ES2931455T3 - Aislamiento continuo integrado de corrientes de fluido desde recipiente de proceso estériles - Google Patents
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Abstract
En este documento se proporcionan procesos de aislamiento y el hardware asociado para permitir que las corrientes de fluido se aíslen de un sistema esterilizado (por ejemplo, un recipiente de proceso estéril) que contiene un proceso estéril. Los procesos de aislamiento descritos en este documento permiten la eliminación continua de flujos de fluidos (p. ej., flujos de desechos, líquidos que contienen proteínas terapéuticas recombinantes) de un sistema esterilizado (p. ej., un sistema de fabricación biológica), lo que proporciona una menor manipulación manual del sistema esterilizado y una disminución riesgo de contaminar el sistema esterilizado. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Aislamiento continuo integrado de corrientes de fluido desde recipiente de proceso estériles
Campo técnico
Esta invención se refiere a métodos de biotecnología y a la biofabricación de proteínas recombinantes.
Antecedentes
Las células de mamífero que contienen un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante a menudo se usan para producir proteínas terapéutica o comercialmente importantes. En el entorno actual de diversos productos en fase de desarrollo, las empresas de biotecnología cada vez están impulsando más el desarrollo de soluciones innovadoras para una fabricación muy flexible y rentable de productos terapéuticos (por ejemplo, sustancias farmacéuticas proteínicas terapéuticas).
En un proceso de biofabricación continuo, a menudo es necesario retirar fluidos de un recipiente de proceso estéril. La retirada de dicho fluido puede ser un flujo continuo o un flujo intermitente basado en algún desencadenante predefinido. La retirada tiene que hacerse de tal manera que proteja la esterilidad del recipiente del que se está retirando el fluido. Esto puede ser problemático en la biofabricación cuando la corriente de fluido tiene la posibilidad de promover el crecimiento biológico que a la larga puede volver al recipiente de proceso estéril. El método predominante usado actualmente es un método de transferencia discontinuo, donde las corrientes de residuos se recogen en un segundo recipiente estéril y cuando ese recipiente alcanza su capacidad, entonces se desconecta del recipiente de proceso estéril y luego se descarta el residuo. Esto no es ideal, ya que es un proceso discontinuo (no continuo) y requiere mucho tiempo manipular y esterilizar los recipientes. Estas manipulaciones también crean un riesgo de procesamiento si alguna etapa falla. Como alternativa, el mismo proceso puede conseguir con bolsas preesterilizadas, sin embargo, el coste de las bolsas puede ser prohibitivo para un proceso continuo y el uso de bolsas no elimina el riesgo de procesamiento. El documento US 2014/295532 divulga sistemas y métodos para producir productos biológicos en un biorreactor y de muestreo asépti
por succión de la muestra desde el biorreactor en un sistema de muestreo (figuras 2, 3) que usa un fluido de desinfección y un gas para limpiar el tubo y el depósito de muestreo después de haber extraído la muestra y haberla transportado a etapas posteriores del sistema de análisis (párrafo 12, 67-72).
El documento DE 9421 778 describe un sistema de muestreo para análisis de bioprocesos.
El documento WO 2013 096 682 describes sistemas y métodos para la retirada de contaminantes de un cultivo de microalgas.
Sumario
La presente invención se basa, en parte, en el desarrollo de un proceso de aislamiento y el equipo asociado para permitir el aislamiento (por ejemplo, retirada) de corrientes de fluido periódica o continuamente de un sistema esterilizado (por ejemplo, un recipiente de proceso estéril) que contiene un proceso estéril. El proceso de aislamiento utiliza un recipiente de aislamiento para separar el proceso estéril del entorno y las corrientes de residuos. El recipiente de aislamiento solamente se llena parcialmente y mantiene un espacio libre superior dentro del recipiente, en el que el espacio libre contiene un agente esterilizante. El agente esterilizante (por ejemplo, un gas esterilizante (por ejemplo, un gas que contiene ozono, óxido de etileno, dióxido de nitrógeno o peróxido de hidrógeno vaporizado)) puede rociarse en el recipiente o introducirse directamente en el espacio libre superior del recipiente. El agente esterilizante mantiene una atmósfera esterilizante dentro del espacio libre superior del recipiente, que proporciona aislamiento entre la corriente de proceso estéril entrante y la corriente de fluido saliente (por ejemplo, una corriente de residuos). La concentración del agente esterilizante (por ejemplo, un gas esterilizante) se controla dentro del espacio libre superior del recipiente para proporcionar la atmósfera esterilizante necesaria.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método de inhibición de la contaminación de un sistema esterilizado, comprendiendo el método proporcionar un sistema que comprende un primer recipiente, en el que el primer recipiente comprende un líquido, hacer fluir un primer volumen del líquido desde el primer recipiente y a través de un volumen de gas esterilizante y a un segundo recipiente. Los sistemas esterilizados contemplados en este documento incluyen, aunque sin limitación, sistemas de fabricación biológicos y sistemas de fabricación farmacéuticos. El primer recipiente es un recipiente esterilizado. En realizaciones ejemplares, el primer recipiente comprende un componente de un sistema de fabricación biológico. Por ejemplo, el primer recipiente puede ser un (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores ejemplares descritos en este documento o conocidos en la técnica), uno o más componentes de sistemas de cromatografía (por ejemplo, una columna de cromatografía), uno o más componentes de sistema de microfiltración, o uno o más componentes de un sistema de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF). Para un sistema de fabricación biológico, el líquido del primer recipiente puede ser un medio de cultivo líquido y/o un líquido que comprende una proteína terapéutica recombinante. En algunas realizaciones, el líquido del primer recipiente comprende una célula que comprende una proteína terapéutica recombinante. La proteína terapéutica recombinante puede ser una proteína
secretada desde la célula o no secretada desde la célula.
En algunos aspectos, el gas esterilizante se selecciona del grupo que consiste en ozono, óxido de etileno, dióxido de nitrógeno, peróxido de hidrógeno vaporizado (por ejemplo, un gas que contiene ozono, un gas que contiene óxido de etileno, un gas que contiene óxido de nitrógeno y un gas que contiene dióxido de hidrógeno).
El primer volumen de líquido que se ha hecho fluir desde el primer recipiente al segundo recipiente puede ser una corriente de residuos. En otro aspecto, el primer volumen del líquido que se ha hecho fluir desde el primer recipiente al segundo recipiente comprende una proteína terapéutica recombinante. Como alternativa, el primer volumen de líquido que ha fluido desde el primer recipiente al segundo recipiente no contiene una proteína terapéutica recombinante (es decir, el primer volumen de líquido es una corriente de residuos o comprende medio de cultivo antes del inicio del cultivo celular). El primer volumen de líquido puede comprender subproductos de fermentación.
En un aspecto, los métodos divulgados en este documento comprenden además hacer fluir un segundo volumen de líquido desde el segundo recipiente a un aparato para purificar y pulir una proteína recombinante. Por ejemplo, el método divulgado en este documento puede comprender además hacer fluir un segundo volumen de líquido desde el segundo recipiente a un primer sistema de cromatografía de múltiples columnas (MCCS1), que captura dicha proteína terapéutica recombinante del medio de cultivo líquido usando el MCCS1, en el que el eluido del MCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente a un segundo sistema de cromatografía de múltiples columnas (MCCS2), y purificar y pulir la proteína terapéutica recombinante usando el MCCS2, en el que el eluido del MCCS2 es una proteína terapéutica recombinante; y en el que el proceso está integrado y se ejecuta continuamente desde dicho líquido del primer recipiente hasta el eluido del MCCS2 que es la proteína terapéutica recombinante. En algunas realizaciones, el segundo volumen de líquido comprende una proteína recombinante.
En un aspecto, los métodos divulgados en este documento comprenden además hacer fluir un segundo volumen de líquido desde el segundo recipiente a un receptáculo para la eliminación de una corriente de residuos biológicos. El receptáculo puede ser, por ejemplo, un sumidero para eliminar residuos, o un vaso de precipitados u otro envase para almacenar y/o retirar el líquido de residuos.
La divulgación también proporciona un sistema para aislar corrientes de proceso estériles desde entornos no estériles. En un aspecto, el sistema comprende un primer recipiente, que comprende una salida de fluido; y al menos un segundo recipiente que comprende una entrada de fluido en comunicación fluida con la salida de fluido del primer recipiente y configurada de modo que el fluido que entra en el segundo recipiente pasa a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del segundo recipiente, una salida de fluido configurada de modo que el fluido que sale del segundo recipiente se retira desde debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del segundo recipiente, al menos una entrada de gas y al menos una salida de gas. En algunos ejemplos, el primer recipiente es un recipiente esterilizado. En una realización ejemplar, el primer recipiente es un componente de un sistema de fabricación biológico. Por ejemplo, el primer recipiente es un conducto de fluido (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores ejemplares descritos en este documento o conocidos en la técnica), uno o más componentes de sistemas de cromatografía (por ejemplo, una columna de cromatografía), uno o más componentes de sistema de microfiltración, o uno o más componentes de un sistema de ultrafiltración/diafiltración. El biorreactor es, por ejemplo, un biorreactor de perfusión, un biorreactor de lote alimentado, un biorreactor de producción o un biorreactor de inóculo. En algunas realizaciones, la salida de fluido del segundo recipiente está en comunicación fluida con un aparato para purificar y pulir una proteína recombinante. En una realización ejemplar, el primer recipiente y el segundo recipiente están dispuestos en una plataforma deslizante.
En algunos aspectos, los sistemas divulgados en este documento comprenden además un conducto de fluido dispuesto entre el primer recipiente y el segundo recipiente y, opcionalmente, comprende además un filtro dispuesto en el conducto de fluido entre el primer recipiente y el segundo recipiente y configurado para retirar materia en partículas del fluido en el conducto de fluido. Los sistemas divulgados en este documento también pueden incluir un sistema de bomba (por ejemplo, una bomba), donde el sistema de bomba está dispuesto en un conducto de fluido. En algunos ejemplos, los sistemas divulgados en este documento comprenden una bomba en comunicación fluida con la salida de fluido del primer recipiente, una bomba en comunicación fluida con una salida de fluido del recipiente de sección, o ambos. En una realización, el sistema de bomba está configurado para retirar un volumen de fluido desde la salida del recipiente y hacer fluir el volumen en la entrada de fluido del segundo recipiente.
En un aspecto, los sistemas divulgados en este documento comprenden un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del segundo recipiente. El gas esterilizante puede ser, por ejemplo, un gas seleccionado del grupo que consiste en ozono, dióxido de etileno, dióxido de nitrógeno o peróxido de hidrógeno vaporizado. En algunas realizaciones, la al menos una entrada de gas está conectada a uno o más elementos de rociado de gas que permiten emitir gas al segundo recipiente y suministrarlo al espacio libre superior. El término "elemento de rociado" se refiere a un elemento poroso (por ejemplo, un filtro, una tubería abierta o una frita) para burbujear un gas a través de un líquido. Para llenar el espacio libre superior, el segundo recipiente comprende al menos una entrada de gas en comunicación gaseosa con un sistema para generar o administrar un gas esterilizante, o para generar y administrar un gas esterilizante. En algunas realizaciones, el sistema para generar o administrar un gas esterilizante es un sistema de generación o administración de ozono, o un sistema de generación y administración de ozono. En algunas
realizaciones, el sistema para administrar un gas esterilizante es gas envasado en frascos. Además, en algunas realizaciones, el segundo recipiente comprende al menos una salida de gas configurada para ventilar de forma continua o periódica el gas desde el segundo recipiente. Para sistemas que usan ozono, la salida de gas está en comunicación gaseosa con una unidad de destrucción de ozono. Para controlar la concentración o cantidad de gas esterilizante contenido en el segundo recipiente, el sistema puede incluir, por ejemplo, una sonda de gas disuelto o un sensor para vigilar la concentración de gas esterilizante dentro del espacio libre superior del segundo recipiente.
En un aspecto, el primer recipiente comprende una salida de fluido en comunicación fluida con una entrada de fluido del segundo recipiente. En una realización ejemplar, el segundo recipiente comprende una entrada de fluido configurada de modo que el volumen de líquido que entra en el segundo recipiente pasa a través del espacio libre superior (por ejemplo, una entrada de fluido localizada en el segundo recipiente en una posición por encima del nivel de líquido), una salida de fluido configurada de modo que el líquido que sale del segundo recipiente fluya desde por debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante (por ejemplo, una salida de fluido localizada en el segundo recipiente en una posición por debajo del nivel de líquido), al menos una entrada de gas y al menos una salida de gas, en el que la entrada de fluido está en comunicación fluida con el primer recipiente. De forma ventajosa, el volumen de gas esterilizante está dispuesto dentro de un espacio libre superior del segundo recipiente. Para llenar el espacio libre superior, el gas esterilizante puede rociarse en el segundo recipiente o introducirse directamente en el espacio libre superior del segundo recipiente. En algunos ejemplos, el segundo recipiente se llena al menos parcialmente con un líquido.
En algunas realizaciones, el líquido del primer recipiente comprende una proteína terapéutica recombinante.
Como se usa en este documento, la palabra "un/o/a" antes de un sustantivo representa uno o más del sustantivo particular. Por ejemplo, la expresión "una célula de mamífero recombinante" representa "una o más células de mamífero recombinantes".
El término "recipiente" es conocido en la técnica y significa un dispositivo (por ejemplo, un envase), de cualquier forma o tamaño, que tenga un volumen interior adecuado para contener un volumen de líquido o gas. El recipiente puede ser abierto (es decir, un dispositivo que interactúa directamente con su entorno externo) o cerrado (es decir, un dispositivo aislado que no tiene interacción con su entorno externo). El término "recipiente" incluye, por ejemplo, un dispositivo que tiene un volumen interior adecuado para cultivar una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) en un medio de cultivo líquido en un conjunto controlado de condiciones físicas que permiten el mantenimiento o proliferación de las células. Ejemplos no limitantes de recipientes son conductos de fluidos, biorreactores (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores ejemplares descritos en este documento o conocidos en la técnica), uno o más componentes de sistemas de cromatografía (por ejemplo, una columna de cromatografía), uno o más componentes de sistema de microfiltración, uno o más componentes de un sistema de ultrafiltración/diafiltración, vasos de precipitados, sumideros o tubos.
El término "esterilización" es conocido en la técnica y se refiere a cualquier proceso validado usado para hacer que una composición sea estéril, por ejemplo, un proceso que elimina (retira) o destruye todas las formas de vida, incluyendo agentes transmisibles (tales como hongos, bacterias, virus, formas de esporas, etc.) presentes sobre una superficie, contenidos en un fluido, en un medicamento o en un compuesto tal como medio de cultivo biológico. La esterilización puede conseguirse aplicando calor, productos químicos (por ejemplo, un gas), irradiación, alta presión o filtración o combinaciones de los mismos.
La expresión "gas esterilizante", como se usa en este documento, se refiere a un gas o composición gaseosa, que puede hacer que una composición sea estéril, por ejemplo, un proceso que elimina (retira) o destruye todas las formas de vida, incluyendo agentes transmisibles (tales como hongos, bacterias, virus, formas de esporas, etc.) presentes sobre una superficie, contenidos en un fluido, en un medicamento o en un compuesto tal como medio de cultivo biológico.
"Esterilidad absoluta" o "absolutamente estéril" son expresiones usadas para describir una composición o proceso que esté completamente libre de contaminantes biológicos autorreplicantes. Por ejemplo, el término puede aplicarse a un recipiente irradiado con gamma, la superficie interior y contenidos de un recipiente, y/o un tampón. Una composición o proceso absolutamente estéril puede estar limpio (según se conoce ese término en la técnica).
"Estéril" o "esterilidad" son términos usados para describir una composición o proceso que tiene un nivel de certeza de esterilidad de aproximadamente o menos de 1,0 x 10'6 (por ejemplo, aproximadamente o menos de 1,0 x 10'7, aproximadamente o menos de 1,0 x 10'8, aproximadamente o menos de 1,0 x 10'9, o 1 x 10'10). La determinación de si una composición o proceso es estéril puede ensayarse usando varios procesos de producción validados conocidos en la técnica. Por ejemplo, una composición o proceso estéril puede estar completamente libre de contaminantes biológicos autorreplicantes viables (por ejemplo, cualquiera de los contaminantes biológicos autorreplicantes descritos en este documento). Una composición o proceso estéril también puede estar limpio (según se conoce ese término en la técnica). Un cultivo celular estéril está libre de contaminación.
La expresión "nivel de certeza de esterilidad" o "SAL" es conocida en la técnica y significa un nivel de confianza de
conseguir esterilidad absoluta dentro de un lote de unidades tratadas. La probabilidad habitualmente se calcula basándose en los resultados de estudios de inactivación realizados durante la validación y expresados en forma de 1 x 10'n.
Las expresiones "recipiente esterilizado" y "recipiente de proceso estéril" son intercambiables y se refieren a un recipiente que se ha sometido a un proceso de esterilización. Como se usa en este documento, la expresión "recipiente esterilizado" o "recipiente de proceso estéril" incluyen, por ejemplo, un recipiente que contiene un monocultivo de carga biológica controlada (por ejemplo, un monocultivo de carga biológica controlada de células de mamífero recombinantes). Como se usa en este documento, la expresión "sistema esterilizado" se refiere a un sistema que comprende la colección de uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más) recipientes de proceso estériles que funcionan de forma cooperativa para conseguir un resultado específico (por ejemplo, la expresión y purificación de una proteína recombinante desde un medio de cultivo líquido). Un "sistema esterilizado" se refiere a un sistema de un total de dos o más recipientes interconectados o de cambio en el que al menos uno o más de los recipientes del sistema es un recipiente esterilizado.
Como se usa en este documento, la expresión "sistema de fabricación biológico" o "sistema de biofabricación" se refiere un sistema para producir un fármaco biológico. La expresión "sistema de fabricación farmacéutico" se refiere un sistema para producir un fármaco micromolecular (por ejemplo, un fármaco, profármaco o un producto farmacéutico). Los componentes de sistemas de fabricación biológicos y sistemas farmacéuticos contemplados en este documento incluyen, por ejemplo, uno o más biorreactores para al inicio y producción de cultivo, matraces, conductos de fluidos, recipientes, uno o más componentes de sistemas de cromatografía (por ejemplo, una columna de cromatografía, bombas, recipientes de proceso), uno o más componentes de un sistema de filtración (por ejemplo, uno o más componentes de un sistema de microfiltración, o uno o más componentes de un sistema de ultrafiltración/diafiltración) y otros dispositivos utilizados para aislamiento y purificación de fármacos. Los sistemas pueden ser abiertos, cerrados, integrados o continuos como se define en este documento o, por lo demás, como lo entiende en general un experto en la materia.
La expresión "fármaco biológico", como se usa en este documento, se refiere a cualquier sustancia terapéutica hecha u obtenida de un organismo vivo o sus productos que se usa en la prevención, diagnóstico o tratamiento de una patología. Por tanto, un fármaco biológico o compuesto biofarmacéutico es un fármaco médico producido usando biotecnología, por ejemplo, una proteína (por ejemplo, una proteína terapéutica recombinante), o un ácido nucleico (ADN, ARN u oligonucleótidos de antisentido), usado con fines terapéuticos o de diagnóstico in vivo.
La expresión "fármaco micromolecular", como se usa en este documento, se refiere a un agente terapéutico que tiene bajo peso molecular, que se usa en la prevención, diagnóstico o tratamiento de una patología. El agente terapéutico habitualmente se sintetiza mediante química orgánica, pero también puede aislarse de fuentes naturales tales como plantas, hongos y microbios.
Como se usa en este documento, un primer recipiente está en "comunicación gaseosa" con un segundo recipiente cuando el primer y segundo recipiente están conectados mediante un dispositivo o conducto que permite el flujo o comunicación de gases entre los recipientes. Asimismo, un primer recipiente está en "comunicación fluida" con un segundo recipiente cuando el primer y segundo recipiente están conectados mediante un dispositivo o conducto que permite el flujo o comunicación de fluidos entre los recipientes. Coherente con los contenidos de la presente invención, las expresiones comunicación fluida y comunicación gaseosa pretenden ser expresiones sinónimas. A este respecto, se pretende que un fluido incluya una sustancia, ya sea un líquido o un gas, que tiende a fluir o adaptarse al contorno de su envase. A este respecto, no solamente un líquido se ajusta a la definición de fluido, sino un gas también porque un gas puede fluir y adaptarse al contorno del envase dentro del que reside.
La expresión "biorreactor de perfusión" es conocida en la técnica y significa un biorreactor que tiene un volumen interior para cultivar una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) en un medio de cultivo líquido, y que tiene un medio (por ejemplo, una salida, una entrada, una bomba u otro dispositivo de ese tipo) para retirar de forma periódica o continua el medio de cultivo líquido del biorreactor y que tiene un medio (por ejemplo, una salida, una entrada, una bomba u otro dispositivo de ese tipo) para añadir sustancialmente el mismo volumen de un medio de cultivo líquido de remplazo al biorreactor. la adición del medio de cultivo líquido de remplazo puede realizarse sustancialmente al mismo tiempo o poco después de retirar el medio de cultivo líquido del biorreactor. El medio para retirar el medio de cultivo líquido del biorreactor y el medio para añadir el medio de cultivo líquido de remplazo puede ser un solo dispositivo o sistema.
La expresión "biorreactor de producción" es una expresión de la técnica y significa un biorreactor a gran escala (por ejemplo, que tiene un volumen interno de más de 500 l, 1000 l, 5000 l, 10000 l, 20000 l, 50000 l o 100000 l). Por ejemplo, un biorreactor de producción puede ser un biorreactor de perfusión.
La expresión "biorreactor de lote alimentado" es una expresión de la técnica y significa un biorreactor que incluye una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero recombinantes) en un primer medio de cultivo líquido, en el que el cultivo de las células presentes en el biorreactor incluye la adición periódica o continua de un segundo medio de cultivo líquido al primer medio de cultivo líquido sin retirada sustancial o significativa del primer medio de cultivo
líquido o segundo medio de cultivo líquido del cultivo celular. El segundo medio de cultivo líquido puede ser igual que el primer medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos de cultivo de lote alimentado, el segundo medio de cultivo líquido es una forma concentrada del primer medio de cultivo líquido. En algunos ejemplos de cultivo de lote alimentado, el segundo medio de cultivo líquido se añade como un polvo seco.
La expresión "sistema de cromatografía de múltiples columnas" o "MCCS" significa un sistema de un total de dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas interconectadas o de cambio. Un ejemplo no limitante de un sistema de cromatografía de múltiples columnas es un sistema de cromatografía de contracorriente periódico (PCC) que incluye un total de dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas interconectadas o de cambio. En este documento se describen ejemplos adicionales de sistemas de cromatografía de múltiples columnas y son conocidos en la técnica.
La expresión "célula de mamífero" significa cualquier célula procedente o derivada de cualquier mamífero (por ejemplo, un ser humano, un hámster, un ratón, un mono verde, una rata, un cerdo, una vaca o un conejo). Por ejemplo, una célula de mamífero puede ser una célula inmortalizada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula diferenciada. En algunas realizaciones, la célula de mamífero es una célula indiferenciada. En este documento se describen ejemplos no limitantes de células de mamífero. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de células de mamífero.
La expresión "cultivo" o "cultivo celular" significa el mantenimiento o proliferación de una célula de mamífero (por ejemplo, una célula de mamífero recombinante) en un conjunto controlado de condiciones físicas.
La expresión "cultivo de células de mamífero" o "cultivo celular" significa un medio de cultivo líquido que contiene una pluralidad de células de mamífero que se mantiene o prolifera en un conjunto controlado de condiciones físicas.
La expresión "medio de cultivo líquido" o "medio de cultivo" significa un fluido que contiene suficientes nutrientes para permitir que una célula (por ejemplo, una célula de mamífero) crezca o prolifere in vitro. Por ejemplo, un medio de cultivo líquido puede contener uno o más de: aminoácidos (por ejemplo, 20 aminoácidos), una purina (por ejemplo, hipoxantina), una pirimidina (por ejemplo, timidina), colina, inositol, tiamina, ácido fólico, biotina, calcio, niacinamida, piridoxina, riboflavina, timidina, cianocobalamina, piruvato, ácido lipoico, magnesio, glucosa, sodio, potasio, hierro, cobre, cinc y bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede contener suero de un mamífero. En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido no contiene suero u otro extracto de un mamífero (un medio de cultivo líquido definido). En algunas realizaciones, un medio de cultivo líquido puede contener oligometales, una hormona de crecimiento de mamífero y/o un factor de crecimiento de mamífero. Otro ejemplo de medio de cultivo líquido es medio mínimo (por ejemplo, un medio que contiene solamente sales inorgánicas, una fuente de carbono y agua). En este documento se describen ejemplos no limitantes de medio de cultivo líquido. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de medio de cultivo líquido y están disponibles en el mercado. Un medio de cultivo líquido puede contener cualquier densidad de células de mamífero. Por ejemplo, como se usa en este documento, un volumen de medio de cultivo líquido retirado de un biorreactor de producción puede estar sustancialmente libre de células de mamífero.
La expresión "proteína terapéutica recombinante" o "proteína recombinante" es conocida en la técnica y significa que incluye cualquier proteína terapéutica obtenida mediante tecnología de ADN recombinante. Como se usa en este documento, una "proteína terapéutica recombinante" incluye, por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una enzima, una proteína manipulada o una proteína o fragmento de proteína inmunógena.
La expresión "fragmento de proteína" o "fragmento de polipéptido" significa una parte de una secuencia polipeptídica que tiene al menos o aproximadamente 4 aminoácidos, al menos o aproximadamente 5 aminoácidos, al menos o aproximadamente 6 aminoácidos, al menos o aproximadamente 7 aminoácidos, al menos o aproximadamente 8 aminoácidos, al menos o aproximadamente 9 aminoácidos, al menos o aproximadamente 10 aminoácidos, al menos o aproximadamente 11 aminoácidos, al menos o aproximadamente 12 aminoácidos, al menos o aproximadamente 13 aminoácidos, al menos o aproximadamente 14 aminoácidos, al menos o aproximadamente 15 aminoácidos, al menos o aproximadamente 16 aminoácidos, al menos o aproximadamente 17 aminoácidos, al menos o aproximadamente 18 aminoácidos, al menos o aproximadamente 19 aminoácidos o al menos o aproximadamente 20 aminoácidos de longitud, o más de 20 aminoácidos de longitud. Un fragmento de proteína recombinante puede producirse usando cualquiera de los procesos descritos en este documento.
La expresión "proteína manipulada" significa un polipéptido que no está codificado de forma natural por un ácido nucleico endógeno presente dentro de un organismo (por ejemplo, un mamífero). Ejemplos de proteínas manipuladas incluyen enzimas (por ejemplo, con una o más sustituciones, eliminaciones, inserciones o adiciones aminoacídicas que provocan un aumento en la estabilidad y/o actividad catalítica de la enzima manipulada), proteínas de fusión, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos divalentes, anticuerpos trivalentes o un diacuerpo), y proteínas de unión a antígeno que contienen al menos una secuencia estructural recombinante.
La expresión "proceso integrado" significa un proceso que se realiza usando elementos estructurales que funcionan de forma cooperativa para conseguir un resultado específico (por ejemplo, la generación de una proteína recombinante
aislada a partir de un medio de cultivo líquido).
La expresión "proceso continuo" significa un proceso que alimenta de forma continua un fluido a través de al menos una parte del sistema.
El término "filtración" significa la retirada de al menos parte de (por ejemplo, al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %) de contaminantes biológicos indeseados (por ejemplo, una célula de mamífero, bacterias, células de levadura, virus o micobacterias) y/o materia en partículas (por ejemplo, proteínas precipitadas) a partir de un líquido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido o un fluido presente en cualquiera de los sistemas o procesos descritos en este documento).
La expresión "cultivo de perfusión" es una expresión de la técnica y significa el cultivo de un cultivo celular en un recipiente (por ejemplo, un biorreactor), en el que el cultivo del cultivo celular en el recipiente incluye la retirada periódica o continua de medio de cultivo líquido presente en el recipiente (por ejemplo, medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células) y al mismo tiempo o poco después de ello la adición de sustancialmente el mismo volumen de un medio de cultivo líquido de remplazo al recipiente. En algunos ejemplos, hay un cambio progresivo (por ejemplo, aumento o disminución) en el volumen de medio de cultivo líquido retirado y el volumen de medio de cultivo de remplazo añadido a lo largo de periodos progresivos (por ejemplo, un periodo de aproximadamente 24 horas, un periodo entre aproximadamente 1 minuto y aproximadamente 24 horas o un periodo de más de 24 horas) durante el periodo de cultivo (por ejemplo, la tasa de realimentación de medio de cultivo sobre una base diaria). La fracción de medio retirado y remplazado cada día puede variar dependiendo de las células particulares que se estén cultivando, la densidad de siembra inicial y la densidad de células en un momento particular. "RV" o "volumen de reactor" significa el volumen del medio de cultivo presente al inicio del proceso de cultivo (por ejemplo, el volumen total del medio de cultivo presente después de la siembra).
La expresión "cultivo de lote alimentado" es una expresión de la técnica y significa un recipiente (por ejemplo, un biorreactor de producción) que incluye una pluralidad de células (por ejemplo, células de mamífero) en un medio de cultivo líquido, en el que el cultivo de las células presentes en el recipiente (por ejemplo, biorreactor de producción) incluye la adición periódica o continua de medio de cultivo líquido fresco al recipiente sin retirada sustancial o significativa del medio de cultivo líquido del recipiente durante el cultivo. El medio de cultivo líquido fresco puede ser igual que el medio de cultivo líquido presente en el recipiente al inicio del cultivo. En algunos ejemplos de cultivo de lote alimentado, el medio de cultivo líquido fresco es una forma concentrada del medio de cultivo líquido presente en el recipiente al inicio del cultivo. En algunos ejemplos de cultivo de lote alimentado, el medio de cultivo líquido fresco se añade como un polvo seco.
"Plataforma deslizante" es una expresión de la técnica y, como se usa en este documento, se refiere a una estructura sólida tridimensional que puede actuar como plataforma o soporte para un sistema descrito en este documento. Una plataforma deslizante puede, si comprende una o más estructuras que posibiliten el movimiento (por ejemplo, ruedas, rodamientos o similares), conferir movilidad al sistema o una parte del mismo. En este documento se describen ejemplos no limitantes de plataformas deslizantes. Se conocen en la técnica ejemplos adicionales de plataformas deslizantes.
Salvo que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comprendido habitualmente por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. En este documento se describen métodos y materiales para su uso en la presente invención; también pueden usarse otros métodos y materiales adecuados conocidos en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes. Todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes, secuencias, entradas a bases de datos y otras referencias mencionadas en este documento se incorporan por referencia en su totalidad. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.
Otros rasgos característicos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las figuras, y a partir de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos
La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra un sistema de ejemplo para aislar corrientes de proceso estériles de entornos no estériles de acuerdo con la presente invención.
La figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra un sistema de ejemplo para aislar corrientes de proceso estériles de entornos no estériles de acuerdo con la presente invención.
Descripción detallada
En este documento se proporcionan procesos de aislamiento y el equipo asociado para permitir que corrientes de fluido se aíslen de un sistema esterilizado (por ejemplo, un recipiente de proceso estéril) que contiene un proceso estéril. Los procesos de aislamiento descritos en este documento proporcionan muchos beneficios. Por ejemplo, los
procesos de aislamiento permiten la retirada periódica o continua de corrientes de fluido de un sistema esterilizado, lo que proporciona menos manipulación manual del sistema esterilizado y un riesgo disminuido de contaminar el sistema esterilizado. Por ejemplo, los procesos de aislamiento descritos en este documento proporcionan la retirada periódica o continua de líquido (por ejemplo, corrientes de residuos, líquido que contiene proteínas terapéuticas recombinantes) de un biorreactor, que a su vez proporciona menos manipulación manual del cultivo celular y un riesgo disminuido de contaminar el cultivo celular. En este documento se describen aspectos no limitantes de estos procesos de aislamiento, y pueden usarse en cualquier combinación.
Los métodos descritos en este documento comprenden hacer fluir volúmenes de fluido desde un primer recipiente hasta un segundo recipiente, hacer fluir volúmenes de fluido desde un tercer recipiente hasta un cuarto recipiente o hacer fluir volúmenes de fluido desde un quinto recipiente hasta un sexto recipiente. Como puede apreciarse en la técnica, hay muchas maneras de hacer fluir un volumen de líquido desde un primer recipiente hasta un segundo recipiente, tal como flujo por gravedad o con la ayuda de una bomba. Por tanto, en algunos aspectos, los sistemas descritos en este documento también pueden incluir una o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) bombas (por ejemplo, automatizadas, por ejemplo, bombas peristálticas automatizadas). La una o más bombas pueden estar dispuestas en el conducto de fluidos dispuesto entre un primer recipiente y un segundo recipiente. Por ejemplo, los sistemas descritos en este documento también pueden incluir una o más bombas configuradas para retirar un volumen de fluido de una salida el primer recipiente y hacer fluir el volumen a un segundo recipiente. En algunos ejemplos, la una o más bombas configuradas para retirar un volumen de fluido de una salida de un recipiente de proceso estéril y hacer fluir el volumen a la entrada de fluidos del recipiente de aislamiento como se describe en este documento. En algunos ejemplos, una o más bombas están en comunicación fluida con la al menos una salida de fluidos del recipiente de aislamiento. El fluido puede retirarse del recipiente de proceso estéril mediante un sistema de bomba (por ejemplo, un sistema de filtración de flujo tangencial alterno (ATF) o filtración de fluido tangencial (TFF)).
En algunos ejemplos, los sistemas descritos en este documento también pueden incluir uno o más (por ejemplo, dos, tres, cuatro o cinco) filtros para retirar contaminantes biológicos indeseados (por ejemplo, una célula de mamífero, bacterias, células de levadura, virus o micobacterias) y/o materia en partículas (por ejemplo, proteínas precipitadas) a partir de un líquido (por ejemplo, un medio de cultivo líquido o un fluido presente en cualquiera de los sistemas o procesos descritos en este documento).
En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos de inhibición de la contaminación de un sistema esterilizado, que comprende proporcionar un sistema que comprende un primer recipiente, en el que el primer recipiente comprende un líquido, hacer fluir un primer volumen del líquido fuera del primer recipiente y a través de un volumen de gas esterilizante a un segundo recipiente.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona métodos de inhibición de la contaminación de un sistema esterilizado, que comprende proporcionar un sistema que comprende un primer recipiente, en el que el primer recipiente comprende un líquido, hacer fluir un primer volumen del líquido fuera del primer recipiente y a través de un volumen de gas esterilizante a un segundo recipiente. En algunos ejemplos, el primer recipiente es un recipiente de proceso estéril, en el que el recipiente de proceso estéril comprende una salida de fluidos en comunicación fluida con una entrada de fluidos del segundo recipiente. En algunos ejemplos, el segundo recipiente es un recipiente de aislamiento como se describe en este documento, y el volumen de gas esterilizante está dispuesto dentro del espacio libre superior del recipiente de aislamiento.
En algunos aspectos, la divulgación proporciona sistemas para aislar corrientes de proceso estériles de entornos no estériles. Para algunos ejemplos, el sistema comprende un recipiente de proceso estéril (por ejemplo, un primer recipiente) que comprende una salida de fluidos, y al menos un recipiente de aislamiento (por ejemplo, un segundo recipiente), comprendiendo el al menos un recipiente de aislamiento (i) una entrada de fluidos en comunicación fluida con la salida de fluidos del primer recipiente y configurada de modo que el fluido que entra en el segundo recipiente pasa a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del segundo recipiente, (ii) una salida de fluidos configurada de modo que el fluido que sale del segundo recipiente se retira de debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del segundo recipiente, (iii) al menos una entrada de gas; y (iv) al menos una salida de gas. En algunos ejemplos, los sistemas divulgados en este documento comprenden además un conducto de fluidos dispuesto entre el primer recipiente y el segundo recipiente.
El proceso de aislamiento divulgado en este documento utiliza un recipiente (es decir, un "recipiente de aislamiento") para separar el proceso estéril del entorno y corrientes de residuos. En algunos ejemplos, el recipiente de aislamiento comprende (i) una entrada de fluidos en comunicación fluida con la salida de fluidos de un recipiente de proceso estéril y configurada de modo que el fluido que entra en el recipiente de aislamiento pasa a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del recipiente de aislamiento, (ii) una salida de fluidos configurada de modo que el fluido que sale del recipiente de aislamiento se retira de debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del recipiente de aislamiento, (iii) al menos una entrada de gas; y (iv) al menos una salida de gas.
Como puede apreciarse en la técnica, el recipiente de aislamiento puede tener una diversidad de diferentes volúmenes. Por ejemplo, el recipiente de aislamiento puede tener un volumen interno entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 20 l (por ejemplo, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 18 l, entre aproximadamente
0,20 l y aproximadamente 16 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 14 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 12 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 9,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 8,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 7,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 6,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 4,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 3,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 2,0 l, entre aproximadamente 0,20 l y aproximadamente 1,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 18 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 16 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 14 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 12 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 9,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 8,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 7,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 6,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 4,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 3,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 2,0 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 1,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 20 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 18 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 16 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 14 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 12 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 9,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 8,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 7,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 6,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 4,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 3,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 2,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 1,0 l), o aproximadamente 0,20 l, aproximadamente 0,50 l, aproximadamente 1,0 l, aproximadamente 2,0 l, aproximadamente 3,0 l, aproximadamente 4.0 l, aproximadamente 5,0 l, aproximadamente 6,0 l, aproximadamente 7,0 l, aproximadamente 8,0 l, aproximadamente 9,0 l, aproximadamente 10,0 l, aproximadamente 12,0 l, aproximadamente 14,0 l, aproximadamente 16.0 l, aproximadamente 18,0 l o aproximadamente 20,0 l.
El recipiente de aislamiento únicamente está llenado parcialmente y mantiene un espacio libre superior dentro del recipiente. El espacio libre superior puede incluir agente esterilizante (por ejemplo, un gas esterilizante). En algunos ejemplos, el espacio libre superior llenado de gas esterilizante contenido dentro del recipiente de aislamiento ocupa entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 97 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 95 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento, por ejemplo, entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 90 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 85 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 80 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 75 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 30 % y aproximadamente un 70 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 35 % y aproximadamente un 65 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 40 % y aproximadamente un 60 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 45 % y aproximadamente un 55 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; o aproximadamente un 5 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 10 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 15 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento, aproximadamente un 20 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 25 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 30 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 35 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 40 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 45 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 50 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 55 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 60 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 65 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 75 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 80 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 85 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 90 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento; o aproximadamente un 95 % del volumen interior total del recipiente de aislamiento.
Gases esterilizantes ejemplares para su uso en los sistemas y métodos divulgados en este documento incluyen, por ejemplo, gas ozono, gas de óxido de etileno, gas de dióxido de nitrógeno y dióxido de hidrógeno vaporizado (por ejemplo, un gas que contiene ozono, un gas que contiene óxido de etileno, un gas que contiene óxido de nitrógeno y un gas que contiene dióxido de hidrógeno), o cualquier mezcla apropiada de dichos gases. En algunos ejemplos, el gas esterilizante contenido dentro del espacio libre superior del recipiente de aislamiento puede mantenerse, por ejemplo, a una temperatura entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 70 °C, aproximadamente 20 °C y aproximadamente 65 °C, aproximadamente 25 °C y aproximadamente 60 °C, aproximadamente 30 °C y aproximadamente 55 °C, aproximadamente 35 °C y aproximadamente 50 °C o aproximadamente 40 °C y aproximadamente 45 °C.
El ozono ofrece muchas ventajas como gas esterilizante. El ozono es un agente esterilizante muy eficaz debido a sus fuertes propiedades oxidantes, que pueden destruir una amplia gama de patógenos, incluyendo priones. La alta reactividad del ozono significa que el ozono residual puede destruirse pasando el ozono sobre un catalizador simple
que revierte el ozono en oxígeno. También significa que el tiempo de ciclo es relativamente corto. En algunos ejemplos, el espacio libre superior contiene ozono, por ejemplo, un gas que contiene ozono que tiene una concentración de ozono de al menos aproximadamente 3000 ppm, por ejemplo, al menos aproximadamente 4000 ppm, al menos aproximadamente 5000 ppm, al menos aproximadamente 6000 ppm, al menos aproximadamente 7000 ppm, al menos aproximadamente 8000 ppm, al menos aproximadamente 9000 ppm, al menos aproximadamente 10000 ppm, al menos aproximadamente 15000 ppm, al menos aproximadamente 20000 ppm, al menos aproximadamente 50000 ppm, al menos aproximadamente 100000 ppm, al menos aproximadamente 500000 ppm o al menos aproximadamente 1000000 ppm.
El óxido de etileno tiene propiedades microbicidas y puede destruir todos los virus, bacterias y hongos conocidos, incluyendo esporas bacterianas y es compatible con la mayoría de materiales (por ejemplo, recipientes de proceso estéril usados en procesos de fabricación biológicos). En algunos ejemplos, el espacio libre superior contiene óxido de etileno, por ejemplo, un gas que contiene óxido de etileno que tiene una concentración de óxido de etileno de al menos aproximadamente 500 ppm, por ejemplo, al menos aproximadamente 850 ppm, al menos aproximadamente 1000 ppm, al menos aproximadamente 2000 ppm, al menos aproximadamente 3000 ppm, al menos aproximadamente 4000 ppm, al menos aproximadamente 5000 ppm, al menos aproximadamente 6000 ppm, al menos aproximadamente 7000 ppm, al menos aproximadamente 8000 ppm, al menos aproximadamente 9000 ppm, al menos aproximadamente 10 000 ppm, al menos aproximadamente 15000 ppm, al menos aproximadamente 20000 ppm, al menos aproximadamente 50000 ppm, al menos aproximadamente 100000 ppm, al menos aproximadamente 500000 ppm o al menos aproximadamente 1000000 ppm.
El gas dióxido de nitrógeno (NO2) es eficaz como esterilizante contra una amplia gama de microorganismos, incluyendo bacterias comunes, virus y esporas. En algunos ejemplos, el espacio libre superior contiene dióxido de nitrógeno, por ejemplo, un gas que contiene dióxido de nitrógeno que tiene una concentración de óxido de etileno de al menos aproximadamente 500 ppm, al menos aproximadamente 850 ppm, al menos aproximadamente 1000 ppm, al menos aproximadamente 2000 ppm, al menos aproximadamente 3000 ppm, al menos aproximadamente 4000 ppm, al menos aproximadamente 5000 ppm, al menos aproximadamente 6000 ppm, al menos aproximadamente 7000 ppm, al menos aproximadamente 8000 ppm, al menos aproximadamente 9000 ppm, al menos aproximadamente 10000 ppm, al menos aproximadamente 15000 ppm, al menos aproximadamente 20000 ppm, al menos aproximadamente 50000 ppm, al menos aproximadamente 100000 ppm, al menos aproximadamente 500000 ppm o al menos aproximadamente 1000000 ppm.
El peróxido de hidrógeno (H2O2) tiene buenas propiedades esterilizantes y puede descomponerse en agua y oxígeno. En algunos ejemplos, el espacio libre superior contiene peróxido de hidrógeno, por ejemplo, un gas que contiene peróxido de hidrógeno que tiene una concentración de óxido de etileno de al menos aproximadamente 5 ppm, al menos aproximadamente 5 ppm, al menos aproximadamente 10 ppm, al menos aproximadamente 50 ppm, al menos aproximadamente 100 ppm, al menos aproximadamente 250 ppm, al menos aproximadamente 500 ppm, al menos aproximadamente 850 ppm, al menos aproximadamente 1000 ppm, al menos aproximadamente 2000 ppm, al menos aproximadamente 3000 ppm, al menos aproximadamente 4000 ppm, al menos aproximadamente 5000 ppm, al menos aproximadamente 6000 ppm, al menos aproximadamente 7000 ppm, al menos aproximadamente 8000 ppm, al menos aproximadamente 9000 ppm, al menos aproximadamente 10000 ppm, al menos aproximadamente 15000 ppm, al menos aproximadamente 20000 ppm, al menos aproximadamente 50000 ppm, al menos aproximadamente 100000 ppm, al menos aproximadamente 500000 ppm o al menos aproximadamente 1000000 ppm.
El recipiente de aislamiento puede incluir además un componente para vigilar la concentración del agente esterilizante (por ejemplo, un gas esterilizante) dentro del espacio libre superior del recipiente para vigilar la atmósfera esterilizante. Por ejemplo, un recipiente de aislamiento puede incluir un sensor para vigilar la concentración de gas esterilizante dentro del espacio libre superior, o un sensor (por ejemplo, una sonda de gas disuelto) para vigilar la concentración de gas disuelto del líquido contenido en el recipiente de aislamiento.
En algunos ejemplos, el espacio llenado de líquido dentro del recipiente de aislamiento representa entre aproximadamente un 3 % y aproximadamente un 97 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 5 % y aproximadamente un 95 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 10 % y aproximadamente un 90 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 15 % y aproximadamente un 85 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 20 % y aproximadamente un 80 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 25 % y aproximadamente un 75 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 30 % y aproximadamente un 70 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 35 % y aproximadamente un 65 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 40 % y aproximadamente un 60 % del volumen total del recipiente de aislamiento; entre aproximadamente un 45 % y aproximadamente un 55 % del volumen total del recipiente de aislamiento; o aproximadamente un 5 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 10 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 15 % del volumen total del recipiente de aislamiento, aproximadamente un 20 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 25 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 30 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 35 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 40 % del volumen
total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 45 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 50 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 55 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 60 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 65 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 75 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 80 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 85 % del volumen total del recipiente de aislamiento; aproximadamente un 90 % del volumen total del recipiente de aislamiento; o aproximadamente un 95 % del volumen total del recipiente de aislamiento.
Un recipiente de aislamiento puede incluir al menos una entrada de gas para introducir un gas esterilizante en el espacio libre superior del recipiente de aislamiento. Como puede apreciarse en la técnica, hay muchas manteras en que puede introducirse un gas al espacio libre superior de un recipiente. Por ejemplo, el gas puede rociarse en el recipiente o introducirse directamente en el espacio libre superior del recipiente. Por tanto, la al menos una entrada de gas puede conectarse a uno o más elementos de rociado de gas que permiten la emisión de gas al recipiente de aislamiento. La entrada de gas puede estar en comunicación gaseosa mediante un conducto con un sistema para generar o administrar un gas esterilizante, o para generar y administrar un gas esterilizante (por ejemplo, ozono, óxido de etileno, dióxido de nitrógeno o peróxido de hidrógeno vaporizado). Por ejemplo, la entrada de gas puede estar en comunicación gaseosa con un sistema para generar ozono, como es bien conocido en la técnica.
El recipiente de aislamiento puede incluir al menos una salida de gas configurada para ventilar gas de forma continua o periódica del espacio libre superior del recipiente de aislamiento. Como puede apreciarse en la técnica, la salida de gas puede estar configurada para ventilar gas automáticamente, si la presión del gas del espacio libre superior es excesiva. La salida de gas puede estar en comunicación gaseosa con una unidad configurada para contener, destruir o atenuar el gas esterilizante. Por ejemplo, la salida de gas puede estar en comunicación gaseosa con una unidad de destrucción de ozono. Las unidades de destrucción de ozono son conocidas en la técnica y pueden ser catalíticas, térmicas, termocatalíticas o de carbono activado. Las unidades catalíticas pueden usar dióxido de manganeso o aluminio recubierto con paladio y destruir el ozono a temperaturas de aproximadamente 50 °C. Las unidades destructoras térmicas típicamente funcionan a temperaturas de aproximadamente 120 °C.
En algunos ejemplos, el recipiente de aislamiento descrito en este documento comprende al menos una entrada de fluidos en comunicación fluida con al menos una salida de fluidos de un recipiente de proceso estéril y configurada de modo que el fluido que entra en el recipiente de aislamiento pase a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del recipiente de aislamiento. En algunos aspectos, la al menos una entrada de fluidos del recipiente de aislamiento está en comunicación fluida con la al menos una salida de fluidos de un recipiente de proceso estéril mediante un conducto de fluidos.
En algunos ejemplos, el recipiente de aislamiento descrito en este documento comprende al menos una salida de fluidos. Para algunas configuraciones de sistema ejemplares, la al menos una salida de fluidos del recipiente de aislamiento está en comunicación fluida con un aparato para purificar y pulir una proteína recombinante. Por tanto, en algunos aspectos, los métodos divulgados en este documento comprenden hacer fluir un volumen de líquido desde el recipiente de aislamiento (por ejemplo, el segundo recipiente) a un aparato para purificar y pulir una proteína recombinante.
El término "purificación" significa una etapa realizada para aislar una proteína recombinante (por ejemplo, una proteína terapéutica recombinante) de una o más impurezas distintas (por ejemplo, impurezas voluminosas) o componentes presentes en un fluido que contiene una proteína recombinante (por ejemplo, proteínas del medio de cultivo líquido o uno o más componentes distintos (por ejemplo, ADN, ARN, otras proteínas, endotoxinas, virus, etc.) presentes en o secretados desde una célula de mamífero). Por ejemplo, la purificación puede realizarse durante o después de una etapa de captura inicial. La purificación puede realizarse usando cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, usando una resina, membrana o cualquier otro soporte sólido que se una a una proteína recombinante o contaminantes (por ejemplo, a través del uso de cromatografía de afinidad, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico o cromatografía de tamiz molecular). Una proteína recombinante puede purificarse de un fluido que contiene la proteína recombinante usando al menos una columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica (por ejemplo, cualquiera de las columnas de cromatografía o membranas cromatográficas descritas en este documento).
El término "pulido" es un término de la técnica y significa una etapa realizada para retirar rastros o pequeñas cantidades restantes de contaminantes o impurezas de un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante que está próxima a una pureza deseada final. Por ejemplo, el pulido puede realizarse pasando un fluido que contiene la proteína terapéutica recombinante a través de una o más columnas cromatográficas o uno o más absorbentes de membrana que se unen selectivamente a la proteína terapéutica recombinante diana o pequeñas cantidades de contaminantes o impurezas presentes en un fluido que contiene una proteína terapéutica recombinante. En dicho ejemplo, el eluido/filtrado de la una o más columnas de cromatografía o el uno o más absorbentes de membrana contiene la proteína terapéutica recombinante.
Por ejemplo, la divulgación proporciona métodos que comprenden hacer fluir un volumen de líquido que comprende una proteína recombinante desde el recipiente de aislamiento (por ejemplo, el segundo recipiente) en un primer
sistema de cromatografía de múltiples columnas (MCCS1), capturar dicha proteína terapéutica recombinante del medio de cultivo líquido usando el MCCS1, en el que el eluido del MCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente a un segundo sistema de cromatografía de múltiples columnas (MCCS2); y purificar y pulir la proteína terapéutica recombinante usando el MCCS2, en el que el eluido del MCCS2 es una proteína terapéutica recombinante; y en el que el proceso está integrado y se ejecuta continuamente desde dicho primer recipiente hasta el eluido del MCCS2 que es la proteína terapéutica recombinante.
La expresión "sistema de cromatografía de múltiples columnas" o "MCCS" significa un sistema de un total de dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas interconectadas o de cambio. Un ejemplo no limitante de un sistema de cromatografía de múltiples columnas es un sistema de cromatografía de contracorriente periódico (PCC) que contiene un total de dos o más columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas interconectadas o de cambio. En este documento se describen ejemplos adicionales de sistemas de cromatografía de múltiples columnas y son conocidos en la técnica.
El término "captura" significa una etapa realizada para purificar o aislar parcialmente (por ejemplo, al menos o aproximadamente un 5 %, por ejemplo, al menos o aproximadamente un 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 40 %, 45 %,
50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o al menos o aproximadamente un 95 % pura en peso), concentrar y estabilizar una proteína recombinante (por ejemplo, una proteína terapéutica recombinante) de uno o más componentes diferentes presentes en un medio de cultivo líquido o un medio de cultivo líquido diluido (por ejemplo, proteínas de medio de cultivo o uno o más componentes diferentes (por ejemplo, ADN, ARN u otras proteínas) presentes en o secretados desde una célula de mamífero). Típicamente, la captura se realiza usando una resina que se une a una proteína recombinante (por ejemplo, a través del uso de cromatografía de afinidad). En este documento se describen métodos no limitantes para capturar una proteína recombinante de un medio de cultivo líquido o medio de cultivo líquido diluido y otros son conocidos en la técnica. Una proteína recombinante puede capturarse de un medio de cultivo líquido usando al menos una columna de cromatografía y/o membrana cromatográfica (por ejemplo, cualquiera de las columnas de cromatografía y/o membranas cromatográficas descritas en este documento).
El término "eluido/filtrado" es un término de la técnica y significa un fluido que se emite desde una columna de cromatografía o membrana cromatográfica que contiene una cantidad detectable de una proteína recombinante (por ejemplo, proteína terapéutica recombinante).
El término "filtración" significa la retirada de al menos parte de (por ejemplo, al menos un 80 %, 90 %, 95 %, 96 %,
97 %, 98 % o 99 %) de contaminantes biológicos indeseados (por ejemplo, una célula de mamífero, bacterias, células de levadura, virus o micobacterias) y/o materia en partículas (por ejemplo, proteínas precipitadas) a partir de un líquido
(por ejemplo, un medio de cultivo líquido o un fluido presente en cualquiera de los sistemas o procesos descritos en este documento).
La expresión "proteína secretada" o "proteína recombinante secretada" significa una proteína (por ejemplo, una proteína recombinante) que originalmente contiene al menos una secuencia señal de secreción cuando se traduce dentro de una célula de mamífero, y a través de, al menos en parte, escisión enzimática de la secuencia señal de secreción en la célula de mamífero, se secreta al menos parcialmente al espacio extracelular (por ejemplo, un medio de cultivo líquido). Los expertos en la materia apreciarán que una proteína "secretada" no tiene que disociarse completamente de la célula para considerarse una proteína secretada.
Para algunas configuraciones de sistema ejemplares, la al menos una salida de fluidos del recipiente de aislamiento está en comunicación fluida con un receptáculo para aceptar y/o eliminar el material de residuo (por ejemplo, un recipiente, un sumidero o una unidad para la eliminación de material fluido de proceso biológico conocido por los expertos en la materia).
Los procesos de aislamiento y los sistemas permiten aislar corrientes de fluido de un recipiente de un sistema esterilizado (por ejemplo, un recipiente de proceso estéril) que contiene un proceso estéril. En algunos ejemplos, el recipiente de proceso estéril contiene un proceso estéril y comprende al menos una salida de fluidos para retirar fluido del recipiente. Para los procesos y sistemas descritos en este documento, la al menos una salida de fluidos está en comunicación fluida con al menos una entrada de fluidos de un recipiente de aislamiento, en la que la salida de fluidos del recipiente de aislamiento está configurada de modo que el fluido que entra en el recipiente de aislamiento pasa a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del recipiente de aislamiento.
Como puede apreciarse en la técnica, el recipiente de proceso estéril puede tener una diversidad de diferentes volúmenes. Por ejemplo, el recipiente de proceso estéril en la etapa puede tener un volumen interno entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 200 l (por ejemplo, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente
180 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 160 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 140 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 120 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 90 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 80 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 70 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadam aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadam aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 30 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadam
aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 0,50 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 200 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 180 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 160 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 140 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 120 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 90 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 80 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 70 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 60 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 40 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 30 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 20 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 1,0 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 200 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 180 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 160 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 140 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 120 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 90 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 80 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 70 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 60 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 40 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 30 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 20 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 1,5 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 200 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 180 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 160 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 140 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 120 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 90 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 80 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 70 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 60 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 40 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 30 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 20 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 2,0 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 200 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 180 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 160 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 140 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 120 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 90 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 80 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 70 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 60 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 40 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 30 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 20 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 10 l, entre aproximadamente 2,5 l y aproximadamente 5,0 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 200 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 180 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 160 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 140 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 120 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 100 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 90 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 80 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 70 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 60 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 50 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 40 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 30 l, entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 20 l, o entre aproximadamente 5,0 l y aproximadamente 10 l).
En algunos ejemplos, el recipiente que contiene el proceso estéril es un componente de un sistema de fabricación biológico. Los componentes de sistemas de fabricación biológicos contemplados en este documento, incluyen, por ejemplo, un matraz, un conducto de fluidos, un biorreactor, uno o más componentes de sistemas de cromatografía (por ejemplo, una columna de cromatografía), uno o más componentes de sistema de microfiltración o uno o más componentes de un sistema de ultrafiltración/diafiltración.
En algunas realizaciones, el biorreactor es un biorreactor de perfusión, un biorreactor de lote alimentado o un biorreactor de producción. El biorreactor de perfusión puede ser cualquiera de los biorreactores de perfusión ejemplares descritos en este documento o conocidos en la técnica. Por ejemplo, un biorreactor de perfusión puede estar hecho de acero inoxidable o plástico (por ejemplo, una bolsa estéril de plástico). La superficie interior de un biorreactor de perfusión puede tener al menos un recubrimiento (por ejemplo, al menos un recubrimiento de gelatina, colágeno, poli-L-ornitina, poliestireno y laminina), y como se conoce en la técnica, uno o más accesos para el rociado de O2 , CO2 y N2 en el medio de cultivo líquido, y un mecanismo de agitación para agitar el medio de cultivo líquido. El biorreactor de perfusión también puede estar equipado con un dispositivo mecánico que puede retirar un volumen de fluido (por ejemplo, medio de cultivo líquido) del biorreactor y opcionalmente, un filtro dentro del dispositivo mecánico que retira las células del fluido durante el proceso de transferencia de fluido fuera del biorreactor (por ejemplo, un sistema de flujo tangencial alterno (ATF), uno de filtración de flujo tangencial (TFF)). El biorreactor también puede estar equipado con una o más bombas, y uno o más depósitos para alojar el fluido retirado.
El volumen del líquido puede retirarse, por ejemplo, usando un sistema mecánico y/o por filtración o flujo por gravedad del volumen a través de una membrana estéril con un límite de peso molecular que excluye células de mamífero presentes en el volumen.
Como puede apreciarse en la técnica, el recipiente que contiene el proceso estéril puede ser cualquier aparato usado
en la técnica con el fin de cultivar células de mamífero (por ejemplo, un matraz (por ejemplo, un matraz de centrifugación), un tubo oscilante o un biorreactor). Por ejemplo, el recipiente que contiene el proceso estéril puede ser cualquier aparato usado en la técnica con el fin de cultivar células de mamífero recombinantes. El recipiente puede incluir un medio interno para agitación (por ejemplo, un propulsor) o el recipiente puede agitarse externamente (por ejemplo, a través del uso de una plataforma giratoria y/o basculante). El recipiente puede estar hecho de acero inoxidable o plástico (por ejemplo, una bolsa estéril de plástico). En algunas realizaciones, el recipiente puede ser un biorreactor de un solo uso desechable (por ejemplo, un biorreactor desechable MilliporeTM Mobius® Cellready de 3 l, biorreactor desechable Pierre Guerin a TM1 NucleoTM de 20 l, un biorreactor desechable Sartorius Cultibag STRTM de 50 l, un biorreactor desechable Sartorius Cultibag RMTM de 20 l, Sartorius Cultibag OrbitalTM de 50 l, GE Wave Bioreactor 2/10 System de 5 l, GE Wave Bioreactor 20/50 System de 25 l, GE Wave Bioreactor 200 System de 200 l o GE Wave Bioreactor 500/1000 System de 500 l). La superficie interior del recipiente de puede tener al menos un recubrimiento (por ejemplo, al menos un recubrimiento de gelatina, colágeno, poli-L-ornitina, poliestireno y laminina), y como se conoce en la técnica, uno o más accesos para el rociado de O2 , CO2 y N2 en el primer medio de cultivo. El recipiente puede estar equipado con una o más sondas sensoras. Cuando el recipiente está compuesto de material plástico no rígido (por ejemplo, una bolsa estéril de plástico), el recipiente puede conectarse a un soporte exterior que rodea y sostiene el recipiente.
Una célula de mamífero recombinante puede ser una célula humana, de ratón, de hámster o de mono. Por ejemplo, una célula de mamífero recombinante puede ser una línea celular, por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO) (por ejemplo, células CHO DG44, células CHO-K1s, células clonales C02.31, células clonales A14.13, células clonales C02.57 y células clonales F05.43), Sp2.0, células de mieloma (por ejemplo, NS/0), linfocitos B, células de hibridoma, linfocitos T, células de riñón embrionario humano (HEK) (por ejemplo, HEK 293E y HEK 293F), células epiteliales de riñón de mono verde africano (Vero) o células epiteliales de riñón canino (Cocker Spaniel) de Madin-Darby (MDCK).
Puede introducirse un ácido nucleico que codifica una proteína recombinante en una célula de mamífero para producir una célula de mamífero recombinante usando una amplia diversidad de métodos conocidos en biología molecular y genética molecular. Ejemplos no limitantes incluyen transfección (por ejemplo, lipofección), transducción (por ejemplo, infección por lentivirus, adenovirus o retrovirus), y electroporación. En algunos casos, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante no se integra de forma estable en un cromosoma de la célula de mamífero recombinante (transfección transitoria), mientras que en otras células de mamífero recombinantes el ácido nucleico se integra. Como alternativa o adicionalmente, el ácido nucleico que codifica una proteína recombinante puede estar presente en un plásmido y/o en un cromosoma artificial de mamífero (por ejemplo, un cromosoma artificial humano). Como alternativa o adicionalmente, el ácido nucleico puede introducirse en la célula de mamífero usando un vector vírico (por ejemplo, un vector de lentivirus, retrovirus o adenovirus). El ácido nucleico puede unirse de forma funcional a una secuencia promotora (por ejemplo, un promotor fuerte, tal como un promotor de p-actina y promotor de CMV, o un promotor inducible). Un vector que incluye el ácido nucleico también puede incluir, si se desea, un marcador de selección (por ejemplo, un gen que confiere resistencia a higromicina, puromicina o neomicina a la célula de mamífero).
Los medios de cultivo líquidos (medios de cultivo) son conocidos en la técnica. Un medio de cultivo líquido puede complementarse con un suero de mamífero (por ejemplo, suero fetal bovino y suero bovino), y/o una hormona de crecimiento o factor de crecimiento (por ejemplo, insulina, transferrina y factor de crecimiento epidérmico). Cualquiera de los medios de cultivo líquidos descritos en este documento puede seleccionarse del grupo de medio de cultivo líquido son componentes de origen animal, medio de cultivo líquido sin suero, medio de cultivo líquido que contiene suero, medio de cultivo líquido químicamente definido y medio de cultivo líquido sin proteínas. Ejemplos no limitantes de medios de cultivo líquidos químicamente definidos, medios de cultivo líquidos sin componentes de origen animal, medios de cultivo líquidos sin suero y medios de cultivo líquidos que contienen suero están disponibles en el mercado.
Un medio de cultivo líquido típicamente incluye una fuente de energía (por ejemplo, un carbohidrato, tal como glucosa), aminoácidos esenciales (por ejemplo, el conjunto básico de veinte aminoácidos más cisteína), vitaminas y/u otros compuestos orgánicos requeridos a bajas concentraciones, ácidos grasos libres y/u oligoelementos. El medio de cultivo líquido (por ejemplo, un primer y/o segundo medio de cultivo líquido) puede complementarse, si se desea, son, por ejemplo, una hormona o factor de crecimiento de mamífero (por ejemplo, insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales y tampones (por ejemplo, sales de calcio, magnesio y fosfato), nucleósidos y bases (por ejemplo, adenosina, timidina e hipoxantina), hidrolizados de proteína y tejido, y/o cualquier combinación de estos aditivos.
En la técnica se conoce una amplia diversidad de diferentes medios de cultivo líquidos que pueden usarse para cultivar células (por ejemplo, células de mamífero) en cualquier etapa de cualquiera de los métodos descritos en este documento. Los componentes del medio que también pueden ser útiles en los presentes procesos incluyen, aunque sin limitación, hidrolizados químicamente definidos (CD), por ejemplo, peptona CD, polipéptidos CD (dos o más aminoácidos) y factores de crecimiento CD. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de medio de histocultivo líquido y componentes del medio.
El medio de cultivo líquido obtenido de un cultivo de células de mamífero recombinantes puede filtrarse o aclararse para obtener un medio de cultivo líquido que esté sustancialmente libre de células y/o virus. En la técnica se conocen
métodos para filtrar o aclarar un medio de cultivo líquido para retirar células (por ejemplo, filtración de 0,2 pm, filtración usando un sistema de flujo tangencial alterno (ATF™), un sistema de filtración de flujo tangencial (TFF) o cualquiera de los sistemas descritos en la solicitud de patente provisional de Estados Unidos n.° 61/878.502). Las células recombinantes también pueden retirarse del medio de cultivo líquido usando centrifugación y retirando el sobrenadante, es decir, el medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células, o permitiendo que las células sedimenten en el fondo gravitatorio de un envase (por ejemplo, recipiente) que contiene el medio de cultivo líquido, y retirando el medio de cultivo líquido (el medio de cultivo líquido que está sustancialmente libre de células) que está distante de las células de mamífero recombinantes sedimentadas. En algunas realizaciones, el uno o más (por ejemplo, dos, tres o todos) del primer medio de cultivo, el segundo medio de cultivo, el tercer medio de cultivo y el cuarto medio de cultivo son idénticos.
El medio de cultivo líquido usado en cualquiera de las etapas en cualquiera de los métodos descritos en este documento puede ser cualquiera de los tipos de medio de cultivo líquido descritos en este documento o conocidos en la técnica. En cualquiera de los métodos ejemplares para aislar una proteína recombinante descritos en este documento, un medio de cultivo líquido obtenido de un cultivo celular de producción puede diluirse mediante la adición de un segundo fluido (por ejemplo, un tampón).
El medio de cultivo líquido que contiene una proteína recombinante (por ejemplo, una proteína terapéutica recombinante) que está sustancialmente libre de células puede almacenarse (por ejemplo, a una temperatura por debajo de aproximadamente 15 °C (por ejemplo, por debajo de aproximadamente 10 °C, por debajo de aproximadamente 4 °C, por debajo de aproximadamente 0 °C, por debajo de aproximadamente -20 °C, por debajo de aproximadamente -50 °C, por debajo de aproximadamente -70 °C o por debajo de aproximadamente -80 °C) durante al menos 1 día (por ejemplo, al menos aproximadamente 2 días, al menos aproximadamente 5 días, al menos aproximadamente 10 días, al menos aproximadamente 15 días, al menos aproximadamente 20 días o al menos aproximadamente 30 días) antes de aislar la proteína recombinante (por ejemplo, antes de alimentar el medio de cultivo líquido en el primer MCCS (por ejemplo, primer PCCS)). Como alternativa, en algunos ejemplos, el medio de cultivo líquido que contiene una proteína recombinante que está sustancialmente libre de células se alimenta en un sistema usado para aislar la proteína recombinante.
Una proteína recombinante puede ser una proteína terapéutica recombinante. Ejemplos no limitantes de proteínas terapéuticas recombinantes que pueden producirse por los métodos proporcionados en este documento incluyen inmunoglobulinas (incluyendo inmunoglobulinas de cadena ligera y pesada, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo, cualquiera de los fragmentos de anticuerpo descritos en este documento), enzimas (por ejemplo, una galactosidasa (por ejemplo, una alfa-galactosidasa), Myozyme® o Cerezyme®), proteínas (por ejemplo, eritropoyetina humana, factor de necrosis tumoral (TNF) o un interferón alfa o beta), o proteínas o fragmentos de proteínas inmunógenas o antigénicas (por ejemplo, proteínas para su uso en una vacuna). La proteína terapéutica recombinante puede ser un polipéptido de unión a antígeno manipulado que contiene al menos una estructura proteínica recombinante multifuncional (véanse, por ejemplo, las proteínas de unión a antígeno recombinantes descritas en Gebauer etal., Current Opin. Chem. Biol. 13:245-255, 2009; y la publicación de solicitud de patente de Estados Unidos n.° 2012/0164066). Ejemplos no limitantes de proteínas terapéuticas recombinantes que son anticuerpos incluyen: panitumumab, omalizumab, abagovomab, abciximab, actoxumab, adalimumab, adecatumumab, afelimomab, afutuzumab, alacizumab, alacizumab, alemtuzumab, alirocumab, altumomab, amatuximab, amatuximab, anatumomab, anrukinzumab, apolizumab, arcitumomab, atinumab, tocilizumab, basilizimab, bectumomab, belimumab, bevacizumab, besilesomab, bezlotoxumab, biciromab, canakinumab, certolizumab, cetuximab, cixutumumab, daclizumab, denosumab, densumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, efungumab, epratuzumab, ertumaxomab, etaracizumab, figitumumab, golimumab, ibritumomab tiuxetan, igovomab, imgatuzumab, infliximab, inolimomab, inotuzumab, labetuzumab, lebrikizumab, moxetumomab, natalizumab, obinutuzumab, oregovomab, palivizumab, panitumumab, pertuzumab, ranibizumab, rituximab, tocilizumab, tositumomab, tralokinumab, tucotuzumab, trastuzumab, veltuzumab, zalutumumab y zatuximab. En la técnica se conocen ejemplos adicionales de anticuerpos terapéuticos recombinantes que pueden producirse por los métodos descritos en este documento. Ejemplos no limitantes adicionales de proteínas terapéuticas recombinantes que pueden producirse por los presentes métodos incluyen: alglucosidasa alfa, laronidasa, abatacept, galsulfasa, lutropina alfa, factor antihemofílico, agalsidasa beta, interferón beta-la, darbepoetina alfa, tenecteplasa, etanorcept, factor de coagulación IX, hormona foliculoestimulante, interferón beta-la, imiglucerasa, dornasa alfa, epoetina alfa, insulina o análogos insulínicos, mecasermina, factor VIII, factor VIIa, antitrombina III, proteína C, albúmina humana, eritropoyetina, factor estimulante de colonias de granulocitos, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, interleucina-11, laronidasa, idursulfasa, galsulfasa, inhibidor de a-1-proteinasa, lactasa, adenosina desaminasa, activador tisular del plasminógeno, tirotropina alfa (por ejemplo, Thyrogen®) y alteplasa. Ejemplos adicionales de proteínas recombinantes que pueden producirse por los presentes métodos incluyen a-glucosidasa ácida, alglucosidasa alfa (por ejemplo, Myozyme® y Lumizyme®), a-L-iduronidasa (por ejemplo, Aldurazyme®), iduronato sulfatasa, heparano N-sulfatasa, galactosa-6-sulfatasa, pgalactosidasa ácida, p-glucoronidasa, N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa, a-N-acetilgalactosaminidasa, lipasa ácida, ceramidasa ácida lisosómica, esfingomielinasa ácida, p-glucosidasa (por ejemplo, Cerezyme® y Ceredase®), galactosilceramidasa, a-galactosidasa-A (por ejemplo, Fabrazyme®), p-galactosidasa ácida, p-galactosidasa, neuraminidasa, hexosaminidasa A y hexosaminidasa B.
Una proteína recombinante soluble secretada puede recuperarse del medio de cultivo líquido retirando o separando
físicamente de otro modo el medio de cultivo líquido de las células (por ejemplo, células de mamífero). En la técnica se conoce una diversidad de diferentes métodos para retirar el medio de cultivo líquido de las células (por ejemplo, células de mamífero) incluyendo, por ejemplo, centrifugación, filtración, pipeteo y/o aspiración. La proteína terapéutica recombinante secretada entonces puede recuperarse y aislarse del medio de cultivo líquido usando una diversidad de técnicas bioquímicas incluyendo diversos tipos de cromatografía (por ejemplo, cromatografía de afinidad, cromatografía de tamiz molecular, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de interacción hidrófoba o cromatografía de intercambio aniónico) y/o filtración (por ejemplo, filtración con límite de peso molecular).
El fluido puede retirarse del recipiente de proceso estéril por retirada continua o periódica. En algunos ejemplos, el fluido retirado del recipiente de proceso estéril comprende una proteína recombinante. En algunos ejemplos, el fluido retirado del recipiente de proceso estéril comprende un medio de cultivo. En algunos ejemplos, el fluido retirado del recipiente de proceso estéril no comprende una proteína recombinante.
Ejemplos
La invención se describe además en el siguiente ejemplo, que no limita el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.
Ejemplo 1
La figura 2 describe un sistema de ejemplo para aislar corrientes de proceso estéril de entornos no estériles de acuerdo con la presente invención. El sistema puede ser cualquier proceso estéril incluyendo, por ejemplo, un componente de una corriente de proceso de fabricación biológico. Como se demuestra en la figura 2, el sistema comprende un recipiente de proceso estéril (110) (por ejemplo, un primer recipiente) que comprende una salida de fluidos (130). Para una corriente de proceso de fabricación biológico, el primer recipiente puede ser, por ejemplo, un conducto de fluidos para hacer fluir medio líquido, un biorreactor (por ejemplo, cualquiera de los biorreactores ejemplares descritos en este documento o conocidos en la técnica), uno o más componentes de sistemas de cromatografía (por ejemplo, una columna de cromatografía), uno o más componentes de sistema de microfiltración, uno o más componentes de un sistema de ultrafiltración/diafiltración. El sistema descrito en la figura 2 comprende además un recipiente de aislamiento (120) (por ejemplo, un segundo recipiente) que comprende una entrada de fluidos (140) en comunicación fluida mediante un conducto de fluidos (210) con la salida de fluidos (130) del primer recipiente (110) y configurada de modo que el fluido que entra en el segundo recipiente pase a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante (150) dentro del segundo recipiente (120), una salida de fluidos (170) configurada de modo que el fluido que sale del segundo recipiente se retire desde debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante (150) dentro del segundo recipiente (120). El segundo recipiente incluye al menos una entrada de gas (180) para suministrar un gas esterilizante mediante un conducto de gases (220) para llenar el espacio libre superior del segundo recipiente. El segundo recipiente también incluye al menos una salida de gases (160) configurada para ventilar gas de forma continua o periódica del aislamiento.
La figura 1 proporciona una realización ejemplar para aislar corrientes de proceso estéril de entornos no estériles de acuerdo con la presente invención. Para el sistema descrito en la figura 1, las corrientes de residuos de un recipiente de proceso estéril (por ejemplo, un primer recipiente, no mostrado) están en comunicación fluida con un recipiente de aislamiento (por ejemplo, un segundo recipiente), estando configurado el recipiente de aislamiento de modo que el fluido entre en la parte superior del segundo recipiente y pase a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante dentro del segundo recipiente. El segundo recipiente comprende además una salida de fluidos configurada de modo que el fluido que sale del segundo recipiente se retire desde debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante (es decir, por debajo de la parte llenada de fluido del segundo recipiente) dentro del segundo recipiente. La figura 2 demuestra además un sistema de bomba que comprende una bomba configurada para retirar un volumen de fluido desde la salida del segundo recipiente y hacer fluir el volumen a un receptáculo para eliminar una corriente de residuos biológicos. El segundo recipiente incluye al menos una entrada de gas en comunicación gaseosa con el sistema para generar o administrar un gas esterilizante, o para generar y administrar un gas esterilizante (por ejemplo, un sistema que genera ozono) para llenar el espacio libre superior del segundo recipiente. De acuerdo con esta realización, el gas esterilizante se rocía al segundo recipiente. El segundo recipiente también incluye al menos una salida de gases configurada para ventilar gas de forma continua o periódica del aislamiento.
Otras realizaciones
Debe apreciarse que, aunque la invención se ha descrito junto con la descripción detallada de la misma, la descripción anterior está destinada a ilustrar y no a limitar el alcance de la invención, que se define por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Otros aspectos, ventajas y modificaciones están dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.
Claims (14)
1. Un método de inhibición de la contaminación de un sistema esterilizado, comprendiendo el método:
proporcionar un sistema que comprende un primer recipiente (110) y un segundo recipiente (120), en el que el primer recipiente (110) comprende un líquido y el segundo recipiente (120) contiene un volumen de gas esterilizante dispuesto dentro de un espacio libre superior del mismo; y
hacer fluir un primer volumen del líquido fuera del primer recipiente (110) y a través del volumen de gas esterilizante y al segundo recipiente (120).
2. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo recipiente (120) comprende además:
(i) una entrada de fluidos (140) configurada de modo que el primer volumen de líquido que entra en el segundo recipiente (120) pase a través del espacio libre superior (150);
(ii) una salida de fluidos configurada de modo que el líquido que sale del segundo recipiente se hace fluir desde debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante (150);
(iii) al menos una entrada de gas (180); y
(iv) al menos una salida de gas (160),
en el que la entrada de fluidos está en comunicación fluida con el primer recipiente (110).
3. El método de la reivindicación 2, en el que el primer recipiente (110) comprende una salida de fluidos (130) en comunicación fluida con una entrada de fluidos (140) del segundo recipiente (120).
4. El método de la reivindicación 1, en el que el gas esterilizante se rocía en el segundo recipiente (120) o se introduce directamente en el espacio libre superior (150) del segundo recipiente (120).
5. El método de la reivindicación 1, en el que el primer recipiente (110) es un biorreactor, un sistema de cromatografía, un sistema de microfiltración (MF) o un sistema de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF).
6. El método de la reivindicación 1, en el que el primer volumen del líquido comprende una proteína terapéutica recombinante.
7. El método de la reivindicación 6, que comprende además:
(i) hacer fluir un segundo volumen de líquido que comprende la proteína terapéutica recombinante desde el segundo recipiente (120) en un primer sistema de cromatografía de múltiples columnas (MCCS1);
(ii) capturar la proteína terapéutica recombinante del medio de cultivo líquido usando el MCCS1, en el que el eluido del MCCS1 que contiene la proteína terapéutica recombinante se alimenta continuamente a un segundo sistema de cromatografía de múltiples columnas (MCCS2); y
(iii) purificar y pulir la proteína terapéutica recombinante usando el MCCS2, en el que el eluido del MCCS2 comprende la proteína terapéutica recombinante,
en el que el proceso está integrado y se ejecuta continuamente desde el primer recipiente (110) hasta el eluido del MCCS2 que comprende la proteína terapéutica recombinante.
8. El método de la reivindicación 6, que comprende además hacer fluir un segundo volumen de líquido que comprende la proteína terapéutica recombinante desde el segundo recipiente (120) a un aparato para purificar y pulir la proteína terapéutica recombinante.
9. El método de la reivindicación 7, en el que la proteína terapéutica recombinante es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, una enzima, una proteína manipulada o una proteína o fragmento de proteína inmunógena.
10. El método de la reivindicación 1, en el que el gas esterilizante se selecciona del grupo que consiste en: ozono, óxido de etileno, dióxido de nitrógeno y peróxido de hidrógeno vaporizado.
11. Un sistema para aislar corrientes de proceso estéril de entornos no estériles, que comprende:
un primer recipiente (110) que comprende una salida de fluidos (130); y
al menos un segundo recipiente (120) que comprende:
(i) una entrada de fluidos (140) en comunicación fluida con la salida de fluidos (130) del primer recipiente (110) y configurada de modo que el fluido que entra en el segundo recipiente (120) pase a través de un espacio libre superior llenado de gas esterilizante (150) dentro del segundo recipiente (170);
(ii) una salida de fluidos (170) configurada de modo que el fluido que sale del segundo recipiente (120) se retira desde debajo del espacio libre superior llenado de gas esterilizante (150) dentro del segundo recipiente (170);
(iii) al menos una entrada de gas (180); y
(iv) al menos una salida de gas (160).
12. El sistema de la reivindicación 11, en el que el primer recipiente (110) es un conducto de fluidos, un biorreactor de producción, un biorreactor de inóculo, un biorreactor de lote alimentado, un sistema de cromatografía, un sistema de microfiltración (MF) o un sistema de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF).
13. El sistema de la reivindicación 11, en el que el gas esterilizante se selecciona del grupo que consiste en ozono, óxido de etileno, dióxido de nitrógeno o peróxido de hidrógeno vaporizado.
14. El sistema de la reivindicación 11, en el que la salida de fluidos del segundo recipiente (170) está en comunicación fluida con un aparato para purificar y pulir una proteína recombinante.
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