemente desintegrantes. Los ejemplos de desintegrantes incluyen almidón glicolato de sodio, carboximetilcelulosa de sodio, carboximetilcelulosa de calcio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, polivinilpirrolidona, metilcelulosa, celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa sustituida con alquilo inferior, almidón, almidón pregelatinizado y alginato de sodio. En algunas realizaciones, el desintegrante es crospovidona. Se puede usar cualquier grado de crospovidona; por ejemplo, los grados CL, CL-SF y XL de crospovidona son apropiados para su uso en las formulaciones descritas en la presente memoria. Los ejemplos específicos incluyen Kollidon, Kollidon CL®, Kollidon CL-M®, Polyplasdone XL®, Polyplasdone XL-10® y Polyplasdone INF-10®. En algunas realizaciones, el portador comprende al menos un desintegrante seleccionado del grupo que consiste en crospovidona, croscarmelosa sódica y almidón glicolato de sodio. En realizaciones específicas, el desintegrante es crospovidona. Los desintegrantes comprenden frecuentemente desde aproximadamente 1 % en peso a aproximadamente 25 % en peso, preferiblemente desde aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 20 % en peso, más preferiblemente desde aproximadamente 5 % en peso a aproximadamente 10 % en peso de la forma de dosificación.

Se pueden usar aglutinantes para impartir cualidades cohesivas a la formulación de un comprimido. Los aglutinantes apropiados incluyen celulosa microcristalina, gelatina, azúcares, polietilenglicol, gomas naturales y sintéticas, polivinilpirrolidona, almidón pregelatinizado, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. En algunas realizaciones, el aglutinante se selecciona del grupo que consiste en celulosa microcristalina, hidroxipropilcelulosa e hidroxipropilmetilcelulosa. En realizaciones específicas, el aglutinante es celulosa microcristalina, por ejemplo Avicel® PH105. Cuando están presentes, los aglutinantes pueden comprender desde aproximadamente 0 % en peso hasta aproximadamente 15 % en peso, o desde aproximadamente 0,2 % en peso hasta aproximadamente 10 % en peso de la forma de dosificación. En algunas realizaciones, el aglutinante comprende aproximadamente un 5 % en peso a aproximadamente un 10 % en peso de la forma de dosificación. En realizaciones particulares, el aglutinante comprende aproximadamente el 10 % en peso de la forma de dosificación.

Las formas de dosificación sólidas contienen frecuentemente uno o más lubricantes. Los ejemplos de lubricantes incluyen estearato de magnesio, estearato de calcio, estearato de zinc, estearilfumarato de sodio, mezclas de estearato de magnesio con lauril sulfato de sodio o mezclas de dos o más de estos. En algunas realizaciones, el lubricante es estearato de magnesio y/o estearilfumarato de sodio. En algunas realizaciones, el lubricante es estearato de magnesio. En algunas de tales realizaciones, la forma de dosificación sólida es un comprimido que comprende estearato de magnesio intragranular y extragranular. En otras realizaciones, la forma de dosificación sólida es un comprimido que comprende estearato de magnesio intragranular y estearilfumarato de sodio extragranular. Cuando están presentes, los lubricantes comprenden con frecuencia desde aproximadamente 0,25 % en peso a aproximadamente 10 % en peso, preferiblemente desde aproximadamente 0,5 % en peso a aproximadamente 6 % en peso de la forma de dosificación.

Los comprimidos también pueden comprometer deslizantes, por ejemplo, dióxido de silicio, dióxido de silicio coloidal, silicato de magnesio, trisilicato de magnesio, talco y otras formas de dióxido de silicio, tales como silicatos agregados y sílice hidratada. En algunas realizaciones, el deslizante es dióxido de silicio. Cuando están presentes, los deslizantes pueden comprender desde aproximadamente 0 % en peso hasta aproximadamente 10 % en peso, preferiblemente desde aproximadamente 0,2 % en peso hasta aproximadamente 5 % en peso, o desde aproximadamente 0,5 % en peso hasta aproximadamente 2 % en peso del comprimido.

Los comprimidos pueden incluir opcionalmente agentes de superficie activa, tales como lauril sulfato de sodio y polisorbato 80. Cuando están presentes, los agentes de superficie activa pueden comprender de 0 % en peso a 10 % en peso, o preferiblemente de 0,2 % en peso a 5 % en peso del comprimido.

En general, las formas de dosificación sólidas de la invención se preparan según procedimientos habituales en química farmacéutica. Se pueden incorporar excipientes seleccionados junto con el ingrediente farmacéutico activo en uno o ambos compartimentos extragranulares o intragranulares.

La dosis eficaz para uso terapéutico del inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 variará de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. Las dosis típicas para adultos serán de aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 3000 mg por día. La cantidad de componente activo en una preparación de dosis unitaria se puede variar o ajustar desde aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 500 mg, preferiblemente de aproximadamente 25 mg a aproximadamente 125 mg según la aplicación particular. Si se desea, la composición también puede contener otros agentes terapéuticos compatibles. A un individuo necesita de dicho tratamiento con un inhibidor de CDK que es un inhibidor de CDK4 y CDK6 se le administra una dosificación de aproximadamente 0,6 a aproximadamente 500 mg por día, y preferentemente de aproximadamente 25 mg a 125 mg por día, ya sea individualmente o en múltiples dosis durante un período de 24 horas. Tal tratamiento se puede repetir a intervalos sucesivos durante el tiempo que sea necesario.

Ejemplos de ensayo

Ejemplo 1

Ensayo de proliferación celular. Las PASMC y PAAF primarios de individuos humanos normales (ScienCell Research Laboratories, San Diego, CA, EE. UU.) y las PASMC primarias de rata (Cell Applications, San Diego, CA, EE. UU.) se sembraron en placas CellBIND® de 96 pocillos en la modificación de Dulbecco del medio de Eagle (DMEM) que contiene suero fetal bovino (FBS) al 5 % y se priva de suero durante 24 h en DMEM que contiene FBS al 0,1 %. Las células se agregaron primero con diferentes concentraciones de palbociclib (por triplicado) durante 30 minutos, y luego se añadieron 30 ng/ml de PDGF-BB o FBS al 5 % para estimular la proliferación celular. Las células se mantuvieron durante 48 h antes de evaluar la tasa de proliferación usando el kit de luminiscencia de ELISA de proliferación celular BrdU (bromodesoxiuridina) (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). Se agregó BrdU al medio 16 h antes de la cuantificación de la incorporación de BrdU. Este procedimiento se usó para generar datos tal como se presentan en al menos la FIG. 1a, 1b, 1c y 1d. Se calcularon los valores de IC⁵⁰ para cualquier inhibidor dado determinando la concentración de compuesto necesaria para inhibir el 50 % de la respuesta aplicada al sistema. Los valores de IC⁵⁰ se derivaron de la ecuación logística de cuatro parámetros que se ajustó a los datos de respuesta a la concentración del compuesto.

Alternativamente, en lugar de usar BrdU, se puede usar EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina). En primer lugar las células se incubaron previamente con diferentes concentraciones del inhibidor de CDK durante 30 minutos, y luego se agregó FBS al 5 % para estimular la proliferación celular. Las células se mantuvieron durante 24 h antes de evaluar la tasa de proliferación usando el Ensayo EDU Click-iT EdU Alexa Fluor® 647 HCS (Thermofisher Scientific, EE.UU.). Se agregó EdU al medio 16 h antes de la cuantificación de la incorporación de EdU. La proliferación se cuantificó escaneando las placas de 96 pocillos usando una plataforma automatizada de imágenes de alto contenido equipada con filtros microscópicos de fluorescencia apropiados para tinción DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol) o Hoechst y tintes Cianina5 como parte del ensayo Click-iT. Las células proliferantes positivas para EdU detectadas en Cianina5 se cuantificaron y normalizaron al número total de células por pocillo donde el número total de células por célula se identificó mediante la señal de DAPI o Hoechst. Luego se calculó el % de efecto:

(C a ri prom. de células proliferantes por concentración - Cant. mín. prom. de proliferación)

(Cant. máx. prom. de proliferación - Cant. mín. prom. de proliferación)

La cantidad promedio de células proliferantes por concentración de inhibidor de CDK con FBS presente. Los inhibidores de CDK utilizados son palbociclib, abemaciclib, dinaciclib (que no forma parte de la invención) y ribociclib.

La cantidad mínima de proliferación (cant. mín. de proliferación) se basa en el número de células en los pocillos en los que no se agrega FBS y no hay presente inhibidor de CDK.

La cantidad máxima de proliferación (cant. máx. de proliferación) se basa en el número de células en los pocillos en los que se agrega FBS y no hay presente inhibidor de CDK.

Este procedimiento se usó para generar datos como se presentan en al menos la FIG. 1e, 1f y 1g.

Análisis de Western en la célula. Las PASMC primarias de sujetos humanos normales se cultivaron y se privaron de suero como se describió anteriormente. En primer lugar las células se incubaron previamente con diferentes concentraciones de palbociclib durante 60 minutos, y luego se agregó FBS al 5 % o FBS al 10 % o PDGF-BB 30 ng/ml para estimular la proliferación celular y la fosforilación de Rb. El efecto de palbociclib sobre la fosforilación de Rb se evaluó 24 h más tarde, usando un ensayo western en la célula según las instrucciones del fabricante (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE, EE.UU.). El Rb fosforilado se midió usando un anticuerpo monoclonal de conejo anti-fosfo-Rb (Ser807/811) (Cell Signaling Technology, Inc., Danvers, MA, EE. UU.), seguido de la detección con anticuerpo secundario anticonejo de cabra marcado con colorante fluorescente infrarrojo IRDye 800CW. Los niveles de actina se midieron usando anticuerpos monoclonales antiactina de ratón (pan Ab-5) (Fisher Scientific Pittsburgh, PA, EE. UU.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, EE. UU.), y seguidos de la detección con anticuerpo secundario de antiratón de cabra marcado con IRDye 680RD. Véase la FIG. 2a en la que se utilizó un 5% de FBS, FIG. 2b en la que se utilizó PDGF-BB, y FIG. 2c en la que se utilizó un 10% de FBS.

Ejemplo 2

Modelo de PAH inducido por MCT en ratas: Ratas macho Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) (260-280 g; grupo de control de vehículo, n = 6; todos los demás grupos, n = 15) recibieron MCT (50 mg/kg, SC; 1 ml/kg de BW) disuelto en vehículo (33,3 % de HCl 1 N, 14,8 % de NaOH 1 N, 52,2 % de diH²O) o vehículo solo el día 0. Se administró sildenafil (50 mg/kg/dosis; BID) (5 ml/kg; PO) ya sea profilácticamente desde los días 0-28 o terapéuticamente desde los días 14-28. El palbociclib (100 mg/kg; QD) se administró terapéuticamente (días 14-28). Se volvieron a suspender tanto el sildenafil como el palbociclib en vehículo (metilcelulosa al 0,5 %) y se administraron por vía oral (5 ml/kg). El día 28, los animales fueron anestesiados con isoflurano, se evaluaron los parámetros hemodinámicos y se recogieron los tejidos después de la eutanasia.

Ejemplo 3

Modelo de PAH inducido por MCT en ratas: Ratas macho Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) (260-280 g; grupo de control de vehículo, n = 6; todos los demás grupos, n = 15) recibieron MCT (50 mg/kg, SC; 1 ml/kg de BW) disuelto en vehículo (33,3 % de HCl 1 N, 14,8 % de NaOH 1 N, 52,2 % de diH²O) o vehículo solo el día 0. Se administró sildenafil (50 mg/kg/dosis; BID) (5 ml/kg; PO) ya sea profilácticamente desde los días 0-28 o terapéuticamente desde los días 14-28. El palbociclib (100 mg/kg; QD) se administró terapéuticamente (días 14-28). Se volvieron a suspender tanto el sildenafil como el palbociclib en vehículo (metilcelulosa al 0,5 %) y se administraron por vía oral (5 ml/kg). El día 28, los animales fueron anestesiados con isoflurano, se evaluaron los parámetros hemodinámicos y se recogieron los tejidos después de la eutanasia.

Mediciones hemodinámicas - estudio de monocrotalina (MCT): El día 28, los animales fueron anestesiados mediante isofluorano al 2 % en un ventilador de presión positiva. La hemodinámica pulmonar se midió usando un transductor de presión precalibrado en animales ventilados con presión positiva de isoflurano. Las presiones arteriales sistémicas y pulmonares en estado estacionario se midieron usando un catéter Millar Solid State Mikro-tip (Millar Instruments, Houston, TX) introducido en el tronco arterial pulmonar a nivel del arco aórtico a través de la arteria carodida derecha. Los valores hemodinámicos se calcularon automáticamente mediante el sistema de adquisición de datos fisiológicos, ADI Chart (ADI Instruments, Colorado Springs, CO) (Plato BioPharma).

Ejemplo 4

Hipertensión arterial pulmonar inducida por SuHx: Se obtuvieron ratas Sprague-Dawley de Charles River Laboratories (200-300 g; control de vehículo, n = 5; todos los demás grupos, n = 10). Las ratas recibieron Semaxinib disuelto en DMSO el día 0, seguido de alojamiento en oxígeno bajo (13 %) hasta el día 28. El sildenafil (30 mg/kg/dosis; BID), el riociguat (10 mg/kg, QD) o el palbociclib (100 mg/kg; QD) se administraron en vehículo (metilcelulosa al 0,5 %) desde los días 7-28. Las evaluaciones hemodinámicas terminales y la necropsia se realizaron el día 28 de una manera similar al estudio MCT.

Mediciones hemodinámicas Estudio Su/Hx: El día 28, los animales fueron anestesiados mediante inyección intramuscular de ketamina/xilazina (80/10 mg/kg). Se insertó un catéter Millar en la arteria pulmonar y se midieron la presión pulmonar y la hemodinámica como describen Stringer et al., (1981) Catheterization of the pulmonary artery in the closed-chest rat. J. Appl. Physiol. 51, 1047-1050. Los valores hemodinámicos se calcularon usando el software NOTOCORDHem (NOTOCORD, Inc., Croissy sur Sienne, Francia) (CorDynamics).

Medición de la hipertrofia de RV. Después de la extracción del corazón en la necropsia, se extrajeron las aurículas y los grandes vasos. El RV se separó del LV y S. Se midieron los pesos húmedos del RV y LV S para calcular el índice de Fulton.

Ejemplo 5

Preparación de tejidos. Bajo anestesia, los animales se desangraron y la circulación pulmonar se lavó abundantemente con solución salina oxigenada (animales del ejemplo 3 [MCT]) o heparizinada (animales del ejemplo 4 [Su5416/Hx]). La tráquea, los pulmones y el corazón se extrajeron intactos de la cavidad torácica y se colocaron en solución salina helada. Se extrajeron los lóbulos del pulmón derecho, se pesaron y se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido. Se usó una jeringa de 10 ml llena de fijador (NBF al 10 %) con una aguja de punta roma incorporada (20 g) para inflar el lóbulo del pulmón izquierdo y se cerró la vía aérea para mantenerla constantemente expandida. A continuación, el pulmón izquierdo se fijó por inmersión en NBF al 10 % durante < 48 horas y luego se transfirió a EtOH al 70 % durante < 5 días.

Análisis histomorfométrico. Se usaron tres secciones transversales de 3-5 pm de espesor del lóbulo pulmonar izquierdo para el análisis histomorfométrico. Las puntuaciones generales de gravedad de la enfermedad se determinaron mediante una evaluación con microscopio óptico de secciones de pulmón teñidas con hematoxilina y eosina (H&E) por un patólogo veterinario certificado por la junta. Las puntuaciones variaron desde 0 (ausente), 1 (mínimo), 2 (leve), 3 (moderado), 4 (marcado) a 5 (grave) y se asignaron según el porcentaje aproximado del tejido afectado por los cambios tisulares (inflamatorios, degenerativos, vasculares y/o proliferativos) característicos del modelo de PAH. El espesor promedio de la pared del vaso se evaluó usando secciones de pulmón preparadas con una tinción de elastina de Verhoeffvan Gieson modificada. El análisis de imágenes se realizó usando un muestreo de campo aleatorio (Visiopharm newCAST) del 10 % del área de tejido con identificación asistida por un observador de los vasos intraacinares y preacinares y la aplicación de una sonda nucleadora para medir el espesor de la pared del vaso. La densidad de los vasos intraacinares completamente muscularizados se evaluó de manera similar usando secciones teñidas con aSMA/Ki67 IHC duales y recuento asistido por observador de > 70 % muscularizado (es decir, SMA+), seccionadas transversalmente, < 50 m de diámetro externo, vasos intraacinares con lumen identificable. Se recontaron las células Ki67+ y pRb+ asociadas a vasos en secciones de pulmón teñidas con aSMA/Ki67 IHC y CD31/pRb IHC, respectivamente, usando un muestreo de campo aleatorio del 10 % del área de tejido e identificación asistida por observador de las células Ki67+ o pRb+ asociadas con las paredes (es decir, en la íntima o media) de los vasos < 100 m de diámetro externo.

Inmunohistoquímica. Antígeno nuclear dual a-SMA/Ki67: Todas las etapas de IHC se realizaron en secciones de 3 pm de espesor, fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE) en un aparato para tinción inmunohistoquímico automático Leica Bond Rx. El instrumento fue programado para hornear y desparafinar los portaobjetos. El anticuerpo primario, aSMA antihumano (policlonal de conejo ab5694, Abcam, Cambridge, MA) se diluyó 1:200 en Primary Antibody Diluent Bond™ (PV6123), se aplicó a los portaobjetos, se incubó durante 30 minutos y se detectó usando el kit de detección Polymer Refine AP-Red Bond™ (DS9390, Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL). Esta etapa fue seguida por una recuperación de epitopo inducida térmicamente de 20 minutos usando la solución Epitope Retrieval 1 Bond™ (ER1) (AR9961, Leica Biosystems). El anticuerpo secundario, anti-Ki67 (antígeno nuclear monoclonal de ratón Ki-67 [MM1] RTU, PA0118 [Leica]) se aplicó durante 15 minutos seguido de detección con el sistema de detección Polymer Refine HRP DAB Bond™ (DS9800). Los portaobjetos se contratiñeron, se deshidrataron y se revistieron con cubreobjetos.

CD31/fosfoRb dual: Las etapas iniciales fueron iguales que las anteriores. La recuperación del epitopo inducida térmicamente se realizó durante 20 minutos con la solución Epitope Retrieval 2 (ER2) Bond™ (AR9640). El anticuerpo primario, anti-fosfoRb (fosfo-Rb policlonal de conejo [ser807/811], 9308, Cell Signaling Technology, Danvers, MA) diluido 1: 600 en Primary Antibody Diluent Bond™ se aplicó a los portaobjetos y se incubó durante 30 minutos. El kit de detección Polymer HRP-DAB Refine Bond™ se usó después del anticuerpo primario. Esta etapa fue seguida por una recuperación de epitopo inducida térmicamente de 10 minutos usando la solución Epitope Retrieval 1 Bond™ (ER1) (AR9961, Leica Biosystems). El anticuerpo secundario, anti-CD31 (monoclonal de conejo [EPR3094], ab76533, Abcam, Cambridge, MA) se aplicó durante 45 minutos seguido de detección con el kit de detección Polymer Refine AP-Red Bond™ (DS9390, Leica Biosystems). Los portaobjetos se contratiñeron, se deshidrataron y se revistieron con cubreobjetos.

Análisis estadístico

Los datos se presentan como la media ± S.E.M. Los análisis estadísticos entre los grupos se realizaron mediante el análisis de varianza de una vía (ANOVA) seguido de la prueba de comparación múltiple de Tukey (GraphPad Prism 6, GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). El nivel de significación estadística se estableció en el valor P ajustado por multiplicidad de 0,05 (etiquetado como f o *), o 0,01 (etiquetado como f f o **).

Claims (3)

REIVINDICACIONES

1. Un inhibidor de CDK para uso en un procedimiento de tratamiento de PAH, en el que el inhibidor de CDK es un inhibidor de CDK4 y CDK6.

2. Un inhibidor de CDK para uso en un procedimiento de tratamiento de PAH, como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el inhibidor de CDK es ribociclid, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.

3. Un inhibidor de CDK para uso en un procedimiento de tratamiento de PAH, como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el inhibidor de CDK es abemaciclib, o una sal aceptable para uso farmacéutico del mismo.