ES2932883T3 - Composición de combinación sinérgica que comprende una saponina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y un segundo compuesto polifenólico - Google Patents

Abstract

Una composición de combinación que comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente efectivas de (i) una saponina esteroidal de origen natural o sintético, una sal farmacéuticamente aceptable de la misma o un extracto vegetal que contiene saponina esteroidal, y (ii) al menos un primer compuesto polifenólico seleccionado de el grupo que consiste en ácidos hidroxicinámicos, flavonoides, ácidos hidroxibenzoicos y (iii) opcionalmente, un segundo compuesto polifenólico, en el que el segundo compuesto polifenólico son ácidos hidroxicinámicos y su uso para prevenir, inhibir, retrasar o tratar a un sujeto que padece una enfermedad neurodegenerativa o condición. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composición de combinación sinérgica que comprende una saponina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y un segundo compuesto polifenólico

Campo de la invención

La presente invención se refiere de manera general a una composición de combinación que comprende una saponina esteroidea, los métodos de preparación y uso de los mismos para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. La invención se refiere más específicamente a una composición de combinación para la utilización en la prevención, inhibición, retraso o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad o condición neurodegenerativa.

Antecedentes

La diosgenina y la sarsasapogenina y derivados de las mismas son las que han sido estudiadas más frecuentemente y han mostrado efectos neuroprotectores. Dichas dos sapogeninas esteroides son las detectadas más comúnmente en Dioscoreaceae, Smilacaceae y Asparagaceae. En 2011, Ghayur et al. (Ghayur et al., Journal of Chinese Integrative Medicine: (2011) 9: 619-625) subrayaron que la diosgenina y los compuestos fenólicos posiblemente eran los responsables de la actividad anti-acetilcolinesterasa (anti-AChE) observada en extracto de nuez de betel. Chiu et al. (Chiu et al., Am J Chin Med. (2011) 39:551 -63) mostraron que la diosgenina (5-125 mg/kg) mejoró significativamente el deterioro cognitivo e incrementó la actividad de los enzimas antioxidantes endógenos en el cerebro de ratones. La diosgenina también incrementó las actividades de la superóxido dismutasa (SOD) y de la glutatión peroxidasa (GSH-Px) y redujo el nivel de malondialdehído (MDA) en el cerebro de los ratones tratados con D-gal. Koh et al. (Lab Anim Res (2016) 32: 105-115) mostraron que la diosgenina inhibe la muerte de las células neurales mediante la reducción de la acumulación de Ap, regulando positivamente la actividad de SOD y suprimiendo la peroxidación de los lípidos. A continuación, la diosgenina recupera la función colinérgica cerebral mediante la potenciación de la actividad de la AChE. Finalmente, la diosgenina bloquea la muerte de las células neurales mediante la aceleración de la expresión del factor de crecimiento nervioso (NGF, por sus siglas en inglés) y la estimulación de la señalización de los receptores de NGF. Tohda (Tohda, Biol. Pharm. Bull. (2016) 39, 1569-1575) se han centrado en la ruta de 1,25D3-MARRS como diana muy crítica para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer (EA) y han demostrado que el estimulante exógeno diosgenina activa esta ruta de señalización. Zhang et al. (Zhang et al., Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology (2017)) han demostrado que la sarsasapogenina puede suprimir el depósito de Ap y potenciar la viabilidad celular en células HT-22 cultivadas en medio rico en glucosa, lo que probablemente está mediado por la activación de PPAR^y y la consiguiente regulación negativa de BACE1. Los autores consideran que la sarsasapogenina posee potentes efectos neuroprotectores y que podría representar un nuevo enfoque en el tratamiento farmacológico del declive cognitivo asociado a la diabetes, probablemente también la enfermedad de Alzheimer. Visanji et al. (Visanji et al., FASEB J. (2008) 22: 2488-2497) han mostrado que la smilagenina (un isómero de la sarsasapogenina) posee efectos tanto neuroprotectores como neurorestauradores tanto in vitro como in vivo. Además, dicho compuesto bloquea y revierte el daño neuronal inducido por MPP+ en neuronas mesencefálicas y por MPTP en un modelo de ratón de enfermedad de Parkinson.

Los polifenoles pertenecen a la clase de metabolitos más extendida en la naturaleza y su distribución es prácticamente ubicua. La familia del fenilpropanoide representa el 20 % de los 200,000 metabolitos secundarios que existen. Dicha familia contiene la mayoría de los compuestos fenólicos de origen natural, tales como el ácido hidroxicinámico y derivados del mismos, los flavonoides, las coumarinas o los estilbenos. Entre los ácidos hidroxicinámicos, el ácido cafeico, el ácido ferúlico, el ácido clorogénico, el ácido isoferúlico y el ácido coumárico es conocido que poseen actividad antioxidante.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un problema importante de la salud pública debido a su creciente prevalencia, larga duración, carga para el cuidador y elevados costes económicos de su atención. En la enfermedad de Alzheimer, los cambios neuropatológicos más característicos son la formación de ovillos neurofibrilares y placas neuríticas caracterizadas por la presencia de haces de filamentos helicoidales apareados que se acumulan en las neuritas y cuerpos de las células neuronales en degeneración. Las placas neuríticas clásicas presentan un núcleo denso central de péptido p-amiloide circundado por una corona de neuritas distróficas (Esiri MM et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry (1998) 65:29-33). Aunque la composición de proteínas de los filamentos helicoidales apareados no ha sido bien definida, se han relacionado varias proteínas asociadas a los microtúbulos en estas lesiones. Por lo tanto, se ha informado de que en los cerebros afectados por la enfermedad de Alzheimer, los niveles de proteína 2 asociada a los microtúbulos (MAP2, por sus siglas en inglés) habitualmente están reducidos [Adlard PA, Vickers JC; Acta Neuropathol (2002) 103: 377-383; Hsia AY et al.; Proc Natl Acad Sci USA (1999) 96: 3228-3233].

Actualmente no existe ningún tratamiento para la enfermedad de Alzheimer. Actualmente los esfuerzos para desarrollar un tratamiento eficaz para la EA se basan en el hallazgo de que los pacientes de esta enfermedad sufren de déficits marcados en el sistema de neurotransmisores colinérgicos, que resultan en una deficiencia en la concentración de acetilcolina en el sistema nervioso central. Entre los enfoques de tratamiento se incluyen precursores de la síntesis de la acetilcolina, agonistas colinérgicos, potenciadores de la liberación de acetilcolina e inhibidores de la acetilcolinesterasa (AChE). Hasta hoy, el enfoque más efectivo ha sido la utilización de inhibidores de AChE, tales como tacrina, donepezilo y rivastigmina. Los estudios anteriores han mostrado que la patogénesis de la EA es desencadena por la acumulación y depósito de péptido p-amiloide (Ap) tóxico en el sistema nervioso central [Callizot et al., J. Neurosc. Res. (2013) 91(5):706-16]. Los medicamentos herbales con diana en los mecanismos subyacentes a la acumulación de Ap podrían ser un enfoque eficaz en la prevención de la enfermedad.

La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en los Estados Unidos. Los síntomas motores predominantes de la EP, incluyendo la lentitud de movimientos, temblores en reposo, rigidez y alteraciones de la marcha, están causados por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra (SN). Los estudios epidemiológicos sugieren que la utilización de pesticidas incrementa el riesgo de EP, posiblemente a través de una actividad disminuida del complejo I en la cadena respiratoria mitocondrial en la sustancia negra y que resulta en la patogénesis de EP. La 1 -metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y su forma derivada (MPP+), el inhibidor del complejo mitocondrial I, ha sido ampliamente utilizada para producir modelos de toxina de EP esporádica. Dicha toxina se ha utilizado para simular la EP in vitro [Visanji. et al., FASEB J. 2008; 22(7):2488-97].

La solicitud de patente n.° EP 1719 512 se refiere a la utilización de uno o más agentes activos seleccionados de entre sarsasapogenina y smilagenina, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad seleccionada de entre enfermedad de Parkinson, hipotensión ortostática, autismo, síndrome de fatiga crónica, miastenia grave, enfermedad de Lambert-Eaton, síndrome del Golfo y exposición ocupacional a compuestos organofosforados. En particular, se han demostrado efectos de la sarsasapogenina y la smilagenina sobre la expresión de los receptores m2 sobre las células CHO, a concentraciones de entre 1 pmol/l y 10 pmol/l. Sin embargo, dichas concentraciones de 1 pmol/l o 10 pmol/l de sarsasapogenina son tóxicas para las neuronas corticales y para la red neurítica.

La solicitud de patente n.° US2008/118583se refiere a un método para tratar la enfermedad de Parkinson en un paciente que lo necesita, que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición nutracéutica sinérgica, en la que dicha composición comprende: 21 mg de Eleutherococcus senticosus, 106 mg de Panaxginseng, 32 mg de Rhodiola rosea, 4 mg de Schizandra chinensis, 106 mg de Astragalus membranaceus, 106 mg de Ganoderma lucidum, 106 mg de Uncaria tomentosa, 21 mg de coenzima Q10, 21 mg de Ginkgo biloba, 64 mg de Hydrocotyle asiatica, 106 mg de Radix polygalae, 21 mg de Silybum marianum, 4 mg de Smilax regelii, 21 mg de Tabebuia avellanedae, 106 mg de vitamina B1 y 106 mg de vitamina E, junto con excipientes farmacéuticamente aceptables, en dicho paciente con el fin de aliviar dicha enfermedad. Sin embargo, la solicitud de patente n.° US2008/118583 no ha dado a conocer una composición de combinación específica que comprenda una saponina esteroidea y un primer compuestos polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico, sino únicamente una mezcla de diferentes extractos vegetales. El documento n.° EP3106160 A1 da a conocer una combinación de huperzina, ácido cafeico y ácido ferúlico destinada al tratamiento de trastornos neurodegenerativos.

Por lo tanto, existe una necesidad de una nueva composición eficaz que comprenda los compuestos activos para la prevención, inhibición, retraso o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad o condición neurodegenerativa, que puede administrarse con mejores regímenes de tratamiento y que puede proporcionar suficiente eficacia con una tolerancia mejorada del paciente, debido a las bajas concentraciones de los compuestos activos.

En el presente contexto, los inventores han desarrollado una nueva composición de combinación sinérgica que comprende una saponina esteroidea y un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico. En efecto, los inventores han mostrado por primera vez que una sapogenina esteroidea y compuestos polifenólicos presentan efectos sinérgicos al utilizarlos en combinación para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. Los inventores han investigado el efecto neuroprotector de un extracto vegetal de Dioscoreaceae, Asparagaceae, Smilacaceae y Fabaceae sobre neuronas corticales primarias de rata lesionadas con glutamato como modelo in vitro de EA. A la luz de los resultados obtenidos y de un análisis analítico del perfil químico del extracto, identificaron tres compuestos que potencialmente participaban en el efecto neuroprotector: la diosgenina, el ácido cafeico y el ácido ferúlico. También se investigó el efecto sinérgico de dichos compuestos. El efecto de dichos compuestos se investigó adicionalmente en un segundo modelo in vitro de EA que es de neuronas corticales primarias lesionadas por péptido p-amiloide.

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición de combinación para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer y otros trastornos del sistema nervioso central y a un método de preparación de la misma.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas.

Según la presente invención, la expresión "composición de combinación" se refiere a una composición que comprende una mezcla de por lo menos dos compuestos activos diferentes. Según la presente invención, la expresión "compuesto activo" se refiere a un compuesto que es médica o biológicamente activo y, en particular, a un compuesto que presenta actividad neuroprotectora.

Según la presente invención, los términos "sinérgicamente" y "sinergia" se refieren a la interacción de por lo menos dos o más compuestos activos de manera que su efecto combinado es superior al de sus efectos individuales.

Los compuestos presentes en la composición pueden existir en forma de estereoisómeros. El término "estereoisómero" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere e incluye moléculas isoméricas que presentan la misma fórmula molecular, aunque difieren en el posicionamiento en el espacio, de átomos y/o grupos funcionales. El término "estereoisómero" incluye enantiómeros (en los que diferentes isómeros son imágenes especulares entre sí) y diastereómeros (en los que diferentes isómeros no son imágenes especulares entre sí). El término "diastereómeros" incluye isómeros, tales como confórmeros, compuestos meso, isómeros cis-trans (E-Z) e isómeros ópticos no enantioméricos.

Según la presente invención, la saponina estereoidea puede ser de origen natural o sintético, sal farmacéuticamente aceptable de la misma o un extracto vegetal que contiene la saponina esteroidea.

Dentro del contexto de la presente invención, la expresión "origen natural" se refiere a una saponina esteroidea activa de origen vegetal.

Dentro del contexto de la presente invención, la expresión "origen sintético" se refiere a una saponina esteroidea activa obtenida mediante semisíntesis o hemisíntesis, para la que la estructura es similar o por lo menos mimetiza parcialmente la estructura de la saponina estereoidea activa de origen vegetal. Entre los ejemplos de saponina estereoidea sintética pueden incluirse diosgenina sintética, sarsasapogenina sintética, sarsaponina sintética, smilagenina sintética, tigogenina sintética, asparagina sintética y laxogenina sintética.

Dentro del contexto de la presente invención, la expresión "extracto vegetal" se refiere a un extracto de flores, a un extracto de hojas, a un extracto de raíces o a un extracto de semillas. Los extractos vegetales pueden obtenerse a partir de una familia de plantas seleccionada del grupo que consiste en Dioscoreaceae, Asparagaceae, Smilacaceae Fabaceae y una mezcla de las mismas. Ventajosamente, los extractos vegetales se obtienen a partir de Dioscoreaceae o Asparagaceae.

Dentro del contexto de la presente invención, la expresión "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a sales preparadas a partir de bases no tóxicas farmacéuticamente aceptables, incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas. Entre las sales derivadas de bases inorgánicas se incluyen aluminio, amonio, calcio, cobre, base férrica, base ferrosa, litio, magnesio, sales mangánicas, manganeso, potasio, sodio, zinc y similares. Entre las realizaciones particulares se incluyen las sales de amonio, calcio, magnesio, potasio y sodio. Entre las sales derivadas de bases no tóxicas orgánicas farmacéuticamente aceptables se incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tales como arginina, betaína, cafeína, colina, N,N-dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilamina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y similares. También se incluyen sales de amonio cuaternario, tales como N+(alquil C1-4)4. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable" también se refiere a sales preparadas a partir de ácidos no tóxicos farmacéuticamente aceptables, incluyendo ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos. Entre las sales derivadas de ácidos inorgánicos se incluyen bromhidrato, clorhidrato, nitrato, fosfato y sulfato. Entre las sales derivadas de ácidos no tóxicos orgánicos farmacéuticamente aceptables se incluyen bencenosulfonato, citrato, etanosulfonato, fumarato, gluconato, yodato, isetionato, maleato, metanosulfonato, metilénbis-b-oxinaftoato, oxalato, palmoato, salicilato, tartrato, teofilinacetato y p-toluenosulfonato. La preparación de las sales farmacéuticamente aceptables indicadas anteriormente y otras sales farmacéuticamente aceptables típicas se describe en mayor detalle en Berge et al., "Pharmaceutical Salts," /. Pharm. Set, 1977:66:1-19.

Según la presente invención, la composición de combinación comprende una saponina esteroidea, también denominada triterpenoide tetracíclico. La saponina estereoidea de la presente invención puede seleccionarse del grupo que consiste en diosgenina, sarsasapogenina, sarsaponina, smilagenina, tigogenina, laxogenina, y los derivados naturales y mezclas de los mismos. Según la presente invención, los derivados naturales de la saponina estereoidea comprende derivados heterosídicos o derivados sustituidos de la saponina esteroidea. Dentro del contexto de la invención, los derivados heterosídicos o glucósidos son moléculas en las que un azúcar se encuentra unido a un grupo funcional de la saponina esteroidea. De entre ellos puede citarse la dioscina o la protodioscina. Según la invención, los derivados sustituidos son moléculas en las que un grupo metoxi se encuentra unido a un grupo funcional de la saponina esteroidea mediante un enlace de oxígeno. Entre ellos pueden citarse icogenina, Me-protodioscina y dioscoréside E.

En una realización ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces, los siguientes:

(i) una saponina estereoidea de origen natural o sintético, una sal farmacéuticamente aceptable de la misma o un extracto vegetal que contiene saponina estereoidea, y

(ii) un primer compuesto polifenólico, en el que el primer compuesto polifenólico se selecciona de entre ácido cafeico y

(iii) un segundo compuesto polifenólico, en el que el segundo compuesto polifenólico se selecciona de ácido ferúlico.

En una realización particular de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces de una saponina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y un segundo compuesto polifenólico, en la que la saponina esteroidea se selecciona del grupo que consiste en diosgenina, sarsasapogenina, smilagenina, los derivados naturales y mezclas de las mismas, en la que el primer compuesto polifenólico se selecciona del grupo que consiste en ácido cafeico y en la que el segundo compuesto polifenólico se selecciona de ácido ferúlico.

En una realización ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces, los siguientes:

(i) una saponina estereoidea de origen natural o sintético, una sal farmacéuticamente aceptable de la misma o un extracto vegetal que contiene saponina estereoidea, y

(ii) ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, y

(iii) ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico.

En una realización ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces, los siguientes:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma como saponina esteroidea, y

• ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, y

• ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico.

En otra realización ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos cantidades sinérgicamente eficaces de:

• sarsasapogenina o los derivados naturales o mezclas de la misma como saponina esteroidea y

• ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, y

• ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico.

En otra realización ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces, los siguientes:

• smilagenina o los derivados naturales o mezclas de la misma como saponina esteroidea y

• ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, y

• ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico.

En una realización particular de la invención, la combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces de una saponina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y un segundo compuesto polifenólico en una proporción molar de saponina esteroidea/primer compuesto polifenólico/segundo compuesto polifenólico que está comprendida entre 0,01/1000/500 y 15/100000/20000. Ventajosamente, la proporción molar de saponina esteroidea/ácido cafeico/ácido ferúlico está comprendida entre 0,03/5000/1000 y 10/50000/10000.

Ventajosamente, la proporción molar de saponina esteroidea/primer compuesto polifenólico/segundo compuesto polifenólico está comprendida entre 0,03/5000/1000 y 0,3/5000/1000, en la que la saponina esteroidea es la diosgenina. Ventajosamente, la proporción molar de diosgenina/ácido cafeico/ácido ferúlico se selecciona de las proporciones siguientes: 0,03/5000/10000 o 0,3/5000/1000, o 0,3/5000/10000, o 0,3/50000/1000 o de 0,3/50000/10000.

En otra realización particular de la invención, la combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces de una saponina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y un segundo compuesto polifenólico, que presenta una proporción molar de saponina esteroidea/primer compuesto polifenólico/segundo compuesto polifenólico que está comprendida entre 1/5000/1000 y 1/50000/10000, en el caso de que la saponina esteroidea sea sarsasapogenina o smilagenina. Ventajosamente, la proporción molar de saponina esteroidea/ácido cafeico/ácido ferúlico está comprendida entre 1/5000/1000 y 1/50000/10000, en el caso de que la saponina esteroidea sea sarsasapogenina o smilagenina.

En una realización particular de la invención, la combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces de una saponina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y un segundo compuesto polifenólico, en el que la saponina esteroidea está presente a una concentración de entre 0,01 pM y 15 pM; el primer compuesto polifenólico está presente a una concentración de entre 1 nM y 100 nM y el segundo compuesto polifenólico está presente a una concentración de entre 0,5 nM y 20 nM. Ventajosamente, la saponina esteroidea se selecciona del grupo que consiste en diosgenina, sarsasapogenina, smilagenina y los derivados o mezclas naturales de las mismas.

En una realización particular de la invención, en el caso de que la saponina esteroidea sea diosgenina, la saponina esteroidea está presente a una concentración de entre 0,01 pM y 0,5 pM, ventajosamente de entre 0,015 pM y 0,45 pM, ventajosamente de entre 0,02 pM y 0,40 pM, ventajosamente de entre 0,025 pM y 0,35 pM y ventajosamente de entre 0,03 pM y 0,3 pM. En una realización particular, la concentración de la saponina esteroidea en la composición de combinación de la invención es inferior o igual a 0,3 pM, en el caso de que la saponina esteroidea sea la diosgenina.

En otra realización particular de la invención, en el caso de que la saponina esteroidea sea sarsasapogenina o smilagenina, la saponina esteroidea está presente a una concentración de entre 0,5 pM y 15 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 10 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 9 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 8 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 7 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 6 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 5 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 4 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 3 pM y ventajosamente de entre 1 pM y 2 pM.

Ventajosamente, el primer compuesto polifenólico está presente a una concentración de entre 1 nM y 100 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 95 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 90 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 85 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 80 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 75 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 70 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 65 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 60 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 55 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 50 nM, ventajosamente de entre 2 nM y 50 nM, ventajosamente de entre 3 nM y 50 nM, ventajosamente de entre 4 nM y 50 nM, ventajosamente de entre 5 nM y 50 nM. En una realización particular, la concentración del primer compuesto polifenólico en la composición de combinación de la invención es inferior o igual a 50 nm. Ventajosamente, el primer compuesto fenólico es el ácido cafeico.

Ventajosamente, el segundo compuesto polifenólico está presente a una concentración de entre 0,5 nM y 20 nM, ventajosamente de entre 0,5 nM y 19 nM, ventajosamente de entre 0,5 nM y 18 nM, ventajosamente de entre 0,6 nM y 17 nM, ventajosamente de entre 0,6 nM y 16 nM, ventajosamente de entre 0,7 nM y 15 nM, ventajosamente de entre 0,7 nM y 14 nM, ventajosamente de entre 0,8 nM y 13 nM, ventajosamente de entre 0,8 nM y 12 nM, ventajosamente de entre 0,9 nM y 11 nM, ventajosamente de entre 0,9 nM y 10 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 10 nM. En una realización particular, la concentración del segundo compuesto polifenólico en la composición de combinación de la invención es inferior o igual a 10 nM.

Ventajosamente, la combinación comprende como componentes activos, una saponina esteroidea, un primer compuesto fenólico y un segundo compuesto polifenólico, en el que la saponina esteroidea está presente a una concentración de entre 0,03 pM y 15 pM; el primer compuesto fenólico etsá presente a una concentración de entre 5 nM y 50 nM y el segundo compuesto fenólico está presente a una concentración de entre 1 nM y 10 nM.

En una realización ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces, los siguientes:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma como saponina esteroidea, en los que la diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma está presente a una concentración de entre 0,01 pM y 0,5 pM, ventajosamente de entre 0,03 pM y 0,3 pM, y

• ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, en los que el ácido cafeico está presente a una concentración de entre 1 nM y 100 nM, ventajosamente de entre 5 nM y 50 nM, y

• ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico, en los que el ácido ferúlico está presente a una concentración de entre 0,5 nM y 20 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 10 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,03 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 5 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 1 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,03 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 5 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 10 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende: • diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,03 pM, y • ácido cafeico a una concentración de 50 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 10 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,03 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 50 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 1 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,3 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 5 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 1 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,3 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 5 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 10 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,3 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 50 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 1 nM.

En una realización particularmente ventajosa de la invención, la composición de combinación comprende:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma a una concentración de 0,3 pM, y

• ácido cafeico a una concentración de 50 nM, y

• ácido ferúlico a una concentración de 10 nM.

En otra realización de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces:

• diosgenina o los derivados naturales o mezclas de la misma como saponina esteroidea, en la que la sarsasapogenina o los derivados naturales o mezclas de la misma está presente a una concentración de entre 0,5 pM y 15 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 10 pM, y

• ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, en los que el ácido cafeico está presente a una concentración de entre 1 nM y 100 nM, ventajosamente de entre 5 nM y 50 nM, y

• ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico, en los que el ácido ferúlico está presente a una concentración de entre 0,5 nM y 20 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 10 nM.

En otra realización de la invención, la composición de combinación comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces:

• smilagenina o los derivados naturales o mezclas de la misma como saponina esteroidea, en los que la smilagenina o los derivados naturales o mezclas de la misma está presente a una concentración de entre 0,5 pM y 15 pM, ventajosamente de entre 1 pM y 10 pM, y

• ácido cafeico como primer compuesto polifenólico, en los que el ácido cafeico está presente a una concentración de entre 1 nM y 100 nM, ventajosamente de entre 5 nM y 50 nM, y

• ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico, en los que el ácido ferúlico está presente a una concentración de entre 0,5 nM y 20 nM, ventajosamente de entre 1 nM y 10 nM.

También pueden utilizarse extractos vegetales, en particular de Dioscoreaceae, Asparagaceae, Smilacaceae y Fabaceae como composición de combinación según la invención. De esta manera, según la presente invención, dicha composición de combinación puede ser una mezcla acuosa u orgánica de dichos componentes activos o un extracto vegetal. Dichos extractos pueden prepararse mediante cualesquiera técnicas conocidas, en particular mediante maceración etanólica asistida por ultrasonidos (UAE) o microondas (MAE). Ventajosamente, el extracto vegetal es un extracto etanólico de una familia de plantas seleccionada del grupo que consiste en Dioscoreaceae, Asparagaceae, Smilacaceae y Fabaceae y una mezcla de las mismas. Según la presente invención, no se utilizan extractos de Rhodiola rosea, Uncaria tomentosa o Smilax regelii para la preparación de la composición de combinación de la invención. En otros términos, en el caso de que la composición de combinación se obtiene de extractos vegetales, la composición está libre de extractos de Rhodiola rosea, Uncaria tomentosa o Smilax regelii.

Según otro aspecto de la invención, la composición de combinación según la invención puede utilizarse como medicamento o como composición nutracéutica. Las composiciones de combinación según la presente invención puede prepararse como composiciones farmacéutica, más particularmente como composiciones farmacéuticas neuroprotectoras. Dichas composiciones pueden comprender los compuestos activos tal como se han definido anteriormente junto con por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

La composición de combinación puede prepararse en forma de composiciones nutracéuticas que comprende los compuestos activos tal como se ha definido anteriormente junto con por lo menos un excipiente nutracéuticamente aceptable.

Dentro del contexto de la invención, la expresión "excipiente farmacéutica o nutracéuticamente aceptable" se refiere e incluye compuestos o materiales utilizados para facilitar la administración de uno o más compuestos (o uno o más ingredientes activos), por ejemplo para incrementar la solubilidad del compuesto. Entre los ejemplos no limitativos típicos de portadores sólidos se incluyen almidón, lactosa, fosfato dicálcico, sucrosa y caolín. Entre los ejemplos no limitativos típicos de portadores líquidos se incluyen agua estéril, solución salina, tampones, surfactantes no iónicos y aceites comestibles. Además, también pueden incluirse diversos adyuvantes utilizados comúnmente en la técnica. Estos compuestos y otros compuestos similares están descritos en la literatura, p. ej., en el índice Merck (Merck & Company, Rahway, N.J.).

Según las realizaciones que implican la administración, en un sujeto que requiere tratamiento, de una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición de combinación tal como se proporciona en la presente memoria; las expresiones "terapéuticamente eficaz" o "una cantidad eficaz para tratar" o "farmacéuticamente eficaz" denotan la cantidad de la composición de combinación de la invención necesaria para inhibir o revertir una condición de enfermedad (p. ej., para tratar la enfermedad neurodegenerativa). Determinar la cantidad terapéuticamente eficaz depende específicamente de factores tales como la toxicidad y la eficacia del medicamento. Dichos factores diferirán según otros factores, tales como potencia, biodisponibilidad relativa, peso corporal de paciente, gravedad de los efectos secundarios adversos y modo preferente de administración. La toxicidad puede determinarse mediante la utilización de métodos bien conocidos de la técnica. La eficacia puede determinarse mediante la utilización de las mismas guías. La eficacia, por ejemplo, puede medirse por un incremento de la supervivencia de las neuronas corticales y de la red de neuritas de las neuronas corticales. Por lo tanto, una cantidad farmacéuticamente eficaz es una cantidad que el médico clínico considera que es toxicológicamente tolerable, aunque eficaz.

La dosis puede ajustarse apropiadamente para conseguir los niveles deseados de fármaco (p. ej., la composición de combinación de la invención), locales o sistémicos, según el modo de administración. En el caso de que la respuesta en un sujeto sea insuficiente a dichas dosis, pueden utilizarse dosis incluso más altas (o dosis superiores eficaces mediante una vía de administración diferente, más localizada) en la medida que lo permita la tolerancia del paciente. También pueden utilizarse múltiples dosis diarias para conseguir niveles sistémicos adecuados de los compuestos activos. Los niveles sistémicos adecuados pueden determinarse mediante, por ejemplo, la medición del nivel plasmático pico o sostenido del fármaco en el paciente. "Dosis" y "posología" se utilizan indistintamente en la presente memoria.

En algunas realizaciones, la cantidad de la composición de combinación administrada en un sujeto en términos de saponina esteroidea es de entre 1 y 20 mg/kg a la semana, y en términos de compuesto polifenólico, de entre 1 y 100 mg/kg a la semana.

En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas se utilizan para aplicaciones in vivo. Según el modo pretendido de administración in vivo, las composiciones utilizadas pueden encontrarse en la forma de administración de sólido, semisólido o líquido, tal como, p. ej., tabletas, comprimidos, polvos, cápsulas, geles, pomadas, líquidos, suspensiones o similares. Preferentemente, las composiciones se administran en formas de administración unitaria adecuadas para la administración única de cantidades de dosis precisas. Las composiciones pueden incluir, además, según la formulación deseada, por lo menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable, que se definen como vehículos de base acuosa utilizados comúnmente para formular composiciones farmacéuticas para la administración animal o humana. El diluyente se selecciona de manera que no afecte a la actividad biológica de los compuestos activos presentes en la composición de combinación de la invención. Son ejemplos de dichos diluyentes, agua destilada, solución salina fisiológica, solución de Ringer, solución de dextrosa y solución de Hank. Pueden utilizarse los mismos diluyentes para reconstituir una proteína recombinante liofilizada de interés. Además, la composición farmacéutica puede incluir, además, otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, portadores, adyuvantes, estabilizantes no inmunogénicos, no terapéuticos y no tóxicos, etc. Las cantidades eficaces de dicho diluyente o portador son cantidades que resultan eficaces para obtener una formulación farmacéuticamente aceptable en términos de solubilidad de los componentes, actividad biológica, etc. En algunas realizaciones, las composiciones proporcionadas en la presente memoria son estériles.

La administración durante el tratamiento in vivo puede llevarse a cabo mediante cualquiera de entre varias vías, incluyendo las vías oral, parenteral, intramuscular, intranasal, sublingual, intratraqueal, ocular, vaginal y rectal, y por inhalación. También pueden utilizarse las vías de administración intracapsular, intravenosa e intraperitoneal. El experto en la materia reconocerá que la vía de administración varía según el trastorno que debe someterse a tratamiento. Por ejemplo, la composición de combinación en la presente memoria puede administrarse en el sujeto mediante administración oral, parenteral o tópica. En una realización, la composición de combinación en la presente memoria se administra por vía oral.

Las composiciones, en el caso de que resulte deseable administrarlas sistémicamente, pueden formularse para la administración parenteral mediante inyección, p. ej., mediante inyección de bolo o la infusión continua. Las formulaciones para inyección pueden tener la presentación de una forma de administración unitaria, p. ej., en ampollas o en envases multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como las suspensiones, las soluciones o las emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.

Entre las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral se incluyen soluciones acuosas de las composiciones activas en forma soluble en agua. Además, pueden prepararse suspensiones de las composiciones activas en forma de suspensiones de inyección aceitosas apropiadas. Entre los solventes o vehículos lipofílicos adecuados se incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo o ésteres sintéticos de ácido graso, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener, además, estabilizadores adecuados o agentes que incrementen la solubilidad de las composiciones para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. Alternativamente, las composiciones activas pueden encontrarse en forma de polvos para la reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., agua libre de pirógenos estéril, antes de la utilización.

Para la administración oral, las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de, por ejemplo, tabletas o cápsulas preparadas por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ligantes (p. ej., almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa), agentes de carga (p. ej., lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato cálcico); lubricantes (p. ej., estearato de magnesio, talco o sílice); desintegrantes (p. ej., almidón de patata o glicolato de almidón sódico) o agentes humectantes (p. ej., laurilsulfato sódico). Las tabletas pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos de la técnica. Las preparaciones líquidas para la administración oral pueden adoptar la forma de, por ejemplo, soluciones, jarabes o suspensiones, o pueden presentarse en forma de un producto seco para la reconstitución con agua u otro vehículo adecuado antes de la utilización. Pueden prepararse dichos preparados líquidos por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables, tales como agentes de suspensión (p. ej., jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas comestibles hidrogenadas); agentes emulsionantes (p. ej., lecitina o acacia); vehículos no acuosos (p. ej., aceite de almendra, ésteres de aceite, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (p. ej., metil- o propil-p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Los preparados pueden contener, además, sales tamponadoras, y agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes según resulte apropiado. El componente o componentes pueden modificarse químicamente de manera que resulte eficaz la administración oral de los anticuerpos. Generalmente, la modificación química contemplada es la unión de por lo menos una molécula a los anticuerpos, en la que dicha molécula permite: (a) la inhibición de la proteólisis, y (b) la incorporación en el torrente sanguíneo a partir del estómago o intestino. Se desea, además, el incremento de la estabilidad global de los anticuerpos y el incremento del tiempo de circulación en el cuerpo. Entre los ejemplos de dichas moléculas se incluyen: polietilenglicol, copolímeros de etilenglicol y propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona y poliprolina. Otros polímeros que podrían utilizarse son poli-1,3-dioxolano y poli-1,3,6-tioxocano. Resultan preferentes para el uso farmacéutico, tal como se ha indicado anteriormente, las moléculas de polietilenglicol. Para las composiciones orales, la localización de liberación puede ser el estómago, el intestino delgado (el duodeno, el yeyuno o el íleon) o el intestino grueso. El experto en la materia disponible de formulaciones que no se disolverán en el estómago pero que liberarán el material en el duodeno o en otros sitios del intestino. Preferentemente, la liberación evitará los efectos perjudiciales del medio del estómago, sea mediante la protección de los compuestos activos, sea mediante la liberación del material biológicamente activo más allá del medio estomacal, tal como en el intestino.

Para la administración bucal, las composiciones pueden adoptar la forma de tabletas o pastillas formuladas de manera convencional.

Para la administración mediante inhalación, las composiciones para la utilización según la presente exposición pueden administrarse convenientemente en la forma de una presentación de spray de aerosol en paquetes presurizados o un nebulizador, utilizando un propelente adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de administración puede determinarse mediante la provisión de una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina, para la utilización en un inhalador o insuflador puede formularse con un contenido de una mezcla de polvos de las composiciones y una base de polvos adecuada, tal como lactosa o almidón.

También se contempla en la presente memoria la administración pulmonar. Las composiciones pueden administrarse en los pulmones de un mamífero mediante inhalación y atraviesa el revestimiento epitelial del pulmón hasta el torrente sanguíneo. Se encuentran contemplada la utilización en la práctica de la presente exposición un amplio abanico de dispositivos mecánicos diseñados para la administración pulmonar de productos terapéuticos, incluyendo, aunque sin limitación, nebulizadores, inhaladores de dosis medidas e inhaladores de polvos, la totalidad de los cuales resultará familiar al experto en la materia.

También se encuentra contemplada la administración nasal de una composición farmacéutica dada a conocer en la presente memoria. La administración nasal permite el paso de una composición farmacéutica de la presente exposición hasta el torrente sanguíneo directamente después de la administración del producto terapéutico en la nariz, sin necesidad de que se deposite el producto en el pulmón. Entre las formulaciones para la administración nasal se incluyen las que contienen dextrano o ciclodextrano.

Las composiciones también pueden formularse en composiciones rectales o vaginales, tales como supositorios o enemas de retención, p. ej., que contengan bases supositorios convencionales, tales como manteca de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender, además, portadores o excipientes sólidos o en fase gel adecuados. Entre los ejemplos de dichos portadores o excipientes se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros, tales como los polietilenglicoles.

Son formas de preparación farmacéutica líquidas o sólidas adecuadas, por ejemplo, las soluciones acuosas o salinas para la inhalación, microencapsuladas, encocleadas, recubiertas sobre partículas microscópicas de oro, contenidas en liposomas, nebulizadas, aerosoles, pellets para la implantación en la piel o secas sobre un objeto afilado para rasparlas dentro de la piel. Las composiciones farmacéuticas incluyen, además, gránulos, cápsulas, polvos, tabletas, píldoras, tabletas recubiertas, (micro)cápsulas, supositorios, jarabes, emulsiones, suspensiones, cremas, gel, gotas, parches, trociscos o preparados con liberación prolongada de composiciones activas, en cuya preparación se utilizan habitualmente excipientes, aditivos y/o adyuvantes, tales como desintegrantes, ligantes, agentes de recubrimiento, agentes de hinchado, lubricantes, saborizantes, edulcorantes o solubilizadores, tal como se ha indicado anteriormente. Las composiciones farmacéuticas resultan adecuadas para la utilización en una diversidad de sistemas de administración de fármaco.

Según otro objetivo de la presente invención, se proporciona una composición de combinación tal como se ha indicado anteriormente para su utilización en la prevención, inhibición, retraso o tratamiento de la degeneración neuronal en un sujeto que sufre de una enfermedad o condición neurodegenerativa.

Más particularmente, la invención proporciona una composición de combinación para su utilización en la prevención de la inhibición, retraso o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad o condición neurodegenerativa seleccionada del grupo que consiste en: enfermedad de Alzheimer (EA), demencia senil de tipo EA (DSEA), enfermedad de Parkinson y todos los síndromes parquinsonianos, demencia de cuerpos de Lewis, deterioro cognitivo leve (DCL), alteraciones de la memoria asociadas a la edad (AMAE) y problemas asociados al envejecimiento, neurodegeneración no cognitiva, degeneración neuromuscular no cognitiva, degeneración gangliónica corticobasal, atrofia multisistema, atrofia cerebral, atrofia olivopontocerebelar, parálisis supranuclear, enfermedad de Niemann-Pick de tipo A, enfermedad de Pick, neurodegeneración traumática, ataxia de Friedreich, ataxia espinocerebelar de tipo 2, síndrome de Fahr, síndrome de Joubert, enfermedad de Huntington, enfermedad de la poliglutamina, atrofia dentatorubral, atrofia pálido-luisiana, atrofia espinobulbar, distrofia miotónica, enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), miastenia grave, enfermedad de Lambert-Eaton, amiotrofia espinal infantil o amiotrofia espinal progresiva, neurodegeneración motora-sensorial, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (tipos 1 y 4), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), enfermedades leucodistróficas, tales como la leucodistrofia metacromática y la adrenoleucodistrofia enfermedad de Alexander, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Zellwegger, enfermedad de Canavan, síndrome de Pelizaeus-Merzbacher, adrenomieloneuropatía, neuropatías, incluyendo la neuropatía hereditaria, la neuropatía diabética y la neuropatía antimitótica.

En una realización particular de la invención, la enfermedad o condición neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer (EA), demencia senil de tipo EA (DSEA) y enfermedad de Parkinson.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas en pacientes que lo necesitan, que comprende la administración en dichos pacientes de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como sustancia activa, y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable tal como se ha definido anteriormente. En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina estereoidea y un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado a la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas en pacientes que lo necesitan, que comprende la administración en dichos pacientes de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como compuestos activos, y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable tal como se ha definido anteriormente. En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina estereoidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado a la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de diosgenina, ácido cafeico y ácido ferúlico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado a la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de sarsasapogenina, ácido cafeico y ácido ferúlico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado a la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas. En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de smilagenina, ácido cafeico y ácido ferúlico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado a la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para la prevención de enfermedades o condiciones neurodegenerativas en pacientes que lo necesitan, que comprende la administración en dichos pacientes de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como sustancia activa, y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable tal como se ha definido anteriormente.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina estereoidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado al tratamiento de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

Otro objeto de la invención se refiere a un método para el tratamiento de enfermedades o condiciones neurodegenerativas en pacientes que lo necesitan, que comprende la administración en dichos pacientes de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina esteroidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como compuestos activos, y por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable tal como se ha definido anteriormente.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una sapogenina estereoidea, un primer compuesto polifenólico y opcionalmente un segundo compuesto polifenólico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado al tratamiento de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de diosgenina, ácido cafeico y ácido ferúlico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado al tratamiento de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de sarsasapogenina, ácido cafeico y ácido ferúlico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado al tratamiento de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

En una realización particularmente ventajosa, la presente invención se refiere a la utilización de una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de smilagenina, ácido cafeico y ácido ferúlico como compuestos activos en la preparación de un producto medicinal destinado al tratamiento de enfermedades o condiciones neurodegenerativas.

A continuación, se describe la invención en mayor detalle en los ejemplos no limitativos siguientes y las figuras 1 a 20 adjuntas.

FIGURAS

Las figuras 1A y 1B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de NSP02-14-E002 (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 1A) y de la red de neuritas (figura 1B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor, seguido de prueba de diferencia mínima significativa protegida (PLSD, por sus siglas en inglés) de Fisher).

La figura 1C muestra la concentración de diferentes compuestos en una dosis de extracto sometida a ensayo -NSP02-14-E002 (en gris, el intervalo de concentraciones activas).

Las figuras 2A y 2B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de NSP02-29-E001 (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 2A) y de la red de neuritas (figura 2B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor, seguido de prueba de diferencia mínima significativa protegida (PLSD) de Fisher).

La figura 2C muestra la concentración de diferentes compuestos en una dosis de extracto sometida a ensayo -NSP02-29-E001 (en gris, el intervalo de concentraciones activas).

Las figuras 3A y 3B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de NSP02-29-E002 (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 3A) y de la red de neuritas (figura 3B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor, seguido de prueba de diferencia mínima significativa protegida (PLSD) de Fisher).

La figura 3C muestra la concentración de diferentes compuestos en una dosis de extracto sometida a ensayo -NSP02-29-E002 (en gris, el intervalo de concentraciones activas).

Las figuras 4A y 4B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de NSP19-30-E002 (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 4A) y de la red de neuritas (figura 4B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor, seguido de prueba de diferencia mínima significativa protegida (PLSD) de Fisher).

La figura 4C muestra la concentración de diferentes compuestos en una dosis de extracto sometida a ensayo -NSP19-30-E002 (en gris, el intervalo de concentraciones activas).

Las figuras 5A y 5B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de NSP20-31-E002 (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 5A) y de la red de neuritas (figura 5B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor, seguido de prueba de diferencia mínima significativa protegida (PLSD) de Fisher).

La figura 5C muestra la concentración de diferentes compuestos en una dosis de extracto sometida a ensayo -NSP20-31-E002 (en gris, el intervalo de concentraciones activas).

Las figuras 6A y 6B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de sarsasapogenina (SAR) (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 6A) y de la red de neuritas (figura 6B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 7A y 7B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de diosgenina (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 7A) y de la red de neuritas (figura 7B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 8A y 8B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de dioscina (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 8A) y de la red de neuritas (figura 8B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 9A y 9B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de quercetina (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 9A) y de la red de neuritas (figura 9B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 10A y 10B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de catequina (CAT) (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 10A) y de la red de neuritas (figura 10B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 11A y 11B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de ácido cafeico (CAF) (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 11A) y de la red de neuritas (figura 11B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 12A y 12B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de ácido coumárico (COU) (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 12A) y de la red de neuritas (figura 12B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 13A y 13B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de ácido ferúlico (FA) (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 13A) y de la red de neuritas (figura 13B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Las figuras 14A y 14B ilustran el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de ácido gálico (GÁLICO) (diferentes concentraciones) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias (figura 14A) y de la red de neuritas (figura 14B). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p<0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

La figura 15 ilustra el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de compuestos de mezcla (diferentes concentraciones de combinaciones binarias: DIOSG/CAF y DIOSG/FA) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias. Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

La figura 16 ilustra el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de compuestos de mezcla (diferentes concentraciones de combinaciones binarias: DIOSG/CAF y DIOSG/FA) sobre la red de neuritas (derecha). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

La figura 17 ilustra el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de compuestos de mezcla (diferentes concentraciones de combinaciones binarias: SAR/CAF y SAR/FA) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias. Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

La figura 18 ilustra el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de compuestos de mezcla (diferentes concentraciones de combinaciones binarias: SAR/CAF y SAR/FA) sobre la red de neuritas (derecha). Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

La figura 19 ilustra el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de compuestos de mezcla (diferentes concentraciones de combinaciones ternarias: DIOSG/CAF/FA) sobre la supervivencia de las neuronas corticales primarias. Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

La figura 20 ilustra el efecto del glutamato (40 gM, 20 min) en presencia o en ausencia de compuestos de mezcla (diferentes concentraciones de combinaciones ternarias: DIOSG/CAF/FA) sobre la red de neuritas. Los datos se expresan como porcentaje del control, como medias ± SEM (100% = sin glutamato). *p < 0,05 vs glutamato (ANOVA de un factor seguido de prueba de Dunnett).

Ejemplos

Ejemplo 1: efecto neuroprotector en el modelo de enfermedad de Alzheimer (EA)

La excitotoxicidad del glutamato es responsable de la muerte neuronal en trastornos neurológicos agudos, incluyendo las enfermedades neurodegenerativas. La pérdida de la homeostasis del calcio es un mediador clave en la muerte celular inducida por el glutamato. Los inventores sometieron a ensayo extractos procedentes de Verbena officinalis para su capacidad de prevenir o reducir los efectos tóxicos del glutamato sobre las neuronas corticales primarias lesionadas por glutamato.

1. Materiales y métodos

1.1. Preparación de extracto vegetal

El extracto obtenido mediante maceración etanólica (EtOH al 50-70 % v/v) asistida por ultrasonido (EAU), de acuerdo con la Farmacopea europea 04/2008-0765, se denomina NSP02-14-E002 (Dioscorea persimilis), NSP02-29-E002 (Dioscorea villosa), NSP19-30-E002 (Asparagus officinalis) NSP20-31-E002 (Smilax aspera). El extracto obtenido mediante el protocolo de decocción tradicional (y optimizado con microondas o no) se denomina NSP02-29-E001 (Dioscorea villosa).

El perfil de triterpenoides tricíclicos y el perfil de compuestos fenólicos del extracto se miden mediante dos métodos de cromatografía líquida de rendimiento ultraelevado (UHPLC). Las concentraciones de los diferentes compuestos se calculan a partir de dichos perfiles. Las muestras y patrones se analizaron en un instrumento UHPLC-QqToF (Dionex Ultimate 3000 dotado de bomba RS, automuestreador y compartimiento de columna termostática y red de diodos UV, Thermo Scientific®) conectado con un espectrómetro de masas (EM) preciso dotado de una fuente de iones de electropulverización (ESI, por sus siglas en inglés) (Impact II, Bruker Daltonics®). Los espectros de masas se captaron en modos de ion positivo y de ion negativo de acuerdo con las características físicas y químicas de los compuestos. El primer método permite identificar y cuantificar los compuestos fenólicos (ácidos hidroxicinámicos, ácidos hidroxibenzoicos, flavonoides y derivados sustituidos/heterosídicos de los mismos); el segundo método es específico de los triterpenoides tetracíclicos. Dichos métodos son la adaptación y trasposición de muchos métodos analíticos [Tang Y, Yi T, Chen H, Zhao Z, Liang Z, Chen H., Phytochem Anal. (2013) 24:413-22; Narváez-Cuenca CE et al., Food Chemistry (2012) 130: 730-738; Ouyang H et al., Journal of Chromatographic Science (2016) 54(6): 1028­ 1036; Rehecho S et al., LWT - Food Science and Technology (2011) 44: 875-882; Quirantes-Piné R et al., Phytomedicine (2013) 20: 1112-1118; Brito A et al., Molecules (2014) 19: 17400-17421 ; Wang Y et al., J Anal Methods Chem. (2015) 2015:130873].

Para los ácidos hidroxicinámicos, ácidos hidroxibenzoicos, flavonoides y derivados sustituidos/heterosídicos de los mismos:

Muestra: se disolvieron 0,0020 g de extracto seco con 5 ml de MeOH y 5 ml de EtOH al 60 % (v/v) (etanol - Lichrosolv®, grado gradiente y agua - Chromasolv®, grado gradiente; Sigma-Aldrich, Lyon, Francia). Se homogeneizó con ultrasonidos durante 5 min.

Patrones (solución madre). Se disolvieron 0,0050 g de cada patrón con 5 ml de una mezcla adecuada de solventes. Se homogeneizaron con ultrasonidos durante 5 min. Para la catequina, la rutina y los ácidos gálico, clorogénico, cafeico, ferúlico, rosmarínico y 4,5-dicafeoilquínico [Extrasynthese, Genay, France; Sigma Aldrich, Lyon, Francia; Phytolab, Vestenbergsgreuth, Alemania] se añadieron 0,5 ml de EtOH al 60 % y 0,5 ml de MeOH (Chromasolv®, grado gradiente; Sigma-Aldrich, Lyon, Francia). Se homogeneizaron y se añadió 1 ml de EtOH al 60 % y se ajustaron a 5 ml con 3 ml de agua. Para el luteolín-7-glucósido y la vitexina (Extrasynthese, Genay, Francia): 0,5 ml de EtOH al 60 %, 0,5 ml de MeOH y 0,5 ml de H2O. Se homogeneizaron y se añadieron 0,5 ml de 2-PrOH y se ajustaron a 5 ml con 3 ml de agua. Para la apigenina (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia): 3 ml de EtOH al 60 % y 2 ml de 2-PrOH. Para la luteolina y la quercetina (Sigma-Aldrich, Lyon, Francia): 4 ml de EtOH al 60 % y 1 ml de 2-PrOH (hipergrado para CL-EM LiChrosolv®, Sigma-Aldrich, Lyon, Francia).

Se introdujeron 50,0 gl de cada solución madre en un matraz volumétrico de 5 ml, se añadieron 300 gl de H2O y se ajustaron a 5 ml con EtOH al 60 %.

Las muestras y los patrones se analizaron utilizando una columna DIONEX Acclaim@ C18 (2,2 gm, 150 x 2,1 mm) a 50°C. Los eluyentes utilizados eran agua/ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) (eluyente A) y acetonitrilo/ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) (eluyente B) (Chromasolv®, grado gradiente y CL-EM ultragrado; Sigma-Aldrich, Lyon, Francia). El programa de elución (condiciones de elución) era: 0-6,5 min, 3-11 % B; 6,5-17 min, 11-20 % B; 17-22 min, 20-36 % de B; 22-29 min, 36-48 % de B; 29-32 min, 48-55 % de B; 32-35 min, 55-74 % de B; 35-37 min, 74-90 % de B; 37-40 min, 90 % de B; 40-40,5 min, 90-3% B; 40,5-42 min, 3% B. El caudal era de 380 gl/min; detección por red de diodos (DAD, por sus siglas en inglés) a 240 y 280 nm; la detección de EM fue en modo de ion negativo, con un voltaje fuente de 3,5 kV y una temperatura de tubo de transferencia iónica de 350°C. Se registró un espectro de masas completo en todo el rango de valores de m/z de 50-1500; el volumen de inyección era de 2 gl.

Para los triterpenoides tetracíclicos y derivados de los mismos:

Muestra. Se disolvieron 0,0020 g de extracto seco con 5 ml de MeOH y 5 ml de EtOH al 60 % (v/v). Se homogeneizaron con ultrasonidos durante 5 min.

Patrones (solución madre). Se disolvieron 0,0050 g de cada patrón con 5 ml de una mezcla adecuada de solventes. Se homogeneizaron con ultrasonidos durante 5 min. Para la protodioscina, la dioscina, la diosgenina y la sarsasapogenina (Selleckchem - Euromedex, Souffelweyersheim, Francia), se añadieron 5 ml de MeOH y se homogeneizaron con ultrasonidos durante 5 min.

Se introdujeron 500,0 gl de cada solución madre en un matraz volumétrico de 5 ml y se ajustaron a 2,0 ml con 0,5 ml de MeOH y 1,0 ml de EtOH al 60 %.

Las muestras y los patrones se analizaron utilizando una columna DIONEX Acclaim@ C18 (2,2 gm, 150 x 2,1 mm) a 50°C. Los eluyentes utilizados eran agua/ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) (eluyente A) y acetonitrilo/ácido fórmico (99,9:0,1, v/v) (eluyente B). El programa de elución (condiciones de elución) era: 0-1 min, 10 % de B; 1-14 min, 10-90 % de B; 14-16,5 min, 90-95 % de B; 16,5-20,5 min, 95 % de B; 20,5-21 min, 95-10 % de B; 21-25 min, 10 % de B. El caudal era de 450 gl/min; la detección DAD fue a 210 nm; la detección de EM fue en modo de ion negativo, con una fuente de voltaje de 3,5 kV y una temperatura del tubo de transferencia iónica de 350°C. Se registró un espectro de masas completo en todo el rango de valores de m/z de 50-1500; el volumen de inyección era de 2 gl.

1.2. Modelo celular

Se cultivaron neuronas corticales de rata tal como se indica en Singer et al., (J. Neuroscience, (1999), 19(7), 2455­ 2463) and Callizot et al. (J. Neurosc., (2013), Res. 91(5), 706-716).

Se eutanizaron las hembras gestantes (Wistar; JanvierLabs, St Berthevin, Francia) a los 15 días de gestación mediante dislocación cervical. Se recolectaron los fetos y se introdujeron inmediatamente en medio L15 de Leibovitz helado (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) con una solución de penicilina al 2 % (10.000 U/ml) y estreptomicina (10 mg/ml) (PS, Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) y albúmina de suero bovino al 1 % (BSA, Pan Biotech, Aidenbach, Alemania). Se trató el córtex durante 20 min a 37°C con una solución de tripsina-EDTA (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) a una concentración final de tripsina al 0,05 % y EDTA al 0,02 %. Se detuvo la disociación mediante la adición de medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 4,5 g/litro de glucosa (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania) que contenía ADNasa I de grado II (concentración final: 0,5 mg/ml; Pan Biotech, Alemania) y suero de feto bovino al 10 % (FCS; Invitrogen, Cergy Pointoise, Francia). Las células se disociaron mecánicamente mediante tres pasos forzados a través de la punta de una pipeta de 10 ml. A continuación, se centrifugaron las células a 515 g durante 10 min a 4°C. Se desechó el sobrenadante y se resuspendió el pellet en un medio de cultivo definido que consistía en medio Neurobasal (Invitrogen, Cergy Pointoise, Francia) con una solución al 2 % de complemento B27 (Invitrogen, Cergy Pointoise, Francia), 2 mmol/l de L-glutamina (Pan Biotech, Aidenbach, Alemania), solución de PS al 2 % y 10 ng/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF, Pan Biotech, Aidenbach, Alemania). Se contaron las células viables en un citómetro de Neubauer, utilizando la prueba de exclusión de azul tripán. Se sembraron las células a una densidad de 30.000 por pocillo en placas de 96 pocillos prerrecubiertas con poli-L-lisina (Corning Biocoat, Tewksbury, EE. UU.) y se cultivaron a 37°C en un incubador de aire (95 %)-CO2 (5 %). Se cambió el medio cada 2 días. Las neuronas corticales se intoxicaron con soluciones de glutamato (ver posteriormente) tras 13 días de cultivo.

1.3. Exposición a glutamato

El día 13, se añadió glutamato (Sigma Aldrich, Lyon, Francia) al cultivo celular hasta una concentración final de 40 pM diluida en medio de control en presencia o en ausencia de compuestos de ensayo durante 20 min. Tras 20 min, se sacaron las células mediante lavado y se añadió medio fresco nuevo que contenía o no extracto NSPXX-E2 o NSPXX-E1 durante 48 h de tiempo adicional.

1.4. Evaluación de la supervivencia

Tras 48 horas de intoxicación con glutamato, las células se fijaron con una solución fría de etanol (95 %, Sigma) y ácido acético (5 %, Sigma) durante 5 min a -20°C. Tras la permeabilización con 0,1 % de saponina (Sigma), las células se incubaron durante 2 h con anticuerpo monoclonal de ratón antiproteína 2 asociada a los microtúbulos (MAP-2; Sigma) a una dilución de 1/400 en PBS (Pan Biotech) que contenía 1 % de suero de feto bovino (Invitrogen) y 0,1 % de saponina.

Dicho anticuerpo se reveló con IgG de cabra antirratón-Alexa Fluor 488 (Invitrogen) a una dilución de 1/400 en PBS que contenía 1 % de suero de feto bovino y 0,1 % de saponina, durante 1 h a temperatura ambiente.

1.5. Análisis técnico y estadístico

1.5.1. Evaluación de la longitud de la red de neuritas:

Para cada condición, se evaluaron 6 pocillos, se obtuvieron 30 fotografías por pocillo con MetaXpress (Molecular Devices) a una ampliación de 20x (30 fotografías a x20 representan ~ 80 % de la superficie total de un pocillo), con el fin de evaluar la red de neuritas (tinción con MAP-2). El análisis de imagen se realizó con el software de edición MetaXpress, módulo personalizado (Molecular Devices); se registró la longitud total de neuritas por fotografía). Se calculó automáticamente la longitud media de neurita por pocillo de diez fotografías; a continuación, se obtuvo un número por pocillo (se proporcionan 6 datos en bruto por condición).

1.5.2. Evaluación de la supervivencia neuronal:

Para condición se evaluaron 6 pocillos; se obtuvieron 30 fotografías por pocillo con MetaXpress (Molecular Devices) con una ampliación de 20x para evaluar los cuerpos celulares (tinción con MAP-2). El análisis de imagen se realizó con el software de edición MetaXpress, módulo personalizado (Molecular Devices); se registró el número de neuronas por fotografía. Se calculó automáticamente el número medio de neuronas por pocillo de diez fotografías; a continuación, se obtuvo un número por pocillo (se proporciona un total de 6 datos en bruto por condición).

1.6. Análisis estadístico

Todos los valores se expresaron como medias /- s.e. (por sus siglas en inglés, error estándar de la media). Se expresaron los datos como porcentaje de las condiciones de control (sin intoxicación, sin glutamato = 100 %) con el fin de expresar las lesiones por glutamato.

Se llevaron a cabo análisis estadísticos de las diferentes condiciones (ANOVA de un factor seguido de pruebas de Dunnett o PLSD de Fisher si era posible, software Statview versión 5.0). Se consideró un nivel de significancia de p<0.05.

2. Resultados

2.1 Resultados obtenidos para el extracto vegetal NSP02-14-E001 (extracto etanólico de Dioscorea persimilis) Los resultados se muestran en la figura 1.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de NSP02-14-E002 (500 ng/ml a 5 pg/ml) añadido 1 h antes que el glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 1A) y la red neurítica (figura 1B).

Se analizó el extracto vegetal NSP02-14-E001 utilizando una columna C18 DIONEX Acclaim@ (2,2 pm, 150x2,1 mm) a 50°C, tal como se ha mencionado anteriormente en el punto 1.1, con el fin de identificar los compuestos neuroprotectores potenciales presentes en el extracto. Se proporcionan los resultados en la figura 1C.

El extracto vegetal NSP02-14-E001 (Dioscorea persimilis) contenía catequina y trazas de derivado de diosgenina (dioscina).

2.2 Resultados obtenidos para el extracto vegetal NSP02-29-E001 (extracto acuoso de Dioscorea villosa)

Los resultados se proporcionan en la figura 2.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de NSP02-29-E001 (10 a 500 ng/ml) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 2A) y la red neurítica (figura 2B), con un efecto protector significativo entre 50 y 500 ng/ml.

A las concentraciones más altas el extracto era tóxico.

Se analizó el extracto vegetal NSP02-29-E001 utilizando una columna C18 DIONEX Acclaim@ (2,2 pm, 150x2,1 mm) a 50°C, tal como se ha mencionado anteriormente en el punto 1.1, con el fin de identificar los compuestos neuroprotectores potenciales presentes en el extracto. Se proporcionan los resultados en la figura 2C.

EL extracto vegetal NSP02-29-E001 (Dioscorea villosa) contenía derivados de catequina y diosgenina (dioscina y protodioscina).

2.3 Resultados obtenidos para el extracto vegetal NSP02-29-E002 (extracto hidroalcohólico de Dioscorea villosa) Los resultados se proporcionan en la figura 3.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de NSP02-29-E002 (50 a 500 ng/ml) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 3A) y la red neurítica (figura 3B), con un efecto protector significativo entre 100 y 500 ng/ml.

A las concentraciones más altas el extracto era tóxico.

Se analizó el extracto vegetal NSP02-29-E002 utilizando una columna C18 DIONEX Acclaim@ (2,2 pm, 150x2,1 mm) a 50°C, tal como se ha mencionado anteriormente en el punto 1.1, con el fin de identificar los compuestos neuroprotectores potenciales presentes en el extracto. Se proporcionan los resultados en la figura 3C.

EL extracto vegetal NSP02-29-E002 (Dioscorea villosa) contenía catequina y trazas de derivado de diosgenina (dioscina y protodioscina).

2.4 Resultados obtenidos para el extracto vegetal NSP19-30-E002 (extracto hidroalcohólico de Asparagus officinalis) Los resultados se proporcionan en la figura 4.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de NSP19-30-E002 (500 ng/ml a 10 pg/ml) añadido 1 h antes que el glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 4A) y la red neurítica (figura 4B).

Se analizó el extracto vegetal NSP19-30-E002 utilizando una columna C18 DIONEX Acclaim@ (2,2 pm, 150x2,1 mm) a 50°C, tal como se ha mencionado anteriormente en el punto 1.1, con el fin de identificar los compuestos neuroprotectores potenciales presentes en el extracto. Se proporcionan los resultados en la figura 4C.

El extracto vegetal NSP19-30-E002 (Asparagus officinalis) contenía sarsasapogenina, ácido cafeico y ácido coumárico.

2.5 Resultados obtenidos para el extracto vegetal NSP20-31-E002 (extracto hidroalcohólico de Smilax aspera) Los resultados se proporcionan en la figura 5.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neurona! significativa (~30 %) (figura 5A). En presencia de NSP19-30-E002 (1 gg/ml a 5 gg/ml) añadido 1 h antes que el glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (~80 % de supervivencia) sobre la red neurítica (figura 5B).

Se analizó el extracto vegetal NSP19-30-E002 utilizando una columna C18 DIONEX Acclaim@ (2,2 gm, 150x2,1 mm) a 50°C, tal como se ha mencionado anteriormente en el punto 1.1, con el fin de identificar los compuestos neuroprotectores potenciales presentes en el extracto. Se proporcionan los resultados en la figura 5C.

El extracto vegetal NSP19-30-E002 (Smilax aspera) contenía sarsasapogenina.

Ejemplo 2: Evaluación del efecto neuroprotector de la sarsasapogenina (SAR), diosgenina (DIOSG), dioscina (DIOS), quercetina, catequina, ácido cafeico (CAF), ácido coumárico (COU), ácido ferúlico (FA) y ácido gálico.

Se llevó a cabo un análisis analítico preciso del perfil químico de los extractos NSP02-29-E001, NSP02-29-E002 y NSP19-30-E002. Se sospechaba que varios compuestos participaban en dicho efecto y que actuaban sinérgicamente. En el presente estudio, el efecto neuroprotector de una mezcla de moléculas individuales sobre las neuronas corticales primarias lesionadas por la exposición al glutamato se evaluó según el método proporcionado en el Ejemplo 1. 1. Efecto de la sarsasapogenina (SAR, saponina esteroidea).

Los resultados se proporcionan en la figura 6.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de SAR (100 pM a 100 nM) añadida 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal y la red neurítica, con un efecto protector significativo entre 100 pM y 10 nM para la red neurítica (figura 6B) y 100 nM para la supervivencia neuronal (figura 6A).

A las concentraciones más altas el extracto era tóxico.

2. Efecto de la diosgenina (DIOSG, saponina esteroidea).

Los resultados se proporcionan en la figura 7.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de DIOSG (3 pM a 30 pM) añadido 1 h antes que el glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 7A) y la red neurítica (figura 7B).

3. Efecto de la dioscina (DIO, saponina esteroidea, derivado heterosídico de la diosgenina).

Los resultados se proporcionan en la figura 8.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de DIOS (6,3 nM a 630 nM) añadido 1 h antes que el glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 8A) y la red neurítica (figura 8B).

4. Efecto de la quercetina (fenilpropanoide - flavonoide).

Los resultados se proporcionan en la figura 9.

En presencia de quercetina añadida 1 h antes que el glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (85 % de supervivencia) a una concentración de 1 y 10 nM sobre la supervivencia neuronal (figura 9A), así como la red neurítica (figura B) a concentraciones de 100 nM y 1 gM.

5. Efecto de la catequina (fenilpropanoide - flavonoide).

Los resultados se proporcionan en la figura 10.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de CAT (1 nM-1 gm) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 10A) y la red neurítica (figura 10B), con un efecto protector significativo entre 100 nM y 1 pM sobre la supervivencia neuronal.

6. Efecto del ácido cafeico (CAF, fenilpropanoide - ácido hidroxicinámico).

Los resultados se proporcionan en la figura 11.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de CAT (500 nM-5 pm) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 11A) y la red neurítica (figura 11B), con un efecto protector significativo entre 500 nM y 5 pM sobre la supervivencia neuronal.

7. Efecto del ácido coumárico (COU, fenilpropanoide - ácido hidroxicinámico).

Los resultados se proporcionan en la figura 12.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de COU (100 nM-1 pm) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 12A) y la red neurítica (figura 12B), con un efecto protector significativo a una concentración de 100 nM sobre la supervivencia neuronal. 8. Efecto del ácido ferúlico (FA).

Los resultados se proporcionan en la figura 13.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de FA (1 pM-100 pm) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 13 A) y la red neurítica (figura 13B), con un efecto protector significativo entre 1 pM y 100 pM sobre la red neurítica.

9. Efecto del ácido gálico.

Los resultados se proporcionan en la figura 14.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %). En presencia de ácido gálico (10 pM) añadido 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal (figura 14 A) y la red neurítica (figura 14B), con un efecto protector significativo entre 10 pM y 1 pM sobre la red neurítica.

Ejemplo 3: efectos neuroprotectores de combinaciones binarias o ternarias.

El efecto neuroprotector sobre las neuronas corticales primarias lesionadas mediante la exposición a glutamato de una mezcla de dos o tres moléculas sometidas a ensayo individualmente en el Ejemplo 2 se evaluó siguiendo el método proporcionado en el Ejemplo 1. También se evaluó su efecto sinérgico.

1. Composiciones de combinación binaria.

Se sometieron a ensayo las composiciones de combinación binarias siguientes a diferentes concentraciones.

• Diosgenina (DIOS), como saponina esteroidea, en combinación con ácido cafeico (CAF) o ácido ferúlico (FA) como primer compuesto polifenólico, y

• sarsasapogenina (SAR), como saponina esteroidea, en combinación con ácido cafeico (CAF) o ácido ferúlico (FA) como primer compuesto polifenólico.

1.1 Efecto de la diosgenina (DIOS) como saponina esteroidea en combinación con ácido cafeico (CAF) o ácido ferúlico (FA) como primer compuesto polifenólico.

Los resultados se proporcionan en las figuras 15 y 16.

El glutamato (40 pM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %) y una gran pérdida de neuritas (~40 %). En presencia de compuestos de mezcla (combinaciones binarias de DlOSG/CAF o DIOSG/FA) añadidos 1 h antes del glutamato y que se dejaron durante la aplicación de tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia de las neuronas y la red neurítica para la mezcla DIOSG/FA a concentraciones de 0,3 pM/10 nM y 0,3 pM/1 nM, con un efecto protector significativo a las mismas concentraciones sobre la red neurítica y para la mezcla DlOSG/CAF (0,3 pM/500 pM).

Mediante la combinación de diosgenina con ácido cafeico y ácido ferúlico, se redujo la concentración de diosgenina en 10 veces en comparación con la concentración de diosgenina al utilizar la diosgenina sola.

1.2. Efecto de la sarsasapogenina, como saponina esteroidea, en combinación con ácido cafeico o ácido ferúlico como primer compuesto polifenólico.

Los resultados se proporcionan en las figuras 17 y 18.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %) y una gran pérdida de neuritas (~40 %). En presencia de compuestos de mezcla (combinaciones binarias de SAR/CAF o SAR/FA) añadidos 1 h antes del glutamato y que se dejaron durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector (~80 % de supervivencia) sobre la supervivencia de las neuronas y la red neurítica para la mezcla SAR/CAF a concentraciones de 10 pM/5 nM y 10 pM/500 nM y de la mezcla SAR/FA a concentraciones de 10 pM/1 nM y 10 pM/10 nM, con un efecto protector significativo a las mismas concentraciones sobre la red neurítica.

Mediante la combinación de sarsasapogenina y ácido cafeico o ácido ferúlico, se redujo la concentración de diosgenina en 10 veces en comparación con la concentración de sarsasapogenina al utilizar la sarsasapogenina sola.

2. Composiciones de combinación ternaria.

Las combinaciones ternarias se prepararon mediante la utilización de:

• una dosis de diosgenina de entre 0,03 pM y 0,3 pM,

• una dosis de ácido cafeico a una concentración de entre 5 nM y 50 nM y

• una dosis de ácido ferúlico a una concentración de entre 1 nM y 10 nM.

Los resultados se proporcionan en las figuras 19 y 20.

El glutamato (40 gM, 20 min) indujo una muerte neuronal significativa (~30 %) y una gran pérdida de neuritas (~40 %). En presencia de compuestos de mezcla (combinación ternaria DIOSG/CAF/Fa) añadida 1 h antes del glutamato y que se dejó durante la aplicación del tóxico y durante las 48 h siguientes al lavado, se observó un efecto protector significativo (~80 %- 90 % de supervivencia) sobre la supervivencia neuronal y la red neurítica a las concentraciones siguientes:

(i) 0,03 pM/5 nM/1 nM (para la supervivencia neuronal)

(ii) 0,03 pM/5 nM/10 nM (para ambos)

(i) 0,03 pM/50 nM/10 nM (para la supervivencia neuronal)

(ii) 0,3 pM/5 nM/1 nM (para ambos)

(iii) 0,3 pM/5 nM/10 nM (para ambos)

(iv) 0,3 pM/50 nM/1 nM (para ambos)

(v) 0,3 pM/50 nM/10 nM (para ambos).

Mediante la combinación DIOSG/CAF/FA, se redujo la concentración de diosgenina en 100 veces, con una concentración de 0,03 pM, en comparación con la concentración de diosgenina al utilizar la diosgenina sola.

Claims (12)

1. REIVINDICACIONES

   i. Composición de combinación que comprende como componentes activos, en cantidades sinérgicamente eficaces:

   a. una saponina estereoidea de origen natural o sintético, una sal farmacéuticamente aceptable de la misma o un extracto vegetal que contiene saponina estereoidea, y

   b. ácido cafeico como primer compuesto polifenólico y

   c. ácido ferúlico como segundo compuesto polifenólico.
2. 2. Composición de combinación según la reivindicación 1, en la que la saponina esteroidea se seleccionó del grupo que consiste en diosgenina, sarsasapogenina, sarsaponina, smilagenina, tigogenina, laxogenina, los derivados naturales de las mismas seleccionadas de entre dioscina, protodioscina, icogenina, Meprotodioscina y dioscoréside E, y mezclas de las mismas.
3. 3. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en la que la proporción molar de saponina esteroidea/ácido cafeico/ácido ferúlico está comprendida entre 0,03/5000/1000 y 10/50000/10000.
4. 4. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la saponina esteroidea está presente a una concentración de entre 0,01 pM y 15 pM, el ácido cafeico está presente a una concentración de entre 1 nM y 100 nM y el ácido ferúlico está presente a una concentración de entre 0,5 nM y 20 nM.
5. 5. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el extracto vegetal es un extracto etanólico procedente de una familia de plantas seleccionada del grupo que consiste en Dioscoreaceae, Asparagaceae, Smilacaceae, Fabaceae y una mezcla de las mismas.
6. 6. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para la utilización de la misma como medicamento o como una composición nutracéutica.
7. 7. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende, además, por lo menos un excipiente farmacéutica o nutracéuticamente aceptable.
8. 8. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición de combinación resulta adecuada para la administración oral, la administración tópica, la administración transdérmica, la administración parenteral y combinaciones de las mismas.
9. 9. Composición de combinación según la reivindicación 8, en la que la composición se formula como gránulos, polvos, jarabes, soluciones, suspensiones, aerosoles, tabletas, cápsulas, trociscos, píldoras, inyecciones, supositorios, cremas, gotas, geles o parches.
10. 10. Composición de combinación según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la utilización de la misma en la prevención, inhibición, retraso o tratamiento de un sujeto que sufre de una enfermedad o condición neurodegenerativa.
11. 11. Composición de combinación según la reivindicación 10, en la que dicha enfermedad o condición neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en: enfermedad de Alzheimer (EA), demencia senil de tipo EA (DSEA), enfermedad de Parkinson y todos los síndromes parquinsonianos, demencia de cuerpos de Lewis, deterioro cognitivo leve (DCL), alteraciones de la memoria asociadas a la edad (AMAE) y problemas asociados al envejecimiento, neurodegeneración no cognitiva, degeneración neuromuscular no cognitiva, degeneración gangliónica corticobasal, atrofia multisistema, atrofia cerebral, atrofia olivopontocerebelar, parálisis supranuclear, enfermedad de Niemann-Pick de tipo A, enfermedad de Pick, neurodegeneración traumática, ataxia de Friedreich, ataxia espinocerebelar de tipo 2, síndrome de Fahr, síndrome de Joubert, enfermedad de Huntington, enfermedad de la poliglutamina, atrofia dentatorubral, atrofia pálido-luisiana, atrofia espinobulbar, distrofia miotónica, enfermedad de Machado-Joseph, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), miastenia grave, enfermedad de Lambert-Eaton, amiotrofia espinal infantil o amiotrofia espinal progresiva, neurodegeneración motora-sensorial, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (tipos 1 y 4), leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), enfermedades leucodistróficas, tales como la leucodistrofia metacromática y la adrenoleucodistrofia, enfermedad de Alexander, enfermedad de Krabbe, enfermedad de Zellwegger, enfermedad de Canavan, síndrome de Pelizaeus-Merzbacher, adrenomieloneuropatía, neuropatías, incluyendo la neuropatía hereditaria, la neuropatía diabética y la neuropatía antimitótica.
12. 12. Composición de combinación según la reivindicación 11, en la que dicha enfermedad o condición neurodegenerativa se selecciona del grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer (EA), demencia senil de tipo EA (DSEA) y enfermedad de Parkinson.