CN101200691B

CN101200691B - 可控制杂菌污染的白腐真菌反应器及其控制方法

Info

Publication number: CN101200691B
Application number: CN2007103039179A
Authority: CN
Inventors: 文湘华; 周成
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2007-12-21
Filing date: 2007-12-21
Publication date: 2011-05-11
Anticipated expiration: 2027-12-21
Also published as: CN101200691A

Abstract

本发明涉及在非灭菌环境条件下建立白腐真菌降解体系时抑制污染杂菌的方法。试验发现：低浓度的臭氧可以用于白腐真菌反应器中污染的杂菌进行控制；在白腐真菌反应器运行试验中，将白腐真菌固定于打结棉线载体上并投入反应器中，通过曝气使附着白腐真菌的载体处于流化状态。然后通过外部回流系统，连续将含有污染杂菌的上清液引入臭氧接触反应器中，经过一定的时间的臭氧杀菌后，再将臭氧处理后的液体回流至白腐真菌反应器中。在连续采用臭氧进行控制时发现：污染杂菌被成功控制在1×10⁴CFU/ml左右，白腐真菌能生成MnP且能在较长时间内保持其形态不变。本发明为白腐真菌反应器的建立和实际工程应用白腐真菌处理难降解污染物废水提供新可能。

Description

可控制杂菌污染的白腐真菌反应器及其控制方法

技术领域

本发明属于应用微生物领域，特别涉及在非灭菌环境条件下建立白腐真菌降解体系时抑制其它微生物生长、繁殖的方法。用于保证对白腐真菌反应器的长期运行。

背景技术

难降解有机污染物很难被微生物分解或分解速度很慢且不彻底，残留时间较长，是环境保护与治理技术研究的难点，至今尚无十分经济有效的解决方法。

在对白腐真菌的研究中人们认识到：白腐真菌能降解多种难降解有机污染物，这为难降解有机污染物的治理提供了一条新的途径。然而，无论国内还是国外，对白腐真菌处理难降解有机污染物废水的研究都还停留在实验室研究阶段，应用到实际工程中的案例基本没有。

那么是什么制约其在实际工程中应用呢？经过对从1982年至今的45个反应器研究情况的分析，我们发现：维持白腐真菌的生物活性是关键的因素。在影响白腐真菌生物活性的因素中，杂菌(主要是细菌)的干扰不容忽视。白腐真菌有别于细菌，它属于真核微生物，生长速度很慢。因此，一旦反应体系有细菌进入，细菌就会与白腐真菌争夺培养基中的营养物质，由于细菌的繁殖速度比真菌快很多，这样，细菌就会在反应体系内占优势，而白腐真菌因缺乏营养将停止生长，进而影响胞外降解酶系的分泌，使整个处理系统失去降解的功能。由此可知，解决白腐真菌降解系统的染菌问题，有助于维持反应器中白腐真菌的生物活性。在实验室研究中，采用灭菌手段来解决染菌问题，这在实际工程中显然是行不通的，因为它将大大提高工艺的运行成本，即使在国外，采用灭菌手段来解决污水处理过程中的染菌问题也是没有先例的。最近几年，国外的研究者已经开始认识到染菌问题是制约白腐真菌处理技术工业化的瓶颈问题，并开始着手研究解决这一问题。

但是，通过检索中外文献，只发现两篇研究应用白腐真菌降解污染物时的抑菌技术，一个为通过控制低pH值、氮限制培养基和添加天然载体，研究应在非灭菌环境用白腐真菌Trametes versicolor降解活性染料的控制策略，但至今未见任何有关反应器水平的相关研究的报道。(Judy A，et al.Competition strategies for the decolorization of a textile-reactivedye with the white-rot fungi Trametes versicolor under non-sterileconditions.Biotechnilogy and Bioengineering，2003，82(6)：736-744.)；另外一篇文章，是Fujita等人采用高温(50℃)对回流系统中的杂菌进行抑制(Fujita M，Era A，Ike M，Soda S，Miyata N，Hirao T.Decolorizationof heat-treatment liquor of waste sludge by a bioreactor usingpolyurethane foam-immobilized white rot fungus equipped with anultramembrane filtration unit.J.Biosci Bioeng 2000；90：387-94)，可以达到80％的抑菌率。但对宽温微生物(15-65℃)而言，此温度是无法控制的；另外，50℃正好嗜热菌的最适生长温度范围。此外，80％控制的杀菌率很低，比如：若8×10⁶的细菌去掉80％仍然还有1.6×10⁶，在数量级上没有变化。因此，一旦白腐真菌反应体系感染这些微生物，是无法通过温度控制的。

综上所述，有关非灭菌环境如何培养白腐真菌和使用它降解活性染料的研究还比较初步，目前还没有能够在非灭菌环境保证白腐真菌活性并能有效抑制杂菌生长的方法。

发明内容

在白腐真菌反应器运行中，一旦反应体系有杂菌(特别是细菌)进入会导致杂菌数量的增加而使整个白腐真菌处理系统失去降解的功能。因此，染菌问题是制约白腐真菌处理技术应用的瓶颈问题。本发明的目的是提供了在自然环境(非灭菌环境)下白腐真菌反应器运行过程中有效抑制杂菌生长的方法和装置。

根据前期研究中的发现：MnP不被低浓度的臭氧所氧化而提出采用臭氧对白腐真菌反应器中污染的杂菌进行控制。首先，采用外部回流臭氧作用系统降低或解决臭氧对白腐真菌的影响。将白腐真菌固定于打结棉线载体上并投入反应器中，通过曝气使附着白腐真菌的载体处于流化状态，使大部分污染的杂菌易于与白腐真菌分离。然后，通过外部回流系统将含有污染杂菌的处理液回流到臭氧作用的反应器中利用臭氧的杀菌能力对回流液中的杂菌进行杀灭，经过预定时间的臭氧杀菌后，将臭氧作用反应器中的处理液流回白腐真菌反应器中。

本发明提供了一种可控制杂菌污染的白腐真菌反应器，其特征在于：

依次包括气泵1连接白腐真菌反应器2，臭氧作用的反应器8通过泵II 4连接白腐真菌反应器2，臭氧发生装置6连接臭氧作用的反应器8；培养基容器5通过泵I3连接白腐真菌反应器2，在白腐真菌反应器2上方设有出水口7。

本发明提供了应用上述的可控制杂菌污染的白腐真菌反应器的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

将白腐真菌固定于打结棉线载体上并投入白腐真菌反应器2，通过气泵1曝气使附着白腐真菌的载体处于流化状态，使大部分污染的杂菌易于与白腐真菌分离；培养基通过泵I3投放至白腐真菌反应器2中；

然后，通过泵II4将含有污染杂菌的处理液回流到臭氧作用的反应器8中利用臭氧的杀菌能力对回流液中的杂菌进行杀灭，经过臭氧杀菌后，将臭氧作用反应器8中的处理液流回白腐真菌反应器2中；

运行条件：白腐真菌反应器2的运行温度为30-40度，工作体积与臭氧作用体积之比为11∶1；曝气采用空气，曝气量为120-160L/h，投加附着生长有白腐真菌的打结丝线载体的数量为：150-200个/L；

臭氧作用的反应器8的运行温度为20-25度；水力停留时间(HRT)为10-40分钟，有效体积与白腐真菌反应器2的体积之比为1∶11；臭氧浓度0.98mg/L，将此浓度的臭氧作用于臭氧作用的反应器8中的处理液。

培养基的投加的配方：葡萄糖：250mg/h.L；酒石酸胺：0.6mg/h.L；磷酸二氢钾25mg/h.L；硫酸镁：6.25mg/h.L；氯化钙：1.25mg/h.L；硫酸锰2.2mg/h.L；维生素B1：0.013mg/h.L；采用乙酸-乙酸钠缓冲液将pH值调至4.5。

有益效果

从白腐真菌反应器中白腐真菌的形态变化、杂菌的数量变化和产MnP的结果表明：本发明消除了臭氧对白腐真菌的影响且对杂菌还具有良好的杀灭作用(可以将每毫升杂菌控制在1×10⁵以下)，并且还能生产目标酶-MnP。因此，本发明是可以用于对白腐真菌反应器运行中对污染的杂菌进行控制的，这为白腐真菌反应器的建立和实际工程中应用白腐真菌处理含难降解污染物废水提供了新的可能途径。

附图说明：

图1控制杂菌污染的白腐真菌反应器装置简图

图2 非连续采用臭氧控菌的控菌白腐真菌反应器运行结果

图中A所示的是臭氧加入的时间；B所示的是臭氧作用结束的时间。

图3控菌白腐真菌反应器中污染细菌

图4锰过氧化物酶(MnP)活性变化

图5白腐真菌反应器中白腐真菌形态

A图：臭氧作用反应器的HRT＝20分钟时运行20天后的白腐真菌形态

B图：臭氧作用反应器的HRT＝40分钟时运行20天后的白腐真菌形态

具体实施方式

1锰过氧化物酶(MnP)不被低浓度的臭氧所氧化

取大肠杆菌(E.coli)悬液加入200ml粗酶液(酶活：259U/L)中，使每毫升粗酶液含1×10⁹个大肠杆菌。开启臭氧发生器待臭氧的产生稳定后，将含臭氧的气体(采用的出口浓度为0.98mg/L)通入含大肠杆菌的粗酶液作用至预定时间。吸取1ml取原液或其稀释液1ml接种平皿，倾注牛肉膏蛋白胨培养基后置于37℃培养24h，计算杀灭率。结果发现：臭氧连续杀菌40分钟后酶活为：263U/L。酶活没有损失而杀菌率可达99.9％。此结果表明了：出口浓度为0.98mg/L的臭氧对MnP没有影响，但此浓度仍然保持对细菌的有效杀灭作用。

2非连续采用臭氧控菌的控菌白腐真菌反应器运行

运行条件：白腐真菌反应器的运行温度为30-40度；工作体积约2.2L；曝气采用空气，曝气量为120-160L/h，投加附着生长有白腐真菌的打结丝线载体的数量为：150-200个/L。

臭氧作用反应器的运行温度为20-25度；HRT为20和40分钟，有效条件为0.2升。臭氧浓度为0.98mg/L(气态中的臭氧浓度)，将此浓度的臭氧通入到200ml的处理液中。

运行方式：白腐真菌反应器连续运行，在前6天不采用臭氧对杂菌进行控制，考察杂菌的生长情况；然后加入臭氧对污染的杂菌进行控制，待污染的杂菌被控制后，再停止臭氧控菌，观察杂菌的生长。

结果表明：在不采用臭氧对污染的杂菌进行控制的情况下，白腐真菌反应器中杂菌的生长非常迅速，在运行一天后杂菌的数量就达到1×10⁵CFU/毫升，在运行6天后，杂菌的数量在1×10⁷-1×10⁸CFU/ml之间整个反应器呈混浊状态。

在运行的第6天开始采用臭氧对污染的杂菌进行控制，污染杂菌的数量开始明显下降。通过一天的控制杂菌的数量由1×10⁷CFU/ml下降到1×10⁴CFU/ml；经过2天的控制，污染杂菌的数量降低至1×10⁴CFU/ml，达到稳定的水平，在其后4天的运行中污染杂菌的数量没有发生较大的波动，基本控制在1×10⁴CFU/ml左右。

在对污染杂菌被控制到稳定水平后，去掉臭氧的作用，污染的杂菌又迅速繁殖，一天后数量增加至1×10⁷CFU/ml左右。

以上的结果表明：在白腐真菌反应器中，如果不对污染的杂菌进行控制，污染的杂菌生长是非常迅速的。另外，臭氧对污染杂菌的控制是非常有效、迅速的。

3控菌白腐真菌反应器的连续运行

运行条件：白腐真菌反应器的运行温度为30-40度；工作体积约2.2L；曝气采用空气，曝气量为120-160L/h，投加的载体量为：400个。

培养基参考配方：葡萄糖：250mg/h.L；酒石酸胺：0.6mg/h.L；磷酸二氢钾25mg/h.L；硫酸镁：6.25mg/h.L；氯化钙：1.25mg/h.L；硫酸锰2.2mg/h.L；维生素B1：0.013mg/h.L；采用乙酸-乙酸钠缓冲液将pH值调至4.5。

臭氧作用反应器的运行温度为20-25度；HRT为20和40分钟，有效条件为0.2升。臭氧浓度为0.98mg/L(气态中的臭氧浓度)，将此浓度的臭氧通入到0.2升的处理液中。

运行方式：白腐真菌反应器连续运行且连续采用臭氧对污染杂菌的控制

结果表明：1连续的臭氧对污染杂菌的控制在运行2天后达到稳定，污染杂菌的数量基本控制在1×10⁵CFU/ml以下。在白腐真菌反应器运行期间，反应器始终处于较清澈的状态，没有出现混浊的情况。

2在此条件下，白腐真菌能连续生产目标酶-锰过氧化物酶(MnP)。

3在反应器运行期间，白腐真菌的生长始终维持。

Claims

1. 一种可控制杂菌污染的白腐真菌反应器，其特征在于：

依次包括气泵(1)连接白腐真菌反应器(2)，臭氧作用的反应器(8)通过泵II(4)连接白腐真菌反应器(2)，臭氧发生装置(6)连接臭氧作用的反应器(8)；培养基容器(5)通过泵I(3)连接白腐真菌反应器(2)，在白腐真菌反应器(2)上方设有出水口(7)。

2. 应用权利要求1可控制杂菌污染的白腐真菌反应器的控制方法，其特征在于，包括以下步骤：

将白腐真菌固定于打结棉线载体上并投入白腐真菌反应器(2)，通过气泵(1)曝气使附着白腐真菌的载体处于流化状态，使大部分污染的杂菌易于与白腐真菌分离；培养基通过泵I(3)投放至白腐真菌反应器(2)中；

然后，通过泵II(4)将含有污染杂菌的处理液回流到臭氧作用的反应器(8)中利用臭氧的杀菌能力对回流液中的杂菌进行杀灭，经过臭氧杀菌后，将臭氧作用反应器(8)中的处理液流回白腐真菌反应器(2)中；

运行条件：白腐真菌反应器(2)的运行温度为30-40度，工作体积与臭氧作用体积之比为11∶1；曝气采用空气，曝气量为120-160L/h，投加附着生长有白腐真菌的打结丝线载体的数量为：150-200个/L；

臭氧作用的反应器(8)的运行温度为20-25度；水力停留时间为10-40分钟，有效体积与白腐真菌反应器(2)的体积之比为1∶11；臭氧浓度0.98mg/L，将此浓度的臭氧作用于臭氧作用的反应器(8)中的处理液。