CN117487686A - 选择和使用褪黑素支持细菌以减少婴儿绞痛 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择和使用褪黑素支持细菌以减少婴儿绞痛。本发明具体涉及能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其用于在受试者中产生褪黑素。用于此类用途的优选菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。此类菌株的治疗用途包括治疗或预防与褪黑素缺乏有关的疾病，例如婴儿绞痛。还提供了新型菌株。

Description

选择和使用褪黑素支持细菌以减少婴儿绞痛
本申请是申请日为2019年7月24日的中国专利申请201980036257.3“选择和使用褪黑素支持细菌以减少婴儿绞痛”的分案申请。
技术领域
本发明在本文中提供了某些乳酸菌菌株、选择此类菌株的方法、以及含有此类菌株的产品，所述菌株因其增加褪黑素水平用于预防和/或治疗绞痛(或与褪黑素的水平减少有关的其它疾病)的能力而加以选择，所述能力包括产生褪黑素前体和关于褪黑素释放的其它重要组分的能力。此外，本发明涉及包含底物组分的制剂，所述底物组分特别选择为增强此类菌株的功效。
背景技术
尽管婴儿绞痛在患病率和痛苦两个方面均非常突出，但其性质和原因仍然知之甚少。还存在用于描述该病况的不同术语。这些术语包括“婴儿绞痛”、“夜晚绞痛”(因为疼痛主要限于夜晚)和“三个月绞痛”(说辞是它在出生后约三个月后消失)。不同的作者已使用了不同的定义。Wessels的定义在文献中已被广泛接受，其为绞痛是在至少三周时期的过程中，每天哭泣三个或更多个小时，每周持续三天或更多天的发作。在2006年公布的Rome III标准修改了这一标准，认为“婴儿绞痛”的诊断适用于具有易怒、焦躁或哭泣的发作的婴儿，所述发作无明显原因而起始且停止，每天持续3个或更多个小时且每周发生至少3天，但持续至少1周(有时称为修改的Wessel标准)。在Rome IV标准中进一步微调；(Benninga等人；Gastroenterology 2016；150:1443–1455)。这些定义中的任一者(Rome III或Rome IV)都与本发明相关。
迄今为止，婴儿绞痛的主要讨论的可能病因已分成：社会心理，胃肠道，包括微生物生态失调和神经发育障碍。
社会心理因素包括：正常哭泣的变型，非典型父母教养方式的行为影响，以及父母-婴儿互动中的问题表现。
胃肠道病症已牵涉绞痛，因为婴儿在哭泣时间内的腿部姿势和痛苦表情。胃肠道因素在下文简要综述：
不正确的喂养技术如奶瓶喂养、平卧位喂养，以及喂养后没有拍嗝(burping)已被视为诱发因素。已发现前六个月中的母乳喂养是保护性因素。婴儿绞痛的风险在非母乳喂养的婴儿中是1.86倍(Saavedra MA，Dacosta JS，Garcias G，Horta BL，Tomasi E，MendocaR.Infantilecolic incidence and associated risk factors:a cohort study.Pediatr(Rio J)2003；79(2):115-122)。
目前不存在绞痛的完全治愈。绞痛的当前治疗范例由药理学方法和/或非药理学方法组成，充其量提供了症状的减轻。提供给父母的关于绞痛的典型治疗干预措施落入四个范畴，包括饮食、身体、行为和药理学。饮食管理包括关于各种喂养技术的专业建议，或使用低变应原性乳、不含大豆或乳糖的配方、食物补充剂(如各种益生菌和益生元)以及固体食物的早期引入。
用于绞痛治疗的非处方药疗法在很大程度上已包括二甲基硅油或二甲基聚硅氧烷(不可吸收的非处方药)的施用，其减少肠道气泡的大小。尽管几项研究证实二甲基硅油对婴儿绞痛的有效性并不比安慰剂好，但二甲基硅油具有安全性概况且被频繁推荐。
已有一些报道暗示在绞痛婴儿中改变的微生物群模式，使得几名研究人员进行且发表了不同的随机化临床对照试验(RCT)，其中已评估了例如罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)DSM 17938减少这些婴儿中的哭泣时间的能力。例如，Savino等人(Pediatrics2010；126:e526–33)在2010年进行了RCT，以测试这种菌株对婴儿绞痛的功效。根据修改的Wessel标准诊断的50个纯母乳喂养的绞痛婴儿，被随机分配为每天接受罗伊氏乳杆菌DSM 17938(108个菌落形成单位)或安慰剂持续21天。父母问卷调查监测了每天的哭泣时间和不良反应。46个婴儿(罗伊氏乳杆菌组：25个；安慰剂组：21个)完成了试验。在第0天时，以分钟/天计(中值)的每日哭泣时间为370相对于300，而在第21天时，则为35.0相对于90.0(p＝.022)。
在2013年，Szajewska等人(J Pediatr 2013；162:257–62)发表了在年龄<5个月的80个婴儿中具有类似设计的RCT，鉴定了与安慰剂组相比，对治疗的应答者比率在益生菌组中显著更高。分钟/天(中值)在第7天时为180相对于180，在第14天时为75相对于128，而在第21天时为52相对于120(p<0.05)。还存在几项其它研究，其显示了罗伊氏乳杆菌DSM17938在绞痛婴儿中显著减少母乳喂养婴儿中的哭泣时间的效应。然而，存在关于以更高比率减少绞痛儿童，包括以更高比率减少配方喂养儿童中的哭泣的甚至更有效干预措施的需要。
因此，当前需要新的(并且优选地改进的)安全有效的化合物和组合物和技术，其证明对于治疗婴儿中的绞痛有用。本发明的组合物和方法响应了这一需要，提供了可以安全有效地预防且治疗婴儿中的绞痛(或与绞痛有关的症状)的产品。
其它目的和优点根据下述公开内容将是更显而易见的。
发明内容
新生儿激素不成熟被暗示为肠动力发育的早期问题中的主要因素，并且因此也引起婴儿例如婴儿绞痛中的疼痛和哭泣。褪黑素是一种激素，其具有支持生物节律的能力，并且对人和动物中的许多功能具有重要作用。褪黑素的前体是5-羟色胺，一种本身可以来源于氨基酸色氨酸的神经递质。
褪黑素是先前被认为占优势地由松果体分泌的神经递质。然而，存在褪黑素产生的松果体外部位，例如视网膜和胃肠道。
小婴儿中的5-羟色胺和褪黑素产生和不同昼夜节律之间的同步以及随后释放，对避免肠动力紊乱和疼痛例如婴儿绞痛(IC)是潜在地重要的。
5-羟色胺增加肠道平滑肌收缩，而褪黑素使肠道平滑肌松弛。如果不被其它试剂(褪黑素是其中重要的一种)平衡，则5-羟色胺浓度峰值可以引起肠痛性痉挛。5-羟色胺和褪黑素两者均具有昼夜节律。虽然在婴儿出生时存在产生的5-羟色胺和发展的5-羟色胺昼夜节律，但内源性褪黑素产生和褪黑素昼夜节律在许多婴儿中直到出生第三个月后才开始准备好。这个时间与婴儿绞痛的正常消失时间相一致。
可以说婴儿绞痛是褪黑素缺乏的病况。因此，已建议给予患有IC的婴儿外源性褪黑素，但许多医生和父母都不愿给予婴儿激素。
在所有新生儿中，存在估计为5％至25％的IC患病率，这在几个方面对于社会、父母和婴儿本身是累赘和高成本的。
因此，尽管一些儿童似乎能够由其食物和/或其肠道细菌产生且释放所需的褪黑素，并且因此不太可能发展婴儿绞痛，但仍有许多儿童不是这样，并且因此需要额外的支持来预防或治疗IC。
因此，需要寻找且开发产品和方法，以支持处于发展IC或患有IC的风险中的儿童中的褪黑素产生和释放。
本发明基于以下发现：可以选择能够产生腺苷的细菌，例如乳酸菌。产生腺苷的乳酸菌在本领域中尚未得到报道，并且此类细菌可以例如用于增加褪黑素合成中的限速酶，芳烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)的产生。尽管AANAT酶在松果体中发现，但它也在褪黑素产生的松果体外部位例如胃肠道中产生。因此，AANAT产生中的增加(例如，经由腺苷产生中的增加)提供了增加胃肠道中的褪黑素产生、或增加褪黑素水平的手段。因此，此类细菌可以用于治疗或预防婴儿绞痛或其它疾病，所述其它疾病与褪黑素产生或合成减少、低或不足有关，或者以其为特征。
因此，本发明提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其能够产生腺苷或诱导腺苷产生，用于受试者中的腺苷产生(例如，增加腺苷水平或者增加或促进腺苷的产生)、或用于受试者中的褪黑素产生(例如，增加褪黑素水平或者增加或促进褪黑素的产生)。
本发明进一步提供了用于在受试者中产生腺苷或褪黑素(例如，增加腺苷或褪黑素的水平、或者增加或促进腺苷或褪黑素的产生)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的细菌菌株，例如乳酸菌菌株的步骤，所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。
本发明进一步提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，所述药物或组合物用于在受试者中产生腺苷或褪黑素(例如，增加腺苷或褪黑素的水平、或者增加或促进腺苷或褪黑素的产生)。
更一般地来看，本发明还提供了能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的细菌，例如乳酸菌。此类细菌因此可以用于在受试者中产生褪黑素，例如用于增加褪黑素的产生或水平。
因此，在一个方面，本发明提供了能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其用于在受试者中产生褪黑素(例如，增加褪黑素的水平、或者增加或促进褪黑素的产生)。
在另一个方面，本发明提供了在受试者中产生褪黑素(例如，增加褪黑素的水平、或者增加或促进褪黑素的产生)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的乳酸菌菌株的步骤，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。
在另一个方面，本发明提供了乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，所述药物或组合物用于在受试者中产生褪黑素(例如，增加褪黑素的水平、或者增加或促进褪黑素的产生)。
如上文讨论的，此类菌株可以用于治疗或预防婴儿绞痛或其它疾病，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征。
因此，本发明进一步提供了用于在治疗或预防受试者中的婴儿绞痛或其它疾病中使用的乳酸菌菌株，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征。
在另一个方面，本发明提供了治疗或预防受试者中的婴儿绞痛或其它疾病的方法，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征，所述方法包括向所述受试者施用有效量的乳酸菌菌株的步骤，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。
在另一个方面，本发明提供了乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，所述药物或组合物用于治疗或预防受试者中的婴儿绞痛或其它疾病，所述其它疾病与褪黑素产生或合成或水平减少、低或不足有关，或者以其为特征。
如本文其它地方所述，此类菌株可能能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，且从而产生褪黑素或诱导褪黑素的产生(例如下游产生)。
本发明的其它目的和优点对于读者将变得显而易见，并且预期这些目的和优点在本发明的范围内。
本发明涉及以下实施方案
1.一种能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其用于在受试者中产生褪黑素。
2.用于实施方案1的用途的菌株，其中所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生。
3.实施方案1或实施方案2的菌株，其中所述乳酸菌菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因、或具有活性5'-核苷酸酶。
4.用于实施方案1至3中任一项的用途的菌株，其中所述菌株具有大于2单位/L或8单位/L的5'-核苷酸酶活性，和/或能够以大于2μmol L-1分钟-1或8μmol L-1分钟-1的水平产生腺苷或诱导其产生，和/或能够产生其水平为大于10或20pg/ml的褪黑素或诱导其产生。
5.用于实施方案1至4中任一项的用途的菌株，其中所述用途是治疗或预防与褪黑素缺乏或减少有关的疾病。
6.用于实施方案1至5中任一项的用途的菌株，其中所述用途是治疗或预防婴儿绞痛。
7.用于实施方案1至6中任一项的用途的菌株，其中所述受试者是多至12个月龄，优选多至6或5个月龄，或优选多至3或4个月龄的婴儿；和/或其中所述受试者是母乳喂养的或用配方奶喂养的或其组合。
8.用于实施方案1至7中任一项的用途的菌株，其中所述用途是治疗或预防肠易激综合征(IBS)、睡眠障碍或神经变性疾病，优选阿尔茨海默病或其它类型的痴呆。
9.用于实施方案1至8中任一项的用途的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)，优选地其中所述菌株不是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。
10.用于实施方案1至9中任一项的用途的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌DSM32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198。
11.用于实施方案1至10中任一项的用途的菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶活性，和/或能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，和/或能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生，其水平与罗伊氏乳杆菌DSM 17938相比是增加的。
12.用于实施方案1至11中任一项的用途的菌株，其中所述用途进一步包括施用至少一种另外的试剂，优选地，其中所述另外的试剂是AMP或AMP的来源。
13.一种能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，其中所述菌株不是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。
14.一种乳酸菌菌株或实施方案13的菌株，其中所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生，其中所述菌株不是罗伊氏乳杆菌DSM 17938。
15.实施方案13或实施方案14的菌株，其中所述菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因、或具有活性5'-核苷酸酶。
16.实施方案13至15中任一项的菌株，其中所述菌株具有大于2单位/L或8单位/L的5'-核苷酸酶活性，和/或能够以大于2μmol L-1分钟-1或8μmol L-1分钟-1的水平产生腺苷或诱导其产生，和/或能够产生其水平为大于10或20pg/ml的褪黑素或诱导其产生。
17.实施方案13至16中任一项的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌，优选罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849或DSM 33198。
18.一种细菌菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM32848、DSM 32849或DSM 33198。
19.实施方案18的菌株，其用于疗法中。
20.实施方案18或实施方案19的菌株，其中所述菌株用于治疗或预防婴儿绞痛。
21.实施方案18或实施方案19的菌株，其中所述菌株用于治疗或预防肠易激综合征(IBS)、睡眠障碍或神经变性疾病，优选阿尔茨海默病或其它类型的痴呆。
22.实施方案13至21中任一项的菌株在用于生产褪黑素的方法中的用途，或实施方案14至21中任一项的菌株在用于生产腺苷的方法中的用途。
23.实施方案22的用途，其中通过所述菌株产生的腺苷被转化为褪黑素。
24.一种用于选择能够产生腺苷的乳酸菌菌株的方法，其中所述方法包括：
a)对于编码5'-核苷酸酶的基因的存在，筛选乳酸菌菌株；和/或
b)对于活性5'-核苷酸酶的存在，筛选乳酸菌菌株或其上清液；和
c)选择能够产生腺苷的菌株；以及任选地
d)培养或繁殖此类菌株。
25.实施方案24的方法，其中对于以下选择所述菌株：具有大于2单位/L的5'-核苷酸酶活性和/或能够以大于2μmol L-1分钟-1的水平产生腺苷，优选地具有大于8单位/L的活性和/或能够以大于8μmol L-1分钟-1的水平产生腺苷。
26.实施方案24至25中任一项的方法，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌。
27.一种通过实施方案24至26中任一项的方法选择的乳酸菌菌株，其中所述菌株能够产生腺苷。
28.实施方案27的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM32848、DSM 32849或DSM 33198。
29.一种通过根据实施方案24至26中任一项的方法选择的菌株，其中所述乳酸菌菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因、或具有活性5'-核苷酸酶，并且能够产生腺苷，所述乳酸菌菌株用于在受试者中产生腺苷，或用于在受试者中产生褪黑素，优选地其中所述用途如实施方案5至8中任一项中限定的。
30.一种适合于增加受试者中的褪黑素或腺苷产生的组合产品，其包含：
(i)能够产生褪黑素或腺苷或者诱导褪黑素或腺苷的产生的第一乳酸菌菌株；和
(ii)褪黑素和/或腺苷的另外的来源，或者增加或增强通过所述乳酸菌菌株的褪黑素和/或腺苷产生或诱导的一种或多种底物组分或试剂，
优选地其中所述菌株如实施方案13至18中任一项中限定的，和/或其中所述底物组分是AMP或AMP的来源。
31.一种在受试者中产生褪黑素的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的乳酸菌菌株的步骤，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。
32.乳酸菌菌株在制造用于在受试者中产生褪黑素的药物或组合物中的用途，所述乳酸菌菌株能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生。
33.实施方案31或实施方案32的方法或用途，其治疗所述受试者中选自以下的疾病：婴儿绞痛、肠易激综合征(IBS)、睡眠障碍和神经变性疾病，优选阿尔茨海默病或其它类型的痴呆。
34.实施方案31至33中任一项的方法或用途，其中所述菌株或所述疾病或所述受试者或所述施用如实施方案2至18中任一项中限定的。
附图说明
图1是显示了褪黑素生产途径的示意图。
图2是显示了本发明的能够产生腺苷的细菌如何影响褪黑素生产途径的示意图。
图3显示了罗伊氏乳杆菌细菌细胞的上清液中的5'-核苷酸酶活性的测量。
图4显示了通过添加罗伊氏乳杆菌细菌细胞上清液，在肠道肠状模型(intestinalenteroidmodel)中的褪黑素产生。
图5A显示了与DSM 17938细菌细胞相比，罗伊氏乳杆菌DSM 33198细菌细胞的上清液中的5'-核苷酸酶活性的测量。图5B显示了与DSM 17938细菌细胞相比，各种罗伊氏乳杆菌细菌细胞的上清液中的5'-核苷酸酶活性的测量。
具体实施方式
因此，如上文概述的，本发明提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其特别是在胃肠(GI)道中能够产生褪黑素或者刺激或诱导或支持褪黑素的产生，例如以增加褪黑素的水平。此类菌株本身可以产生褪黑素，例如分泌褪黑素，并且因此直接提供或产生褪黑素。
然而，还提供的是这样的菌株，其例如通过产生褪黑素合成途径的上游组分(或褪黑素的前体)、或者刺激或诱导褪黑素合成途径的上游组分(或褪黑素的前体)的产生，并且从而支持或增加褪黑素产生，间接地导致褪黑素的产生。一个优选实例是芳烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)的产生或诱导，所述AANAT是5-羟色胺转化为N-乙酰基5-羟色胺中的限速酶，所述N-乙酰基5-羟色胺依次又转化成褪黑素。
如上文概述的，另一种特别优选的乳酸菌菌株是可以在受试者中，特别是在胃肠(GI)道中产生或诱导腺苷的菌株。此类腺苷可以作用于适当的细胞表面腺苷受体(例如A2A受体、A2B受体、A3或A4受体，优选A2A受体)，并且导致产生升高水平的细胞内cAMP。A2A和其它腺苷受体已知存在于GI道中发现的细胞中。细胞内cAMP依次又涉及AANAT的产生(参见图2)。因此，增加的细胞内cAMP水平可以导致增加的AANAT水平，并且因此导致增加的褪黑素水平。因此，腺苷应该优选在细胞外提供，以便能够结合细胞表面腺苷受体。为此，腺苷可以在细菌细胞内产生，并且转运到细胞外(或分泌)。可替代地，腺苷可以在细胞外产生，例如在细菌细胞表面上或在上清液中产生。此类细胞外产生可以例如方便地借助于细胞壁(或细胞表面)锚定的5'-核苷酸酶(或胞外5'-核苷酸酶)的存在而发生，所述酶可以将适当的底物转化为腺苷。此类细胞外产生可以同样借助于在细胞上清液或细胞外空间中的5'-核苷酸酶(或胞外5'-核苷酸酶)的存在而发生。如本文所示，细菌菌株可以将此类5'-核苷酸酶(或胞外5'-核苷酸酶)提供或产生或释放到细胞上清液或细胞外空间内，所述酶然后可以在其中将适当的底物转化为腺苷。适当的底物包括AMP。
因此，当细菌菌株在本文中被称为能够产生腺苷时，这包括通过细菌细胞本身直接产生腺苷，并且还包括通过细菌细胞借助于细胞产生腺苷，所述细胞具有活性5'-核苷酸酶(例如，存在于细菌细胞表面上、或者释放到细胞上清液或细胞外空间内)，并且从而将适当的底物例如AMP转化为腺苷或能够将其转化为腺苷。此类底物可以是例如在环境中内源性地天然存在的，或者可以例如通过外源手段提供给细菌。
因此，例如与其中不存在此类菌株的水平相比，此类菌株可以导致增加水平的褪黑素。
褪黑素已知在GI道产生，并且因此这个区域中的产生或增加的产生应该是生理学上有效的。优选地，产生的褪黑素的量是临床上或治疗上重要的。因此，本发明的菌株可以用于治疗与褪黑素的减少或降低水平有关(或以其为特征)、或者与褪黑素缺乏有关(或以其为特征)的任何疾病或病况，或者可以用于治疗将获益于褪黑素的水平增加的任何疾病或病况。此类疾病或病况(以及实际上患有此类疾病或病况的受试者)将容易地被本领域技术人员识别，并且例如包括这样的疾病、病况或受试者，例如与正常或健康受试者中的水平，例如具有相同、相当或可比较年龄的正常或健康受试者中的水平相比，所述疾病、病况或受试者具有如低、减少例如显著减少(或异常)水平的褪黑素或者褪黑素缺乏。此类疾病的优选实例是婴儿绞痛。用于此类治疗用途的优选菌株是产生褪黑素或腺苷的那些菌株。
因此，本发明的再进一步方面提供了能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的乳酸菌菌株，例如，由于所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生；或者提供了能够产生腺苷或诱导腺苷的产生的乳酸菌菌株。还提供了此类菌株的治疗用途。优选地，所述菌株具有编码5'-核苷酸酶的基因，或者此类菌株具有活性5'-核苷酸酶，例如以将AMP(或其它适当的底物)转化为腺苷。腺苷产生的示例性水平或者5'-核苷酸酶活性或褪黑素产生的水平在本文其它地方所述。
本发明的优选菌株是罗伊氏乳杆菌菌株，更优选罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198(其保藏细节在本文其它地方提供)，并且此类菌株，例如分离的菌株或者此类菌株的生物学纯培养物或制剂，构成本发明的进一步方面，如包含此类菌株的组合物(例如药物或营养组合物，例如食物补充剂或益生菌组合物，例如具有药学上或营养学上可接受的稀释剂和/或赋形剂)，或者例如如本文其它地方所述，此类菌株特别用于治疗或预防婴儿绞痛(或如本文其它地方所述的其它疾病)的治疗用途一样。在一些实施方案中，不使用DSM 17938菌株。因此，本发明提供了用于疗法中，例如用于治疗或预防如本文其它地方所述的疾病的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198。本发明进一步提供了用于治疗或预防婴儿绞痛的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM33198。
因此，本发明的一个再进一步方面提供了治疗或预防受试者中的婴儿绞痛、或如本文其它地方所述的其它疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM 33198的步骤。
在另一个方面，本发明提供了罗伊氏乳杆菌菌株DSM 32846、DSM 32847、DSM32848、DSM 32849和/或DSM 33198在制造药物或组合物中的用途，所述药物或组合物用于治疗或预防受试者中的婴儿绞痛、或如本文其它地方所述的其它疾病。
如本文其它地方所述的本发明的替代和优选实施方案和特点，同样适用于此处以及本文其它地方所述的本发明的治疗方法和用途。
菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和/或DSM33198已因其产生腺苷的能力而加以选择，例如通过具有编码5'-核苷酸酶的基因、以及可以将AMP底物转化为腺苷的活性5'-核苷酸酶，并且不仅适合于增加腺苷的水平(例如与其中不存在该菌株的水平相比)，而且还适合于例如通过如本文其它地方所述增加ANAT的水平，来增加褪黑素的水平。菌株包含活性的细胞壁锚定的5'-核苷酸酶，并且在其各自的上清液中也显示了5'-核苷酸酶活性(参见图3和图5A/B)。
这些罗伊氏乳杆菌菌株已由天然存在的菌株进行开发(换言之，进行修饰或适应或进化)，并且还已因一种或多种其它改善的特性而加以选择，所述特性例如对胆汁的抗性增加或对粘膜表面例如GI道表面的粘附性增加。因此，DSM 32846和DSM 32847已进化为对胆汁酸更耐受，并且从而例如在GI道中大量存活。DSM 32848和DSM 32849已进化为更好地粘附于粘液，目的是在GI道中更好地定殖，且从而例如根据本发明更好地起作用。罗伊氏乳杆菌菌株DSM 33198也已在包括反复冻干程序的多步骤选择方法中进行修饰，以允许其比其天然分离株(亲本菌株)更耐受，并且在生产过程中得到更高的存活。因此，此类菌株并不对应于自然界中存在的菌株，并且已被迫进化且是非天然菌株。选择了所有菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848、DSM 32849和DSM 33198。优选的菌株是DSM 32846、DSM 32847、DSM 32849或DSM 33198。更优选的菌株是DSM 32846、DSM 32847或DSM 33198。
在一个实施方案中，选择或使用了菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM32848和/或DSM 32849。优选的菌株是DSM 32846、DSM 32847或DSM32849。更优选的菌株是DSM 32846或DSM 32847，例如在一些实施方案中，DSM 32846是优选的。在一些实施方案中，选择或使用了菌株DSM 33198。
本发明提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造药物或组合物中的用途，所述菌株能够产生腺苷或诱导腺苷的产生(例如，增加腺苷的水平、或者增加或促进腺苷的产生)，所述药物或组合物用于在受试者中产生腺苷。
此类方法和用途可以用于治疗或预防婴儿绞痛或如本文其它地方所述的其它疾病，例如肠易激综合征(IBS)、睡眠障碍或者神经变性疾病或病症，例如阿尔茨海默病或其它类型的痴呆，例如其它类型的老年性痴呆。此类疾病也是与褪黑素缺乏或减少有关(或以其为特征)，或者例如将获益于褪黑素水平升高或增加的疾病的实例。
胃肠动力意指胃肠道中的肌肉伸展和收缩，以转移待消化的食物。这些肌肉的同步收缩称为蠕动。
胃肠道中存在大量局部释放的因子包括激素，其调节动力和分泌。消化系统的运动及其内部的内含物的运输决定了动力。当消化道的任何部分中的神经和/或肌肉，胃肠运动功能，无法以正常力量和协调起作用时，个人发生与动力紊乱相关的症状。
已描述了运动功能的紊乱例如在患有婴儿绞痛的受试者中的各个肠区域中产生各种症状。
婴儿绞痛是用于描述在生命的前三个月过程中无明显原因而过度哭泣的婴儿的术语。绞痛是婴儿期最令人痛苦的问题之一。它对于婴儿、父母和医疗保健提供者都是痛苦的。绞痛的原因尚未完全理解。
新生儿激素不成熟被暗示为肠动力发育的早期问题中的主要因素，并且因此也引起婴儿例如婴儿绞痛中的疼痛和哭泣。
褪黑素是一种激素，其具有支持生物节律的能力，并且对人和动物中的许多功能具有重要作用。该激素通过在胃肠道的平滑肌和肠肌丛细胞上表达的选择性受体(褪黑素受体)来影响胃肠动力。胃肠道平滑肌收缩潜在的基本机制是电流的循环生成。胃肠道的肌电活动由两种电位组成：在移行性肌电复合波(myoelectric migrating complex)中组构的慢波和尖峰活动。
褪黑素的前体是5-羟色胺，一种本身可以来源于氨基酸色氨酸的神经递质。
已显示了5-羟色胺诱导的食物运输降低部分地被褪黑素阻断。它是褪黑素和5-羟色胺在肠活动的调节中的对重平衡系统。
进一步地，有功能且平衡的褪黑素-5-羟色胺系统通过大脑和GI道两者中的内分泌效应以及旁分泌效应来影响食欲和消化过程。
两种激素的作用看起来对动力具有相反的作用，并且最终作用是剂量依赖性的。还已知褪黑素和5-羟色胺涉及超敏反应过程和疼痛传导。
褪黑素，也称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是早期被认为占优势地由松果体分泌的激素和神经递质。但是，存在褪黑素产生的重要的松果体外部位，例如视网膜和胃肠道。现在有报道显示，胃肠道中的褪黑素是松果体中的至少400倍。胃肠道褪黑素的昼夜节律变动似乎不(像松果体一样)受光暴露控制，而是受进食和食物组成控制。
小婴儿中的5-羟色胺和褪黑素产生和不同昼夜节律之间的同步以及随后释放，对避免肠动力紊乱和疼痛例如婴儿绞痛(IC)是重要的。
5-羟色胺增加肠道平滑肌收缩，而褪黑素使肠道平滑肌松弛。如果不被其它试剂(褪黑素是其中重要的一种)平衡，则5-羟色胺浓度峰值可以引起肠痛性痉挛。5-羟色胺和褪黑素两者均具有昼夜节律。虽然在婴儿出生时存在产生的5-羟色胺和发展的5-羟色胺昼夜节律，但内源性褪黑素产生和褪黑素昼夜节律在许多婴儿中直到出生第三个月后才开始准备好。这个时间与婴儿绞痛的正常消失时间相一致。已显示褪黑素对于患有绞痛的婴儿在生命早期的早晨低，而它在没有绞痛的婴儿高(Cengiz等人2015，Turkish journal offamilymedicine and primary care；9(1)/10-15)。此类婴儿(例如患有与褪黑素或褪黑素平衡的缺乏有关的婴儿绞痛形式的婴儿，例如在早晨例如在6AM、8AM、10AM或中午12点之时或之前的褪黑素水平中的缺乏)是可以使用本发明治疗的受试者的实例。
因此，尽管一些儿童似乎能够由其食物和/或其肠道细菌内源性地产生且释放所需的褪黑素，并且因此不太可能发展婴儿绞痛，但仍有许多其他儿童不是这样，并且因此需要额外的支持来预防或治疗IC。此类婴儿(例如，具有例如由并未充分发展的肠道微生物组引起的褪黑素缺乏的婴儿、或者具有营养问题或喂养问题的婴儿)也是可以使用本发明治疗的受试者的实例。
可以说婴儿绞痛是褪黑素缺乏的病况。这对于处于应激情形的儿童、或应激应对能力较弱的儿童，例如对于在足月妊娠时间之前出生、或没有完全功能性食物代谢等的儿童尤为重要。此类婴儿(例如，在足月妊娠时间之前出生的、或通过剖宫产术出生的、或没有完全功能性食物代谢的具有褪黑素缺乏的婴儿)也是可以使用本发明治疗的受试者的实例。
与褪黑素功能的平衡相关的病况的另一个实例是肠易激综合征(IBS)，其为常见病症，特征在于与在不存在可查明原因的情况下的紊乱肠排便习惯组合的复发性腹痛或不适。提示褪黑素对疼痛知觉和肠排便习惯显示正面效应(Siah KTH等人，2014，WorldJGastroenterol；20(10):2492-2498)。因此，患有IBS，特别是与褪黑素或褪黑素平衡的缺乏有关的IBS形式的受试者，也是可以使用本发明治疗的受试者的实例。
褪黑素缺乏已主要在松果体、循环、唾液、脑脊髓液中，并且通过测量尿中的代谢产物6-羟基硫酸褪黑素(6-sulfatoxymelatonin)来进行调查。
肠中存在多于20种类型的肠内分泌细胞，这使其成为人体中最大的内分泌器官。肠嗜铬(EC)细胞是一类肠内分泌和神经内分泌细胞。它们位于内衬消化道管腔的上皮旁边，并且在胃肠调节，特别是肠动力和分泌中起关键作用。EC细胞经由神经递质5-羟色胺和其它肽的分泌，来调节肠道神经系统(ENS)中的神经元信号传递，它们进一步表达腺苷受体并且具有褪黑素的活性合成。
褪黑素信号传递不足的常见症状是睡眠紊乱，并且褪黑素是当今最流行的天然健康补充剂之一。褪黑素经常被称为“黑暗激素”，因为它的合成和分泌在身体的一些位置中通过黑暗得到增强，并且受到光的抑制。睡眠紊乱在儿童中高度流行，并且如果没有适当的治疗，则可以变成慢性的并持续多年(Esposito等人2019，J Transl Med，17:77)。据报道，即使是老年人群也经历睡眠紊乱。定期观察到夜间褪黑素峰值在衰老过程中降低。因此，具有或患有睡眠紊乱或睡眠障碍，特别是与褪黑素或褪黑素平衡的缺乏有关的睡眠紊乱或睡眠障碍形式的受试者，也是可以使用本发明治疗的受试者的实例。
在神经变性病症中，尤其是阿尔茨海默病和其它类型的老年性痴呆中，褪黑素的水平降低也已得到反复描述(Blumenbach Johann Friedrich，2012，The ScientificWorld JournalVolume 2012，Article ID 640389)。因此，患有此类神经变性病症，特别是与褪黑素或褪黑素平衡的缺乏有关的此类神经变性病症形式的受试者，也是可以使用本发明治疗的受试者的实例。
褪黑素形成的速率取决于在松果体中以及在褪黑素产生的松果体外部位处，例如胃肠道中的酶，芳烷基胺-N-乙酰基转移酶(AANAT)的活性(图1和图2)。腺苷经由腺苷受体增加细胞内cAMP水平，其增加褪黑素合成中的限速酶AANAT的产生。
本发明的一个目的是使用产生腺苷的乳酸菌菌株来预防和/或治疗婴儿绞痛。
本发明的另一个目的是使用产生腺苷的乳酸菌菌株来预防和/或治疗IBS。
本发明的另一个目的是使用产生腺苷的乳酸菌菌株来预防和/或治疗睡眠障碍。
本发明的另一个目的是使用产生腺苷的乳酸菌菌株来预防和/或治疗神经变性病症，例如阿尔茨海默病和其它类型的痴呆，例如其它类型的老年性痴呆。
本发明还涉及用于选择能够产生腺苷的特定细菌菌株，包括乳酸菌菌株的方法，以及此类菌株对于患有绞痛或处于绞痛风险中的婴儿递送有益效应的用途。本发明的一个进一步目的是提供能够产生腺苷的新细菌菌株。
人体中一个重要的代谢过程是嘌呤代谢，其中嘌呤被特异性酶代谢且分解。这些酶的一个实例是胞外-5'-核苷酸酶(CD73)，其被认为是腺苷生成中的关键酶。
本发明人惊讶地发现一些特定益生菌菌株能够产生腺苷。
因此，本发明包括选择有效产生腺苷的特定细菌菌株，包括乳酸菌菌株的新方法。选择特定细菌菌株的目的是将它们用于治疗某些病症，例如婴儿绞痛(或如本文其它地方所述的其它疾病)。
本发明提供了用于选择细菌菌株，特别是乳酸菌菌株的方法，所述菌株可用作益生菌并用于疗法中，例如作为药物或食物补充剂。
因此，本发明的一个方面提供了用于选择能够产生腺苷的细菌菌株，优选乳酸菌菌株的方法，其中所述方法包括：
a)对于编码5'-核苷酸酶例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的基因的存在，筛选细菌菌株例如乳酸菌菌株；和/或
b)对于活性5'-核苷酸酶例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的存在，筛选细菌菌株例如乳酸菌菌株或其上清液。
此类5'-核苷酸酶(5'NT)酶也可以被称为胞外-5'核苷酸酶或CD73(分化簇73)。然后可以选择能够产生腺苷的菌株。
可替代地来看，本发明提供了通过以下用于选择细菌菌株优选乳酸菌菌株的方法：对于其产生腺苷的能力筛选细菌菌株例如乳酸菌菌株，并且选择具有该能力的菌株。
一旦已使用本发明的方法选择了适当的菌株，它就可以随后用于在受试者中产生例如局部产生腺苷。
通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株是本发明的一个再进一步方面，其中所述菌株能够在受试者中产生腺苷，例如局部产生腺苷。
还提供了通过本发明选择的菌株在婴儿绞痛(或如本文其它地方所述的其它疾病)中的治疗用途。
因此，本发明的一个进一步方面提供了通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶，并且能够产生腺苷，其用于在受试者中产生例如局部产生腺苷。
本发明的替代实施方案提供了用于在受试者中产生例如局部产生腺苷的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'-核苷酸酶基因或活性5'-核苷酸酶，并且能够产生腺苷。这种菌株的优选特点及其用途在本文其它地方描述。
如本文其它地方概述的，本发明的特定实施方案是预防和/或治疗婴儿绞痛(或如本文其它地方所述的其它疾病)。
还提供了治疗方法或用于在受试者中产生例如局部产生腺苷的方法，所述方法包括以有效允许在所述受试者中产生例如局部产生腺苷的量，向所述受试者施用通过本发明的选择方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，或者施用细菌菌株例如乳酸菌菌株，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶，并且能够产生腺苷。菌株的优选特点及其例如在婴儿绞痛(或如本文其它地方所述的其它疾病)中的治疗用途在本文其它地方描述。
本发明还提供的是通过本发明的选择方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造组合物或药物中的用途，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶，并且能够产生腺苷，所述组合物或药物用于在受试者中产生例如局部产生腺苷。替代实施方案提供了细菌菌株，例如乳酸菌菌株在制造组合物或药物中的用途，其中所述菌株具有5'核苷酸酶基因或活性5'核苷酸酶，并且能够产生腺苷，所述组合物或药物用于在受试者中产生例如局部产生腺苷。菌株的优选特点及其例如在婴儿绞痛(或如本文其它地方所述的其它疾病)中的治疗用途在本文其它地方描述。
包含如本文所述的细菌菌株(例如包含一种或多种细菌菌株)(例如能够产生或诱导腺苷、褪黑素等的细菌菌株)的产品或组合物，例如药物组合物、益生菌组合物、或饮食/营养组合物，以及所述产品或组合物在如本文所述的方法和用途中的使用，构成本发明的再进一步方面。
联合国粮食及农业组织(Food and Agricultural Organization of the UnitedNations)将益生菌定义为“当以足够的量施用时，对宿主赋予健康益处的活微生物”。如今，许多不同的细菌被用作益生菌，例如产生乳酸的细菌，如乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的菌株。
如本文其它地方所述，本发明的替代和优选的实施方案和特点同样适用于本发明的治疗方法、用途和产品。
如上所述，本发明涉及能够产生腺苷的细菌菌株的选择和使用。
有效产生腺苷的所述菌株可以用于在受试者例如哺乳动物，优选人中局部产生腺苷。
因此，如上文概述的，本发明提供了用于选择或筛选能够产生腺苷的细菌菌株的各种方法。
一些方法包括筛选编码5'-核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的基因的存在的步骤(例如步骤a))。此类筛选可以使用任何适当的方法进行，并且选择对于5'-核苷酸酶基因呈阳性的菌株。此类方法将方便地在体外进行，例如将是基于遗传或核酸的方法，以检测编码5'核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5’核苷酸酶(或其鉴定性片段)的基因的存在，所述5'核苷酸酶的序列是本领域已知的。例如，PCR方案(或其它基于核酸的技术)可以基于编码酶的已知核酸序列，容易地设计为实现这点，或者作为替代方法，可以仔细检查候选菌株的基因组序列，目的是例如基于与已知的5'核苷酸酶序列的同源性，鉴定编码5'核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5'核苷酸酶的所述基因的存在，包括例如如下文讨论的LPXTG-基序(SEQID NO：1)的存在。
在本发明的方法中待检测的示例性基因是来自罗伊氏乳杆菌的细胞壁锚定的(胞外)5'核苷酸酶基因(例如GenBank登录号：AEI56270.1，LPXTG-基序细胞壁锚定结构域蛋白[罗伊氏乳杆菌SD2112])，或来自其它细菌物种例如其它乳酸菌的适当同系物/5'核苷酸酶。示例性技术在实验实施例中进行描述。
一些方法包括筛选活性(功能性)5'-核苷酸酶，例如细胞壁锚定的5'核苷酸酶的存在的步骤(例如步骤b))。此类步骤可以使用任何适当的方法，例如使用酶促测定来进行。5'-核苷酸酶催化下述反应：(AMP是单磷酸腺苷)，并且测量这一反应的测定可以容易地用于确定活性5'-核苷酸酶(或5'-核苷酸酶活性)的存在。换言之，本文提到的活性或功能性5'-核苷酸酶是这样的酶，其能够在合适的条件下，例如当提供有适当的底物例如AMP时，催化这一反应。需要时，例如通过测量磷酸根或腺苷或其它适当的腺苷下游产物(其在反应中生成，并且可以进行测量或定量)的量或浓度，可以例如在此类酶促测定中定量5'-核苷酸酶的活性。活性可以方便地在细菌细胞的样品、或来自细菌细胞的上清液上进行测量。
用于进行此类测定的方法是本领域技术人员众所周知的。例如，适当的试剂盒是商购可得的，例如Crystal Chem 5'-Nucleotidase Assay Kit(Crystal Chem，目录#80229，Downers Grove，IL，USA)，其中借助于染料(醌染料)的产生来测量5'-核苷酸酶活性，所述染料作为AMP转化为腺苷的下游产物(即，作为腺苷产生的结果)而形成。提供AMP作为底物。示例性技术在实施例部分中进行描述。适当的方法连同其5'-核苷酸酶试剂也可容易地得自其它试剂供应商例如Sigma。
具有高或显著生产水平的5'-核苷酸酶(或5'-核苷酸酶活性)的菌株是优选的，例如具有至少或大于2单位/L(单位/升)的5'-核苷酸酶活性，和/或能够以至少或大于2μmolL-1分钟-1(μmol/升/分钟)的水平产生腺苷的菌株。因此，在优选的实施方案中，选择具有其水平为至少或大于3、4、5、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150单位/L的5'-核苷酸酶活性，和/或能够以至少或大于3、4、5、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150μmol L-1分钟-1的水平产生腺苷的菌株。在一些实施方案中，此类值可以代表上限。此类值一般指在细菌细胞的样品上，例如在细菌细胞的表面上，或在培养的细菌细胞的上清液中，优选在上清液中测量的5'-核苷酸酶活性的值。此类值一般指在细菌细胞的样品中，例如在培养的细菌细胞的上清液中测量的腺苷水平(优选细胞外腺苷水平)。此类值一般指当用109个细菌/ml的浓度或来自此类培养物的上清液进行测量时的5'-核苷酸酶活性(或腺苷水平)的值。一个单位定义为对于产生1μmol产物/分钟(例如1μmol产物/升/分钟)所需的酶量。然后，以单位/升计的浓度对应于以1μM/分钟(例如1μM/升/分钟)增加浓度所需的酶浓度。使用来自CrystalChem Inc的5'-核苷酸酶试剂盒(#80229)，在实施例中显示了用于测量这种活性的适当和示例性的测定。因此，在优选的实施方案中，上述单位和值指当使用这种试剂盒和/或实施例中阐述的条件，特别是用109个细菌/ml的浓度、或来自此类培养物的上清液或等价测定进行测量时的单位和值。因此，此类方法将方便地在体外进行。
包括至少步骤b)的方法将是优选的，因为编码5'-核苷酸酶的基因的存在不一定指示活性5'-核苷酸酶的存在。在本发明的方法、用途和乳酸菌中，腺苷产生或腺苷活性应该在细胞外，即在乳酸菌的外部或表面上发生，使得它可以例如存在于上清液或由乳酸菌产生的其它细胞外液中。因此，在细胞表面上，例如以细胞壁锚定的5'-核苷酸酶的形式，或细菌细胞的细胞外，例如在上清液中的活性5'-核苷酸酶的存在，可以是有用的特点，使得产生腺苷的反应在细胞外部，例如在细菌细胞的表面上发生。
因此，良好水平的腺苷(例如由5'-核苷酸酶产生的细胞外腺苷)的产生，也可以指示5'-核苷酸酶基因的存在或活性5'-核苷酸酶的存在。因此，本发明的选择方法还可以涉及选择产生腺苷的菌株的步骤。具有高或显著生产水平的腺苷例如细胞外腺苷的菌株是优选的，例如以在受试者中治疗上有效的水平、或以使得观察到增加(且优选治疗上有效)水平的褪黑素的水平产生腺苷的菌株。此类值一般指在培养的菌株的上清液中或培养的菌株的细胞表面上(在体外)测量的腺苷值，并且上文提供了一些示例性的特定值。
然而，在一些实施方案中，它适当地指在受试者中例如局部地，例如在施用部位处，例如在胃肠道中产生的腺苷的值、水平或量。例如当与如本文其它地方所述的相关对照，例如当不施用菌株时的腺苷水平，或特定受试者中的基础或天然腺苷水平相比较时，例如优选的菌株可以允许增加的腺苷产生，例如增加的腺苷体内产生，例如局部产生(例如在GI道中)。
在本文描述的本发明的所有方面中，局部产生可以指在施用部位处的腺苷产生或水平，例如在胃肠道中的腺苷产生或水平(例如当施用是口服时)。在一个方面，腺苷的局部产生可以具有全身性的下游效应，并且可以增加循环系统例如血液或血浆中、或胃肠道外部的其它地方的腺苷或褪黑素的水平。
例如在受试者的GI道中，可以引起增加的腺苷(或褪黑素或5’核苷酸酶活性)局部水平的菌株因此是优选的，特别是当菌株口服施用时观察到此类效应的情况下。优选地，所述增加是可测量的或显著的增加，例如是统计学上或临床上显著的。例如，可以引起腺苷(或褪黑素或5'核苷酸酶活性)的水平，例如腺苷(或褪黑素或5'核苷酸酶活性)的局部水平中的至少或多至1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍增加的菌株是优选的。可以使用任何适当的比较，例如，当与不施用菌株时观察到的水平、或施用对照制剂例如不含相关菌株的对照制剂的水平相比较时的增加。
测量腺苷(或褪黑素或5’核苷酸酶活性)产生的水平的适当方法是本领域技术人员众所周知的。因此，在本发明的一些实施方案中，选择方法将涉及检测或确定由候选菌株产生的腺苷的量或水平(例如浓度)的步骤。
任选地，腺苷产生或5’核苷酸酶活性(或实际上本文所述菌株的任何其它适当的特性)的水平，可以方便地与阳性或阴性对照菌株进行比较。适当的阳性对照菌株可以是DSM 17938，其已在实施例中显示出例如在细菌细胞的上清液中，产生显著水平的腺苷/5'核苷酸酶活性。例如在细菌细胞的上清液中，与DSM 17938相比，一些菌株产生更高水平，有时显著更高水平的腺苷/5'核苷酸酶活性。因此，例如当在体外评价时，例如在细菌细胞的上清液中，与DSM 17938相比，能够产生更高(增加)水平、或显著更高(增加)水平的5'核苷酸酶活性的菌株，构成本发明的一个再进一步方面。示例性菌株是DSM 32846、DSM32847、DSM 32849和DSM 33198(参见图3和图5A/B)。可替代地来看，例如当在体外评价时，例如在细菌细胞的上清液中，与DSM 17938相比，能够产生更高(增加)水平、或显著更高(增加)水平的腺苷或诱导其产生的菌株，构成本发明的一个再进一步方面。例如当在体内评价时，与DSM 17938相比，能够在受试者中产生更高(增加)水平、或显著更高(增加)水平的腺苷，例如在受试者中更高等等的腺苷的局部水平或诱导其产生的菌株，构成本发明的一个再进一步方面，特别是当菌株口服施用时观察到此类效应的情况下。
一般而言，对于一些实施方案，当与DSM17938相比较时，具有一种或多种改善(例如，显著改善)特性的菌株是优选的。
优选地，(在腺苷产生或5’核苷酸酶活性中的)所述增加是可测量的或显著的增加，例如是统计学上或临床上显著的。例如，与用DSM 17938的水平相比，可以引起腺苷水平，例如腺苷的局部或体外水平，或5'核苷酸酶活性水平(例如当在体外评价时)中的至少或多至10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、550％或更高的增加的菌株是优选的。可替代地来看，与用DSM 17938的水平相比，可以引起腺苷水平，例如腺苷的局部或体外水平，或5'核苷酸酶活性水平中的至少或多至1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍的增加的菌株是优选的。体外水平可以如本文其它地方所述，例如在细菌培养物中方便地进行测量。优选地，此类增加是腺苷或5’核苷酸酶活性的细胞外水平中的增加，例如如在体外例如在细菌培养物的上清液中测量的。
适当的阴性对照菌株可以是不包含编码5'核苷酸酶的基因、或不包含活性5'核苷酸酶(或不具有如本文其它地方所述的5'核苷酸酶活性)的菌株。
由于通过本发明的方法选择的菌株的下游用途，在选择或分离产生腺苷的菌株之后，其它实施方案将涉及以下的进一步步骤：培养或繁殖或产生此类菌株，以及任选地将所述培养或繁殖或产生的菌株配制成包含所述菌株的组合物，例如药物组合物或营养组合物，例如如本文其它地方所述，或者可能例如通过冻干或冷冻干燥，将此类菌株贮存用于未来使用。在一个实施方案中，细菌菌株以冷冻干燥的形式提供。
本发明的方法(以及实际上如本文所述的治疗方法)的选择步骤将一般需要在支持腺苷产生的适当培养基(或体内环境)中进行。优选的培养基(或体内环境)将含有适当的碳源，其将支持通过所述菌株的腺苷产生，优选地连同通过5’核苷酸酶用于腺苷产生的适当底物例如AMP一起。
尽管此类测定可以方便地在体外进行，但另一个选项是在适当的离体测定中评价菌株，例如使用适当的肠道肠状模型(参见例如实施例5中所述的肠状模型和测定，在其中例如可以评价褪黑素的水平)。
因此，尽管用于评价菌株，例如用于评价通过菌株的腺苷或褪黑素产生的诱导的任何适当的体外或离体模型，但用于评价菌株的优选的体外或离体模型是肠道肠状模型，优选人肠道肠状模型，其可以例如用于评价褪黑素水平。此类模型优选包含肠内分泌细胞，例如如实施例5中所述。
本发明的优选菌株能够产生至少或多至10、20、30、40、50、60或70pg/ml褪黑素，或者诱导其产生。在一些实施方案中，此类值可以代表上限。此类值一般指当在适当的体外或离体测定中进行测量时，由所述菌株诱导的褪黑素产生的水平，例如指当所述细胞与本发明的菌株或取自所述菌株的上清液接触时，由肠内分泌细胞(优选人细胞)产生的、或在包含肠内分泌细胞(例如，具有如本文其它地方所述的％的肠内分泌细胞)的肠道肠状模型，优选包含人细胞的模型中产生的褪黑素水平。使用包含肠内分泌细胞，例如至少20％或30％，例如20-40％、30-40％或多至40％的肠内分泌细胞的人肠道肠状模型，在实施例中显示了用于测量这种活性的适当和示例性的测定。因此，在优选的实施方案中，上述值指当使用这种测定(或等价测定，例如具有上述％的肠内分泌细胞)和/或实施例中阐述的条件进行测量时的值。
例如来自如上所述的肠内分泌细胞或在肠道肠状模型中，与DSM 17938相比，一些菌株能够产生或诱导更高水平，有时显著更高水平的褪黑素。因此，例如当如上所述例如使用肠内分泌细胞或肠道肠状模型进行评价时，与DSM 17938相比，能够产生或诱导更高(增加)水平、或显著更高(增加)水平的褪黑素的菌株，构成本发明的一个再进一步方面。与用DSM 17938的水平相比，示例性菌株可以引起褪黑素产生水平中的至少或多至1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、5.5倍、6倍、6.5倍、7倍、7.5倍、8倍、8.5倍、9倍、9.5倍或10倍增加并且是优选的。
因此，本发明的筛选方法可以任选地包括以下的进一步步骤：选择能够产生褪黑素或诱导褪黑素的产生的菌株，例如使用如上所述的方法或任何其它适当的方法。选择的菌株可以优选地以如上所述的水平诱导褪黑素的产生。
在其中使用本发明的方法筛选多于一种细菌菌株的实施方案中，可以任选地定量所生成的腺苷或5’核苷酸酶活性(或褪黑素)的量，并且可以选择具有最高活性或水平的5'-核苷酸酶，或足够高活性或水平的5'-核苷酸酶，例如具有如本文其它地方所述的活性或水平，例如具有比DSM17938更高(优选显著更高)的活性或水平的细菌菌株，例如乳酸菌菌株，或者可以选择产生最高量或水平的腺苷或褪黑素，或足够高量或水平的腺苷或褪黑素，例如具有如本文其它地方所述的量或水平，例如具有比DSM17938更高(优选显著更高)的量或水平的菌株。
因此，本发明的一个再进一步方面是提供了用于选择有效产生腺苷(或褪黑素)的细菌菌株，优选乳酸菌菌株的方法，所述方法包括：
a)对于编码5'-核苷酸酶例如细胞表面锚定的5'核苷酸酶的基因的存在，筛选乳酸菌菌株，和；
b)定量5'-核苷酸酶的活性，以及；任选地
c)选择具有最高或足够高的5'-核苷酸酶活性的乳酸菌菌株。
在适当时，包括如本文所述的某些步骤的方法还包括由这些步骤组成的方法。
如上文阐述的，通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株是本发明的一个再进一步方面，其中所述菌株能够产生腺苷，并且优选地依次又产生褪黑素或支持褪黑素的生产，例如增加的产生。
任何适当的细菌菌株，例如益生菌菌株，例如任何益生菌，可以经受本发明的选择方法，并且能够产生腺苷的任何适当的细菌菌株，例如益生菌菌株，可以用于本发明的方法或用途中，例如本文所述的治疗方法或用途中。
优选的细菌菌株是乳酸菌，例如乳杆菌属或双歧杆菌属。特别优选的细菌菌株是罗伊氏乳杆菌，特别是于2018年7月4日，根据布达佩斯条约保藏于DSMZ-DeutscheSammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b，Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，德国)的菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM32848和DSM32849(分类命名分别为BT6、FT2、MB4和MFT3)，以及于2019年7月9日，根据布达佩斯条约保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b，Inhoffenstr.7B，D-38124Braunschweig，德国)的罗伊氏乳杆菌DSM33198(分类命名为1476C)。这些细菌菌株或分离的细菌菌株(以及其它菌株，例如罗伊氏乳杆菌菌株，特别是相关的罗伊氏乳杆菌菌株，其具有这些保藏菌株中的一种或多种的一种或多种特征，例如产生腺苷和/或5'核苷酸酶活性和/或褪黑素、或者诱导关于腺苷和/或5'核苷酸酶活性和/或褪黑素产生的作用的能力)构成本发明的优选方面，并且可以例如用于治疗如本文其它地方所述的疾病或病况、或者用于如本文所述的任何其它用途。在一些实施方案中，不使用罗伊氏乳杆菌菌株DSM 17938。
因此，本发明的一个再进一步方面提供了此类菌株治疗或预防如本文所述的一种或多种疾病的用途。
本发明的另一个目的是提供用于改善如本文所述的具体病症的治疗的用途和效果的方法，其包括最大化、增加或改善所选菌株例如乳酸菌菌株的5'-核苷酸酶活性，其优选将导致增加或改善的腺苷产生。可以通过在特异性生长条件下培养细菌，以允许高腺苷产率(或者例如与不存在特异性生长条件下观察到的产率相比，更高例如显著更高的腺苷产率)来实现这点。在本发明的一个实施方案中，特异性生长条件可以是例如在正常生长培养基中培养乳酸菌，所述生长培养基补充有通过5'核苷酸酶用于腺苷产生的适当底物例如AMP、或者AMP的适当上游组分例如ADP和/或ATP。
在本发明的一个进一步相关的实施方案中，为了使5'-核苷酸酶的活性最大化，可以施用更高浓度的细菌，例如乳酸菌。示例性浓度可以是常规剂量的2至10倍。
在本发明的一个进一步相关的实施方案中，可以通过适当的方法，例如将5'-核苷酸酶基因插入质粒载体在适当的启动子例如诱导型启动子的控制下，在细菌菌株中过表达或诱导5'-核苷酸酶基因。可替代地，可以通过将基因的一个或多个另外的拷贝插入细菌细胞内，例如插入细菌细胞的染色体上在适当的启动子例如诱导型启动子或天然启动子的控制下，来过表达5'-核苷酸酶基因。
如上所述，本发明的菌株，或者通过本发明的方法选择、产生、获得或可获得的菌株具有在疗法中的用途。因此，本发明的一个进一步方面提供了本发明的产生腺苷的菌株，或者使用本发明的选择方法选择、获得或可获得的菌株，其用于在受试者中产生例如局部产生腺苷，且由此优选产生例如局部产生褪黑素。在本发明的优选实施方案中，腺苷等和优选褪黑素的所述产生用于治疗婴儿绞痛(以及如本文所述的其它疾病)，其将获益于腺苷以及由此褪黑素的产生或增加的产生，例如局部产生。
本发明的治疗方法和用途中的细菌菌株的施用，以药学上、治疗上或生理学上有效的量，对需要治疗的受试者(动物/哺乳动物)进行。因此，所述方法和用途可能涉及鉴定需要治疗的受试者的另外步骤。
根据本发明的疾病或病况的治疗(例如预先存在的疾病的治疗)包括所述疾病或病况的治愈，或者疾病或疾病症状的任何减少或减轻(例如疾病严重性的减少)。
本发明的方法和用途适合于疾病或病况的预防，以及疾病或病况的治疗。因此，预防性治疗也由本发明涵盖。为此，在本发明的方法和用途中，治疗或疗法在适当时还包括预防法或预防。此类预防(或保护)方面可以方便地如本文所述对健康受试者或正常受试者进行，并且可以包括完全预防和显著预防两者。类似地，显著预防可以包括这样的情况，其中与如果没有给予治疗将预计的严重性或症状相比，疾病或疾病症状的严重性是减少的(例如可测量地或显著减少的)。
本发明的一个再进一步方面提供了用于如本文其它地方定义的治疗用途的菌株或产品，其中所述用途进一步包括施用至少一种另外的试剂，例如另外的治疗试剂或营养试剂。示例性试剂可以是将增加或增强腺苷产生的底物组分(例如，可以增加或增强腺苷产生的组分)，或此类组分的来源。
因此，在本发明的一个再进一步的实施方案中，当涉及产生腺苷的细菌时，所述菌株或产品的施用进一步包括底物组分例如AMP和/或产生这种组分的材料或试剂的施用。优选的底物是AMP或AMP的来源。
在此类实施方案中，底物组分或其它另外的组分可以在施用于受试者之前直接加入细菌制剂中。可替代地，它可以在制造过程结束时，例如在发酵结束时加入细菌制剂中，这之后细菌可以例如通过冻干或冷冻干燥进行贮存用于未来使用。可替代地，它可以如下所述分开施用。
在此类实施方案中，另外的治疗试剂可以是可用于治疗所讨论的疾病的任何另外的试剂。
所述另外的试剂可以连同本发明的菌株或产品(例如，作为组合制剂)一起施用，或者可以分开施用。另外，所述另外的试剂可以与本发明的菌株或产品同时或在不同的时间点，例如序贯地施用。取决于所讨论的另外的试剂，技术人员可以容易地确定合适的施用方案和时机。
本发明还提供了组合物(或组合产品或试剂盒)，其包含：
(i)通过本发明的选择方法选择、产生、获得或可获得的细菌菌株，例如乳酸菌菌株(或如本文另外定义的能够产生腺苷或诱导腺苷产生的细菌菌株)，其中所述细菌菌株具有编码细胞表面锚定的5'-核苷酸酶或活性5’核苷酸酶的基因，并且能够产生腺苷；和
(ii)将增加或增强腺苷产生的一种或多种底物组分或试剂，或者此类组分或试剂的来源。
上文概述了示例性的组分或试剂。优选的组分是AMP或AMP的来源。
本发明还提供了适合于增加受试者中的褪黑素或腺苷产生的组合物(或组合产品或试剂盒)，其包含：
(i)如本文所述能够产生褪黑素或腺苷或者诱导褪黑素或腺苷的产生的第一细菌菌株，例如乳酸菌菌株；和
(ii)褪黑素和/或腺苷的另外的来源，或者适当时，增加或增强通过乳酸菌菌株的褪黑素和/或腺苷产生或诱导的一种或多种底物组分或试剂，或者此类组分或试剂的来源。
优选的组分是AMP或AMP的来源。
在本发明的试剂盒或组合产品中，组分(i)和(ii)一般在分开的区室或容器中、或者作为试剂盒或产品的分开组分提供。试剂盒可以包含另外的组分，其也可以在分开的区室或容器中。优选地，试剂盒(或组合产品)用于如本文所述的本发明的方法或用途中，例如用于治疗或预防本文所述的其它疾病，特别是婴儿绞痛。可以任选地提供关于在本发明的方法和用途中使用试剂盒或产品的说明书。
如本文使用的，术语“受试者”包括哺乳动物，特别是人，尤其是婴儿(例如，其中待预防或治疗的疾病是绞痛)。在本发明的优选实施方案中，将选择的菌株例如乳酸菌菌株施用于人。对于除绞痛外的疾病，患有所述疾病或怀疑患有所述疾病或处于所述疾病的风险中的任何受试者，例如人受试者，例如成人或儿童或婴儿受试者是适当的。
根据本发明的优选受试者是小于或多至12个月龄，优选小于或多至5或6个月龄，优选小于或多至3或4个月龄的婴儿。当待治疗或预防的疾病是婴儿绞痛时，此类受试者特别适当的。因此，受试者可以从出生开始，或者在生命的前几周内(例如在前1、2、3或4周内)、或在前几个月内(例如在前1、2、3或4个月内)进行治疗。
如本文其它地方所述，优选的受试者是患有婴儿绞痛(或如本文所述的其它疾病之一)、或者被认为或怀疑患有婴儿绞痛(或如本文所述的其它疾病之一)的那些受试者。由于本发明的治疗用途也可以用于预防疾病，因此适当的受试者包括处于患有婴儿绞痛(或如本文所述的其它疾病之一)的风险中的那些受试者。
示例性受试者包括专一地(仅)母乳喂养的婴儿和专一地(仅)配方喂养的婴儿(非母乳喂养的婴儿)，或者既母乳喂养又配方喂养的婴儿。
其它示例性受试者包括尚未产生或释放褪黑素、或者在其它方面无法产生或释放褪黑素的婴儿，特别是患有绞痛、怀疑患有绞痛、或处于发展绞痛的风险中的婴儿，例如其中褪黑素昼夜节律周期尚未发展或开始的婴儿，或无法从其食物和/或其肠道细菌中产生或释放所需褪黑素的婴儿，或包括例如与正常或健康受试者中的水平，例如具有相同、相当或可比较年龄的正常或健康受试者中的水平相比，具有如低、减少例如显著减少(或异常)水平的褪黑素或者褪黑素缺乏的婴儿。
对于除绞痛外的疾病，示例性的受试者包括例如与正常或健康受试者中的水平，例如具有相同、相当或可比较年龄的正常或健康受试者中的水平相比，具有如低、减少例如显著减少(或异常)水平的褪黑素或者褪黑素缺乏的受试者。
其它示例性受试者包括具有某种营养或饮食难题或问题的婴儿，所述难题或问题例如导致褪黑素的水平低或不足。此类受试者可能包括在足月妊娠时间之前出生的婴儿，例如早产婴儿或在36周妊娠之前出生的婴儿，或者缺乏完全功能性食物代谢的婴儿，或者具有喂养问题或营养问题的婴儿。
其它示例性受试者包括例如与正常婴儿或具有相同年龄的受试者相比，具有激素不成熟(换言之，亚最佳、亚正常、未发育、缺乏、低或不成熟的激素产生)，例如褪黑素不成熟的那些受试者，优选婴儿，特别是由于所述激素不成熟具有肠动力缺乏的那些受试者。此类激素不成熟，例如褪黑素不成熟或者褪黑素减少或缺乏，可能例如与患有婴儿绞痛的一些婴儿有关。待治疗的其它优选疾病(以及因此的受试者)是与褪黑素缺乏有关的疾病或病况(或患有所述疾病的受试者)。
在所有此类受试者中，适当时或必要时，可以使用本领域可容易地获得和已知的技术，容易地测量所述受试者中的褪黑素水平。例如，褪黑素的水平可以容易地在血清/血液或唾液样品中进行测量。用于此类测量的商业试剂盒也是可获得的。
可以使用任何适当的施用模式。方便地，所述施用是口服、直肠或通过管饲。因此，需要时或适当时，可以将细菌施用于GI道或口腔。细菌可以包括在婴儿配方或食物补充剂或油滴剂、以及药物制剂中。
根据待治疗的疾病(或病况)、施用模式和涉及的制剂，可以容易地选择如本文定义的本发明的菌株、产品和组合物的适当剂量。
例如，这样选择剂量和施用方案，使得根据本发明施用于受试者的细菌可以导致腺苷(或褪黑素)增加的产生，例如局部产生，并且在婴儿绞痛(或待治疗的其它疾病)中引起所需疗效或健康益处。因此，优选地，所述剂量是治疗有效剂量，其适合于在治疗的哺乳动物的类型和病况，并且例如施用于有此需要的受试者。例如，可以使用例如104至1012，例如105至109、或106至108、或108至1010、或1010至1012的细菌总CFU的日剂量，例如单个日剂量。
在一个实施方案中，将日剂量(例如105至109、或106至108、或108至1010、或1010至1012的CFU)分成数次施用，例如2-8次施用(例如3-5次施用)，或与受试者的每一次喂养(母乳和/或配方)结合。在一个实施方案中，将更高的剂量，例如在起始期后剂量的2至10倍或10至100倍，和/或更频繁地施用的剂量作为起始剂量施用3-14天(例如5-10天，例如7天)，用于受试者中的更快缓解。
当与适当的对照相比较时，如本文所述的，术语“增加”或“增强”或“更高”(或等价术语)包括任何可测量的增加或升高。适当的对照通过本领域技术人员容易地鉴定，并且可以包括当菌株不存在时的水平，或者未治疗的或安慰剂治疗的受试者中的水平，或者健康或正常受试者例如年龄匹配的受试者、或治疗前的同一受试者中的水平。优选地，增加将是显著的，例如临床上或统计学上显著的，例如具有≤0.05的概率值。
优选地，当与适当的对照水平或值相比较(例如，与未治疗的或安慰剂治疗的受试者相比较，或者与健康或正常受试者或治疗前的同一受试者相比较)时，此类增加(以及实际上如本文其它地方提到的其它增加、改善或正面效应)是可测量的增加等(适当时)，更优选地，它们是显著增加，优选临床上显著或统计学上显著的增加，例如具有≤0.05的概率值。
当与适当的对照相比较时，如本文所述的，术语“降低”或“减少”(或等价术语)包括任何可测量的降低或减少。适当的对照通过本领域技术人员容易地鉴定，并且可以包括当菌株不存在时的水平，或者未治疗的或安慰剂治疗的受试者中的水平，或者健康或正常受试者例如年龄匹配的受试者、或治疗前的同一受试者中的水平。优选地，降低或减少将是显著的，例如临床上或统计学上显著的，例如具有≤0.05的概率值。
因此，优选地，当与适当的对照水平或值相比较(例如，与未治疗的或安慰剂治疗的受试者相比较，或者与健康或正常受试者或治疗前的同一受试者相比较)时，此类降低(以及实际上如本文其它地方提到的其它降低、减少或负面效应)是可测量的降低等(适当时)，更优选地，它们是显著降低，优选临床上显著或统计学上显著的降低，例如具有≤0.05的概率值。
如整个申请自始至终使用的，术语“一个”和“一种”以它们意指所提及的组分或步骤的“至少一个/种”、“至少第一”、“一个或多个/一种或多种”或“多个/种”的含义使用，除了其中上限在其后具体陈述的情况下之外。
另外，当术语“包含/包括(comprise)”、“包含/包括(comprises)”、“具有(has)”或“具有(having)”、或其它等价术语在本文中使用的情况下，则在一些更具体的实施方案中，这些术语包括术语“由……组成”或“基本上由……组成”、或其它等价术语。
如本文讨论的，列表“由各种组分和特点组成”也可以指“包含”各种组分和特点的列表。
根据下述非限制性实施例和所附权利要求，其它目的和优点将更加显而易见。
实施例
实施例1
用于鉴定具有编码细胞表面定位的5'-核苷酸酶的基因的菌株的方法
在厌氧大气中在37℃下在MRS平板上培养细菌16小时。用无菌塑料环收集10个细菌菌落，并且悬浮于100微升的无菌水(PCR质量)中。(可替代地：使用合适的方法由细菌培养物制备DNA)。
5'-核苷酸酶基因的存在可以通过PCR来检查，例如通过使用PuReTaq Ready ToGoPCR珠(GE HealthCare)和下文所述的引物对中的任一种(各0.4mM)。应该将细菌悬浮液或DNA制备物(0.5微升)加入PCR混合物中，并且应该通过运行以下程序来执行PCR反应：95℃，5分钟；30x(95℃，30秒；55℃，30秒；72℃，30秒)；72℃，10分钟。可以通过使用标准琼脂糖凝胶电泳来分开且显现PCR产物，并且通过标准Sanger测序(使用用于PCR的正向引物)来测定序列。
可以使用下述引物中的任一种来检测该基因：
引物对1(产物大小233bp)
LrNuc1f：GGAACTTTGGGAAACCATGA(SEQ ID NO：2)
LrNuc1r：CGGGCAACTTTACCATCACT(SEQ ID NO：3)
引物对2(产物大小212bp)
LrNuc2f：TACTCGTGAAAATGCCGTTG(SEQ ID NO：4)
LrNuc2r：GTGCCCCTGTCATTTCAACT(SEQ ID NO：5)
引物对3(产物大小232bp)
LrNuc3f：AGCTTTACCAAATTGACCCTGA(SEQ ID NO：6)
LrNuc3f：TTGATATTAGGCGCATCCTTTT(SEQ ID NO：7)。
序列
编码细胞表面锚定的5′-核苷酸酶的基因，GenBank登录号：AEI56270.1，LPXTG基序细胞壁锚定结构域蛋白[罗伊氏乳杆菌SD2112](SEQ ID NO：8)
细胞表面锚定的5'-核苷酸酶蛋白，GenBank登录号：AEI56270.1，LPXTG-基序细胞壁锚定结构域蛋白[罗伊氏乳杆菌SD2112](SEQ ID NO：9)
实施例2
用于分析5'-核苷酸酶活性的程序
Crystal Chem 5'-Nucleotidase Assay Kit(Crystal Chem，Elk GroveVillage，IL，USA)用于测定细菌细胞和发酵上清液的5'-核苷酸酶活性。简言之，程序如下。
在两个步骤中，将试剂CC1和CC2加入含有细菌或上清液的样品中。试剂1含有通过来自细菌的5'-核苷酸酶转化为腺苷的AMP。腺苷通过试剂1中的组分进一步水解成肌苷和次黄嘌呤。在第二步中，次黄嘌呤被转化为尿酸和过氧化氢，其用于生成醌染料，所述醌染料在分光光度计中在550nm处进行动态测量。通过计算3至5分钟之间的吸光度变化，并且与来自校准样品的值进行比较，来确定活性。
实施例3
罗伊氏乳杆菌菌株中的5'-核苷酸酶活性
使用上文实施例2中所述的方法生成了实验数据，其显示了罗伊氏乳杆菌DSM32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849，以及罗伊氏乳杆菌DSM 17938(于2006年1月30日，根据布达佩斯条约保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von MikroorganismenundZellkulturen GmbH(Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig))中的5'-核苷酸酶活性。结果显示于图3中。
实施例4
菌株选择
上文实施例3中的所有新菌株，即罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849，都显示了在细菌上清液中的5'-核苷酸酶活性。对浓度为109个细菌/ml的细菌培养物的上清液进行分析。
罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849已就改善的特性进行开发/进化。DSM 32846和DSM 32847已制备成进化为对胆汁酸更耐受，并且从而在GI道中大量存活。DSM 32848和DSM 32849已进化为更好地粘附于粘液，目的是在GI道中更好地定殖，且从而根据本发明更好地起作用。
选择所有菌株罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32848和DSM 32849。优选的菌株是DSM 32846、DSM 32847和DSM 32849。
实施例5
益生菌菌株对人肠道肠状模型中的褪黑素产生的作用
背景
来源于肠隐窝干细胞的人肠道肠状物(Human intestinal enteroids,HIE)在肠上皮的体外模型中是生物学上相关的。HIE含有所有肠上皮细胞类型；然而，类似于人肠道，HIE通常产生少量(～1％)的肠内分泌细胞(EEC)，这限制了其研究。为了增加HIE中的EEC数目，慢病毒转导用于将空肠HIE稳定地改造为具有多西环素诱导的neurogenin-3(NGN3)表达，所述NGE3是驱动EEC分化(tetNGN3-HIE)的转录因子。在这种基因工程细胞系中，培养物中存在的肠内分泌细胞数目从≤1％增加到～40％。
材料与方法
人肠道肠状物
HIE培养物由从经历减肥手术的成年患者的空肠组织中分离的隐窝生成。这些建立的培养物通过Texas Medical Center Digestive Diseases Center Study Design andClinical Research Core，在Baylor College of Medicine处获得。由组织样品制备三维HIE培养物并且维持在培养中。为了增加HIE中的EEC数目，慢病毒转导用于将空肠HIE稳定地改造为具有多西环素诱导的neurogenin-3(NGN3)表达，所述NGE3是驱动EEC分化(tetNGN3-HIE)的转录因子。在这种基因工程细胞系中，培养物中存在的肠内分泌细胞数目从≤1％增加到～40％。根据标准方案，所有肠状物都以96孔单层形式繁殖且分化。关于这种肠状系的更多信息、它如何进行培养以及测定的一般方法学，在Chang-Graham等人(Chang-Graham等人，Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology，2019，S2352-345X(19)30049-9，印刷中，在线出版物可获得)中进行描述。
细菌菌株和制剂
在该实验中，关于其增加肠中的褪黑素产生的能力，研究了两种不同的罗伊氏乳杆菌菌株(DSM 17938和DSM 32846)。
在本研究中使用来自罗伊氏乳杆菌DSM 17938和罗伊氏乳杆菌DSM 32846的条件培养基(上清液)，所述罗伊氏乳杆菌在Lactobacillus Defined Media 4(LDM4)培养基中生长直至它们达到静止期，更多细节参见下文。
从MRS琼脂平板中挑选出细菌菌株的单个菌落，且用于接种10mL MRS肉汤，并且在37℃水浴中的密封锥形管中温育。在8小时后，制备培养物的1:10稀释物，并且通过分光光度计读取在600nm处的光密度，然后以0.1的起始OD(下文计算)接种25mL预温的LDM4，并且置于水浴内以温育16小时。
○OD＝0.307。1:10稀释物＝3.07的OD
25mL*(0.1OD)＝3.07x x＝0.814mL
○814uL与24.19mLLDM4组合。
在16小时后，取出培养物。最终OD为2.6。细胞通过以4700rpm离心进行沉淀，并且将上清液转移至新的50mL锥形管中。将上清液在-20℃下贮存过夜。
使用的化学制品
AMP＝5'-单磷酸腺苷，99％(Acros Organics)代码：102790259，批号：A0395274。
在MiliQ水中制备10mL储备溶液(2mM的储备溶液＝6.9mg/ml(FW＝347.224))，并且通过0.22uM过滤器进行过滤灭菌。
实验设置
对诱导的肠状物的对照处理：
■LDM4(培养基)，
■LDM4+20uMAMP，
■LDM4+200uMAMP
DSM 32846和DSM 17938上清液对诱导的肠状物的实验处理：
■单独的DSM 32846上清液
■DSM 32846上清液+20uMAMP
■DSM 32846上清液+200uMAMP
■单独的DSM 17938上清液
■DSM 17938上清液+20uMAMP
■DSM 17938上清液+200uMAMP。
在准备将上清液或其它添加物施加到肠状物上之前，将pH中和，并且将上清液过滤灭菌。使用10–30uL的10M氢氧化钠溶液，将pH调整至7.0，并且通过将2uL上清液施加到pH试纸(Fisher Brand–目录13-640-510，范围6.0–8.0)上，来测量pH。使用0.22uM过滤器(Thermo Scientific Nalgene Rapid Flow 0.22uM过滤器，代码：00158)，对上清液进行过滤灭菌。
将100uL(总体积)的处理置于肠状物上。在37℃，5％CO2组织培养箱中，在肠状物上温育1小时。在温育之后，取出上清液，并且贮存于-20℃下直至下游分析。
褪黑素通过ELISA(Eagle Biosciences Inc，Amherst，NH，USA)进行检测。在遵循标准方案之前完成的唯一步骤是将上清液解冻，并且允许达到室温(大约20–21摄氏度)。
结果
人肠道肠状物(HIE)作为肠上皮的体外模型是生物学上相关的。如图4中所示，单独的DSM 32846没有明显作用，但当补充有AMP时，它显示了对来自HIE的褪黑素产生的显著作用。较高的AMP浓度得到甚至更高的褪黑素产生。与对照相比，DSM 17938具有褪黑素产生中的增加，但小于DSM 32846。因此，DSM 32846是用于肠中的褪黑素产生的良好候选菌株。
实施例6
罗伊氏乳杆菌菌株中的5'-核苷酸酶活性
使用上文实施例2中所述的方法生成了实验数据，其显示了罗伊氏乳杆菌DSM33198中的5'-核苷酸酶活性。结果显示于图5A中，其中它们已关于来自同一实验的DSM17938的5'-核苷酸酶活性(DSM17938活性＝1)进行标准化。还已对来自图3的结果完成了关于DSM17938的5'-核苷酸酶活性(DSM17938活性＝1)的相同类型的标准化，并且这呈现于图5B中，使得对于不同的细菌菌株，容易地比较关于DSM17938的5'-核苷酸酶活性中的倍数变化。
实施例7
菌株选择
上文实施例6中的新菌株，即罗伊氏乳杆菌DSM 33198，显示了在细菌上清液中的高5'-核苷酸酶活性。对浓度为109个细菌/ml的细菌培养物的上清液进行分析。
罗伊氏乳杆菌DSM 33198已就改善的特性进行开发。罗伊氏乳杆菌菌株DSM 33198已在包括反复冻干程序的多步骤选择方法中进行修饰，以允许其比其天然分离株更耐受，并且在生产过程中得到更高的存活。
选择了罗伊氏乳杆菌DSM 33198。
PCT
PCT
仅由受理局使用
PCT
仅由国际局使用

Claims (7)

1.诱导褪黑素的产生的罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)菌株，其用于在在受试者中产生褪黑素，其中所述用途是用于治疗或预防睡眠障碍或肠易激综合征(IBS)；
其中所述菌株具有5'-核苷酸酶活性，和/或产生腺苷，和/或诱导褪黑素的产生，其水平与罗伊氏乳杆菌DSM 17938相比是增加的。
2.权利要求1所用的菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM32849或DSM 33198。
3.权利要求1或权利要求2所用的菌株，其中与使用DSM 17938的水平相比，所述菌株能够导致5'-核苷酸酶活性和/或腺苷水平和/或褪黑素水平增加到多至5倍；或与使用DSM17938的水平相比，导致5'-核苷酸酶活性和/或腺苷水平和/或褪黑素水平增加到至少1.5倍，优选增加到至少2倍，更优选增加到至少3、4或5倍。
4.权利要求1至3的任一项所用的菌株，其中所述菌株具有大于8单位/L的5'-核苷酸酶活性，和/或以大于8μmol L-1分钟-1的水平产生腺苷，和/或诱导产生水平为大于20pg/ml的褪黑素。
5.权利要求1至4的任一项所用的菌株，其中所述受试者是多至12个月龄，优选多至6或5个月龄，或优选多至3或4个月龄的婴儿；和/或其中所述受试者是母乳喂养的或用配方奶喂养的或其组合。
6.权利要求1至5的任一项所用的菌株，其中所述用途进一步包括施用至少一种另外的试剂，其中所述另外的试剂是AMP。
7.一种细菌菌株，其中所述菌株是罗伊氏乳杆菌DSM 32846、DSM 32847、DSM 32849或DSM 33198，其中所述菌株用于治疗或预防睡眠障碍或肠易激综合征(IBS)。
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