CN109843297A

CN109843297A - 治疗pah的抗增殖剂

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Publication number: CN109843297A
Application number: CN201780064690.9A
Authority: CN
Inventors: S·M·埃文斯
Original assignee: SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: SmithKline Beecham Ltd; Pfizer Inc
Priority date: 2016-10-20
Filing date: 2017-10-09
Publication date: 2019-06-04
Also published as: CA3040815A1; EP3804724A1; RU2019111887A3; JP2021038265A; US20210186974A1; EP3804724B1; EP3528812A1; ES2934846T3; AU2017345367A1; RU2019111887A; ES2852349T3; US10849903B2; MX2019004602A; CA3040815C; EP3528812B1; US20190240226A1; SG11201902523UA; IL266026A; TW201827054A; BR112019005526A2

Abstract

可通过施用有效剂量的CDK抑制剂治疗肺高血压和相关疾病，如肺动脉高压，所述的CDK抑制剂包括帕博西尼，6‑乙酰基‑8‑环戊基‑5‑甲基‑2‑{[5‑(哌嗪‑1‑基)吡啶‑2基]氨基}吡啶并[2,3‑d]嘧啶‑7(8H)‑酮或其药学上可接受的盐。

Description

治疗PAH的抗增殖剂

技术领域

可通过施用有效剂量的CDK抑制剂治疗肺高血压和相关疾病，如肺动脉高压，所述的CDK抑制剂包括帕博西尼(palbociclib)，6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。

发明背景

肺高血压(PH)先前已被分类为原发性(特发性)或继发性。最近，世界卫生组织(WHO)已将肺高血压分为5组：第1组：肺动脉高压(PAH)；第2组：具有左心脏疾病的PH；第3组：具有肺病及/或低氧血症的PH；第4组：由慢性血栓栓塞性及/或栓塞性疾病造成的PH；以及第5组：其它状况(例如结节病、组织细胞增多病X、淋巴管瘤病及肺血管压迫)。

肺动脉高压(PAH)是一种严重、复杂、进行性且威胁生命的肺血管疾病，其特征在于强烈的血管收缩和肺动脉壁中平滑肌细胞的异常增殖。肺部血管的严重狭窄导致肺动脉压非常高。这些高压使心脏难以泵送血液通过被氧合的肺。具有PAH的患者由于心脏努力挣扎以对抗这些高压来泵送血液，而遭受呼吸极度短促。具有PAH的患者通常发展肺血管阻力(PVR)显著增加和肺动脉压力(PAP)持续升高，其最终导致右心室衰竭和死亡。被诊断为PAH的患者的预后差且生活质量同样受损，如果未被治疗的话，从诊断时起平均预期寿命为2至5年。

目前治疗PAH的方法侧重于减轻症状及延长患者寿命并提高生活质量。这类治疗方法包括施用：血管扩张剂，诸如前列环素(prostacyclin)、依前列醇(epoprostenol)和西地那非(sildenafil)；内皮素受体拮抗剂，诸如波生坦(bosentan)；钙通道阻断剂，诸如氨氯地平(amlodipine)、地尔硫(diltiazem)和硝苯地平(nifedipine)；抗凝剂，诸如华法林(warfarin)；补充氧疗法和利尿剂。当医学治疗失败时，最后的治疗选择为肺及/或心-肺移植。然而，这些方法的每一种都存在一种或多种缺点，例如缺乏有效性、副作用严重、患者依从性低及无法预防PAH。因此，需要更好的治疗PAH的方法。本发明解决这些需求。

发明概述

本发明提供一种通过施用有效剂量的CDK抑制剂(包括帕博西尼)治疗PAH和其它相关疾病和病症的方法。

涉及朝PAH进展的二种关键细胞类型为肺动脉平滑肌细胞(PASMC)和肺动脉外膜成纤维细胞(PAAF)。本发明部分基于如下发现：帕博西尼显著影响人和大鼠PASMC及人PAAF的抗增殖作用。帕博西尼亦显著影响PAH模型中血液动力学、肺血管细胞增殖、肺动脉形态和右心室肥大的变化。

帕博西尼为CDK4和CDK6的有效和选择性抑制剂，具有下列结构：

WHO Drug Information，Vol.27，No.2，第172页(2013)中描述了博西尼。帕博西尼及其药学上可接受的盐和制剂已被公开于下列文献中：国际公布第WO 2003/062236号和美国专利编号6,936,612、7,208,489和7,456,168；国际公布第WO 2005/005426号和美国专利第7,345,171和7,863,278号；国际公布第WO 2008/032157号和美国专利第7,781,583号；国际公布第WO 2014/128588号；以及国际申请第PCT/IB2016/053040号。通过引用将上述各参考文献的全部内容并入本说明书。

帕博西尼在美国被批准与来曲唑(letrozole)组合作为停经后妇女的初始内分泌疗法或在用内分泌疗法时疾病进展后与氟维司群(fulvestrant)组合用于治疗激素受体(HR)阳性、人表皮生长因子2(HER2)阴性的晚期或转移性乳癌。

在本发明的另一个实施方案中，对被诊断患有或处于发生肺高血压或PAH的风险中的个体施用帕博西尼，该肺高血压或PAH包括，但不限于特发性PAH、遗传性或家族性PAH和继发性肺高血压(例如由肺栓塞、肺气肿、肺纤维化和先天性心脏病引起的高血压)。在一个实施方案中，所述的个体被诊断有特发性PAH或遗传性PAH。在一些实施方案中，所述的处于发生PAH的风险中的个体在编码2型骨形态发生蛋白受体的基因中具有突变。

本发明亦包括用于治疗或预防肺动脉高压的套装产品。在一个实施方案中，所述的套装产品包含帕博西尼和给药器具。该给药器具可经过设计用于肺部递送，诸如吸入器、喷雾器、吹入器、滴管和雾化器。在其它实施方案中，所述的给药器具可经过设计用于静脉内或动脉内递送，诸如导管。帕博西尼可视需要地被配制以储存在给药器具中。该套装产品可进一步包含用于对个体(例如人)施用帕博西尼以治疗或预防本说明书中所讨论的PAH或其它疾病的说明书。在一个实施方案中，例如，通过明确说明在28天周期期间施用帕博西尼的日子，所述的说明书阐述并使给药方式合格。

附图简单说明

图1。细胞增殖：以经系列稀释的帕博西尼处理细胞后，进行BrdU掺入测定法以测量细胞DNA合成率和增殖。该剂量-响应曲线显示帕博西尼有效抑制人PASMC(图1a和1b)、人PAAF(图1c)、大鼠PASMC(图1d)的增殖。以经系列稀释的帕博西尼或另一种已知的CDK抑制剂处理细胞后，进行EdU掺入测定法以测量细胞DNA合成率和增殖。该剂量-响应曲线显示人PASMC(图1e)、人PAAF(图1f)和大鼠PASMC(图1g)的增殖被抑制。

图2。Rb磷酸化：帕博西尼对视网膜母细胞瘤基因产物磷酸化的作用。帕博西尼有效地阻断人初代PASMC中由5％FBS(图2a)或PDGF-BB(图2b)诱导的在丝氨酸807和811的Rb磷酸化(磷酸-Rb)，同时其对总Rb水平几乎没有作用。已知CDK抑制剂抑制由10％FBS诱导的人初代PASMC中的磷酸-Rb(图2c)。

图3。大鼠野百合碱(MCT)模型中与PAH病理学相关的血液动力学变化和结构变化。图3a显示所研究药物的给药频率。以平均肺动脉压(MPAP；图3b)、肺动脉收缩压(SPAP；图3h)和肺动脉舒张压(DPAP；图3i)、富尔顿(Fulton)指数(RV/(LV+S)；图3c)、血管壁厚度(图3d)、肌化腺泡内血管密度(图3e)、组织病理学(图3f)、疾病严重性评分(图3g)和心脏重量(图3j)显示实验结果。

图4。大鼠SuHx PAH模型中肺脉管系统的血液动力学变化和明显结构改善。图4a显示所研究药物的给药频率(图4a)。以平均肺动脉压(MPAP；图4b)、SPAP(图4h)、DPAP(图4i)、富尔顿指数(RV/(LV+S)；图4c)、血管壁厚度(图4d)、肌化腺泡内血管密度(图4e)、组织病理学(图4f)、疾病严重性评分(图4g)和心脏重量(图4j)显示实验结果。

图5。在肺脉管系统中评估的细胞增殖。大鼠肺切片中双重染色的αSMA/Ki67(图5a)和CD31/磷酸Rb(图5b)的IHC。实验结果pRb；显示位Ki67(图5c)和血管相关上午视网膜母细胞瘤蛋白磷酸化(图5d)。

发明的详细说明

肺高血压(如全身性高血压)并非单一疾病，而是一组疾病，此组疾病共有平均肺动脉压力≥25mm Hg的界定要素。PH已被分类并被分成5组(Galie等人，ERJ(2009)Dec.；34(6)；1219-63)。一般而言本发明涉及，但不限于，治疗世界卫生组织(WHO)第1组或PAH组的疾病，该组疾病的特征为由于前毛细血管肺微血管病所导致的肺动脉压力升高和血流阻力增加。

PAH肺中的关键特征为异常细胞增殖，此导致肺脉管系统的腔管进展性闭塞，造成血管阻力病理性增加。肺血管重塑为主动结构改变过程，其内在地与细胞生长、细胞死亡、细胞迁移、细胞分化和细胞外基质合成或降解的修饰关联。Schermuly，R.T.等人，Mechanisms of disease：pulmonary arterial hypertension.Naturereviews.Cardiology8，443-455(2011)。虽然已有许多药理学类别被批准作为临床PAH疗法，但它们主要诱导血管舒张，从而降低肺血管阻力。再者，鉴于患者的个别差异，单一疗法可能不充分。Humbert,M.&Ghofrani,H.A.The molecular targets of approvedtreatments for pulmonary arterial hypertension.Thorax 71，73-83(2016)。因此，这些疗法没有解决血管重塑的复杂性。

肺脉管系统的变化涉及PASMC、PAAF和肺动脉内皮细胞(PAEC)。Guignabert，C，等人，Pathogenesis of pulmonary arterial hypertension：lessons fromcancer.European respiratory review：an official journal of the EuropeanRespiratory Society 22，543-551(2013)。新近对PAH研究的综述讨论了增殖信号传导“转发站(hub)”以靶向信号转导的多个途径。Pullamsetti，SS，等人，American journal ofrespiratory and critical care medicine(2016)，于2016年9月14日首次在线以DOI：10.1164/rccm.201606-1226PP发表。另一篇综述考虑了肺部血流的变化与肺血管壁内皮细胞的癌样变化之间的关系。Heppe，C.M.，等人，Vascular Pharmacology 83(2016)17-25。

新方法已着重于靶向支持PAH患者的肺血管重塑的促增殖表型，目的是实现效能提高和存活增强。已经有几个在临床前研究中显示肿瘤药物有效减缓PAH疾病进展的实例。见Savai，R.，等人，Pro-proliferative and inflammatory signaling converge onFoxO1transcription factor in pulmonary hypertension.Nature medicine 20，1289-1300(2014)；Ciuclan，L.，等人，Imatinib attenuates hypoxia-induced pulmonaryarterial hypertension pathology via reduction in 5-hydroxytryptamine throughinhibition of tryptophan hydroxylase 1expression.American journal ofrespiratory and critical care medicine187，78-89(2013)；以及Schermuly，R.T.，等人，Reversal of experimental pulmonary hypertension by PDGF inhibition.TheJournal of clinical investigation 115，2811-2821(2005)。

细胞周期蛋白依赖性激酶和相关的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶为重要的细胞酶，其在调节细胞分裂和增殖中执行重要功能。细胞周期蛋白依赖性激酶催化单位被称为细胞周期蛋白的调节亚基激活。现已鉴定了至少十六种哺乳动物细胞周期蛋白(Johnson DG，Walker CL.Cyclins and Cell Cycle Checkpoints.Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.(1999)39：295 312)。细胞周期蛋白B/CDK1、细胞周期蛋白A/CDK2、细胞周期蛋白E/CDK2、细胞周期蛋白D/CDK4、细胞周期蛋白D/CDK6及可能其它外差回路(heterodyne)(包括CDK3和CDK7)为细胞周期进程的重要调节剂。细胞周期蛋白/CDK外差回路的额外功能包括调节转录、DNA修复、分化和凋亡(Morgan DO.Cyclin dependent kinases：engines，clocks，andmicroprocessors.Annu.Rev.Cell.Dev.Biol.(1997)13：261 291)。

肺血管重塑的复杂性提供许多研究途径，诸如靶向涉及被称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的蛋白质的细胞增殖周期。这些CDK与特定的细胞周期蛋白联结以形成活性所必要的全酶复合物。对增殖周期的每个步骤而言，需要不同的细胞周期蛋白，且各细胞周期蛋白的相对表达增加及/或减少以周期性激活其特异性CDK。Charron，T.，等人，The cellcycle：a critical therapeutic target to prevent vascular proliferativedisease.The Canadian journal of cardiology 22Suppl B，41B-55B(2006)。

本发明部分基于如下发现：CDK抑制剂(CDKi)抑制人和大鼠PASMC及人PAAF中的有丝分裂原的增殖作用并在PAH模型中减少血液动力学、肺血管细胞增殖、肺动脉形态和右心室肥大的升高。

本发明进一步部分基于以下发现：帕博西尼显著影响人和大鼠PASMC及人PAAF中的抗增殖作用，并在PAH模型中显著影响血液动力学、肺血管细胞增殖、肺动脉形态和右心室肥大的变化。

本发明的另一个实施方案包括治疗PAH(肺动脉高压)的方法，该方法包括对有该需要的个体施用有效量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐。

本发明的另一个实施方案包括治疗PAH(肺动脉高压)的方法，该方法包括对有该需要的个体施用有效量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。

本发明的另一个实施方案包括治疗PAH的方法，该方法包括对有该需要的个体施用有效量的CDK抑制剂。

本发明的另一个实施方案包括治疗PAH的方法，该方法包括对有该需要的个体施用有效量的CDK抑制剂，该CDK抑制剂选自下列化合物或其药学上可接受的盐中的任一种：

曲来西尼(trilaciclib)(G1T28)、G1T38、欧弗西地(alvocidib)SEL-24、密西尼(milciclib)、AGM-130、AT 7519、BAY 1143572/1112054、BCD-115、CYC065、FLX 925、SHR6390、TG-02、A-1467729、ABC 1183、AZD 5576、BPI 1178、塞内辛(senexin)、ICEC0942、CCT-68127、CCT-251921、ON 123300、渥鲁西尼(voruciclib)、SEL120-34、SRX-3177、TP 1287、SY1365、UD-017或VS2-370。

本发明的另一个实施方案包括治疗PAH的方法，该方法包括对有该需要的个体施用有效量的CDK抑制剂，该CDK抑制剂选自：

1.利博西尼(ribociclib)(7-环戊基-N,N-二甲基-2-((5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-羧酰胺)或其药学上可接受的盐：一种CDKi，其靶向细胞周期蛋白D1/CDK4和细胞周期蛋白D3/CDK6细胞周期途径，具有潜在的抗肿瘤活性。利博西尼特异性抑制CDK4和CDK6；

2.艾贝马西尼(abemaciclib)(2-嘧啶胺N-(5-((4-乙基-1-哌嗪基)甲基)-2-吡啶基)-5-氟-4-(4-氟-2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-苯并咪唑-6-基))或其药学上可接受的盐：一种CDKi，其靶向CDK4和CDK6细胞周期途径；或

3.地纳西尼(dinaciclib)(2-[(2S)-1-[3-乙基-7-[(1-氧离子基吡啶-1-鎓-3-基)甲氨基]吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基]哌啶-2-基]乙醇)或其药学上可接受的盐：一种CDKi，其选择性地靶向CDK1、CDK2、CDK5和CDK9。

本发明的另一个实施方案包括治疗PAH的方法，它包括对有该需要的个体施用有效量的CDK抑制剂或其药学上可接受的盐，包括下列文献的非穷尽性列表中的任何一篇或组合中提供了该CDK抑制剂：WO03/062236、WO07140222、WO10075074、WO10020675、WO16015598、WO16015597、WO16015605、WO16015604、WO2012/066508、WO04004632、WO11026911、WO11026904、WO2011/101409、WO2006/074985、WO2012/061156、WO1000913、WO10009155和WO0183469。

治疗的相关疾病包括下列疾病的任何一种或多种或组合：肺毛细血管血管瘤病(PCH)(第1组)、由于左心脏疾病造成的肺高血压(第2组PH)、由于肺病及/或低氧造成的肺高血压(第3组)、慢性血栓栓塞性肺高血压(第4组)、病因不明或具有多因素病因的肺高血压(第5组)、特发型肺血管疾病或包括任何形式的急性和慢性肺损伤和炎症的肺病(ARDS、ILD、肺炎、COPD、哮喘)或原发性肺血管病(特发性肺高血压、胶原蛋白血管相关性肺高血压、肝脏疾病相关性肺高血压、药物相关性肺高血压、HIV相关性肺高血压、血凝块诱发的肺高血压)。本发明的另一个实施方案包括治疗本说明书中所讨论的相关疾病的方法，它包括对有需要治疗的个体施用有效量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐或无该等盐。

在由PDGF-BB或血清诱导的人和大鼠PASMC的增殖中检查了帕博西尼的活性。见实施例1。帕博西尼有效地抑制由PDGF-BB诱导的人初代PASMC的增殖，通过BrdU所得的IC₅₀为7.4nM，为3组的平均值(图1a)，并以相对荧光单位(rFU)表示。由5％胎牛血清(FBS)诱导的人类和大鼠初代PASMC二者的增殖被帕博西尼处理类似抑制(IC₅₀分别为7.4nM和27.4nM，各为3组的平均值)(图1b和图1d)。帕博西尼在对抗涉及血管重塑的另一种细胞类型，外膜成纤维细胞(PAAF)亦非常有效。由血清诱导的人初代PAAF的增殖受抑制，IC₅₀＝21.6nM(为3组的平均值)(图1c)。

为了证明CDK抑制剂对PASMC和PAAF的抗增殖作用是经由CDK的活性的药理学抑制来实现，与帕博西尼平行获得了另外三种化合物(艾贝马西尼、地纳西尼和利博西尼)的特性。表1提供了如图1e、1f和1g中所呈现的基于％增殖作用的IC₅₀值。

应注意的是，由于实验后勤工作，与图1a和1b，及图2a和2b关联的人类PASMC供体细胞是使用来自一位供体的细胞产生的，而与图1e和2c关联的数据是由不同的供体产生的。同样地，支持图1c和1f的人类PAAF亦从不同供体细胞得到的。最后，图1d和1g的大鼠PASMC制备物是由获自不同动物的细胞制备物产生的。如实施例1中所讨论，测定法之间亦有差异。

表1：hPASMC、hPAAF和rPASMC中的增殖抑制

然后使用细胞中蛋白质印迹分析来检查帕博西尼对人PASMC的Rb磷酸化的作用。见实施例1。帕博西尼有效抑制由PDGF-BB或血清诱导的Rb磷酸化的IC₅₀分别为5.2nM(图2b)和14.9nM(图2a)。因此，帕博西尼在阻断PAH中涉及病理性血管重塑的键细胞类型的增殖中非常有效。

在另外的研究中，其中与艾贝马西尼、地纳西尼和利博西尼平行操作帕博西尼，使用10％FBS诱导增殖，且所有CDK抑制剂均显示出抑制该经诱导的Rb磷酸化。见表2，其基于图2c中呈现的数据，其中与增殖的百分比效应类似计算了所述的百分比效应。

表2：hPASMC中Rb的磷酸化的抑制

化合物	平均IC<sub>50</sub>(nM)，N＝6
		帕博西尼	64.18
地纳西尼	5.65
		艾贝马西尼	262.04
利博西尼	351.83

已显示MCT主要在肝脏产生毒性代谢物野百合碱吡咯后诱导肺血管损伤。MCT模型提供了人类PAH的几个关键方面的优点，包括血管重塑、平滑肌细胞增殖、内皮功能障碍、炎性细胞因子上调及右心室(RV)衰竭。Stenmark，K.R.，等人，Animal models of pulmonaryarterial hypertension：the hope for etiological discovery and pharmacologicalcure.American journal of physiology.Lung cellular and molecular physiology297，L1013-1032(2009)。对于图3和4，Palbo为帕博西尼，Sild为西地那非，Rio为利奥西呱(riociguat)，而Veh为载体。在实施例3中所描述的MCT PAH模型中，暴露于MCT的大鼠一致性发生了肺高血压，其平均肺动脉压(MPAP)、肺动脉收缩压(SPAP)和肺动脉舒张压(DPAP)增加。暴露于MCT后富尔顿(Fulton)指数亦增加。富尔顿指数为下式基于重量的比例：

右心室[RV]/(左心室[LV]+隔膜[S])

对于这些研究，当在第0天首次施用药剂时，该药剂被认为是预防性施用，同一天亦施用第二药剂(例如MCT)以引起该模型中发生PAH症状。然而，当动物已发生PAH症状后施用药剂时，该药剂被认为是治疗性施用，例如在研究的第14天首次施用该药剂。

如所预期，当预防性给药(第0-28天)时，西地那非(50毫克/千克/剂量；PO，BID)显著减少MPAP(图3b)、SPAP(图3h)、DPAP(图3i)、富尔顿指数(图3c)和心脏重量(图3j)的PAH-相关增加。然而，当治疗性施用时(14-28天)；本研究中西地那非(已被批准用于PAH的疗法)仅显示出MPAP、SPAP、DPAP、富尔顿指数和心脏重量的小幅且不显著的降低。

当治疗性施用(14-28天)时，帕博西尼(100毫克/千克/天；PO；QD)远超预期。图3a显示了所研究的药物的给药频率。当预防性给药时，帕博西尼不仅符合而且超过西地那非的阳性血液动力学和生理学作用。

在组织形态计量学上，帕博西尼显著地改善(且在一些情况下完全正常化)肺脉管系统的结构变化，但西地那非没有(图3f)。与施用载体/MCT的组相比较，施用帕博西尼的组(14-28天)显著降低了腺泡内肺动脉(≤50μm外径)和腺泡前肺动脉(51-100μm外径)的平均血管壁厚度(弹性蛋白染色)(降至0.58x MCT)，超出了西地那非的有利效果(0-28天)(0.76x MCT)，而西地那非组(14-28天)对这些测量值的作用很小(图3d)。相较于西地那非，帕博西尼(14-28天)亦使完全肌化的腺泡内血管的密度降低更多，西地那非仅在第0至28天给药时有效。(αSMA染色；图3e)。此外，与施用载体/MCT的组(范围1-4；平均值3)相比较，施用帕博西尼的组(14-28天)亦显著降低了疾病严重性评分(范围0-2；平均值1)，再次优于施用西地那非的组(0-28天；范围1-4；平均值2.5)(图3g)。

慢性低氧加上血管内皮生长因子(VEGF)受体阻断(塞美西尼(Semaxinib)/Su5416)在大鼠中引起严重PAH。Stenmark，K.R.，见下文。如实施例4中所描述，在Su5416/HxPAH模型中，相对于常用来治疗PAH患者的二种药物：西地那非(30毫克/千克/剂量；PO；BID)和利奥西呱(10毫克/千克/天，PO；QD)，评估了帕博西尼(100毫克/千克/天；PO；QD)。Lang，M.，等人，The soluble guanylate cyclase stimulator riociguat amelioratespulmonary hypertension induced by hypoxia and SU5416 in rats.PloS one 7，e43433(2012)。所有三种药物均在第7至28天施用(图4a)。虽然如预期，以西地那非预防性治疗显著降低MPAP(图4b)、SPAP(图4h)和DPAP(图4i)，且以利奥西呱预防性治疗显著降低MPAP和DPAP，但与载体/Su 5416/Hx组相比较时，本研究中使用这二种药剂任一药剂的治疗性治疗仅导致富尔顿指数略为降低，且肺或心脏重量无变化。然而，帕博西尼将血液动力学终点恢复至接近非患病的对照组，取代了西地那非和利奥西呱二者(图4b比较MPAP结果，且图4c比较富尔顿指数值)。当检视治疗性治疗时，仅帕博西尼组显示出富尔顿指数(图4c)和心脏重量显著降低(图4j)。

在组织形态计量学上，帕博西尼显著改善(且在一些情况下完全正常化)了肺血管中的结构变化，但西地那非或利奥西呱没有(图4f)。组织形态计量学分析显示帕博西尼显著降低腺泡内血管和腺泡前血管二者的平均血管壁厚度，但利奥西呱或西地那非没有(图4d)。与载体/Su5416/Hx组相比较，施用帕博西尼的组亦显著降低肌化的腺泡内血管密度(0.68x Su5416/Hx)。施用西地那非和利奥西呱的组的平均值与载体/SuHx组的差别没有统计学上的显著不同(图4e)。此外，与载体/Su5416/Hx组(范围3-4；平均值3.65)相比较，施用帕博西尼的组的疾病严重性评分几乎完全正常化(范围0-1.5；平均值0.25)，优于施用西地那非和利奥西呱的组(图4g)。令人惊讶地，在大鼠Su5416/Hx PAH模型中，帕博西尼治疗导致血液动力学改变接近完全抑制及肺脉管系统的结构显著改善，优于西地那非和利奥西呱。

IHC分析来自活体内研究的双重αSMA/Ki67染色和双重CD31/磷酸Rb染色的大鼠肺切片(图5a和5b)显示，MCT引起血管相关的Ki67⁺增殖细胞的显著增加(图5c)且血管相关的磷酸Rb⁺细胞数量有增加的趋势(图5d)。见实施例5。通过施用帕博西尼，这些靶特异性终点显著降低至对照水平(图5c)。类似地，Su5416/治疗与低氧的组合诱导了肺脉管系统中血管相关的Ki67⁺和pRb⁺细胞显著增加。帕博西尼完全逆转了这些增加；然而，西地那非或利奥西呱显示对这些生物标记物没有明显的有益作用。在PAH疾病模型中帕博西尼抑制了肺脉管系统中的细胞增殖。

本发明包括一种治疗PAH或本说明书中所公开的病症的方法，其中该方法包括使用帕博西尼作为单一疗法或者也包括将帕博西尼用于组合疗法中，该组合疗法中将帕博西尼与经批准用于治疗PAH、用于治疗与PAH相关的病症或用于治疗本说明书中所公开的病症或它们的组合的一种或多种药物(亦称为活性剂)联合施用有需要治疗的患者。例如，另外的活性剂可包括，但不限于前列腺素(例如依前列醇(epoprostenol)、曲前列素(treprostinil)、伊洛前列素(iloprost)、西利前列素(selexipag))、内皮素受体拮抗剂(例如波生坦、安立生坦(ambrisentan)、马西替坦(macitentan))、鸟苷酸环化酶抑制剂(例如利奥西呱)、血管扩张剂(例如前列环素和西地那非)、钙通道阻断剂(例如氨氯地平、地尔硫和硝苯地平)；抗凝剂(例如华法林)和利尿剂。对药物例如西地那非的提及包括西地那非和所有药学上可接受的盐，例如西地那非柠檬酸盐。

在另一方案中，帕博西尼用于制造用于治疗或预防PAH的药物。再在另一方案中，帕博西尼用于制造治疗或预防如本说明书中所讨论的相关疾病的药物。在各种实施方案中，所述的药物被配成用于经由口服施用，包括立即释出和持续释出的药物制剂。在其它实施方案中，所述的药物被配成用于经由吸入施用。在所有这些实施方案中，本发明提供所述药物的单位剂量形式。

本发明亦包括经同位素标记的化合物，该经同位素标记的化合物与帕博西尼相同，除了有一个或多个原子被具有与自然界中常见的原子质量或质量数不同的原子质量或质量数的原子所替代。可被掺入本发明化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟和氯的同位素，诸如分别为²H、³H、¹³C、¹¹C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸O、¹⁷O、³¹P、³²P、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。含有上述同位素及/或其它原子的其它同位素的本发明化合物、其前药及该化合物或该前药的药学上可接受的盐在本发明的范围内。本发明的某些经同位素标记的化合物，例如那些被掺入放射性同位素(诸如³H和¹⁴C)的化合物乃有用于药物及/或底物组织分布分析。特别优选氚化(即³H)和碳-14(即¹⁴C)同位素，因其容易制备和检测。此外，以较重的同位素的取代，诸如氘(即²H)，可因代谢稳定性较高而提供某些治疗优势，例如体内半衰期增加或剂量需求降低，因此，在某些情况下可能是优选的。通常可以通过进行下文中所公开的方案及/或实施例和制备方法中的程序制备经同位素标记的帕博西尼及其前药，但以易于取得的经同位素标记的试剂来取代非经同位素标记的试剂。

当本说明书中提及帕博西尼时，其包括6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或形成包含盐的药学上可接受的制剂的其药学上可接受的盐，其包括，但不限于帕博西尼的酸加成盐、溶剂化物和N-氧化物。见WO 03/062236(以引用方式将其并入本说明书)。

本说明书中所使用的术语“个体”系指人、灵长类动物、伴侣动物(包括猫或狗)。术语“个体”包括患者。

本说明书中所使用的术语“治疗”系指逆转、减轻、抑制进展或预防该术语适用的失调或病症或预防该病症或失调的一种或多种症状。本说明书中所使用的术语“治疗”系指治疗的行为，如上句所定义的“治疗”。

可以以广泛多种口服和肠胃道外剂型配制和施用帕博西尼，包括经皮和直肠给药。本领域技术人员将认识到，下列剂型可包含帕博西尼或帕博西尼的相应药学上可接受的盐或溶剂化物作为活性成分。

本发明亦包含药物制剂，该药物制剂包含治疗有效量的帕博西尼与药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。为了制备具有本发明化合物的药物组合物，药学上可接受的载体可为固体或液体。固体形式的制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体载体可以是亦可作为稀释剂、调味剂、黏合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的一种或多种物质。在片剂剂型方面，根据剂量，帕博西尼可构成该剂型的1wt％至80wt％，通常为该剂型的5wt％至60wt％，更典型为约10wt％至约35wt％，或再更典型为约15wt％至约25wt％。在具体的实施方案中，帕博西尼占该剂型(按重量计)的约20wt％。

在本发明的固体剂型中，所述的载体可包含各种药学上可接受的赋形剂，包括，例如稀释剂、崩解剂、黏合剂、润滑剂、助流剂和表面活性剂。制剂亦可包括赋形剂，诸如防腐剂、抗氧化剂、调味剂和着色剂，及本领域中已知的其它赋形剂。

固体剂型，诸如片剂，通常含有稀释剂，例如乳糖(单水合物、喷雾干燥的单水合物、无水物，等)、甘露醇、木糖醇、右旋糖、蔗糖、山梨醇、可压缩的糖、微晶纤维素、粉状纤维素、淀粉、预胶化之淀粉、葡萄糖结合剂(dextrate)、葡聚醣、糊精、右旋糖、麦芽糖糊精、碳酸钙、磷酸氢钙、磷酸钙、硫酸钙、碳酸镁、氧化镁、泊洛沙姆、聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素及它们的混合物。不同类型的微晶纤维素可能适合用于本说明书中所描述的制剂中。微晶纤维素的实例包括类型：PH101、PH102、PH103、PH105、PH112、PH113、PH200、PH301和其它类型的微晶纤维素，诸如硅化的微晶纤维素(SMCC)。在一些实施方案中，所述的稀释剂选自由下列各项组成的组：微晶纤维素、乳糖一水合物、甘露醇、山梨醇、木糖醇、碳酸镁、磷酸氢钙、磷酸钙或它们的混合物。在某些实施方案中，所述的稀释剂包含微晶纤维素。在一些实施方案中，所述的稀释剂包含一种或多种类型的微晶纤维素，例如或它们的混合物。在一些这类实施方案中，所述的稀释剂不包括乳糖一水合物。在其它这类实施方案中，所述的稀释剂包含微晶纤维素，且进一步包含乳糖一水合物。稀释剂常占该固体剂型的约25wt％至约75wt％，且优选占所述剂型的约50wt％至约75wt％。

固体剂型常含有崩解剂。崩解剂的实例包括淀粉羟乙酸钠、羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、聚乙烯吡咯啶酮、甲基纤维素、微晶纤维素、低级烷基取代的羟丙基纤维素、淀粉、预胶化淀粉和藻酸钠。在一些实施方案中，所述的崩解剂为交联聚维酮。任何等级的交联聚维酮均可使用；例如CL、CL-SF和XL等级的交联聚维酮适合用于本说明书中所描述的制剂中。具体实例包括Kollidon、Kollidon Kollidon Polyplasdone Polyplasdone 和Polyplasdone在一些实施方案中，所述的载体包含至少一种选自由下列各项组成的组的崩解剂：交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠和淀粉羟乙酸钠。在特别的实施方案中，所述的崩解剂为交联聚维酮。崩解剂常占所述剂型的约1wt％至约25wt％，优选为约5wt％至约20wt％，更优选为约5wt％至约10wt％。

粘合剂可用于赋予片剂制剂粘附性质。合适的粘合剂包括微晶纤维素、明胶、糖、聚乙二醇、天然和合成树胶、聚乙烯吡咯啶酮、预胶化淀粉、羟丙基纤维素及羟丙基甲基纤维素。在一些实施方案中，所述的粘合剂选自由下列各项组成的组：微晶纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。在特别的实施方案中，所述的粘合剂为微晶纤维素，例如当存在时，粘合剂可占所述剂型的约0wt％至约15wt％或约0.2wt％至约10wt％。在一些实施方案中，所述的粘合剂占所述剂型的约5wt％至约10wt％。在特别的实施方案中，所述的粘合剂占所述剂型的约10wt％。

固体剂型常含有一种或多种润滑剂。润滑剂的实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂富马酸钠、硬脂酸镁与十二烷基硫酸钠的混合物或两种或更多种这类物质的混合物。在一些实施方案中，所述的润滑剂为硬脂酸镁及/或硬脂酰富马酸钠。在一些实施方案中，所述的润滑剂为硬脂酸镁。在一些这类实施方案中，所述的固体剂型为包含颗粒内和颗粒外硬脂酸镁的片剂。在其它实施方案中，所述的固体剂型为包含颗粒内硬脂酸镁和颗粒外硬脂酰富马酸钠的片剂。当存在时，润滑剂通常占所述剂型的约0.25wt％至约10wt％，优选为约0.5wt％至约6wt％。

片剂亦可能包含助流剂，例如二氧化硅、胶态二氧化硅、硅酸镁、三硅酸镁、滑石及其它形式的二氧化硅，诸如聚集型硅酸盐和水合二氧化硅。在一些实施方案中，所述的助流剂为二氧化硅。当存在时，助流剂可占所述片剂的约0wt％至约10wt％，优选为约0.2wt％至约5wt％，或约0.5wt％至约2wt％。

片剂可视需要包含表面活性剂，诸如月桂基硫酸钠和聚山梨酯80。当存在时，表面活性剂可占所述片剂的0wt％至10wt％，或优选为0.2wt％至5wt％。

一般而言，根据制药化学中常用的方法制备本发明的固体剂型。所选择的赋形剂可与活性药物成分一起被掺入颗粒外或颗粒内隔室中的一个或二者。

帕博西尼的治疗有效剂量将在每天约0.01毫克/千克体重至约100毫克/千克体重之间变化。典型的成人剂量将为每天约0.1毫克至约3000毫克。通常，该帕博西尼的治疗有效的成人剂量为每天75毫克、100毫克或125毫克。根据特定应用，单位剂量制剂中的活性组分的量可在约0.1毫克至约500毫克，优选为约25毫克至约125毫克之间变化或调整。若需要时，所述的组合物亦可含有其它可配伍的治疗剂。需要以帕博西尼治疗的个体的施用剂量为每天约0.6至约500毫克，且优选为每天约25毫克至125毫克，在24小时之期间内一次性施用或以多个剂量施用所述的剂量。只要必需，可以以连续的间隔重复进行该治疗。

测定法实施例

实施例1

细胞增殖测定法：将来自正常人类个体的初代PASMC和PAAF(ScienCell研究实验室，美国加州圣地亚哥)和大鼠的初代PASMC(Cell Applications，美国加州圣地亚哥)平皿接种在96孔板中的含有5％胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中，且在含有0.1％FBS的DMEM中血清饥饿24小时。首先将细胞与不同浓度的帕博西尼预培育30分钟(一式三份)，然后加入30ng/ml PDGF-BB或5％FBS以刺激细胞增殖。将细胞保持48小时，然后使用细胞增殖ELISA BrdU(Cell Proliferation ELISA BrdU)(溴脱氧尿苷)发光套装产品(Roche Diagnostics公司，德国曼海姆)评估增殖速率。在培养基中加入BrdU，16小时后再定量BrdU结合。使用此程序产生至少呈现在图1a、1b、1c和1d中的数据。通过测定抑制50％反应时需要施加至该系统的化合物的浓度来计算任何指定的抑制剂的IC₅₀值。IC₅₀值从拟合至该化合物浓度反应数据的四参数逻辑计算方程式导出。

或者，可以不使用BrdU，而使用EdU(5-乙炔基-2'-脱氧尿苷)。首先将细胞与不同浓度的CDK抑制剂预温育30分钟，然后加入5％FBS以刺激细胞增殖。将细胞保持24小时，然后使用EDU Click-iT EdU Alexa 647 HCS测定法(Thermofisher Scientific，美国)评估增殖速率。在培养基中加入EdU，16小时后再定量EdU结合。使用配备适当的荧光显微过滤器的自动化高含量成像平台扫描96孔板以定量增殖，该荧光显微过滤器用于作为Click-iT测定法的一部分的DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或Hoechst染色和Cyanine5染料。定量以Cyanine5检测的增殖性EdU阳性细胞并对每孔的总细胞数标准化，其中通过DAPI或Hoechst信号鉴定每孔的总细胞数。然后计算％效应：

含有FBS的每个CDK抑制剂浓度的增殖细胞的平均量。所使用的CDK抑制剂为帕博西尼、艾贝马西尼、地纳西尼和利奥西呱。

增殖的最小量基于其中未添加FBS且无CDK抑制剂存在的孔中的细胞数。

增殖的最大量基于其中添加了FBS且无CDK抑制剂存在的孔中的细胞数。

此程序用来产生至少在图1e、1f和1g中呈现的数据。

细胞内蛋白质印迹分析：如上所述培养来自正常人个体的初代PASMC且使其血清饥饿。首先将细胞与不同浓度的帕博西尼预温育60分钟，然后加入5％FBS或10％FBS或30ng/ml PDGF-BB以刺激细胞增殖和Rb磷酸化。24小时后，根据制造商的说明书(Li-CorBiosciences公司，美国内布拉斯加州林肯市)，使用细胞内蛋白质印迹分析评估帕博西尼对Rb磷酸化的影响。使用兔单株抗体抗磷酸-Rb(Ser807/811)(Cell SignalingTechnology公司，美国麻萨诸塞州丹佛市)测量磷酸化Rb，接着以经IRDye 800CW红外荧光染料标记的山羊抗兔二级抗体检测。使用小鼠抗肌动蛋白单株抗体(pan Ab-5)(FisherScientific公司，美国宾州匹兹堡；Sigma Aldrich公司，美国密苏里州圣路易斯)测量肌动蛋白的量，随后以经IRDye 680RD标记的山羊抗小鼠二级抗体检测。见图2a，其中使用5％FBS；图2b，其中使用PDGF-BB；以及图2c，其中使用10％FBS。

实施例2

MCT诱导的大鼠PAH模型：在第0天，雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River实验室)(260-280g；载体对照组，n＝6；所有其它组，n＝15)接受溶解于载体(33.3％1N HCl，14.8％1N NaOH，52.2％去离子H₂O)中的MCT(50毫克/千克，SC；1毫升/千克BW)或单独的载体。从第0-28天预防性地施用(5毫升/千克；PO)西地那非或从第14-28天治疗性地施用西地那非(50毫克/千克/剂量；BID)。治疗性地施用帕博西尼(100毫克/千克；QD)(第14-28天)。将西地那非和帕博西尼二者再悬浮于载体(0.5％甲基纤维素)中并经由口服施用(5毫升/千克)。在第28天，经由异氟烷麻醉动物，评估血液动力学参数并在安乐死后收集组织。

实施例3

由MCT诱导的大鼠PAH模型：在第0天，雄性Sprague-Dawley大鼠(Charles River实验室)(260-280g；载体对照组，n＝6；所有其它组，n＝15)接受溶解于载体(33.3％1N HCl，14.8％1N NaOH，52.2％去离子H₂O)中的MCT(50毫克/千克，SC；1毫升/千克BW)或单独的载体。从第0-28天预防性地施用(5毫升/千克；PO)西地那非或从第14-28天治疗性地施用西地那非(50毫克/千克/剂量；BID)。治疗性地施用帕博西尼(100毫克/千克；QD)(第14-28天)。将西地那非和帕博西尼二者再悬浮于载体(0.5％甲基纤维素)中并经由口服施用(5毫升/千克)。在第28天，经由异氟烷麻醉动物，评估血液动力学参数并在安乐死后收集组织。

血液动力学测量-野百合碱(MCT)研究：在第28天，在正压呼吸机中经由2％异氟烷将动物麻醉。使用经预校准的压力传感器测量在异氟烷正压通气中的动物的肺血液动力学参数。使用经由右颈动脉引导至主动脉弓高度的肺动脉干的Millar Solid State Mikro尖端导管(Millar仪器，德州休斯顿)测量稳态肺动脉压和全身动脉压。通过生理数据采集系统，ADI Chart(ADI仪器，科罗拉多州科罗拉多斯普林斯)(柏拉图生物制药)自动计算血液动力学数值。

实施例4

由SuHx诱导的肺动脉高压：自Charles River实验室获得Sprague-Dawley大鼠(200-300g；载体对照组，n＝5；所有其它组，n＝10)。在第0天，大鼠接受溶解在DMSO中的塞美西尼，接着被饲养在低氧(13％)下，直到第28天。从第7-28天施用在载体(0.5％甲基纤维素)中的西地那非(30毫克/千克/剂量；BID)、利奥西呱(10毫克/千克，QD)或帕博西尼(100毫克/千克；QD)。在第28天，以类似于MCT研究的方式进行终端血液动力学评估和尸检。

血液动力学测量Su/Hx研究：在第28天，经由肌内注射氯胺酮/赛拉嗪(80/10毫克/千克)将动物麻醉。将Millar导管插入肺动脉并依Stringer等人，(1981)Catheterizationof the pulmonary artery in the closed-chest rat.J.Appl.Physiol.51，1047-1050的描述测量肺压力和血液动力学参数。使用NOTOCORD-Hem软件(NOTOCORD公司，法国)(CorDynamics)计算血液动力学数值。

测量RV肥大：在尸检采集心脏后，取出心房和大血管。将RV与LV和S分开。测量RV和LV+S的湿重以计算富尔顿指数。

实施例5

组织制备物：在麻醉下，将动物放血并以氧合的(来自实施例3的动物[MCT])或肝素化的(来自实施例4的动物[Su5416/Hx])盐水冲洗肺循环。从胸腔完好取出气管、肺和心脏并放置在冰冷的盐水中。取出右肺叶，称重并立即在液态氮中快速冷冻。使用充填固定剂(10％NBF)的具有附接的钝端针(20g)的10毫升注射器将左肺叶充气并将气道打结以保持肺叶持续扩张。然后，将左肺浸入10％NBF中固定≤48小时，再转移到70％乙醇中≤5天。

组织形态计量分析：使用三个3-5微米厚的左肺叶横截面进行组织形态计量学分析。由委员会认证的兽医病理学家通过光学显微镜评估经苏木精和伊红(H&E)染色的肺切片来确定整体疾病严重性评分。评分范围从0(无)、1(最小)、2(轻度)、3(中度)、4(明显)至5(重度)并根据受PAH模型的组织变化(炎性、退行性、血管及/或增殖)特征影响的组织的近似百分比进行分配。使用以经修饰的Verhoeff-van Gieson弹性蛋白染色制备的肺切片评估平均血管壁厚度。利用随机场域采样(Visiopharm newCAST)加观察者辅助识别腺泡内和腺泡前血管来采样10％的组织面积进行图像分析并应用核探头测量血管壁的厚度。使用经双αSMA/Ki67 IHC染色的切片及观察者辅助计算≥70％肌化(即，SMA⁺)、横向切片、≤50微米外径、具有可识别腔的腺泡内血管，以类似方式评估充分肌化的腺泡内血管密度。使用随机场域采样的10％组织面积及观察者辅助识别与外径≤100μm的血管壁(即，在内膜或中层)相关的Ki67⁺或pRb⁺细胞，分别计算在经αSMA/Ki67 IHC和CD31/pRb IHC染色的肺切片中的血管相关的Ki67⁺和pRb⁺细胞。

免疫组织化学。双α-SMA/Ki67核抗原：在Leica Bond Rx自动免疫组织化学染色仪上，在3微米厚，经福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)切片上进行所有IHC步骤。该仪器经过编程以烘烤并将载玻片脱蜡。将该初级抗体，抗人αSMA(兔多株抗体ab5694，Abcam公司，麻萨诸塞州剑桥)在Bond^TM初级抗体稀释剂(PV6123)中稀释200倍(1：200)，施加在载玻片上，培育30分钟并使用Bond^TM Polymer Refine AP-Red检测套装产品(DS9390，LeicaBiosystems公司，伊利诺伊州Buffalo Grove)检测。此步骤后接着使用Bond^TM EpitopeRetrieval 1(ER1)溶液(AR9961，Leica Biosystems)进行20分钟热诱导的表位修复。施用二级抗体，抗Ki67(小鼠单株抗体Ki67[MM1]核抗原RTU，PA0118[Leica])15分钟，再以Bond^TMPolymer Refine HRP DAB检测系统(DS9800)检测。将载玻片复染、脱水并盖上盖玻片。

双CD31/磷酸Rb：初始步骤与上述步骤相同。以Bond^TM Epitope Retrieval 2(ER2)溶液(AR9640)进行20分钟的热诱导的表位修复。将该初级抗体，抗磷酸-Rb(兔多株磷酸-Rb[ser807/811]，9308，Cell Signaling Technology公司，麻萨诸塞州丹佛斯)在Bond^TM初级抗体稀释剂中稀释600倍(1：600)，施加在载玻片上并培育30分钟。接着使用针对初级抗体的Bond^TM Polymer HRP-DAB Refine检测套装产品。此步骤之后，使用Bond^TM EpitopeRetrieval 1(ER1)溶液(AR9961，Leica Biosystems)进行10分钟热诱导的表位修复。施加二级抗体，抗CD31(兔单株抗体[EPR3094]，ab76533，Abcam公司，麻萨诸塞州剑桥)45分钟，然后以Bond^TM Polymer Refine AP-Red检测套装产品(DS9390，Leica Biosystems)检测。将载玻片复染、脱水并盖上盖玻片。

统计学分析

以平均值±S.E.M呈现数据。先使用单因素方差分析(ANOVA)，再使用Tukey多重比较检验(GraphPad Prism 6，GraphPad软件，美国加州圣地亚哥)进行组间的统计分析。将统计学显著性的水平设定为经多重调节的P值0.05(标记为或*)或0.01(标记为或**)。

Claims

1.一种治疗PAH的方法，它包括向有此需要的受治疗者施用有效量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐。

2.权利要求1的方法，其中在24小时期间以单剂量或以多剂量施用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐每天约0.6至约500毫克的剂量。

3.权利要求1的方法，其中在24小时期间以单剂量或以多剂量施用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐每天约25至125毫克的剂量。

4.权利要求1至3任一项的方法，其中与一种或多种其它活性剂联合施用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐。

5.权利要求1至4任一项的方法，其中该方法是施用有效量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。

6.权利要求4的方法，其中所述的其它活性剂是西地那非。

7.一种治疗疾病的方法，其中所述的疾病是下列疾病中的一种或多种：PCH、由于左心脏疾病造成的肺高血压、由于肺病及/或低氧造成的肺高血压、慢性血栓栓塞性肺高血压、病因不明或具有多因素病因的肺高血压、特发型肺血管疾病或肺病和原发性肺血管病，该方法包括向有此需要的人或动物施用有效量的6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐。

8.权利要求7的方法，其中所述的疾病是PCH。

9.权利要求7的方法，其中所述的疾病是由于左心脏疾病造成的肺高血压。

10.权利要求7的方法，其中所述的疾病是由于肺病或低氧造成的肺高血压。

11.权利要求7的方法，其中所述的疾病是慢性血栓栓塞性肺高血压。

12.权利要求7的方法，其中所述的疾病是病因不明或具有多因素病因的肺高血。

13.权利要求7的方法，其中所述的疾病是特发型肺血管疾病或肺病。

14.权利要求13的方法，其中所述的特发型肺血管疾病或肺病包括任何形式的急性、慢性肺损伤和炎症。

15.权利要求7的方法，其中所述的疾病是原发性肺血管病。

16.权利要求15的方法，其中所述的原发性肺血管病是特发性肺高血压、胶原蛋白血管相关性肺高血压、肝脏疾病相关性肺高血压、药物相关性肺高血压、HIV相关性肺高血压和血凝块诱发的肺高血压。

17.一种治疗PAH的方法，它包括向有此需要的受治疗者施用有效量的CDK抑制剂。

18.权利要求17的方法，其中所述的CDK抑制剂是利博西尼、艾贝马西尼或地纳西尼或它们的药学上可接受的盐。

19.权利要求17的方法，其中所述的CDK抑制剂是CDK4和CDK6的抑制剂。

20.权利要求17或权利要求19的方法，其中所述的CDK抑制剂是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐。

21.权利要求20的方法，其中在24小时期间以单剂量或以多剂量施用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐每天约0.6至约500毫克的剂量。

22.权利要求20或权利要求21的方法，其中在24小时期间以单剂量或以多剂量施用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐每天约25至125毫克的剂量。

23.权利要求20至22任一项的方法，其中与一种或多种其它活性剂联合施用6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮或其药学上可接受的盐。

24.权利要求17或权利要求19至23任一项的方法，其中所述的CDK抑制剂是6-乙酰基-8-环戊基-5-甲基-2-{[5-(哌嗪-1-基)吡啶-2基]氨基}吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮。

25.权利要求23或权利要求24的方法，其中所述的其它活性剂是前列腺素、内皮素受体拮抗剂、鸟苷酸环化酶抑制剂、血管扩张剂、钙通道阻断剂、抗凝剂和利尿剂。