ES2928358T3 - Lípidos catiónicos para el suministro de ácidos nucleicos y preparación de los mismos - Google Patents

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Abstract

La presente invención proporciona lípidos catiónicos y formulaciones de nanopartículas de lípidos que comprenden estos lípidos, solos o en combinación con otros lípidos. Estas nanopartículas lipídicas pueden formularse con ácidos nucleicos para facilitar su administración intracelular tanto in vitro como para aplicaciones terapéuticas. La presente invención también proporciona métodos de síntesis química de estos lípidos, preparación de nanopartículas lipídicas y formulación con ácidos nucleicos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos catiónicos para el suministro de ácidos nucleicos y preparación de los mismos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
[0001] La presente invención proporciona lípidos catiónicos y formulaciones de nanopartículas lipídicas que comprenden estos lípidos, solos o en combinación con otros lípidos. Estas nanopartículas de lípidos se pueden formular con ácidos nucleicos para facilitar su administración intracelular tanto in vitro como para aplicaciones terapéuticas in vivo.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
[0002] Los ácidos nucleicos terapéuticos que incluyen ARN pequeño de interferencia (siARN), micro ARN (miARN), oligonucleótidos antisentido, ARN mensajero (ARNm), ribozimas, pADN y ácidos nucleicos inmunoestimulantes actúan a través de una variedad de mecanismos. Las proteínas específicas pueden ser reguladas a la baja por siARN o miARN a través de interferencia de ARN (ARNi). Las células hematopoyéticas, como los leucocitos en general y los linfocitos T primarios y las células B en particular, son notoriamente difíciles de transfectar con ARN de interferencia pequeños (siARN). La modulación de la función de las células inmunitarias, como las células T y las células B, mediante la regulación a la baja de genes específicos mediante el uso de ARN de interferencia (ARNi), tiene un enorme potencial para avanzar en las terapias dirigidas en muchos trastornos relacionados con la inmunidad, como el cáncer, la inflamación, la autoinmunidad y las infecciones virales. Las aplicaciones terapéuticas de ARNi son extremadamente amplias, ya que las construcciones de siARN y miARN se pueden sintetizar con cualquier secuencia de nucleótidos dirigida contra una proteína diana. Hasta la fecha, las construcciones de siARN han demostrado la capacidad de silenciar especialmente las proteínas diana tanto en modelos in vitro como in vivo. Actualmente se están evaluando en estudios clínicos.
[0003] El ARN mensajero (ARNm) es la familia de grandes moléculas de ARN que transportan la información genética desde el ADN hasta el ribosoma. Algunos ácidos nucleicos, como ARNm o plásmidos, pueden usarse para efectuar la expresión de productos celulares específicos. Dichos ácidos nucleicos serían útiles en el tratamiento de enfermedades relacionadas con la deficiencia de una proteína o enzima. Sin embargo, muchos problemas asociados con los ácidos nucleicos en contextos terapéuticos. Uno de los principales problemas con los ácidos nucleicos terapéuticos es la estabilidad del enlace fosfodiéster entre nucleótidos y su susceptibilidad a las nucleasas. Aparte de eso, estos ácidos nucleicos tienen una capacidad limitada para atravesar la membrana celular.
[0004] Los lípidos catiónicos han demostrado ser excelentes portadores de ácidos nucleicos para tratar diversas enfermedades en aplicaciones de terapia génica. Nanopartículas lipídicas formadas a partir de lípidos catiónicos y otros co-lípidos como colesterol, DSPC y lípidos PEGilados encapsulados en oligonucleótidos que los protegen de la degradación y facilitan la captación celular.
[0005] El documento EP2871178 A1 se refiere a un lípido catiónico que facilita la introducción de un ácido nucleico, por ejemplo, una célula o similar y una composición que lo contiene. El documento WO2015199952 A1 se relaciona con lípidos catiónicos que se pueden usar en combinación con otros componentes lipídicos, como lípidos neutros, colesterol y lípidos conjugados con polímeros, para formar nanopartículas lipídicas con oligonucleótidos, para facilitar la administración intracelular de ácidos nucleicos terapéuticos (p. ej., oligonucleótidos, ARN mensajero) tanto in vitro como in vivo. El documento WO2010054401 A1 se refiere a lípidos catiónicos y partículas lipídicas que comprenden estos lípidos que son ventajosos para el suministro in vivo de ácidos nucleicos, así como composiciones de partículas lipídicas de ácido nucleico adecuadas para uso terapéutico in vivo.
[0006] No obstante, sigue existiendo la necesidad en la técnica de plataformas de administración adecuadas y eficientes para la administración de oligonucleótidos.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
[0007] La presente invención se refiere a nuevos lípidos catiónicos que pueden usarse en la preparación de nanopartículas lipídicas. Estas nanopartículas lipídicas protegen a los ácidos nucleicos de la degradación, la eliminación de la circulación y la liberación intracelular. Además, las nanopartículas lipídicas encapsuladas en ácido nucleico son ventajosamente bien toleradas y proporcionan un índice terapéutico adecuado, de modo que el tratamiento del paciente con una dosis eficaz del ácido nucleico no está asociado con una toxicidad y/o un riesgo inaceptables para el paciente. La presente divulgación también describe métodos de síntesis química de estos lípidos, preparación de nanopartículas lipídicas y formulaciones con ácidos nucleicos, que no forman parte de la invención.
[0008] En algunas formas de realización, la presente invención se refiere a nuevos lípidos catiónicos y formulaciones de tales lípidos con siARN y pADN. Estas nanopartículas lipídicas (NPL) se caracterizaron aún más mediante DLS y se evaluó su actividad in vitro en varias líneas de células cancerosas.
[0009] Según los principios de la presente invención, las estructuras de los lípidos se basan en grupos funcionales tales como hidrazina, hidrazida o hidroxilamina enlazados, directamente o a través de un enlazador, a un residuo de ácido graso R-C(=O)-, R-C(=O)-O o R- donde RCOOH es el ácido graso correspondiente que puede ser saturado o insaturado. Los lípidos también contienen un grupo principal funcional, por ejemplo, una amina, un heterociclo o heteroarilo que contiene N, o una cadena lateral de un aminoácido (p. ej., cadenas laterales de histidina o arginina), que está unida a través de un conector, por ejemplo, una cadena de alquileno. En algunas formas de realización, los lípidos presentan una estructura asimétrica y una carga mejorada, por lo que se plantea la hipótesis de que tales lípidos mostrarán una unión mejorada y mejorarán el escape endosomal (es decir, una estabilidad mejorada) debido al desequilibrio estructural. Otros lípidos según la invención tienen estructuras simétricas como se describe más adelante en este documento.
[0010] El lípido catiónico puede comprender dos residuos de ácido graso unidos simétrica o asimétricamente al grupo funcional mencionado anteriormente.
[0011] En un aspecto de la presente invención, el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (I):
Figure imgf000003_0001
en la que
Y es O o NH;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) alquilo C10-C22;
(b) alquenilo C10-C22;
(c) alquinilo C10-C22;
(d) alquilen C4-C10-Z-alquilo C4-C22; y
(e) alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22;
Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0012] En algunas formas de realización, el compuesto de fórmula (I) comprende un grupo funcional seleccionado de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida, etanolamina y etilendiamina. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0013] En algunas formas de realización de fórmula (I), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (I), p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), p es 1. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 0 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 1 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), z es 2. En otras formas de realización de fórmula (I), T es C. En otras formas de realización de fórmula (I), W es un enlace. En otras formas de realización de fórmula (I), R1 es NR4R5.
[0014] En algunas formas de realización representativas de fórmula (I), p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (Ia). En algunas formas de realización representativas de fórmula (Ia), R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (Ia-1). Las estructuras de las fórmulas (Ia) y (Ia-1) se representan en la descripción detallada a continuación.
[0015] En otro aspecto de la presente invención, el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (II):
Figure imgf000004_0001
en la que
A es
Figure imgf000004_0002
X' es O o NH;
Y' es O o NH;
con la condición de que cuando A es
Figure imgf000004_0003
X' e Y' no pueden ser simultáneamente O;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) alquilo C10-C22;
(b) alquenilo C10-C22;
(c) alquinilo C10-C22;
(d) alquilen C4-C io-Z-alquilo C4-C22; y
(e) alquileno C4-C io-Z-alquenilo C4-C22;
Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0016] En algunas formas de realización, el compuesto de fórmula (II) comprende un grupo funcional seleccionado de hidrazina, hidroxilamina, hidrazida, etanolamina y etilendiamina. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0017] En algunas formas de realización de fórmula (II), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (II), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (II), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (II), m es 1 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (II), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (II), z es 2. En otras formas de realización de fórmula (II), T es C. En otras formas de realización formas de realización de fórmula (II), W es un enlace. En algunas formas de realización de fórmula (II), m es 0 y W es O.
[0018] En algunas formas de realización representativas de fórmula (II), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa). En algunas formas de realización representativas de fórmula (IIa), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa-1). En otras formas de realización representativas de fórmula (IIa), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa-2). En otras formas de realización representativas de fórmula (IIa), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa-3). En otras formas de realización representativas de fórmula (IIa), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa-4). En otras formas de realización representativas de fórmula (II), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIb). En algunas formas de realización representativas de fórmula (IIb), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIb-1).
[0019] Las estructuras de las fórmulas (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1) se representan en la descripción detallada a continuación.
[0020] Ejemplos específicos de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia-1), (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1) son compuestos 1-66, cuyas estructuras se representan en la Tabla 1 en la Descripción Detallada. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0021] Un intermedio de fórmula (IIa-5), que puede usarse para preparar un compuesto de fórmula (IIa-4), representa una forma de realización separada de la invención.
[0022] En otro aspecto, el lípido catiónico de la presente invención está representado por la estructura de fórmula (III):
Figure imgf000005_0001
en la que
X e Y son cada uno independientemente O, N o NH, en la que X e Y no pueden ser simultáneamente O; cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y
n es un número entero entre 1 y 30;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0023] En otro aspecto, el lípido catiónico de la presente invención está representado por la estructura de fórmula (IIIA):
Figure imgf000006_0001
donde
X e Y son cada uno independientemente O, N o NH, donde X e Y no pueden ser ambos simultáneamente O; cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22;
n es un número entero entre 1 y 30; y
x es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0024] Los ejemplos específicos de los compuestos de fórmula (III) son los compuestos 67-70, cuyas estructuras se representan en la Tabla 2 de la Descripción Detallada. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0025] En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición que comprende el lípido catiónico de cualquiera de las fórmulas (I), (la), (Ia-1), (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb), (IIb-1) y (III), y que comprende además al menos un lípido adicional neutro o modificado con PEG. En algunas formas de realización, la composición puede comprender además un ácido nucleico. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen, entre otros, ARN de interferencia pequeño (siARN), microARN (miARN), oligonucleótidos antisentido, ARN mensajero (ARNm), ribozimas, ADNp, ARNm de CRISPR, ARNg y ácidos nucleicos inmunoestimulantes. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0026] En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición para usar en un método de silenciamiento génico, comprendiendo el método la etapa de poner en contacto una célula con una composición según la presente invención. En algunas formas de realización, la célula es una célula cancerosa.
[0027] En otras formas de realización, las composiciones de la presente invención se pueden usar como un sistema de suministro para administrar un agente terapéutico en su ubicación objetivo en el cuerpo. Por tanto, la presente descripción también se refiere a un método para administrar un agente terapéutico, mediante la preparación de una composición que comprende un lípido catiónico como se describe en el presente documento y un agente terapéutico, y la administración de la combinación a un sujeto que lo necesita, sin que el método forme parte de la invención.
[0028] Los lípidos catiónicos de la presente invención se pueden usar solos o en combinación con otros componentes lipídicos tales como lípidos neutros, lípidos cargados, esteroides (incluidos, por ejemplo, esteroles) y/o sus análogos y/o lípidos conjugados con polímeros para formar nanopartículas lipídicas para la administración de agentes terapéuticos. En algunos casos, las nanopartículas de lípidos se utilizan para administrar ácidos nucleicos para el tratamiento de diversas enfermedades o afecciones, en particular, afecciones asociadas con leucocitos, como inflamación y/o falta de proteína suficiente.
[0029] La presente invención se refiere a una composición para uso en un método para tratar una afección asociada con leucocitos, comprendiendo el método la etapa de administrar a un sujeto que lo necesita una composición según la presente invención. La condición asociada con los leucocitos se puede seleccionar del grupo que consiste en cáncer, infección, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas e inflamación.
[0030] Debe entenderse que la Descripción Detallada y los ejemplos específicos, si bien indican formas de realización preferidas de la invención, se proporcionan únicamente a modo de ilustración, ya que los expertos en la técnica apreciarán diversos cambios y modificaciones a partir de esta Descripción Detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0031]
Figura 1: Efecto de silenciamiento génico in vitro del lípido 1: Se trataron células T humanas SupTI con nanopartículas lipídicas (NPL) que comprenden lípido catiónico 1 encapsulado siCD45 durante 48 horas (A) o 72 horas (B) a diferentes dosis de siARN (0,4 jiM, 0,2 jiM, 0,1 jiM).
Figura 2: Las células de carcinoma de ovario humano (NAR) resistentes a los medicamentos se trataron con nanopartículas NPL-siPLK-1 o NPL-siLuc durante 72 horas y la expresión de PLK-1 se midió mediante qPCR. Figura 3: Efecto de silenciamiento génico in vitro del lípido 1 en células NAR: Se trataron células de cáncer de ovario humano (células NAR) con nanopartículas de lípido1/siPLK1 durante 48 horas a diferentes concentraciones de siARN (0,2 jiM y 0,1 jiM). Las células apoptóticas se analizaron mediante FACS usando PI/Anexina.
Figura 4: Efecto de silenciamiento génico in vitro de los lípidos 10 y 11 en células NAR: Se trataron células de cáncer de ovario humano (células NAR) con nanopartículas de lipid1/siPLK1 durante 48 h a diferentes concentraciones de siARN (0,1 jiM y 0,05 jiM). Las células apoptóticas se analizaron mediante FACS usando PI/Anexina.
Figura 5: Se trataron células de carcinoma de ovario humano (OVCAR 8) con nanopartículas NPL-siPLK-1 o NPL-siLuc durante 72 h y se midió la expresión de PLK-1 mediante qPCR.
Figura 6: Se trataron esferoides de células de carcinoma de ovario humano (NAR) resistentes a fármacos con nanopartículas NPL-siPLK-1 o NPL-siLuc durante 72 h y se midió la expresión de PLK-1 mediante qPCR. Figura 7: Se incubaron células de carcinoma de colon humano (HCT116) con NPL (que comprenden MC3, lípidos 38 o lípidos 55) con siARN de ctl durante 72 horas. La viabilidad celular se midió mediante ensayo XTT. La Figura 10 muestra la proliferación celular (% de células no tratadas) frente a la concentración de siPLK1. Figura 8: Efectos de silenciamiento génico in vitro de los lípidos 38 o 55. Se incubaron células en suspensión de mieloma múltiple humano (U266) con NPL que contenían siPLK1 a diferentes concentraciones durante 48 horas. La expresión de PLK1 se midió por qPCR. Los niveles de ARNm de PLK1 se normalizaron a las células tratadas con siARN de LNPs-ctl.
Figura 9: Efecto del silenciamiento de PLK1 sobre la viabilidad celular. Se incubaron células en suspensión de mieloma múltiple humano (U266) con NPL que comprendían lípidos catiónicos 38 o 55 y siPLKlor ctl-siARN a diferentes concentraciones durante 48 horas. La viabilidad celular inducida por la regulación negativa de PLK1 se midió mediante el ensayo XTT.
Figura 10: Efecto del silenciamiento de PLK1 sobre la viabilidad celular; se incubaron células en suspensión de linfoma de células B humanas (RPMI-8226) con NPL que comprendían lípidos catiónicos 38 o 55 y siPLKl o ctlsiARN a diferentes concentraciones durante 48 horas. La viabilidad celular inducida por la regulación negativa de PLK1 se midió mediante el ensayo XTT.
Figura 11: Efecto del silenciamiento de PLK1 sobre la viabilidad celular. Se incubaron células en suspensión de mieloma múltiple humano (MM1) con NPL que comprendían lípidos catiónicos 38 o 55 y siPLKl o ctl-siARN a diferentes concentraciones durante 48 horas. La viabilidad celular inducida por la regulación negativa de PLK1 se midió mediante el ensayo XTT.
Figura 12: Expresión in vitro de pADN. Se incubaron células de carcinoma de colon humano (HCT 116) con ADNp de LNPs-LUC a diferentes concentraciones durante 48 horas. La expresión de luciferasa se midió con un luminómetro. Se usó Lipofectamine 2000 (Lipo 2000) como control positivo. Los NPL se formularon con lípido 38 y diferentes cantidades de DOPE, junto con otros colípidos Chol y Pe G-DMG.
Figura 13: Las células HEK 293 se trataron con nanopartículas de ADN-NPL (relación N/P 10:1, ADN 0,6 nM) durante 72 horas y la expresión de mKATE se analizó mediante citometría de flujo.
Figura 14: Las células HEK 293 se trataron con nanopartículas de ADN-NPL (proporción N/P 10:1) en ADN diferente durante 72 horas y la expresión de mKATE se analizó mediante citometría de flujo. Figura 14A: Lípido 1. Figura 14B: Lípido 10.
Figura 15: Suministro in vitro de ARNm. Se trataron células de macrófagos murinos difíciles de transfectar (RAW 264.7) con NPL que contenían lípidos catiónicos 38 o 54 y ARNm de luciferasa durante 18 horas a diferentes concentraciones de ARNm. La expresión de luciferasa se midió con un luminómetro.
Figura 16: Entrega in vivo de ARNm. Se administraron NPL que contenían lípidos catiónicos 38 o 54 ARNm de luciferasa por vía intramuscular a ratones C57BL6/j a 1 mg/kg de peso corporal. La expresión de luciferasa se midió mediante el sistema de formación de imágenes por bioluminiscencia Biospace: (A) después de 8 horas de administración i.m.; y (B) después de 24 horas.
Figura 17: Los NPL compuestos por el lípido 54 o el lípido 38 formulados con ARNm de luciferasa se administraron por vía intravenosa a ratones C57BL6/j a 1 mg/kg de peso corporal. Después de 8 h, se midió la expresión de luciferasa mediante el sistema de formación de imágenes por bioluminiscencia Biospace.
Figura 18: Suministro in vivo de ARNm al hígado. Los NPL compuestos por lípido 38 formulados con ARNm de luciferasa se administraron por vía intravenosa en ratones C57BL6/j a 1 mg/kg de peso corporal. Después de 8 horas y 24 horas de administración, la expresión de luciferasa se midió mediante el sistema de imágenes por bioluminiscencia Biospace.
Figura 19: Sin toxicidad hepática en primates no humanos en comparación con MC3. Monos Cynomolgus (n = 2 por grupo, machos) recibieron una única administración i.v. (1 ml/kg) de (0,5 mg/kg) de partículas MC3 con siNC5 y partículas basadas en lípidos 38 con siNC5 (0,5 mg/kg). A las 1 y 24 horas después de la administración, se recogió suero y se analizó para determinar ALT, AST. Cada punto de datos es un promedio de 2 animales ± SEM.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA PRESENTE INVENCIÓN
[0032] La presente invención se basa en el descubrimiento de lípidos catiónicos útiles en la preparación de nanopartículas lipídicas para administrar agentes activos in vitro e in vivo. Los lípidos catiónicos de la presente invención son útiles en el suministro de ácidos nucleicos tales como siARN, miARN y ARNm, etc.
Lípidos Catiónicos
[0033] En alguna forma de realización, la presente invención se refiere a un lípido catiónico que comprende un resto de hidrazina, hidrazina, hidroxilamina, etanolamina o dietilendiamina unido a al menos un resto de ácido graso saturado o insaturado. En algunas formas de realización, el lípido catiónico comprende dos residuos de ácido graso unidos asimétricamente al resto hidrazina, hidrazina, hidroxilamina, etanolamina o dietilendiamina.
[0034] El lípido catiónico puede comprender dos residuos de ácido graso unidos simétrica o asimétricamente al grupo funcional mencionado anteriormente.
[0035] En un aspecto de la presente invención, X es N, y el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (I):
Figure imgf000008_0001
en la que
Y es O o NH;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) alquilo C10-C22;
(b) alquenilo C10-C22;
(c) alquinilo C10-C22;
(d) alquilen C4-C10-Z-alquilo C4-C22; y
(e) alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22;
Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0036] En algunas formas de realización de fórmula (I), R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en: (a) un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un C10-C22 alquinilo; y (b) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0037] En algunas formas de realización de fórmula (I), R1 es NR4R5. En algunas formas de realización de fórmula (I), R1 es la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural. En algunas formas de realización de fórmula (I), R1 es un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S.
[0038] En algunas formas de realización, el compuesto de fórmula (I) comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste en hidrazina, hidroxilamina, hidrazida, etanolamina y etilendiamina. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0039] En algunas formas de realización de fórmula (I), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (I), p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), p es 1. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 0 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 1 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), z es 2. En otras formas de realización de fórmula (I), T es C. En otras formas de realización de fórmula (I), W es un enlace.
[0040] En algunas formas de realización representativas de fórmula (I), p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (Ia):
Figure imgf000009_0001
en la que R1, R2, R3, Y, m, n y z son como se definen en la fórmula (I).
[0041] En algunas formas de realización de fórmula (Ia), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (Ia), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (I), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (Ia), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C14-C20 o un alquenilo C14-C20. En otras formas de realización de fórmula (Ia), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10-Z-C4-alquilo C22 en donde Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-. En otras formas de realización, de fórmula (a), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-. En otras formas de realización de fórmula (Ia), Y es O. En otras formas de realización de fórmula (Ia), Y es NH.
[0042] En otras formas de realización representativas de fórmula (I), R1 es NR4R5, y el compuesto es representado por la estructura de fórmula (Ia-1):
Figure imgf000010_0001
en la que R2, R3, R4, R5, Y, m, n y z son como se definen en la fórmula (I).
[0043] En algunas formas de realización de fórmula (Ia-1), R4 y R5 son cada uno CH3. En otras formas de realización de fórmula (Ia-1), R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico seleccionado del grupo que consiste en pirrolidinil piperidininilo y piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con un alquilo. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0044] En otro aspecto de la presente invención, el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (II):
Figure imgf000010_0002
en la que
A es
Figure imgf000010_0003
X' es O o NH;
Y' es O o NH;
con la condición de que cuando A es
Figure imgf000010_0004
X' e Y' no pueden ser ambos O;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) alquilo C10-C22;
(b) alquenilo C10-C22;
(c) alquinilo C10-C22;
(d) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22; y
(e) alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22;
Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0045] En algunas formas de realización de fórmula (II), R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en: (a) un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y (b) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-,-C(=O)-O- o -O-. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0046] En algunas formas de realización de fórmula (II), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (II), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (II), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (II), m es 1 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (II), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (II), z es 2. En otras formas de realización de fórmula (II), T es C. En otras formas de realización formas de realización de fórmula (II), W es un enlace. En algunas formas de realización de fórmula (II), m es 0 y W es O.
[0047] En algunas formas de realización representativas de fórmula (II), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa):
Figure imgf000011_0001
en la que R1, R2, R3, X', T, W, n, m, p y z son como se definen en la fórmula (II).
[0048] En algunas formas de realización de fórmula (IIa) p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-1):
Figure imgf000011_0002
en la que R1, R2, R3, X', n, m y z son como se definen en la fórmula (II).
[0049] En otras formas de realización de fórmula (IIa), R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-2):
Figure imgf000012_0001
donde R2, R3, R4, R5, X', n, m y z son como se definen en la fórmula (II).
[0050] En aún otras formas de realización de fórmula (IIa), p es 1, m es 1, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-3):
Figure imgf000012_0002
en la que R1 es la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
R2, R3, X', n y z son como se definen en la fórmula (II).
[0051] En algunas formas de realización de fórmula (IIa), p es 0, R1 es NR4R5, W es un enlace, m es 0, X' es O y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-4):
Figure imgf000012_0003
[0052] En algunas formas de realización, los compuestos de fórmula (IIa-5) se pueden usar como productos intermedios para preparar compuestos de fórmula (IIa-4):
Figure imgf000012_0004
en la que R2 y R3 son como se definen en la fórmula (IIa-4).
[0053] En otras formas de realización representativas de fórmula (II), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIb):
Figure imgf000013_0001
donde R1, R2, R3, T, W, X', Y' n, m, p y z son como se definen en la fórmula (II).
[0054] En algunas formas de realización representativas de fórmula (IIb), p es 0, W es un enlace, T es C y R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIb-1):
Figure imgf000013_0002
donde R2, R3, R4, R5, X', Y', n, m y z son como se definen en la fórmula (II).
[0055] En algunas formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C14-C20 o un alquenilo C14-C20.
[0056] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-.
[0057] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-.
[0058] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), X' es O.
[0059] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), X' es NH.
[0060] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), Y' es NH.
[0061] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), R4 y R5 son cada uno CH3, o donde R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico seleccionado del grupo que consiste en pirrolidinil piperidinilo y piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con un alquilo.
[0062] Ejemplos específicos de los compuestos de fórmula (I), (Ia), (Ia-1), (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIa-5), (IIb) y (IIb-1) son compuestos 1-66, cuyas estructuras se representan en la Tabla 1 a continuación. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
Tabla 1
Figure imgf000014_0001
(Continuación)
Figure imgf000015_0001
(Continuación)
Figure imgf000016_0001
(Continuación)
Figure imgf000017_0001
(Continuación)
Figure imgf000018_0001
(Continuación)
Figure imgf000019_0001
(Continuación)
Figure imgf000020_0001
(Continuación)
Figure imgf000021_0001
(Continuación)
Figure imgf000022_0001
(Continuación)
Figure imgf000023_0003
[0063] En otro aspecto, el lípido catiónico de la presente invención está representado por la estructura de fórmula (III):
Figure imgf000023_0001
( I I I )
donde
X e Y son cada uno independientemente O, N o NH, donde X e Y no pueden ser ambos O;
cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y
n es un número entero entre 1 y 30;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0064] En otro aspecto, el lípido catiónico de la presente invención está representado por la estructura de fórmula (MIA):
Figure imgf000023_0002
en la que
X e Y son cada uno independientemente O, N o NH, en la que X e Y no pueden ser ambos O;
cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22;
n es un número entero entre 1 y 30; y
x es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0065] En algunas formas de realización de fórmula (III) o (IIIA), X e Y se seleccionan cada uno independientemente del grupo que consiste en O y N. En otras formas de realización de fórmula (III), X e Y se seleccionan cada uno independientemente del grupo grupo que consta de O, N y NH.
[0066] Ejemplos específicos de los compuestos de fórmula (III) son los compuestos 67-70, cuyas estructuras se representan en la Tabla 2.
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0003
donde n es como se define anteriormente para la fórmula (III) o (IIIA).
Formas de realización adicionales de la presente invención
[0067] El lípido catiónico puede comprender dos residuos de ácido graso unidos simétrica o asimétricamente al grupo funcional mencionado anteriormente.
[0068] En un aspecto de la presente invención, el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (I'):
Figure imgf000024_0002
en la que
Y es O o NH;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y
(b) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-o -C(=O)-O;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0069] En algunas formas de realización, el compuesto de fórmula (I') comprende un grupo funcional seleccionado de hidrazina, hidroxilamina e hidrazida. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0070] En algunas formas de realización de fórmula (I'), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (I'), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (I'), p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I'), p es 1. En otras formas de realización de fórmula (I'), m es 0 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I'), m es 1 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (I'), z es 0. En otras formas de realización de la fórmula (I'), z es 2. En otras formas de realización de la fórmula (I'), T es C. En otras formas de realización de la fórmula (I'), W es un vínculo. En otras formas de realización de fórmula (I'), R1 es NR4R5.
[0071] En algunas formas de realización representativas de fórmula (I'), p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (Ia'):
Figure imgf000025_0001
en la que R1, R2, R3, Y, m, n y z son como se definen en la fórmula (I'). En algunas formas de realización de fórmula (Ia'), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (Ia'), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (Ia'), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (Ia')), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C14-C20 o un alquenilo C14-C20. En otras formas de realización de fórmula (Ia'), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10 -Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-o -C(=O)-O-. En otras formas de realización de fórmula (Ia), Y es O. En otras formas de realización de fórmula (Ia'), Y es NH.
[0072] En otras formas de realización representativas de fórmula (I'), R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (Ia-1'):
Figure imgf000026_0001
en la que R2, R3, R4, R5, Y, m, n y z son como se definen en la fórmula (I). En algunas formas de realización de fórmula (Ia-1'), cada uno de R4y R5 es CH3. En otras formas de realización de fórmula (Ia-1'), R4y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico seleccionado de pirrolidinil piperidininilo y piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con un alquilo. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención. En otro aspecto de la presente invención, el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (II'):
Figure imgf000026_0002
donde
A es
Figure imgf000026_0003
X' es O o NH;
Y' es O o NH;
con la condición de que cuando A es
Figure imgf000026_0004
X' e Y' no pueden ser ambos O;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados entre O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y
(b) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)- o -C(=O)-O;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
[0073] En algunas formas de realización, el compuesto de fórmula (II') comprende un grupo funcional seleccionado de hidrazina, hidroxilamina e hidrazida. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0074] En algunas formas de realización de fórmula (II'), m es 0. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (II'), m es 1. En otras formas de realización de fórmula (I), m es 1 y p es 0. En otras formas de realización de fórmula (II'), z es 0. En otras formas de realización de fórmula (II'), z es 2. En otras formas de realización de fórmula (II'), T es C. En otras formas de realización de fórmula (II'), W es un enlace.
[0075] En algunas formas de realización representativas de fórmula (II'), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIa)':
Figure imgf000027_0001
en la que R1, R2, R3, X', T, W, n, m, p y z son como se definen en la fórmula (II').
[0076] En algunas formas de realización de fórmula (IIa') p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-1'):
Figure imgf000027_0002
en la que R1, R2, R3, X', n, m y z son como se definen en la fórmula (II').
[0077] En otras formas de realización de fórmula (IIa'), R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-2'):
Figure imgf000028_0001
en la que R2, R3, R4, R5, X', n, m y z son como se definen en la fórmula (II').
[0078] En otras formas de realización más de fórmula (IIa'), p es 1, m es 1, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-3'):
Figure imgf000028_0002
donde R1 es la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y R1, R2, R3, X', n y z son como se definen en la fórmula (II).
[0079] En otras formas de realización representativas de fórmula (II'), el lípido catiónico está representado por la estructura de fórmula (IIb'):
Figure imgf000028_0003
en la que R1, R2, R3, T, W, X', Y' n, m, p y z son como se definen en la fórmula (II').
[0080] En algunas formas de realización representativas de fórmula (IIb'), p es 0, W es un enlace, T es C y R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIb-1 '):
Figure imgf000028_0004
donde R2, R3, R4, R5, X', Y', n, m y z son como se definen en la fórmula (II').
[0081] En algunas formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II'), (IIa'), (IIa-1'), (IIa-2'), (IIa 3'), (IIb') y (IIb-1'), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C14-C20 o un alquenilo C14-C20.
[0082] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II'), (IIa'), (IIa-1'), (IIa-2'), (IIa-3'), (IIb') y (IIb-1'), R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 en donde Z es -O-C(=O)-o -C(=O)-O-.
[0083] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II'), (IIa'), (IIa-1'), (IIa-2'), (IIa-3'), (IIb') y (IIb-1'), X' es O.
[0084] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II'), (IIa'), (IIa-1'), (IIa-2'), (IIa-3'), (IIb') y (IIb-1'), X' es NH.
[0085] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II'), (IIa'), (IIa-1'), (IIa-2'), (IIa-3'), (IIb') y (IIb-1'), Y' es NH.
[0086] En otras formas de realización de los compuestos de cualquiera de las fórmulas (II'), (IIa'), (IIa-1'), (IIa-2'), (IIa-3'), (IIb') y (IIb-1'), R4 y R5 son cada uno CH3, o donde R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico seleccionado de pirrolidinil piperidinilo, piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con un alquilo.
[0087] En otro aspecto, el lípido catiónico de la presente invención está representado por la estructura de fórmula (III'):
Figure imgf000029_0001
donde
X e Y son cada uno independientemente O o N;
cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y
n es de 1a 30;
incluyendo sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereoisómeros y mezclas de los mismos.
Definiciones químicas
[0088] Un grupo "alquilo" se refiere a cualquier hidrocarburo alifático saturado, incluidos los grupos alquilo de cadena lineal y de cadena ramificada. En una forma de realización, el grupo alquilo tiene de 1 a 4 carbonos designados aquí como alquilo C1-C4. En otra forma de realización, el grupo alquilo tiene 10-22 carbonos designados aquí como alquilo C10-C22. En otra forma de realización, el grupo alquilo tiene 4-10 carbonos designados aquí como alquilo C4-C10. En otra forma de realización, el grupo alquilo tiene 4-22 carbonos designados aquí como alquilo C4-C22.
[0089] Un grupo "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que contiene al menos un doble enlace carbonocarbono que incluye grupos alquenilo de cadena lineal, de cadena ramificada y cíclicos. En una forma de realización, el grupo alquenilo tiene 10-22 carbonos designados aquí como alquenilo C10-C22. En otra forma de realización, el grupo alquenilo tiene 4-10 carbonos designados aquí como alquenilo C4-C10. En otra forma de realización, el grupo alquenilo tiene 4-22 carbonos designados aquí como alquenilo C4-C22. Los ejemplos de grupos alquenilo incluyen etenilo, propenilo, n-butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo, heptenilo, octenilo, ciclohexilbutenilo y decenilo.
[0090] Un grupo "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifático que contiene al menos un triple enlace carbonocarbono que incluye cadena lineal y cadena ramificada. En una forma de realización, el grupo alquinilo tiene 10-22 carbonos designados aquí como alquinilo C10-C22. En otra forma de realización, el grupo alquinilo tiene 4-10 carbonos designados aquí como alquinilo C4-C10. En otra forma de realización, el grupo alquinilo tiene 4-22 carbonos designados aquí como alquinilo C4-C22. Los ejemplos de grupos alquinilo incluyen etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, heptinilo, octinilo y decinilo.
[0091] El término "heteroarilo" utilizado aquí solo o como parte de otro grupo se refiere a un sistema heteroaromático que contiene al menos un anillo de heteroátomo en donde el átomo se selecciona de nitrógeno, azufre y oxígeno. El heteroarilo contiene 5 o más átomos en el anillo. El grupo heteroarilo puede ser monocíclico, bicíclico, tricíclico y similares. También se incluyen en esta definición los anillos benzoheterocíclicos. Si el nitrógeno es un átomo anular, la presente invención también contempla los N-óxidos de los heteroarilos que contienen nitrógeno. Los ejemplos no limitantes de restos heteroarilo incluyen tienilo, benzotienilo, 1-naftotienilo, tiantrenilo, furilo, benzofurilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, isoindolilo, indazolilo, purinilo, isoquinolilo, quinolilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinolinilo, pteridinilo, carbolinilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo y similares.
[0092] El término "anillo heterocíclico" o "heterociclilo" usado aquí solo o como parte de otro grupo se refiere a un anillo de cinco miembros a ocho miembros que tienen de 1 a 4 heteroátomos, tales como oxígeno, azufre y/o nitrógeno, en particular nitrógeno, ya sea solo o junto con átomos anulares de azufre u oxígeno. Estos anillos de cinco a ocho miembros pueden ser saturados, completamente insaturados o parcialmente insaturados, prefiriéndose los anillos completamente saturados. Los restos de anillos heterocíclicos preferidos incluyen piperidinilo, pirrolidinilo, piperazinilo, pirrolinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piranilo, tiopiranilo, indolinilo, dihidrofuranilo, tetrahidrofuranilo, dihidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo, dihidropiranilo, tetrahidropiranilo, dihidrotiazolilo y similares. En algunas formas de realización, el grupo cíclico es pirrolidinilo. En otras formas de realización, el grupo heteroarilo o heterociclilo es piperidinilo. En otras formas de realización, el grupo heterociclilo es piperidina.
[0093] Como se usa aquí en la especificación y en la sección de reivindicaciones a continuación, se entiende que el término "aminoácido" o "aminoácidos" incluye los 20 aminoácidos naturales, es decir, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, threonina, triptófano, tirosina y valina. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención. Según otras formas de realización, el término aminoácidos se refiere a aminoácidos no naturales o aminoácidos sintéticos.
[0094] Además, el término "aminoácido" incluye tanto D- como L-aminoácidos. De acuerdo con los principios de la presente invención, el término "cadena lateral de aminoácido" se refiere a un grupo "R" de un aminoácido de fórmula H2NC (R)-COOH.
[0095] El término resto "hidrazina" se refiere al grupo "-NH-NH-".
[0096] El término resto "hidroxilamina", como se usa en el presente documento, se refiere al grupo "-NH-O-".
[0097] El término "hidrazida "resto como se usa aquí se refiere al grupo "-C(=O)-NN"
[0098] El término "resto hidroxilamina" como se usa aquí se refiere al grupo "-O-CH2-CH2-N-" o "-W-CH2-CH2-O-"
[0099] El término resto "etilendiamina", como se usa en el presente documento, se refiere al grupo "-N-CH2-CH2-N-" o "-N-CH2-CH2-N-"
[0100] El término "guanidina" como se usa en el presente documento se refiere al grupo -NHC(=NH)NH2.
[0101] El término "grupo saliente" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier grupo saliente lábil que se reemplaza fácilmente por otro resto. En algunas formas de realización, el grupo saliente se selecciona del grupo que consiste en halógeno, sulfoniloxi y -O-C(O)R', en donde R' es un alquilo, arilo o alquilarilo. En algunas formas de realización preferidas, el grupo saliente se selecciona del grupo que consta de Cl, Br, I, mesilato (OMs), triflato (OTr) y tosilato (OTs). En una forma de realización actualmente preferida, el grupo saliente X es Br. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0102] El término "grupo protector" se refiere a residuos químicos utilizados para bloquear sitios reactivos durante la síntesis química, que permiten que la reacción química se lleve a cabo selectivamente en un sitio de reacción en un compuesto multifuncional, otros sitios reactivos deben bloquearse temporalmente. Los residuos utilizados para bloquear estos sitios reactivos se denominan grupos protectores.
[0103] El término "grupo protector de nitrógeno" o "grupo protector de N" o "grupo protector de amino" como se usa aquí indistintamente se refiere a un grupo fácilmente escindible unido a grupos amino. Los ejemplos de grupos protectores de amino incluyen t-butoxicarbonilo (BOC), benciloxicarbonilo, acetilo, fenilcarbonilo o un grupo sililo, que puede estar sustituido con alquilo (trialquilsililo), con un arilo (triarilsililo) o una combinación de los mismos (p. ej., dialquilfenilsililo), por ejemplo, trimetilsililo (TMS) o t-butildimetilo sililo (TBDMS). Otros ejemplos de grupos protectores de hidroxi incluyen, por ejemplo, alquilo C1-C4 (p. ej., metilo, etilo, propilo, butilo y similares), -CH2Ph (bencilo o bzl), alilo (All), (alilo)-CO-(alquilo C1-C6), -SO2-(alquilo C1-C6), -SO2-arilo, -CO-Ar en donde Ar es un grupo arilo como se ha definido anteriormente, y -CO-(alquilo C1-C6)Ar (p. ej., un grupo carboxibencilo (Bz)). Otros ejemplos de grupos protectores de hidroxi incluyen grupos protectores sensibles a ácidos tales como tetrahidropiranilo (THP), metoximetilo (MOM), trifenilmetilo (Tritilo) y dimetoxitritilo (DMT). Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención. Los grupos protectores pueden eliminarse aplicando agentes desprotectores como se conoce en la técnica. Los métodos de incorporación y desprotección están descritos por CB Reese y E. Haslam, "Protective Groups in Organic Chemistry", JGW McOmie, Ed., Plenum Press, Nueva York, NY, 1973, capítulos 3 y 4, respectivamente, y TW Greene y PGM Wuts, "Protective Groups in OrganicSynthesis", 2a ed., John Wiley and Sons, Nueva York, NY, 1991 y AJ Pearson y WR Roush, Activating Agents and Protecting Groups, John Wiley and Sons (1999). De acuerdo con algunas formas de realización, las sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales de adición de "ácido" y "base", que conservan la eficacia biológica del ácido o la base.
[0104] Uno o más de los lípidos catiónicos de la invención pueden estar presentes como una sal. El término "sal" abarca sales de adición tanto básicas como ácidas, incluidas, entre otras, sales de carboxilato o sales con nitrógenos amínicos, e incluye sales formadas con los aniones y cationes orgánicos e inorgánicos que se analizan a continuación. Además, el término incluye sales que se forman por reacciones ácido-base estándar con grupos básicos (como grupos amino) y ácidos orgánicos o inorgánicos. Dichos ácidos incluyen clorhídrico, fluorhídrico, trifluoroacético, sulfúrico, fosfórico, acético, succínico, cítrico, láctico, maleico, fumárico, palmítico, cólico, pamoico, mucico, D-glutámico, D-canfórico, glutárico, ftálico, tartárico, láurico, esteárico., salicílico, metanosulfónico, bencenosulfónico, sórbico, pícrico, benzoico, cinámico y ácidos similares. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la invención.
[0105] El término "catión orgánico o inorgánico" se refiere a contraiones para el anión de una sal. Los contraiones incluyen, pero no se limitan a metales alcalinos y alcalinotérreos (tales como litio, sodio, potasio, bario, aluminio y calcio); amonio y mono-, di-y tri-alquilaminas tales como trimetilamina, ciclohexilamina; y los cationes orgánicos, tales como dibencilamonio, bencilamonio, 2-hidroxietilamonio, bis(2-hidroxietil)amonio, feniletilbencilamonio, dibencitiletilendiamonio y cationes similares. Véase, por ejemplo, Berge et al., J. Pharm. ciencia (1977), 66:1-19.
Composiciones y usos terapéuticos
[0106] En algunos aspectos, la presente invención proporciona una composición que comprende un lípido catiónico según cualquiera de las fórmulas (I), (la), (Ia-1), (II), (IIa), (IIa-1), (IIa-2), (IIa-3), (IIa-4), (IIb) y (IIb-1), por ejemplo, cualquiera de los compuestos 1 a 66, y un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición puede comprender además comprender al menos un lípido adicional neutro o modificado con PEG.
[0107] En algunas formas de realización, la composición puede comprender además un ácido nucleico. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen ARN pequeño de interferencia (siARN), microARN (miARN), oligonucleótidos antisentido, ARN mensajero (ARNm), ribozimas, ADNp, ARNm CRISPR, ARNg y ácidos nucleicos inmunoestimulantes. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0108] En algunas formas de realización, la presente invención proporciona una composición para usar en un método de silenciamiento génico, que comprende el paso de poner en contacto una célula con una composición que comprende un lípido catiónico de la presente invención. En algunas formas de realización, la célula es una célula cancerosa.
[0109] En otras formas de realización, la composición comprende además uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en un lípido neutro, un lípido cargado, un esteroide y un lípido conjugado con polímero. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0110] Las composiciones de la presente invención se pueden usar como un sistema de administración para administrar un agente terapéutico en su ubicación objetivo en el cuerpo. Por tanto, la presente descripción se refiere a un método para administrar un agente terapéutico, mediante la preparación de una composición que comprende un lípido catiónico como se describe en el presente documento y un agente terapéutico, y la administración de la combinación a un sujeto que lo necesita, sin que el método forme parte de la invención.
[0111] En formas de realización particulares, la presente invención proporciona nuevos lípidos catiónicos que permiten la formulación de composiciones mejoradas para el suministro in vitro e in vivo de IVT-ARNm y/u otros oligonucleótidos.
[0112] En algunas formas de realización, estas composiciones de nanopartículas lipídicas son útiles para la expresión de proteína codificada por ARNm.
[0113] En otras formas de realización, estas composiciones de nanopartículas lipídicas mejoradas son útiles para la regulación positiva de la expresión de proteínas endógenas mediante la administración de inhibidores de miARN dirigidos a un miARN específico o un grupo de miARN que regulan un ARNm diana o varios ARNm.
[0114] En otras formas de realización, estas composiciones de nanopartículas lipídicas mejoradas son útiles para regular a la baja (p. ej., silenciar) los niveles de proteína y/o los niveles de ARNm de los genes diana.
[0115] En algunas otras formas de realización, las nanopartículas lipídicas también son útiles para el suministro de ARNm y plásmidos para la expresión de transgenes.
[0116] En aún otras formas de realización, las composiciones de nanopartículas lipídicas son útiles para inducir un efecto farmacológico resultante de la expresión de una proteína, p. ej., aumento de la producción de glóbulos rojos a través de la entrega de un ARNm de eritropoyetina adecuado, o protección contra infecciones mediante la entrega de ARNm que codifica un anticuerpo adecuado ARNm que codifica para un anticuerpo adecuado.
[0117] El lípido catiónico puede estar en forma de nanopartículas y administrarse tal cual. Las nanopartículas pueden administrarse en una solución. Las nanopartículas pueden formularse en una composición farmacéutica adecuada para ser administrada por cualquier vía de administración deseada. Ejemplos de rutas de administración incluyen rutas tales como, pero no limitadas a: tópica, oral o parenteral. Dependiendo del modo de administración pretendido, las composiciones utilizadas pueden estar en forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas o líquidas, tales como, por ejemplo, tabletas, supositorios, píldoras, cápsulas, polvos, líquidos, suspensiones o similares, preferiblemente en formas de dosificación unitaria adecuadas para la administración única de dosificaciones precisas. Las composiciones farmacéuticas pueden incluir partículas catiónicas, un excipiente farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmacéuticos, vehículos, adyuvantes y similares. Se prefiere que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que sea inerte al ácido nucleico encapsulado dentro de las partículas y que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad bajo las condiciones de uso. La administración también puede estar localizada. La administración puede ser además sistémica.
[0118] En algunas formas de realización, las formulaciones inyectables para administración parenteral se pueden preparar como soluciones o suspensiones líquidas, formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección, o como emulsiones. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares. Además, si se desea, las composiciones farmacéuticas a administrar también pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tamponadores del pH y similares, como por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, y similares. Las suspensiones inyectables acuosas también pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, incluidos, por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores. Las formulaciones parenterales pueden estar presentes en envases sellados de dosis unitaria o dosis múltiples, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condición liofilizada (liofilizada) que requiere solo la adición del vehículo líquido estéril, como, por ejemplo, agua, para inyecciones inmediatamente antes de su uso. En algunas formas de realización, la administración parenteral incluye la administración intravenosa.
[0119] En otras formas de realización, para la administración oral, se puede formar una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable mediante la incorporación de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica., talco, celulosa, croscarmelosa de sodio, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Tales composiciones incluyen soluciones, suspensiones, tabletas, tabletas dispersables, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida y similares. Las formulaciones adecuadas para la administración oral pueden consistir en soluciones líquidas tales como cantidades efectivas de los compuestos disueltos en diluyentes tales como agua, solución salina o jugo de naranja; bolsitas, pastillas y trociscos, cada uno de los cuales contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo en forma de sólidos o gránulos; polvos, suspensiones en un líquido apropiado; y emulsiones adecuadas. Las formulaciones líquidas pueden incluir diluyentes tales como agua y alcoholes (tales como, por ejemplo, etanol, alcohol bencílico y polietilenalcoholes), con o sin la adición de un tensioactivo farmacéuticamente aceptable, agentes de suspensión o agentes emulsionantes.
[0120] Al determinar las dosis de las partículas a administrar, la dosis y la frecuencia de administración seleccionarse en relación con las propiedades farmacológicas de los ácidos nucleicos específicos encapsulados dentro de las partículas.
[0121] En algunas formas de realización representativas, una partícula que comprende un ácido nucleico, como, por ejemplo, siARN, miARN, shARN, ARN anti-sentido y similares, puede usarse en el tratamiento de diversas afecciones asociadas con leucocitos, según sobre la identidad del ácido nucleico, el leucocito diana específico y similares. En algunas formas de realización, el ácido nucleico encapsulado dentro de las partículas puede ser un ácido nucleico capaz de inducir el silenciamiento de un gen diana. En algunas formas de realización, el gen diana puede ser cualquier gen, cuya expresión esté relacionada con la afección a tratar. En algunas formas de realización, el gen diana puede ser un gen seleccionado de, entre otros: factores de crecimiento (como EGFR, PDGFR), genes relacionados con vías de angiogénesis (como VEGF, integrinas), genes implicados en vías de señalización intracelular y regulación del ciclo celular (como PI3K/AKT/mTOR, Ras/Raf/MAPK, PDK1, CHK1, PLK1, ciclinas). En algunas formas de realización, se puede encapsular dentro de las partículas una combinación de ácidos nucleicos, cada uno de los cuales tiene una o más dianas.
[0122] De acuerdo con algunas formas de realización, las condiciones asociadas a los leucocitos de ejemplo que pueden ser tratadas por las partículas dirigidas pueden seleccionarse entre, pero sin limitarse a: varios tipos de cáncer, diversas infecciones (tales como, por ejemplo, infección viral, infección bacteriana, infección fúngica y similares), enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas, inflamaciones y similares.
[0123] En algunas formas de realización representativas, las partículas dirigidas que comprenden un ácido nucleico (como siARN o miARN, shARN, ARN anti-sentido o similares) pueden usarse para el tratamiento del cáncer.
[0124] En algunas formas de realización, el cáncer es un trastorno en donde una población de células se ha vuelto, en diversos grados, insensible a los mecanismos de control que normalmente gobiernan la proliferación y diferenciación. En algunas formas de realización, el cáncer es un cáncer de la sangre. Ejemplos no limitativos de cánceres de sangre son linfoma, leucemia y miloma. Los linfomas se pueden dividir en dos categorías: linfoma de Hodgkin y linfoma no Hodgkin. La mayoría de los linfomas no Hodgkin son linfomas de células B, que crecen rápidamente (grado alto) o lentamente (grado bajo). Hay 14 tipos de linfomas no Hodgkin de células B. Los otros son linfomas de células T.
[0125] En algunas formas de realización representativas, el ácido nucleico que se puede usar para el tratamiento del cáncer se dirige contra un gen diana, que está implicado en la regulación del ciclo celular. En algunas formas de realización representativas, el gen diana puede ser quinasa 1 similar a Polo (PLK), ciclina D1, CHK1, genes de la vía Notch.
[0126] De acuerdo con algunas formas de realización ejemplares, la pluralidad de lípidos de las partículas lipídicas pueden ser de origen natural o sintético y pueden seleccionarse entre, pero sin limitarse a: lípidos catiónicos, fosfatidiletanolaminas, lípidos ionizados, lípidos estabilizadores de membrana, fosfolípidos y similares, o combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0127] En algunas formas de realización, los lípidos estabilizadores de membrana se pueden seleccionar de, entre otros: colesterol, fosfolípidos (tales como, por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, difosfatidilgliceroles), cefalinas, esfingolípidos (esfingomielinas y glicoesfingolípidos), glicoglicerolípidos y combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0128] En algunas formas de realización, las fosfatidiletanolaminas pueden seleccionarse entre, pero sin limitarse a: 1,2-dilauroill-fosfatidil-etanolamina (DLPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPhPE) 1,3-dipalmitoil-sn-glicero-2-fosfoetanolamina (1,3-DPPE), 1-palmitoil-3-oleoil-sn-glicero-2-fosfoetanolamina (1,3-POPE), biotina-fosfatidiletanolamina, 1,2-dimiristoil-snglicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE) o combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, las fosfatidiletanolaminas pueden conjugarse con un derivado de PEG-amina. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0129] De acuerdo con algunas formas de realización, "lípido neutro" se refiere a cualquiera de una serie de especies de lípidos que existen en una forma zwitteriónica neutra o sin carga a pH fisiológico, tales lípidos incluyen, pero no se limitan a fosfotidilcolinas tales como 1,2-Distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), 1,2-Dipalmitoil-sn-gliccro-3-fosfocolina (DPPC), 1,2-Dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), 1-Palmitoil-2-olcoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoilsn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), fosfatidiletanolaminas como 1,2-diolcoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE), esfingomielinas (SM), ceramidas, esteroides como los esteroles y sus derivados. Los lípidos neutros pueden ser sintéticos o de origen natural.
[0130] Según algunas formas de realización, las partículas (fase lipídica de las mismas), pueden incluir además uno o más derivados de PEG. En algunas formas de realización, los derivados de PEG pueden conjugarse con una o más moléculas adicionales, como un lípido. En algunas formas de realización, el derivado de PEG se selecciona de, entre otros: PEG-DMG 3-A/-(-metox¡ poli(etilenglicol)2000)carbamoil-1,2-dimirisilglicerol, PEG-cDMA 3-N-(-metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil-1,2-dimiristiloxi-propilamina; PEG-cDSA, 3-N-(-metoxipoli(etilenglicol)2000)carbamoil-1,2-diesteariloxi-propilamina, DSPE-PEG, PEG-maleimida, DSPE-PEG-maleimida o combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención.
[0131] En algunas formas de realización, el derivado/resto de maleimida se puede conjugar, unir o enlazar a un derivado de PEG, que puede estar por sí mismo conjugado, unido y/o enlazado a un lípido.
[0132] De acuerdo con algunas formas de realización, la relación entre los diversos lípidos en la partícula puede variar. En alguna encarnación, la relación es una relación molar. En algunas formas de realización, la relación es una relación en peso. En algunas formas de realización, cada uno de los grupos lipídicos puede estar en una relación molar/una relación en peso de aproximadamente 1%-99%.
[0133] De acuerdo con algunas formas de realización, la proporción de peso entre el ácido nucleico y la mezcla de lípidos se puede ajustar para lograr el máximo efecto biológico del ácido nucleico en el sitio objetivo. En algunas formas de realización, la relación entre el ácido nucleico y la fase lipídica puede ser 1:1. Por ejemplo, la relación en peso entre el ácido nucleico y la fase lipídica puede ser 1:2. Por ejemplo, la relación ponderal entre el ácido nucleico y la fase lipídica puede ser de 1:5. Por ejemplo, la relación ponderal entre el ácido nucleico y la fase lipídica puede ser de 1:10. Por ejemplo, la relación ponderal entre el ácido nucleico y la fase lipídica puede ser de 1:16. Por ejemplo, la relación ponderal entre el ácido nucleico y la fase lipídica puede ser de 1:20. En algunas formas de realización, la relación en peso entre el ácido nucleico y la fase lipídica es de aproximadamente 1:1 a 1:20 (p:p).
[0134] En algunas formas de realización, las partículas son nanopartículas. En algunas formas de realización, las partículas (incluido el ácido nucleico encapsulado dentro) y el resto de direccionamiento en las partículas superficiales tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 10 a aproximadamente 500 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 10 a aproximadamente 350 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 20 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 75 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 90 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 120 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 150 a aproximadamente 200. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de más de aproximadamente 10 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 20 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 30 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 40 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 50 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 60 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 70 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 80 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 90 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 100 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de más de aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas tienen un tamaño de partícula (diámetro) de no más de aproximadamente 500 nm. En algunas formas de realización, las partículas (incluyendo el ácido nucleico encapsulado dentro) tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 nm. En algunas formas de realización, las partículas (incluyendo el ácido nucleico encapsulado dentro) tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 50 a aproximadamente 60 nm. En algunas formas de realización, las partículas (incluyendo el ácido nucleico encapsulado dentro) tienen un tamaño de partícula (diámetro) en el rango de aproximadamente 55 a aproximadamente 58 nm. En algunas formas de realización, el tamaño es un diámetro hidrodinámico.
[0135] Según formas de realización ejemplares, las partículas pueden comprender un lípido catiónico (como el compuesto que se muestra en la Tabla 1 o 2), colesterol, 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC), derivado de PEG (como DMGPEG) y PEG-maleimida conjugada con un lípido (como DSPE-PEG-maleimida); en varias proporciones mol:mol, y conjugado adicionalmente con un resto de direccionamiento, en donde el resto de direccionamiento está conjugado, unido y unido al resto de maleimida. Por ejemplo, la fase lipídica puede estar compuesta por: lípido catiónico (DLinMC3)/DSPC/colesterol/DMG-PEG/DSPE-PEG-Maleimida (mol/mol 50:10:38:1,5:0,5). Por ejemplo, la fase lipídica puede estar compuesta por: DLinMC3-DMA/Chol/DSPC/DMG-PEG/DSPE-PEG-maleimida (mol/mol 50:38:10:1,95:0,05).
[0136] De acuerdo con algunas formas de realización, la fase lipídica puede comprender aproximadamente 30-60% (mol) de lípidos catiónicos. Por ejemplo, el(los) lípido(s) catiónico(s) puede(n) comprender aproximadamente el 40-50% (mol) de la fase lipídica.
[0137] De acuerdo con algunas formas de realización, la fase lipídica puede comprender aproximadamente 20-70% (mol) de lípidos estabilizadores de membrana. Por ejemplo, los lípidos estabilizadores de la membrana pueden comprender alrededor del 40-60% de la fase lipídica. En algunas formas de realización, se puede usar más de un tipo de lípido estabilizador de membrana en la fase lipídica. Por ejemplo, el lípido estabilizador de la membrana puede incluir colesterol (siendo alrededor del 30-50 % (mol) de la fase lipídica), y un fosfolípido (como, por ejemplo, DSPC), que puede ser alrededor del 5-15 % (mol) de la fase lipídica.
[0138] Según algunas formas de realización, la fase lipídica puede comprender aproximadamente 0,01-3 % (mol:mol) de PEG-maleimida (opcionalmente conjugada con un lípido). Por ejemplo, la PEG-maleimida puede comprender alrededor del 0,05-0,6% de la mezcla de lípidos.
[0139] De acuerdo con algunas formas de realización, un derivado de PEG adicional (conjugado con un lípido) puede comprender aproximadamente el 0,5-10% de la composición de la fase lipídica.
[0140] Se proporciona un método, que no forma parte de la invención, para la preparación de partículas dirigidas para el suministro de un ácido nucleico a los leucocitos, comprendiendo el método uno o más de los pasos de:
a) mezclar una pluralidad de lípidos, incluyendo, un lípido catiónico según la invención, un lípido estabilizador de membrana y PEG-maleimida conjugado con un fosfolípido, en un disolvente orgánico en una proporción deseada;
b) añadir ácidos nucleicos a la mezcla en una solución adecuada en una proporción deseada;
c) mezclar la mezcla de lípidos y los ácidos nucleicos en un micromezclador de microfluidos para formar partículas;
d) dializar las partículas para eliminar los disolventes no deseados;
e) incubar las partículas con anticuerpos dirigidos reducidos para generar partículas dirigidas;
f) eliminar los anticuerpos no conjugados, opcionalmente mediante filtración en gel;
g) filtración de partículas t-conjugadas reconstituidas que encapsulan moléculas de ácido nucleico;
[0141] En algunas formas de realización, los lípidos se suspenden en un tampón acuoso ácido, como etanol. En algunas formas de realización, el ácido nucleico está en una solución tampón de acetato.
[0142] En algunas formas de realización, el ácido nucleico se puede mezclar con la mezcla de lípidos en un mezclador microfluidificador para formar partículas que encapsulen/transporten el ácido nucleico.
Definiciones
[0143] Para facilitar la comprensión de la presente invención, a continuación se definen una serie de términos y frases. Debe entenderse que estos términos y frases tienen el propósito de descripción y no de limitación, de modo que la terminología o fraseología de la presente especificación debe ser interpretada por el experto en la materia a la luz de las enseñanzas y orientación presentadas en este documento, en combinación con el conocimiento de un experto en la materia.
[0144] Como se menciona en el presente documento, los términos "ácido nucleico", "moléculas de ácido nucleico", "oligonucleótido", "polinucleótido" y "nucleótido" se pueden usar de manera intercambiable en el presente documento. Los términos se refieren a polímeros de desoxirribonucleótidos (ADN), ribonucleótidos (ARN) y formas modificadas de los mismos en forma de un fragmento separado o como componente de una construcción más grande, lineal o ramificado, monocatenario, bicatenario, triple, o híbridos de los mismos. El término también abarca híbridos de ARN/ADN. Los polinucleótidos pueden incluir secuencias de oligonucleótidos o polinucleótidos sentido y antisentido de ADN o ARN. Las moléculas de ADN o ARN pueden ser, por ejemplo, pero sin limitarse a: ADN complementario (ADNc), ADN genómico, ADN sintetizado, ADN recombinante o un híbrido de los mismos o una molécula de ARN como, por ejemplo, ARNm, ARNsh, ARNsi, miARN, ARN antisentido y similares. Cada posibilidad representa una forma de realización separada de la presente invención. Los términos incluyen además oligonucleótidos compuestos de bases naturales, azúcares y enlaces covalentes entre nucleósidos, así como oligonucleótidos que tienen porciones no naturales, que funcionan de manera similar a las respectivas porciones naturales.
[0145] Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente aquí para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en los que uno o más residuos de aminoácidos son un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como a los polímeros de aminoácidos naturales.
[0146] El término "construcción", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada o ensamblada artificialmente que puede incluir una o más secuencias de ácido nucleico, donde las secuencias de ácido nucleico pueden incluir secuencias codificantes (es decir, secuencia que codifica un producto final), secuencias reguladoras, secuencias no codificantes o cualquier combinación de las mismas. El término construcción incluye, por ejemplo, vector, pero no debe verse como limitado a él.
[0147] "Vector de expresión" se refiere a construcciones que tienen la capacidad de incorporar y expresar fragmentos de ácido nucleico heterólogo (como, por ejemplo, ADN), en una célula extraña. En otras palabras, un vector de expresión comprende secuencias/fragmentos de ácido nucleico (tales como ADN, ARNm, ARNt, ARNr), capaces de transcribirse. Muchos vectores de expresión procarióticos y eucarióticos son conocidos y/o disponibles comercialmente. La selección de vectores de expresión apropiados está dentro del conocimiento de los expertos en la técnica. En algunas formas de realización representativas, el vector de expresión puede codificar una molécula de ARN de doble cadena en el sitio objetivo.
[0148] El término "expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a la producción de una molécula de producto final deseada en una célula diana. La molécula del producto final puede incluir, por ejemplo, una molécula de ARN; un péptido o una proteína; y similares; o combinaciones de los mismos.
[0149] Como se usa en este documento, los términos "introducir" y "transfección" se pueden usar de manera intercambiable y se refieren a la transferencia de moléculas, como, por ejemplo, ácidos nucleicos, moléculas de polinucleótidos, vectores y similares en una célula objetivo(s), y más específicamente en el interior de un espacio encerrado en una membrana de una(s) célula(s) diana. Las moléculas se pueden "introducir" en la(s) célula(s) diana por cualquier medio conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo, como enseñan Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2001). Los medios para "introducir" moléculas en una célula incluyen, por ejemplo, pero no se limitan a: choque térmico, transfección con fosfato de calcio, transfección con PEI, electroporación, lipofección, reactivo(s) de transfección, transferencia mediada por virus y similares, o combinaciones de los mismos. La transfección de la célula se puede realizar sobre cualquier tipo de célula, de cualquier origen, como, por ejemplo, células humanas, animales células vegetales, células víricas y similares. Las células pueden seleccionarse de células aisladas, células cultivadas de tejido, líneas celulares, células presentes dentro del cuerpo de un organismo y similares.
[0150] El término "tratar" y "tratamiento" como se usa en el presente documento se refiere a anular, inhibir, ralentizar o revertir la progresión de una enfermedad o afección, mejorar los síntomas clínicos de una enfermedad o afección o prevenir la aparición de síntomas clínicos de una enfermedad o condición. El término "prevenir" se define aquí como prohibir que un sujeto adquiera un trastorno o enfermedad o condición.
[0151] El término "tratamiento del cáncer" está dirigido a incluir uno o más de los siguientes: una disminución en la tasa de crecimiento del cáncer (es decir, el cáncer sigue creciendo pero a una tasa más lenta); cese del crecimiento canceroso, es decir, estasis del crecimiento del tumor, y el tumor disminuye o se reduce de tamaño. El término también incluye la reducción del número de metástasis, la reducción del número de nuevas metástasis formadas, el enlentecimiento de la progresión del cáncer de una etapa a la otra y una disminución de la angiogénesis inducida por el cáncer. En la mayoría de los casos preferidos, el tumor se elimina totalmente. Además, en este término se incluye el alargamiento del período de supervivencia del sujeto que se somete al tratamiento, el alargamiento del tiempo de progresión de la enfermedad, la regresión del tumor y similares. En algunas formas de realización, el cáncer es un cáncer de la sangre.
[0152] El término "leucocitos" se refiere a glóbulos blancos (WBC), producidos y derivados de una célula madre hematopoyética multipotente en la médula ósea. Los glóbulos blancos tienen núcleos, y los tipos de glóbulos blancos se pueden clasificar en cinco tipos principales, que incluyen neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos, según las características funcionales o físicas. Los tipos principales se pueden clasificar en subtipos. Por ejemplo, los linfocitos incluyen células B, células T y células NK. Las células B, por ejemplo, liberan anticuerpos y ayudan a la activación de las células T. Las células T, por ejemplo, se pueden clasificar en varios subtipos, que incluyen: células T colaboradoras (CD4+ Th) que activan y regulan las células T y B; células T citotóxicas (CD8+) que pueden atacar y matar células infectadas por virus y células tumorales; células T gamma-delta (células T y§) que pueden servir de puente entre las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas y participar en la fagocitosis; y células T reguladoras (supresoras) que modulan el sistema inmunológico, mantienen la tolerancia a los autoantígenos y anulan las condiciones autoinmunes.
Métodos de síntesis
[0153] Los compuestos de la presente invención se pueden preparar de acuerdo con los siguientes métodos generales de síntesis:
Figure imgf000037_0001
z _ 2 Esquema 1
z = 2-10
i
n = 0-6
R = alquilo, alquenilo, alquinilo
R’. R” = alquilo
NR'R" = anillo heterocíclico. guanidina
X = gmpo saliente
Figure imgf000038_0001
Esquema 2
Figure imgf000039_0001
[0154] Los ejemplos anteriores de la técnica relacionada y las limitaciones relacionadas con los mismos pretenden ser ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de la técnica relacionada resultarán evidentes para los expertos en la técnica tras la lectura de la memoria descriptiva y el estudio de las Figuras.
Ejemplo 1: Materiales y métodos:
Materiales
[0155] Lípidos: todos los lípidos utilizados para la producción de NPL (colesterol, DSPC y DSPE PEG-Mal) se adquirieron de Avanti Polar lipids (EE. UU.).
[0156] Anticuerpos monoclonales: anti-CD45 AF647, se adquirió anexina-647 de BioLegend. El yoduro de propodeo se adquirió de Sigma-Aldrich.
[0157] Las moléculas de siARN fueron diseñadas y analizadas por Alnylam Pharmaceuticals (EE. UU.).
[0158] Secuencias de siARN modificadas químicamente:
siARN CD45:
Cadena sentido: cuGGcuGAAuuucAGAGcAdTsdT (SEQ ID NO: 1)
Cadena antisentido: UGCUCUGAAAUUcAGCcAGdTsdT (SEQ ID NO: 2)
siARN NC5 (siNC5 o ctl siARN):
Cadena sentido: CAUAUUGCGCGUAUAGUCGCGUUAG
Cadena antisentido: UGGUAUAACGCGCAUAUCAGCGCAAUC
Luc siARN (siLuc):
Cadena sentido: cuuAcGcuGAGuAcuucGAdTsdT (SEQ ID NO: 3)
Cadena antisentido: UCGAAGuACUcAGCGuAAGdTsdT (SEQ ID NO: 4))
El siARN marcado con Alexa-647 poseía la misma secuencia que siLuc. Los nucleótidos modificados con 2'-OMe están en minúsculas, y los enlaces de fosforotioato están representados por "s". siARN PLK 1 (PLK 1)
Cadena sentido GCUUAAUGACGAGUUCUUUACUUCT
Cadena antisentido: GACGAAUUACUGCUCAAGAAAUGAAGA
Líneas celulares:
SupT1, HEK 293, NAR y OVCAR-8 se adquirieron células de la American Type Culture Collection (ATCC) y se cultivaron como se recomienda.
Preparación de nanopartículas basadas en lípidos (NPL) que atrapan siARN
[0159] Se prepararon NPL utilizando micromezclas de microfluidos (Precision NanoSystems, Vancouver, BC, Canadá) como se describe por Cohen et.al. Un volumen de mezclas de lípidos (lípido catiónico, DSPC, Chol, DMG-PEG y DSPE-PEG Mal en relación molar 50:10:38:1,5:0,5, concentración total de lípidos 9,64 nM) en etanol y tres volúmenes de siARN (1:16 p/p de siARN a lípidos) que contenían soluciones de tampón de acetato se inyectaron a través del micromezclador a un caudal combinado de 2 ml/minuto (0,5 ml/min para etanol y 1,5 ml/min para tampón acuoso). Para los NPL marcados, se incorporó el 10 % de siARN marcado con Alexa-647. Para las partículas marcadas con Cy5, se usó un 10 % de siARN no dirigido marcado con Cy5. La mezcla resultante se dializó frente a PBS (pH 7,4) durante 16 h para eliminar el etanol. Análisis de tamaño, potencial Z y ultraestructura de a CD38-LNPs-siARN
[0160] La distribución de tamaño de los NPL y el potencial Z se determinaron mediante dispersión de luz dinámica utilizando un medidor Malvern nano ZS Z (Malvern instruments, Reino Unido). Para las mediciones de tamaño, los NPL se diluyeron 1:20 en PBS. Todas las muestras utilizadas mostraron un índice de polidispersidad (PDI) inferior a 0,2. Para las mediciones de potencial Z, los NPL se diluyeron 1:200 en DDW. En algunos casos, como se ha indicado, las medidas de tamaño y potencial zeta se realizaron en agua.
PCR cuantitativa en tiempo real
[0161] Los niveles de ARNm de la quinasa 1 tipo polo (gen PLK1) en las células se cuantificaron mediante PCR en tiempo real, cuarenta y ocho o setenta y dos horas después de la transfección. El ARN total se aisló utilizando el kit de purificación de ARN E-Z (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), y 1 mg de ARN de cada muestra se transcribió inversamente en ADNc utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA), la cuantificación de ADNc (5 ng en total) se realizó en el sistema de detección de secuencias del paso uno (Applied Biosystems, Foster City, CA) usando syber green (Applied Biosystems). GAPDH fue elegido como un gen de mantenimiento.
[0162] Para la PCR en tiempo real se eligieron los siguientes cebadores:
Cebadores para PLK1:
directo - ACCAGCACGTCGTAGGATTC
inverso - CAAGCACAATTTGCCGTAGG
Cebadores para GAPDH:
directo - TCA GGG TTT CAC ATT TGG CA
inverso - GAG CAT GGA TCG GAA AAC CA
Silenciamiento génico in vitro
[0163] Se colocaron células Suptl o NAR o OVCAR en placas de 12 pocilios de cultivo de tejidos a una densidad de 1 x 105 células con 1 ml de medio completo. Se agregaron NPL que contenían diferentes siARN (siPLKI o siCD45 o siLUC) a los pozos y la concentración se mencionó en las figuras. Las células se aislaron en diferentes intervalos de tiempo mencionados en las Figuras y se analizaron mediante citometría de flujo (para la eliminación de siCD45) o qPCR para el análisis del silenciamiento de PLK1. El ensayo de apoptosis con PI/Anexina se analizó mediante citometría de flujo en caso de muerte celular inducida por siPLK1.
Estudios del ciclo celular:
[0164] Las células transfectadas se lavaron con PBS enfriado con hielo y se fijaron con etanol al 70 % durante 1 h.
[0165] A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS frío y se incubaron durante 10 min a 37 °C en 250 pl de PBS con 10 pg/ml de yoduro de propidio (PI), 2,5 pg/ml de ARNasa A sin ADNasa (Sigma, EE. UU.) y 0,01% Triton-X. La fluorescencia de PI se evaluó mediante citometría de flujo. Los análisis de FlowJo™ se realizaron en al menos 9000 células por muestra después de eliminar los residuos y los dupletes de células en función de los canales FL2-Area/FL2-Width. Las distribuciones del ciclo celular se obtuvieron mediante la aplicación del modelo Dean-Jett-Fox en células seleccionadas con puntuaciones RMS que oscilan entre 1,5 y 2,5.
Ejemplo 2: Síntesis de lípidos:
Métodos generales de preparación (formas de realización ejemplares de los Esquemas 1-3).
[0166]
Esquema geueral Método
Figure imgf000042_0001
R = alquilo, alquemlo, alqumilo
Esquema 4
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Método A:
[0167] El compuesto (i) o el compuesto funcional de amina como se definió anteriormente se conjuga con ácidos grasos a través del método de acoplamiento EDC/NHC estándar para producir el compuesto (ii). La reducción adicional con hidruro de litio y aluminio (LAH) seguido de la purificación por cromatografía en columna de gel de sílice da el compuesto final deseado (iii).
Método B:
[0168] El compuesto (i) y/o el compuesto funcional de amina y el aldehído correspondiente de la cadena grasa de alquilo/alquenilo se agitaron durante 2 h a ta bajo argón, seguido de reducción con NaCNBH4 o triacetoxi borohidruro de sodio y rendimientos de purificación por cromatografía en columna de gel de sílice compuesto final deseado.
Método C:
[0169] El compuesto (i) o el compuesto funcional de amina como se define anteriormente, se calienta con el correspondiente bromuro de alquilo/alquenilo (cualquier otro como se define anteriormente) durante la noche seguido de purificación por cromatografía en columna produce el compuesto final deseado (ii).
Método D:
[0170] El compuesto de dihidroxilo se hizo reaccionar con cloruro de ácido graso en presencia de trietilamina para dar el compuesto (ii). El compuesto (ii) se oxida adicionalmente con clorocromato de piridinio (PCC) y luego se hace reaccionar con un compuesto funcional de amina y la purificación por cromatografía en columna de gel de sílice produce el compuesto deseado (iv).
Síntesis del Lípido 1 (Método A):
[0171]
Figure imgf000045_0001
[0172] Se tomaron ácido linoleico (0,88 mg, 3,14 mmol) y EDCI (0,9 mg, 4,71 mmol) en un matraz de 100 ml y se disolvieron en DCM seco seguido de la adición de clorhidrato de dimetilaminoetilhidrazina (0,2 mg, 1,25 mmol) y trietilamina (0,1 ml). La mezcla de reacción se agitó durante 24 h, se lavó con agua y una solución de salmuera. El compuesto bruto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH:CHCh (4:96)) para producir 0,8 g del compuesto puro (9Z,12Z)-N'-(2-(dimetilamino)etil)-N'-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoil)octadeca-9,12-dienohidrazida.
[0173] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 85,22-5,45 (8H, m); 3,7-3,8 (1H, t); 3,2-3,3 (1H, m); 2,8 (4H, t), 2,6 (2H, t), 2,3 (6H, s); 2,2 (4H, m); 2,0 (8H, q); 1,2-1,4 (32H, m), 0,9 (6H, t).
[0174] ESI-MS: 628,6 (M+1)
[0175] El compuesto anterior (0,8 mg, 1,27 mmol) se tomó en un matraz de fondo redondo (RB) de 50 ml y se disolvió en 5 ml de THF seco, seguido de la adición de IN LAH en solución de THF (6 ml, 6,36 mmol) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 24 horas. La reacción se inactivó con cloruro de amonio saturado a 0 °C seguido de cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (2: 98)) purificación para producir 0,3 g del compuesto puro 2-(1,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)hidrazinil)-W,W-dimetiletano-1-amina como líquido amarillo pálido. 1H RMN (400 MHz, CDCh): RMN 8: 5,22-5,45 (8H, m); 3,2 (2H,t); 3,1 (2H, t); 2,8 (4H, t), 2,5 (2H, m); 2,4 (6H, s); 2,3 (1H, m); 2,0 (12H, q); 1,5 (4H, m); 1,2-1,4 (32H, m), 0,9 (6H, t).
[0177] ESI-MS: 600,6 (M+1)
Síntesis de los lípidos 10 y 12:
[0178]
Figure imgf000046_0001
[0179] Alcohol linoleico (1,7 g, 6,3 mmol) se disolvió en DCM seco bajo argón y se añadieron tamices moleculares a la mezcla de reacción. Se añadió PCC (2 g, 9,5 mmol) por fracciones a la mezcla de reacción durante un período de 10 min. La mezcla de reacción se agitó durante 1 h y se filtró a través de una almohadilla de sílice para eliminar el PCC, seguido de la evaporación del disolvente para producir 1,5 g de aldehído linoleico bruto. El aldehído bruto (1,5 g, 5,6 mmol) y la Boc-hidrazida (0,6 g, 4,5 mmol) se disolvieron en DCM seco en atmósfera de argón, luego se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (4,7 g, 22,6 mmol) a la mezcla de reacción y se agitó durante 24 h. a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de hidróxido de sodio y se extrajo con DCM (3X50 mL) seguido de lavado con agua y solución de salmuera. El solvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna de sílice (EtOAc: Hexano (5: 95) produjo 1,3 g del compuesto puro W,A/-dilinoleil-boc hidrazida.
[0180] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 85,22-5,45 (8H, m), 2,8 (4H, t), 2,6 (3H, bs), 2,0-2,1 (8H, q), 1,5-1,8 (6H, m), 1,4-1,5 (12H, s), 1,2-1,4 (32H, m), 0,9 (6H, t)
[0181] ESI-MS: 629,6 (M+1)+.
[0182] W,W-dilinoleil-boc hidrazida (1,3 g, 2,07 mmol) fue disuelto en DCM seco en atmósfera de argón. La mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se añadió gota a gota ácido trifluoroacético (TFA) (2 ml) y se agitó durante 3 horas. Una vez completada la reacción por análisis TLC, la mezcla de reacción se lavó con bicarbonato de sodio seguido de solución de salmuera. El disolvente se evaporó y la mezcla de reacción bruta (0,4 g, 0,76 mmol), ácido W,A/-dimetilaminobutmco (0,19 g, 1,3 mmol) y EDCI (0,43 g, 2,26 mmol) se disolvieron en DCM seco en atmósfera de argón. Se añadió trietilamina y la reacción se agitó durante 24 horas. La mezcla de reacción se lavó con agua seguido de solución de bicarbonato de sodio y salmuera. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCl3 (2:98) para producir 0,3 g de lípido puro 10 como líquido incoloro.
[0183] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 5,22-5,45 (8H,m), 2,8 (4H,t), 2,6 (3H,m), 2,3-2,5 (4H,m), 2,2 (6H,s), 2,0(8H,q), 1,6-1,8 (8H, m); 1,2-1,5 (36H,m), 0,9 (6H,t)
[0184] ESI-MS: 642,6 (M+1)+.
[0185] El compuesto 2 se disolvió en THF seco y LAH 1 M en solución de THF se añadió a la mezcla de reacción y se calentó a reflujo durante 12 h. La reacción se inactivó con solución de cloruro de amonio seguido de evaporación del solvente y la purificación por cromatografía en columna de gel de sílice produjo el lípido puro 12.
[0186] 1H RMN 8: 5,22-5,45 (8H, m), 2,8 (4H, t), 2,6 (2H, m), 2,4-2,5 (6H, m), 2,2 (6H, s), 2,0 (8H, q), 1,6 -1,8 (8H, m), 1,2­ 1,5 (36H, m), 0,9 (6H, t)
[0187] ESI-MS: 629,1 (M+1)+.
Síntesis del Lípido 11:
[0188]
Figure imgf000047_0001
[0189] W,A/-dilinoleil hidrazina (300 mg, 0,56 mmol), NE,NE dimetil- Na boc L-lisina (180 mg, 1,13 mmol) y EDCI (320 mg, 1,68 mmol) se tomaron en un matraz RB de 50 ml y se disolvió en 10 ml de DCM seco bajo argón. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas y luego la mezcla de reacción se lavó con agua seguido de solución de bicarbonato de sodio y salmuera. El producto bruto se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH:CHCh; 3:97) para producir 200 mg del compuesto puro.
[0190] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 85,22-5,45 (8H, m); 3,8-4,0 (1H, m); 2,8 (4H, t), 2,6-2,7 (4H, t), 2,4 (2H, m); 2,2 (6H, s), 2,0 (8H, m), 1,5-1,8 (6H, m); 1,4 (9H, s), 1,2-1,4 (34H, m), 0,9 (6H, t).
[0191] ESI-MS: 785,6 (M+1)+
[0192] El compuesto anterior (200 mg, 0,25 mmol) se tomó en un matraz RB de 50 ml y se disolvió en 4 ml de DCM seco bajo atmósfera de argón. Se añadió gota a gota ácido trifluoroacético (2 ml) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó durante 3 horas. El solvente se lavó con solución de bicarbonato de sodio seguido de salmuera. La mezcla de reacción se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice utilizando un sistema de disolventes de cloroformo y metanol (95:5) para producir 120 mg del compuesto puro 11 (2-amino-6-(dimetilamino)-N',N'-di((9Z12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)hexanohidrazida) como semisólido.
[0193] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 65,22-5,45 (8H, m); 3,4 (1H, m), 2,8 (4H, t), 2,7 (4H, t), 2,5 (2H, t), 2,4 (6H, s), 2,0 (m), 1,6 (2H, m), 1,4-1,5 (6H, m), 1,2-1,4 (34H, m), 0,9 (6H, t)
[0194] ESI-MS: 686,6 (M+1)+.
Síntesis del Lípido 14:
[0195]
Figure imgf000048_0001
[0196] Linoleil aldehido (2,64 g, 10,0 mmol, 2 equiv.) y clorhidrato de hidroxilamina (0,34 g, 5,0 mmol, 1,0 equiv.) se disolvieron en DCM seco en atmósfera de argón y luego se añadió trimetilamina (0,7 ml, 5,0 mmol, 1,0 equiv.). Después de disolver los compuestos, se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (3,1 g, 15,0 mmol, 3 equiv.) a la mezcla de reacción y se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de hidróxido de sodio seguido de lavado con agua y solución de salmuera. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílice (EtOAc: Hexano (5:95) para producir 1,5 g (55 %) de un compuesto de color blanco puro N,N-dilinoleilhidroxilamina.
[0197] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 65,27-5,39 (8H, m), 2,77 (4H, t, J = 6,84 Hz), 2,57-2,68 (4H, m), 2,05 (8H, q, J= 6,80, 6,87 Hz); 1,50-1,65 (4H, m); 1,22-1,42 (32H, m), 0,89 (6H, t, J = 6,86 Hz).
[0198] ESI-MS: 530 [M+1]+
[0199] N,N-dilinoleil-hidroxilamina (0,48 g, 0,90 mmol, 1 equiv.) Clorhidrato de ácido N,N-dimetilaminobutírico (0,30 g, 1,8 mmol, 2 equiv.), EDCI (0,34 g, 1,8 mmol, 2 equiv.) y se disolvió DMAP (0,01 g, 0,09 mmol, 0,1 equiv.) en DCM seco en atmósfera de argón. A continuación, se añadió trimetilamina (0,25 ml, 1,8 mmol, 2 equiv.) y la reacción se agitó durante 24 h. La mezcla de reacción se lavó con agua, seguido de bicarbonato de sodio y solución de salmuera. El solvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (3:97) a rendimiento 0,6 g (85%) de lípido 14 puro como líquido incoloro.
[0200] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 65,22-5,45 (8H, m); 2,71-2,87 (8H, m), 2,24-2,36 (4H, m); 2,21 (6H, s); 1,93-2,12 (8H, m); 1,74-1,81 (2H, m); 1,42-1,58 (4H, m); 1,6-1,8 (8H, m); 1,20-1,40 (32H, m), 0,89 (6H, t, J = 6,90 Hz).
[0201] Masa: 643,1 [M]+; 644,1 [M+1]+
Síntesis del Lípido 15:
[0202]
Figure imgf000049_0001
[0203] Linoleil aldehido (1,7 g, 6,06 mmol, 2 equiv.), clorhidrato de W,W-dimetilaminoetilhidrazina (0,53 g, 3,03 mmol, 1 equiv.) y trimetilamina (0,84 ml, 6,06 mmol, 2 equiv.) en DCM seco en atmósfera de argón, luego se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (1,91 g, 9,09 mmol, 3 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de hidróxido de sodio seguido de lavado con agua y solución de salmuera. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (3:97)) produjo 1,08 g (60 %) de lípido puro 15 como líquido incoloro.
[0204] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 86,77 (1H, t, J = 5,55 Hz), 5,34-5,48 (8H, m); 3,13 (2H, m), 3,00-3,05 (2H, m), 2,77 (4H, t, J = 6,44 Hz), 2,41-2,48 (4H, m), 2,22-2,34 (2H, m), 2,28 (s, 6H), 1,46-1,51 (4H, m), 1,32-1,40 (32H, m), 0,89 (6H, t, J = 6,90 Hz).
[0205] ESI-MS: 599 ([M]+), 600 ([M+1]+).
Síntesis del lípido 22:
[0206]
Figure imgf000049_0002
[0207] W,W-dilinoleil-hidroxilamina (0,20 g, 0,37 mmol, 1 equiv.) W-metil piperizina ácido propanoico (0,12 g, 0,74 mmol, 2 equiv.), EDCI (0,13 g, 0,74 mmol, 2 equiv.) y DMAP (5 mg, 0,03 mmol, 0,1 equiv.) se disolvieron en DCM seco en atmósfera de argón. A continuación, se añadió trimetilamina (0,1 ml, 0,74 mmol, 2 equiv.) y la reacción se agitó durante 24 horas. La mezcla de reacción se lavó con agua, seguido de solución de bicarbonato de sodio y salmuera. El disolvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (5:95) para producir 0,21 g (76 %) de lípido puro como líquido incoloro.
[0208] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 85,21-5,45 (8H, m); 2,75-2,87 (8H, m), 2,70 (2H, t, J = 7,28 Hz); 2,47 (2H, t, J= 7,25 Hz); 2,27 (3H, s); 1,98-2,10 (8H, m); 1,44-1,57 (4H, m); 1,15-1,40 (32H, m), 0,88 (6H, t, J = 6,81 Hz).
[0209] Masa: 684,8 [M+1]+.
Síntesis del Lípido 38:
[0210]
Figure imgf000050_0001
[0211] Aldehído de linoleilo (2,64 g, 10,0 mmol, 2 equiv.) y etanolamina (0,30 g, 5,0 mmol, 1 equiv.) se disolvieron en DCM en atmósfera de argón, luego se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (3,1 g, 15,0 mmol, 3 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de hidróxido de sodio seguido de lavado con agua y solución de salmuera. El solvente se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía en columna (MeOH: CHCh (2: 98) para producir 2,3 g (85 %) del compuesto puro de color amarillento W,W-dilinoleil-aminoetanol.
[0212] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 85,35-5,46 (8H, m); 3,52 (2H, t, J = 5,38 Hz); 2,77 (4H,t, J = 6,37 Hz), 2,57 (2H,t, J = 5,38 Hz), 2,43-2,49 (4H, m), 2,05 (8H, q, J = 6,73, 6,75 Hz), 1,43-1,48 (4H, m), 1,32-1,38 (32H, m), 0,89 (6H, t, J = 6,85 Hz)
[0213] ESI-MS: 558 [M+1]+
[0214] W,W-dilinoleil-aminoetanol (0,55 g, 1,0 mmol, 1 equiv.), ácido W,W-dimetilaminobutírico (0,33 g, 2,0 mmol, 2 equiv.), EDCI (0,38 g, 2,0 mmol, 2 equiv.) y DMAP (0,01 g, 0,01 mmol, 0,1 equiv.) se disolvieron en DCM seco en atmósfera de argón. Trimetilamina (0,28 ml, 2,00 mmol, 2 equiv.) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 h. La mezcla de reacción se lavó con agua, seguido de bicarbonato de sodio y solución de salmuera. El solvente se evaporó y el residuo se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (3: 97) para producir 0,46 g (70 %) de lípido puro 38 como líquido incoloro.
[0215] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 85,27-5,45 (8H, m); 4,12 (2H, t, J = 6,33 Hz); 2,77 (4H, t, J = 6,37 Hz); 2,67 (2H, t, J = 6,34 Hz); 2,38-2,49 (4H, m), 2,19-2,38 (4H, m); 2,21 (6H,s); 2,05 (8H, q, J = 6,82, 6,84 Hz); 1,70-1,85 (4H, m); 1,20-1,50 (36H, m), 0,9 (6H, t, J= 6,85 Hz).
[0216] ESI-MS: 671 ([M]+), 672 ([M+1]+).
Síntesis de los lípidos 54 y 57:
[0217]
Figure imgf000051_0001
Decanoato de 7-oxoheptilo:
[0218]
Figure imgf000051_0002
[0219] Se tomó 1,7-heptanodiol (5 g, 37 mmol) en un matraz de 100 ml y se disolvió en DCM seco seguido de mediante la adición lenta en porciones de PCC (8,9 g, 41,6 mmol) durante 15 min. A continuación, la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. La mezcla de reacción en bruto se filtró a través de una capa de gel de sílice y se lavó con DCM (2x 50 ml). El disolvente orgánico se secó con Na2SO4 y el disolvente se eliminó a presión reducida. El hidroxil aldehído bruto obtenido se usó directamente sin ninguna purificación adicional.
[0220] El hidroxialdehído bruto (1,3 g, 10,0 mmol), ácido decanoico (2,0 g, 12,0 mmol) y EDC (2,8 g, 15,0 mmol) se tomaron en un matraz de 100 ml y se disolvieron en DCM seco y se añadió DMAP (cat.) a 0°C. La mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. A continuación, la mezcla de reacción se lavó con agua, seguido de una solución de salmuera, y se secó sobre Na2SO4 anhidro. La mezcla bruta se purificó mediante cromatografía en columna de sílice (EtOAc: Hexano (05:95) para dar un aceite incoloro con un rendimiento del 90 % (2,4 g).
[0221] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 89,76 (1H, t, J = 1,91 Hz); 4,05 (2H, t, J = 6,76 Hz), 2,43 (2H, dt, J = 7,48, 5,70 Hz); 2,28 (2H, t, J = 7,68 Hz); 1,78-1,52 (8H, m); 1,44-1,33 (4H, m); 1,32-1,20 (12H, m), 0,87 (3H, t, J= 6,62 Hz).
[0222] Masa: 285,8 [M+1]+, 283,8 [M-1]+
(2-(2-(dimetNammo)etN)hidrazma-1,1-diM)bis(heptano-7,1-diM)bis(decanoato) (líp ido 57):
[0223]
Figure imgf000052_0001
[0224] Se disolvieron decanoato de 7-oxoheptil (0,6 g, 2,2 mmol) y clorhidrato de dimetilaminoetilhidrazina (0,18 g, 1,0 mmol) en DCM seco seguido de la adición de trimetilamina (0,1 ml). Se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (0,6 g, 3,0 mmol) a la mezcla de reacción y se agitó durante 24 h a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con una solución de NaHCO3 seguido de una solución de salmuera y se secó sobre sulfato de sodio. La mezcla bruta se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (5:95) para producir 73 % (0,51 g) de (2-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,1 -diil)bis(heptano-7,1 -diil) bis(decanoato) como líquido amarillo pálido
[0225] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 89,28 (1H, t, J = 5,55 Hz); 4,01 (1H, t, J = 6,60 Hz), 3,70 (2H, t, J = 7,70 Hz), 3,30­ 3,20 (3H, m), 2,54 (3H, t, J = 7,55 Hz), 2,33-2,21 (6H, m), 2,20 (s, 6H); 1,80-1,70 (4H, m); 1,37-1,17 (24H, m), 0,83 (6H, t, J = 6,90 Hz).
[0226] ESI-MS: 640 ([M+1]+.
((2-hidroxietM)azanodiM)bis(heptano-7,1-diM)bis(decanoato):
[0227]
Figure imgf000052_0002
[0228] Decanoato de 7-oxoheptilo (1,0 g, 3,7 mmol) y etanolamina (0,11 g, 1,85 mmol) se disolvieron en DCM seco seguido de la adición de triacetoxiborohidruro de sodio (1,1 g, 5,5 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 24 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción se lavó con solución de bicarbonato de sodio seguido de solución de salmuera y se secó sobre sulfato de sodio. La mezcla cruda se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (2:97) para producir 85 % (0,91 g) de ((2-hidroxietil)azanediil)bis(heptano-7,1-diil)bis(decanoato) puro como líquido pálido.
[0229] 1H RMN (400 MHz, CDCl3): 84,05 (4H, t, J = 6,98 Hz); 3,60 (2H, t, J = 5,31 Hz); 2,66 (2H, t, J = 5,31 Hz); 2,54 (4H, t, J= 7,58 Hz); 2,28 (4H, t, J= 7,58 Hz); 1,68-1,54 (8H, m); 1,53-1,41 (4H, m); 1,20-1,40 (32H, m), 0,89 (6H, t, J = 6,80 Hz).
[0230] ESI-EM: 598 ([M+1]+).
((2-((4-(dimetNammo)butanoN)oxi)etN)azanediM)bis(heptano-7,1-diM)bis(decanoato) (lípido 54):
[0231]
Figure imgf000052_0003
[0232] ((2-hidroxietil)azanediil)bis(heptano-7,1-diil)bis(decanoato) (0,4 g, 0,7 mmol) y se tomó ácido 4-(dimetilamino)butanoico (0,17 g, 1,0 mmol) en un matraz de 100 ml y se disolvió en DCM seco. A continuación, se añadió EDCI (0,27 g, 1,4 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DMAp (cat.) y se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con agua barbechada con solución de salmuera y se secó sobre Na2SO4. La mezcla bruta se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCl3 (2:98) para producir 75 % (0,37 g) de ((2-((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)etil)azanodiil)bis(heptano-7,1-diil) bis(decanoato) como líquido pálido
[0233] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 84,11 (2H, t, J = 6,51 Hz); 4,04 (4H, t, J = 6,78 Hz); 2,66 (2H, t, J = 6,51 Hz); 2,43 (4H, t, J = 7,73 Hz); 2,33 (2H, t, J = 7,58 Hz); 2,28 (4H, t, J = 7,58 Hz); 2,21 (6H, s); 1,68-1,54 (6H, m); 1,67-1,52 (8H, m); 1,46­ 1,36 (4H, m); 1,20-1,40 (32H, m), 0,87 (6H, t, J= 6,80 Hz).
[0234] ESI-MS: 711 ([M+1]+).
Síntesis del lípido 24
[0235]
Figure imgf000053_0001
Ácido 2-hexildecanoico:
[0236]
Figure imgf000053_0002
[0237] El LDA recién preparado (9,0 mL, 2 M en THF, 18,0 mmol) en THF (30 ml) se añadió lentamente a una solución de ácido decanoico (2,6 g, 15,3 mmol) y NaH (suspensión de aceite mineral al 60% p/p, 690 mg, 18,0 mmol) en THF (19 mL) a 0 °C y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente. Después de la adición de n-C6H13l (2,6 mL, 18,0 mmol), la mezcla de reacción se agitó durante 6 h a temperatura ambiente. 45°C y luego se extinguió con HCl 1N a temperatura ambiente. La capa orgánica se secó sobre Na2SO4 anhidro y se concentró a presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía en columna de sílice flash (EtOAc:Hex (10:90) para dar (3,7 g, 65%) como un líquido incoloro.
[0238] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 82,38-2,28 (1H, m); 1,69-1,53 (2H, m); 1,50-1,40 (2H, m); 1,36-1,20 (20H, m); 0,87 (6H, t, J= 6,87 Hz).
[0239] Masa: 255 [M-1]+
6,6'-(1-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,2-diil)bis(6-oxohexanoato) de dimetilo:
[0240]
Figure imgf000054_0001
[0241] Se disolvieron adipato de metilo (1,6 g, 10,0 mmol), dimetilaminoetilhidrazina (0,88 g, 5,0 mmol) y EDC (2,8 g, 15,0 mmol) en DCM seco seguido de la adición de trietilamina. La mezcla de reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con agua seguido de una solución de salmuera y se secó sobre sulfato de sodio. La mezcla bruta se purificó por cromatografía en columna (MeOH: CHCh (5:95) para dar un líquido amarillo pálido.
[0242] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 83,66 (3H, s); 3,64 (3H, s); 2,26-2,41 (6H, m); 2,15-2,26 (12H, s); 1,65-1,54 (4H, m); 1,65-1,55 (4H, m).
[0243] Masa: 388 [M+1]+
6,6'-(1-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,2-diil)bis(hexan-1-ol):
[0244]
Figure imgf000054_0002
[0245] Dimetil-6,6'-(1-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,2-diil)bis(6-oxohexanoato) (0,77 g, 2,0 mmol) se disolvió en THF seco seguido de la adición de exceso de LAH (10,0 ml, 2 M en THF, 20,0 mmol). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 24 h, se inactivó mediante la adición lenta de H2O y se filtró y se secó sobre Na2SO4. 6,6'-(1-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,2-diil)bis(hexan-1-ol).
[0246] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 83,62 (4H, t, J = 6,70 Hz); 2,70 (2H, t, J = 6,87 Hz); 2,65 (2H, t, J = 7,10 Hz); 2,50­ 2,60 (4H, m); 2,44 (2H, t, J = 6,91 Hz); 2,29 (6H, s); 1,65-1,45 (6H, m); 1,44-1,25 (8H, m).
[0247] ESI-EM: 304 ([M+1]+).
(1-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,2-diil)bis(hexano-6,1-dMl)bis(2-hexildecanoato) (lípido 24):
[0248]
Figure imgf000054_0003
[0249] 6,6'-(1-(2-(dimetilamino)etil)hidrazina-1,2-diil)bis(hexan-1-ol) (0,30 g, 1,0 mmol) y ácido 2-hexildecanoico (0,50 g, 2,2 mmol, 2 equiv.) se tomaron en un matraz de 50 ml y se disolvieron en DCM seco. que EDC (0,27 g, 1,4 mmol) se añadió a la mezcla de reacción seguido de DMAP (cat.), y la reacción se agitó durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con agua barbechada con solución de salmuera y se secó sobre Na2SO4. La mezcla bruta se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (MeOH: CHCh (5: 95) para producir un compuesto puro al 65 % (0,49 g) como un líquido pálido.
[0250] 1H RMN (400 MHz, CDCI3): 83,72 (4H, t, J= 5,65 Hz); 3,20-3,34 (4H, m); 2,31 (4H, t, J = 6,71 Hz); 2,21 (6H, s); 1,71-1,85 (4H, m); 1,68-1,50 (6H, m); 1,50-1,36 (6H, m); 1,32-1,17 (50H, m), 0,84 (12H, t, J = 6,91 Hz).
[0251] ESI-MS: 780 ([M+1]+).
Síntesis del lípido 56
[0252]
Figure imgf000055_0001
Ácido 6-hidroxihexanoico:
[0253]
Figure imgf000055_0002
[0254] Se disolvió £-caprolactona (2,2 g, 20,0 mmol) en 6 ml de dioxano y se añadieron 50 ml de una solución de NaOH 3M. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La solución se lavó con acetato de etilo para eliminar algunas impurezas orgánicas.La capa acuosa se acidificó a pH 3-4 con HCl concentrado al 37 % y luego se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). La capa orgánica se lavó con NaCl saturado (2 x 50 ml), se secó con Na2SO4 y se filtró. La capa orgánica se concentró al vacío para producir > 90 % (2,0 g) como aceite incoloro.
[0255] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 83,62 (2H, t, J = 6,30 Hz); 2,33 (2H, t, J = 7,45 Hz); 1,63 (2H, pent); 1,55 (2H, q, J = 7,45 Hz); 1,42-1,32 (2H, m).
Ácido 7-oxoheptanoico:
[0256]
[0257] Se añadió IBX (1,0 g, 3,5 mmol, 1,5 eq) a una solución de ácido 6-hidroxihexanoico (0,60 g, 4,5 mmol) en DMSO (10 ml). La mezcla se agitó durante 6 hy se inactivó mediante la adición de agua. El precipitado se eliminó por filtración. La extracción con acetato de etilo (2 x 50 ml), la anhidrificación con Na2SO4 y la eliminación del disolvente al vacío dieron un rendimiento de oxoácido casi puro de 0,46 g (78%) como un aceite incoloro.
[0258] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 89,48 (1H, t, J = 1,57 Hz); 2,33 (2H, t, J = 7,45 Hz); 2,20 (2H, t, J = 7,20 Hz); 2,10­ 1,95 (2H, m), 1,45-1,32 (2H, m).
6-oxohexanoato de (Z)-non-2-en-1-ilo:
[0259]
Figure imgf000056_0001
[0260] Ácido 7-oxoheptanoico (0,26 g, 2,0 mmol) y c/'s-2-nonen-1-ol (0,28 g, 2,0 mmol, 1 equiv.) tomado en un matraz de 50 ml y disuelto en DCM seco y se añadió EDCI (0,27 g, 1,4 mmol) a la mezcla de reacción seguido de DMAP (cat) agitado durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con agua barbechada con solución de salmuera y se secó sobre sulfito de sodio. La mezcla bruta se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (EtOAc: Hexano (5: 95) para producir un 85 % (0,44 g) de compuesto puro como líquido.
[0261] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 89,74 (1H, t, J = 1,69 Hz), 5,68-5,58 (1H, m); 5,54-5,44 (1H, m); 4,60 (2H, d, J = 7,20 Hz); 2,40-2,50 (2H, m); 2,38- 2,28 (2H, m); 2,08 (2H, q, J = 7,70, 6,90 Hz); 1,70-1,60 (4H, m); 1,40-1,20 (8H, m); 0,86 (6H, t, J= 6,95 Hz)
[0262] ESI-MS: 277 ([M+Na]+).
Di((Z)-non-2-en-1-ilo) 6,6'-(2-(terc-butoxicarbonil)hidrazina-1,1-diil)dihexanoato:
[0263]
Figure imgf000056_0002
[0264] (Z)-non-2-en-1-ilo 6-oxohexanoato (0,25 g, 1,0 mmol, 2 equiv.) y Soc-hidrazina (0,06 g, 0,5 mmol, 1,0 equiv.) se disolvieron en DCM seco en atmósfera de nitrógeno, luego se añadió triacetoxiborohidruro de sodio (0,63 g, 3,0 mmol, 3,0 equiv) a la mezcla de reacción y se agitó durante 12 h a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de bicarbonato de sodio y extrajo con DCM seguido de lavado con agua y solución de salmuera. El solvente se evaporó y purificó por cromatografía en columna (EtOAc: Hexano (10:90) para producir 0,21 g (78%) de lípido puro como líquido incoloro.
[0265] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 85,60-5,50 (2H, m); 5,47-5,37 (2H, m); 5,25 (br s, 1H), 4,53 (2H, s), 4,51 (2H, s), 2,65­ 2,42 (4H, m), 2,21 (4H, t, J = 7,50 Hz), 2,00 (4H, q, J = 7,90, 7,11 Hz), 1,54 (4H, pent); 1,32-1,45 (15H, m), 1,30-1,09 (18H, m), 0,79 (6H, t, J = 6,75 Hz).
[0266] ESI-MS: 609 ([M+1]+), 553 ([M-f-Bu]+).
Di((Z)-non-2-en-1-ilo) 6,6'-(hidrazina-1,1-diil)dihexanoato:
[0267]
Figure imgf000057_0001
[0268] El compuesto de hidrazina protegida con Boc anterior (0,25 g, 0,41 mmol) se disolvió en 10 ml de TFA/DCM (2:8) en atmósfera de nitrógeno durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con solución de bicarbonato de sodio y se extrajo con DCM seguido de lavado con agua y solución de salmuera y secado sobre Na2SO4. El disolvente se evaporó para producir, sin más purificación, 0,20 g (99%) de hidrazina pura como un líquido amarillo pálido.
[0269] 1H RMN (400 MHz, CDCh): 85,70-5,58 (2H, m); 5,56-5,42 (2H, m); 4,62 (2H, s), 4,60 (2H, s); 2,44 (4H, t, J = 7,52 Hz); 2,31 (4H, t, J = 7,52 Hz); 2,09 (4H, q, J = 7,52, 7,15 Hz); 1,64 (4H, pent); 1,55 (4H, pent); 1,43-1,20 (18H, m); 0,87 (6H, t, J= 7,15 Hz).
[0270] ESI-MS: 509 ([M+1]+)
Di((Z)-non-2-en-1-ilo) 6,6'-(2-(4-(dimetilamino)butanoil)hidrazina-1,1-diil)dihexanoato (lípido 56):
[0271]
Figure imgf000057_0002
[0272] Di((Z)-non-2-en-1-ilo) 6,6'-(hidrazina-1,1-diil)dihexanoato (0,20 g, 0,4 mmol, 1 equiv.), clorhidrato de ácido N,N- dimetilaminobutírico (0,10 g, 0,6 mmol, 1,5 equiv.), EDC (0,15 g, 0,8 mmol, 2,0 equiv.) y d Ma P (cat.) disuelto en DCM seco bajo atmósfera de nitrógeno. A continuación, se añadió trimetilamina (0,28 ml, 2,00 mmol, 2 equiv.) y la reacción se agitó durante 12 h. A la mezcla de reacción se le añadió bicarbonato de sodio y la mezcla se lavó con agua, seguido de una solución de salmuera y se secó sobre Na2SO4. El solvente se evaporó y la mezcla de reacción se purificó por cromatografía en columna de sílice (MeOH: CHCh (5:95) para producir 85 % (0,20 g) de lípido puro como líquido amarillo pálido.
[0273] 1H RMN (400 MHz, CDCla): 85,67-5,57 (4H, m); 5,57-5,44 (4H, m); 4,61 (4H, t, J= 5,52 Hz); 2,66 (2H, t, J = 8,16 Hz); 2,45 (2H, t, J = 7,47 Hz); 2,40 (2H, t, J = 7,75 Hz); 2,34-2,20 (4H, m); 2,28 (6H, s); 2,08 (4H, q, J= 7,80 Hz); 2,00 -1,90 (4H, m), 1,86-1,76 (2H, m), 1,70-1,55 (4H, m), 1,54-1,40 (4H, m), 1,38-1,20 (14H, m), 0,87 (6H, t, J= 6,92 Hz) [0274] ESI-MS: 622 ([M+1]+)
Ejemplo 3: Caracterización físico-quím ica
[0275]
Figure imgf000057_0003
(Continuación)
Figure imgf000058_0001
Ejemplo 4: Resultados biológicos
[0276] El silenciamiento génico in vitro se realizó como se describe en el Ejemplo 1.
[0277] La Figura 1 representa el efecto de silenciamiento génico in vitro del lípido 1: Las células T humanas SupT1 se trataron con nanopartículas lipídicas (NPL) que comprenden siCD45 encapsulado en lípido catiónico 1 durante 48 h (A) o 72 h (B) a diferentes dosis de siARN (0,4 jiM, 0,2 jiM, 0,1 jiM). Los resultados demuestran la eficacia del lípido 1 para regular a la baja el gen CD45 en células T que son difíciles de transfectar.
[0278] Se trataron células de carcinoma de ovario humano (NAR) resistentes a fármacos con NPL-siPLK-1 o nanopartículas NPL-siLuc Lipid 1 NPL (A); Los NPL de lípidos 10 y 11 (B) durante 72 horas y la expresión de PLK-1 se midió mediante qPCR como se describe en el ejemplo 1. Como se muestra en la Figura 2A, los NPL que contienen lípidos regulan a la baja el protooncogén PLK1 de manera eficiente, esto puede inducir la apoptosis en las células cancerosas. A dosis más altas de cntr LUC-siARN, los NPL con lípido 1 no afectaron la expresión de plk1. Además, como se muestra en la Figura 2B, los lípidos 10 y 11 que contienen NPL-siPLK1 también regulan eficientemente el gen plk1 a diferentes dosis, mientras que siLuC NPL no tiene efecto sobre la expresión de plk1.
[0279] Efecto de silenciamiento génico in vitro del lípido 1 en células NAR: Se trataron células de cáncer de ovario humano (células NAR) con nanopartículas de lípido1/siPLK1 durante 48 h a diferentes concentraciones de siARN (0,2 jiM y 0,1 jiM). Las células apoptóticas se analizaron mediante FACS usando PI/Anexina. Como se muestra en la Figura 3, los siPLK1-NPL con lípido1 inducen apoptosis en células cancerosas debido a la regulación a la baja del protooncogén plk1. El porcentaje de células apoptóticas tempranas fue mayor en las células tratadas con siPLK1-NPL a una dosis de 0,2 uM de siPLK1. No hubo efecto sobre el ciclo celular en las células tratadas con siLUC-NPL, lo que indica la entrega eficiente de siPLK1 a las células NAR.
[0280] Efecto de silenciamiento génico in vitro de los lípidos 10 y 11 en células NAR: Se trataron células de cáncer de ovario humano (células NAR) con nanopartículas de lípido 10 o lípido 11/siPLK1 durante 48 h a diferentes concentraciones de siARN (0,1 jiM y 0,05 jiM). siLUC-NPL utilizados como control negativo. Las células apoptóticas se analizaron mediante FACS usando PI/Anexina. Como se muestra en la Figura 4, los siPLK1-NPL compuestos por lípidos 10 o lípidos 11 regulan eficientemente el gen PLK1 seguido de la inducción de la apoptosis en las células NAR.
[0281] Se trataron células de carcinoma de ovario humano (OVCAR 8) con NPL que contenían lípido 1 con siPLK1 o siLUC durante 72 h y se midió la expresión de PLK-1 mediante qPCR. Como se muestra en la Figura 5, el lípido 1 que contiene siPLK1-NPL regula eficientemente el gen PLK1 en comparación con los NPL que contienen dlin-mc3-dma.
[0282] Se trataron esferoides de células de carcinoma de ovario humano (NAR) resistentes a fármacos con NPL compuestos de lípido 1 y con siPLK-1 o siLuc s durante 72 h y se midió la expresión de PLK-1 mediante qPCR. Los esferoides son cultivos 3D de células tumorales que imitan tumores in vivo. Como se muestra en la Figura 6, los siPLK1-NPL que contienen lípidos regulan significativamente a la baja el gen PLK1 en comparación con los siLUC-NPL, lo que indica la eficacia de los lípidos 1 para entregar el siARN en los esferoides NAR.
[0283] Se incubaron células de carcinoma de colon humano (HCT116) con NPL con ctl siARN (ver métodos) durante 72 horas. La viabilidad celular se midió mediante ensayo XTT. La toxicidad de los NPL compuestos por el lípido 38 o el lípido 55 se compara con los NPL estándar de oro compuestos por Dlin-MC3-DMA. Como se muestra en la Figura 7, los NPL compuestos por el lípido 38 o el lípido 55 son menos tóxicos que los NPL compuestos por Dlin-MC3-DMA en función de la dosis.
[0284] Efectos de silenciamiento génico in vitro de los lípidos 38 y 55. Se incubaron células en suspensión de mieloma múltiple humano (U266) con NPL que contenían siPLK1 a diferentes concentraciones durante 48 horas. La expresión de PLK1 se midió por qPCR. Los niveles de ARNm de PLK1 se normalizaron con respecto a las células tratadas con siARN de LNPs-ctl. Como se muestra en la Figura 8, el gen PLK1 se reguló eficientemente en células tratadas con siPLK1-NPL compuestas de lípido 38 o lípido 55 y comparables a Dlin-MC3-DMA NPL.
[0285] Efecto de la regulación negativa de PLK1 en la supervivencia de células de mieloma múltiple: Se incubaron células
en suspensión de mieloma múltiple humano (U266) con siPLK1-NPL o siCtl-NPL compuestas de ya sea el lípido 38 o 55 a diferentes concentraciones durante 48 horas. La viabilidad celular afectada por la regulación negativa de p LK1 se midió mediante el ensayo XTT. Como se muestra en la Figura 9, los NPL siPLK1 compuestos por el lípido 38 o el lípido 55 tienen más efecto sobre la viabilidad celular en comparación con los NPL Dlin-MC3-DMA debido a la regulación negativa eficiente del gen PLK1, mientras que los siCtl-NPL no tienen efecto sobre la viabilidad celular indicando el uso seguro de nuevos lípidos.
[0286] Efecto del silenciamiento de PLK1 sobre la viabilidad del linfoma de células B: Se incubaron células en suspensión de linfoma de células B humanas (RPMI-8226) con siPLK1-NPL o siCtl-NPL compuestas por lípido 38 o 55 a diferentes concentraciones durante 48 horas. La viabilidad celular afectada por la regulación negativa de PLK1 se midió mediante el ensayo XTT. Como se muestra en la Figura 10, los siPLK1-NPL compuestos por el lípido 38 o el lípido 55 exhiben un efecto dependiente de la dosis sobre la viabilidad de las células cancerosas del linfoma de células B debido a la regulación negativa eficiente del gen PLK1, mientras que los siCtl-NPL no tienen efecto sobre la viabilidad celular.
[0287] Efecto del silenciamiento de PLK1 sobre la viabilidad celular: se incubaron células en suspensión de mieloma múltiple humano (MM1) con siPLK1-NPL o siCtl-NPL compuestas por lípido 38 o 55 a diferentes concentraciones durante 48 horas. La viabilidad celular afectada por la regulación negativa de PLK1 se midió mediante el ensayo XTT. Como se muestra en la Figura 11, los siPLK1-NPL compuestos por el lípido 38 o el lípido 55 exhiben un efecto dependiente de la dosis sobre la viabilidad de las células de cáncer de mieloma múltiple debido a la regulación negativa de PLK1, mientras que los siCtl-NPL no tienen efecto sobre la viabilidad celular.
[0288] Expresión in vitro de pADN: Se incubaron células de carcinoma de colon humano (HCT 116) con LNPs-LUC pADN a diferentes concentraciones durante 48 horas. La expresión de luciferasa se midió con un luminómetro. Se usó Lipofectamine 2000 (Lipo 2000) como control positivo. Los NPL estaban compuestos por el lípido 38 y diferentes cantidades de colípido DOPE, junto con otros colípidos como Chol, PEG-DMG. Como se muestra en la Figura 12, los NPL-ADNp compuestos por el lípido 38 administran pADN de manera eficaz al núcleo. La cantidad de expresión de luciferasa fue similar a la del control positivo lipo 2000.
[0289] Expresión in vitro de pADN en células HEK 293: Las células HEK se trataron con NPL compuestas por lípido 1 o lípido 10 encapsuladas con mKATE-ADNp a una concentración de 0,6nM ADNp. Después de 72 h, la expresión de mKATE se analizó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 13, los NPL compuestos por el lípido 1 o el lípido 10 entregaron eficientemente el ADNp al núcleo y se observó expresión de mKATE, mientras que los NPL Dlin-MC3-DMA no mostraron ningún efecto sobre la expresión de mKATE.
[0290] Expresión dependiente de la dosis de pADN en células HEK 293: las células HEK se trataron con NPL compuestas de lípido 1 o lípido 10 encapsuladas con mKATE-ADNp en diferentes cantidades de pADN. Después de 72 h, la expresión de mKATE se analizó mediante citometría de flujo. Como se muestra en la Figura 14A, los NPL-ADNp compuestos por el lípido 1 no mostraron ninguna expresión dependiente de la dosis, pero como se muestra en la Figura 14B, los NPL que contenían el lípido 10 mostraron una expresión de mKATE dependiente de la dosis.
[0291] Suministro in vitro de ARNm: Se trataron células de macrófagos murinos difíciles de transfectar (RAW 264,7) con NPL compuestas por Lípido 38 o Lípido 54 y se formularon con ARNm de luciferasa en diferentes cantidades de ARNm. Después de 18 horas, se midió la expresión de luciferasa con un luminómetro. Como se muestra en la Figura 15, la expresión de luciferasa se observó en células tratadas con 38-NPL de lípidos de manera eficiente en comparación con 54-NPL de lípidos, además se observó una expresión dependiente de la dosis en NPL que contenían lípido 38.
[0292] Suministro in vivo de ARNm a células musculares: NPL compuestos por lípido 54 o lípido 38 formulados con ARNm de luciferasa se administraron por vía intramuscular a ratones C57BL6/j a 1 mg/kg de peso corporal. La expresión de luciferasa se midió mediante el sistema de formación de imágenes por bioluminiscencia Biospace: (a) después de 8 horas de administración i.m.; y (b) después de 24 horas. Como se muestra en la Figura 16, se observaron cantidades significativas de luciferasa después de 8 horas de administración para ambos NPL compuestos por el lípido 38 o el lípido 54. La expresión seguía siendo alta 24 horas después de la administración de los NPL, lo que indica la eficiencia de estos lípidos en la entrega de ARNm in vivo.
[0293] Suministro in vivo de ARNm al hígado: NPL compuestos por lípido 54 o lípido 38 formulados con ARNm de luciferasa se administraron por vía intravenosa en ratones C57BL6/j a 1 mg/kg de peso corporal. Después de 8 h, se midió la expresión de luciferasa mediante el sistema de formación de imágenes por bioluminiscencia Biospace. Como se muestra en la Figura 17, los ratones tratados con NPL compuestos por lípido 38 y ARNm mostraron una cantidad significativa de luciferasa en hígado de ratón en comparación con NPL compuestos por lípido 54.
[0294] Suministro in vivo de ARNm al hígado: NPL compuestos por lípido 38 formulados con El ARNm de luciferasa se administró por vía intravenosa en ratones C57BL6/j a 1 mg/kg de peso corporal. Después de 8 horas y 24 horas de administración, la expresión de luciferasa se midió mediante el sistema de imágenes por bioluminiscencia Biospace. Como se muestra en la Figura 18, se observó una cantidad significativa de expresión de luciferasa en el hígado. Además, la expresión de luciferasa fue alta después de 8 h en comparación con después de 24 h.
[0295] Figura 19: demuestra que no hay toxicidad hepática en primates no humanos en comparación con MC3. Los monos Cynomolgus (n = 2 por grupo, machos) recibieron una única administración intravenosa (1 ml/kg) de (0,5 mg/kg) de partículas MC3 con siNC5 y partículas basadas en lípidos 38 con siNC5 (0,5 mg/kg). A las 1 y 24 h después de la administración, se recogió suero y se analizó para determinar ALT, AST (mediante el analizador Roch Cobra Auto). Cada punto de datos es un promedio de 2 animales ± SEM.
[0296] Aunque la presente invención se ha descrito en particular, los expertos en la materia apreciarán que se pueden realizar muchas variaciones y modificaciones.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un lípido catiónico que está representado por la estructura de fórmula (I), fórmula (II) o fórmula (III), que incluye sales, hidratos, solvatos, polimorfos, isómeros ópticos, isómeros geométricos, enantiómeros, diastereómeros y mezclas de los mismos, donde la estructura de fórmula (I), fórmula (II) y fórmula (III) se representa a continuación:
Figure imgf000061_0001
donde
Y es O o NH;
T es C o S;
W es un enlace o NH;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) alquilo C10-C22;
(b) alquenilo C10-C22;
(c) alquinilo C10-C22;
(d) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22; y
(e) alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22;
Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
Figure imgf000061_0002
donde
A es
Figure imgf000062_0001
X' es O o NH;
Y' es O o NH;
con la condición de que cuando A es
Figure imgf000062_0002
X' e Y' no pueden ser ambos O;
T es C o S;
W es un enlace, O, NH o S;
R1 se selecciona del grupo que consiste en:
(a) NR4R5 en donde R4 y R5 son cada uno independientemente un alquilo C1-C4; o R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros, que contiene opcionalmente uno o más heteroátomos adicionales seleccionados del grupo que consiste en O, N y S; o NR4R5 representan un grupo guanidina (-NHC(=NH)NH2);
(b) la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
(c) un anillo heterocíclico o heteroaromático de 5 o 6 miembros que contiene uno o más heteroátomos seleccionados del grupo que consiste en O, N y S;
R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste en:
(a) alquilo C10-C22;
(b) alquenilo C10-C22;
(c) alquinilo C10-C22;
(d) alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22; y
(e) alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22;
Z es -O-C(=O)-, -C(=O)-O- o -O-;
n es 0, 1,2, 3, 4, 5 o 6;
m es 0 o 1;
p es 0 o 1; y
z es 0 o 2;
Figure imgf000062_0003
donde
X e Y son cada uno independientemente O, N o NH;
cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; y
n es de 1 a 30.
2. El lípido catiónico según la reivindicación 1, que está representado por la estructura de fórmula (I).
3. El lípido catiónico según la reivindicación 2,
en donde m es 0; o
donde m es 1; o
donde p es 0; o
donde p es 1; o
donde m es 0 y p es 0; o
donde m es 1 y p es 0; o
donde z es 0; o
donde z es 2; o
donde T es C; o
donde W es un enlace; o
donde R1 es NR4R5
4. El lípido catiónico según la reivindicación 2, en donde p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (la):
Figure imgf000063_0001
en la que R1, R2, R3, Y, m, n y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (I);
preferiblemente donde m es 0; o
donde m es 1; o
donde z es 0; o
donde R2 y R3 son cada uno independientemente un alquilo C14-C20 o un alquenilo C14-C20; o
donde R2 y R3 son cada uno independientemente un alquileno C4-C10-Z-alquilo C4-C22 o un alquileno C4-C10-Z-alquenilo C4-C22 donde Z es -O-c(= O)-, -C(=O)-O- o -O-; o
donde Y es O; o
donde Y es NH.
5. El lípido catiónico de acuerdo con la reivindicación 4, donde R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (Ia-1):
Figure imgf000063_0002
donde R2, R3, R4, R5, Y, m, n y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (I); preferiblemente donde R4 y R5 son cada uno CH3, o donde R4 y R5 junto con el nitrógeno al que están unidos forman un anillo heterocíclico seleccionado del grupo que consiste en pirrolidinil piperidininilo y piperazinilo, cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido con un alquilo.
6. El lípido catiónico según la reivindicación 1, que está representado por la estructura de fórmula (II).
7. El lípido catiónico según la reivindicación 6, en donde m es 0; o
donde m es 1; o
donde z es 0; o
donde z es 2; o
donde p es 0.
8. El lípido catiónico de acuerdo con la reivindicación 6, que está representado por la estructura de fórmula (IIa):
Figure imgf000064_0001
donde R1, R2, R3, X', T, W, n, m, p y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (II); preferiblemente donde p es 0, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-1):
Figure imgf000064_0002
donde R1, R2, R3, X', n, m y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (II);
más preferiblemente donde R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-2):
Figure imgf000064_0003
donde R2, R3, R4, R5, X', n, m y z son como definido en la reivindicación 1 para la fórmula (II); o
donde p es 1, m es 1, W es un enlace y T es C, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-3):
Figure imgf000065_0001
donde R1 es la cadena lateral de un aminoácido natural o no natural; y
R2, R3, X', n y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (II); o
donde p es 0, R1 es NR4R5, W es un enlace, m es 0 y X' es O, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIa-4):
Figure imgf000065_0002
donde R2, R3, R4, R5, n y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (II).
9. El lípido catiónico de conformidad con la reivindicación 6, que está representado por la estructura de fórmula (IIb):
Figure imgf000065_0003
en la que R1, R2, R3, T, W, X', Y' n, m, p y z son como se definen en la reivindicación 1 para fórmula (II) preferiblemente
en la que p es 0, W es un enlace, T es C y R1 es NR4R5, y el compuesto está representado por la estructura de fórmula (IIb-1):
Figure imgf000065_0004
en la que R2, R3, R4, R5, X', Y', n, m y z son como se definen en la reivindicación 1 para la fórmula (II).
10 El lípido catiónico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se selecciona del grupo que consiste en:
2-(1,2-di((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-il)hidrazinil)-N,N-dimetiletano-1-amina;
4-(1,2-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)-N,N-d¡met¡lbutan-1-amma;
1-(4-(1,2-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡ml)but¡l)p¡rrol¡d¡na;
N,N-d¡met¡l-4-(((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)(((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1 -¡l)ox¡)am¡no)butan-1 -am¡na; 4-(d¡met¡lam¡no)-N'-('(Z)-octadec-9-en-1-¡l)-N-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)butanoh¡draz¡da;
4-((d¡((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)ox¡)-N,N-d¡met¡lbutan-1-am¡na;
1- (4-(2,2-d¡((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)but¡l)p¡rrol¡d¡na;
4-((((6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatr¡aconta - 6,9,28,31-tetraen-19-¡l)am¡no)ox¡)-N,N-d¡met¡lbutan-1-am¡na;
2- ((d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)ox¡)-N,N-d¡met¡l-2-oxoetan-1-am¡na;
4-(d¡met¡lam¡no)-N,N-d¡e(9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)butanoh¡draz¡da;
(5)-2-am¡no-6-(d¡met¡lam¡no)-N',N'-d¡((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)hexanoh¡draz¡da;
4-(2,2-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)-N,N-d¡met¡lbutan-1-amma;
1- ((S)-4-am¡no-5-(2,2-d¡((9Z72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)-5-oxopent¡l)guan¡d¡na;
4-((d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)ox¡)-N,N-d¡met¡l-4-oxobutan-1-am¡na;
2- (2,2-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)-N,N-d¡met¡letano-1-amma;
4-(d¡met¡lam¡no)-N-((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)-N-(((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1 -¡l)ox¡)butanam¡da; N',N'-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)-4-(p¡rrol¡d¡n-1-¡l)butanoh¡draz¡da;
(S)-2-am¡no-3-(1H-¡m¡dazol-4-¡l)-N,N-d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)propanoh¡draz¡da;
N,N-d¡met¡l-2-(2-((Z)-octadec-9-en-1-¡l)-1-((9Z,l2Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)etan-1-am¡na;
N,N-d¡met¡l-2-(1-((9Z, 72Z)-octadeca-9,12-d¡en-12-d¡en-1-¡l)-2-octadec¡lh¡draz¡n¡l)etan-1-am¡na;
4-(4-met¡lp¡peraz¡n-1-¡l)-N,N-d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)butanoh¡draz¡da;
0 - (4-(4-met¡lp¡peraz¡n-1-¡l)butano¡l)-N,N-d¡((9Z,12)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡drox¡lam¡na;
(2-(4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)b¡s(hexano-6,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
(1-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,2-d¡¡l)b¡s(hexano-6,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
(1-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,2-d¡¡l)b¡s(nonano-9,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
d¡(tr¡decan-7-¡lo) 10,10'-(1-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,2-d¡¡l)b¡s(decanoato);
(2-(4-(d¡met¡lam¡no)but¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)b¡s(hexano-6,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
(2-(4-(d¡met¡lam¡no)but¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)b¡s(nonano-9,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
((4-(d¡met¡lam¡no)butox¡)azanod¡¡l)b¡s(hexano-6,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
((4-(d¡met¡lam¡no)butox¡)azanod¡¡l)b¡s(nonano-9,1-d¡¡l)b¡s(2-hex¡ldecanoato);
4-(2-(2,2-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)et¡l)-1H-¡m¡dazol;
1- (2-(2,2-d¡((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡draz¡n¡l)et¡l)guan¡d¡na;
0 - (2-(1H-¡m¡dazol-4-¡l)acet¡l)-N,N-d¡((9Z,72Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)h¡drox¡lam¡na;
1- (2-((d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)ox¡)-2-oxoet¡l)guan¡d¡na;
2- (d¡((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo 2-(1H-¡m¡dazol-4-¡l)acetato
2-(d¡((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo carbam¡m¡do¡lgl¡c¡nato;
2-(d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo d¡met¡lgl¡c¡nato;
2-(d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo 4-(d¡met¡lam¡no)butanoato;
2-(d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo L-h¡st¡d¡nato;
(1-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,2-d¡¡l)b¡s(octano-8,1-d¡¡lo) (4Z,4'Z)-b¡s(2-hex¡ldec-4-enoato);
(l-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,2-d¡¡l)b¡s(octano-8,1-d¡¡lo) (3Z,3'Z)-b¡s(non-3-enoato);
d¡((Z)-non-3-en-1-¡lo) 8,8'-(2-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-pentadec-9-en-7-¡lo) 8,8'-(2-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-pentadec-9-en-7-¡lo) 8,8'-(((4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)ox¡)azanod¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-non-3-en-1-¡lo) 8,8'-(((4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)ox¡)azanod¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-pentadec-9-en-7-¡lo) 8,8'-(2-(((2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)t¡o)carbon¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)d¡octanoato; d¡(tr¡decan-7-¡lo) 8,8'-(2-(((2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)t¡o)carbon¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-pentadec-9-en-7-¡lo) 8,8'-((2-((d¡met¡lgl¡c¡l)ox¡)et¡l)azanod¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-non-3-en-1-¡lo) 8,8'-((2-((4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)ox¡)et¡l)azanod¡¡l)d¡octanoato;
d¡((Z)-non-3-en-1-¡lo) 8,8'-((2-((carbam¡m¡do¡lgl¡c¡l)ox¡)et¡l)azanod¡¡l)d¡octanoato;
8,8'-((2-((4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)ox¡)et¡l)azanod¡¡l)d¡octanoato de d¡(tr¡decan-7-¡lo);
((2-((4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)ox¡)et¡l)azanod¡¡l)b¡s(octano-8,1-d¡¡l) (3Z,3'Z)-b¡s(non-3-enoato);
((2-((4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)ox¡)et¡l)azanod¡¡l)b¡s(heptano-7,1-d¡¡l)b¡s(decanoato);
2-(d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo 4-(4-met¡lp¡peraz¡n-1-¡l)butanoato;
d¡((Z)-non-3-en-1-¡lo) 6,6'-(2-(4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)d¡hexanoato
6,6'-(2-(4-(d¡met¡lam¡no)butano¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)d¡hexanoato;
(2-(2-(d¡met¡lam¡no)et¡l)h¡draz¡na-1,1-d¡¡l)b¡s(heptano-7,1-d¡¡l)b¡s(decanoato); (9Z,12Z)-N-(2-(4-(d¡met¡lam¡no)butox¡)et¡l)-N-((9Z,12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)octadeca-9,12-d¡en-1-am¡na;
4-(d¡met¡lam¡no)-N',N'-b¡s(6-(((Z)-non-3-en-1-¡l)ox¡)hex¡l)butanoh¡draz¡da;
4-(p¡rrol¡d¡n-1-¡l)butanoato de 2-(d¡((9Z12Z)-octadeca-9,12-d¡en-1-¡l)am¡no)et¡lo;
N-(2-(4-(d¡met¡lam¡no)butox¡)et¡l)-6-(((Z)-non-3-en-1-¡l)ox¡)-N-(6-(((Z)-non- 3-en-1-¡l)ox¡)hex¡l)hexan-1-am¡na; ((2-(4-(d¡met¡lam¡no)butox¡)et¡l)azanod¡¡l)b¡s(heptano-7,1-d¡¡l)b¡s(decanoato); y
d¡((Z)-non-3-en-1-¡lo) 6,6'-((2-(4-(d¡met¡lam¡no)butox¡)et¡l)azanod¡¡l)d¡hexanoato.
11. El líp¡do cat¡ón¡co de conform¡dad con la re¡v¡nd¡cac¡ón 1, que está representado por la estructura de fórmula (III), donde preferentemente el lípido catiónico se selecciona del grupo que consiste en:
Figure imgf000067_0002
12. El lípido catiónico según la reivindicación 1, que está representado por la estructura de fórmula (MIA):
Figure imgf000067_0001
en la que
X e Y son cada uno independientemente O, N o NH, donde X e Y no pueden ser ambos O; cada uno de R1, R2 y R3 está independientemente ausente o es un alquilo C10-C22, un alquenilo C10-C22 o un alquinilo C10-C22; n es un número entero entre 1 y 30; y
x es 0 o 2.
13. Una composición que comprende un lípido catiónico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, comprendiendo opcionalmente la composición además al menos un lípido adicional neutro o modificado con PEG y/o un ácido nucleico.
14. Una composición según la reivindicación 13, que comprende ARN mensajero (ARNm).
15. Una composición de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, para usar en el tratamiento de una afección asociada a los leucocitos, en la que la afección asociada a los leucocitos se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en cáncer, infección, enfermedades autoinmunes, enfermedades neurodegenerativas e inflamación, o para usar en enfermedades génicas. silenciamiento, o para expresar una proteína codificada por el ARN mensajero (ARNm).
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