ES2927850T3 - Sustratos quimioluminiscentes para peroxidasa con una vida útil prolongada - Google Patents

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Abstract

Un kit para realizar un ensayo para determinar un analito en una muestra con una vida útil prolongada, en el que el kit comprende una dihidrazida cíclica quimioluminiscente, un potenciador, un copotenciador y un peróxido oxidante. El kit es útil en ensayos de transferencia e inmunoensayos para la detección de proteínas y moléculas de ácido nucleico. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Sustratos quimioluminiscentes para peroxidasa con una vida útil prolongada
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un sustrato quimioluminiscente para ensayar peroxidasas en un ensayo para determinar un analito en una muestra, en el que el sustrato quimioluminiscente tiene una vida útil prolongada.
Técnica antecedente
La oxidación quimioluminiscente del luminol catalizada por la peroxidasa de rábano picante (HRP) encuentra un amplio empleo en las pruebas analíticas de antígenos, anticuerpos y ácidos nucleicos y, en particular, en las pruebas de transferencia, por ejemplo, Dot y Western Blots (proteínas), Southern y Northern Blots (ácidos nucleicos), así como en los inmunoensayos ligados a enzimas (EIA, para proteínas o ácidos nucleicos).
Se sabe que la oxidación quimioluminiscente del luminol catalizada por la HRP puede hacerse más rápida y eficiente añadiendo un mediador de electrones, o potenciador, como se muestra, por ejemplo, en Kricka LJ (1991), Clinical Chemistry, 37:1472-1481o por Kricka LJ, Voyta JC y Bronstein I en "Chemiluminescent Methods for Detecting and Quantitating Enzyme Activity" (2000), Methods Enzymol; 305:370-390.
El mecanismo de la reacción de quimioluminiscencia mejorada (ECL), en la que el luminol y un potenciador se oxidan simultáneamente, se ha descrito como sigue [Lind J, Merenyi G, y Eriksen TE (1983), J Am Chem Soc, 105: 7655-7661]. En la primera etapa de la ECL, el potenciador (E), que es un sustrato más activo para la HRP que el luminol, es oxidado por el peróxido de hidrógeno en presencia de la HRP según un mecanismo de "ping-pong":
HRP H2O2 —— HRP-I (1)
HRP-I E — HRP-II E- (2)
HRP-II E — HRP E- (3)
donde E es el potenciador, E- es un radical producto de la oxidación de un electrón del potenciador, HRP es la enzima peroxidasa de rábano picante en su estado de reposo de Fe(III), HRP-I y HRP-II son los intermedios oxidados de la peroxidasa, que están, por dos y un equivalente de oxidación, por encima del estado de reposo, respectivamente. A continuación, el producto radical del potenciador (E-) reacciona reversiblemente con una molécula de luminol (LH-) [Easton PM, Simmonds AC, Rakishev A, Egorov Am y Candeias LP (1996), J Am Chem Soc; 118:6619-6624]:
E- LH'^ E L- (4)
Termodinámicamente, la posición de equilibrio redox (4) está determinada por la diferencia entre los potenciales de reducción de los radicales del potenciador y del luminol en las condiciones del experimento. Una vez formados, dos radicales de luminol (L--) dismutan a anión de luminol (LH-) y a intermedio de diazaquinona (L):
2 L- — LH- L (5)
El intermedio de la diazaquinona (L) reacciona con el peróxido de hidrógeno con la formación de un peróxido de luminol (LO22-), que colapsa al estado excitado del 3-aminoftalato [AP2-]*) con la expulsión del nitrógeno molecular; el [AP2-]* vuelve entonces al estado básico (AP2-) con la emisión de un fotón (hv) a 425 nm:
L H2O2 — LO22- — [AP2-]* N2 — AP2- hv (6)
La intensidad de la luz emitida es proporcional al cuadrado de la tasa de generación de radicales de luminol (L-"). La relación cuadrática es una consecuencia del mecanismo de generación de las especies excitadas, que implica la dismutación de dos radicales de luminol, ecuación 5. A su vez, la tasa de generación de radicales de luminol viene dada por la tasa de renovación enzimática, ponderada por la fracción de los radicales generados que resulta en radicales de luminol (L--) tras el equilibrio redox (4). La tasa de renovación enzimática se rige por el paso determinante de la tasa, la reducción de la HRP-II a enzima férrica (HRP), ecuación (3). En conclusión, el aumento de la quimioluminiscencia puede describirse con una buena aproximación considerando (a) la aceleración de la renovación enzimática por reacción del potenciador con la HRP-II y (b) la reacción reversible de transferencia de electrones entre el radical potenciador y el luminol.
Se utilizaron con éxito varios compuestos para mejorar la quimioluminiscencia inducida por la HRP, como la luciferina, 6-hidroxibenzotriazoles, p-yodofenoles, ácido p-cumárico y otros potenciadores fenólicos (Thorpe GHG y Kricka LJ (1986) Methods Enzymol 133:331); aminas aromáticas (Patente de EE.UU. N° 4.279.950); acetanilidas (Solicitud de patente europea N° 603953); fenotiazinas N-sustituidas (Patente de EE.UU. N° 5.171.688 y Patente de EE.UU. n° 6.432.662); ácidos borónicos (Patente de EE.UU. N° 5.629.168).
Se obtuvo un gran aumento adicional en la emisión de luz quimioluminiscente con ciertas 4-dialkilaminopiridinas, como la 4-morfolino-piridina (MORP), la 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y la 4-pirrolidinopiridina (PPY), como se describe en la Patente estadounidense n° 7.803.573. Estos compuestos, pertenecientes a la clase de las 4-aminopiridinas, proporcionan una mejora adicional en la producción de luz sólo cuando se utilizan junto con potenciadores primarios, del tipo de transferencia de electrones. Por lo tanto, pueden describirse como potenciadores secundarios, o co-potenciadores, como en Vdovenko MM, Della Ciana L, y Sakharov IY (2009) Anal Biochem 392:54. La adición de 4-dialkilaminopiridinas a una solución de sustrato que contiene el potenciador SPTZ aumentó significativamente la tasa de producción de radicales catiónicos SPTZ, ecuaciones (2) y (3), aumentando así la renovación de la HRP como se describe en Sakharov IY y Vdovenko MM (2013) Anal Biochem 434:12. Otro grupo de compuestos que se comportan como co-potenciadores se describe en el documento US 9.040.252. Estos co-potenciadores pertenecen a la clase de los N-azoles, siendo los más útiles el imidazol, el 1-metil-imidazol, el 1,2,3-triazol y el 1,2,4-triazol.
En la operación práctica, el usuario mezclará dos soluciones tampón separadas, previamente preparadas, conteniendo una parte el luminol y los potenciadores, y la otra parte el oxidante de peróxido. Mientras que las dos soluciones separadas pueden almacenarse durante un largo periodo de tiempo, la "solución de trabajo" resultante, obtenida al mezclar las dos soluciones parciales, tiene una estabilidad limitada, que va desde unas pocas horas hasta, como máximo, varios días.
Así, es deseable eliminar la necesidad de mezclar componentes separados en el momento del procedimiento de prueba, sin reducir o comprometer el rendimiento del sustrato.
Los intentos anteriores de proporcionar sustratos de peroxidasa completos con una estabilidad de almacenamiento prolongada han tenido un éxito muy limitado. Por ejemplo, Giri en la Patente de EE.UU. n° 6.602.679 divulga formulaciones con estabilidad extendida, que contienen potenciadores y estabilizadores de peróxido. Sin embargo, no hay datos de estabilidad. Del mismo modo, Woerner, en la solicitud de patente de EE.UU. 2007/0264647 describe el uso de halogenuros de estaño como estabilizadores del peróxido de hidrógeno en condiciones alcalinas para su uso en la detección quimioluminiscente, fluorescente y colorimétrica de ensayos de tipo peroxidasa. Aunque se reivindica que, "al estabilizar y/o potenciar el peróxido de hidrógeno en el sistema tampón, las composiciones utilizadas en dichos ensayos pueden tener una mayor vida útil", no se aporta ninguna prueba experimental.
Por lo tanto, a pesar de lo que se ha informado anteriormente, todavía hay una necesidad de formulaciones mejoradas de sustratos para la detección quimioluminiscente mejorada de la peroxidasa con todos los componentes mezclados en una solución tampón y con una vida útil prolongada.
Objeto y sumario de la invención
El objeto de la presente invención es proporcionar un sustrato quimioluminiscente novedoso para determinar cuantitativamente una enzima peroxidasa en ensayos para la detección de un analito en una muestra, en los que el sustrato quimioluminiscente tiene una vida útil prolongada.
Según la invención, el objeto anterior se consigue gracias a los kits especificados en las reivindicaciones subsiguientes, que se entienden como parte integrante de la presente descripción.
Según una realización, la presente divulgación se refiere a un kit para realizar un ensayo para determinar un analito en una muestra, en el que el kit comprende una diacilhidrazida cíclica quimioluminiscente, un oxidante de peróxido, un potenciador y un co-potenciador, en el que el potenciador es una N-alquilfenoxazina aniónica y el co-potenciador se selecciona entre una 4-dialquilaminopiridina y un N-azol.
Según otra realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para realizar un ensayo de quimioluminiscencia para detectar un analito en una muestra, en el que el procedimiento emplea el kit aquí divulgado.
Breve descripción de los dibujos
La invención se describirá ahora, sólo a modo de ejemplo, con referencia a las figuras de dibujo adjuntas, en las que:
- La figura 1 muestra las estructuras de las diacilhidrazidas cíclicas de la presente invención.
- La figura 2 muestra las estructuras de los potenciadores aniónicos de N-alquilfenoxazina de la presente invención.
- La figura 3 muestra un gráfico de la cinética de oxidación del SPTZ.
- La figura 4 muestra un gráfico de la cinética de oxidación del SPOX.
- La figura 5 muestra la dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de SPOX en un sustrato de luminol/perborato/SPOX.
- La figura 6 muestra la dependencia del pH de la señal quimioluminiscente en un sustrato de luminol/perborato/SPOX.
- La figura 7 muestra la dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de MORP en un sustrato de luminol/perborato/SPOX/MORP.
- La figura 8 muestra la dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de imidazol en un sustrato de luminol/perborato/SPOX/imidazol.
- La figura 9 muestra la dependencia del pH de la señal quimioluminiscente en los sustratos luminol/perborato/SPOX/MORP y luminol/perborato/SPOX/imidazol.
- La figura 10 muestra la dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de SPOX en un sustrato L-012/perborato/SPOX.
- La figura 11 muestra la dependencia del pH de la señal quimioluminiscente en un sustrato L-012/perborato/SPOX.
- La figura 12 muestra la dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de MORP en el sustrato L-012/perborato/SPOX/MORP.
- La figura 13 muestra la transferencia Western de IKBa humana obtenida con los sustratos luminol/SPOX y L-012/SPOX frente a los sustratos luminol/SPTZ.
- La figura 14 muestra la transferencia Western de IKBa humana obtenida con los sustratos luminol/SPOX y L-012/SPOX frente a los sustratos luminol/SPTZ.
- La figura 15 muestra un gráfico de la señal quimioluminiscente del sustrato L/SPOX6, preparado como se describe en el Ejemplo 11, frente al tiempo de almacenamiento a 4°C.
- La figura 16 muestra un gráfico de la señal quimioluminiscente del sustrato L012/SPOX, preparado como se describe en el Ejemplo 11, frente al tiempo de almacenamiento a 4°C.
Descripción detallada de la invención
En la siguiente descripción, se dan numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión completa de las realizaciones. Las realizaciones pueden practicarse sin uno o más de los detalles específicos, o con otros procedimientos, componentes, materiales, etc. En otros casos, no se muestran ni se describen en detalle estructuras, materiales u operaciones bien conocidas para evitar que se oculten aspectos de las realizaciones. La referencia a lo largo de la presente memoria descriptiva a "una realización" o " realización" significa que un rasgo, estructura o característica particular descrita en relación con la realización está incluida en al menos una realización. Por lo tanto, las apariciones de los términos "en una realización" o "en la realización" en varios lugares a lo largo de la presente memoria descriptiva no se refieren necesariamente a la misma realización. Además, los rasgos, estructuras o características particulares pueden combinarse de cualquier manera adecuada en una o más realizaciones.
Los títulos que se proporcionan en este documento son sólo por conveniencia y no interpretan el ámbito o el significado de las realizaciones.
La presente invención se refiere a un kit para realizar un ensayo para determinar un analito en una muestra, en el que el kit comprende una diacildihidrazida quimioluminiscente, un oxidante de peróxido, un potenciador y un copotenciador, en el que el potenciador es una N-alquilfenoxazina aniónica y el co-potenciador se selecciona entre una 4-dialquilaminopiridina y un N-azol.
En una realización, la diacildihidrazida quimioluminiscente se selecciona del grupo que consiste en luminol, isoluminol, 5-amino-6,8-dimetil-2,3-dihidroftalazina-14-diona (DML), 5-amino-6,8-dietil-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona (DEL), y 8-amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazina-1,4(2H,3H)-diona (L-012). Las estructuras químicas de estas diacildihidrazidas quimioluminiscentes se muestran en la Fig. 1. Preferentemente, la diacildihidrazida quimioluminiscente se selecciona entre Luminol y 8-amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazina-1,4(2H,3H)-diona (L-012).
En una realización, la N-alquilfenoxazina aniónica se selecciona del grupo que consiste en el ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propano-1-sulfónico (SPOX), el ácido 4-(10H-fenoxazina-10-il)butano-1-sulfónico (SBOX), el ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propanoico (CPOX) y el ácido 4-(10H-fenoxazina-10-il)butanoico (CBOX) y sus sales. Las estructuras químicas de estas N-alquilfenoxazinas se muestran en la Fig. 2. Preferentemente, la N-filenoxazina aniónica se selecciona entre ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propano-1-sulfónico (SPOX) y ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propanoico (CPOX).
Los co-potenciadores de la presente invención pertenecen a dos clases diferentes de compuestos, 4-dialkilaminopiridinas (como se describe en el documento US 7.803.573), y N-azoles (como se describe en el documento US 9.040.252). Entre las 4-dialkilaminopiridinas, los compuestos preferidos son 4-morfolino-piridina (MORP), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 4-pirrolidinopiridina (PPY). Entre los N-azoles, los compuestos preferidos son imidazol y 1-metil-imidazol.
El oxidante de peróxido según la presente invención puede ser peróxido de hidrógeno, o cualquier complejo de peróxido de hidrógeno, que -al disolverse en una solución acuosa- libera peróxido de hidrógeno, como perboratos, percarbonatos o el complejo urea/peróxido de hidrógeno en una proporción molar igual a 1:1. En una realización preferente, el oxidante de peróxido se selecciona entre peróxido de hidrógeno, complejo de urea/peróxido de hidrógeno, una sal de perborato, una sal de percarbonato. Preferentemente, las sales de perborato y percarbonato son sales alcalinas o alcalinotérreas.
En otra realización, el kit comprende además una enzima peroxidasa.
La enzima peroxidasa es cualquier peroxidasa adecuada para su uso en ensayos de quimioluminiscencia. Según una realización, la enzima peroxidasa se selecciona entre peroxidasa de rábano picante (por ejemplo, Sigma tipo VIA o IX), o una peroxidasa aniónica, como la peroxidasa de soja y la peroxidasa de batata.
La enzima peroxidasa puede estar conjugada o no con un reactivo de detección del analito a detectar. La enzima peroxidasa (o su conjugado) puede ser añadida por el usuario final.
La limitada estabilidad de almacenamiento de los sustratos quimioluminiscentes mejorados para la peroxidasa se debe a dos causas principales: (1) oxidación del potenciador (2) descomposición del peróxido de hidrógeno. De estas dos causas, la primera, la oxidación del potenciador, es con mucho la más importante. Otros componentes del sustrato, como las diacilhidrazidas cíclicas, los co-potenciadores y el tampón son esencialmente estables a la oxidación por el oxígeno molecular o el peróxido, incluso en solución alcalina.
La oxidación del potenciador puede ocurrir por reacción con oxígeno molecular, o con peróxido. Estas reacciones de oxidación suelen ser más rápidas a medida que aumenta el pH, y están catalizadas por trazas de iones metálicos, especialmente hierro y cobre.
Ciertas clases de potenciadores, como los potenciadores fenólicos, están sujetos a una rápida oxidación incluso por el oxígeno molecular. De hecho, las soluciones que contienen luminol y potenciadores fenólicos deben almacenarse a 4°C, ya que pierden un gran porcentaje de su actividad si se almacenan incluso durante un día a temperatura ambiente.
Los potenciadores de N-alquilfenotiazinas, como el 3-(10'-fenotiazinil) propano-1-sulfonato (SPTZ) son estables a la oxidación por el oxígeno molecular durante periodos muy largos incluso en soluciones alcalinas mantenidas a temperatura ambiente. Sin embargo, se descomponen lentamente en presencia de peróxidos (Fig. 3). La disminución simultánea de la concentración del potenciador y del peróxido conduce a una degradación del rendimiento.
Por el contrario, los presentes inventores comprobaron que los potenciadores de N-alquilfenoxazinas aniónicas son extremadamente estables a la oxidación por peróxidos, incluso en soluciones alcalinas (Fig. 4).
Este hallazgo sugiere fuertemente que el principal factor que afecta a la estabilidad de almacenamiento de los sustratos quimioluminiscentes mejorados es la estabilidad hacia la oxidación del propio potenciador. En cambio, Giri en la Patente de EE.UU. n° 6.602.679 y Woerneren en la solicitud de patente de Ee.Uu.2007/0264647 se basan exclusivamente en la adición de estabilizadores de peróxido para mejorar la estabilidad de almacenamiento de los sustratos quimioluminiscentes mejorados, descuidando el papel del potenciador.
Sobre esta base, los presentes inventores desarrollaron sustratos quimioluminiscentes en los que las N-alquilfenotiazinas aniónicas fueron sustituidas, como potenciadores, por N-alquilfenoxazinas aniónicas, Ejemplos 2­ 10. En el ejemplo 11 se describen formulaciones optimizadas de sustratos quimioluminiscentes basados en luminol o L-012, con 3-(10'-fenoxazinil) propano-1-sulfonato (SPOX) como potenciador y MORP o imidazol como copotenciador. El rendimiento de estos sustratos es similar o superior al de los sustratos de referencia con SPTZ como potenciador, L/SPTZ1 y L/SPTZ2 (Ejemplo 2), tanto en términos de señal quimioluminiscente inicial, Fig. 13, como de inmunoensayos de transferencia de Western, Fig. 14.
Se realizaron estudios de estabilidad con los sustratos del Ejemplo 11 tanto a 4°C como a 23°C. Las señales quimioluminiscentes iniciales se registraron inmediatamente después de mezclar todos los componentes. Los resultados se muestran en la Tabla I y la Fig. 13 (4°C), y en la Tabla II (23°C). En ambos casos, los sustratos que contienen SPOX como potenciador son mucho más estables que los que tienen SPTZ.
TABLA I
% Pérdida de señal inicial a 4°C (días)
Sustrato 30 60 130
L/SPTZ1 85 100 100
L/SPTZ2 100 100 100
L/SPOX2 0 0 25
L/SPOX6 0 0 5
L/SPOX10 0 5 10
L/SPOX16 0 0 5
L012/SPOX 0 0 0
TABLA II
% Pérdida de señal inicial a 23°C (días)
Sustrato 15 30 60
L/SPTZ1 100 100 100
L/SPTZ2 100 100 100
L/SPOX2 10 20 30
L/SPOX6 0 5 15
L/SPOX10 0 5 15
L/SPOX16 0 0 0
L012/SPOX 0 0 10
Los sustratos más prometedores se controlaron durante períodos de tiempo más largos. Los resultados se resumen en la Fig. 15 para L/SPXO6. Este sustrato muestra una disminución de la señal de aproximadamente un 15% tras su almacenamiento a 4°C durante 211 días (7 meses). Se comprobó que la estabilidad de almacenamiento es aún mejor con el sustrato L012/SPOX, Fig. 16. En este caso, se observa una disminución de la señal de sólo el 8%, tras el almacenamiento a 4°C durante 585 días (casi 20 meses).
En una realización, el kit comprende una diacilhidrazida cíclica quimioluminiscente, un oxidante de peróxido, un potenciador y un co-potenciador, en el que la diacilhidrazida cíclica quimioluminiscente está presente en un primer vial y el oxidante de peróxido está presente en un segundo vial, y en el que el potenciador y el co-potenciador están presentes en el primer vial o en el segundo vial o en ambos. El segundo vial que contiene el oxidante de peróxido está libre de cualquier estabilizador del oxidante de peróxido. Los reactivos del kit están presentes en los viales en estado líquido o sólido. Si los reactivos del kit están en estado sólido, pueden estar presentes en forma de polvo o comprimidos y tienen que ser reconstituidos en una fase líquida mediante la adición de agua o de una solución tampón en el momento de su uso. Se pueden añadir potenciadores y co-potenciadores, así como otros aditivos, como quelantes y estabilizadores, a los viales de dihidrazida cíclica quimioluminiscente o a los de oxidante de peróxido, o a ambos, siempre que el o los estabilizadores no sean estabilizadores del oxidante de peróxido. Los dos viales también pueden contener sustancias tampón que al mezclarse generan un sustrato quimioluminiscente, o "solución de trabajo", con un valor de pH adecuado para realizar el ensayo. La solución de trabajo obtenida mediante la mezcla de los compuestos mencionados anteriormente es estable durante un largo período de tiempo (generalmente 6 meses o más) y está libre de cualquier estabilizador del oxidante de peróxido.
En una realización, la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente, el oxidante de peróxido, el potenciador y el copotenciador se formulan en un solo vial y en ausencia de cualquier estabilizador del oxidante de peróxido.
La enzima peroxidasa o un conjugado de la misma -si está presente en el kit- no se almacena junto con su componente de sustrato (es decir, el oxidante de peróxido), sino en un vial diferente.
Según otra realización, la presente divulgación se refiere a un procedimiento para realizar un ensayo de quimioluminiscencia para la detección de un analito en una muestra.
El término "ensayo" significa la detección, semicuantificación y cuantificación de un analito. Normalmente, la realización de un ensayo requiere relacionar la producción de luz con la cantidad de peroxidasa utilizada. La emisión de luz se detecta o se mide de manera que la presencia y/o la cantidad de analito se relacionan con la producción de luz.
Según la presente divulgación, la realización de un ensayo requiere relacionar la producción de luz generada por la reacción de quimioluminiscencia de una diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente reaccionada con una enzima peroxidasa, un potenciador, un co-potenciador y un oxidante de peróxido con la cantidad de cualquiera de los socios de la reacción (es decir, cualquiera de la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente, la enzima peroxidasa, el oxidante de peróxido, el potenciador y el co-potenciador). Según una realización preferente, la producción de luz está relacionada con la cantidad de la enzima peroxidasa utilizada.
El procedimiento para realizar un ensayo de quimioluminiscencia para la detección de un analito en una muestra comprende las siguientes etapas:
(i) realización de un sustrato quimioluminiscente mediante la mezcla de una diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente, un potenciador, un co-potenciador y un oxidante de peróxido, en el que el potenciador es una N-alquilfenoxazina aniónica y el co-potenciador se selecciona entre una 4-dialquilaminopiridina y un N-azol, y en el que el sustrato quimioluminiscente está libre de cualquier estabilizador del oxidante de peróxido, (ii) hacer reaccionar un soporte sólido, en el que se ha inmovilizado el analito de interés, con el sustrato quimioluminiscente,
(iii) añadir al soporte sólido un reactivo de detección del analito de interés, en el que el reactivo de detección está conjugado con una enzima peroxidasa, y
(iv) registrar la señal luminosa producida generada por la reacción de quimioluminiscencia de la enzima peroxidasa con el sustrato quimioluminiscente, que se correlaciona con la presencia/cantidad del analito de interés.
En una realización, la diacildihidrazida quimioluminiscente se selecciona del grupo que consiste en luminol, isoluminol, 5-amino-6,8-dimetil-2,3-dihidroftalazina-14-diona (DML), 5-amino-6,8-dietil-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona (DEL), y 8-amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazina-1,4(2H,3H)-diona (L-012). Preferentemente, la diacildihidrazida quimioluminiscente se selecciona entre Luminol y 8-amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazina-1,4(2H,3H)-diona (L-012).
En una realización, la N-alquilfenoxazina aniónica se selecciona del grupo que consiste en ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propano-1-sulfónico (SPOX), ácido 4-(10H-fenoxazina-10-il)butano-1-sulfónico (SBOX), ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propanoico (CPOX) y ácido 4-(10H-fenoxazina-10-il)butanoico (CBOX) y sus sales. Preferentemente, la N-filenoxazina aniónica se selecciona entre el ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propano-1-sulfónico (SPOX) y el ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propanoico (CPOX).
Entre las 4-dialkilaminopiridinas, los co-potenciadores preferidos son 4-morfolino-piridina (MORP), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 4-pirrolidinopiridina (PPY). Entre los N-azoles, los co-potenciadores preferidos son imidazol y 1-metil-imidazol.
El oxidante de peróxido según la presente invención puede ser peróxido de hidrógeno, o cualquier complejo de peróxido de hidrógeno, que -al disolverse en una solución acuosa- libera peróxido de hidrógeno, como los perboratos, percarbonatos o el complejo urea/peróxido de hidrógeno en una proporción molar igual a 1:1. En una realización preferente, el oxidante de peróxido se selecciona entre peróxido de hidrógeno, complejo de urea/peróxido de hidrógeno, una sal de perborato, una sal de percarbonato. Preferentemente, las sales de perborato y percarbonato son sales alcalinas o alcalinotérreas.
La enzima peroxidasa es cualquier peroxidasa adecuada para su uso en ensayos de quimioluminiscencia. Según una realización, la enzima peroxidasa se selecciona entre la peroxidasa de rábano picante (por ejemplo, Sigma tipo VIA o IX), o una peroxidasa aniónica, como la peroxidasa de soja y la peroxidasa de batata.
Según una realización, la concentración de la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,01 mM y 10 mM, preferentemente entre 0,05 y 5,0 mM.
Según una realización, la concentración del potenciador de N-alquilfenoxazina aniónica en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,01 y 3 mM, preferentemente entre 0,03 y 1,0 mM.
De acuerdo con una realización, la concentración del co-potenciador en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,05 y 25 mM, preferentemente entre 0,1 y 12 mM.
Según una realización, la concentración del peróxido en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,1 y 8 mM, preferentemente entre 0,25 y 4 mM.
Según una realización, el pH del sustrato quimioluminiscente está comprendido entre 6,0 y 9,5, preferentemente entre 6,5 y 9,0.
Según una realización preferente, el sustrato quimioluminiscente (libre de cualquier estabilizador de oxidante de peróxido), que tiene un pH comprendido entre 6,0 y 9,5, preferentemente entre 6,5 y 9,0, contiene:
i) la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente en una concentración entre 0,01 mM y 10 mM, preferentemente entre 0,05 y 5 mM;
ii) el potenciador aniónico N-alquilfenoxazina en una concentración entre 0,01 y 3 mM, preferentemente entre 0,03 y 1 mM;
iii) el co-potenciador en una concentración entre 0,05 y 25 mM, preferentemente entre 0,1 y 12 mM; y iv) el oxidante de peróxido en una concentración entre 0,1 y 8 mM, preferentemente entre 0,25 y 4,0 mM.
Al realizar el ensayo para detectar el analito de interés (ya sea de forma cualitativa o cuantitativa), la enzima peroxidasa se encuentra en forma de un conjugado con un reactivo de detección del analito a detectar. El reactivo de detección puede seleccionarse entre una proteína, un anticuerpo, un nucleótido, un oligonucleótido o una molécula de ácido nucleico, según el tipo de analito que se desee detectar. El reactivo de detección conjugado con la enzima peroxidasa puede ser (a) un reactivo de detección capaz de unirse específicamente al analito o (b) un reactivo de detección secundario capaz de unirse al reactivo de detección que se une específicamente al analito. En este último caso, el reactivo de detección que se une específicamente al analito se añade al sustrato quimioluminiscente o al soporte sólido, donde se ha inmovilizado el analito de interés, y el reactivo de detección secundario capaz de unirse al reactivo de detección se añade posteriormente al soporte sólido.
Las reacciones de quimioluminiscencia de la presente invención son aplicables para la detección y cuantificación de analitos, utilizando, por ejemplo, la formación de un enlace entre el analito (por ejemplo, una proteína o una molécula de ácido nucleico) y un soporte sólido (por ejemplo, una membrana o una placa de microtitulación) y utilizando la enzima peroxidasa como trazador. La reacción luminiscente se inicia añadiendo el sustrato quimioluminiscente, tal y como se describe en el presente documento, al soporte sólido (que ha reaccionado previamente con la muestra que contiene el analito) y añadiendo posteriormente al soporte sólido la solución que contiene la enzima peroxidasa. La emisión de luz se prolonga y puede medirse con una película, una cámara u otros instrumentos.
Los ensayos de quimioluminiscencia basados en el sustrato quimioluminiscente según la presente divulgación incluyen ensayos transferencia por puntos y transferencia Western para proteínas y ensayos de transferencias Southern y Northern para ácidos nucleicos.
Los ensayos de transferencia basados en el sustrato quimioluminiscente según la presente divulgación utilizan la electroforesis en gel para separar el analito de interés (una proteína o una molécula de ácido nucleico) de los otros componentes (otras proteínas u otras moléculas de ácido nucleico) presentes en la muestra a analizar. A continuación, el analito y los demás componentes se transfieren a una membrana, en la que se sondean (detectan) utilizando el sustrato quimioluminiscente aquí descrito y un reactivo de detección capaz de unirse específicamente al analito de interés, en el que el reactivo de detección se conjuga con la enzima peroxidasa.
Los ensayos de quimioluminiscencia basados en el sustrato quimioluminiscente de la presente invención también incluyen los inmunoensayos enzimáticos (EIA), como por ejemplo los ensayos ELISA. Los inmunoensayos enzimáticos son especialmente útiles para detectar analitos presentes en la muestra en cantidades extremadamente pequeñas, como los marcadores tumorales, las hormonas tiroideas, las proteínas de los virus (por ejemplo, el VIH, el VHC o las proteínas del VPH) o las hormonas esteroideas (por ejemplo, el estradiol o la aldosterona). La realización de un ensayo ELISA para detectar un analito implica al menos un reactivo de detección con especificidad para el analito de interés. El analito de la muestra se inmoviliza en un soporte sólido (normalmente una placa de microtitulación de poliestireno), ya sea de forma no específica (mediante la adsorción a la superficie del soporte sólido) o específica (mediante la captura por parte de otro reactivo de detección específico para el mismo analito a la superficie del soporte sólido, en un "ELISA en sándwich"). Después de inmovilizar el analito en la superficie del soporte sólido, se añade el reactivo de detección, formando un complejo con el analito. El reactivo de detección puede estar unido covalentemente a una enzima peroxidasa como trazador, o puede ser detectado por un reactivo de detección secundario que esté unido a una enzima peroxidasa a través de (bio)conjugación (como por ejemplo a través de biotina o estreptavidina). Entre cada etapa, la placa se suele lavar con una solución de detergente suave para eliminar cualquier proteína o anticuerpo que no esté específicamente unido. Tras la última etapa de lavado, la placa se desarrolla añadiendo el sustrato quimioluminiscente aquí descrito y -en el caso de que el reactivo de detección no esté directamente conjugado con la enzima peroxidasa- la solución que contiene la enzima peroxidasa conjugada con el reactivo de detección secundario para producir una señal luminosa, que indica la cantidad de analito en la muestra.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar aspectos específicos de la invención. Sin embargo, no pretenden limitar la invención.
Ejemplos
Todos los reactivos utilizados en la presente solicitud fueron adquiridos en Sigma-Aldrich, TCI Europe y Panreac. La 5-amino-6,8-dimetil-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona (DML) y la 5-amino-6,8-dietil-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona (DEL) se sintetizaron según Neumann H, Klaus S, Klawonn M, Struebing D, Huebner S, Goerdes D, von Wangelin AJ, Lalk M y Beller M (2004) Zeitschrift für Naturforschung B, 59:431-438.
Los potenciadores SPOX y CPOX se sintetizaron de acuerdo con Kulys J, Vidziunaite R, Janciene R, y Palaima A (2006) Electroanalysis 18:1771-1777.
Las mediciones espectrofotométricas se realizaron en un UV-VIS Varian - Cary 100 BIO. Las mediciones de quimioluminiscencia se realizaron con un espectrómetro multietiqueta de microplacas, Victor3 (Perkin-Elmer) en modo de luminiscencia (sin filtro de emisión). Se utilizaron microplacas negras de 96 pocillos, (Optiplate-96F).
La solución de prueba de HRP se preparó diluyendo 15 pL de solución madre de peroxidasa de rábano picante (HRP) (20 mg/L) en 50 mL con tampón (concentración: 6 ng/mL). Se añadieron 28 pl de HRP a cada pocillo (228 pl de volumen final en el pocillo). Así, la cantidad final de HRP en cada pocillo es de 168 pg.
Ejemplo 1 - Cinética de oxidación de SPTZ y SPOX por perborato de sodio
Se prepararon las siguientes soluciones:
Solución SPTZ
[SPTZ]= 0,05 mM
[perborato de sodio]= 4 mM
en tampón Tris 300 mM, pH 8,73
Solución SPOX
[SPOX]= 0,05 mM
[perborato de sodio]= 4 mM
en tampón Tris 300 mM, pH 8,73
Se añadieron alícuotas de 2 mL de cualquiera de las dos soluciones a una cubeta de cuarzo de 1 cm. La cubeta se introdujo en un soporte de cubetas con termostato que se mantuvo a 35 °C. La cinética de oxidación se monitorizó espectrofotométricamente a 254 nm (SPTZ) y 312 nm (SPOX) durante 64 h. Los resultados se muestran en la FIG. 3 (Solución SPTZ) y FIG. 4 (Solución SPOX).
Ejemplo 2 - Sustratos quimioluminiscentes de referencia
Se prepararon dos sustratos quimioluminiscentes de referencia como sigue:
Sustrato L/SPTZ1
[luminol] = 5,0 mM
[perborato de sodio] = 4 mM
[SPTZ] = 1,5 mM
en tampón Tris 150 mM, pH 9,0.
La señal inicial se fija en 100 RLU (unidades de luz relativas)
Sustrato L/SPTZ2
[luminol] = 5,0 mM
[perborato de sodio] = 4,0 mM
[SPTZ] = 3,0 mM
[MORP] = 3,0 mM
en tampón Tris 125 mM, pH 9,0.
La señal inicial de L/SPTZ2 es 10 veces mayor que la de L/SPTZ1.
Ejemplo 3 - Dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de SPOX en sustratos de luminol/perborato/SPOX
Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[luminol]= 5,0 mM
[perborato de sodio]= 4 mM
[SPOX]= 0-3,0 mM [potenciador]
en tampón Tris 125 mM, pH 9,0
Se colocaron 200 jL de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillos. Se añadieron 30 j l de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente a la concentración de SPOX, como se muestra en la FIG. 5.
Ejemplo 4 - Dependencia del pH de la señal quimioluminiscente en substratos de luminol/perborato/SPOX Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[luminol] = 5,0 mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 0,3 mM (potenciador)
Tampón Tris 125 mM. pH 7,80-9,30
Se colocaron 200 jL de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillos. Se añadieron 30 j l de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente al pH, como se muestra en la FIG. 6.
Ejemplo 5 - Dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de MORP en sustratos de luminol/perborato/SPOX/MORP
Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[luminol] = 5,0 mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 3,0 mM (potenciador)
[MORP] = 0-10 mM (coadyuvante)
en tampón Tris 125 mM, pH 9,0
Se colocaron 200 jL de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillos. Se añadieron 30 j l de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3.
Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente a la concentración de MORP, como se muestra en la FIG. 7.
Ejemplo 6 - Dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de imidazol en sustratos de luminol/perborato/SPOX/imidazol
Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[luminol] = 0,15mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 0,3 mM (potenciador)
[imidazol] = 0-20 mM (co-potenciador)
en tampón Tris 125 mM, pH 9,0
Se colocaron 200 pl de estos sustratos en una microplaca negra de 96 pocillos. Se añadieron 30 pl de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente a la concentración de imidazol, como se muestra en la FIG. 8.
Ejemplo 7 - Dependencia del pH de la señal quimioluminiscente en sustratos de luminol/perborato/SPOX/MORP y luminol/perborato/SPOX/imidazol
Se prepararon dos series de sustratos quimioluminiscentes con las siguientes composiciones:
co-potenciador = MORP
[luminol] = 5,0 mM
[perborato de sodio] = 4,0 mM
[SPOX] = 0,3 mM (potenciador)
[MORP] = 3,0 mM (co-potenciador)
pH 7,80-9. 40 Tampón Tris 125 mM
co-potenciador = imidazol
[luminol] = 5,0 mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 0,3 mM (potenciador)
[imidazol] = 8,0 mM (co-potenciador)
Tampón Tris 125 mM, pH 7,80-9,40
Se colocaron 200 pL de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillos. Se añadieron 30 pl de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente al pH, como se muestra en la FIG. 9.
Ejemplo 8 - Dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de SPOX en sustratos L-012/perborato/SPOX
Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[L-012] = 0,15mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 0-0,4 mM (potenciador)
en tampón Tris 125 mM, pH 6,9
Se colocaron 200 jL de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillosl. Se añadieron 30 |jl de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente a la concentración de imidazol, como se muestra en la FIG. 10.
Ejemplo 9 - Dependencia del pH de la señal quimioluminiscente en substratos de L-012/perborato/SPOX Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 0,3 mM (potenciador)
Tampón Tris 125 mM, pH 6,30-7,60
Se colocaron 200 jL de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillos. Se añadieron 30 j l de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente al pH, como se muestra en la FIG. 11.
Ejemplo 10 - Dependencia de la señal quimioluminiscente de la concentración de MORP en sustratos L-012/perborato/SPOX/MORP
Se preparó una serie de sustratos quimioluminiscentes con la siguiente composición:
[L-012] = 0,15 mM
[perborato de sodio]= 4,0 mM
[SPOX] = 0,15 mM (potenciador)
[MORP] = 0-3,0 mM
Tampón Tris 125 mM, pH 6,9
se colocaron 200 j l de estos sustratos en una microplaca negra de 96-pocillos. Se añadieron 30 j l de solución de HRP (1/3700 de solución de 20 mg/L) a cada pocillo y se colocó la placa en un lector de placas Wallac Victor-3. Las señales quimioluminiscentes iniciales, normalizadas con el sustrato de referencia L/SPTZ1 (Ejemplo 2) fijado en 100 RLU, se trazan frente a la concentración de imidazol, como se muestra en la FIG. 12.
Ejemplo 11 -Sustratos Luminol/SPOXy L-012/SPOX frente a luminol/SPTZ
Se prepararon tres sustratos quimioluminiscentes basados en luminol con SPOX como potenciador, como sigue:
1. L/SPOX2
[luminol] = 4,0 mM
[perborato de sodio] = 4,0 mM
[SPOX] = 1,0 mM (potenciador)
[MORP] = 5,0 mM (co-potenciador)
en tampón Tris 150 mM, pH 9,00
co-potenciador = imidazol
2. L/SPOX6
[luminol] = 3,8 mM
[perborato de sodio] = 1,6 mM
[SPOX] = 0,34 mM (potenciador)
[imidazol] = 12,0 mM (co-potenciador)
en tampón Tris 150 mM, pH 9,00
3. L/SPOX10
[luminol] = 3,8 mM
[perborato de sodio] = 1,6 mM
[SPOX] = 0,34 mM (potenciador)
[imidazol] = 12,0 mM (co-potenciador)
en tampón Tris 150 mM, pH 8,20
4. L/SPOX16
[luminol] = 1,6 mM
[perborato de sodio] = 1,6 mM
[SPOX] = 0,34 mM (potenciador)
[imidazol] = 12,0 mM (co-potenciador)
en tampón fosfato/difosfato 1M, pH 8,85
5. L012/SPOX
[L-012] = 0,6 mM
[perborato de sodio] = 1,75 mM
[SPOX] = 0,74 mM (potenciador)
[MORP] = 1,75 mM (co-potenciador)
en tampón Tris/difosfato 50mM/30mM de pH 7,6
Se registraron los niveles iniciales de señal quimioluminiscente para cada uno de estos sustratos, así como los sustratos de referencia de luminol/SPTZ del ejemplo 2, L/SPTZ1 y L/SPTZ2. Los resultados se representaron en forma de gráfico de barras, como se muestra en la Figura 13.
Ejemplo 12 - Comparación del rendimiento entre los sustratos quimioluminiscentes luminol/SPOX, L-012/SPOX frente luminol/SPTZ en ensayos de Transferencia Western
Se comparó una serie de sustratos quimioluminiscentes de luminol/SPOX con sustratos de luminol/SPTZ. Los sustratos se probaron en transferencia western para detectar HDAC-1 en lisados de células HeLa. Una serie de diluciones de 2 veces del lisado celular (de 5 a 0,078 jg)/(de 2,5 a 0,039 |jg) se ejecutó en un gel prefabricado mini-PROTEAN TGX al 4-20% y se transfirió a una membrana de nitrocelulosa con el sistema de transferencia Trans-Blot® Turbo™. La membrana se bloqueó con un 2% de ECL™ Blocking Agent (GE Healthcare), se sondeó con un anticuerpo policlonal de conejo anti-HDAC-1 (Cat. N° ab19845, Abcam), y se incubó con un anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con h Rp (Cat. No. ab6721, Abcam). Los sustratos quimioluminiscentes se incubaron con los transferidos durante 1 minuto y 30 segundos a temperatura ambiente antes de obtener imágenes con ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare). Las imágenes se tomaron a los 120 y 180 segundos. Los resultados se muestran en la FIG. 14.
Naturalmente, aunque el principio de la invención sigue siendo el mismo, los detalles de construcción y las realizaciones pueden variar ampliamente con respecto a lo que se ha descrito e ilustrado a modo de ejemplo, sin apartarse del ámbito de la presente invención.

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Kit para realizar un ensayo de determinación de un analito en una muestra, en el que el kit comprende una diacilhidrazida cíclica quimioluminiscente, un oxidante de peróxido, un potenciador y un co-potenciador, en el que el potenciador es una N-alquilfenoxazina aniónica y el co-potenciador se selecciona entre una 4-dialquilaminopiridina o un N-azol.
2. Kit según la reivindicación 1, en el que el kit comprende además una enzima peroxidasa o un conjugado de la misma.
3. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente se selecciona del grupo que consiste en luminol, isoluminol, 5-amino-6,8-dimetil-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona, 5-amino-6,8-dietil-2,3-dihidroftalazina-1,4-diona y 8-amino-5-cloro-7-fenilpirido[3,4-d]piridazina-1,4(2H,3H)-diona.
4. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el potenciador N-alquilfenoxazina aniónica se selecciona del grupo que consiste en el ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propano-1-sulfónico, el ácido 4-(10H-fenoxazina-10-il)butano-1-sulfónico, el ácido 3-(10H-fenoxazina-10-il)propanoico y el ácido 4-(10H-fenoxazina-10-il)butanoico, y sus sales.
5. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el co-potenciador se selecciona entre imidazol, 1-metilimidazol, 4-morfolinopiridina (MORP), 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 4-pirrolidinopiridina (PPY).
6. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la enzima peroxidasa se selecciona entre peroxidasa de rábano picante, peroxidasa de soja y peroxidasa de batata.
7. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el oxidante de peróxido se selecciona entre peróxido de hidrógeno, complejo de urea/peróxido de hidrógeno, una sal de perborato, una sal de percarbonato.
8. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente está presente en un primer vial y el oxidante de peróxido está presente en un segundo vial, y en el que el potenciador y el co-potenciador están presentes en el primer vial o en el segundo o en ambos viales.
9. Kit según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente, el oxidante de peróxido, el potenciador y el co-potenciador están todos presentes en un único vial.
10. Un procedimiento para realizar un ensayo de quimioluminiscencia para la detección de un analito en una muestra, en el que el procedimiento comprende las siguientes etapas:
(i) realización de un sustrato quimioluminiscente mediante la mezcla de una diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente, un potenciador, un co-potenciador y un oxidante de peróxido, en el que el potenciador es una N-alquilfenoxazina aniónica y el co-potenciador se selecciona entre una 4-dialquilaminopiridina y un N-azol, y en el que el sustrato quimioluminiscente está libre de cualquier estabilizador del oxidante de peróxido,
(ii) hacer reaccionar un soporte sólido, en el que se ha inmovilizado el analito de interés, con el sustrato quimioluminiscente,
(iii) añadir al soporte sólido un reactivo de detección del analito de interés, en el que el reactivo de detección se conjuga directa o indirectamente con una enzima peroxidasa, y
(iv) registrar la señal luminosa de salida generada por la reacción de quimioluminiscencia de la enzima peroxidasa con el sustrato quimioluminiscente, en el que la señal luminosa de salida se correlaciona con la presencia/cantidad del analito de interés.
11. El procedimiento según la reivindicación 10, en el que la concentración de la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,01 mM y 10 mM.
12. El procedimiento según la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que la concentración del potenciador N-alquilfenoxazina aniónica en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,01 y 3 mM.
13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en el que la concentración del copotenciador en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,05 y 25 mM, preferentemente entre 0,1 y 12 mM.
14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que la concentración del peróxido en el sustrato quimioluminiscente está comprendida entre 0,1 y 8 mM.
15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en el que el pH del sustrato quimioluminiscente está comprendido entre 6,0 y 9,5, preferentemente entre 6,5 y 9,0.
16. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que el sustrato quimioluminiscente, con un pH comprendido entre 6,0 y 9,5, contiene:
i) la diacildihidrazida cíclica quimioluminiscente en una concentración entre 0,01 mM y 10 mM; ii) el potenciador N-alquilfenoxazina aniónica en una concentración entre 0,01 y 3 mM; iii) el co-potenciador en una concentración entre 0,05 y 25 mM; y
iv) el oxidante de peróxido en una concentración entre 0,1 y 8 mM.
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