ES2928223T3 - Selección y uso de bacterias de apoyo a la melatonina para reducir los cólicos infantiles - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a cepas bacterianas de ácido láctico que son capaces de producir o inducir la producción de melatonina, para su uso en la producción de melatonina en un sujeto. Las cepas preferidas para dichos usos son capaces de producir o inducir la producción de adenosina. Los usos terapéuticos de dichas cepas incluyen el tratamiento o la prevención de enfermedades asociadas con la deficiencia de melatonina, por ejemplo, el cólico infantil. También se proporcionan nuevas cepas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Selección y uso de bacterias de apoyo a la melatonina para reducir los cólicos infantiles
Campo de la invención
La presente invención proporciona determinadas cepas de bacterias Lactobacillus reuteri seleccionadas por su capacidad de aumentar los niveles de melatonina para la profilaxis y/o el tratamiento de los cólicos (u otras enfermedades asociadas con niveles reducidos de melatonina), incluida la capacidad de producir precursores y otros componentes importantes para la liberación de melatonina, un método para seleccionar dichas cepas y productos que contienen dichas cepas. Además, esta invención se refiere a preparaciones que comprenden el componente de sustrato AMP que se selecciona específicamente para mejorar la eficacia de dichas cepas.
Antecedentes de la invención
A pesar de su relevancia en términos de frecuencia y malestar, todavía no se conocen bien la naturaleza ni las causas de los cólicos infantiles. También se utilizan diferentes expresiones para describir la afección. Estas expresiones incluyen “cólicos infantiles” , “cólicos vespertinos” porque el dolor se limita principalmente a la noche y “cólicos de los tres meses” con el pretexto de que desaparecen aproximadamente a los tres meses del nacimiento. Diferentes autores han utilizado diferentes definiciones. La definición de Wessels de que los cólicos son paroxismos de llanto durante tres o más horas al días durante tres días o más a la semana, durante un período de al menos tres semanas ha sido mayoritariamente aceptada en la bibliografía. En 2006, se publicaron los criterios de Roma III modificando este criterio para considerar el diagnóstico de los “cólicos infantiles” aplicable a lactantes con paroxismos de irritabilidad, molestias o llanto que comienzan y cesan sin causa aparente, con una duración de 3 o más horas al día y que se producen al menos 3 días a la semana, pero durante al menos 1 semana (a veces denominado criterio de Wessel modificado). Perfeccionándose la definición en los criterios de Roma IV; (Benninga y col.; Gastroenterology 2016;150:1443-1455). Cualquiera de estas definiciones (Roma III o Roma IV) es pertinente para la presente invención.
Hasta la fecha, los principales factores causales analizados de los cólicos infantiles se han dividido en: psicosociales, gastrointestinales, incluida la disbiosis microbiana, y trastornos del neurodesarrollo.
Los factores psicosociales incluyen: variantes del llanto normal, efectos conductuales de crianza atípica y manifestación de problemas en la interacción padre-hijo.
Los trastornos gastrointestinales se han incluido en los cólicos debido a la posición de las piernas del lactante y a las muecas durante un ataque de llanto. A continuación, se revisan brevemente los factores gastrointestinales:
Las técnicas de alimentación inadecuadas, como la alimentación con biberón, la alimentación en posición horizontal y la ausencia de eructos tras la alimentación, se han considerado como factores causales. Se ha descubierto que la lactancia materna en los primeros seis meses es un factor protector. El riesgo de padecer cólicos infantiles es 1,86 veces mayor entre los lactantes no amamantados (Saavedra M. A., Dacosta J. S., Garcias G., Horta B. L., Tomasi E., Mendoca R. “ Infantile colic incidence and associated risk factors: a cohort study” . Pediatr (Rio J) 2003; 79(2): 115-122).
En la actualidad, no existe una cura completa para los cólicos. El paradigma de tratamiento actual para los cólicos consiste en métodos farmacológicos y/o no farmacológicos, que proporcionan, en el mejor de los casos, una reducción de los síntomas. Las intervenciones terapéuticas típicas para los cólicos que se ofrecen a los padres se dividen en cuatro categorías, que incluyen, dietética, física, conductual y farmacológica. Las manipulaciones dietéticas incluyen asesoramiento profesional sobre diversas técnicas de alimentación, o el uso de leche hipoalergénica, fórmulas sin soja o sin lactosa, complementos alimenticios como diversos probióticos y prebióticos, y una introducción precoz de los sólidos.
Una medicación sin receta para el tratamiento de los cólicos ha incluido en gran medida la administración de simeticona o dimetilpolisiloxano, un fármaco de venta sin receta, no absorbible, que reduce el tamaño de las burbujas de gas intestinal. La simeticona tiene un perfil seguro y se recomienda con frecuencia, a pesar de que son varios los estudios que demuestran que la eficacia de la simeticona en los cólicos infantiles no es mejor que la del placebo.
Ha habido algunos informes que implican un patrón de microbiota alterado en los lactantes con cólicos, lo que ha hecho que varios investigadores realicen y publiquen diferentes ensayos clínicos controlados aleatorios (ECA), donde se ha evaluado la capacidad de, por ejemplo, Lactobacillus reuteri DSM 17938 para reducir el tiempo de llanto en estos lactantes. Por ejemplo, Savino y col. (Pediatrics 2010;126:e526-33) realizó un ECA en 2010 para probar la eficacia de esta cepa en los cólicos infantiles. Se distribuyeron aleatoriamente cincuenta lactantes con cólicos alimentados exclusivamente con leche materna, diagnosticados según los criterios de Wessel modificados, para recibir L reuteri DSM 17938 (108 unidades formadoras de colonias) o placebo diariamente durante 21 días. Los cuestionarios para los padres registraron el tiempo de llanto diario y los efectos adversos. Cuarenta y seis lactantes
(grupo de L reuterí: 25; grupo de placebo: 21) completaron el ensayo. Los tiempos de llanto diarios en minutos/día (mediana) fueron 370 frente a 300 el día 0 y 35,0 frente a 90,0 (p = 0,022) el día 21.
En 2013, Szajewska y col. (J Pediatr 2013;162:257-62) publicaron con un diseño similar un ECA en 80 lactantes < 5 meses, identificando que la tasa de lactantes que respondieron al tratamiento fue significativamente mayor en el grupo de probiótico en comparación con el grupo de placebo. Los minutos/día (mediana) fueron 180 frente a 180 el día 7, 75 frente a 128 el día 14 y 52 frente a 120 (p < 0,05) el día 21. También ha habido otros diversos estudios que muestran el efecto de L. reuteri DSM 17938 en lactantes con cólicos para reducir significativamente el tiempo de llanto en lactantes amamantados. Sin embargo, existe la necesidad de intervenciones aún más eficaces para reducir el llanto a una mayor tasa en los niños con cólicos, incluso a una mayor tasa en los niños alimentados con fórmula.
Por lo tanto, actualmente existe la necesidad de nuevos (y preferiblemente mejores) compuestos y composiciones seguros y eficaces, así como de técnicas que demuestren ser útiles para tratar los cólicos en lactantes. Las composiciones y los métodos de la presente invención responden a esta necesidad, proporcionando productos que pueden prevenir y tratar de forma segura y eficaz los cólicos (o los síntomas asociados con los cólicos) en lactantes.
Otros objetos y ventajas serán más evidentes a partir de la siguiente descripción.
Sumario de la invención
La inmadurez hormonal de los recién nacidos se incluye como un factor importante en los problemas precoces del desarrollo de la motilidad intestinal y, por lo tanto, también provoca dolor y llanto en el lactante, tal como en los cólicos infantiles. La melatonina es una hormona que tiene la capacidad de mantener los ritmos biológicos, y tiene efectos importantes en muchas funciones de los seres humanos y los animales. Un precursor de la melatonina es la serotonina, un neurotransmisor en sí mismo que se puede obtener del aminoácido triptófano.
La melatonina es un neurotransmisor que antes se pensaba que era secretado predominantemente por la glándula pineal. Sin embargo, existen sitios extrapineales de producción de melatonina, tales como la retina y el tracto gastrointestinal.
La sincronización entre la producción y los diferentes ritmos circadianos y la posterior liberación de serotonina y melatonina en lactantes de pocos meses puede ser importante para evitar alteraciones de la motilidad intestinal y dolor, como los cólicos infantiles (CI).
La serotonina aumenta la contracción del músculo liso intestinal y la melatonina relaja el músculo liso intestinal. Los máximos de concentración de serotonina pueden provocar calambres intestinales si no se equilibran con otros agentes, de los cuales la melatonina es importante. Tanto la serotonina como la melatonina tienen ritmos circadianos. Si bien se produce serotonina y se desarrollan ritmos circadianos de serotonina cuando nace un lactante, la producción endógena de melatonina y el ritmo circadiano de melatonina en muchos lactantes no están listos para comenzar hasta después del tercer mes de vida. Este tiempo coincide con el tiempo de desaparición normal de los cólicos infantiles.
Se puede decir que los cólicos infantiles es una afección de deficiencia de melatonina. Por lo tanto, se ha sugerido administrar melatonina exógena a los lactantes con CI, pero muchos médicos y padres son reacios a administrar hormonas a un lactante.
De todos los niños recién nacidos, hay una frecuencia estimada del 5 % al 25 % de CI, lo que es, en varios sentidos, oneroso y costoso para la sociedad, los padres y el propio lactante.
Por tanto, aunque algunos niños parecen capaces de producir y liberar la melatonina necesaria de sus alimentos y/o de sus bacterias intestinales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de desarrollar cólicos infantiles, hay muchos otros que no lo hacen y que, por lo tanto, necesitan apoyo adicional para prevenir o tratar los CI.
Por tanto, existe la necesidad de encontrar y desarrollar productos y métodos para apoyar la producción y liberación de melatonina en niños con riesgo de desarrollar CI o que tienen CI.
La presente invención se basa en el descubrimiento de que se pueden seleccionar bacterias, por ejemplo, bacterias acidolácticas, que son capaces de producir adenosina. Las bacterias acidolácticas que producen adenosina no se han informado en la técnica, y dichas bacterias se pueden utilizar, por ejemplo, para aumentar la producción de arilalquilamina-N-acetiltransferasa (AANAT), la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de melatonina. Aunque la enzima AANAT se encuentra en la glándula pineal, también se produce en los sitios extrapineales de producción de melatonina, tales como en el tracto gastrointestinal. Por tanto, un aumento en la producción de AANAT (por ejemplo, mediante un aumento en la producción de adenosina) proporciona un medio para aumentar la producción de melatonina o aumentar los niveles de melatonina en el tracto gastrointestinal. Por tanto, dichas bacterias se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de cólicos infantiles u otras enfermedades asociadas o caracterizadas por una producción o síntesis de melatonina reducida, baja o deficiente.
Las realizaciones de la presente invención se definen en las reivindicaciones.
En un aspecto, la presente invención proporciona una cepa bacteriana, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 o DSM 33198.
En otro aspecto, la presente invención proporciona una cepa bacteriana de la invención para su uso en terapia. En otro aspecto, la presente invención proporciona una cepa bacteriana de la invención para su uso en el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles en un sujeto.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para la selección de una cepa de bacterias acidolácticas capaz de producir adenosina, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri y en donde dicho método comprende:
a) cribar una cepa de bacterias acidolácticas para detectar la presencia de un gen que codifica una 5'-nucleotidasa, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri; y/o
b) cribar una cepa de bacterias acidolácticas, o su sobrenadante, para detectar la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri; y
c) seleccionar una cepa de Lactobacillus reuteri que produce adenosina a un nivel mayor en comparación con Lactobacillus reuteri DSM 17938; y opcionalmente
d) cultivar o propagar dicha cepa de Lactobacillus reuteri.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un producto combinado adecuado para aumentar la producción de melatonina o adenosina en un sujeto que comprende:
(i) una primera cepa de Lactobacillus reuteri capaz de inducir la producción de melatonina o de producir adenosina, en donde dicha cepa es una cepa de la presente invención; y
(ii) un componente de sustrato para aumentar o potenciar la inducción de la producción de melatonina y/o la producción de adenosina por dicha cepa de Lactobacillus reuteri, en donde dicho componente de sustrato es AMP
Por tanto, las cepas bacterianas de la invención son capaces de producir adenosina y se pueden utilizar en la producción de adenosina (p. ej., aumentando los niveles de adenosina, o aumentando o promoviendo la producción de adenosina) en un sujeto, o en la producción de melatonina (p. ej., aumentando los niveles de melatonina, o aumentando o promoviendo la producción de melatonina) en un sujeto.
La adenosina o la melatonina se pueden producir (p. ej., se pueden aumentar los niveles de adenosina o melatonina, o se puede aumentar o promover la producción de adenosina o melatonina) en un sujeto, mediante la administración de una cantidad eficaz de una cepa bacteriana de la invención, que es capaz de producir adenosina, a dicho sujeto. Las cepas bacterianas de la invención son capaces de inducir la producción de melatonina. Por tanto, dichas cepas bacterianas se pueden utilizar para la producción de melatonina, por ejemplo, para aumentar la producción o los niveles de melatonina en un sujeto.
La melatonina se puede producir (p. ej., se pueden aumentar los niveles de melatonina, o se puede aumentar o promover la producción de melatonina) en un sujeto mediante la administración de una cantidad eficaz de una cepa de bacterias acidolácticas de la invención que es capaz de inducir la producción de melatonina a dicho sujeto.
Como se ha analizado anteriormente, dichas cepas se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles, u otras enfermedades asociadas con o caracterizadas por una producción o síntesis o niveles reducidos, bajos o deficientes de melatonina.
Por tanto, las cepas de bacterias acidolácticas de la invención que son capaces de inducir la producción de melatonina se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles u otras enfermedades asociadas con o caracterizadas por una producción o síntesis o niveles reducidos, bajos o deficientes de melatonina en un sujeto.
Los cólicos infantiles u otra enfermedad asociada con o caracterizada por una producción o síntesis o niveles de melatonina reducidos, bajos o deficientes, en un sujeto, se pueden tratar o prevenirse mediante la administración de una cantidad eficaz de una cepa de bacterias acidolácticas de la invención que sea capaz de inducir la producción de melatonina a dicho sujeto.
Dichas cepas de la invención son capaces de producir adenosina y, por lo tanto, de inducir la producción (por ejemplo, la producción posterior) de melatonina como se describe en otra parte del presente documento.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un esquema que muestra la vía de producción de melatonina.
La Figura 2 es un esquema que muestra cómo una bacteria capaz de producir adenosina de la invención afecta a la vía de producción de melatonina.
La Figura 3 muestra la medición de la actividad 5'-nucleotidasa en el sobrenadante de células de bacterias L reuteri.
La Figura 4 muestra la producción de melatonina en un modelo enteroide intestinal mediante la adición de sobrenadante de células de bacterias L. reuteri.
La Figura 5A muestra la medición de la actividad 5'-nucleotidasa en el sobrenadante de células de bacterias L. reuteri DSM 33198 en comparación con células de bacterias DSM 17938. La Figura 5B muestra la medición de la actividad 5'-nucleotidasa en el sobrenadante de diferentes células de bacterias L. reuteri en comparación con las células de bacterias DSM 17938.
Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas de la misma
Por tanto, como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona cepas bacterianas que son capaces de estimular, inducir o apoyar la producción de melatonina, por ejemplo, para aumentar los niveles de melatonina, particularmente en el tracto gastrointestinal (GI).
Dichas cepas pueden generar indirectamente la producción de melatonina, por ejemplo, al producir, estimular o inducir la producción de un componente anterior de la vía de síntesis de melatonina (o un precursor de la melatonina) y, por lo tanto, apoyar o aumentar la producción de melatonina. Un ejemplo preferido sería la producción o inducción de arilalquilamina-N-acetil transferasa (AANAT), que es la enzima limitante de la velocidad en la conversión de serotonina en N-acetil serotonina que, a su vez, se convierte en melatonina.
Como se ha esbozado anteriormente, una cepa de bacterias acidolácticas de la invención es aquella que puede producir adenosina en un sujeto, particularmente en el tracto gastrointestinal (GI). Dicha adenosina puede actuar sobre los receptores de adenosina de la superficie celular apropiados (por ejemplo, receptores A2A, receptores A2B, receptores A3 o A4, preferiblemente receptores A2A) y generar la producción de niveles elevados de AMPc intracelular. Se sabe que A2A y otros receptores de adenosina están presentes en las células que se encuentran en el tracto GI. El cAMP intracelular, a su vez, participa en la producción de AANAT (véase la Figura 2). Por tanto, el aumento de los niveles de cAMP intracelular puede generar un aumento de los niveles de AANAT y, por lo tanto, un aumento de los niveles de melatonina. Por tanto, la adenosina debe proporcionarse preferiblemente de forma extracelular para poder unirse a los receptores de adenosina de la superficie celular. Con este fin, la adenosina puede producirse dentro de las células bacterianas y transportarse extracelularmente (o secretarse). Como alternativa, la adenosina se puede producir extracelularmente, por ejemplo, en la superficie de la célula bacteriana o en el sobrenadante. Dicha producción extracelular puede tener lugar convenientemente, por ejemplo, mediante la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular (o superficie celular) (o enzima ecto-5'-nucleotidasa), que puede convertir el sustrato apropiado en adenosina. Dicha producción extracelular puede tener lugar igualmente por medio de la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa (o enzima ecto-5'-nucleotidasa) en el sobrenadante celular o en el espacio extracelular. Como se muestra en el presente documento, las cepas bacterianas pueden proporcionar o producir o liberar dicha enzima 5'-nucleotidasa (o enzima ecto-5'-nucleotidasa) en el sobrenadante celular o espacio extracelular, donde luego puede convertir el sustrato apropiado en adenosina. Los sustratos apropiados incluyen AMP.
Por tanto, cuando se hace referencia en el presente documento a las cepas bacterianas como capaces de producir adenosina, esto incluye la producción directa de adenosina por las propias células bacterianas y también incluye la producción de adenosina por las células bacterianas por medio de las células que tienen una enzima 5'-nucleotidasa activa (por ejemplo, presente en la superficie de la célula bacteriana o liberada en el sobrenadante de la célula o en el espacio extracelular) y, por lo tanto, convirtiendo o pudiendo convertir el sustrato apropiado, p. ej., AMP, en adenosina. Dicho sustrato puede estar presente de forma natural, p. ej., endógenamente en el medio ambiente, o puede proporcionarse a las bacterias, p. ej., por medios exógenos.
Por tanto, dichas cepas pueden generar niveles aumentados de melatonina, por ejemplo, en comparación con los niveles en donde no están presentes dichas cepas.
Se sabe que la melatonina se produce en el tracto GI y, por tanto, la producción o el aumento de la producción en esta región debería ser fisiológicamente eficaz. Preferiblemente, la cantidad de melatonina producida es clínica o
terapéuticamente significativa. Por tanto, las cepas de la invención se pueden utilizar para tratar cualquier enfermedad o afección asociada con (o caracterizada por) niveles reducidos o disminuidos de melatonina, o asociada con (o caracterizada por) deficiencia de melatonina, o se pueden utilizar para tratar cualquier enfermedad o afección que se beneficiaría de mayores niveles de melatonina. Dichas enfermedades o afecciones (y, de hecho, los sujetos que padecen dichas enfermedades o afecciones) serían fácilmente reconocidas por los expertos en la técnica e incluirían, por ejemplo, enfermedades, afecciones o sujetos que tienen niveles bajos, reducidos, p. ej., significativamente reducidos (o anormales) de melatonina o deficiencia de melatonina, p. ej., en comparación con los niveles en un sujeto normal o sano, por ejemplo, los niveles en un sujeto normal o sano de la misma edad, o de una edad equivalente o comparable. Un ejemplo preferido de dicha enfermedad es el de los cólicos infantiles.
Por tanto, una cepa de bacterias acidolácticas de la invención es capaz de inducir la producción de melatonina, por ejemplo, en virtud de que dicha cepa sea capaz de producir adenosina. Una cepa de bacterias acidolácticas de la invención es capaz de producir adenosina. También se proporcionan usos terapéuticos de dichas cepas. Dichas cepas tienen un gen que codifica una 5'-nucleotidasa y que tienen una enzima 5'-nucleotidasa activa, por ejemplo, para convertir AMP (u otro sustrato apropiado) en adenosina. Los niveles ilustrativos de producción de adenosina o los niveles de actividad 5'-nucleotidasa o producción de melatonina se describen en otra parte del presente documento.
Las cepas de la presente invención son cepas de L. reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 y/o DSM 33198 (cuyos detalles de depósito se proporcionan en otra parte del presente documento), y dichas cepas, p. ej., cepas aisladas o cultivos biológicamente puros o preparaciones de dichas cepas, forman aspectos de la invención, así como las composiciones (p. ej., farmacéuticas o nutricionales, p. ej., complementos alimenticios o probióticos, composiciones, p. ej., con diluyentes y/o excipientes farmacéutica o nutricionalmente aceptables) que comprenden dichas cepas, o el uso terapéutico de dichas cepas, por ejemplo, como se describe en otra parte del presente documento, en particular, para el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles (u otras enfermedades como se describe en otra parte del presente documento). Por tanto, la presente invención proporciona las cepas de Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, Ds M 32849 y/o Ds M 33198 para su uso en terapia, por ejemplo, para el tratamiento o la prevención de enfermedades como se describe en otra parte del presente documento. La presente invención proporciona además las cepas de Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 y/o DSM33198 para su uso en el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles.
El cólicos infantiles, u otras enfermedades como se describe en otra parte del presente documento, en un sujeto, se pueden tratar o prevenirse mediante la administración de una cantidad eficaz de las cepas de Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 y/o DSM 33198, a dicho sujeto.
Las realizaciones y características alternativas y preferidas de la invención, tal como se describen en otras partes del presente documento, se aplican igualmente a los usos de la invención descritos en el presente documento y en otras partes del presente documento.
Las cepas de L. reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 y/o DSM 33198 se han seleccionado por su capacidad para producir adenosina, por ejemplo, al tener un gen que codifica una 5'-nucleotidasa y una enzima 5'-nucleotidasa activa que puede convertir el sustrato de AMP en adenosina, y son adecuadas no solo para aumentar los niveles de adenosina (p. ej., en comparación con los niveles a los que las cepas no están presentes), sino también para aumentar los niveles de melatonina, por ejemplo, aumentando los niveles de AANAT como se describe en otra parte del presente documento. Las cepas comprenden una enzima 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular activa y también muestran actividad de la enzima 5'-nucleotidasa en sus respectivos sobrenadantes (véanse la Figura 3 y la Figura 5 A/B).
Estas cepas de L. reuteri se han desarrollado (en otras palabras, se han modificado, adaptado o hecho evolucionar) a partir de cepas naturales, y también se han seleccionado por una o más de otras propiedades mejoradas, tales como una mayor resistencia a la bilis o una mayor adherencia a las superficies mucosas, p. ej., superficies del tracto GI. Por tanto, DSM 32846 y DSM 32847 han evolucionado para ser más tolerantes a los ácidos biliares y, por lo tanto, por ejemplo, sobrevivir en mayor número en el tracto GI. DSM 32849 han evolucionado para adherirse mejor a la mucosidad, con el objetivo de colonizar mejor el tracto GI y, por lo tanto, funcionar mejor, por ejemplo, según la presente invención. La cepa de L. reuteri DSM 33198 también se ha modificado en un proceso de selección de varias etapas que incluye un procedimiento repetido de liofilización para permitir que sea más tolerante y proporcione una mayor supervivencia en el proceso de producción que su aislado nativo (cepa original). Por tanto, dichas cepas no corresponden a las cepas que se dan en la naturaleza y se han visto obligadas a evolucionar, no siendo cepas nativas. Se seleccionan todas las cepas de Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 y DSM 33198. Las cepas preferidas son DSM 32846, DSM 32847 o DSM 33198.
En una realización, se seleccionan o utilizan las cepas de Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847 y/o DSM 32849. Las cepas más preferidas son DSM 32846 o DSM 32847, por ejemplo, se prefiere DSM 32846 en algunas realizaciones. En algunas realizaciones, se selecciona o usa la cepa DSM 33198.
Dichas cepas de la invención se pueden utilizar en el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles u otras enfermedades como se describe en otra parte del presente documento, por ejemplo, el síndrome del intestino irritable (SII), trastornos del sueño, o enfermedades o trastornos neurodegenerativos, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer u otros tipos de demencia, por ejemplo, otros tipos de demencia senil. Dichas enfermedades también son ejemplos de enfermedades asociadas con (o caracterizadas por) una deficiencia o reducción de melatonina, o que, por ejemplo, se beneficiarían de niveles elevados o aumentados de melatonina.
La motilidad gastrointestinal significa el estiramiento y las contracciones de los músculos en el tracto gastrointestinal para transferir los alimentos que se digieren. La contracción sincronizada de estos músculos se denomina peristalsis.
Hay una gran cantidad de factores liberados localmente, incluidas las hormonas del tracto gastrointestinal que modulan la motilidad y la secreción. Los movimientos del sistema digestivo y el tránsito de su contenido definen la motilidad. Cuando los nervios y/o músculos de cualquier parte del tracto digestivo, la función motora gastrointestinal, no funcionan con fuerza y coordinación normales, una persona desarrolla síntomas relacionados con las alteraciones de la motilidad.
Se ha descrito que las alteraciones de la función motora producen una variedad de síntomas en diversas regiones intestinales, tal como en un sujeto con cólicos infantiles.
Los cólicos infantiles es el término que se utiliza para describir a los lactantes que lloran en exceso sin razón evidente durante los tres primeros meses de vida. Los cólicos es uno de los problemas más angustiosos de la infancia. Es angustioso para el lactante, los padres y el médico. La causa de los cólicos no se entiende por completo.
La inmadurez hormonal de los recién nacidos se incluye como un factor importante en los problemas precoces del desarrollo de la motilidad intestinal y, por lo tanto, también provoca dolor y llanto en el lactante, tal como en los cólicos infantiles.
La melatonina es una hormona que tiene la capacidad de mantener los ritmos biológicos, y tiene efectos importantes en muchas funciones de los seres humanos y los animales. La hormona influye en la motilidad gastrointestinal mediante receptores selectivos (receptores de melatonina) expresados en los músculos lisos y las células del plexo mientérico del tracto gastrointestinal. El mecanismo básico subyacente a la contracción del músculo liso gastrointestinal es la generación cíclica de corriente eléctrica. La actividad mioeléctrica del tracto gastrointestinal consiste en dos tipos de potenciales eléctricos: actividad de onda lenta y pico organizada en el complejo mioeléctrico migratorio.
Un precursor de la melatonina es la serotonina, un neurotransmisor en sí mismo que se puede obtener del aminoácido triptófano.
Se ha demostrado que la melatonina bloquea en parte la disminución del tránsito alimentario inducida por la serotonina. Es un sistema de contrapeso de la melatonina y la serotonina en la regulación de la actividad intestinal.
Además, el sistema melatonina-serotonina funcional y equilibrado afecta al apetito y a los procesos digestivos mediante efectos endocrinos y paracrinos tanto en el cerebro como en el tracto gastrointestinal.
La acción de las dos hormonas parece tener el efecto contrario sobre la motilidad, y los efectos finales dependen de la dosis. También se sabe que la melatonina y la serotonina participan en los procesos de hipersensibilidad y conducción del dolor.
La melatonina, también conocida como N-acetil-5-metoxitriptamina, es una hormona y un neurotransmisor que antes se pensaba que era secretado predominantemente por la glándula pineal. Pero hay importantes sitios extrapineales de producción de melatonina, tales como la retina y el tracto gastrointestinal. Ahora hay informes que muestran al menos 400 veces más melatonina en el tracto gastrointestinal que en la glándula pineal. La variación circadiana de la melatonina gastrointestinal no parece estar controlada por la exposición a la luz (como la glándula pineal), sino por la ingesta y la composición de los alimentos.
La sincronización entre la producción y los diferentes ritmos circadianos y la posterior liberación de serotonina y melatonina en lactantes de pocos meses es importante para evitar alteraciones de la motilidad intestinal y dolor, como los cólicos infantiles (CI).
La serotonina aumenta la contracción del músculo liso intestinal y la melatonina relaja el músculo liso intestinal. Los máximos de concentración de serotonina pueden provocar calambres intestinales si no se equilibran con otros agentes, de los cuales la melatonina es importante. Tanto la serotonina como la melatonina tienen ritmos circadianos. Si bien se produce serotonina y se desarrollan ritmos circadianos de serotonina cuando nace un lactante, la producción endógena de melatonina y el ritmo circadiano de melatonina en muchos lactantes no están listos para comenzar hasta después del tercer mes de vida. Este tiempo coincide con el tiempo de desaparición normal de los cólicos infantiles. Se ha demostrado que la melatonina es baja por la mañana temprano en la vida de los lactantes que tienen cólicos, mientras que es alta en los lactantes que no tienen cólicos (Cengiz y col. 2015,
Turkish journal of family medicine and primary care; 9 (1 )/10-15). Dichos lactantes (por ejemplo, lactantes con formas de cólicos infantiles asociadas con deficiencias en la melatonina o en el equilibrio de la melatonina, por ejemplo, deficiencias en los niveles de melatonina por la mañana, por ejemplo, a las 6 a. m., 8 a. m., 10 a. m. o 12 del mediodía, o antes) son ejemplos de sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención.
Por tanto, aunque algunos niños parecen capaces de producir y liberar endógenamente la melatonina necesaria de sus alimentos y/o de sus bacterias intestinales y, por lo tanto, tienen menos probabilidades de desarrollar cólicos infantiles, hay muchos otros que no lo hacen y que, por lo tanto, necesitan apoyo adicional para prevenir o tratar los CI. Dichos lactantes (p. ej., lactantes con deficiencias en melatonina provocadas, por ejemplo, por un microbioma intestinal no desarrollado por completo o lactantes que tienen problemas de nutrición o problemas de alimentación) también son ejemplos de sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención.
Se puede decir que los cólicos infantiles es una afección de deficiencia de melatonina. Esto es especialmente importante para los niños en situaciones estresantes, o que son menos capaces de lidiar con el estrés, como los niños nacidos antes del tiempo completo de gestación o cuando el metabolismo alimentario no es completamente funcional, etc. Dichos lactantes (por ejemplo, lactantes con deficiencias en melatonina nacidos antes del tiempo completo de gestación, o nacidos por cesárea, o sin metabolismo alimentario completamente funcional) también son ejemplos de sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención.
Otro ejemplo de una afección que se relaciona con el equilibrio de la función de la melatonina es el síndrome del intestino irritable (SII), que es un trastorno común caracterizado por dolor o malestar abdominal recurrente, junto con hábitos intestinales alterados en ausencia de causas identificables. Se sugiere que la melatonina muestra un efecto positivo sobre la percepción del dolor y los hábitos intestinales (Siah K. T. H. y col., 2014, World J Gastroenterol; 20(10): 2492-2498). Por tanto, los sujetos que tienen SII, en particular, formas de SII asociadas con deficiencias en la melatonina o en el equilibrio de la melatonina, también son ejemplos de sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención.
La deficiencia de melatonina se ha investigado principalmente en la glándula pineal, la circulación, la saliva, el líquido cefalorraquídeo y, midiendo el metabolito 6-sulfatoximelatonina, en la orina.
Hay más de 20 tipos de células enteroendocrinas en el intestino, lo que lo convierte en el órgano endocrino más grande del cuerpo humano. Las células enterocromafines (EC) son un tipo de célula enteroendocrina y neuroendocrina. Residen junto al epitelio que recubre la luz del tracto digestivo y desempeñan un papel crucial en la regulación gastrointestinal, particularmente en la motilidad y secreción intestinales. Las células EC modulan la señalización neuronal en el sistema nervioso entérico (SNE) a través de la secreción del neurotransmisor serotonina y otros péptidos, además expresan receptores de adenosina y tienen una síntesis activa de melatonina.
Un síntoma común de la señalización insuficiente de melatonina son los trastornos del sueño, y la melatonina es uno de los suplementos naturales para la salud más populares de nuestro tiempo. La melatonina se suele denominar “ la hormona de la oscuridad” , porque su síntesis y secreción en algunos lugares del organismo son potenciadas por la oscuridad e inhibidas por la luz. Los trastornos del sueño son muy frecuentes en los niños y, sin el tratamiento adecuado, pueden volverse crónicos y durar muchos años (Esposito y col. 2019, J Transl Med, 17:77). Incluso se informa que la población anciana experimenta trastornos del sueño. Se observa regularmente que el valor máximo de melatonina durante la noche disminuye con el envejecimiento. Por tanto, los sujetos que tienen o padecen alteraciones del sueño o trastornos del sueño, en particular, formas de alteraciones del sueño o de trastornos del sueño asociadas con las deficiencias en la melatonina o en el equilibrio de la melatonina, también son ejemplos de sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención.
También se han descrito repetidamente niveles reducidos de melatonina en trastornos neurodegenerativos, especialmente en la enfermedad de Alzheimer y otros tipos de demencia senil (Blumenbach Johann Friedrich, 2012, The Scientific World Journal Volume 2012, ID del artículo 640389). Por tanto, los sujetos que tienen dichos trastornos neurodegenerativos, en particular, formas de dichos trastornos neurodegenerativos asociadas con las deficiencias en la melatonina o en el equilibrio de la melatonina, también son ejemplos de sujetos que se pueden tratar mediante la presente invención.
La velocidad de formación de melatonina depende de la actividad de la enzima arilalquilamina-N-acetiltransferasa (AANAT) (Fig 1 y Fig 2) en la glándula pineal, pero también en los sitios extrapineales de producción de melatonina, tales como en el tracto gastrointestinal.
La adenosina aumenta los niveles de cAMP intracelular a través del receptor de adenosina, lo que aumenta la producción de AANAT, la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de melatonina.
Es un objeto de la presente invención utilizar las cepas acidolácticas productoras de adenosina de la invención para prevenir y/o tratar los cólicos infantiles.
Es otro objeto de la presente invención utilizar las cepas acidolácticas productoras de adenosina de la invención para prevenir y/o tratar el SII.
Es otro objeto de la presente invención utilizar las cepas acidolácticas productoras de adenosina de la invención para prevenir y/o tratar los trastornos del sueño.
Es otro objeto de la presente invención utilizar las cepas acidolácticas productoras de adenosina de la invención para prevenir y/o tratar trastornos neurodegenerativos, p. ej., la enfermedad de Alzheimer y otros tipos de demencia, p. ej., otros tipos de demencia senil.
Esta invención también se refiere a un método para la selección de cepas de bacterias acidolácticas específicas que son Lactobacillus reuteri, que son capaces de producir adenosina.
Un proceso metabólico importante en el cuerpo humano es el metabolismo de las purinas, en donde las purinas son metabolizadas y descompuestas por enzimas específicas. Un ejemplo de esas enzimas es la ecto-5'-nucleotidasa (CD73), que se considera una enzima clave en la generación de adenosina.
Los inventores descubrieron que, sorprendentemente, algunas cepas bacterianas probióticas específicas eran capaces de producir adenosina.
Por tanto, la presente invención incluye un nuevo método, como se define en otra parte del presente documento, para seleccionar cepas específicas de bacterias acidolácticas que son Lactobacillus reuteri, que son eficaces en la producción de adenosina. El propósito de seleccionar cepas bacterianas específicas es utilizarlas para tratar determinados trastornos tales como los cólicos infantiles (u otras enfermedades como se describe en otra parte del presente documento).
La presente invención proporciona un método como se define en otra parte del presente documento para seleccionar cepas de bacterias acidolácticas que son Lactobacillus reuteri, que son útiles como probióticos y en terapia, por ejemplo, como productos farmacéuticos o como complementos alimenticios.
Por tanto, un aspecto de la presente invención proporciona un método para la selección de una cepa de bacterias acidolácticas capaz de producir adenosina, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri y en donde dicho método comprende:
a) cribar una cepa de bacterias acidolácticas para detectar la presencia de un gen que codifica una 5'-nucleotidasa, p. ej., una 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri; y/o
b) cribar una cepa de bacterias acidolácticas, o su sobrenadante, para detectar la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa, p. ej., una 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri; y
c) seleccionar una cepa de Lactobacillus reuteri que produce adenosina a un nivel mayor en comparación con Lactobacillus reuteri DSM 17938; y opcionalmente
d) cultivar o propagar dicha cepa de Lactobacillus reuteri.
Dichas enzimas 5'-nucleotidasa (5'NT) también pueden denominarse enzimas ecto-5'-nucleotidasa o CD73 (grupo de diferenciación 73). A continuación, se pueden seleccionar las cepas que son capaces de producir adenosina.
Una vez que se ha seleccionado una cepa apropiada mediante el método de la presente invención, se puede utilizar para la producción, p. ej., la producción local, de adenosina en un sujeto.
Los productos o las composiciones, p. ej., composiciones farmacéuticas, composiciones probióticas o composiciones dietéticas/nutracéuticas, que comprenden las cepas bacterianas (por ejemplo, que comprenden una o más de las cepas bacterianas) de la invención y los usos terapéuticos de dichos productos o composiciones como se describe en el presente documento forman más aspectos adicionales de la invención.
La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura define los probióticos como “ microorganismos vivos que, cuando se administran en cantidades adecuadas, transmiten al hospedador un beneficio para la salud” . Hoy en día, se utiliza una serie de bacterias diferentes como probióticos, por ejemplo, bacterias productoras de ácido láctico, tales como las cepas de Lactobacillus y Bifidobacteria.
Las realizaciones y características alternativas y preferidas de la invención, como se describen en otra parte del presente documento, se aplican igualmente a los usos y productos de la invención.
Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se refiere a la selección y al uso de cepas bacterianas que son capaces de producir adenosina.
Dichas cepas que son eficaces en la producción de adenosina se pueden utilizar para la producción local de adenosina en un sujeto, p. ej., un mamífero, preferiblemente un ser humano.
Por tanto, como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona un método para la selección o el cribado de cepas bacterianas de Lactobacillus reuteri capaces de producir adenosina.
Algunos de los métodos de la invención comprenden una etapa (etapa a)) de cribado de la presencia de un gen que codifica una 5'-nucleotidasa, p. ej., una 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular. Dicho cribado puede llevarse a cabo mediante cualquier método apropiado y se seleccionan las cepas que expresan un gen de 5'-nucleotidasa. Dichos métodos se llevarán a cabo convenientemente in vitro, por ejemplo, serán métodos genéticos o basados en ácidos nucleicos para detectar la presencia de un gen que codifica una 5'-nucleotidasa, p. ej., una 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular (o un fragmento identificador de la misma) cuyas secuencias son conocidas en la técnica. Por ejemplo, se puede diseñar fácilmente un protocolo de PCR (u otra técnica basada en ácidos nucleicos) para hacer esto basándose en las secuencias de ácidos nucleicos conocidas que codifican las enzimas, o como alternativa, se pueden analizar las secuencias genómicas de las cepas candidatas con el objetivo de identificar dicho gen que codifica una 5'-nucleotidasa, p. ej., una 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular, por ejemplo, basándose en la homología con secuencias conocidas de 5'-nucleotidasa, incluida, por ejemplo, la presencia de un motivo LPXTG (SEQ ID NO: 1) como se explica más adelante.
Un gen ilustrativo para detectarse en los métodos de la invención es el gen de (ecto-)5'-nucleotidasa anclado a la pared celular de L. reuteri (p. ej., número de acceso de GenBank: AEI56270.1, proteína de dominio de anclaje a la pared celular con motivo LPXTG [Lactobacillus reuteri SD2112]), o un homólogo apropiado/5'-nucleotidasa de otras especies de bacterias, p. ej., otras bacterias acidolácticas. En los ejemplos experimentales, se describe una técnica ilustrativa.
Algunos métodos de la invención comprenden una etapa (etapa b)) de cribado de la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa (funcional), p. ej., una enzima 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular. Dicha etapa puede llevarse a cabo mediante cualquier método apropiado, por ejemplo, mediante un ensayo enzimático. La enzima 5'-nucleotidasa cataliza la siguiente reacción: AMP H2 O ~ adenosina fosfato (AMP es monofosfato de adenosina) y se puede utilizar fácilmente un ensayo para medir esta reacción a fin de determinar la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa (o actividad 5'-nucleotidasa). En otras palabras, la referencia en el presente documento a una enzima 5'-nucleotidasa activa o funcional es aquella que es capaz de catalizar esta reacción en condiciones adecuadas, p. ej., cuando se suministra con un sustrato apropiado tal como AMP. Si se desea, se puede cuantificar la actividad de la enzima 5'-nucleotidasa p. ej., en dicho ensayo enzimático, por ejemplo, midiendo la cantidad o concentración de fosfato o adenosina u otro producto posterior apropiado de la adenosina que se genera en la reacción y puede medirse o cuantificarse. La actividad puede medirse convenientemente en una muestra de las células bacterianas o en el sobrenadante de las células bacterianas.
Los métodos para llevar a cabo dicho ensayo serán muy conocidos por un experto en la técnica. Por ejemplo, hay kits apropiados disponibles en el mercado tal como el kit de ensayo de 5'-nucleotidasa Crystal Chem (Crystal Chem, catálogo n.° 80229, Downers Grove, IL, EE. UU.), en el que se mide la actividad de la enzima 5'-nucleotidasa mediante la producción de un colorante (un colorante de quinona), que se forma como un producto posterior de la conversión de AMP en adenosina (es decir, como resultado de la producción de adenosina). El AMP se proporciona como sustrato. En el apartado de ejemplos, se describe una técnica ilustrativa. La metodología apropiada también se puede obtener fácilmente de otros proveedores de reactivos, p. ej., Sigma, junto con su reactivo de enzima 5'-nucleotidasa.
Las cepas seleccionadas mediante el método de selección de la invención producen adenosina a un nivel que es mayor en comparación con Lactobacillus reuteri DSM 17938. Se prefieren las cepas con niveles de producción altos o significativos de la enzima 5'-nucleotidasa (o actividad 5'-nucleotidasa), por ejemplo, las cepas que tienen una actividad 5'-nucleotidasa de al menos o superior a 8 unidades/l (unidades por litro) y/o que son capaces de producir adenosina a un nivel de al menos o superior a 8 pmol l-1 min-1 (pmol por litro por minuto). Por tanto, en realizaciones preferidas, una cepa se selecciona por tener actividad 5'-nucleotidasa a un nivel de al menos, o superior a, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 unidades/l, y/o que es capaz de producir adenosina a un nivel de al menos, o superior a, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 o 150 pmol l-1 min-1. En algunas realizaciones dichos valores pueden representar límites superiores. Dichos valores generalmente se refieren a valores de actividad 5'-nucleotidasa medidos en una muestra de células bacterianas, p. ej., en la superficie de las células bacterianas, o en el sobrenadante de las células bacterianas en cultivo, preferiblemente en el sobrenadante. En general, dichos valores se refieren a niveles de adenosina (preferiblemente niveles de adenosina extracelular) medidos en una muestra de células bacterianas, p. ej., en el sobrenadante de las células bacterianas en cultivo. En general, dichos valores se refieren a valores de actividad 5'-nucleotidasa (o niveles de adenosina) cuando se miden con una concentración de 109 bacterias/ml, o el sobrenadante de dicho cultivo. Una unidad se define como la cantidad de enzima necesaria para producir 1 pmol de producto/min (p. ej., 1 pmol de producto/litro/min). La concentración en unidades/litro corresponderá entonces a la concentración de enzima necesaria para aumentar la concentración en 1 pM/min (p. ej., 1 pM/litro/min). En los ejemplos, se muestra un ensayo apropiado e ilustrado para medir esta actividad
mediante el kit de 5'-nucleotidasa (n.° 80229) de Crystal Chem Inc. Por tanto, en realizaciones preferidas, las unidades y los valores anteriores se refieren a unidades y valores cuando se miden mediante este kit y/o las condiciones expuestas en los ejemplos, en particular, con una concentración de 109 bacterias/ml, o el sobrenadante de dicho cultivo, o un ensayo equivalente. Por tanto, dichos métodos se llevarán a cabo convenientemente in vitro.
Se preferirán los métodos que comprenden al menos la etapa b), ya que la presencia de un gen que codifica una 5'-nucleotidasa no siempre es indicativa de la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa. En los métodos, usos y cepas de bacterias acidolácticas de la invención, la producción de adenosina o la actividad adenosina debe tener lugar extracelularmente, es decir, fuera o en la superficie de las bacterias acidolácticas, de modo que pueda estar presente, por ejemplo, en el sobrenadante u otro líquido extracelular producido por las bacterias acidolácticas. Por tanto, la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa en la superficie celular, por ejemplo, en forma de 5'-nucleotidasa anclada a la pared celular, o extracelular de la célula bacteriana, por ejemplo, en el sobrenadante, puede ser una característica útil, de modo que la reacción para producir adenosina tenga lugar fuera de la célula, por ejemplo, en la superficie de la célula bacteriana.
Por tanto, la producción de buenos niveles de adenosina (p. ej., adenosina extracelular producida por la enzima 5'-nucleotidasa) también puede ser un indicador de la presencia de un gen de 5'-nucleotidasa o de la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa. Por tanto, el método de selección de la invención también puede implicar la etapa de seleccionar una cepa que produzca adenosina. Se prefieren cepas con niveles de producción altos o significativos de adenosina, p. ej., adenosina extracelular, por ejemplo, cepas que produzcan adenosina a un nivel que sea terapéuticamente eficaz en un sujeto, o a un nivel al que se observen niveles de melatonina mayores (y que preferiblemente sea terapéuticamente eficaz). Dichos valores generalmente se refieren a valores de adenosina medidos en el sobrenadante de cepas en cultivo o en la superficie celular de cepas en cultivo (in vitro), y anteriormente se han proporcionado algunos valores específicos ilustrativos.
Sin embargo, en algunas realizaciones, es apropiado referirse a valores, niveles o cantidades de adenosina producida en un sujeto, por ejemplo, localmente, p. ej., en el sitio de administración, p. ej., en el tracto gastrointestinal. Por ejemplo, las cepas preferidas pueden permitir una mayor producción de adenosina, por ejemplo, una mayor producción in vivo, p. ej., producción local (p. ej., en el tracto GI), de adenosina, por ejemplo, en comparación con un control pertinente como se describe en otra parte del presente documento, tal como los niveles de adenosina cuando no se administran cepas, o la base o el nivel natural de adenosina en un determinado sujeto.
En todos los aspectos de la invención descritos en el presente documento, la producción local puede referirse a la producción o a los niveles de adenosina en el sitio de administración, por ejemplo, la producción o los niveles de adenosina en el tracto gastrointestinal (p. ej., cuando la administración es oral). En un aspecto, la producción local de adenosina puede tener efectos posteriores sistémicos y puede aumentar los niveles de adenosina o melatonina en el sistema circulatorio, por ejemplo, en sangre o plasma, u otros lugares fuera del tracto gastrointestinal.
Por tanto, se prefieren las cepas que pueden dar lugar a mayores niveles locales de adenosina (o melatonina o actividad 5'-nucleotidasa), por ejemplo, en el tracto GI de un sujeto, en particular, cuando se observa dicho efecto al administrarse las cepas por vía oral. Preferiblemente, dichos aumentos son aumentos medibles o significativos, por ejemplo, estadística o clínicamente significativos. A modo de ejemplo, se prefieren las cepas que pueden dar lugar a aumentos de al menos o hasta 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces, en los niveles de adenosina (o melatonina o actividad 5'-nucleotidasa), por ejemplo, niveles locales de adenosina (o melatonina o actividad 5'-nucleotidasa). Se puede utilizar cualquier comparación apropiada, por ejemplo, un aumento en comparación con los niveles observados cuando no se administra ninguna cepa o los niveles cuando se administra una formulación de control, p. ej., una formulación de control que no contenga la cepa pertinente.
Los métodos apropiados para medir los niveles de producción de adenosina (o melatonina o actividad 5'-nucleotidasa) serían muy conocidos por un experto en la técnica. Por tanto, en algunas realizaciones de la invención, el método de selección implicará la etapa de detectar o determinar la cantidad o el nivel (p. ej., la concentración) de adenosina producida por una cepa candidata.
Los niveles de producción de adenosina pueden compararse convenientemente con DSM 17938 como cepa de control positivo o con una cepa de control negativo. DSM 17938 es una cepa de control positivo apropiada de la que se ha demostrado en los ejemplos que produce niveles significativos de actividad adenosina/5'-nucleotidasa, por ejemplo, en el sobrenadante de células bacterianas. Las cepas seleccionadas mediante el método de la invención como se define en otra parte del presente documento producirán niveles más altos, a veces niveles significativamente más altos, de actividad adenosina/5'-nucleotidasa que DSM 17938, por ejemplo, en el sobrenadante de células bacterianas. Las cepas seleccionadas mediante el método de la invención son capaces de producir niveles más altos (aumentados), o niveles significativamente más altos (aumentados), de actividad 5'-nucleotidasa que DSM 17938, por ejemplo, en el sobrenadante de células bacterianas, por ejemplo, cuando se evalúan in vitro. Los ejemplos de cepas son las cepas de la invención, es decir, DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 y DSM 33198 (véase la Figura 3 y la Figura 5 A/B). Como alternativa, las cepas seleccionadas mediante el
método de la invención son capaces de producir niveles más altos (aumentados) o niveles significativamente más altos (aumentados) de adenosina en comparación con DSM 17938, por ejemplo, en el sobrenadante de células bacterianas, por ejemplo, cuando se evalúan in vitro. Por ejemplo, las cepas seleccionadas mediante el método de la invención pueden ser capaces de producir o inducir la producción de niveles más altos (aumentados), o niveles significativamente más altos (aumentados) de adenosina en un sujeto, por ejemplo, niveles locales superiores, etc., de adenosina en un sujeto en comparación con DSM 17938, por ejemplo, cuando se evalúan in vivo, en particular, cuando las cepas se administran por vía oral.
Dichas cepas tienen una o más propiedades mejoradas (p. ej., significativamente mejoradas) en comparación con DSM17938.
Preferiblemente, dichos aumentos (en la producción de adenosina o en la actividad 5'-nucleotidasa) son aumentos medibles o significativos, por ejemplo, estadística o clínicamente significativos. A modo de ejemplo, se prefieren cepas que pueden dar lugar a aumentos de al menos, o hasta el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 %, 200 %, 250 %, 300 %, 350 %, 400 %, 450 %, 500 %, 550 % o mayores, en niveles de adenosina, por ejemplo, niveles locales o in vitro de adenosina, o en niveles de actividad 5'-nucleotidasa (p. ej., evaluados in vitro), en comparación con los niveles con DSM 17938. Como alternativa, se prefieren las cepas que pueden dar lugar a aumentos de al menos o hasta 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces o 10 veces en los niveles de adenosina, por ejemplo, niveles locales o in vitro de adenosina, o en los niveles de actividad 5'-nucleotidasa, en comparación con los niveles con DSM 17938. Los niveles in vitro pueden medirse convenientemente como se describe en otra parte del presente documento, por ejemplo, en cultivos bacterianos. Preferiblemente, dichos aumentos son aumentos en los niveles extracelulares de actividad adenosina o 5'-nucleotidasa, por ejemplo, medidos in vitro, por ejemplo, en el sobrenadante de cultivos bacterianos.
Una cepa de control negativo apropiada podría ser una cepa que no contenga un gen que codifique una 5'-nucleotidasa o que no contenga una enzima 5'-nucleotidasa activa (o que no tenga actividad 5'-nucleotidasa como se describe en otra parte del presente documento).
Debido a los usos posteriores de las cepas que se seleccionan mediante los métodos de la invención, tras seleccionar o aislar cepas de Lactobacillus reuteri productoras de adenosina, otras realizaciones implicarán las etapas adicionales de cultivar, propagar o producir dichas cepas y, opcionalmente, de formular dichas cepas cultivadas, propagadas o producidas en una composición que comprende dicha cepa, p. ej., una composición farmacéutica o nutricional, p. ej., como se describe en otra parte del presente documento, o posiblemente almacenando dichas cepas para usos futuros, por ejemplo, mediante liofilización o criodesecación. En una realización, las cepas bacterianas se proporcionan en forma liofilizada.
Las etapas de selección de los métodos de la invención (y, en realidad, de los usos terapéuticos descritos en el presente documento) generalmente necesitarán llevarse a cabo en un medio de cultivo (o entorno in vivo) apropiado, que apoye la producción de adenosina. Los medios de cultivo preferidos (o entorno in vivo) contendrán una fuente de carbono apropiada, que apoyará la producción de adenosina por dicha cepa, preferiblemente junto con un sustrato apropiado para la producción de adenosina por la enzima 5'-nucleotidasa, p. ej., AMP.
Aunque dichos ensayos pueden llevarse a cabo convenientemente in vitro, otra opción sería evaluar las cepas en un ensayo ex vivo apropiado, p. ej., mediante un modelo enteroide intestinal apropiado (véase, por ejemplo, el modelo enteroide y los ensayos descritos en el Ejemplo 5, donde, por ejemplo, se pueden evaluar los niveles de melatonina).
Por lo tanto, aunque cualquier modelo in vitro o ex-vivo apropiado para la evaluación de las cepas, por ejemplo, para la evaluación de la inducción de la producción de adenosina o melatonina por las cepas, los modelos in vitro o ex vivo preferidos para la evaluación de las cepas son modelos enteroides intestinales, preferiblemente modelos enteroides intestinales humanos que se pueden utilizar, por ejemplo, para evaluar los niveles de melatonina. Dichos modelos comprenden preferiblemente células enteroendocrinas, por ejemplo, como se describe en el Ejemplo 5.
Las cepas preferidas de la invención son capaces de producir o inducir la producción de al menos o hasta 10, 20, 30, 40, 50, 60 o 70 pg/ml de melatonina. En algunas realizaciones dichos valores pueden representar límites superiores. Dichos valores generalmente se refieren a los niveles de producción de melatonina inducidos por dichas cepas cuando se miden en un ensayo in vitro o ex vivo apropiado, por ejemplo, se refieren a los niveles de melatonina producidos por células enteroendocrinas (preferiblemente células humanas) o producidos en un modelo enteroide intestinal que comprende células enteroendocrinas (por ejemplo, con % de células enteroendocrinas como los descritos en otra parte del presente documento), preferiblemente un modelo que comprende células humanas, cuando dichas células se ponen en contacto con las cepas de la invención o con el sobrenadante tomado de dichas cepas. En los ejemplos, se muestra un ensayo apropiado e ilustrado para medir esta actividad mediante un modelo enteroide intestinal humano que comprende células enteroendocrinas, p. ej., al menos el 20 % o 30 %, por ejemplo, 20-40 %, 30-40 % o hasta el 40 %, de células enteroendocrinas. Por tanto, en realizaciones preferidas, los valores
anteriores se refieren a valores medidos mediante este ensayo (o un ensayo equivalente, por ejemplo, con el % anterior de células enteroendocrinas) y/o las condiciones establecidas en los ejemplos.
Algunas cepas serán capaces de inducir niveles más altos, a veces niveles significativamente más altos, de melatonina que DSM 17938, por ejemplo, a partir de células enteroendocrinas o en modelos enteroides intestinales como se ha descrito anteriormente. Las cepas ilustrativas pueden dar lugar a aumentos de al menos o hasta 1,5 veces, 2 veces, 2,5 veces, 3 veces, 3,5 veces, 4 veces, 4,5 veces, 5 veces, 5,5 veces, 6 veces, 6,5 veces, 7 veces, 7,5 veces, 8 veces, 8,5 veces, 9 veces, 9,5 veces o 10 veces, en los niveles de producción de melatonina, en comparación con los niveles con DSM 17938, y son las preferidas.
Por tanto, los métodos de cribado de la invención pueden comprender opcionalmente una etapa adicional de selección de una cepa que sea capaz de inducir la producción de melatonina, por ejemplo, mediante la metodología descrita anteriormente o cualquier otra metodología apropiada. Las cepas seleccionadas pueden inducir preferiblemente la producción de melatonina a los niveles descritos anteriormente.
En realizaciones en donde se criba más de una cepa bacteriana mediante los métodos de la invención, opcionalmente, se puede cuantificar la cantidad de adenosina generada, y se puede seleccionar la cepa bacteriana de Lactobacillus reuteri que produzca la mayor cantidad o el nivel más alto de adenosina o melatonina, o una cantidad o un nivel suficientemente alto de adenosina, con cantidades o niveles mayores (preferiblemente significativamente mayores) que los producidos por DSM17938.
Los métodos que comprenden determinadas etapas como se describe en el presente documento también incluyen, cuando corresponda, métodos que consisten en estas etapas.
Cualquier cepa de bacterias acidolácticas apropiada que sea Lactobacillus reuteri, por ejemplo, una cepa de bacterias acidolácticas probiótica que es Lactobacillus reuteri, puede someterse a los métodos de selección de la invención.
Las cepas bacterianas de la invención son Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847 y DSM 32849, que se depositaron en virtud del Tratado de Budapest en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) el 4 de julio de 2018 y Lactobacillus reuteri DSM 33198, que se depositó en virtud del Tratado de Budapest en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) el 9 de julio de 2019. Estas cepas bacterianas o cepas bacterianas aisladas forman aspectos de la invención y se pueden utilizar, por ejemplo, para tratar las enfermedades o afecciones que se describen en otra parte del presente documento o para cualquier otro uso que se describe en el presente documento.
Por tanto, otro aspecto adicional de la invención proporciona el uso de dichas cepas para tratar o prevenir una o más de las enfermedades descritas en el presente documento.
Maximizar, aumentar o mejorar la actividad 5'-nucleotidasa de las cepas de Lactobacillus reuteri seleccionadas conducirán preferiblemente a una producción aumentada o mejorada de adenosina para mejorar el uso y el efecto del tratamiento de trastornos específicos como se describe en el presente documento. Esto se puede lograr cultivando las bacterias en condiciones de crecimiento específicas para permitir un alto rendimiento de adenosina (o un rendimiento de adenosina mayor, p. ej., significativamente mayor, p. ej., en comparación con el rendimiento observado en ausencia de la condición de crecimiento específica). Las condiciones de crecimiento específicas pueden ser, p. ej., cultivar bacterias Lactobacillus reuteri en un medio de crecimiento normal complementado con un sustrato apropiado para la producción de adenosina por la enzima 5'-nucleotidasa, p. ej., AMP, o componentes anteriores apropiados de AMP tales como ADP y/o ATP.
Para maximizar la actividad 5'-nucleotidasa, se puede administrar una mayor concentración de bacterias de la invención. Una concentración ilustrativa podría ser de 2 a 10 veces mayor que una dosis convencional.
Como se ha descrito anteriormente, las cepas de la invención, o las cepas seleccionadas, producidas, obtenidas o que se pueden obtener mediante los métodos de la invención tienen usos en terapia. Las cepas productoras de adenosina de la invención, o las cepas que se seleccionan, obtienen o que se pueden obtener mediante los métodos de selección de la invención se pueden utilizar en la producción, p. ej., la producción local, de adenosina y, por lo tanto, preferiblemente de melatonina en un sujeto. Dicha producción de adenosina, etc., y preferiblemente de melatonina, se puede utilizar para el tratamiento de los cólicos infantiles (y otras enfermedades como se describe en el presente documento) que se beneficiarán de la producción o el aumento de la producción, p. ej., la producción local, de adenosina y, por lo tanto, de melatonina.
La administración de las cepas bacterianas en los usos de la invención se lleva a cabo en cantidades farmacéutica, terapéutica o fisiológicamente eficaces a sujetos (animales/mamíferos) que necesitan tratamiento.
El tratamiento de enfermedades o afecciones según la presente invención (por ejemplo, el tratamiento de enfermedades preexistentes) incluye la cura de dichas enfermedades o afecciones, o cualquier reducción o alivio de la enfermedad (p. ej., reducción de la gravedad de la enfermedad) o síntomas de la enfermedad.
Los usos de la presente invención son adecuados para la prevención de enfermedades o afecciones, así como para el tratamiento de enfermedades o afecciones. Por tanto, el tratamiento profiláctico también está abarcado por la invención. Por esta razón, en los usos de la presente invención, el tratamiento o la terapia también incluyen la profilaxis o la prevención cuando sea adecuado.
Dichos aspectos preventivos (o protectores) pueden llevarse a cabo convenientemente en sujetos sanos o normales como se describe en el presente documento, y pueden incluir tanto la prevención completa como la prevención significativa. De manera similar, la prevención significativa puede incluir el escenario en donde se reduce la gravedad de la enfermedad o los síntomas de la enfermedad (p. ej., se reduce de manera medible o significativa) en comparación con la gravedad o los síntomas esperados si no se administrara ningún tratamiento. Otro aspecto más de la invención proporciona una cepa o un producto para los usos terapéuticos como se define en otra parte del presente documento, en donde dicho uso comprende además la administración de al menos un agente adicional, p. ej., un agente nutricional o terapéutico adicional. Algunos ejemplos de agentes pueden ser componentes de sustrato que aumentarán o mejorarán la producción de adenosina (p. ej., un componente que puede aumentar o mejorar la producción de adenosina), o una fuente de dichos componentes.
Por tanto, en otra realización más de la invención, en lo que se refiere a una bacteria productora de adenosina de la invención, la administración de dichas cepas o productos comprende además la administración de un componente de sustrato, p. ej., AMP y/o un material o agente que produzca este componente. Un sustrato preferido sería AMP o una fuente de AMP.
En dichas realizaciones, el componente de sustrato, u otro componente adicional, podría añadirse a la preparación bacteriana directamente antes de la administración al sujeto. Como alternativa, se podría añadir a la preparación bacteriana al final del proceso de fabricación, p. ej., al final de la fermentación, tras lo que las bacterias pueden almacenarse para un uso futuro, p. ej., mediante liofilización o criodesecación. Como alternativa, se puede administrar por separado como se describe a continuación.
En dichas realizaciones, el agente terapéutico adicional puede ser cualquier agente adicional que sea útil en el tratamiento de la enfermedad en cuestión.
Dichos agentes adicionales pueden administrarse junto con las cepas o productos de la invención (p. ej., como una preparación combinada) o pueden administrarse por separado. Además, dichos agentes adicionales se pueden administrar al mismo tiempo que las cepas o los productos de la invención o en diferentes momentos, p. ej., secuencialmente. Las pautas y los momentos de administración adecuados pueden determinarse fácilmente por el experto en la técnica dependiendo del agente adicional en cuestión. La invención también proporciona un producto combinado adecuado para aumentar la producción de melatonina o adenosina en un sujeto que comprende:
(i) una primera cepa de Lactobacillus reuteri capaz de inducir la producción de melatonina o de producir adenosina, en donde dicha cepa es una cepa de la invención; y
(ii) un componente de sustrato para aumentar o potenciar la inducción de melatonina y/o la producción de adenosina por dicha cepa de Lactobacillus reuteri, en donde dicho componente de sustrato es AMP.
En los productos combinados de la invención, los componentes (i) y (ii) generalmente se proporcionan en compartimentos o recipientes separados, o como componentes separados del kit o producto. Los kits pueden comprender componentes adicionales que también pueden estar en compartimentos o recipientes separados. Los kits (o productos combinados) se pueden utilizar en los usos de la presente invención como se describe en el presente documento, por ejemplo, en el tratamiento o la prevención de otras enfermedades descritas en el presente documento, en particular, los cólicos infantiles. Opcionalmente, se pueden proporcionar instrucciones para el uso de los kits o productos en los métodos y usos de la invención.
El término “ sujeto” como se usa en el presente documento incluye mamíferos, en particular, seres humanos, especialmente lactantes (por ejemplo, cuando la enfermedad que se ha de prevenir o tratar son los cólicos). En realizaciones preferidas de la invención, la cepa seleccionada de la invención se administra a un ser humano. Para enfermedades distintas de los cólicos, es apropiado cualquier sujeto, p. ej., un sujeto humano, p. ej., un sujeto adulto o niño o lactante, que padezca dicha enfermedad o se sospeche que padezca dicha enfermedad o que esté en riesgo de padecerla.
Un sujeto preferido según la presente invención es un lactante de menos de o hasta 12 meses, preferiblemente de menos de o hasta 5 o 6 meses, preferiblemente de menos de o hasta 3 o 4 meses. Dichos sujetos son particularmente apropiados cuando la enfermedad que se ha de tratar o prevenir es los cólicos infantiles. Por tanto,
los sujetos se pueden tratar desde el nacimiento, o en el transcurso de las primeras semanas (p. ej., en las primeras 1,2, 3 o 4 semanas) o en el transcurso de los primeros meses (p. ej., en los primeros 1, 2, 3 o 4 meses) de vida.
Como se describe en otra parte del presente documento, los sujetos preferidos son aquellos que padecen cólicos infantiles (o una de las otras enfermedades descritas en el presente documento) o que se cree o se sospecha que padecen cólicos infantiles (o una de las otras enfermedades descritas en el presente documento). Como los usos terapéuticos de la invención también se pueden utilizar para prevenir enfermedades, los sujetos apropiados incluyen aquellos con riesgo de padecer cólicos infantiles (o una de las otras enfermedades descritas en el presente documento).
Los sujetos ilustrativos incluirán lactantes amamantados exclusivamente (únicamente) con leche materna y lactantes alimentados exclusivamente (únicamente) con fórmula (lactantes no alimentados con leche materna) o lactantes que han sido alimentados tanto con leche materna como con fórmula.
Otros sujetos ilustrativos incluyen lactantes, en particular, lactantes con cólicos, con sospecha de tener cólicos o riesgo de desarrollar cólicos, que aún no producen o liberan melatonina, o que no pueden producir o liberar melatonina, por ejemplo, lactantes en los que el ciclo circadiano de la melatonina aún no se ha desarrollado o comenzado, o lactantes que no pueden producir o liberar la melatonina requerida a partir de la alimentación y/o de sus bacterias intestinales, o incluyen lactantes que tienen niveles bajos, reducidos, p. ej., significativamente reducidos (o anormales) de melatonina o deficiencia de melatonina, p. ej., en comparación con los niveles en un sujeto normal o sano, por ejemplo, los niveles en un sujeto normal o sano de la misma edad, equivalente o comparable.
Para enfermedades distintas de los cólicos, los sujetos ilustrativos incluyen sujetos que tienen niveles bajos, reducidos, p. ej., significativamente reducidos (o anormales) de melatonina o deficiencia de melatonina, p. ej., en comparación con los niveles en un sujeto normal o sano, por ejemplo, niveles en un sujeto normal o sano de la misma edad, o de una edad equivalente o comparable.
Otros sujetos ilustrativos incluyen lactantes que tienen algún tipo de problema nutricional o dietético, por ejemplo, que produce niveles bajos o deficientes de melatonina. Dichos sujetos pueden incluir lactantes nacidos antes del tiempo completo de gestación, por ejemplo, lactantes prematuros o lactantes nacidos antes de las 36 semanas de gestación, o lactantes que carecen de un metabolismo alimentario completamente funcional, o lactantes que tienen problemas de alimentación o nutrición.
Otros sujetos ilustrativos incluyen aquellos, preferiblemente lactantes, con inmadurez hormonal (en otras palabras, producción de hormonas subóptima, subnormal, subdesarrollada, deficiente, baja o inmadura), por ejemplo, en comparación con un lactante o sujeto normal de la misma edad, por ejemplo, inmadurez de melatonina, en particular, aquellos sujetos que tienen deficiencias en la motilidad intestinal debido a dicha inmadurez hormonal. Dicha inmadurez hormonal, p. ej., inmadurez de melatonina, o reducción o deficiencia de melatonina, puede estar asociada, por ejemplo, con algunos lactantes que padecen cólicos infantiles. Otras enfermedades preferidas (y, por consiguiente, otros sujetos) que se pueden tratar son enfermedades o estados asociados con la deficiencia de melatonina (o sujetos que padecen dichas enfermedades).
En todos estos sujetos, cuando procede o es necesario, los niveles de melatonina en dicho sujeto pueden medirse fácilmente mediante técnicas fácilmente disponibles y conocidas en la técnica. Por ejemplo, los niveles de melatonina se pueden medir fácilmente en muestras de suero/sangre o saliva. También hay disponibles kits comerciales para dichas mediciones.
Se puede utilizar cualquier modo de administración apropiado. Convenientemente, dicha administración es oral, rectal o por sonda. Por tanto, las bacterias se pueden administrar en el tracto GI o en la cavidad oral, según se desee o sea apropiado. Las bacterias se pueden incluir en una fórmula para lactantes o en un complemento alimenticio o en gotas de aceite, así como en una formulación farmacéutica.
Las dosis apropiadas de las cepas, los productos y las composiciones de la invención como se definen en el presente documento se pueden seleccionar fácilmente dependiendo de la enfermedad (o afección) que haya que tratarse, del modo de administración y de la formulación en cuestión.
Por ejemplo, con respecto a las cepas bacterianas para el uso de la invención, se escoge una pauta posológica o de administración de modo que las bacterias de la invención administradas al sujeto puedan dar lugar a una mayor producción, p. ej., producción local, de adenosina (o melatonina) y dar lugar a los efectos terapéuticos deseados o beneficios para la salud en los cólicos infantiles (u otra enfermedad que se vaya a tratar). Por tanto, preferiblemente, dicha posología es una posología terapéuticamente eficaz que es apropiada para el tipo de mamífero y la afección que se está tratando, y se administra, por ejemplo, a un sujeto que lo necesita. Por ejemplo se pueden usar dosis diarias, p. ej., una dosis diaria única, de 104 a 1012, por ejemplo, de 105 a 109, o de 106 a 108, o de 108 a 1010, o de 1010 a 1012 UFC totales de bacterias.
En una realización, la dosis diaria (p. ej., de 105 a 109 o de 106 a 108o de 108 a 1010 o de 1010 a 1012 de UFC) se divide en varias administraciones, p. ej., 2-8 administraciones (tales como 3-5 administraciones) o en asociación con cada alimentación (leche materna y/o fórmula) del sujeto. En una realización, se administra una dosis más alta, tal como de 2 a 10 o de 10 a 100 veces la dosis después del período inicial, y/o una dosis administrada con mayor frecuencia como dosis inicial durante 3 a 14 días (p. ej., 5 a 10 días, como 7 días) para un alivio más rápido en un sujeto.
El término “aumentar” o “ mejorar” o “superior” (o términos equivalentes) como se describe en el presente documento incluye cualquier aumento o elevación mensurable cuando se compara con un control apropiado. Un experto en la técnica identificaría fácilmente los controles apropiados, y podrían incluir los niveles cuando las cepas no estén presentes, o los niveles en sujetos no tratados o tratados con placebo, o los niveles en un sujeto sano o normal, por ejemplo, un sujeto de la misma edad, o el mismo sujeto antes del tratamiento. Preferiblemente, el aumento será significativo, por ejemplo, clínica o estadísticamente significativo, por ejemplo, con un valor de probabilidad de < 0,05.
Preferiblemente dichos aumentos (y de hecho otros aumentos, mejoras o efectos positivos como se menciona en otra parte del presente documento) son aumentos medibles, etc., (según corresponda), más preferiblemente son aumentos significativos, preferiblemente aumentos clínicamente significativos o estadísticamente significativos, por ejemplo, con un valora de probabilidad de < 0,05, en comparación con un nivel o valor de control apropiado (p. ej., en comparación con un sujeto no tratado o tratado con placebo, o en comparación con un sujeto sano o normal, o el mismo sujeto antes del tratamiento).
El término “disminuir” o “ reducir” (o términos equivalentes) como se describe en el presente documento incluye cualquier disminución o reducción medible en comparación con un control apropiado. Un experto en la técnica identificaría fácilmente los controles apropiados, y podrían incluir los niveles cuando las cepas no estén presentes, o los niveles en sujetos no tratados o tratados con placebo, o los niveles en un sujeto sano o normal, por ejemplo, un sujeto de la misma edad, o el mismo sujeto antes del tratamiento. Preferiblemente, la disminución o reducción será significativa, por ejemplo clínica o estadísticamente significativa, por ejemplo, con un valor de probabilidad de < 0,05.
Por tanto, preferiblemente dichas disminuciones (y, de hecho, otras disminuciones, reducciones o efectos negativos como se menciona en otra parte del presente documento) son disminuciones medibles, etc., (según corresponda), más preferiblemente son disminuciones significativas, preferiblemente disminuciones clínicamente significativas o estadísticamente significativas, por ejemplo, con un valor de probabilidad de < 0,05, en comparación con un nivel o valor de control apropiado (p. ej., en comparación con un sujeto no tratado o tratado con placebo, o en comparación con un sujeto sano o normal, o el mismo sujeto antes del tratamiento).
Como se usa a lo largo de toda la solicitud, los términos “un” y “ una” se usan en el sentido de que significan “al menos uno/a” , “al menos un/a primero/a” , “ uno/a o más” o “una pluralidad” de los componentes o de las etapas mencionados, excepto en los casos en donde se establezca específicamente un límite superior.
Además, cuando los términos “comprenden” , “comprende” , “tiene” o “que tiene” , u otros términos equivalentes se usan en el presente documento, entonces, en algunas realizaciones más específicas, estos términos incluyen las expresiones “consiste en” o “consiste esencialmente en” u otros términos equivalentes. Las listas que “consisten en” diversos componentes y características, como se analiza en el presente documento, también pueden referirse a listas “que comprenden” los diversos componentes y características.
Otros objetos y ventajas serán más evidentes a partir de los siguientes ejemplos no limitativos y reivindicaciones adjuntas.
Ejemplo 1
Un método para la identificación de cepas que tienen un gen que codifica una 5'-nucleotidasa ubicada en la superficie celular
Se cultivan las bacterias en placas MRS durante 16 h a 37 0C en atmósfera anaeróbica. Se recogen 10 colonias bacterianas con un asa de plástico estéril y se suspenden en 100 microlitros de agua estéril (calidad PCR). (Alternativa: se prepara el ADN del cultivo bacteriano mediante un método adecuado).
La presencia del gen de 5'-nucleotidasa se puede examinar mediante PCR, p. ej., mediante perlas de PCR PuReTaq Ready To Go (GE HealthCare) y cualquiera de los pares de cebadores descritos a continuación (0,4 mM de cada uno). Se debe añadir la suspensión bacteriana o la preparación de ADN (0,5 microlitros) a la mezcla de PCR y la reacción de PCR se debe realizar ejecutando el programa 95 0C, 5 min; x30 (95 0C, 30 s; 55 0C, 30 s; 72 0C, 30 s); 72 0C, 10 min. Los productos de PCR podrían separarse y visualizarse mediante electroforesis en gel de agarosa convencional y la secuencia determinada por secuenciación de Sanger convencional (mediante el cebador directo usado para la PCR).
El gen podría detectarse mediante cualquiera de los siguientes cebadores:
Par de cebador 1 (tamaño del producto 233 pb)
LrNuc1f: GGAACTTTGGGAAACCATGA (SEQ ID NO:2)
LrNuc1 r: CGGGCAACTTTACCATCACT (SEQ ID NO:3)
Par de cebador 2 (tamaño del producto 212 pb)
LrNuc2f: TACTCGTGAAAATGCCGTTG (SEQ ID NO:4)
LrNuc2r: GTGCCCCTGTCATTTCAACT (SEQ ID NO:5)
Par de cebador 3 (tamaño del producto 232 pb)
LrNuc3f: AGCTTTACCAAATTGACCCTGA (SEQ ID NO:6)
LrNuc3r: TTGATATTAGGCGCATCCTTTT (SEQ ID NO:7)
Secuencias
Gen que codifica la 5'-nucleotidasa anclada a la superficie celular, número de acceso de GenBank: AEI56270.1, proteína de dominio de anclaje a la pared celular con motivo LPXTG [Lactobacillus reuteri SD2112] (SEQ ID NO: 8)
A T G A A G A A T A A T A GTT C A A A A T A TTG TT T ATTGTT AG GG A C AG C GC T GTTAG G A C TAT ATTTCCAAG CTAATAG TG TTC ATGC G G AT G C G A C T G G T A T C A C A G C T A A T G G A G A A A C T A C C C A T A G C A A T G T T A C T C C A A T G G T T C A G A C T A A T A A G G A 7G A G G C A A G T A C A C C G C A A A C A A C T A C T G A T T G G T C T G A C C C G G C C A A A T A T C A A A G T G A C A T T C C AG T T C A G A T T T T AG G AAT C AA T G AC T T G €AT G G T G G G T T A G A AAC G A C T G G AT C A GC T A C G AT T G G A G A T A A G A C T TATT C G AAT G C C G G A A C AGTTGC A C G C CT A GCTGGT A A C C T T G AT G C G G C G G AG G A A A G T T IT A A G A A C G C T A A T C C G A C G G G A a g c t c a a t t c g g g t a g a a g c c g g a g a t a t g g t t g g g g c t t c t c c a g c a a a t t c t g C T C T T C T C C AA G AC G AA T C A AC C AT G C AT G C T TT AG ACG C AAT G C A m T G A A A T AG G AAC T T T G G G AAAC C A T G AG T T C G AT G AAG G T T T A G C T G AG T AT A T G C G G AT T G T T AAT G G T G G T G A A C C T A C T A A A C A A T A T A A T G A A G C T G A G A T G G C C T A T C C T C AT G T G A A A A C A G G G A T T AATAT CAT TACT G CC AAT G TT G T AAAT A A A T C T G AT G G TC A A A T C C C AT T T G G AAT G C A A C C A T ACTTGATT A A A G A A A T T C AT ACT AG T G A T G G TAAAG TT G C CC G G ATC G G AT TT AT TG G G ATT G AAAC TACT TC CCT AC CAATT TT A A C C T T A T A C G A T A A T l'A C A A A G A T 1 A T G AT G T T T T AG AC G AG G C T G A AAC A AT T G C A A A A T AT G ATC AAATT TT ACG C A A A A A A G G T G T T A A C G C AATTGT AGTTCTTG CCC AT AC AGGGGTTTC A ACTG AT A A A G AT G G C AG C AC TA A AG G T A ATGCTGTTGA TATCATTAAG AAG CT TT ACC AAAT TG AC CC TG AT AAT TC TG T CG AC CTT TATAT TG
c t g g t c a c t c c c a c c a a t a t g c t a a t g c t a c t g t t g g a a g t g t a a a a t t a g t g c a AG C C ATTT A C A C G G G T A A AG C T T AC G AT G AT ATT A T C G G T I ’ A C A T C G A T C C A A C A ACTAATGATTTTGCGCCCAATAGTCTCGTTTCACATGTCTTTCCGGTACTATCTGA A A A G G A T G C G C C T A A T A T C A A A A C G G A T G C A A A T G T T A C A G C A A T T G T T G A A G A TGC G A A C A A C C G AG T A G C ACCG AT TAT T A A C A A G A A A A T A G G G G A A G C T GCTAC AACAG G CG AT AT T C T T G G AC G AC T T C AT AAT AC T C C T AC T C G T G AAA AT G C C G T T G G TG AAT TAG T TG T CG AT G G T CAATT AT ATG C CG CT CAT AAAG TAG G CT TACCAG CT G AT TT TG CG AT G ACT AAT ACAG G G G G CG T TCG T G CAG AT CT G CAT G TT AAT CC TGATC G T TC CAT TACAT G G G G G AG TG C CC AAG CAG T TC AAC CATT TG G TAATAT T T T G C G G G T A G T T G A A A T G A C A G G G G C A C A A A T C G T T G A A G C C T T G A A T C A A C A A T A C G A C G A A G A T C A A G C TTACTACTTAC A G A T T TC C G G G C TAC ATTATACTTATAC T G A C C A A A A C G A T C C T A A C C A A C C A T A T A A G G T C G T T C A A G T T T A T G A C C A A C A T AA T C A ACC G CT TG AT ATG AA TAA G ACT TAC AAT G TT G TT ATT AAT G ACT TT TT AG C AGGTGGCGGAGATGGCTTTTCTGC ATTTA AG G G TACTA A AGTTGTCGGG ATTGTT GGTC A A G A T A C AG ACG CG TTT ATTG ACTAT ATT ACTG AT A T G A C T A A T G A T G G TA A A C C A A T T A C T G C G C C A A C A A T G A A C C G T A A G A n T A C T T G A C T G C T G A A C A A G T A G C G A A G G C T G A C T C A G A T T C A C A G T T A C A A A C A G G A A C T A A T C A G A A C A C T C A A A A C G A T G C T A A T T C C C A G A C T G A A G G A A A T C A G C T T C A A G A A G T T C C G A G C C A A C C G G T A T C T C C A A C A G T A A C C T T G C C A A C A A C A G C T G G T C A A C C C G C C G A A A C T G T T A C A C T A C A T G C T C A A T C T A A G C A A C A A A C C G T A G C T G C T A A T A A T C A A T T A A TTAATTTGAC G CCTAC ATC A A T T AAT G G C C A A A A A C A A A A A G C AG C T G A C C A G C A A G C AG C T T T AC C AC A AAC T AG T AAC G A T G AAG AT C T T G C AT T AC T T C T T C T C G G A AGTTCATT A A T G G C A G C A A C C G G A T T G A C A A T T A T T G A T C G C A A G C G T A A A C A T G CTTAA
Proteína 5'-nucleotidasa anclada a la superficie celular, número de acceso de GenBank: AEI56270.1, proteína de dominio de anclaje a la pared celular con motivo LPXTG [Lactobacillus reuteri SD2112] (SEQ ID NO: 9)
M K NN S S K Y C LLLGT A L LG L YF Q AN S VH A DA TGITANGETTHSN VT P M VQT NI K DE A S TPCJTTrDW SDPAKYQSDIPVQILGIN DLHGGLETTGSATIC D K T YSN A G T VAR LAG N L DAAEESFKNANPTGSSTRVEAGDMVGASPANSAT.LQDESTMHALDAMHFETGTLGN HEFDEG LAE YM R1VNGGEPTKQ YN E AEM A Y Pí i V K T G 1N11T A N V V NKS DGQ1PFGMQ PYLIKEIEiTSD GKVARlG r IGIETTSLPILILYDIS YK D YD V LD E AE T1AKYD Q ILR KK G V N AJVV LAH TG V STD KD GS TKG N AVD ÜK K L YQ IDPDNSV D LY IA GHSHQ Y A N A T V G S VKLVQAEYTGKAYDDHGYIDPTTNDFAPNSLVSHVFPVLSEKDAPNEKTDANVTAIVE D A N N R V A PE E N K KIGE A ATTGDILGRLH N T PTR E N A VGEL V VDGQL Y AA H K VG LPAD FAMTN rG G V RAD LH VN PD R SlTW G S AQ AVQPKGN ILRVVEM TGAQlVEALN QQYDE DQ AYYLQI8GLH YTYTDQN DPN QPYKVVQVYDQH N OPLDM N KTYN VVIN DFLAGG G D G F8AFKG T KVV G IVG Q D I DAFIDY1TDMTNDGKPJT APTM N RKIYLTAEQ VAKAD SDSQLQTGTNQNTQNDANSQTEGNQLQEVPSQPVSPTVTLPTTAGQPAETVTLHAQS KQQTVAAN N QLIN LTPTSTNGQKQKAADQQAALPQTSN DEDLALLLLGSSLM AATGL TUDRKRKH A
Ejemplo 2
Procedimiento para analizar la actividad 5'-nucleotidasa
Se utilizó el kit de ensayo de 5'-nucleotidasa Crystal Chem (Crystal Chem, Elk Grove Village, IL, EE. UU.) para determinar la actividad 5'-nucleotidasa de las células bacterianas y los sobrenadantes de fermentación. En resumen, el procedimiento fue el siguiente.
En dos etapas, se añadieron los reactivos CC1 y CC2 a las muestras que contenían las bacterias o los sobrenadantes. El Reactivo 1 contiene AMP que fue convertido en adenosina por la enzima 5'-nucleotidasa de la bacteria. La adenosina se hidrolizó posteriormente en inosina e hipoxantina por los componentes del reactivo 1. En la segunda etapa, la hipoxantina se convirtió en ácido úrico y peróxido de hidrógeno, que se utilizó para generar un colorante de quinona que se midió cinéticamente a 550 nm en un espectrofotómetro. La actividad se determinó calculando el cambio de absorbancia entre 3 y 5 minutos y comparándolo con el valor de una muestra de calibrador.
Ejemplo 3
Actividad 5'-nucleotidasa en cepas de Lactobacillus reuteri
Los datos experimentales que muestran actividad 5'-nucleotidasa en Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 y DSM 32849 (todas depositadas en virtud del Tratado de Budapest en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig) el 4 de julio de 2018), así como en Lactobacillus reuteri DSM 17938 (depositada en virtud del Tratado de Budapest en DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig) el 30 de enero de 2006) se generaron mediante el método descrito en el Ejemplo 2 anterior. Los resultados se muestran en la Figura 3.
Ejemplo 4
Selección de cepas
Todas las cepas nuevas del Ejemplo 3 anterior, es decir Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 y DSM 32849 muestran actividad 5'-nucleotidasa en el sobrenadante bacteriano. El análisis se llevó a cabo en el sobrenadante de cultivos bacterianos con la concentración de 109 bacterias por ml.
Las Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 y DSM 32849 se han desarrollado/han evolucionado para mejorar las propiedades. Se ha hecho que DSM 32846 y DSM 32847 evolucionen para ser más tolerantes a los ácidos biliares y, por lo tanto, sobrevivan en mayor número en el tracto GI. DSM 32848 y DSM 32849 han evolucionado para adherirse mejor a la mucosidad, con el objetivo de colonizar mejor el tracto GI y, por lo tanto, funcionar mejor según la presente invención.
Se seleccionan todas las cepas de Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32848 and DSM 32849. Las cepas preferidas son DSM 32846, DSM 32847 y DSM 32849.
Ejemplo 5
Efectos de las cepas bacterianas probióticas sobre la producción de melatonina en un modelo enteroide intestinal humano
Antecedentes
Los Enteroides intestinales Humanos (EIH) que derivan de células madre de la cripta intestinal son adecuados biológicamente en un modelo in vitro del epitelio intestinal. Los EIH contienen todos los tipos de células epiteliales intestinales; sin embargo, de manera similar al intestino humano, los EIH normalmente producen Células EnteroEndocrinas (CEE) en cantidades bajas (~1 %), lo que limita su estudio. Para aumentar el número de CEE en los EIH, se utilizó una transducción de lentivirus para diseñar de manera estable EIH yeyunales con expresión de neurogenina-3 (NGN3) inducible por doxiciclina, un factor de transcripción que impulsa la diferenciación de las CEE (tetNGN3-EIH). En esta estirpe celular modificada genéticamente, el número de células enteroendocrinas presentes en el cultivo aumenta del < 1 % al ~40 %.
Materiales y métodos
Enteroides intestinales humanos
Se generaron cultivos de EIH a partir de criptas aisladas de los tejidos yeyunales de pacientes adultos sometidos a cirugía bariátrica. Estos cultivos establecidos se obtuvieron en la Facultad de Medicina de Baylor a través del Núcleo de Investigación Clínica y Diseño de Estudios del Centro de Enfermedades Digestivas del Centro Médico de Texas. Se prepararon cultivos de EIH tridimensionales a partir de muestras de tejido y se mantuvieron en cultivo. Para aumentar el número de CEE en los EIH, se utilizó una transducción de lentivirus para diseñar de manera estable EIH yeyunales con expresión de neurogenina-3 (NGN3) inducible por doxiciclina, un factor de transcripción que impulsa la diferenciación de las CEE (tetNGN3-EIH). En esta estirpe celular modificada genéticamente, el número de células enteroendocrinas presentes en el cultivo aumenta del < 1 % al ~40 %. Todos los enteroides se propagaron y diferenciaron en forma de monocapa de 96 pocillos según los protocolos convencionales. Más información sobre esta estirpe enteroide, cómo se cultiva y la metodología general para el ensayo se describen en Chang-Graham y col. (Chang-Graham y col., “ Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology” , 2019, S2352-345X(19)30049-9, en prensa, publicación en línea disponible).
Cepas y preparaciones bacterianas
En este experimento, se estudiaron dos cepas diferentes de Lactobacillus reuteri (DSM 17938 y DSM 32846) con respecto a su capacidad para aumentar la producción de melatonina en el intestino.
En este estudio, se utilizó medio acondicionado (sobrenadante) de Lactobacillus reuteri DSM 17938 y Lactobacillus reuteri DSM 32846 cultivado en Medio Definido 4 de Lactobacillus (LDM4, Lactobacillus Defined Media 4) hasta que alcanza la fase estacionaria; véanse más detalles a continuación.
Se recogió una única colonia de la cepa bacteriana de una placa de agar MRS y se utilizó para inocular 10 ml de caldo MRS, y se incubó en un tubo cónico bien cerrado en un baño de agua a 37 0C. Después de ocho horas, se hizo una dilución 1:10 del cultivo y se leyó la densidad óptica a 600 nm con un espectrofotómetro, a continuación, se inocularon 25 ml de LDM4 precalentado a una DO inicial de 0,1 (cálculo a continuación) y se colocaron al baño maría para incubar durante 16 horas.
o DO = 0,307. Dilución 1:10 = DO de 3,07
25 ml x (DO de 0,1) = 3,07x x = 0,814 ml
o se combinaron 814 ul con 24,19 ml de LDM4
Después de 16 horas, se retiró el cultivo. La DO final fue de 2,6. Las células se sedimentaron por centrifugación a 4700 rpm y el sobrenadante se transfirió a un tubo cónico nuevo de 50 ml. Los sobrenadantes se almacenaron a -20 °C durante la noche.
Productos químicos utilizados
AMP = Adenosina 5'-monofosfato, 99 % (Acros Organics) Código: 102790259, Lote: A0395274.
Los 10 ml de solución madre (solución madre de 2 mM = 6,9 mg/ml (347,224)) se prepararon en agua MiliQ y se filtraron esterilizados a través de un filtro de 0,22 uM.
Configuración experimental
Tratamientos de control sobre enteroides inducidos:
■ LDM4 (medio de cultivo),
■ LDM4 AMP 20 uM,
■ LDM4 AMP de 200 uM
Tratamientos experimentales de sobrenadante de DSM 32846 y DSM 17938 en enteroides inducidos:
■ Sobrenadante de DSM 32846 solo
■ Sobrenadante de DSM 32846 AMP 20 uM
■ Sobrenadante de DSM 32846 AMP 200 uM
■ Sobrenadante de DSM 17938 solo
■ Sobrenadante de DSM 17938 AMP 20 uM
■ Sobrenadante de DSM 17938 AMP 200 uM
Antes de que el sobrenadante o las otras adiciones estuvieran listas para aplicarse sobre los enteroides, se neutralizó el pH y se esterilizó el sobrenadante por filtración. Se ajustó el pH a 7,0 mediante 10-30 ul de solución de hidróxido de sodio 10 M y se midió el pH aplicando 2 ul del sobrenadante sobre papel de pH (Fisher Brand - Cat. 13 640-510 intervalo de 6,0-8,0). El sobrenadante se esterilizó por filtración mediante un filtro de 0,22 uM (filtros Thermo Scientific Nalgene Rapid Flow de 0,22 uM Código: 00158)
Se colocaron 100 ul (volumen total) de tratamiento sobre los enteroides. La incubación fue de 1 hora en los enteroides en una incubadora de cultivo tisular a 37 0C, CO2 al 5 %. Después de la incubación, se retiró el sobrenadante y se almacenó a -20 0C hasta su análisis posterior.
Se detectó la melatonina mediante ELISA (Eagle Biosciences Inc, Amherst, NH, EE. UU.). La única etapa que se realizó antes de seguir el protocolo convencional fue descongelar los sobrenadantes y dejar que alcanzaran la temperatura ambiente. (aproximadamente 20-21 grados Celsius).
Resultados
Los enteroides intestinales humanos (EIH) son adecuados biológicamente como modelo in vitro del epitelio intestinal. Como se muestra en la Figura 4, la DSM 32846 sola no tiene un efecto significativo, pero cuando se complementa con AMP, muestra un efecto pronunciado sobre la producción de melatonina de los EIH. Una mayor concentración de AMP dio una producción de melatonina aún mayor. La DSM 17938 tiene un aumento en la producción de melatonina en comparación con el control, pero menor que la DSM 32846. Por lo tanto, la DSM 32846 es una buena cepa candidata para su uso en la producción de melatonina en el intestino.
Ejemplo 6
Actividad 5'-nucleotidasa en cepas de Lactobacillus reuteri
Los datos experimentales que muestran actividad 5'-nucleotidasa en Lactobacillus reuteri DSM 33198 se generaron mediante el método descrito en el Ejemplo 2 anterior. Los resultados se muestran en la Figura 5A, en donde se han normalizado en relación con la actividad 5'-nucleotidasa de DSM17938 (actividad de DSM17938 = 1) del mismo experimento. El mismo tipo de normalización en relación con la actividad 5'-nucleotidasa de DSM17938 (actividad de DSM17938 = 1) también se ha realizado en los resultados de la Figura 3, y esto se presenta en la Figura 5B, lo que facilita la comparación del factor de cambio en la actividad 5'-nucleotidasa en relación con la DSM17938 para las diferentes cepas bacterianas.
Ejemplo 7
Selección de cepas
La nueva cepa del Ejemplo 6 anterior, es decir Lactobacillus reuteri DSM 33198 muestra una alta actividad 5'-nucleotidasa en el sobrenadante bacteriano. El análisis se llevó a cabo en el sobrenadante del cultivo bacteriano con la concentración de 109 bacterias por ml.
Lactobacillus reuteri DSM 33198 se ha desarrollado para obtener propiedades mejoradas. La cepa de L. reuteri DSM 33198 se ha modificado en un proceso de selección de varias etapas que incluye un procedimiento repetido de criodesecación para permitir que sea más tolerante y proporcionar una mayor supervivencia en el proceso de producción que su aislado nativo.
Se selecciona Lactobacillus reuteri DSM 33198.
PCT
0-1 Formulario PCT/RO/134
indicaciones referidas al depositados o a otro mat
13bis) 0-1-1 Preparado utilizando Presentación en línea PCT Versión 3.51.000.263e MT/FOP 20141031/0.20.5.20
0-2 Núm. de solicitud internacional PCT/EP2019/069984
0-3 Referencia de la presentación de 69.139115/02
3-3-1 Nombre de la institución depositaria DSM Leibniz Institute DSMZ - Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares
-3-2 Dirección de la institución depositaría Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig,
Alemania
-3-3 Fecha de depósito 4 de julio de 2018 (04.07.2018)
-3-4 Número de adhesión DSM 32848
-5 Estados designados para los que se hacen s designaciones indicaciones
Las indicaciones realizadas a continuación
referencia al o a los microorganismos depos
o a otro material biológico al o a los que se
referencia en la descripción en la:
-1 página 24
-2 línea 2
-1 página 24
-2 línea 4
-3 Identificación de depósito
-3-1 Nombre de la institución depo DSM Leibniz Institute DSMZ - Colección alemana de microorganismos y cultivos celulares
-3-2 Dirección de la institución dep Inhoffenstr. 7B, D-38124 Braunschweig,
Alemania
-3-3 Fecha de depósito 9 de julio de 2019 (09.07.2019)
-3-4 Número de adhesión DSM 33198
-5 Estados designados para lo Todas las designaciones indicaciones
Para uso exclusivo de la oficina receptora
-4 Este formulario se recibió con la solicitud Sí
internacional: (Sí o No)
-4-1 Agente autorizado 
Anna-Mari Romu-Hofmann
Para uso exclusivo de la oficina internacional
-5 Este formulario se internacional el:
-5-1 Agente autorizado 
Claims (1)
- REIVINDICACIONES1. Una cepa bacteriana, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri DSM 32846, DSM 32847, DSM 32849 o DSM 33198.2. La cepa bacteriana de la reivindicación 1, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri DSM 32846.3. La cepa bacteriana de la reivindicación 1, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri DSM 32847.4. La cepa bacteriana de la reivindicación 1, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri DSM 32849.5. La cepa bacteriana de la reivindicación 1, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri DSM 33198.6. La cepa bacteriana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en terapia.7. La cepa bacteriana de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para su uso en el tratamiento o la prevención de los cólicos infantiles en un sujeto.8. La cepa para el uso de la reivindicación 7, en donde el sujeto es un lactante de hasta 12 meses, preferiblemente de hasta 6 o 5 meses, o preferiblemente de hasta 3 o 4 meses; y/o en donde el sujeto es amamantado o alimentado con leche de fórmula, o una combinación de los mismos.9. La cepa para el uso de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde dicho uso comprende además la administración de al menos un agente adicional, en donde dicho agente adicional es AMP.10. Un método para la selección de una cepa de bacterias acidolácticas capaz de producir adenosina, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri y en donde dicho método comprende:a) cribar una cepa de bacterias acidolácticas para detectar la presencia de un gen que codifica una 5'-nucleotidasa, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri; y/ob) cribar una cepa de bacterias acidolácticas, o su sobrenadante, para detectar la presencia de una enzima 5'-nucleotidasa activa, en donde dicha cepa es Lactobacillus reuteri; yc) seleccionar una cepa de Lactobacillus reuteri que produce adenosina a un nivel que se aumenta en comparación con Lactobacillus reuteri DSM 17938; y opcionalmented) cultivar o propagar dicha cepa de Lactobacillus reuteri.i i . El método de la reivindicación 10, en donde dicha cepa se selecciona por:(i) tener una actividad 5'-nucleotidasa superior a 8 unidades/l y/o producir adenosina a un nivel superior a 8 pmol l-1 min-1; y/o(ii) dar lugar a aumentos de hasta 5 veces en la actividad 5'-nucleotidasa y/o los niveles de adenosina, en comparación con los niveles con DSM 17938; o aumentos de al menos 1,5 veces, preferiblemente aumentos de al menos 2 veces, más preferiblemente aumentos de al menos 3, 4 o 5 veces, en la actividad 5'-nucleotidasa y/o los niveles de adenosina, en comparación con los niveles con DSM 17938.12. Un producto combinado adecuado para aumentar la producción de melatonina o adenosina en un sujeto que comprende:(i) una primera cepa de Lactobacillus reuteri capaz de inducir la producción de melatonina o de producir adenosina, en donde dicha cepa es la cepa de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y (ii) un componente de sustrato para aumentar o potenciar la inducción de la producción de melatonina y/o la producción de adenosina por dicha cepa de Lactobacillus reuteri, en donde dicho componente de sustrato es AMP.
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