ES2925312T3 - Terapia combinada para el tratamiento del cáncer - Google Patents

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Abstract

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden inhibidores de histona metiltransferasa EZH2 humana y uno o más agentes terapéuticos, particularmente agentes anticancerosos como prednisona, y métodos de terapia combinada para administrar a sujetos que los necesitan para el tratamiento del cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Terapia combinada para el tratamiento del cáncer
Esta invención se refiere a composiciones que comprenden inhibidores de la histona metiltransferasa humana EZH2, la subunidad catalítica del complejo PRC2 que cataliza la monometilación a trimetilación de la lisina 27 en la histona H3 (H3-K27) y uno o más agentes terapéuticos, en particular agentes anticancerosos, y compuestos y composiciones para su uso en el tratamiento o prevención del cáncer.
Los tratamientos de terapia combinada para el cáncer se han vuelto más comunes, en parte debido a la ventaja percibida de atacar la enfermedad a través de múltiples vías. Aunque se han identificado muchos tratamientos de terapia de combinación efectivos en las últimas décadas; en vista del alto número continuo de muertes cada año como resultado del cáncer, existe una necesidad continua de identificar regímenes terapéuticos efectivos para su uso en el tratamiento contra el cáncer.
El documento US 2012/071418A1 describe la inhibición de determinadas formas mutantes y de tipo salvaje de histona metiltransferasa humana EZH2, métodos de tratamiento de cánceres y métodos de determinación de la capacidad de respuesta a un inhibidor de EZH2 en un sujeto.
La presente invención está definida por las reivindicaciones.
La presente invención presenta una composición que comprende un compuesto de fórmula 44
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y otros agentes terapéuticos; en el que los otros agentes terapéuticos son CHOP (ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona o prednisolona) o R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina, prednisona o prednisolona).
La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (44) revelado en este documento o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y los otros agentes terapéuticos, y un portador farmacéuticamente aceptable.
En este documento se describe un método de tratamiento o prevención de una enfermedad mediante la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un compuesto de fórmula (44), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los otros agentes terapéuticos adicionales definidos en este documento. La enfermedad se puede influir, tratar o prevenir mediante la modulación del estado de metilación de las histonas u otras proteínas. Por ejemplo, la enfermedad es cáncer, una afección precancerosa o una enfermedad neurológica. Preferiblemente, el linfoma es linfoma no Hodgkin, linfoma folicular o linfoma difuso de células B grandes. Alternativamente, la leucemia es leucemia mielógena crónica (CML). La afección precancerosa es, por ejemplo, síndromes mielodisplásicos (MDS, anteriormente conocido como preleucemia).
El sujeto incluye cualquier sujeto humano que haya sido diagnosticado, tenga síntomas o esté en riesgo de desarrollar un cáncer o una afección precancerosa. El sujeto incluye cualquier sujeto humano que exprese una EZH2 mutante. Por ejemplo, una EZH2 mutante comprende una o más mutaciones, en las que la mutación es una sustitución, una mutación puntual, una mutación sin sentido, una mutación sin sentido invertida, una deleción o una inserción. Una EZH2 mutante puede comprender una mutación en el dominio de bolsillo del sustrato como se define en SEQ ID NO: 6. Una EZH2 mutante puede tener una sustitución en el aminoácido Y641. Preferiblemente, la EZH2 mutante tiene una de las siguientes mutaciones: sustitución de fenilalanina (F) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641F); una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641H); una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641N); una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641S); y una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641C).
Otras mutaciones de EZH2 pueden incluir, pero no se limitan a: una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 677 de SEQ ID NO: 1 (A677G); una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 687 de SEQ ID NO: 1 (A687V); una sustitución de metionina (M) por el residuo de tipo salvaje valina (V) en la posición de aminoácido 674 de SEQ ID NO: 1 (V674M); una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 685 de SEQ ID NO: 1 (R685H); una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 685 de SEQ ID NO: 1 (R685C); una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 322 de SEQ ID NO: 3 (N322S), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 288 de SEQ ID NO: 3 (R288Q), una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de tipo salvaje treonina (T) en la posición de aminoácido 573 de SEQ ID NO: 3 (T573I), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664E), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 458 de SEQ ID NO: 5 (R458Q), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 249 de SEQ ID NO: 3 (E249K), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 684 de SEQ ID NO: 3 (R684C), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 628 de SEQ ID NO: 21 (R628H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 501 de SEQ ID NO: 5 (Q501H), una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 192 de SEQ ID NO: 3 (D192N), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664V), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje valina (V) en la posición de aminoácido 704 de SEQ ID NO: 3 (V704L), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje prolina (P) en la posición de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 3 (P132S), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 669 de SEQ ID NO: 21 (E669K), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 255 de SEQ ID NO: 3 (A255T), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 726 de SEQ ID NO: 3 (E726V), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 571 de SEQ ID NO: 3 (C571Y), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 145 de SEQ ID NO: 3 (F145C), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693T), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 145 de SEQ ID NO: 3 (F145S), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 21 (Q109H), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 622 de SEQ ID NO: 21 (F622C), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 135 de SEQ ID NO: 3 (G135R), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 168 de SEQ ID NO: 5 (R168Q), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 159 de SEQ ID NO: 3 (G159R), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 310 de SEQ ID NO: 5 (R310C), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 561 de SEQ ID NO: 3 (R561H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 634 de SEQ ID NO: 21 (R634H), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 660 de SEQ ID NO: 3 (G660R), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 181 de SEQ ID NO: 3 (Y181C), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje histidina (H) en la posición de aminoácido 297 de SEQ ID NO: 3 (H297R), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 612 de SEQ ID NO: 21 (C612S), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje histidina (H) en la posición de aminoácido 694 de SEQ ID NO: 3 (H694Y), una sustitución de alanina (A) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664A), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 150 de SEQ ID NO: 3 (I150T), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 264 de SEQ ID NO: 3 (I264R), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje prolina (P) en la posición de aminoácido 636 de SEQ ID NO: 3 (P636L), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 713 de SEQ ID NO: 3 (I713T), una sustitución de prolina (P) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 501 de SEQ ID NO: 5 (Q501P), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 243 de SEQ ID NO: 3 (K243Q), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 130 de SEQ ID NO: 5 (E130D), una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 509 de SEQ ID NO: 3 (R509G), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 566 de SEQ ID NO: 3 (R566H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 677 de SEQ ID NO: 3 (D677H), una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 466 de SEQ ID NO: 5 (K466N), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 78 de SEQ ID NO: 3 (R78H), una sustitución de metionina (M) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 6 (K6M), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje serina (S) en la posición de aminoácido 538 de SEQ ID NO: 3 (S538L), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 149 de SEQ ID NO: 3 (L149Q), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 252 de SEQ ID NO: 3 (L252V), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 674 de SEQ ID NO: 3 (L674V), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 656 de SEQ ID NO: 3 (A656V), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 731 de SEQ ID NO: 3 (Y731D), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 345 de SEQ ID NO: 3 (A345T), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 244 de SEQ ID NO: 3 (Y244D), una sustitución de triptófano (W) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 576 de SEQ ID NO: 3 (C576W), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 640 de SEQ ID NO: 3 (N640K), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 675 de SEQ ID NO: 3 (N675K), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 579 de SEQ ID NO: 21 (D579Y), una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693I), y una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693K).
Otras mutaciones de EZH2 pueden incluir: un marco de lectura en la posición de aminoácido 730, 391,461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730, o 363 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21 o la posición de nucleótido correspondiente de la secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 3, 5 o 2; una deleción de ácido glutámico (E) y leucina (L) en las posiciones de aminoácido 148 y 149 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21, o una mutación sin sentido en la posición de aminoácido 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137 o 60 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21.
Un sujeto puede tener resistencia a uno cualquiera o más de otros agentes terapéuticos o cualquiera de los compuestos descritos en este documento. Por ejemplo, el sujeto puede tener resistencia a los inhibidores de EZH o a la prednisona.
En este documento se describe un método de inhibición de la proliferación de células cancerosas que comprende poner en contacto dichas células cancerosas con una composición que comprende un compuesto de fórmula (44) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y los agentes terapéuticos adicionales definidos en este documento. La inhibición de la proliferación de células cancerosas incluye retrasar el crecimiento de células cancerosas, inducir la muerte celular, reducir la viabilidad de las células cancerosas, inhibir o retrasar el crecimiento del tumor o reducir el tamaño del tumor.
En este documento se describen métodos de terapia de combinación en los que un compuesto de fórmula (44), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los otros agentes terapéuticos definidos en este documento se administran de forma simultánea o secuencial. Por ejemplo, un compuesto de fórmula (44) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse antes de la administración de otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, un compuesto de fórmula (44) o una sal farmacéuticamente aceptable puede administrarse antes de la administración de una composición que comprende un compuesto de fórmula (44) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y los otros agentes terapéuticos. La administración concurrente o secuencial de un compuesto de fórmula (44) y/o cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier ruta apropiada que incluye, pero no se limitan a, las vías oral, intravenosa, intramuscular y la absorción directa a través de los tejidos de la membrana mucosa. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes.
Los métodos de terapia de combinación descritos en este documento pueden dar como resultado un efecto sinérgico, en el que el efecto de una combinación de compuestos u otros agentes terapéuticos es mayor que la suma de los efectos resultantes de la administración de cualquiera de los compuestos u otros agentes terapéuticos como agentes únicos. Un efecto sinérgico también puede ser un efecto que no se puede lograr mediante la administración de cualquiera de los compuestos u otros agentes terapéuticos como agentes únicos. El efecto sinérgico puede incluir, pero no se limita a, un efecto de tratamiento del cáncer al reducir el tamaño del tumor, inhibir crecimiento del tumor, o aumento de la supervivencia del sujeto. El efecto sinérgico también puede incluir la reducción de la viabilidad de las células cancerosas, la inducción de la muerte de las células cancerosas y la inhibición o el retraso del crecimiento de las células cancerosas.
Las composiciones de la presente invención se pueden administrar a una dosificación de 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día. Cualquier compuesto de fórmula (IIa) o sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse a una dosificación de 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día. Cualquier otro agente terapéutico puede administrarse a una dosificación de 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día.
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que entienden comúnmente los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. En la memoria descriptiva, las formas singulares también incluyen el plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento en la práctica o prueba de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales apropiados. Las referencias en este documento citadas no se admiten como estado de la técnica de la invención reivindicada. En caso de conflicto, prevalecerá la presente memoria descriptiva, incluidas las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no pretenden ser limitativos.
Otras características y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y las reivindicaciones.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 es un esquema que detalla los programas de tratamiento in vitro para determinar el efecto de la terapia de combinación sobre la viabilidad celular. (A) Administración del compuesto 44 antes de la administración del compuesto 44 y los componentes CHOP (ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona). (B) Administración del compuesto 44 antes de los componentes CHOP. (C) Administración de los componentes CHOP antes de la administración del compuesto 44 y los componentes CHOP. Después de 4 días, se determinó la viabilidad celular.
La figura 2 tiene cuatro gráficos de la medición de la viabilidad de las células cancerosas in vitro después del tratamiento con el compuesto 44 y los componentes CHOP solo o en combinación. Las células WSU-DLCL2 se trataron como se muestra en la figura 1A. Las células se trataron primero con concentraciones variables del compuesto 44. Después de cuatro días, las células se trataron con la combinación de concentraciones variables del compuesto 44 y (A) mafofsamida (metabolito de la ciclofosfamida), (B) doxorrubicina, (C) vincristina o (D) prednisolona (metabolito de prednisona). Las células de control se trataron con DMSO. La viabilidad celular se normalizó al porcentaje de viabilidad celular en tratados con DMSO para cada concentración del compuesto 44.
La figura 3 tiene tres gráficos de la viabilidad de las células cancerosas después de diversos programas de tratamiento. Las células WSU-DCLC2 se trataron con concentraciones crecientes de prednisolona y el compuesto 44. Las células se trataron con el compuesto 44 y la prednisolona según el programa de tratamiento en (A) Figura 1A, (B) Figura 1B 0 (C) Figura 1C. La viabilidad celular se normalizó con la muestra tratada con DMSO/DMSO.
La figura 4 tiene tres gráficos de la medición de la viabilidad de las células cancerosas después del tratamiento con prednisolona y el compuesto 44 en líneas celulares con diferentes mutaciones EZH2. Las células se trataron como se representa en la figura 1A y con concentraciones crecientes de la prednisolona y el compuesto 44. La viabilidad celular se normalizó con la muestra tratada con DMSO/DMSO. (A) Las células WSU-DLCL2 expresan la mutación Y641F y son sensibles a los inhibidores de EZH2. (B) Las células RL expresan la mutación Y641N y son resistentes a los inhibidores de EZH2 y a la prednisolona. (C) Las células OCI-LY19 son de tipo salvaje en Y641 y muestran sensibilidad a la prednisolona, pero no muestran sensibilidad al compuesto 44 ni mayor sensibilidad a las combinaciones del compuesto 44 más prednisolona.
La figura 5 tiene cinco gráficos que muestran un panel de perfiles farmacocinéticos para la coadministración del compuesto 44 y de los componentes CHOP in vivo. A los ratones BALB/c se les administró una única administración oral del compuesto 44 y los componentes CHOP. La concentración del compuesto 44 (ng/mL) en el plasma se midió en diversos puntos de tiempo 0-24 horas después de la administración. La ciclofosfamida se administró mediante inyección intraperitoneal a 30 mg/kg. La vincristina se administró por inyección intravenosa a 0.375 mg/kg. La doxorrubicina se administró por inyección intravenosa a 2.475 mg/kg. La prednisolona se administró por vía oral a 0.15 mg/kg. El compuesto 44 se administró por vía oral a 225 mg/kg.
La figura 6 tiene dos gráficos que demuestran el efecto de la administración del compuesto 44 y CHOP en el modelo de xenoinjerto SUDHL6 sobre el crecimiento y la supervivencia del tumor. A ratones desnudos atímicos se les inyectó por vía subcutánea 1 * 107 células de linfoma humano SUDHL6. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aprox. 120 mm3 El compuesto 44 se administró durante 28 días a las dosificaciones indicadas tres veces al día (TID) o dos veces al día (BID). Se administró CHOP (ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisona) los días 1 y 8 a ratones que recibieron 225 mg/kg dos veces al día (225 mg/kg dos veces al día y CHOP). Los ratones de control no recibieron ningún compuesto 44 (vehículo) ni CHOP solamente (CHOP). El volumen del tumor se midió dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados cuando el volumen del tumor alcanzó los 2000 mm3 o 60 días después de la primera dosis. (A) Para el análisis del retraso del crecimiento del tumor, se calculó la mediana del volumen del tumor para cada grupo de tratamiento midiendo los tumores dos veces por semana durante 60 días o hasta que el tumor alcanzó los 2000 mm3. (B) La curva de Kaplan-meier representa la tasa de supervivencia de los ratones.
La figura 7 tiene tres gráficos que demuestran el efecto de la administración del compuesto 44 y CHOP en el modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2 sobre el crecimiento y la supervivencia del tumor. A los ratones SClD se les inyectó por vía subcutánea 1 * 107 células de linfoma humano WSU-DLCL2. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aprox. 120 mm3 El compuesto 44 se administró durante 28 días a las dosificaciones indicadas tres veces al día (TID), dos veces al día (BID) o una vez al día (QD). Se administró CHOP (ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisona) los días 1 y 22 a ratones que recibieron 225 mg/kg dos veces al día (225 mg/kg BID y CHOP). Los ratones de control no recibieron ningún compuesto 44 (vehículo) ni CHOP solamente (CHOP). El volumen del tumor se midió dos veces por semana. Los animales fueron sacrificados 28 días después de la primera dosis. (A) La eficacia del tratamiento se determinó midiendo la media del volumen del tumor durante el transcurso del tratamiento. (B) La concentración (ng/mL) del compuesto 44 se midió en plasma de ratones el día 28 antes de la administración (mínimo) y tres horas después de la administración (post). (C) La concentración (ng/g) del compuesto 44 se midió a partir de tejido tumoral de ratones el día 28 tres horas después de la administración.
La figura 8 es un análisis de transferencia Western y un gráfico que muestra el estado de metilación de histonas de muestras tumorales del modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2. Los tumores se recogieron 28 días después de la inyección y se extrajeron las histonas. (A) Se probó una transferencia Western con anticuerpos que reconocían específicamente la lisina 27 trimetilada de la histona H3 (H3K27me3) y las proteínas de la histona H3 total. (B) El estado de metilación de los tumores se determinó mediante ELISA. Se detectó la trimetilación de H3K27 y se normalizó a los niveles totales de histona H3.
La figura 9 tiene cuatro gráficos que demuestran el efecto de la administración del compuesto 44 y COP en un modelo de xenoinjerto SUDHL10 sobre el crecimiento y la supervivencia del tumor. A los ratones SCID se les inyectó por vía subcutánea 1 * 107 células de linfoma humano SUDHL10. Después de que los tumores alcanzaron un tamaño de aprox. 120 mm3 El compuesto 44 se administró durante 28 días a las dosificaciones indicadas dos veces al día (BID). Se administró COP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona) los días 1 y 22 a ratones que recibieron 250 mg/kg dos veces al día (250 mg/kg BID y COP). Los ratones de control no recibieron ningún compuesto 44 (vehículo) ni COP solamente (COP). El volumen del tumor se midió dos veces por semana. (A) La eficacia del tratamiento se determinó midiendo la media del volumen del tumor durante el transcurso del tratamiento. (B) El peso medio del tumor se determinó después de sacrificar a los ratones el día 28 después de la primera dosificación. (C) Para el análisis del retraso del crecimiento del tumor, se calculó la media del volumen del tumor y SEM para cada grupo de tratamiento midiendo los tumores dos veces por semana durante 60 días o hasta que el tumor alcanzó los 2000 mm3. (D) La curva de Kaplan-Meier representa la tasa de supervivencia de los ratones tratados.
La figura 10 tiene cuatro gráficos que muestran los perfiles farmacocinéticos y farmacodinámicos después de la administración de COP y el compuesto 44 en el modelo de xenoinjerto SUDHL10. Los ratones portadores de tumores se sacrificaron después de 28 días de tratamiento y se recogieron los tejidos. (A) La concentración (ng/mL) del compuesto 44 se midió en plasma de ratones el día 28 antes de la administración (mínima) y después de la administración (post) mediante LC-MS/MS. El estado de metilación de diversos tejidos de ratones portadores de tumores se determinó mediante ELISA: (B) tumor, (C) bazo y (D) médula ósea. Se detectó la trimetilación de H3K27 y se normalizó a los niveles totales de histona H3.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se basa en el descubrimiento de que los inhibidores de la histona metiltransferasa EZH2 y otros agentes anticancerígenos pueden usarse en combinación para tratar ciertos tumores con resultados superiores a los que se logran al tratar tumores con inhibidores de la histona metiltransferasa EZH2 y los agentes anticancerígenos solo. De acuerdo con lo anterior, en este documento se describe una composición que comprende un inhibidor de histona metiltransferasa EZH2 y otros agentes terapéuticos, y métodos para su uso para tratar enfermedades cuyo curso puede verse afectado por la modulación del estado de metilación de histonas u otras proteínas, por ejemplo, cáncer. En este documento se describen métodos para terapias combinadas que comprenden inhibidor de histona metiltransferasa EZH2 y uno o más agentes terapéuticos para tratar el cáncer, por ejemplo, linfoma folicular (FL) y linfoma de células B grandes de células difusas (DCLBL). Específicamente, los métodos descritos en este documento son útiles para tratar o prevenir el cáncer o inhibir la proliferación de células cancerosas.
EZH2 es una histona metiltransferasa que es la subunidad catalítica del complejo PRC2 que cataliza la monometilación a trimetilación de la lisina 27 en la histona H3 (H3-K27). La trimetilación de la histona H3-K27 es un mecanismo para suprimir la transcripción de genes específicos próximos al sitio de modificación de la histona. Se sabe que esta trimetilación es un marcador de cáncer con una expresión alterada en el cáncer, tal como el cáncer de próstata (véase, por ejemplo, la Publicación de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2003/0175736). Otros estudios proporcionaron evidencia de un vínculo funcional entre la expresión desregulada de EZH2, la represión transcripcional y la transformación neoplásica. Varambally et al. (2002) Nature 419(6907):624-9 Kleer et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100(20): 11606-11.
En este documento se describen métodos de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o afección precancerosa en un sujeto administrando a un sujeto que expresa una EZH2 mutante una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 y otros agentes terapéuticos. La EZH2 mutante se refiere a un polipéptido de EZH2 mutante o una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de EZH2 mutante. Por ejemplo, la EZH2 mutante comprende una o más mutaciones en su dominio de bolsillo de sustrato como se define en SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, la mutación puede ser una sustitución, una mutación puntual, una mutación sin sentido, una mutación sin sentido invertida, una deleción o una inserción.
Los ácidos nucleicos y polipéptidos humanos de EZH2 se han descrito previamente. Véase, por ejemplo, Chen et al. (1996) Genomics 38:30-7 [746 aminoácidos]; Número de Acceso de Swiss-Prot Q15910 [746 aminoácidos]; números de acceso de GenBank n M_004456 y NP_004447 (isoforma a [751 aminoácidos]); y números de acceso de GenBank NM_152998 y NP_694543 (isoforma b [707 aminoácidos]).
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A continuación se proporciona un modelo de estructura de la proteína EZH2 parcial en base a la cadena A de la proteína 1 del dominio SET de unión al receptor nuclear (NSD1). Este modelo corresponde a los residuos de aminoácidos 533-732 de la secuencia EZH2 de SEQ ID NO: 1.
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La secuencia de aminoácidos correspondiente de este modelo de estructura se proporciona a continuación. Los residuos en el dominio de bolsillo del sustrato están subrayados. Los residuos en el dominio SET se muestran en cursiva.
SCPCVIAQNFCEKFCQCSSECQNRFPGCRCKAQCNTKQCPCYLAVRECDPDLCLTCGA
ADH WDS KNVSC KNCSIQRGS K K H I.IJA PSDVA GWGÍFIKDP VQKNEFfSEY641 CGEIISQD
EADRRGKVYDKYM C5FLFNLNNDFI*74VDÁ677TRKGNK íR685FA687NHSVNPNCYAKVMMV
NGDHR[GIFAKRAIQTGEELFFDYRYSQAD (SEQ ID NO: 6)
Se cree que el sitio catalítico de EZH2 reside en un dominio conservado de la proteína conocido como dominio SET. La secuencia de aminoácidos del dominio SET de EZH2 se proporciona mediante la siguiente secuencia parcial que abarca los residuos de aminoácidos 613-726 del No. de acceso de Swiss-Prot Q15910 (SEQ ID NO: 1):
HLLLAPSDVAGWGIFIKDPVQKNEFISEYCGEIISQDEADRRGKVYDKYMCSFLFNLNNDFW
DATRKGNKIRFANHSVNPNCYAKVMMVNGDHRIGIFAKRAIQTGEELFFDY (SEQ ID NO: 7).
El residuo de tirosina (Y) que se muestra subrayado en SEQ ID NO: 7 es Tyr641 (Y641) en No. de acceso de Swiss-Prot Q15910 (SEQ ID NO: 1).
El dominio SET de No. de acceso de GenBank NP_004447 (SEQ ID NO: 3) abarca los residuos de aminoácidos 618­ 731 y es idéntico a SEQ ID NO: 6. El residuo de tirosina correspondiente a Y641 en No. de acceso de Swiss-Prot Q15910 se muestra subrayado en SEQ ID NO: 7 es Tyr646 (y 646) en el No. de acceso de GenBank NP_004447 (SEQ ID NO: 3).
El dominio SET de No. de acceso de GenBank NP_694543 (SEQ ID NO: 5) abarca los residuos de aminoácidos 574­ 687 y es idéntico a SEQ ID NO: 7. El residuo de tirosina correspondiente a Y641 en No. de acceso de Swiss-Prot Q15910 se muestra subrayado en SEQ ID NO: 7 es Tyr602 (y 602) en el No. de acceso de GenBank NP_694543 (SEQ ID NO: 5).
La secuencia de nucleótidos que codifica el dominio SET del No. de acceso de GenBank NP_004447 es
c a t c t a t t g c t g g c a c c a t c t g a c g t g g c a g g c t g g g g g a t t t t t a t c a a a g a t c c t g t g c a g
a a a a a t g a a t t c a t c t c a g a a t a c t g t g g a g a g a t t a t t t c t c a a g a t g a a g c t g a c a g a a g a
g g g a a a g t g t a t g a t a a a t a c a t g t g c a g c t t t c t g t t c a a c t t g a a c a a t g a t t t t g t g g t g
g a t g c a a c c c g c a a g g g t a a c a a a a t t c g t t t t g c a a a t c a t t c g g t a a a t c c a a a c t g c t a t
g c a a a a g t t a t g a t g g t t a a c g g t g a t c a c a g g a t a g g t a t t t t t g c c a a g a g a g c c a t c c a g
a c t g g c g a a g a g c t g t t t t t t g a t t a c
(SEQ ID NO: 8),
donde el codón que codifica Y641 se muestra subrayado.
Para los fines de esta solicitud, el residuo de aminoácido Y641 de EZH2 humana debe entenderse como el residuo de tirosina que es o corresponde a Y641 en No. de acceso de Swiss-Prot Q15910.
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También para los fines de esta solicitud, un mutante Y641 de EZH2 humana y, de manera equivalente, un mutante Y641 de EZH2, debe entenderse que se refiere a una EZH2 humana en la que el residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje es sustituido por un residuo de aminoácido que no sea tirosina.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de un único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje por un residuo de aminoácido distinto de tirosina.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de fenilalanina (F) por el único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641F o, de manera equivalente, Y641F.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de histidina (H) por el único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641H o, de manera equivalente, Y641H.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de asparagina (N) por el único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641N o, de manera equivalente, Y641N.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de serina (S) por el único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641S o, de manera equivalente, Y641S.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante Y641 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de cisteína (C) por el único residuo de aminoácido correspondiente a Y641 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante Y641 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante Y641C o, de manera equivalente, Y641C.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante A677 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de un aminoácido que no es alanina, preferiblemente glicina (G), por el único residuo de aminoácido correspondiente a A677 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante A677 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante A677, y preferiblemente un mutante A677G o, de manera equivalente, A677G.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante A687 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución de un aminoácido que no es alanina, preferiblemente valina (V), por el único residuo de aminoácido correspondiente a A687 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante A687 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante A687 y preferiblemente mutante A687V o, de manera equivalente, A687V.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante R685 de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje solamente por la sustitución del aminoácido único por un aminoácido que no es arginina, preferiblemente histidina (H) o cisteína (C), por el único residuo de aminoácido correspondiente a R685 de EZH2 humana de tipo salvaje. El mutante R685 de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante R685 y preferiblemente mutante R685C o mutante R685H o, de manera equivalente, R685H o R685C.
En una realización, la secuencia de aminoácidos de un mutante de EZH2 difiere de la secuencia de aminoácidos de EZH2 humana de tipo salvaje en uno o más residuos de aminoácidos en su dominio de bolsillo de sustrato como se define en SEQ ID NO: 6. El mutante de EZH2 según esta realización se denomina en este documento mutante de EZH2.
Otro ejemplo de mutación de aminoácido por sustitución incluye una sustitución en la posición de aminoácido 677, 687, 674, 685 o 641 de SEQ ID NO: 1, tal como, pero no se limita a, una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 677 de SEQ ID NO: 1 (A677G); una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 687 de SEQ ID NO: 1 (A687V); una sustitución de metionina (M) por el residuo de tipo salvaje valina (V) en la posición de aminoácido 674 de SEQ ID NO: 1 (V674M); una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 685 de SEQ ID NO: 1 (R685H); una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 685 de SEQ ID NO: 1 (R685C); una sustitución de fenilalanina (F) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641F); una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641H); una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641N); una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641S); o una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 641 de SEQ ID NO: 1 (Y641C).
La mutación de la presente invención también puede incluir una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 322 de SEQ ID NO: 3 (N322S), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 288 de SEQ ID NO: 3 (R288Q), una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de tipo salvaje treonina (T) en la posición de aminoácido 573 de SEQ ID NO: 3 (T573I), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664E), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 458 de SEQ ID NO: 5 (R458Q), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 249 de SEQ ID NO: 3 (E249K), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 684 de SEQ ID NO: 3 (R684C), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 628 de SEQ ID NO: 21 (R628H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 501 de SEQ ID NO: 5 (Q501H), una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 192 de SEQ ID NO: 3 (D192N), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664V), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje valina (V) en la posición de aminoácido 704 de SEQ ID NO: 3 (V704L), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje prolina (P) en la posición de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 3 (P132S), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 669 de SEQ ID NO: 21 (E669K), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 255 de SEQ ID NO: 3 (A255T), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 726 de SEQ ID NO: 3 (E726V), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 571 de SEQ ID NO: 3 (C571Y), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 145 de SEQ ID NO: 3 (F145C), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693T), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 145 de SEQ ID NO: 3 (F145S), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 21 (Q109H), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 622 de SEQ ID NO: 21 (F622C), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 135 de SEQ ID NO: 3 (G135R), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 168 de SEQ ID NO: 5 (R168Q), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 159 de SEQ ID NO: 3 (G159R), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 310 de SEQ ID NO: 5 (R310C), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 561 de SEQ ID NO: 3 (R561H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 634 de SEQ ID NO: 21 (R634H), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 660 de SEQ ID NO: 3 (G660R), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 181 de SEQ ID NO: 3 (Y181C), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje histidina (H) en la posición de aminoácido 297 de SEQ ID NO: 3 (H297R), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 612 de SEQ ID NO: 21 (C612S), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje histidina (H) en la posición de aminoácido 694 de SEQ ID NO: 3 (H694Y), una sustitución de alanina (A) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664A), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 150 de SEQ ID NO: 3 (I150T), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 264 de SEQ ID NO: 3 (I264R), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje prolina (P) en la posición de aminoácido 636 de SEQ ID NO: 3 (P636L), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 713 de SEQ ID NO: 3 (I713T), una sustitución de prolina (P) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 501 de SEQ ID NO: 5 (Q501P), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 243 de SEQ ID NO: 3 (K243Q), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 130 de SEQ ID NO: 5 (E130D), una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 509 de SEQ ID NO: 3 (R509G), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 566 de SEQ ID NO: 3 (R566H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 677 de SEQ ID NO: 3 (D677H), una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 466 de SEQ ID NO: 5 (K466N), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 78 de SEQ ID NO: 3 (R78H), una sustitución de metionina (M) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 6 (K6M), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje serina (S) en la posición de aminoácido 538 de SEQ ID NO: 3 (S538L), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 149 de SEQ ID NO: 3 (L149Q), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 252 de SEQ ID NO: 3 (L252V), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 674 de SEQ ID NO: 3 (L674V), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 656 de SEQ ID NO: 3 (A656V), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 731 de SEQ ID NO: 3 (Y731D), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 345 de SEQ ID NO: 3 (A345T), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 244 de SEQ ID NO: 3 (Y244D), una sustitución de triptófano (W) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 576 de SEQ ID NO: 3 (C576W), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 640 de SEQ ID NO: 3 (N640K), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 675 de SEQ ID NO: 3 (N675K), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 579 de SEQ ID NO: 21 (D579Y), una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693I), y una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de Se Q ID NO: 3 (N693K).
La mutación de la presente invención puede ser un marco de lectura en la posición de aminoácido 730, 391,461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730 o 363 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21 o la posición de nucleótido correspondiente de la secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 3, 5 o 21. La mutación de EZH2 también puede ser una inserción de un ácido glutámico (E) entre las posiciones de aminoácidos 148 y 149 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21. Otro ejemplo de mutación EZH2 es una eliminación de ácido glutámico (E) y leucina (L) en las posiciones de aminoácidos 148 y 149 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21. La EZH2 mutante puede comprender además una mutación sin sentido en la posición de aminoácido 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137 o 60 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21.
Se esperaría que las células heterocigotas para EZH2 mostraran un fenotipo maligno debido a la formación eficiente de H3-K27me1 por la enzima WT y la subsiguiente transición eficiente de esta especie progenitora a H3-K27me2 y, especialmente, H3-K27me3, por la(s) forma(s) de enzima mutante.
Los resultados anteriores apuntan a la dependencia del acoplamiento enzimático entre las enzimas que realizan la monometilación de H3-K27 y determinadas formas mutantes de EZH2 para la patogenia del linfoma folicular y el linfoma difuso de células B grandes. Por ejemplo, las células que expresan EZH2 mutante, Y641 pueden ser más sensibles a los inhibidores de EZH2 de molécula pequeña que las células que expresan EZH2 WT. Específicamente, las células que expresan EZH2 mutante, Y641 muestran crecimiento, división o proliferación reducidos, o incluso experimentan apoptosis o necrosis después del tratamiento con inhibidores de EZH2. Por el contrario, las células que expresan EZH2 W t no responden al efecto antiproliferativo de los inhibidores de EZH2 (Solicitud de la Patente de los Estados Unidos No.61/381,684)
En este documento se describe un método de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o afección precancerosa en un sujeto mediante la administración a un sujeto que expresa una EZH2 mutante que comprende una mutación en el dominio de bolsillo del sustrato como se define en SEQ ID NO: 6 una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 de fórmula (44) en combinación con otros agentes apropiados para administrarse juntos de forma simultánea, secuencial o alternada.
En este documento se describe un método de inhibición en un sujeto de la conversión de H3-K27 en H3-K27 trimetilado. La inhibición puede implicar inhibir en un sujeto la conversión de H3-K27 no metilado a H3-K27 monometilado, la conversión de H3-K27 monometilado a H3-K27 dimetilado, la conversión de H3-K27 dimetilado a H3-K27 trimetilado, o cualquier combinación de los mismos, incluyendo, por ejemplo, conversión de H3-K27 monometilado en H3-K27 dimetilado y conversión de H3-K27 dimetilado en H3-K27 trimetilado. Como se usa en este documento, H3-K27 no metilado se refiere a la histona H3 sin un grupo metilo unido covalentemente al grupo amino de la lisina 27. Como se usa en este documento, H3-K27 monometilado se refiere a la histona H3 con un único grupo metilo unido covalentemente al grupo amino de la lisina 27. El H3-K27 monometilado también se denomina en este documento H3-K27me1. Como se usa en este documento, H3-K27 dimetilado se refiere a la histona H3 con dos grupos metilo unidos covalentemente al grupo amino de la lisina 27. El H3-K27 dimetilado también se denomina en este documento H3-K27me2. Como se usa en este documento, trimetilado H3-K27 se refiere a la histona H3 con tres grupos metilo unidos covalentemente al grupo amino de la lisina 27. El H3-K27 trimetilado también se denomina en este documento H3-K27me3.
La histona H3 es una proteína de 136 aminoácidos de longitud, cuya secuencia es conocida. Véase, por ejemplo, el No. de acceso de GenBank CAB02546. Como se revela más adelante en este documento, además de la histona H3 de longitud completa, los fragmentos peptídicos de la histona H3 que comprenden el residuo de lisina correspondiente a K27 de la histona H3 de longitud completa se pueden usar como sustrato para EZH2 (y también para las formas mutantes de EZH2) para evaluar la conversión de H3-K27m1 a H3-K27m2 y la conversión de H3-K27m2 a H3-K27m3. En una realización, tal fragmento peptídico corresponde a los residuos de aminoácidos 21-44 de la histona H3. Tal fragmento de péptido tiene la secuencia de aminoácidos LATKAARKSAPATGGVKKPHRYRP (SEQ ID NO: 19).
Una composición de la presente invención comprende un compuesto de fórmula 44 y otros agentes terapéuticos, o una de sus sales farmacéuticamente aceptable. El compuesto de fórmula 44 es apropiado para la administración como parte de una terapia de combinación con uno o más agentes terapéuticos o modalidad de tratamiento, apropiados para administrarse juntos, de forma secuencial o alternada.
En este documento se describe el compuesto 44
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una realización, el compuesto de la invención es el propio compuesto, es decir, la base libre o molécula "desnuda". En otra realización, el compuesto es una sal del mismo, por ejemplo, una sal mono-HCl o tri-HCl, una sal mono-HBr o tri-HBr de la molécula desnuda.
El compuesto 44 se representa en la siguiente tabla. En la siguiente tabla, cada ocurrencia de
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debe interpretarse como
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Tabla 1
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En la presente memoria descriptiva, la fórmula estructural del compuesto representa un cierto isómero por conveniencia en algunos casos, pero la presente invención incluye todos los isómeros, tales como isómeros geométricos, isómeros ópticos en base a un carbono asimétrico, estereoisómeros, tautómeros y similares. Además, puede estar presente un polimorfismo cristalino para los compuestos representados por la fórmula. Se observa que cualquier forma cristalina, mezcla de formas cristalinas o anhídrido o hidrato de los mismos está incluida en el alcance de la presente invención.
“ Isomería” significa compuestos que tienen fórmulas moleculares idénticas pero difieren en la secuencia de enlace de sus átomos o en la disposición de sus átomos en el espacio. Los isómeros que difieren en la disposición de sus átomos en el espacio se denominan "estereoisómeros". Los estereoisómeros que no son imágenes especulares entre sí se denominan "diastereoisómeros", y los estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí se denominan "enantiómeros" o, a veces, isómeros ópticos. Una mezcla que contiene cantidades iguales de formas enantioméricas individuales de quiralidad opuesta se denomina "mezcla racémica".
Un átomo de carbono unido a cuatro sustituyentes no idénticos se denomina "centro quiral".
"Isómero quiral" significa un compuesto con al menos un centro quiral. Los compuestos con más de un centro quiral pueden existir como un diastereoisómero individual o como una mezcla de diastereoisómeros, denominada "mezcla de diastereoisómeros". Cuando está presente un centro quiral, un estereoisómero puede caracterizarse por la configuración absoluta (R o S) de ese centro quiral. La configuración absoluta se refiere a la disposición en el espacio de los sustituyentes unidos al centro quiral. Los sustituyentes unidos al centro quiral en consideración se clasifican de acuerdo con the Sequence Rule of Cahn, Ingold and Prelog. (Cahn et al., Angew. Chem. Inter. Edit. 1966, 5, 385; errata 511; Cahn et al., Angew. Chem. 1966, 78, 413; Cahn and Ingold, J. Chem. Soc. 1951 (London), 612; Cahn et al., Experientia 1956, 12, 81; Cahn, J. Chem. Educ. 1964, 41, 116).
"Isómero geométrico" significa los diastereómeros que deben su existencia a la rotación impedida alrededor de los dobles enlaces o un enlazante cicloalquilo (por ejemplo, 1,3-ciclobutilo). Estas configuraciones se diferencian en sus nombres por los prefijos cis y trans, o Z y E, que indican que los grupos están en el mismo lado o en el lado opuesto del doble enlace en la molécula según las reglas de Cahn-Ingold-Prelog.
Debe entenderse que los compuestos descritos en este documento pueden representarse como diferentes isómeros quirales o isómeros geométricos. También debe entenderse que cuando los compuestos tienen formas isómeras quirales o isómeras geométricas, se pretende que todas las formas isómeras estén incluidas en el alcance de la presente divulgación, y la denominación de los compuestos no excluye ninguna forma isómera.
Adicionalmente, las estructuras y otros compuestos discutidos en esta divulgación incluyen todos sus isómeros atrópicos. Los "isómeros atrópicos" son un tipo de estereoisómero en el que los átomos de dos isómeros están dispuestos de manera diferente en el espacio. Los isómeros atrópicos deben su existencia a una rotación restringida provocada por el impedimento de la rotación de grandes grupos alrededor de un enlace central. Tales isómeros atrópicos existen por lo general como una mezcla; sin embargo, como resultado de los avances recientes en las técnicas de cromatografía, ha sido posible separar mezclas de dos isómeros atrópicos en casos seleccionados.
"Tautomero" es uno de dos o más isómeros estructurales que existen en equilibrio y se convierte fácilmente de una forma isomérica a otra. Esta conversión da como resultado la migración formal de un átomo de hidrógeno acompañada de un cambio de dobles enlaces conjugados adyacentes. Los tautómeros existen como una mezcla de un conjunto tautomérico en solución. En soluciones donde es posible la tautomerización, se alcanzará un equilibrio químico de los tautómeros. La proporción exacta de los tautómeros depende de varios factores, incluidos la temperatura, el disolvente y el pH. El concepto de tautómeros que son interconvertibles por tautomerizaciones se llama tautomerismo.
De los diversos tipos de tautomerismo que son posibles, se observan comúnmente dos. En el tautomerismo de cetoenol se produce un desplazamiento simultáneo de electrones y un átomo de hidrógeno. El tautomerismo de la cadena en anillo surge como resultado del grupo aldehído (-CHO) en una molécula de cadena de azúcar que reacciona con uno de los grupos hidroxi (-OH) en la misma molécula para darle una forma cíclica (en forma de anillo) como la que exhibe la glucosa.
Los pares tautoméricos comunes son: cetona-enol, amida-nitrilo, lactama-lactima, tautomerismo del ácido amidaimídico en anillos heterocíclicos (por ejemplo, en bases nitrogenadas tales como guanina, timina y citosina), imina-enamina y enamina-enamina. Un ejemplo de equilibrio de ceto-enol es entre piridin-2(1H)-onas y los correspondientes piridin-2-oles, como se muestra a continuación.
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Debe entenderse que los compuestos descritos en este documento pueden representarse como diferentes tautómeros. También debe entenderse que cuando los compuestos tienen formas tautoméricas, todas las formas tautoméricas están destinadas a estar incluidas en el alcance de la presente divulgación, y la denominación de los compuestos no excluye ninguna forma tautómera.
El término "cristales polimorfos", "polimorfos" o "formas cristalinas" significa estructuras cristalinas en las que un compuesto (o una de sus sales o solvatos) puede cristalizar en diferentes arreglos de empaquetamiento de cristales, todos los cuales tienen la misma composición elemental. Las diferentes formas de cristal suelen tener diferentes patrones de difracción de rayos X, espectro infrarrojo, puntos de fusión, dureza de densidad, forma de cristal, propiedades ópticas y eléctricas, estabilidad y solubilidad. El solvente de recristalización, la tasa de cristalización, la temperatura de almacenamiento y otros factores pueden hacer que domine una forma de cristal. Los polimorfos cristalinos de los compuestos se pueden preparar por cristalización en diferentes condiciones.
El compuesto de fórmula 44 revelado en este documento incluye el propio compuesto, así como sus sales, sus ésteres y sus solvatos, si corresponde. Se puede formar una sal, por ejemplo, entre un anión y un grupo cargado positivamente (por ejemplo, amino) en un compuesto de benceno sustituido con arilo o heteroarilo. Los aniones apropiados incluyen cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, bisulfato, sulfamato, nitrato, fosfato, citrato, metanosulfonato, trifluoroacetato, glutamato, glucuronato, glutarato, malato, maleato, succinato, fumarato, tartrato, tosilato, salicilato, lactato, naftalenosulfonato y acetato (por ejemplo, trifluoroacetato). El término "anión farmacéuticamente aceptable" se refiere a un anión apropiado para formar una sal farmacéuticamente aceptable. Del mismo modo, también se puede formar una sal entre un catión y un grupo cargado negativamente (por ejemplo, carboxilato) en un compuesto de benceno sustituido con arilo o heteroarilo. Los cationes apropiados incluyen iones de sodio, iones de potasio, iones de magnesio, iones de calcio y un catión de amonio tal como iones de tetrametilamonio. Los compuestos de benceno sustituidos con arilo o heteroarilo también incluyen aquellas sales que contienen átomos de nitrógeno cuaternario. En forma de sal, se entiende que la proporción del compuesto al catión o anión de la sal puede ser 1:1, o cualquier proporción distinta de 1:1, por ejemplo, 3:1, 2:1, 1:2, o 1:3.
Adicionalmente, los compuestos descritos en este documento, por ejemplo, las sales de los compuestos, pueden existir en forma ya sea hidratada o sin hidratar (la anhidra) o como solvatos con otras moléculas de disolvente. Los ejemplos no limitantes de hidratos incluyen monohidratos, dihidratos, etc. Los ejemplos no limitantes de solvatos incluyen solvatos de etanol, solvatos de acetona, etc.
“Solvato” significa formas de adición de disolvente que contienen cantidades ya sea estequiométricas o no estequiométricas de disolvente. Algunos compuestos tienen tendencia a atrapar una proporción molar fija de moléculas de disolvente en estado sólido cristalino, formando de este modo un solvato. Si el disolvente es agua, el solvato formado es un hidrato; y si el disolvente es alcohol, el solvato formado es un alcoholato. Los hidratos se forman por la combinación de una o más moléculas de agua con una molécula de la sustancia en la que el agua conserva su estado molecular como H2o. Como se usa en este documento, el término "análogo" se refiere a un compuesto químico que es estructuralmente similar a otro pero difiere ligeramente en composición (como en el reemplazo de un átomo por un átomo de un elemento diferente o en presencia de un grupo funcional particular, o la sustitución de un grupo funcional por otro grupo funcional). De este modo, un análogo es un compuesto que es similar o comparable en función y apariencia, pero no en estructura u origen al compuesto de referencia.
Como se define en este documento, el término "derivado" se refiere a compuestos que tienen una estructura de núcleo común y están sustituidos con diversos grupos como se describe en este documento. Por ejemplo, todos los compuestos representados por la fórmula (I) son compuestos de benceno sustituidos con arilo o heteroarilo y tienen la fórmula (I) como núcleo común.
El término "bioisóstero" se refiere a un compuesto resultante del intercambio de un átomo o de un grupo de átomos con otro átomo o grupo de átomos, ampliamente similar. El objetivo de un reemplazo bioisotérico es crear un nuevo compuesto con propiedades biológicas similares al compuesto original. El reemplazo bioisotérico puede tener una base fisicoquímica o topológica. Los ejemplos de bioisósteros de ácido carboxílico incluyen, pero no se limitan a, acilo sulfonimidas, tetrazoles, sulfonatos y fosfonatos. Véase, por ejemplo, Patani and LaVoie, Chem. Rev. 96, 3147-3176, 1996.
La presente divulgación pretende incluir todos los isótopos de átomos que se encuentran en los presentes compuestos. Los isótopos incluyen aquellos átomos que tienen el mismo número atómico pero diferente número de masa. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen tritio y deuterio, y los isótopos de carbono incluyen C-13 y C-14.
Un inhibidor de EZH2 "inhibe selectivamente" la actividad de la histona metiltransferasa de la EZH2 mutante cuando inhibe la actividad de la histona metiltransferasa de la EZH2 mutante de forma más eficaz que cuando inhibe la actividad de la histona metiltransferasa del EZH2 natural. Por ejemplo, en una realización, el inhibidor selectivo tiene una IC50 para la EZH2 mutante que es al menos un 40 por ciento más baja que la IC50 para la EZH2 de tipo salvaje. En una realización, el inhibidor selectivo tiene una IC50 para la EZH2 mutante que es al menos un 50 por ciento más baja que la IC50 para la EZH2 de tipo salvaje. En una realización, el inhibidor selectivo tiene una IC50 para la EZH2 mutante que es al menos un 60 por ciento más baja que la IC50 para la EZH2 de tipo salvaje. En una realización, el inhibidor selectivo tiene una IC50 para la EZH2 mutante que es al menos un 70 por ciento más baja que la IC50 para la EZH2 de tipo salvaje. En una realización, el inhibidor selectivo tiene una IC50 para la EZH2 mutante que es al menos un 80 por ciento más baja que la IC50 para la EZH2 de tipo salvaje. En una realización, el inhibidor selectivo tiene una IC50 para la EZH2 mutante que es al menos un 90 por ciento más baja que la IC50 para la EZH2 de tipo salvaje.
En una realización, el inhibidor selectivo de una EZH2 mutante ejerce esencialmente ningún efecto inhibidor sobre la EZH2 de tipo salvaje.
En ciertos aspectos de la invención, el inhibidor inhibe la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3. En una realización, se dice que el inhibidor inhibe la trimetilación de H3-K27. Dado que la conversión de H3-K27me1 a H3-K27me2 precede a la conversión de H3-K27me2 a H3-K27me3, un inhibidor de la conversión de H3-K27me1 a H3-K27me2 naturalmente también inhibe la conversión de H3-K27me2 a H3-K27me3, es decir, inhibe la trimetilación de H3-K27. También es posible inhibir la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3 sin inhibir la conversión de H3-K27me1 en H3-K27me2. La inhibición de este tipo también daría como resultado la inhibición de la trimetilación de H3-K27, aunque sin inhibición de la dimetilación de H3-K27.
En una realización, el inhibidor inhibe la conversión de H3-K27me1 en H3-K27me2 y la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3. Tal inhibidor puede inhibir directamente la conversión de H3-K27me1 en H3-K27me2 solo. Alternativamente, tal inhibidor puede inhibir directamente tanto la conversión de H3-K27me1 a H3-K27me2 como la conversión de H3-K27me2 a H3-K27me3.
En ciertos aspectos de la invención, el compuesto inhibidor inhibe la actividad de histona metiltransferasa. La inhibición de la actividad de la histona metiltransferasa se puede detectar usando cualquier método apropiado. La inhibición se puede medir, por ejemplo, en términos de tasa de actividad de histona metiltransferasa o como producto de la actividad de histona metiltransferasa.
La inhibición es una inhibición medible en comparación con un control apropiado. En una realización, la inhibición es al menos un 10 por ciento de inhibición en comparación con un control apropiado. Es decir, la tasa de actividad enzimática o la cantidad de producto con el inhibidor es menor que o igual a 90 por ciento de la tasa o cantidad correspondiente hecha sin el inhibidor. En diversas otras realizaciones, la inhibición es al menos 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 90 o 95 por ciento de inhibición en comparación con un control apropiado. En una realización, la inhibición es al menos un 99 por ciento de inhibición en comparación con un control apropiado. Es decir, la tasa de actividad enzimática o la cantidad de producto con el inhibidor es menor o igual al 1 por ciento de la tasa o cantidad correspondiente preparada sin el inhibidor.
Una composición de la presente invención comprende un compuesto de fórmula 44, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y otros agentes terapéuticos, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención proporciona la administración de un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y otros agentes terapéuticos o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como una coformulación o formulaciones separadas, en la que la administración de formulaciones es de forma simultánea, secuencial o alternada. Los otros agentes terapéuticos son ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona; ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisolona; rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona; o rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisolona. Los otros agentes terapéuticos pueden ser un agente que imparta un atributo beneficioso a la composición (por ejemplo, un agente que afecte a la viscosidad de la composición). El atributo beneficioso de la composición incluye, pero no se limita a, la acción conjunta farmacocinética o farmacodinámica resultante de la combinación de un compuesto de fórmula 44 y los otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, el uno o más de los otros agentes terapéuticos pueden ser agentes anticancerígenos o agentes quimioterapéuticos. Por ejemplo, el uno o más de los otros agentes terapéuticos pueden ser glucocorticoides.
Los otros agentes terapéuticos son combinaciones de quimioterapia estándar CHOP (ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona o prednisolona) o R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina, prednisona o prednisolona).
En este documento se describen métodos para terapia de combinación en los que una composición que comprende un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y los otros agentes terapéuticos se administran a un sujeto que necesita el tratamiento de una enfermedad o cáncer. La terapia de combinación también puede administrarse a células cancerosas para inhibir la proliferación o inducir la muerte celular. Un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo puede administrarse antes de la administración de la composición de la presente invención que comprende un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y los otros agentes terapéuticos. Por ejemplo, un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra antes de la administración de los otros agentes terapéuticos, de manera que los otros agentes terapéuticos se administran ya sea en una sola composición o en dos o más composiciones, por ejemplo, administrada de forma simultánea, secuencial o alternada.
En una realización, una composición de la presente invención incluye un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y CHOP (ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona o prednisolona) o R-CHOP (rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina, prednisona o prednisolona). Los métodos descritos en este documento incluyen la terapia de combinación de administrar un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo y agentes anticancerosos, en los que los agentes anticancerosos son CHOP o R-CHOP.
Como se describe en este documento, la "terapia de combinación" pretende abarcar la administración de estos agentes terapéuticos de forma secuencial, en la que cada agente terapéutico se administra en un momento diferente, así como la administración de estos agentes terapéuticos, o al menos dos de los agentes terapéuticos al mismo tiempo, o de manera sustancialmente simultánea. La administración simultánea puede lograrse, por ejemplo, administrando al sujeto una única cápsula que tenga una proporción fija de cada agente terapéutico o múltiples cápsulas únicas para cada uno de los agentes terapéuticos. La administración secuencial o sustancialmente simultánea de cada agente terapéutico puede efectuarse por cualquier vía apropiada que incluye, pero no se limita a, vías orales, vías intravenosas, vías intramusculares y absorción directa a través de tejidos de membranas mucosas. Los agentes terapéuticos pueden administrarse por la misma vía o por vías diferentes. Por ejemplo, un primer agente terapéutico de la combinación seleccionada puede administrarse por inyección intravenosa mientras que los otros agentes terapéuticos de la combinación pueden administrarse por vía oral. Alternativamente, por ejemplo, todos los agentes terapéuticos pueden administrarse por vía oral o todos los agentes terapéuticos pueden administrarse mediante inyección intravenosa. Los agentes terapéuticos también pueden administrarse alternativamente.
Las terapias de combinación descritas en este documento pueden dar como resultado un efecto sinérgico en el tratamiento de una enfermedad o cáncer. Se define un "efecto sinérgico" cuando la eficacia de una combinación de agentes terapéuticos es mayor que la suma de los efectos de cualquiera de los agentes administrados solos. Un efecto sinérgico también puede ser un efecto que no puede lograrse mediante la administración de cualquiera de los compuestos u otros agentes terapéuticos como agentes únicos. El efecto sinérgico puede incluir, pero no se limita a, un efecto de tratar el cáncer reduciendo el tamaño del tumor, inhibiendo el crecimiento del tumor o aumentando la supervivencia del sujeto. El efecto sinérgico también puede incluir la reducción de la viabilidad de las células cancerosas, la inducción de la muerte de las células cancerosas y la inhibición o el retraso del crecimiento de las células cancerosas.
Como se describe en este documento, "terapia de combinación" también abarca la administración de los agentes terapéuticos como se describe anteriormente en combinación adicional con otros ingredientes biológicamente activos y terapias no farmacológicas (por ejemplo, cirugía o tratamiento con radiación). Cuando la terapia de combinación comprende además un tratamiento no farmacológico, el tratamiento no farmacológico se puede realizar en cualquier momento apropiado siempre que se logre un efecto beneficioso de la acción conjunta de la combinación de los agentes terapéuticos y el tratamiento no farmacológico. Por ejemplo, en casos apropiados, el efecto beneficioso aún se logra cuando el tratamiento no farmacológico se elimina temporalmente de la administración de los agentes terapéuticos, quizás por días o incluso semanas.
Una composición descrita en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede administrarse en combinación con radioterapia. La radioterapia también se puede administrar en combinación con una composición de la presente invención y otro agente quimioterapéutico descrito en este documento como parte de una terapia con múltiples agentes.
En este documento se describen composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula 44 o las sales farmacéuticamente aceptables del mismo, y los otros agentes terapéuticos revelados en este documento, mezclados con portadores o excipientes farmacéuticamente apropiados en dosis para tratar o prevenir una enfermedad o afección como se describe en este documento. En este documento se describen composiciones farmacéuticas que comprenden el compuesto 44
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o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, y uno o más agentes terapéuticos, mezclados con portadores excipientes farmacéuticamente apropiados en dosis para tratar o prevenir una enfermedad o afección como se describe en este documento. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también se pueden administrar en combinación con otros agentes terapéuticos o modalidades terapéuticas de forma simultánea, secuencial o alternada.
Las mezclas de las composiciones descritas en este documento también se pueden administrar al paciente como una mezcla simple o en composiciones farmacéuticas formuladas apropiadas. En este documento se describen composiciones farmacéuticas que comprenden una dosis terapéuticamente eficaz de un inhibidor de EZH2 de fórmula 44, o una de sus sales, hidratos, enantiómeros o estereoisómeros farmacéuticamente aceptables; uno o más de otros agentes terapéuticos y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
Una "composición farmacéutica" es una formulación que contiene los compuestos descritos en este documento en una forma apropiada para la administración a un sujeto. Por ejemplo, la composición farmacéutica está a granel o en forma de dosificación unitaria. La forma de dosificación unitaria es cualquiera de una variedad de formas, incluyendo, por ejemplo, una cápsula, una bolsa IV, un comprimido, una única bomba en un inhalador de aerosol o un vial. La cantidad de ingrediente activo (por ejemplo, una formulación del compuesto revelado o sal, hidrato, solvato o isómero del mismo) en una dosis unitaria de composición es una cantidad eficaz y varía según el tratamiento particular implicado. Un experto en la técnica apreciará que a veces es necesario realizar variaciones de rutina en la dosificación dependiendo de la edad y el estado del paciente. La dosificación también dependerá de la vía de administración. Se contempla una variedad de vías, que incluyen oral, pulmonar, rectal, parenteral, transdérmica, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, por inhalación, bucal, sublingual, intrapleural, intratecal, intranasal y similares. Las formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de un compuesto descrito en este documento incluyen polvos, aerosoles, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. En una realización, el compuesto activo se mezcla en condiciones estériles con un portador farmacéuticamente aceptable y con cualquier conservante, solución reguladora o propulsor que se requiera.
Como se usa en este documento, la frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellos compuestos, aniones, cationes, materiales, composiciones, portadores y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del buen juicio médico, son apropiados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad excesiva, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una proporción beneficio/riesgo razonable.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" significa un excipiente que es útil en la preparación de una composición farmacéutica que es generalmente segura, no tóxica y no indeseable biológicamente ni de otro modo, e incluye excipientes que son aceptables para su uso veterinario así como para su uso farmacéutico humano. Un "excipiente farmacéuticamente aceptable" como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones incluye tanto uno como más de uno de tales excipientes.
Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), administración transdérmica (tópica) y transmucosal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; soluciones reguladoras tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro sódico o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.
Una composición de la invención se puede administrar a un sujeto en muchos de los métodos bien conocidos que se usan actualmente para el tratamiento quimioterapéutico. Por ejemplo, para el tratamiento de cánceres, un compuesto descrito en este documento puede inyectarse directamente en los tumores, inyectarse en el torrente sanguíneo o en las cavidades corporales o tomarse por vía oral o aplicarse a través de la piel con parches. La dosis elegida debe ser suficiente para constituir un tratamiento eficaz pero no tan alta como para causar efectos secundarios inaceptables. El estado de la condición de la enfermedad (por ejemplo, cáncer, precáncer y similares) y la salud del paciente debe ser preferiblemente monitoreada de cerca durante y por un período razonable después del tratamiento.
El término "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en este documento, se refiere a una cantidad de un agente farmacéutico para tratar, mejorar o prevenir una enfermedad o afección identificada, o para exhibir un efecto inhibidor o terapéutico detectable. El efecto puede detectarse mediante cualquier método de ensayo conocido en la técnica. La cantidad eficaz precisa para un sujeto dependerá del peso corporal, el tamaño y la salud del sujeto; la naturaleza y extensión de la afección; y la terapia o combinación de terapias seleccionadas para la administración. Las cantidades terapéuticamente eficaces para una situación dada pueden determinarse mediante experimentación de rutina que esté dentro de la habilidad y el juicio del médico. En un aspecto preferido, la enfermedad o afección que se va a tratar es el cáncer. En otro aspecto, la enfermedad o afección que se va a tratar es un trastorno de proliferación celular.
En determinadas realizaciones, la cantidad terapéuticamente eficaz de cada agente farmacéutico usado en combinación será menor cuando se use en combinación en comparación con la monoterapia con cada agente solo. Tal cantidad terapéuticamente eficaz más baja podría proporcionar una toxicidad más baja del régimen terapéutico.
Para cualquier compuesto, la cantidad terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente ya sea en ensayos de cultivo celular, por ejemplo, de células neoplásicas, o en modelos animales, normalmente ratas, ratones, conejos, perros o cerdos. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración y la vía de administración apropiados. A continuación, tal información se puede usar para determinar dosis y vías útiles para la administración en seres humanos. La eficacia y la toxicidad terapéutica/profiláctica pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales de experimentación. por ejemplo, ED50 (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50 % de la población) y LD50 (la dosis letal para el 50 % de la población). La proporción de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la proporción, LD50/ED50. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran grandes índices terapéuticos. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, la sensibilidad del paciente y la vía de administración.
La dosificación y la administración se ajustan para proporcionar niveles suficientes del (de los) agente(s) activo(s) o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado de la enfermedad, la salud general del sujeto, la edad, el peso y el sexo del sujeto, la dieta, el tiempo y la frecuencia de administración, la(s) combinación(es) de fármacos, la sensibilidad a la reacción y la tolerancia /respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de acción prolongada se pueden administrar cada 3 o 4 días, cada semana o una vez cada dos semanas, dependiendo de la vida media y la tasa de eliminación de la formulación particular.
Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos activos descritas en este documento pueden fabricarse de una manera generalmente conocida, por ejemplo, por medio de procedimientos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más portadores farmacéuticamente aceptables que comprenden excipientes y/o auxiliares que facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. Por supuesto, la formulación apropiada depende de la vía de administración elegida.
Las composiciones farmacéuticas apropiadas para su uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores apropiados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una inyección fácil. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservado contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol y sorbitol, y cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos entre los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo filtrada previamente en condiciones estériles.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador farmacéuticamente aceptable comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en forma de comprimidos. Para fines de administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un portador fluido para su uso como enjuague bucal, en el que el compuesto en el portador fluido se aplica por vía oral y se enjuaga y se expectora o se traga. Los agentes aglutinantes farmacéuticamente compatibles y/o los materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante tal como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador a presión, que contiene un propulsor apropiado, por ejemplo, un gas como el dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosos o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, en la formulación se usan penetrantes apropiados para la barrera que se va a penetrar. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos activos se pueden preparar con portadores farmacéuticamente aceptables que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar según métodos conocidos para los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811.
Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de unidad de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma de unidad de dosificación como se usa en este documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto que se va a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La memoria descriptiva de las formas unitarias de dosificación de la divulgación está dictada y depende directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se desea lograr.
En las aplicaciones terapéuticas, las dosificaciones de los compuestos inhibidores de EZH2 descritos en este documento, otros agentes terapéuticos descritos en este documento, las composiciones que comprenden un compuesto de fórmula (IIa) y uno o más de otros agentes terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas usadas de acuerdo con la divulgación varían dependiendo del agente, la edad, el peso y la condición clínica del paciente receptor, y la experiencia y juicio del médico o practicante que administra la terapia, entre otros factores que afectan la dosificación seleccionada. En general, la dosis debería ser suficiente para dar como resultado una ralentización y, preferiblemente, una regresión del crecimiento de los tumores y también, preferiblemente, causar una regresión completa del cáncer. Las dosificación pueden oscilar desde aproximadamente 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 5000 mg/kg por día. En aspectos preferidos, las dosificaciones pueden oscilar desde aproximadamente 1 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día. En un aspecto, la dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 mg/día a aproximadamente 50 g/día; aproximadamente 0.1 mg/día a aproximadamente 25 g/día; aproximadamente 0.1 mg/día a aproximadamente 10 g/día; aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 3 g/día; o aproximadamente 0.1 mg a aproximadamente 1 g/día, en dosis únicas, divididas o continuas (la dosis puede ajustarse según el peso del paciente en kg, el área de superficie corporal en m2y la edad en años). Una cantidad eficaz de un agente farmacéutico es aquella que proporciona una mejora objetivamente identificable según lo observado por el médico u otro observador calificado. Por ejemplo, la regresión de un tumor en un paciente puede medirse con referencia al diámetro de un tumor. La disminución del diámetro de un tumor indica regresión. La regresión también está indicada por la imposibilidad de que los tumores vuelvan a aparecer después de que se ha detenido el tratamiento. Como se usa en este documento, el término "modo de dosificación eficaz" se refiere a la cantidad de un compuesto activo para producir el efecto biológico deseado en un sujeto o célula.
Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con las instrucciones de administración.
Las composiciones descritas en este documento son capaces de formar sales adicionales. La composición descrita en este documento es capaz de formar más de una sal por molécula, por ejemplo, mono-, di-, tri-. Todas estas formas también se contemplan dentro del alcance de la presente divulgación.
Como se usa en este documento, "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a derivados de los compuestos descritos en este documento en los que el compuesto original se modifica haciendo sales ácidas o básicas del mismo. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sales de ácidos minerales u orgánicos de residuos básicos tales como aminas, sales alcalinas u orgánicas de residuos ácidos tales como ácidos carboxílicos y similares. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales no tóxicas convencionales o las sales de amonio cuaternario del compuesto original formado, por ejemplo, a partir de ácidos inorgánicos u orgánicos no tóxicos. Por ejemplo, tales sales no tóxicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, aquellas derivadas de ácidos inorgánicos y orgánicos seleccionados de 2-acetoxibenzoico, 2-hidroxietano sulfónico, acético, ascórbico, benceno sulfónico, benzoico, bicarbónico, carbónico, cítrico, edético, etano disulfónico, 1,2-etano sulfónico, fumárico, glucoheptónico, glucónico, glutámico, glicólico, glicolarsanílico, hexilresorcínico, hidrabámico, bromhídrico, clorhídrico, yodhídrico, hidroximaleico, hidroxinaftoico, isetiónico, láctico, lactobiónico, lauril sulfónico, maleico, málico, mandélico, metano sulfónico, napsílico, nítrico, oxálico, pamoico, pantoténico, fenilacético, fosfórico, poligalacturónico, propiónico, salicílico, esteárico, subacético, succínico, sulfámico, sulfanílico, sulfúrico, tánico, tartárico, tolueno sulfónico y los ácidos de amina comúnmente presentes, por ejemplo, glicina, alanina, fenilalanina, arginina, etc.
Otros ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables incluyen ácido hexanoico, ácido ciclopentano propiónico, ácido pirúvico, ácido malónico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, ácido cinámico, ácido 4-clorobencenosulfónico, ácido 2-naftalenosulfónico, ácido 4-toluenosulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo-[2.2.2]-oct-2-eno-1-carboxílico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido terciario butilacético, ácido mucónico y similares. La presente divulgación también abarca las sales formadas cuando un protón ácido presente en el compuesto principal se reemplaza por un ion metálico, por ejemplo, un ion de metal alcalino, un ion alcalinotérreo o un ion de aluminio; o se coordina con una base orgánica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, trometamina, N-metilglucamina y similares.
Debe entenderse que todas las referencias a sales farmacéuticamente aceptables incluyen formas de adición de disolventes (solvatos) o formas cristalinas (polimorfos) como se define en este documento, de la misma sal.
Las composiciones descritas en este documento también se pueden preparar como ésteres, por ejemplo, ésteres farmacéuticamente aceptables. Por ejemplo, un grupo funcional de ácido carboxílico en un compuesto se puede convertir en su correspondiente éster, por ejemplo, un éster metílico, etílico u otro. Además, un grupo de alcohol en un compuesto se puede convertir en su éster correspondiente, por ejemplo, acetato, propionato u otro éster.
La composición, o las sales farmacéuticamente aceptables de la misma, se administran por vía oral, nasal, transdérmica, pulmonar, por inhalación, bucal, sublingual, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, intravenosa, rectal, intrapleural, intratecal y parenteral. En una realización, el compuesto se administra por vía oral. Un experto en la técnica reconocerá las ventajas de determinadas vías de administración.
El régimen de dosificación que usa los compuestos se selecciona de acuerdo con una variedad de factores que incluyen tipo, especie, edad, peso, sexo y condición médica del paciente; la gravedad de la afección que se va a tratar; la vía de administración; la función renal y hepática del paciente; y el compuesto particular o sal del mismo empleado. Un médico o veterinario con experiencia ordinaria puede determinar y prescribir fácilmente la cantidad eficaz del fármaco necesaria para prevenir, contrarrestar o detener el progreso de la afección.
Las técnicas para la formulación y administración de los compuestos revelados de la invención se pueden encontrar en Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, Mack Publishing Co., Easton, PA (1995). En una realización, los compuestos descritos en este documento y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos se usan en preparaciones farmacéuticas en combinación con un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores farmacéuticamente aceptables apropiados incluyen cargas o diluyentes sólidos inertes y soluciones acuosas u orgánicas estériles. Los compuestos estarán presentes en dichas composiciones farmacéuticas en cantidades suficientes para proporcionar la cantidad de dosificación deseada en el intervalo descrito en este documento.
Todos los porcentajes y proporciones usados en este documento, a menos que se indique lo contrario, son en peso. Otras características y ventajas de la presente invención son evidentes a partir de los diferentes ejemplos. Los ejemplos proporcionados ilustran diferentes componentes y metodología útiles en la práctica de la presente invención. Los ejemplos no limitan la invención reivindicada. En base a la presente divulgación, el experto en la técnica puede identificar y emplear otros componentes y metodologías útiles para poner en práctica la presente invención.
En este documento se describen métodos de tratamiento de afecciones y enfermedades cuyo curso puede verse afectado por la modulación del estado de metilación de las histonas u otras proteínas, en el que dicho estado de metilación está mediado al menos en parte por la actividad de EZH2. La modulación del estado de metilación de las histonas puede, a su vez, influir en el nivel de expresión de los genes diana activados por la metilación y/o los genes diana suprimidos por la metilación. El método incluye administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento, una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición descrita en este documento o una de las sales, profármacos, metabolitos, polimorfos o solvatos de las mismas farmacéuticamente aceptables, a un sujeto que necesita dicho tratamiento.
En base a al menos en el hecho de que se ha encontrado que la metilación anormal de histonas está asociada con determinados cánceres y afecciones precancerosas, un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa con una EZH2 mutante en un sujeto comprende administrar al sujeto que lo necesita una sustancia terapéuticamente eficaz cantidad de un compuesto que inhibe la metilación. Un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto puede comprender administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhiba la conversión de H3-K27 no metilado en H3-K27 monometilado (H3-K27me1). Un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto puede comprender administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la conversión de H3-K27 monometilado (H3-K27me1) en H3-K27 dimetilado (H3-K27me2). Un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto puede comprender administrar al sujeto que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe la conversión de H3-K27me2 en H3-K27 trimetilado (H3-K27me3). Un método de tratamiento del cáncer o una afección precancerosa en un sujeto puede comprender administrar al sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto que inhibe tanto la conversión de H3-K27me1 en H3-K27me2 como la conversión de H3-K27me2 en H3-K27me3. Es importante tener en cuenta que el aumento específico de la enfermedad en la metilación puede ocurrir en la cromatina en loci genómicos clave en ausencia de un aumento global en los niveles celulares de histona o metilación de proteínas. Por ejemplo, es posible que ocurra una hipermetilación aberrante en genes clave relevantes para la enfermedad en un contexto de hipometilación global de histonas o proteínas.
Los moduladores de la metilación pueden usarse para modular la proliferación celular, en general. Por ejemplo, en algunos casos, la proliferación excesiva puede reducirse con agentes que disminuyen la metilación, mientras que la proliferación insuficiente puede estimularse con agentes que aumentan la metilación. De acuerdo con lo anterior, las enfermedades que pueden tratarse incluyen enfermedades hiperproliferativas, tales como el crecimiento celular benigno y el crecimiento celular maligno (cáncer).
El trastorno en el que interviene la metilación de proteínas mediada por EZH2 puede ser cáncer, un trastorno de proliferación celular o una afección precancerosa. La presente divulgación proporciona además el uso de una composición descrita en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, para un sujeto que necesite dicho tratamiento, para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento del cáncer. Los cánceres de ejemplo que pueden tratarse incluyen linfomas, que incluyen linfoma no Hodgkin, linfoma folicular (FL) y linfoma difuso de células B grandes (DLBCL); melanoma; y leucemia, incluyendo CML. Una afección precancerosa de ejemplo incluye el síndrome mielodisplásico (MDS; anteriormente conocido como preleucemia).
En general, los compuestos que son moduladores de la metilación pueden usarse para modular la proliferación celular, en general. Por ejemplo, en algunos casos, la proliferación excesiva puede reducirse con agentes que disminuyen la metilación, mientras que la proliferación insuficiente puede estimularse con agentes que aumentan la metilación. De acuerdo con lo anterior, las enfermedades que pueden tratarse con los compuestos descritos en este documento incluyen enfermedades hiperproliferativas, tales como el crecimiento de células benignas y el crecimiento de células malignas.
Como se usa en este documento, un "sujeto que lo necesita" es un sujeto que tiene un trastorno en el que la metilación de proteínas mediada por EZH2 juega un papel, o un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar tal trastorno con respecto a la población en general. Un sujeto que lo necesite puede tener un estado precanceroso. Preferiblemente, un sujeto que lo necesite tiene cáncer. Un "sujeto" incluye un mamífero. El mamífero puede ser por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate, un pájaro, un ratón, una rata, un ave, un perro, un gato, una vaca, un caballo, una cabra, un camello, una oveja o un cerdo. Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
El sujeto de la presente invención incluye cualquier sujeto humano que haya sido diagnosticado, tenga síntomas o esté en riesgo de desarrollar un cáncer o una afección precancerosa. El objeto de la presente invención incluye cualquier sujeto humano que exprese una EZH2 mutante. Por ejemplo, una EZH2 mutante comprende una o más mutaciones, en las que la mutación es una sustitución, una mutación puntual, una mutación sin sentido, una mutación sin sentido invertida, una deleción o una inserción o cualquier otra mutación de EZH2 descrita en este documento.
Un sujeto que lo necesite puede tener un cáncer refractario o resistente. "Cáncer refractario o resistente" significa cáncer que no responde al tratamiento. El cáncer puede ser resistente al comienzo del tratamiento o puede volverse resistente durante el tratamiento. En algunas realizaciones, el sujeto que lo necesita tiene recurrencia del cáncer después de la remisión en la terapia más reciente. En algunas realizaciones, el sujeto que lo necesitaba recibió y fracasó en todas las terapias eficaces conocidas para el tratamiento del cáncer. En algunas realizaciones, el sujeto que lo necesitaba recibió al menos una terapia previa. En determinadas realizaciones, la terapia anterior es monoterapia. En determinadas realizaciones, la terapia anterior es una terapia de combinación.
En algunas realizaciones, un sujeto que lo necesite puede tener un cáncer secundario como resultado de una terapia previa. "Cáncer secundario" significa cáncer que surge debido o como resultado de terapias cancerígenas previas, tales como la quimioterapia.
El sujeto también puede exhibir resistencia a los inhibidores de la histona metiltransferasa EZH2 o a cualquier otro agente terapéutico.
En este documento se describe un método para seleccionar una terapia de combinación para un sujeto que tiene cáncer. El método incluye las etapas de: detectar una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en una muestra del sujeto; y seleccionar, en base a la presencia de una o más mutaciones EZH2, una terapia de combinación para tratar el cáncer. La terapia puede incluir la administración al sujeto de una composición de la invención. El método puede incluir además la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición de la invención. Una mutación EZH2 puede detectarse usando cualquier método apropiado conocido en la técnica. Se describen más métodos en la Publicación de la Patente de los Estados Unidos US 20130040906.
Los métodos y usos descritos en este documento pueden incluir etapas para detectar una o más mutaciones EZH2 descritas en este documento en una muestra de un sujeto que lo necesite antes y/o después de la administración de una composición de la invención (por ejemplo, una composición que comprende un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los otros agentes terapéuticos) al sujeto. La presencia de una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en la muestra probada indica que el sujeto responde a la terapia de combinación descrita en este documento.
La presente invención proporciona medicina, tratamiento y/o gestión del cáncer personalizados para un sujeto mediante la detección genética de una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento en el sujeto. Por ejemplo, en este documento se describen métodos de tratamiento o alivio de un síntoma de cáncer o una afección precancerosa en un sujeto que lo necesite determinando la capacidad de respuesta del sujeto a una terapia combinada y cuando el sujeto responde a la terapia combinada, administrando al sujeto una composición descrita en este documento. La capacidad de respuesta se determina obteniendo una muestra del sujeto y detectando una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento, y la presencia de una o más mutaciones de EZH2 descritas en este documento indica que el sujeto responde a la composición descrita en este documento. Una vez que se determina la capacidad de respuesta de un sujeto, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición, por ejemplo, una composición que comprende un compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los otros agentes terapéuticos. La cantidad terapéuticamente eficaz de una composición puede ser determinada por un experto en la técnica.
Como se usa en este documento, el término "capacidad de respuesta" es intercambiable con los términos "receptivo", "sensible" y "sensibilidad", y significa que un sujeto muestra respuestas terapéuticas cuando se le administra una composición descrita en este documento. por ejemplo, las células tumorales o los tejidos tumorales del sujeto experimentan apoptosis y/o necrosis, y/o muestran crecimiento, división o proliferación reducidos. Este término también significa que un sujeto mostrará o tiene una mayor probabilidad, con respecto a la población en general, de mostrar respuestas terapéuticas cuando se le administre una composición descrita en este documento. por ejemplo, las células tumorales o los tejidos tumorales del sujeto experimentan apoptosis y/o necrosis, y/o muestran crecimiento, división o proliferación reducidos.
Por "muestra" se entiende cualquier muestra biológica derivada del sujeto, que incluye, entre otros, células, muestras de tejidos, fluidos corporales (incluidos, entre otros, mucosidad, sangre, plasma, suero, orina, saliva y semen), células tumorales y tejidos tumorales. Preferiblemente, la muestra se selecciona de médula ósea, células de sangre periférica, sangre, plasma y suero. Las muestras pueden ser proporcionadas por el sujeto bajo tratamiento o prueba. Alternativamente, el médico puede obtener muestras según la práctica habitual en la técnica.
Como se usa en este documento, el término "trastorno de proliferación celular" se refiere a condiciones en las que el crecimiento no regulado o anormal, o ambos, de las células puede conducir al desarrollo de una afección o enfermedad no deseada, que puede ser cancerosa o no. Los trastornos de proliferación celular de ejemplo de la invención abarcan una variedad de condiciones en las que la división celular está desregulada. Los trastornos proliferativos de células ejemplos de incluyen, pero no se limitan a, neoplasmas, tumores benignos, tumores malignos, afecciones precancerosas, tumores in situ, tumores encapsulados, tumores metastásicos, tumores líquidos, tumores sólidos, tumores inmunológicos, tumores hematológicos, cánceres, carcinomas, leucemias, linfomas, sarcomas y células de división rápida. El término "célula que se divide rápidamente", como se usa en este documento, se define como cualquier célula que se divide a una tasa que excede o es mayor que la esperada u observada entre células vecinas o yuxtapuestas dentro del mismo tejido. Un trastorno de proliferación celular incluye un precáncer o una afección precancerosa. Un trastorno de proliferación celular incluye el cáncer. Preferiblemente, los métodos proporcionados en este documento se usan para tratar o aliviar un síntoma de cáncer. El término "cáncer" incluye tumores sólidos, así como tumores hematológicos y/o malignidades. Una "célula precancerosa" o "célula precancerosa" es una célula que manifiesta un trastorno proliferativo celular que es un precáncer o una afección precancerosa. Una “célula cancerosa” o “célula cancerosa” es una célula que manifiesta un trastorno proliferativo celular que es un cáncer. Puede usarse cualquier medio reproducible de medición para identificar células cancerosas o células precancerosas. Las células cancerosas o las células precancerosas se pueden identificar mediante tipificación histológica o clasificación de una muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de biopsia). Las células cancerosas o las células precancerosas se pueden identificar mediante el uso de marcadores moleculares apropiados.
Las condiciones o trastornos no cancerosos de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide; inflamación; enfermedad autoinmune; condiciones linfoproliferativas; acromegalia; espondilitis reumatoide; osteoartritis; gota, otras condiciones artríticas; septicemia; shock séptico; choque endotóxico; septicemia por gramnegativos; síndrome de shock tóxico; asma; síndrome de dificultad respiratoria del adulto; afección pulmonar obstructiva crónica; inflamación pulmonar crónica; enfermedad inflamatoria intestinal; enfermedad de Crohn; soriasis; eczema; colitis ulcerosa; fibrosis pancreática; fibrosis hepática; enfermedad renal aguda y crónica; síndrome del intestino irritable; piresis; reestenosis; paludismo cerebral; accidentes cerebrovasculares y lesiones isquémicas; trauma neural; enfermedad de Alzheimer; enfermedad de Huntington; enfermedad de Parkinson; dolor agudo y crónico; rinitis alérgica; conjuntivitis alérgica; insuficiencia cardíaca crónica; síndrome coronario agudo; caquexia; malaria; lepra; leishmaniasis; enfermedad de Lyme; síndrome de Reiter; sinovitis aguda; degeneración muscular, bursitis; tendinitis; tenosinovitis; síndrome del disco intervertebral herniado, roto o prolapsado; osteopetrosis; trombosis; reestenosis; silicosis; sarcosis pulmonar; enfermedades de reabsorción ósea, tales como osteoporosis; reacción de injerto contra huésped; esclerosis múltiple; lupus; fibromialgia; SIDA y otras enfermedades virales tales como Herpes Zoster, Herpes Simplex I o II, virus de influenza y citomegalovirus; y diabetes mellitus.
Los cánceres de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer anorrectal, cáncer del canal anal, cáncer de apéndice, astrocitoma cerebeloso infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma de células basales, cáncer de piel (no melanoma), cáncer biliar, cáncer de las vías biliares extrahepáticas, cáncer de las vías biliares intrahepáticas, cáncer de vejiga, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de huesos y articulaciones, osteosarcoma e histiocitoma fibroso maligno, cáncer cerebral, tumor cerebral, glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodeimales primitivos supratentoriales, ruta visual y glioma hipotalámico, cáncer de mama, adenomas bronquiales/carcinoides, tumor carcinoide, gastrointestinal, cáncer del sistema nervioso, linfoma del sistema nervioso, cáncer del sistema nervioso central, linfoma del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, cánceres infantiles, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, neoplasia linfoide, micosis fungoide, síndrome de Seziary, cáncer de endometrio, cáncer de esófago, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinativas, cáncer extrahepático de las vías biliares, cáncer de ojo, melanoma intraocular, retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (de estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales, tumor de células germinales de ovario, glioma tumoral trofoblástico gestacional, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, cáncer ocular, tumores de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón, cáncer renal, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, leucemia de células pilosas, cáncer de labio y cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, cáncer de pulmón de células no pequeñas, cáncer de pulmón de células pequeñas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma no Hodgkin, linfoma primario del sistema nervioso central, macroglobulinemia de Waldenstram, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (del ojo), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico, cáncer de boca, cáncer de lengua, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena crónica, leucemia mieloide aguda, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de cavidad oral, cáncer de orofaringe, cáncer de ovario, cáncer epitelial de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de páncreas de células de los islotes, cáncer de seno paranasal y cavidad nasal, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivo supratentorial, tumor pituitario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer de recto, pelvis renal y uréter, cáncer de células de transición, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, cáncer de glándulas salivales, familia de tumores sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejido blando, cáncer uterino, sarcoma uterino, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer de intestino delgado, sarcoma de tejidos blandos, carcinoma de células escamosas, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter y otros órganos urinarios, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de uretra, cáncer de endometrio uterino, sarcoma uterino, cáncer del cuerpo uterino, cáncer de vagina, cáncer de vulva y tumor de Wilm.
Un "trastorno de proliferación celular del sistema hematológico" es un trastorno de proliferación celular que implica las células del sistema hematológico. Un trastorno de proliferación celular del sistema hematológico puede incluir linfoma, leucemia, neoplasias mieloides, neoplasias de mastocitos, mielodisplasia, gammapatía monoclonal benigna, granulomatosis linfomatoide, papulosis linfomatoide, policitemia vera, leucemia mielocítica crónica, metaplasia mieloide agnogénica y trombocitemia esencial. Un trastorno de proliferación celular del sistema hematológico puede incluir hiperplasia, displasia y metaplasia de células del sistema hematológico. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar un cáncer seleccionado del grupo que consiste en un cáncer hematológico de la presente invención o un trastorno proliferativo de células hematológicas de la presente invención. Un cáncer hematológico de la presente invención puede incluir mieloma múltiple, linfoma (incluyendo linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfomas infantiles y linfomas de origen linfocítico y cutáneo), leucemia (incluyendo leucemia infantil, leucemia de células pilosas, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielocítica crónica, leucemia mielógena crónica y leucemia de mastocitos), neoplasias mieloides y neoplasias de mastocitos.
Un “trastorno de proliferación celular del pulmón” es un trastorno de proliferación celular que implica a las células del pulmón. Los trastornos proliferativos celulares del pulmón pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células pulmonares. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir cáncer de pulmón, un precáncer o una afección precancerosa del pulmón, crecimientos o lesiones benignos del pulmón y crecimientos o lesiones malignos del pulmón, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo que no sean el pulmón. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar el cáncer de pulmón o los trastornos de proliferación celular del pulmón. El cáncer de pulmón puede incluir todas las formas de cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede incluir neoplasias pulmonares malignas, carcinoma in situ, tumores carcinoides típicos y tumores carcinoides atípicos. El cáncer de pulmón puede incluir cáncer de pulmón de células pequeñas ("SCLC"), cáncer de pulmón de células no pequeñas ("NSCLC"), carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células pequeñas, carcinoma de células grandes, carcinoma de células adenoescamosas y mesotelioma. El cáncer de pulmón puede incluir "carcinoma cicatricial", carcinoma bronquioalveolar, carcinoma de células gigantes, carcinoma de células fusiformes y carcinoma neuroendocrino de células grandes. El cáncer de pulmón puede incluir neoplasias pulmonares que tienen heterogeneidad histológica y ultraestructural (por ejemplo, tipos celulares mixtos).
Los trastornos proliferativos celulares del pulmón pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células pulmonares. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir cáncer de pulmón, afecciones precancerosas del pulmón. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia del pulmón. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir hiperplasia inducida por amianto, metaplasia escamosa y metaplasia mesotelial reactiva benigna. Los trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir el reemplazo del epitelio cilíndrico por epitelio escamoso estratificado y displasia de la mucosa. Las personas expuestas a agentes ambientales nocivos inhalados, tales como el humo del cigarrillo y el asbesto, pueden tener un mayor riesgo de desarrollar trastornos de proliferación celular del pulmón. Las enfermedades pulmonares previas que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos de proliferación celular del pulmón pueden incluir enfermedad pulmonar intersticial crónica, enfermedad pulmonar necrosante, esclerodermia, enfermedad reumatoide, sarcoidosis, neumonitis intersticial, tuberculosis, neumonías repetidas, fibrosis pulmonar idiopática, granulomas, asbestosis, alveolitis fibrosante y enfermedad de Hodgkin.
Un “trastorno proliferativo celular del colon” es un trastorno proliferativo celular que implica a las células del colon. Preferiblemente, el trastorno de proliferación celular del colon es el cáncer de colon. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar el cáncer de colon o los trastornos de proliferación celular del colon. El cáncer de colon puede incluir todas las formas de cáncer de colon. El cáncer de colon puede incluir cánceres de colon esporádicos y hereditarios. El cáncer de colon puede incluir neoplasias malignas de colon, carcinoma in situ, tumores carcinoides típicos y tumores carcinoides atípicos. El cáncer de colon puede incluir adenocarcinoma, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células adenoescamosas. El cáncer de colon puede estar asociado con un síndrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliposis adenomatosa familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot y poliposis juvenil. El cáncer de colon puede ser causado por un síndrome hereditario seleccionado del grupo que consiste en cáncer colorrectal hereditario sin poliposis, poliposis adenomatosa familiar, síndrome de Gardner, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Turcot y poliposis juvenil.
Los trastornos proliferativos celulares del colon pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células del colon. Los trastornos de proliferación celular del colon pueden incluir cáncer de colon, afecciones precancerosas del colon, pólipos adenomatosos del colon y lesiones metacrónicas del colon. Un trastorno de proliferación celular del colon puede incluir adenoma. Los trastornos de proliferación celular del colon se pueden caracterizar por hiperplasia, metaplasia y displasia del colon. Las enfermedades de colon anteriores que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos celulares del colon pueden incluir cáncer de colon previo. Las enfermedades actuales que pueden predisponer a los individuos al desarrollo de trastornos proliferativos celulares del colon pueden incluir la enfermedad de Crohn y la colitis ulcerosa. Un trastorno de proliferación celular del colon puede estar asociado con una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC. Un individuo puede tener un riesgo elevado de desarrollar un trastorno proliferativo celular del colon debido a la presencia de una mutación en un gen seleccionado del grupo que consiste en p53, ras, FAP y DCC.
Un "trastorno de proliferación celular del páncreas" es un trastorno de proliferación celular que implica a las células del páncreas. Los trastornos de proliferación celular del páncreas pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan a las células pancreáticas. Los trastornos de proliferación celular del páncreas pueden incluir cáncer de páncreas, precáncer o afección precancerosa del páncreas, hiperplasia del páncreas y disaplasia del páncreas, crecimientos benignos o lesiones del páncreas y crecimientos malignos o lesiones del páncreas y lesiones de metástasis en tejidos y órganos del cuerpo distintos del páncreas. El cáncer de páncreas incluye todas las formas de cáncer de páncreas. El cáncer de páncreas puede incluir adenocarcinoma ductal, carcinoma adenoescamoso, carcinoma pleomórfico de células gigantes, adenocarcinoma mucinoso, carcinoma de células gigantes tipo osteoclasto, cistoadenocarcinoma mucinoso, carcinoma acinar, carcinoma de células grandes no clasificado, carcinoma de células pequeñas, pancreatoblastoma, neoplasia papilar, cistoadenoma mucinoso, neoplasia quística papilar y cistoadenoma seroso. El cáncer de páncreas también puede incluir neoplasias pancreáticas que tienen heterogeneidad histológica y ultraestructural (por ejemplo, tipos celulares mixtos).
Un "trastorno proliferativo celular de la próstata" es un trastorno proliferativo celular que implica a las células de la próstata. Los trastornos proliferativos celulares de la próstata pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células prostáticas. Los trastornos proliferativos de células de la próstata pueden incluir cáncer de próstata, un precáncer o una afección precancerosa de la próstata, crecimientos o lesiones benignos de la próstata y crecimientos o lesiones malignos de la próstata, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo distintos de la próstata. Los trastornos de proliferación celular de la próstata pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la próstata.
Un "trastorno de proliferación celular de la piel" es un trastorno de proliferación celular que implica a las células de la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan a las células de la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir un precáncer o afección precancerosa de la piel, crecimientos o lesiones benignos de la piel, melanoma, melanoma maligno y otros crecimientos o lesiones malignos de la piel, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo, distintos la piel. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la piel.
Un "trastorno de proliferación celular del ovario" es un trastorno de proliferación celular que implica a las células del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario pueden incluir todas las formas de trastornos de proliferación celular que afectan a las células del ovario. Los trastornos de proliferación celular del ovario pueden incluir un precáncer o una afección precancerosa del ovario, tumores o lesiones benignos del ovario, cáncer de ovario, tumores malignos o lesiones del ovario y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo distintos del ovario. Los trastornos de proliferación celular de la piel pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de las células del ovario.
Un "trastorno de proliferación celular de la mama" es un trastorno de proliferación celular que implica a las células de la mama. Los trastornos proliferativos celulares de la mama pueden incluir todas las formas de trastornos proliferativos celulares que afectan a las células mamarias. Los trastornos de proliferación celular de la mama pueden incluir cáncer de mama, un precáncer o una afección precancerosa de la mama, tumores o lesiones benignos de la mama y tumores o lesiones malignos de la mama, y lesiones metastásicas en tejidos y órganos del cuerpo distintos de la mama. Los trastornos de proliferación celular de la mama pueden incluir hiperplasia, metaplasia y displasia de la mama.
Un trastorno proliferativo celular de la mama puede ser una afección precancerosa de la mama. Las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar una afección precancerosa de la mama. Una afección precancerosa de la mama puede incluir hiperplasia atípica de la mama, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobulillar in situ (LCIS), neoplasia lobulillar y crecimiento o lesión de la mama en estadio 0 o grado 0 (por ejemplo, cáncer de mama en estadio 0 o grado 0, o carcinoma in situ). Una afección precancerosa de la mama se puede estadificar según el esquema de clasificación TNM aceptado por the American Joint Committee on Cancer (AJCC), donde al tumor primario (T) se le ha asignado una estadio de T0 o Tis; y donde a los ganglios linfáticos regionales (N) se les ha asignado una estadio de N0; y donde a la metástasis distante (M) se le ha asignado una etapa de M0.
El trastorno proliferativo celular de la mama puede ser cáncer de mama. Preferiblemente, las composiciones de la presente invención se pueden usar para tratar el cáncer de mama. El cáncer de mama incluye todas las formas de cáncer de mama. El cáncer de mama puede incluir cánceres de mama epiteliales primarios. El cáncer de mama puede incluir cánceres en los que la mama está afectada por otros tumores tales como linfoma, sarcoma o melanoma. El cáncer de mama puede incluir carcinoma de mama, carcinoma ductal de mama, carcinoma lobulillar de mama, carcinoma indiferenciado de mama, cistosarcoma filoides de mama, angiosarcoma de mama y linfoma primario de mama. El cáncer de mama puede incluir cáncer de mama en estadio I, II, IIIA, IIIB, IIIC y IV. El carcinoma ductal de mama puede incluir carcinoma invasivo, carcinoma invasivo in situ con componente intraductal predominante, cáncer de mama inflamatorio y un carcinoma ductal de mama con un tipo histológico seleccionado del grupo que consiste en comedón, mucinoso (coloide), medular, medular con infiltrado linfocítico, papilar, escirroso y tubular. El carcinoma lobulillar de mama puede incluir carcinoma lobulillar invasivo con predominio in situ componente, carcinoma lobulillar invasivo y carcinoma lobulillar infiltrante. El cáncer de mama puede incluir la enfermedad de Paget, la enfermedad de Paget con carcinoma intraductal y la enfermedad de Paget con carcinoma ductal invasivo. El cáncer de mama puede incluir neoplasias de mama que tienen heterogeneidad histológica y ultraestructural (por ejemplo, tipos de células mixtas).
También se revela que un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, puede usarse para tratar el cáncer de mama. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir cáncer de mama familiar. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir cáncer de mama esporádico. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto masculino. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto femenino. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto femenino premenopáusico o en un sujeto femenino posmenopáusico. Un cáncer de mama que se va a tratar puede surgir en un sujeto igual o mayor de 30 años, o en un sujeto menor de 30 años. Un cáncer de mama que se va a tratar ha surgido en un sujeto igual o mayor de 50 años, o en un sujeto menor de 50 años. Un cáncer de mama a tratar puede surgir en un sujeto igual o mayor de 70 años, o en un sujeto menor de 70 años.
Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar para identificar una mutación familiar o espontánea en BRCA1, BRCA2 o p53. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como si tuviera una amplificación del gen HER2/neu, si sobreexpresara HER2/neu, o si tuviera un nivel bajo, intermedio o alto de expresión de HER2/neu. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar para un marcador seleccionado del grupo que consiste en receptor de estrógeno (ER), receptor de progesterona (PR), receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano, Ki-67, CA15-3, CA27 -29, y c-Met. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como ER-desconocido, rico en ER o pobre en ER. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como ER-negativo o ER-positivo. La tipificación del ER de un cáncer de mama se puede realizar por cualquier medio reproducible. La tipificación del ER de un cáncer de mama se puede realizar como se establece en Onkologie 27: 175-179 (2004). Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como PR-desconocido, PR-rico o PR-pobre. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como PR-negativo o PR-positivo. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como receptor positivo o receptor negativo. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede tipificar como asociado con niveles sanguíneos elevados de CA 15-3, o CA 27-29, o ambos.
Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor localizado en la mama. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama asociado con una biopsia de ganglio linfático centinela (SLN) negativa. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que está asociado con una biopsia de ganglio linfático centinela (SLN) positiva. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que está asociado con uno o más ganglios linfáticos axilares positivos, donde los ganglios linfáticos axilares se han estadificado mediante cualquier método aplicable. Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que se ha tipificado como que tiene un estado de ganglio negativo (por ejemplo, ganglio negativo) o un estado de ganglio positivo (por ejemplo, ganglio positivo). Un cáncer de mama que se va a tratar puede incluir un tumor de mama que ha hecho metástasis en otros lugares del cuerpo. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar como que ha hecho metástasis en un lugar seleccionado del grupo que consiste en hueso, pulmón, hígado o cerebro. Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar según una característica seleccionada del grupo que consiste en metastásico, localizado, regional, local-regional, localmente avanzado, distante, multicéntrico, bilateral, ipsilateral, contralateral, recién diagnosticado, recurrente e inoperable.
También se revela que un compuesto descrito en este documento, o una sal, éster, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, puede usarse para tratar o prevenir un trastorno de proliferación celular de la mama, o para tratar o prevenir el cáncer de mama, en un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama con respecto a la población en general. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama con respecto a la población en general es un sujeto femenino con antecedentes familiares o antecedentes personales de cáncer de mama. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama con respecto a la población en general es un sujeto femenino que tiene una mutación espontánea o de línea germinal en BRCA1 o BRCA2, o ambos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama con respecto a la población en general es un sujeto femenino con antecedentes familiares de cáncer de mama y una mutación espontánea o de línea germinal en BRCA1 o BRCA2, o ambos. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama con respecto a la población en general es una mujer mayor de 30 años, mayor de 40 años, mayor de 50 años, mayor de 60 años, mayor de 70 años, mayor de 80 años, o mayor de 90 años. Un sujeto con un mayor riesgo de desarrollar cáncer de mama con respecto a la población en general es un sujeto con hiperplasia atípica de mama, carcinoma ductal in situ (DCIS), carcinoma intraductal, carcinoma lobulillar in situ (LCIS), neoplasia lobulillar, o un crecimiento o lesión de la mama en estadio 0 (por ejemplo, cáncer de mama en estadio 0 o grado 0, o carcinoma in situ).
Un cáncer de mama que se va a tratar se puede clasificar histológicamente según el sistema de Scarff-Bloom-Richardson, en el que a un tumor de mama se le ha asignado una puntuación de recuento de mitosis de 1,2 o 3; una puntuación de pleomorfismo nuclear de 1,2 o 3; una puntuación de formación de túbulos de 1,2 o 3; y una puntuación total de Scarff-Bloom-Richardson de entre 3 y 9. A un cáncer de mama que se va a tratar se le puede asignar un grado de tumor según el Panel de consenso internacional sobre el tratamiento del cáncer de mama seleccionado del grupo que consta de grado 1, grado 1-2, grado 2, grado 2-3 o grado 3.
Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar en etapas según el sistema de clasificación TNM del American Joint Committee on Cancer (AJCC), donde al tumor (T) se le ha asignado un estadio de TX, T1, T1mic, T1a, T1b, T1c, T2, T3, T4, T4a, T4b, T4c o T4d; y donde a los ganglios linfáticos regionales (N) se les ha asignado una estadio de NX, N0, N1, N2, N2a, N2b, N3, N3a, N3b o N3c; y donde a la metástasis distante (M) se le puede asignar un estadio de MX, M0 o M1. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar por etapas según la clasificación del American Joint Committee on Cancer (AJCC) como el Estadio I, Estadio IIA, Estadio IIB, Estadio IIIA, Estadio IIIB, Estadio IIIC o Estadio IV. Un cáncer que se va a tratar se le puede asignar un grado según una clasificación AJCC como Grado GX (por ejemplo, grado no se puede evaluar), Grado 1, Grado 2, Grado 3 o Grado 4. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar según una clasificación patológica (pN) del AJCC de pNX, pN0, PN0 (I-), PN0 (I+), PN0 (mol-), PN0 (mol+), PN1, PN1(mi), PN1a, PN1b, PN1c, pN2, pN2a, pN2b, pN3, pN3a, pN3b o pN3c.
Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene menor que o igual a aproximadamente 2 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que tiene desde aproximadamente 2 a aproximadamente 5 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que es mayor que o igual a aproximadamente 3 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar puede incluir un tumor que se ha determinado que es mayor que 5 centímetros de diámetro. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar por apariencia microscópica como bien diferenciado, moderadamente diferenciado, pobremente diferenciado o indiferenciado. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar por apariencia microscópica con respecto al recuento de mitosis (por ejemplo, cantidad de división celular) o pleomorfismo nuclear (por ejemplo, cambio en las células). Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar por apariencia microscópica como asociado con áreas de necrosis (por ejemplo, áreas de células moribundas o degeneradas). Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar como que tiene un cariotipo anormal, que tiene un número anormal de cromosomas o que tiene uno o más cromosomas que tienen una apariencia anormal. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar como aneuploide, triploide, tetraploide o con ploidía alterada. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar como que tiene una translocación cromosómica, o una deleción o duplicación de un cromosoma completo, o una región de deleción, duplicación o amplificación de una porción de un cromosoma.
Un cáncer que se va a tratar puede evaluarse mediante citometría de ADN, citometría de flujo o citometría de imagen. Un cáncer que se va a tratar se puede clasificar con un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o 90 % de células en la etapa de síntesis de la división celular (por ejemplo, en la fase S de la división celular). Un cáncer que se va a tratar se puede tipificar como si tuviera una fracción de fase S baja o una fracción de fase S alta.
Como se usa en este documento, una "célula normal" es una célula que no se puede clasificar como parte de un "trastorno proliferativo celular". Una célula normal carece de crecimiento no regulado o anormal, o ambos, que pueden conducir al desarrollo de una afección o enfermedad no deseada. Preferiblemente, una célula normal posee mecanismos de control de puntos de control del ciclo celular que funcionan normalmente.
Como se usa en este documento, "ponerse en contacto con una célula" se refiere a una condición en la que un compuesto u otra composición de materia está en contacto directo con una célula, o está lo suficientemente cerca para inducir un efecto biológico deseado en una célula.
Como se usa en este documento, "compuesto candidato" se refiere a un compuesto descrito en este documento, o una sal, éster, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, que ha sido o será probado en uno o más ensayos biológicos in vitro o in vivo, con el fin de determinar si es probable que ese compuesto provoque una respuesta biológica o médica deseada en una célula, tejido, sistema, animal o ser humano que está buscando un investigador o médico. Un compuesto candidato es un compuesto descrito en este documento, o una de sus sales, ésteres, profármacos, metabolitos, polimorfos o solvatos farmacéuticamente aceptables. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento del cáncer. La respuesta biológica o médica puede ser el tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular. Los ensayos biológicos in vitro o in vivo pueden incluir, pero no se limitan a, ensayos de actividad enzimática, ensayos de cambio de movilidad electroforética, ensayos de genes indicadores, ensayos de viabilidad celular in vitro y los ensayos descritos en este documento.
Como se usa en este documento, "tratamiento" o "tratar" describe el manejo y la atención de un paciente con el fin de combatir una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco o metabolito farmacéuticamente aceptable, polimorfo o solvato del mismo, para aliviar los síntomas o complicaciones de una enfermedad, afección o trastorno, o para eliminar la enfermedad, afección o trastorno.
Una composición descrita en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable de la misma, también puede usarse para prevenir una enfermedad, afección o trastorno. Como se usa en este documento, "que previene" o "prevenir" describe reducir o eliminar la aparición de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección o trastorno.
Como se usa en este documento, el término "aliviar" pretende describir un procedimiento mediante el cual se reduce la gravedad de un signo o síntoma de un trastorno. Es importante destacar que un signo o síntoma puede aliviarse sin eliminarse. En una realización preferida, la administración de las composiciones farmacéuticas descritas en este documento conduce a la eliminación de un signo o síntoma, sin embargo, no se requiere la eliminación. Se espera que las dosificaciones eficaces reduzcan la gravedad de un signo o síntoma. Por ejemplo, un signo o síntoma de un trastorno tal como el cáncer, que puede ocurrir en múltiples ubicaciones, se alivia si la gravedad del cáncer disminuye en al menos una de las múltiples ubicaciones.
Como se usa en este documento, el término "gravedad" pretende describir el potencial del cáncer para transformarse de un estado precanceroso o benigno a un estado maligno. Alternativamente, o además, se entiende que la gravedad describe un estadio del cáncer, por ejemplo, según el sistema TNM (aceptado por la International Union Against Cancer (UICC) y el American Joint Committee on Cancer (AJCC)) o por otros métodos reconocidos en la técnica. El estadio del cáncer se refiere a la extensión o gravedad del cáncer, en base a factores tales como la ubicación del tumor primario, el tamaño del tumor, el número de tumores y la afectación de los ganglios linfáticos (propagación del cáncer a los ganglios linfáticos). Alternativamente, o además, se pretende que la gravedad describa el grado del tumor mediante métodos reconocidos en la técnica (véase, National Cancer Institute, www.cancer.gov). El grado del tumor es un sistema que se usa para clasificar las células cancerosas en términos de qué tan anormales se ven bajo un microscopio y qué tan rápido es probable que el tumor crezca y se propague. Se consideran muchos factores al determinar el grado del tumor, incluida la estructura y el patrón de crecimiento de las células. Los factores específicos usados para determinar el grado del tumor varían con cada tipo de cáncer. La gravedad también describe un grado histológico, también llamado diferenciación, que se refiere a cuánto se parecen las células tumorales a las células normales del mismo tipo de tejido (consulte el Instituto Nacional del Cáncer, www.cancer.gov). Además, la gravedad describe un grado nuclear, que se refiere al tamaño y la forma del núcleo en las células tumorales y el porcentaje de células tumorales que se están dividiendo (véase, National Cancer Institute, www.cancer.gov).
Por ejemplo, la gravedad describe el grado en que un tumor ha secretado factores de crecimiento, ha degradado la matriz extracelular, se ha vascularizado, ha perdido la adhesión a los tejidos yuxtapuestos o ha hecho metástasis. Además, la gravedad describe el número de ubicaciones a las que ha hecho metástasis un tumor primario. Finalmente, la gravedad incluye la dificultad de tratar tumores de diferentes tipos y ubicaciones. Por ejemplo, los tumores inoperables, aquellos cánceres que tienen mayor acceso a múltiples sistemas del cuerpo (tumores hematológicos e inmunológicos) y aquellos que son más resistentes a los tratamientos tradicionales se consideran más graves. En estas situaciones, prolongar la esperanza de vida del sujeto y/o reducir el dolor, disminuir la proporción de células cancerosas o restringir las células a un sistema y mejorar el estadio del cáncer/grado tumoral/grado histológico/grado nuclear se consideran alivio de un signo o síntoma del cáncer
Como se usa en este documento, el término "síntoma" se define como una indicación de enfermedad, dolencia, lesión o que algo no está bien en el cuerpo. Los síntomas se sienten o notan por el individuo que experimenta el síntoma, pero es posible que otros no los noten fácilmente. Otros se definen como profesionales no sanitarios.
Como se usa en este documento, el término "signo" también se define como una indicación de que algo no está bien en el cuerpo. Pero los signos se definen como cosas que pueden ser vistas por un médico, una enfermera u otro profesional de la salud.
El cáncer es un grupo de enfermedades que pueden causar casi cualquier signo o síntoma. Los signos y síntomas dependerán de la ubicación del cáncer, el tamaño del cáncer y cuánto afecta a los órganos o estructuras cercanos. Si un cáncer se propaga (hace metástasis), los síntomas pueden aparecer en diferentes partes del cuerpo.
El trastorno en el que interviene la metilación de proteínas mediada por EZH2 puede ser una enfermedad neurológica. Los compuestos descritos en este documento también se pueden usar para tratar enfermedades neurológicas tales como epilepsia, esquizofrenia, trastorno bipolar u otros trastornos psicológicos y/o psiquiátricos, neuropatías, atrofia del músculo esquelético y enfermedades neurodegenerativas, por ejemplo, una enfermedad neurodegenerativa. Las enfermedades neurodegenerativas de ejemplo incluyen: Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y enfermedad de Parkinson. Otra clase de enfermedades neurodegenerativas incluye enfermedades causadas al menos en parte por la agregación de poliglutamina. Las enfermedades de esta clase incluyen: Enfermedades de Huntington, atrofia muscular espinalbulbar (SBMA o enfermedad de Kennedy), atrofia dentatorubropalidoluisiana (DRPLA), ataxia espinocerebelosa 1 (SCA1), ataxia espinocerebelosa 2 (SCA2), enfermedad de Machado-Joseph (MJD; SCA3), ataxia espinocerebelosa 6 (SCA6 ), ataxia espinocerebelosa 7 (SCA7) y ataxia espinocerebelosa 12 (SCA12).
Cualquier otra enfermedad en la que la metilación epigenética, que está mediada por EZH2, desempeñe un papel puede tratarse o prevenirse usando composiciones y métodos descritos en este documento.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una reducción del tamaño de un tumor. Una reducción del tamaño de un tumor también puede denominarse "regresión tumoral". Preferiblemente, después del tratamiento, el tamaño del tumor se reduce en un 5 % o más con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, el tamaño del tumor se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 2 0 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; aún más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 % o más. El tamaño de un tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un tumor se puede medir como el diámetro del tumor.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una reducción del volumen del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, el volumen del tumor se reduce en un 5 % o más con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, el volumen del tumor se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 2 0 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; aún más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 % o más. El volumen del tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible.
El tratamiento del cáncer da como resultado una disminución en el número de tumores. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de tumores se reduce en un 5 % o más relativo con el número antes del tratamiento; más preferiblemente, el número de tumores se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 2 0 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; aún más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 %. El número de tumores puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El número de tumores puede medirse contando los tumores visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferiblemente, la ampliación especificada es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución del número de lesiones metastásicas en otros tejidos u órganos distantes del sitio del tumor primario. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 5 % o más con respecto al número antes del tratamiento; más preferiblemente, el número de lesiones metastásicas se reduce en un 10 % o más; más preferiblemente, reducido en un 2 0 % o más; más preferiblemente, reducido en un 30 % o más; más preferiblemente, reducido en un 40 % o más; aún más preferiblemente, reducido en un 50 % o más; y lo más preferiblemente, reducido en más del 75 %. El número de lesiones metastásicas puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El número de lesiones metastásicas puede medirse contando las lesiones metastásicas visibles a simple vista o con un aumento específico. Preferiblemente, la ampliación especificada es 2x, 3x, 4x, 5x, 10x o 50x.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe solo el portador. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia se incrementa en más de 30 días; más preferiblemente, en más de 60 días; más preferiblemente, en más de 90 días; y lo más preferiblemente, en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población de sujetos no tratados. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia se incrementa en más de 30 días; más preferiblemente, en más de 60 días; más preferiblemente, en más de 90 días; y lo más preferiblemente, en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede resultar en un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, análogo o derivado del mismo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el tiempo promedio de supervivencia se incrementa en más de 30 días; más preferiblemente, en más de 60 días; más preferiblemente, en más de 90 días; y lo más preferiblemente, en más de 120 días. Un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También puede medirse un aumento en el tiempo promedio de supervivencia de una población, por ejemplo, calculando para una población la duración promedio de supervivencia tras la finalización de una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede dar como resultado una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que solo recibe portadores. El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución de la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población no tratada. El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados en comparación con una población que recibe monoterapia con un fármaco que no es un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, análogo o derivado del mismo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la tasa de mortalidad se reduce en más del 2 %; más preferiblemente, en más del 5 %; más preferiblemente, en más del 10 %; y lo más preferiblemente, en más del 25 %. Una disminución en la tasa de mortalidad de una población de sujetos tratados puede medirse por cualquier medio reproducible. Puede medirse una disminución en la tasa de mortalidad de una población, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con enfermedades por unidad de tiempo tras el inicio del tratamiento con un compuesto activo. También se puede medir una disminución en la tasa de mortalidad de una población, por ejemplo, calculando para una población el número promedio de muertes relacionadas con enfermedades por unidad de tiempo después de completar una primera ronda de tratamiento con un compuesto activo.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución en la tasa de crecimiento del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, la tasa de crecimiento del tumor se reduce en al menos un 5 % con respecto al número antes del tratamiento; más preferiblemente, la tasa de crecimiento del tumor se reduce en al menos un 10 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 20 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 30 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 40 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, reducido en al menos un 75 %. La tasa de crecimiento del tumor puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. La tasa de crecimiento del tumor se puede medir según un cambio en el diámetro del tumor por unidad de tiempo.
El tratamiento del cáncer puede resultar en una disminución en el crecimiento del tumor. Preferiblemente, después del tratamiento, el nuevo crecimiento del tumor es inferior al 5 %; más preferiblemente, el nuevo crecimiento del tumor es inferior al 10 %; más preferiblemente, menos del 20 %; más preferiblemente, menos del 30 %; más preferiblemente, menos del 40 %; más preferiblemente, menos del 50 %; aún más preferiblemente, menos del 50 %; y lo más preferiblemente, menos del 75 %. El nuevo crecimiento del tumor se puede medir por cualquier medio de medición reproducible. El nuevo crecimiento del tumor se mide, por ejemplo, midiendo un aumento en el diámetro de un tumor después de una reducción tumoral previa que siguió al tratamiento. Una disminución en el nuevo crecimiento del tumor está indicada por la imposibilidad de que los tumores vuelvan a aparecer después de que se ha detenido el tratamiento.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la tasa de proliferación celular. Preferiblemente, después del tratamiento, la tasa de proliferación celular se reduce en al menos un 5 %; más preferiblemente, en al menos un 10 %; más preferiblemente, en al menos un 20 %; más preferiblemente, en al menos un 30 %; más preferiblemente, en al menos un 40 %; más preferiblemente, en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, en al menos un 75 %. La tasa de proliferación celular puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. La tasa de proliferación celular se mide, por ejemplo, midiendo el número de células en división en una muestra de tejido por unidad de tiempo.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una reducción en la proporción de células en proliferación. Preferiblemente, después del tratamiento, la proporción de células en proliferación se reduce en al menos un 5 %; más preferiblemente, en al menos un 10 %; más preferiblemente, en al menos un 20 %; más preferiblemente, en al menos un 30 %; más preferiblemente, en al menos un 40 %; más preferiblemente, en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, en al menos un 75 %. La proporción de células en proliferación puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. Preferiblemente, la proporción de células en proliferación se mide, por ejemplo, cuantificando el número de células en división con respecto al número de células que no se dividen en una muestra de tejido. La proporción de células en proliferación puede ser equivalente al índice mitótico.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una disminución del tamaño de un área o zona de proliferación celular. Preferiblemente, después del tratamiento, el tamaño de un área o zona de proliferación celular se reduce en al menos un 5 % con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, reducido en al menos un 10 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 2 0 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 30 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 40 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, reducido en al menos un 75 %. El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. El tamaño de un área o zona de proliferación celular puede medirse como un diámetro o ancho de un área o zona de proliferación celular.
El tratamiento o la prevención de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado una disminución en el número o la proporción de células que tienen una apariencia o morfología anormal. Preferiblemente, después del tratamiento, el número de células que tienen una morfología anormal se reduce en al menos un 5 % con respecto a su tamaño antes del tratamiento; más preferiblemente, reducido en al menos un 10 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 20 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 30 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 40 %; más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; aún más preferiblemente, reducido en al menos un 50 %; y lo más preferiblemente, reducido en al menos un 75 %. Una apariencia o morfología celular anormal puede medirse por cualquier medio de medición reproducible. Una morfología celular anormal puede medirse mediante microscopía, por ejemplo, usando un microscopio de cultivo de tejido invertido. Una morfología celular anormal puede tomar la forma de pleomorfismo nuclear.
Como se usa en este documento, el término "selectivamente" significa que tiende a ocurrir con mayor frecuencia en una población que en otra población. Las poblaciones comparadas pueden ser poblaciones celulares. Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, actúa selectivamente sobre una célula cancerosa o precancerosa pero no sobre una célula normal. Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, actúa selectivamente para modular una diana molecular.
(por ejemplo, una proteína diana metiltransferasa), pero no modula significativamente otra diana molecular (por ejemplo, una proteína metiltransferasa no diana). La divulgación también proporciona un método de inhibición selectiva de la actividad de una enzima, tal como una proteína metiltransferasa. Preferiblemente, un evento ocurre selectivamente en la población A con respecto a la población si ocurre más de dos veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Un evento ocurre selectivamente si ocurre más de cinco veces más frecuentemente en la población A. Un evento ocurre selectivamente si ocurre más de diez veces más frecuentemente en la población A; más preferiblemente, más de cincuenta veces; aún más preferiblemente, más de 100 veces; y lo más preferiblemente, más de 1000 veces más frecuentemente en la población A en comparación con la población B. Por ejemplo, se diría que la muerte celular ocurre selectivamente en las células cancerosas si ocurriera con más del doble de frecuencia en las células cancerosas en comparación con las células normales.
Como se describe en este documento, una composición que comprende un compuesto de fórmula (44) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los otros agentes terapéuticos, puede modular la actividad de una diana molecular (por ejemplo, una proteína diana metiltransferasa). La modulación se refiere a estimular o inhibir una actividad de una diana molecular. Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular al menos dos veces con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones pero careciendo solamente de la presencia de dicho compuesto. Más preferiblemente, un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, modula la actividad de una diana molecular si estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones pero careciendo solamente de la presencia de dicho compuesto. La actividad de una diana molecular puede medirse por cualquier medio reproducible. La actividad de una diana molecular puede medirse in vitro o in vivo. Por ejemplo, la actividad de una diana molecular puede medirse in vitro mediante un ensayo de actividad enzimática o un ensayo de unión al ADN, o puede medirse la actividad de una diana molecular in vivo analizando la expresión de un gen indicador.
Una composición de la presente invención no modula significativamente la actividad de una diana molecular si la adición del compuesto no estimula o inhibe la actividad de la diana molecular en más del 10 % con respecto a la actividad de la diana molecular en las mismas condiciones pero careciendo solamente de la presencia de dicho compuesto.
Como se usa en este documento, el término "selectivo de isoenzimas" significa inhibición o estimulación preferencial de una primera isoforma de una enzima en comparación con una segunda isoforma de una enzima (por ejemplo, inhibición o estimulación preferencial de una proteína metiltransferasa isoenzima alfa en comparación con una proteína metiltransferasa isoenzima beta). Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, demuestra una diferencia mínima de cuatro veces, preferiblemente una diferencia de diez veces, más preferiblemente una diferencia de cincuenta veces, en la dosificación requerida para lograr un efecto biológico. Preferiblemente, un compuesto descrito en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, demuestra esta diferencia en todo el intervalo de inhibición, y la diferencia se ejemplifica en la IC50, es decir, una inhibición del 50 %, para una diana molecular de interés.
La administración de una composición de la presente invención a una célula o a un sujeto que la necesite puede resultar en la modulación (es decir, estimulación o inhibición) de una actividad de una proteína metiltransferasa de interés.
La administración de una composición que comprende un compuesto de fórmula (44) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y los otros agentes terapéuticos, a una célula o a un sujeto que lo necesita da como resultado la modulación (es decir, estimulación o inhibición) de una actividad de una diana intracelular (por ejemplo, sustrato). Varias dianas intracelulares pueden modularse con los compuestos de la presente invención, incluyendo, pero sin limitarse a, la proteína metiltransferasa.
Activar se refiere a colocar una composición de materia (por ejemplo, proteína o ácido nucleico) en un estado apropiado para llevar a cabo una función biológica deseada. Una composición de materia capaz de activarse también tiene un estado inactivo. Una composición de materia activada puede tener una función biológica inhibitoria o estimulante, o ambas.
La elevación se refiere a un aumento en la actividad biológica deseada de una composición de materia. (por ejemplo, una proteína o un ácido nucleico). La elevación puede ocurrir a través de un aumento en la concentración de una composición de materia.
Como se usa en este documento, "una ruta de punto de control del ciclo celular" se refiere a una ruta bioquímica que está implicada en la modulación de un punto de control del ciclo celular. Una ruta de punto de control del ciclo celular puede tener efectos estimulantes o inhibidores, o ambos, en una o más funciones que comprenden un punto de control del ciclo celular. Una ruta de punto de control del ciclo celular se compone de al menos dos composiciones de materia, preferiblemente proteínas, las cuales contribuyen a la modulación de un punto de control del ciclo celular. Una ruta del punto de control del ciclo celular puede activarse mediante la activación de uno o más miembros de la ruta del punto de control del ciclo celular. Preferiblemente, una ruta de punto de control del ciclo celular es una ruta de señalización bioquímica.
Como se usa en este documento, "regulador del punto de control del ciclo celular" se refiere a una composición de materia que puede funcionar, al menos en parte, en la modulación de un punto de control del ciclo celular. Un regulador del punto de control del ciclo celular puede tener efectos estimulantes o inhibidores, o ambos, en una o más funciones que comprenden un punto de control del ciclo celular. Un regulador del punto de control del ciclo celular puede ser una proteína o no una proteína.
El tratamiento del cáncer o de un trastorno de proliferación celular puede dar como resultado la muerte celular y, preferiblemente, la muerte celular da como resultado una disminución de al menos un 10 % en el número de células en una población. Más preferiblemente, muerte celular significa una disminución de al menos un 20 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 30 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 40 %; más preferiblemente, una disminución de al menos el 50 %; lo más preferiblemente, una disminución de al menos el 75 %. El número de células en una población puede medirse por cualquier medio reproducible. Se puede medir un número de células en una población mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), microscopía de inmunofluorescencia y microscopía óptica. Los métodos de medición de la muerte celular son los que se muestran en Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 100(5): 2674-8, 2003. En un aspecto, la muerte celular se produce por apoptosis.
Preferiblemente, una cantidad eficaz de una composición de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, no es significativamente citotóxica para las células normales. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto no es significativamente citotóxica para las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente eficaz no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. Una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto no afecta significativamente a la viabilidad de las células normales si la administración del compuesto en una cantidad terapéuticamente eficaz no induce la muerte celular en más del 10 % de las células normales. En un aspecto, la muerte celular se produce por apoptosis.
Poner en contacto una célula con una composición de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede inducir o activar selectivamente la muerte celular en células cancerosas. Administrar a un sujeto que lo necesite un compuesto descrito en este documento, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede inducir o activar selectivamente la muerte celular en células cancerosas. Poner en contacto una célula con una composición de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, puede inducir selectivamente la muerte celular en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular. Preferiblemente, la administración a un sujeto que lo necesite de una composición de la presente invención, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, induce selectivamente la muerte celular en una o más células afectadas por un trastorno de proliferación celular.
En este documento se describe un método de tratamiento o prevención del cáncer mediante la administración de una composición descrita en este documento, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato del mismo farmacéuticamente aceptable, a un sujeto que lo necesite, donde la administración de la composición de la presente invención, o una sal, profármaco, metabolito, polimorfo o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, da como resultado uno o más de los siguientes: prevención de la proliferación de células cancerosas mediante la acumulación de células en una o más fases del ciclo celular (por ejemplo, G1, G1/S, G2 /M), o inducción de senescencia celular, o promoción de diferenciación de células tumorales; promoción de la muerte celular en células cancerosas a través de citotoxicidad, necrosis o apoptosis, sin una cantidad significativa de muerte celular en células normales, actividad antitumoral en animales con un índice terapéutico de al menos 2. Como se usa en este documento, "índice terapéutico" es la dosis máxima tolerada dividida por la dosis eficaz.
Un experto en la técnica puede consultar los textos de referencia general para obtener descripciones detalladas de técnicas conocidas discutidas en este documento o técnicas equivalentes. Estos textos incluyen Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (2005); Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2000); Coligan et al., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, N.Y.; Enna et al., Current Protocols in Pharmacology, John Wiley & Sons, N.Y.; Fingl et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics (1975), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, 18th edition (1990). Por supuesto, también se puede hacer referencia a estos textos al hacer o usar un aspecto de la invención.
Ejemplo 1: Síntesis de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil -4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida
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Etapa 1: Síntesis del ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico
Brv
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0 2
A una solución agitada del ácido 2-metil-3-nitrobenzoico (100 g, 552 mmol) en H2SO4 conc. (400 mL), se le agregó 1,3-dibromo-5,5-dimetil-2,4-imidazolidindiona ( 88 g, 308 mmol) en porciones a temperatura ambiente y luego la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 5 horas La mezcla de reacción se vertió sobre agua helada, el sólido precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó al vacío para proporcionar el compuesto deseado como un sólido (140 g, 98 %). El compuesto aislado se llevó directamente a la siguiente etapa. 1H RMN (DMSO-cfó, 400 MHz) 8 8.31 (s, 1H), 8.17 (s, 1H), 2.43 (s, 3H).
Etapa 2: Síntesis del 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo
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A una solución agitada de ácido 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoico (285 g, 1105 mmol) en DMF (2.8 L) a temperatura ambiente, se le agregó carbonato de sodio (468 g, 4415 mmol) seguido de la adición de yoduro de metilo (626,6 g, 4415 mmol). La mezcla de reacción resultante se calentó a 60 °C, durante 8 h. Una vez completada (controlada por TLC), la mezcla de reacción se filtró (para eliminar el carbonato de sodio) y se lavó con acetato de etilo (1 L x 3). El filtrado combinado se lavó con agua (3 L x 5) y la fase acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo (1 L x 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida para proporcionar el compuesto base como un sólido (290 g, 97 % de rendimiento). El compuesto aislado se llevó directamente a la siguiente etapa. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 8 8.17 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 3.96 (s, 3H), 2.59 (s, 3H).
Etapa 3: Síntesis del 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo
Figure imgf000038_0004
A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-nitrobenzoato de metilo (290 g, 1058 mmol) en etanol (1.5 L) se le agregó cloruro de amonio acuoso (283 g, 5290 mmol disuelto en 1.5 L de agua). La mezcla resultante se agitó a 80 °C a la que se le agregó polvo de hierro (472 g, 8451 mmol) en porciones. La mezcla de reacción resultante se calentó a 80 °C, durante 12 h. Una vez completada según lo determinado por TLC, la mezcla de reacción se filtró en caliente sobre celite® y el lecho de celite se lavó con metanol (5 L) seguido de lavado con MeOH al 30 % en DCM (5 L). El filtrado combinado se concentró al vacío, el residuo obtenido se diluyó con solución acuosa de bicarbonato de sodio (2 L) y se extrajo con acetato de etilo (5 L X 3). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida para dar el compuesto base como un sólido (220 g, 85 %). El compuesto se llevó directamente a la siguiente etapa. 1H RMN (CDCla, 400 MHz) 8 7.37 (s, 1H), 6.92 (s, 1H), 3.94 (s, 3H), 3.80 (bs, 2H), 2.31 (s, 3H).
Etapa 4: Síntesis del 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo
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A una solución agitada de 3-amino-5-bromo-2-metilbenzoato de metilo (15 g, 61.5 mmol) y dihidro-2H-piran-4(3)-ona (9.2 g, 92 mmol) en dicloroetano (300 mL) se le agregó ácido acético (22 g, 369 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego la mezcla de reacción se enfrió a 0 °C y se agregó triacetoxiborohidruro de sodio (39 g, 184 mmol). La mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción determinada por TLC, se agregó solución acuosa de bicarbonato de sodio a la mezcla de reacción hasta que se obtuvo un pH de 7-8. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100-200) eluyendo con acetato de etilo:hexano para proporcionar el compuesto deseado como un sólido (14 g, 69 %). 1H RMN (DMSO-de, 400 MHz) 6 7.01 (s, 1H), 6.98 (s, 1H), 5.00 (d, 1H, J=7.6 Hz), 3.84-3.87 (m, 2H), 3.79 (s, 3H), 3.54-3.56 (m, 1H), 3.43 (t, 2H, J=12 Hz), 2.14 (s, 3H), 1.81-1.84 (m, 2H), 1.47-1.55 (m, 2H).
Etapa 5: Síntesis del 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato de metilo
Figure imgf000039_0002
A una solución agitada de 5-bromo-2-metil-3-((tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)benzoato de metilo (14 g, 42.7 mmol) en dicloroetano (150 mL) se le agregó acetaldehído (3.75 g, 85.2 mmol) y ácido acético (15.3 g, 256 mmol). La mezcla de reacción resultante se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos. La mezcla se enfrió a 0 °C y se agregó triacetoxiborohidruro de sodio (27 g, 128 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. Una vez completada la reacción según lo determinado por TLC, se agregó solución acuosa de bicarbonato de sodio a la mezcla de reacción hasta que se obtuvo un pH de 7-8, se separó la fase orgánica y se extrajo la fase acuosa con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice de malla 1 00 -2 0 0 ) eluyendo con acetato de etilo:hexano para proporcionar el compuesto deseado como un líquido viscoso (14 g, 93 %). 1H RMN (DMSO-de, 400 MHz) 6 7.62 (s, 1H), 7.52 (s, 1H), 3.80 (bs, 5H), 3.31 (t, 2H), 2.97-3.05 (m, 2H), 2.87-2.96 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 1.52-1.61 (m, 2H), 1.37-1.50 (m, 2H), 0.87 (t, 3H, J=6 . 8 Hz).
Etapa 6 : Síntesis de la 5-bromo-N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-2 -metilbenzamida
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A una solución agitada de 5-bromo-3-(etil(tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-2-metilbenzoato (14 g, 39.4 mmol) en etanol (100 mL) se le agregó NaOH acuoso (2.36 g, 59.2 mmol en 25 mL de agua) y la mezcla resultante se agitó a 60 °C, durante 1 h. Una vez completada la reacción según lo determinado por TLC, se eliminó el solvente a presión reducida y el residuo obtenido se acidificó con HCl 1 N hasta obtener un pH de 7 y luego se agregó solución acuosa de ácido cítrico hasta obtener un pH de 5-6. La capa acuosa se extrajo con MeOH al 10 % en DCM (200 mL x 3), las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y concentraron a presión reducida para dar el ácido respectivo (14 g, 100 %).
Luego se disolvió el ácido anterior (14 g, 40.9 mmol) en DMSO (70 mL) y se le agregó 3-(aminometil)-4,6-dimetilpiridin-2(1H)-ona (12.4 g, 81.9 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 15 minutos, luego se agregó PYBOP (31.9 g, 61.4 mmol) y se continuó agitando durante la noche a temperatura ambiente. Una vez completada la reacción según lo determinado por TLC, la mezcla de reacción se vertió en agua helada (700 mL), se agitó durante 30 minutos y el sólido precipitado se recogió por filtración, se lavó con agua (500 mL) y se secó al aire. El sólido obtenido se agitó con acetonitrilo (75 mL x 2), se filtró y se secó al aire. El sólido obtenido se agitó de nuevo con MeOH al 5 % en DCM (100 mL), se filtró y se secó completamente al vacío para proporcionar el compuesto base como un sólido (14 g, 74 %). 1H RMN (DMSO-de, 400 MHz) 6 11.47 (s, 1H), 8.23 (t, 1H), 7.30 (s, 1H), 7.08 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.23 (d, 2H, J=4.4 Hz), 3.81 (d, 2H, J=10.4 Hz), 3.20-3.26 (m, 2H), 3.00-3.07 (m, 1H), 2.91-2.96 (m, 2H), 2.18 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.58-1.60 (m, 2H), 1.45-1.50 (m, 2H), 0.78 (t, 3H, J=6.8 Hz).
Etapa 7: Síntesis de la N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1, 1'-bifenil]-3-carboxamida
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A una solución agitada de 5-bromo-N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)-3-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-ilo) amino)-2-metilbenzamida (14 g, 29.5 mmol) en una mezcla de dioxano/agua (70 mL/14 mL) se le agregó 4-(4-(4, 4, 5, 5-tetrametil-1, 3, 2- dioxaborolan-2-il) bencil) morfolina (13.4 g, 44.2 mmol) seguido de la adición de Na2 CO3 (11.2 g, 106.1 mmol). La solución se purgó con argón durante 15 minutos y luego con Pd (PPh3 ) 4 (3.40 g, 2.94 mmol) y la solución se purgó de nuevo con argón durante 10 min más. La mezcla de reacción se calentó a 100 °C, durante 4 h. Una vez completada (controlada por TLC), la mezcla de reacción se diluyó con agua y se extrajo con MeOH al 10 %/DCM. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. El compuesto en bruto se purificó mediante cromatografía en columna (gel de sílice de malla 100­ 200) eluyendo con metanol: DCM al compuesto base como un sólido (12 g, 71 %). Datos analíticos: LCMS: 573.35 (M 1)+; HpLC: 99.5 % (@ 254 nm) (Rí;3.999; Método: Columna: YMC ODS-A 150 mm * 4.6 mm * 5 p; Fase móvil: A; TFA al 0.05 % en agua/B; TFA al 0.05 % en acetonitrilo; Vol. de inyección: 10 pL, temperatura de col.: 30 °C; Velocidad de flujo: 1.4 mL/min.; Gradiente: 5 % B a 95 % B en 8 min, Mantener durante 1.5 min, 9.51-12 min 5 % B); 1H RMN (DMSO-de, 400 MHz) 611.46 (s, 1H), 8.19 (t, 1H), 7.57 (d, 2H, J=7.2 Hz), 7.36-7.39 (m, 3H), 7.21 (s, 1H), 5.85 (s, 1H), 4.28 (d, 2H, J=2.8 Hz), 3.82 (d, 2H, J=9.6 Hz), 3.57 (bs, 4H), 3.48 (s, 2H), 3.24 (t, 2H, J=10.8Hz), 3.07-3.09 (m, 2H), 3.01 (m, 1H), 2.36 (m, 4H), 2.24 (s, 3H), 2.20 (s, 3H), 2.10 (s, 3H), 1.64-1.67 (m, 2H), 1.51-1.53 (m, 2H), 0.83 (t, 3H, J=6.4 Hz).
Etapa 8: Síntesis de N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il)metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il)amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1,1'-bifenil]-3-carboxamida trihidrocloruro
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Se disolvió la N-((4, 6-dimetil-2-oxo-1,2-dihidropiridin-3-il) metil)-5-(etil (tetrahidro-2H-piran-4-il) amino)-4-metil-4'-(morfolinometil)-[1, 1'-bifenil]-3-carboxamida (12 g, 21,0 mmol) en HCl metanólico (200 ml) y se agitó a temperatura ambiente durante 3 h. Después de tres horas de agitación, la mezcla de reacción se concentró a presión reducida. El sólido obtenido se agitó con éter (100 mL x 2) para proporcionar la sal deseada como un sólido (11 g, 77 %). Datos analíticos de la sal tri-HCl: LCMS: 573.40 (M 1)+; HPLC: 99.1 %(@ 254 nm) (Rí;3.961; Método: Columna: YMC ODS-A 150 mm * 4.6 mm * 5 p; Fase móvil: A; TFA al 0.05 % en agua/B; TFA al 0.05 % en acetonitrilo; inyección Vol: 10 pL, temperatura col.: 30 °C; Velocidad de flujo: 1.4 mL/min.; Gradiente: 5 % de B a 95 % de B en 8 min, Mantener durante 1.5 min, 9.51-12 min 5 % de B); 1H RMN (D2O 400 MHz) 67.92 (bs, 1H,) 7.80 (s, 1H), 7.77 (d, 2H, J=8 Hz), 7.63 (s, 1H), 7.61 (s, 1H), 6.30 (s, 1H), 4.48 (s, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.09-4.11 (m, 4H), 3.95-3.97 (m, 2H), 3.77 (t, 3H, J=10.4 Hz), 3.44-3.47 (m, 3H), 3.24-3.32 (m, 3H), 2.42 (s, 3H), 2.35 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.01 (m, 2H), 1.76 (m, 2H), 1.04 (t, 3H, J=6.8 Hz).
Ejemplo 2: Terapia de combinación del compuesto 44 y los componentes CHOP.
Las líneas celulares de linfoma humano WSU-DLCL2 (DSMZ; ACC 575), OCI-Ly19 (DSMZ; ACC 528), RL (ATCC; CRL-2261) se obtuvieron de las fuentes indicadas y se mantuvieron en medio RPMI-1640 complementado con suero bovino fetal al 10 % y glutamina 2 mM. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % de aire.
Se investigó el efecto de la terapia de combinación del compuesto 44 con cada componente individual de CHOP (ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisolona) sobre la viabilidad de las células cancerosas in vitro. El programa de dosificación se representa en la figura 1A. Se trataron células de linfoma humano WSU-DLCL2 con concentraciones crecientes del compuesto 44. Después de 4 días, se administró a las células una combinación de concentraciones crecientes del compuesto 44 y cada componente CHOP. Después de 4 días, se determinó la viabilidad celular usando el reactivo Millipore Guava ViaCount y análisis de citometría de flujo. El porcentaje de células viables para cada muestra se normalizó al porcentaje de células viables para las muestras tratadas con DMSO dentro de cada grupo de concentración del compuesto 44.
Las células tratadas con el compuesto 44 y solo los componentes CHOP mostraron una disminución en la viabilidad celular. Las células tratadas con el compuesto 44 con Mafofsamida (metabolito de ciclofosfamida) (Figura 2A) y Doxorrubicina (Figura 2B) no exhibieron una viabilidad celular reducida a concentraciones crecientes de Mafofsamida o Doxorrubicina. La terapia de combinación del compuesto 44 con Vincristina (Figura 2C) mostró una viabilidad celular reducida en la concentración más alta del compuesto 44. Es importante destacar que la terapia de combinación que usa el compuesto 44 y prednisolona (metabolito de Prednisona) (Figura 2D) mostró una reducción sinérgica en la viabilidad celular en las 2 dosis más altas del compuesto 44 y todas las dosis de prednisolona.
Ejemplo de referencia 3: Los efectos sinérgicos de la terapia combinada del compuesto 44 y prednisolona dependen del programa de dosificación.
Para investigar el papel del momento de la administración del compuesto 44 y la prednisolona en la viabilidad celular, las células WSU-DlCL2 se trataron con diferentes programas de dosificación, como se representa en la figura 1. La viabilidad celular se determinó mediante tinción con reactivo Millipore Guava ViaCount y luego se analizó mediante citometría de flujo.
La administración del compuesto 44 antes de la coadministración del compuesto 44 y prednisolona dio como resultado una viabilidad celular reducida (Figura 3A). Células tratadas como se representa en la figura 1A. La viabilidad celular se normalizó a la muestra de DMSO/DMSO, revelando así el efecto del tratamiento con solo el compuesto 44. Las concentraciones crecientes del compuesto 44 dieron como resultado una reducción del crecimiento celular. Es importante señalar que el aumento de las concentraciones de prednisolona en combinación con el compuesto 44 dio como resultado una reducción adicional del crecimiento celular en comparación con el tratamiento de las células con el compuesto 44 o la prednisolona de forma independiente como agentes únicos. Por lo tanto, la terapia de combinación del compuesto 44 y prednisolona, en la que el compuesto 44 se administra primero, provoca un efecto sinérgico de reducción de la viabilidad de las células cancerosas.
La administración del compuesto 44 antes de la administración de prednisolona dio como resultado una viabilidad celular reducida (Figura 3B). Las células se trataron como se representa la figura 1B. La viabilidad celular se normalizó a la muestra tratada con DMSO para cada grupo de concentración del compuesto 44. El tratamiento con concentraciones crecientes de prednisolona como agente único después de una administración previa del compuesto 44 también resultó en una reducción adicional de la viabilidad celular en comparación con las células tratadas solo con prednisolona, demostrando así el efecto sinérgico de la terapia de combinación con el compuesto 44 y prednisolona.
La administración de prednisona antes de la coadministración del compuesto 44 y prednisolona no redujo la viabilidad celular (Figura 3C). Las células se trataron como se representa la figura 1C. La viabilidad celular se normalizó a la muestra tratada con DMSO para cada grupo de concentración del compuesto 44. Estos resultados demostraron que la administración de prednisolona antes del tratamiento con una composición que comprende el compuesto 44 y prednisolona no provocó un efecto sinérgico sobre la viabilidad celular.
Estos datos muestran claramente que la terapia de combinación del compuesto 44 y prednisolona disminuye la viabilidad de las células cancerosas o induce la muerte de las células cancerosas. Específicamente, la terapia de combinación en la que las células se tratan con el compuesto 44 antes del tratamiento con prednisolona o una combinación de prenisolona y el compuesto 44 da como resultado un efecto sinérgico sobre la viabilidad celular, en el que la reducción de la viabilidad celular es mayor que la inducida por el tratamiento con prednisolona o el compuesto 44 como agentes únicos.
Ejemplo de referencia 4: La combinación del compuesto 44 y la prednisolona depende de la mutación EZH2.
Se analizaron diferentes líneas celulares de cáncer de linfoma humano que albergaban diferentes mutaciones EZH2 en cuanto a su capacidad de respuesta al compuesto 44 y prednisolona. Las células se trataron con programas de dosificación como en la figura 1A, donde las células se tratan primero con el compuesto 44 y luego, después de 4 días, se tratan con una combinación del compuesto 44 y prednisolona. La viabilidad celular se determinó 4 días después usando el reactivo Millipore Guava ViaCount y análisis de citometría de flujo. El porcentaje de viabilidad celular se normalizó al porcentaje de la muestra tratada con DMSO.
Las células de linterna que expresan EZH2 de tipo salvaje (WT), línea celular OCI-LY19, son resistentes al tratamiento con inhibidores de EZH2. De acuerdo con lo anterior, el tratamiento con concentraciones crecientes del compuesto 44 no afecta a la viabilidad celular. El aumento de las concentraciones de prednisolona no tiene un efecto adicional o sinérgico sobre la viabilidad celular (Figura 4A).
Las células WSU-DLCL2 que albergan una mutación Y641F son sensibles al tratamiento con inhibidores de EZH2, como lo demuestra una disminución de la viabilidad celular a concentraciones crecientes del compuesto 44 cuando se administra como agente único. Además, cuando se tratan en combinación con prednisolona, las células exhiben una viabilidad celular reducida (Figura 4B).
Las células RL albergan una mutación Y641N y son resistentes al tratamiento con inhibidores de EZH2. La administración de concentraciones crecientes de solo el compuesto 44 no da como resultado una reducción de la viabilidad celular. Sin embargo, la coadministración del compuesto 44 con prednisolona dio como resultado un efecto sinérgico, en el que la viabilidad celular disminuyó más que la observada cuando el compuesto 44 y la prednisolona se administraron como agentes únicos (Figura 4C).
Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la terapia de combinación con el compuesto 44 y la prednisolona puede dar como resultado un efecto sinérgico en la reducción de la viabilidad de las células cancerosas y el aumento de la muerte de las células cancerosas en las células que expresan una EZH2 mutante. Además, las células que son resistentes a cualquier fármaco, el compuesto 44 o la prednisolona, cuando se administran como agente único, se vuelven sensibles al tratamiento combinado y se reduce la viabilidad celular.
Ejemplo 5: Análisis farmacocinético de la coadministración del compuesto 44 y los componentes CHOP in vivo.
Se realizó un análisis farmacocinético del compuesto 44 en combinación con cada uno de los componentes CHOP (ciclofosfamida, vincristina, doxorrubicina y prednisolona) para determinar la absorción o distribución del compuesto 44 in vivo. Se obtuvieron machos BALB/c de entre 8-12 semanas de edad y con un peso de 20 a 40 g de in vivo, Bengaluru, India. A los animales se les administró uno de los componentes CHOP como agente único o en combinación con el compuesto 44. La ciclofosfamida se administró mediante inyección intraperitoneal a 30 mg/kg. La vincristina se administró por inyección intravenosa a 0.375 mg/kg. La doxorrubicina se administró por inyección intravenosa a 2.475 mg/kg. La prednisolona se administró por vía oral a 0.15 mg/kg. El compuesto 44 se administró a 225 mg/kg por administración oral. Se tomaron muestras de plasma en diversos puntos de tiempo durante un transcurso de 24 horas después de la administración.
El procedimiento de extracción para las muestras de estudio de plasma o los estándares de calibración de plasma enriquecidos fue idéntico: Se agregó una muestra de 25 pl de la muestra ya sea de estudio o del estándar de calibración enriquecido a tubos de microcentrífuga individuales preetiquetados. Luego se agregó un volumen de 100 pL de IS (Glipizide, 500 ng/mL) preparado en ACN a los tubos de microcentrífuga, excepto en la muestra en blanco donde se agregó acetonitrilo y se agitó con vórtex durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron durante 10 minutos a una velocidad de 15000 rpm (20600 g) a 4 °C. Después de la centrifugación, se tomaron muestras de 100 pl del sobrenadante de cada tubo de centrífuga y se transfirieron a viales de inserción. Estos viales se cargaron en un muestreador automático para el análisis LC/MS/MS. Los estándares de calibración se prepararon agregando 10 pL de analito (Compuesto 44, ciclofosfamida, doxorrubicina, vincristina y prednisolona) en 190 pL de plasma de ratón en blanco.
Módulo de análisis no compartimental en WinNonlin® (Versión 5.2) para evaluar los parámetros farmacocinéticos. Las áreas bajo la curva de tiempo de concentración (AUC) se calcularon por regla trapezoidal lineal. La proporción (AUCcombinación/AUCúnico) de AUC para la terapia de combinación del compuesto 44 con cada componente de CHOP (AUCcombinación) al AUC de cada componente CHOP solo (AUCúnico) e indicó una biodisponibilidad similar cuando los componentes CHOP se administraron solo o con el compuesto 44.
Ejemplo 6 : Análisis de la terapia combinada del compuesto 44 y CHOP en modelos de xenoinjerto de ratón.
Ratones
Ratones Fox Chase SCID® hembra (CB17/Icr-PrkdCscid/IcrIcoCrl, Charles River Laboratories) o ratones desnudos atímicos (Crl:NU(Ncr)-Foxnínu, Charles River Laboratories) tenían 8 semanas de edad y un intervalo de peso corporal (PC) de 16.0 a 21.1 g el día 1 del estudio. Los animales fueron alimentados ad libitum de agua (ósmosis inversa 1 ppm Cl) y Lab Diet® NIH 31 modificada e irradiada compuesta por 18.0 % de proteína bruta, 5.0 % de grasa bruta y 5.0 % de fibra bruta. Los ratones se alojaron sobre un lecho de Enrich-o'cobs™ irradiado en microaisladores estáticos en un ciclo de luz de 12 horas a 20-22 °C (68-72 °F) y 40-60 % de humedad. Todos los procedimientos cumplen con las recomendaciones de the Guide for Care and Use of Laboratory Animals con respecto a la inmovilización, la cría, los procedimientos quirúrgicos, la regulación de alimentos y líquidos, y la atención veterinaria.
Cultivo de células tumorales
Las líneas celulares de linfoma humano se obtuvieron de diferentes fuentes (ATCC, DSMZ) y se mantuvieron en Piedmont como cultivos en suspensión en medio RPMI-1640 que contenía 100 unidades/mL de sal sódica de penicilina G, 100 g/mL de estreptomicina y 25 g/mL de gentamicina. El medio se complementó con suero bovino fetal al 10 % y glutamina 2 mM. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % aire.
Implantación de tumores in vivo
Las líneas celulares de linfoma humano se recolectaron durante el crecimiento de la fase logarítmica media y se volvieron a suspender en PBS con Matrigel™ al 50 % (BD Biociencias). Cada ratón recibió 1 * 107 células (0.2 mL de suspensión celular) por vía subcutánea en el flanco derecho. Los tumores se calibraron en dos dimensiones para controlar el crecimiento a medida que el volumen medio se acercaba al intervalo 80-120 mm3 deseado. El tamaño del tumor, en mm3, se calculó a partir de:
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donde w = ancho y l = longitud, en mm, del tumor. El peso del tumor se puede estimar asumiendo que 1 mg es equivalente a 1 mm3 de volumen del tumor. Después de 10-30 días (dependiendo de la línea celular usada) los ratones con tumores de 108-126 mm3 se clasificaron en grupos de tratamiento con volúmenes medios del tumor de 117-119 mm3.
Artículos de prueba
Los compuestos de fórmula (IIa) se almacenaron a temperatura ambiente y se protegieron de la luz. En cada día de tratamiento, se prepararon formulaciones de compuestos frescos suspendiendo los polvos en carboximetilcelulosa sódica al 0.5 % (NaCMC) y Tween® 80 al 0.1 % en agua desionizada. El vehículo del compuesto 44, 0.5 % de NaCMC y 0.1 % de Tween® 80 en agua desionizada, se usó para tratar los grupos de control en los mismos horarios. Las formulaciones se almacenaron protegidas de la luz a 4 °C antes de la administración.
Se usaron varios productos quimioterapéuticos en paralelo a los compuestos de Epizyme. La ciclofosfamida (Baxter, lote No. 016591) se reconstituyó a 20 mg/mL con solución salina estéril y se almacenó a 4 °C. Se preparó una solución de dosificación nueva para cada dosis mediante dilución con solución salina. La doxorrubicina (doxorrubicina Meiji®, Meiji Pharmaceutical Co. Ltd., 1 mg/mL) se almacenó a 4 °C y se diluyó con solución salina cada día de tratamiento. La vincristina (Hospira, Inc., 1 mg/mL) se diluyó con solución salina cada día de tratamiento. La prednisona (Boehringer Ingelheim GmbH, 1 mg/mL) se diluvó con p Bs al comienzo de cada ciclo de dosificación de 5 días.
Plan de tratamiento
Los ratones se trataron con dosis compuestas que oscilaban entre 75 y 600 mg/kg y con programas TID (3 veces al día cada 8 h), BID (dos veces al día cada 12 h) o QD (una vez al día) durante diversos días. por sonda oral o inyecciones por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea. Cada dosis se administró en un volumen de 0.2 mL/20 g de ratón (10 mL/kg) y se ajustó al último peso registrado de los animales individuales. La duración máxima del tratamiento fue de 28 días.
Análisis de la mediana del volumen del tumor (MTV) y la inhibición del crecimiento del tumor (TGI)
La eficacia del tratamiento se determinó el último día de tratamiento. Para cada grupo se determinó MTV(n), la mediana del volumen del tumor para el número de animales, n, evaluable el último día. El porcentaje de inhibición del crecimiento del tumor (% de TGI) se puede definir de varias maneras. En primer lugar, la diferencia entre el MTV(n) del grupo de control designado y el MTV(n) del grupo tratado con fármacos se expresa como porcentaje del MTV(n) del grupo de control:
Figure imgf000043_0002
Otra forma de calcular el % de TGI es tener en cuenta el cambio del tamaño del tumor del día 1 al día n, siendo n el último día de tratamiento.
Figure imgf000043_0003
AMTVc^,ro. = MTV(n)co„tro{- MTV{Í ) COKr,Cl
* “ T v tratado ~ M T H n ) tratado ~ “ T V W tratado
Análisis de retraso del crecimiento del tumor
Alternativamente, los ratones se mantuvieron vivos después del último día de tratamiento para el análisis del retraso del crecimiento del tumor. Los tumores se calibraron dos veces por semana y cada animal de prueba se sacrificó cuando su neoplasia alcanzó el volumen de punto final de 2 0 0 0 mm3 o en el último día preespecificado del estudio, lo que ocurriera primero. El tiempo hasta el punto final (TTE) para cada ratón se calculó a partir de la siguiente ecuación:
Figure imgf000044_0001
donde b es la intersección y m es la pendiente de la línea obtenida por regresión lineal de un conjunto de datos de crecimiento del tumor transformado logarítmicamente. Los conjuntos de datos estaban compuestos por la primera observación que superó el volumen del punto final del estudio y las tres observaciones consecutivas que precedieron inmediatamente al logro del volumen del punto final. A los animales que no alcanzaron el punto final de volumen se les asignó un valor de TTE igual al último día del estudio (preespecificado). A cualquier animal clasificado como muerte relacionada con el tratamiento (TR) se le asignaría un valor de TTE igual al día de la muerte. Cualquier animal clasificado como muerte no relacionada con el tratamiento (NTR) se excluyó de los cálculos de TTE y de todos los análisis posteriores.
El resultado del tratamiento se determinó a partir del retraso del crecimiento del tumor (TGD), definido como el aumento de la mediana de TTE en un grupo de tratamiento en comparación con el grupo de control:
TGD — T — C
expresado en días, o como porcentaje de la mediana de TTE del grupo de control:
Figure imgf000044_0002
100
dónde:
'i ' = mediana de TTE zara w grupo de tratan eito
C = mediana de TTE para e grupo de Mitro
Toxicidad
Los animales se pesaron diariamente en los días 1-5 y luego dos veces por semana hasta la finalización del estudio. Los ratones se examinaron con frecuencia en busca de signos evidentes de cualquier efecto secundario adverso relacionado con el tratamiento, que se documentaron. La toxicidad aceptable para la dosis máxima tolerada (MTD) se definió como una pérdida de PC media del grupo de menos del 20 % durante la prueba y no más del 10 % de mortalidad debido a muertes por TR. Una muerte se clasificaría como TR si era atribuible a efectos secundarios del tratamiento evidenciados por signos clínicos y/o necropsia, o debido a causas desconocidas durante el período de dosificación. Una muerte debía clasificarse como NTR si había evidencia de que la muerte no estaba relacionada con los efectos secundarios del tratamiento. Las muertes por NTR durante el intervalo de dosificación por lo general se clasificarían como NTRa (debido a un accidente o error humano) o NTRm (debido a la diseminación tumoral confirmada por necropsia por invasión y/o metástasis). Los animales tratados por vía oral que mueren por causas desconocidas durante el período de dosificación pueden clasificarse como NTRu cuando el desempeño del grupo no respalda una clasificación de TR y la necropsia, para descartar un error de dosificación, no es factible.
Muestreo
Durante varios días durante el estudio, se tomaron muestras de los ratones de una manera preespecificada. El muestreo incluyó hemorragias no terminales (0.25 mL) de la vena mandibular sin anestesia y extracción de sangre de volumen completo mediante punción cardíaca terminal bajo anestesia con CO2. Las muestras de sangre fueron procesadas para plasma, con K2-EDTA como anticoagulante. Las muestras de plasma se congelaron a -80 °C y se almacenaron antes del bioanálisis de los niveles del compuesto.
Los tumores se recogieron de ratones especificados en condiciones libres de ARNasa y se dividieron en dos. Un corte de 2 mm de espesor de la mitad de cada tumor se fijó con formalina durante 24 horas y se transfirió a etanol al 70 %. Los tejidos tumorales fijados se embebieron en parafina. El tejido tumoral restante de cada animal se congeló instantáneamente en N2 líquido y se pulverizó con un mortero y maja.
Se tomaron muestras de ratones específicos para los tejidos sustitutos, incluidos el bazo, la piel, la médula ósea y los bigotes. Cada tejido se aisló y fijó y/o se congeló instantáneamente.
Análisis estadísticos y gráficos
Todos los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con Prism 3.03 (GraphPad) para Windows. Se aplicaron varios métodos de análisis. Las medianas de los volúmenes del tumor D29 se compararon con la prueba de Kruskal-Wallis y una prueba de comparación múltiple de Dunn post hoc. Estas pruebas se realizaron tres veces.
Los análisis estadísticos de dos colas se realizaron con P = 0.05. Prism informa los resultados como no significativos (ns) en P > 0.05, significativo (simbolizado por "*") en 0.01 < P < 0.05, muy significativo ("**") en 0.001 < P < 0.01 y extremadamente significativo ("***") en P > 0.001.
Para probar la significancia estadística entre los grupos de control y tratados durante todo el transcurso del tiempo de tratamiento, se empleó una prueba ANOVA de medidas repetidas seguida de una prueba posterior de comparación múltiple de Dunnett o una prueba ANOVA de 2 vías.
Para las representaciones gráficas, se construyó un diagrama s de "caja y bigotes" para mostrar la distribución de los volúmenes del tumor individual para cada grupo. La caja representa los 25o a 75o percentil de observaciones, la línea horizontal corresponde al valor de la mediana, y los "bigotes" indican los valores máximo y mínimo. La mediana o media (± SEM) de los volúmenes del tumor se representaron gráficamente en un diagrama semilogarítmico o lineal como funciones del tiempo. Los cambios de peso medio del grupo durante el estudio se representaron como cambio porcentual, ± SEM, desde D1.
Se construyó un diagrama de dispersión para mostrar los valores de TTE, por grupo. El diagrama TTE incluye las muertes por NTR, que se excluyen de todos los demás análisis gráficos. Cuando un animal abandonó el estudio debido al tamaño del tumor, el volumen final del tumor registrado para el animal se incluyó con los datos usados para calcular la mediana del volumen en puntos de tiempo posteriores. El porcentaje de animales de cada grupo que permanecieron en el estudio frente al tiempo se presentó en un diagrama de supervivencia de Kaplan-Meier.
Extracción de histonas
Para el aislamiento de histonas, se homogeneizaron 60-90 mg de tejido tumoral en 1.5 mL de solución reguladora de extracción nuclear (Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, KCl 25 mM, Triton X-100 al 1 %, sacarosa al 8 . 6 %, más un comprimido inhibidor de la proteasa de Roche 1836145) y se incubó en hielo durante 5 minutos. Los núcleos se recogieron por centrifugación a 600 g durante 5 minutos a 4 °C y se lavaron una vez en PBS. Se eliminó el sobrenadante y se extrajeron las histonas durante una hora, con vortex cada 15 minutos, con ácido sulfúrico frío 0.4 N. Los extractos se clarificaron por centrifugación a 10000 g durante 10 minutos a 4 °C y se transfirieron a un tubo de microcentrífuga nueva que contenía 10x volumen de acetona helada. Las histonas se precipitaron a -20 °C, durante 2 horas durante la noche, se formaron las pellas mediante centrifugación a 1 00 0 0 g durante 10 minutos y se volvieron a suspender en agua.
ELISA
Las histonas se extrajeron de muestras de tumores como se describe anteriormente. Las histonas se prepararon en concentraciones equivalentes en solución reguladora de recubrimiento (PBS 0.05 % BSA), lo que produjo 0.5 ng/ul de muestra, y se agregaron 100 ul de muestra o estándar por duplicado a 2 placas ELISA de 96 pocillos (Thermo Labsystems, Immulon 4HBX #3885). Las placas se sellaron y se incubaron durante la noche a 4 °C. Al día siguiente, las placas se lavaron 3x con 300 ul/pocillo de PBST (PBS 0.05 % de Tween 20; 10X PBST, KPL #51-14-02) en un lavador de placas Bio Tek. Las placas se bloquearon con 300 ul/pocillo de diluyente (PBS 2 % de BSA 0.05 % de Tween 20), se incubaron a TA durante 2 horas y se lavaron 3x con PBST. Todos los anticuerpos se diluyeron en diluyente. Se agregaron a cada placa 100 ul/pocillo de anti-H3K27me3 (CST #9733, stock de glicerol al 50 % 1:1000) o H3 anti-total (Abcam ab1791, glicerol al 50 % 1:10000). Las placas se incubaron durante 90 min a TA y se lavaron 3x con PBST. Se agregaron 10 0 ul/pocillo de anti-Rb-IgG-HRP (Cell Signaling Technology, 7074) 1 :2 , 0 00 a la placa H3K27Me3 y 1:6,000 a la placa H3 y se incubó durante 90 min a TA. Las placas se lavaron 4X con PBST. Para la detección, se agregaron 100 ul/pocillo de sustrato TMB (BioFx Laboratories, #TMBS) y las placas se incubaron en la oscuridad a TA, durante 5 min. La reacción se detuvo con 100 ul/pocillo H2SO4 1N. Se leyó la absorbancia a 450 nm en un lector de microplacas SpectaMax M5.
Estudio de eficacia en modelo de xenoinjerto SUDHL6
La eficacia del tratamiento con el compuesto 44 y en combinación con CHOP en la inhibición del crecimiento del tumor in vivo se determinó en el modelo de xenoinjerto SUDHL6. La comparación del crecimiento del tumor y la tasa de supervivencia estableció que la administración del compuesto 44 y CHOP inhibía o retrasaba el crecimiento del tumor y aumentaba la supervivencia de los ratones portadores de tumores. A ratones desnudos atímicos se les inyectó por vía subcutánea 1 * 107 células de linfoma humano SUDHL6. El compuesto 44 se administró una vez al día (QD), dos veces al día (BID) o tres veces al día (TID) a las concentraciones indicadas (75 mg/kg, 150 mg/kg o 225 mg/kg). Los ratones recibieron CHOP los días 1 y 8. El volumen del tumor se midió dos veces por semana hasta el punto final de 60 días o cuando el volumen del tumor alcanzó los 2 0 0 0 mm3, lo que ocurra primero.
La terapia de combinación del compuesto 44 y CHOP mostró una inhibición del crecimiento del tumor durante el curso del tratamiento (28 días) en comparación con los ratones tratados con CHOP o el compuesto 44 solo (Figura 6 A). Significativamente, los ratones que recibieron terapia de combinación del compuesto 44 y CHOP exhibieron una regresión duradera del tamaño del tumor; 7 de 12 ratones demostraron respuestas completas el día 60 en el grupo de combinación de 225 mg/kg BID y CHOP (Figura 6 A). Se determinó una curva de Kaplan-Meier para mostrar la supervivencia de los ratones en el estudio. El 57 % de los ratones que recibieron la terapia de combinación del compuesto 44 y CHOP sobrevivieron 60 días después de la inyección (Figura 6 B). No se observó eficacia de agente único con el compuesto 44 durante el tratamiento de 28 días, sin embargo, la alta variabilidad intragrupo puede haber enmascarado el efecto del tratamiento del compuesto 44 como agente único.
Estudio de eficacia en el modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2
La eficacia del tratamiento con el compuesto 44 y en combinación con CHOP en la inhibición del crecimiento del tumor in vivo se determinó en el modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2. La comparación del crecimiento del tumor estableció que la administración del compuesto 44 y CHOP inhibió o retrasó el crecimiento del tumor de los ratones portadores de tumores. A los ratones SCID se les inyectó por vía subcutánea 1 * 107 Células de linfoma humano WSU-DLCL2. El compuesto 44 se administró una vez al día (QD), dos veces al día (BID) o tres veces al día (TID) a las concentraciones indicadas (150 mg/kg, 225 mg/kg, 300 mg/kg o 600 mg/kg). Los ratones recibieron CHOP los días 1 y 22 (los ratones SCID no toleraron CHOP los días 1 y 8 ). El volumen del tumor se midió dos veces por semana hasta el punto final de 28 días.
El compuesto 44 solo y en combinación con la terapia CHOP dio como resultado la inhibición del crecimiento del tumor (Figura 7A). La administración de 150 mg/kg tres veces al día (TID) y 225 mg/kg dos veces al día (BID) del compuesto 44 como agente único dio como resultado tumores significativamente más pequeños por volumen en comparación con los ratones tratados con vehículo de control (p<0.05). Además, la terapia de combinación del compuesto 44 y CHOP mostró una inhibición estadísticamente significativa del crecimiento del tumor en comparación con los ratones tratados con vehículo de control (p<0.001). Los análisis estadísticos se calcularon usando ANOVA de medidas repetidas seguido de la prueba posterior de Dunnett. También se calculó la inhibición del crecimiento del tumor, revelando que el tratamiento de tumores con el compuesto 44 dio como resultado una mayor inhibición del crecimiento del tumor en todas las dosis (Tabla 2). De forma importante, el tratamiento combinado del compuesto 44 con CHOP dio como resultado la mayor inhibición del crecimiento del tumor.
Tabla 2. Inhibición del crecimiento del tumor (TGI) del modelo de xenoinjerto WSU-DLCL2.
Figure imgf000046_0001
Para examinar la absorción y distribución de los agentes administrados, se realizó un análisis farmacocinético para determinar la concentración del compuesto 44 (ng/mL) en el plasma de ratones portadores de tumores (Figura 7B). Las muestras de plasma se obtuvieron el día 28, 5 minutos antes de la última dosis ("mínimo") y 3 horas después de la última dosis ("post"). Las muestras de plasma se analizaron mediante LC-MS/MS para determinar la concentración del compuesto 44 (ng/mL). Los niveles del compuesto 44 no fueron significativamente diferentes entre los ratones que recibieron 225 mg/kg del compuesto 44 dos veces al día (BID) como agente único y 225 mg/kg del compuesto 44 (BID) con CHOP en el punto de tiempo mínimo. Sin embargo, 3 horas después de la administración de la última dosis, los niveles del compuesto 44 aumentaron significativamente en ratones que recibieron 225 mg/kg del compuesto 44 dos veces al día (BID) con CHOP en comparación con el compuesto 44 como agente único.
También se realizó un análisis farmacocinético para determinar la concentración del compuesto 44 (ng/g) en tejido tumoral recogido de ratones el día 28 a las 3 horas después de la última administración del tratamiento (Figura 7C).
La eficacia de la inhibición de la diana in vivo se determinó mediante el análisis del estado de metilación de las histonas en los tumores después de 28 días de tratamiento. El análisis de Western Blot (Figura 8 A) demostró que el compuesto 44 inhibió la metilación de H3K27 en todas las dosificaciones y programas de dosificación en tumores WSU-DLCL2. Las histonas se extrajeron como se describe anteriormente. Las concentraciones de proteína para histonas extraídas con ácido se determinaron mediante ensayo BCA (Pierce). Se fraccionaron 400-800 ng de cada lisado en gel Tris-Glycine al 10-20 % (Biorad), se transfirieron usando iBlot (7 minutos en el programa 3, usando pilas de transferencia de nitrocelulosa) y se probaron con los siguientes anticuerpos en solución reguladora de bloqueo Odyssey: conejo anti -H3K27me3 (CST 9733; dilución 1:20000) y ratón anti-Total H3 (CST 3638; dilución 1:20000). Después de la incubación primaria de Ab, las membranas se probaron con IgG de asno anti-ratón IRDye 800CW (LiCOR #926-32212) e IgG de cabra anti-conejo Alexa Fluor 680 (Invitrogen #A-21076) Ab secundario y se tomaron imágenes usando el sistema LiCOR Odyssey. La señal de la proteína histona H3 total se usó como control.
El análisis de la metilación de histonas en tumores WSU-DLCL2 por ELISA confirmó que el compuesto 44 inhibía la metilación de histonas en todas las dosificaciones y programas de dosificación (Figura 8 B). Los tumores de ratones que recibieron vehículo o CHOP no exhibieron ninguna inhibición de la metilación en H3K27. Las histonas se extrajeron de los tumores después de 28 días de tratamiento y se analizaron por ELISA como se describe anteriormente.
Estudio de eficacia en el modelo de xenoinjerto SUDHL10
La eficacia del tratamiento con el compuesto 44 y en combinación con COP (ciclofosfamida, Oncovin [vincristina] y prednisona) en la inhibición del crecimiento del tumor in vivo se determinó en el modelo de xenoinjerto SUDHL10. La comparación del crecimiento del tumor estableció que la administración del compuesto 44 y COP inhibió o retrasó el crecimiento del tumor de los ratones portadores de tumores. A los ratones SCID se les inyectó por vía subcutánea 1 x 107 células de linfoma humano SUDHL10. El compuesto 44 se administró dos veces al día (BID) o tres veces al día (TID) a las concentraciones indicadas (125 mg/kg, 250 mg/kg o 500 mg/kg). Los ratones recibieron COP los días 1 y 22 (los ratones SCID no toleraron CHOP los días 1 y 8 ). El volumen del tumor se midió dos veces por semana hasta el punto final de 28 días. La mitad de la cohorte se sacrificó después de 28 días de tratamiento, mientras que la otra mitad se analizó hasta el punto final de 60 días para el análisis del retraso en el crecimiento del tumor.
La figura 9A muestra que la administración del compuesto 44 solo mostró una inhibición del crecimiento del tumor estadísticamente significativa como agente único a 250 mg/kg y 500 mg/kg cuando se administró dos veces al día (BID), en comparación con ratones tratados con vehículo de control (p<0.001). Además, la terapia de combinación del compuesto 44 a 250 mg/kg dos veces al día (BID) y COP mostró una inhibición estadísticamente significativa del crecimiento del tumor en comparación con los ratones tratados con vehículo de control (p<0.001). Los análisis estadísticos se calcularon usando ANOVA de medidas repetidas seguido de la prueba posterior de Dunnett. Un ratón del grupo de 500 mg/kg BID fue sacrificado el día 15 debido a su mala condición corporal. Los ratones que recibieron la terapia de combinación del compuesto 44 y COP exhibieron una pérdida de peso corporal del 8 % el día 25, en el que se detuvo la dosificación pero se reanudó el día 27. El día 29, 1/16 ratones y 2/15 ratones no tenían tumor en el grupo de 250 mg/kg y 500 mg/kg. Sorprendentemente, 10/14 ratones que recibieron la terapia combinada de compuesto 44 y COP no tenían tumor el día 29.
También se calculó la inhibición del crecimiento del tumor, revelando que el tratamiento de tumores de xenoinjerto SUDHL10 con el compuesto 44, con o sin COP dio como resultado una inhibición eficaz del crecimiento del tumor en todas las dosificaciones (Tabla 3).
Tabla 3. Inhibición del crecimiento del tumor (TGI) en el modelo de xenoinjerto SUDHL10.
Figure imgf000047_0001
Los tumores se pesaron después de sacrificar a los ratones el día 28 (Figura 9B). Los tumores de ratones que recibieron la administración de un único agente del compuesto 44 a 125 mg/kg o COP fueron significativamente más pequeños en comparación con los ratones de control (vehículo). Los tumores de los ratones que recibieron la terapia de combinación del compuesto 44 y COP fueron significativamente más pequeños que los tumores de los ratones que recibieron el compuesto 44 como agente único en dosificaciones de 250 mg/kg y 500 mg/kg.
La mitad de la cohorte se mantuvo hasta el día 60, para determinar la eficacia del tratamiento mediante la determinación del retraso en el crecimiento del tumor (Figura 9C). El crecimiento del tumor en ratones tratados con dosis de 250 mg/kg y 500 mg/kg del compuesto 44 como agente único exhibió pequeños tumores en el día 28, mientras que los ratones de control y tratados con COP exhibieron tumores grandes donde los tumores continuaron creciendo después del día 28. Sorprendentemente, los ratones que recibieron la terapia combinada no solamente tenían tumores más pequeños que todos los demás grupos de tratamiento, sino que también mostraron un retraso significativo y duradero en el crecimiento del tumor.
La figura 9D muestra una curva de Kaplan-Meier que representa la tasa de supervivencia de los ratones tratados con el compuesto 44 solo o en combinación en COP. La administración del compuesto 44 como agente único a 125 mg/kg, 250 mg/kg y 500 mg/kg aumentó la supervivencia de los ratones en comparación con los ratones de control o los ratones tratados solamente con COP. Significativamente, la administración combinada del compuesto 44 con COP mejoró la tasa de supervivencia de los ratones en comparación con la administración de un único agente.
Se realizaron estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos en el modelo de xenoinjerto SUDHL10. La figura 10A muestra el análisis farmacocinético de las concentraciones del compuesto 44 en niveles plasmáticos (ng/mL). Se obtuvieron muestras de plasma de ratones portadores de tumores el día 28, ya sea 5 minutos antes de la última dosis ("mínimo") o 3 horas después de la última dosis ("post"). Los niveles del compuesto 44 se determinaron por LC-MS. El análisis farmacodinámico se realizó mediante ELISA y se determinó la proporción de H3K27 trimetilado en las muestras tumorales. También se realizó un análisis farmacodinámico en otros tejidos, específicamente el bazo y la médula ósea, de los ratones portadores de tumores para mostrar la eficacia de la inhibición de la metilación de histonas por el compuesto 44 en tejidos normales del ratón sustituto (Figuras 10B y 10C).
Ejemplo de referencia 7: Efectos sinérgicos del compuesto 44 y la terapia de combinación de agentes anticancerígenos.
Métodos
Las líneas celulares de linfoma humano WSU-DLCL2 (DSMZ; ACC 575), SU-DHL-10 (DSMZ; ACC 576) y Toledo (ATCC; CRL-2631) se obtuvieron de las fuentes indicadas y se mantuvieron en medios RPMI-1640 complementados con 10 %-20 % de suero bovino fetal inactivado por calor y glutamina 2 mM. Las células se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos en una incubadora humidificada a 37 °C, en una atmósfera de 5 % de CO2 y 95 % de aire. Los WSU-DLCL2 y SU-DHL-10 contienen la mutación Y641 EZH2, y la línea celular Toledo contiene EZH2 WT.
Los efectos antiproliferativos in vitro de la combinación del compuesto 44 con los siguientes fármacos: Se investigaron AraC, cisplatino, decitabina, dexametasona, everolimus, prednisolona y doxorrubicina. Se trataron células de linfoma humano WSU-DLCL2, SU-DHL-10 o Toledo con concentraciones crecientes del compuesto 44 en matraces. Después de 4 días de tratamiento, las células WSU-DLCL2 o SU-DHL-10 se dividieron a la densidad de siembra inicial y se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con cada concentración del compuesto 44 en una fila de la placa. Después de 6 días, las células Toledo se dividieron hasta la densidad de siembra inicial y se sembraron en una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con cada concentración del compuesto 44 en una fila de la placa. A continuación, se agregaron dosis crecientes de fármacos a las placas. Una dosis por columna formando una matriz del compuesto 44 y dosis de fármaco. Después de la incubación durante 3 días adicionales, se midió la viabilidad celular de WSU-DLCL2 o SU-DHL-10 usando el reactivo Promega Cell Titer-Glo seguido de detección de luminiscencia. Después de 5 días, se midió la viabilidad de las células Toledo usando el reactivo Promega Cell Titer-Glo seguido de detección de luminiscencia.
Análisis de los datos
La sinergia se determinó mediante el paquete de software Calcusyn de Biosoft en base al método Chou-Talalay para la combinación de fármacos que usa la ecuación del efecto mediano (Chou 2006). En primer lugar, los valores de luminiscencia sin procesar se convirtieron en porcentaje de inhibición o fracción afectada (Fa) calculada usando controles para inhibición máxima y células tratadas con DMSO para control de inhibición mínima ubicadas en cada placa. Los valores de porcentaje de inhibición para cada proporción constante de combinaciones de compuestos se ingresaron en Calcusyn para determinar los valores del índice de combinación. Los valores del índice de combinación inferiores a 1 indicaron sinergia.
Para los compuestos de prueba que no inhibieron la viabilidad de las células en un 50 %, no se puede determinar la sinergia usando Calcusyn. En su lugar, los datos se informaron como el cambio de IC50 veces de la IC50 para el compuesto 44. Alternativamente, si el compuesto 44 no tenía ningún efecto, como con las células de Toledo, se informaba de las veces de cambio de IC50 para el fármaco en lugar del compuesto 44.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un compuesto de fórmula 44
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o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y otros agentes terapéuticos en los que dichos otros agentes terapéuticos son:
ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona;
ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisolona;
rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona; o
rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisolona.
2. Una composición como se define en la reivindicación 1 para su uso como medicamento.
3. La composición para su uso según la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad en un sujeto que lo necesite, en la que dicha enfermedad puede verse influenciada por la modulación del estado de metilación de las histonas u otras proteínas, opcionalmente en la que dicho estado de metilación está mediado al menos en parte por la actividad de EZH2.
4. La composición para su uso según la reivindicación 2, en la que la composición es para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer o de una afección precancerosa.
5. Un compuesto de fórmula 44
Figure imgf000072_0002
o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en el tratamiento o la prevención del cáncer, en el que dicho compuesto se administra de forma simultánea o secuencial con otros agentes terapéuticos, y en el que dichos otros agentes terapéuticos son:
ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona;
ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisolona;
rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona; o
rituximab, ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisolona.
6. El compuesto para su uso según la reivindicación 5, en el que el compuesto de fórmula 44 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo se administra antes de la administración de dichos otros agentes terapéuticos.
7. El compuesto para su uso según la reivindicación 5, en el que el compuesto de fórmula 44, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, se administra antes de la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de una composición de la reivindicación 1.
8. La composición para su uso según la reivindicación 2, 3 o 4, o el compuesto para su uso según la reivindicación 7, en la que la composición de la reivindicación 1 se administra al sujeto que la necesita a una dosificación de 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día.
9. El compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que (i) el compuesto 44 se administra a una dosificación de 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día; o (ii) cada uno de los otros agentes terapéuticos se administra a una dosificación de 0.01 mg/kg por día a aproximadamente 1000 mg/kg por día.
10. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 y 7, o el compuesto para su uso según una cualquiera o más de las reivindicaciones 4 a 6, en la que dicho sujeto expresa la EZH2 mutante; opcionalmente en la que
(i) dicha EZH2 mutante tiene una o más mutaciones, en la que la mutación es una sustitución, una mutación puntual, una mutación sin sentido, una mutación sin sentido invertida, una deleción o una inserción;
(ii) dicha EZH2 mutante tiene una o más mutaciones en su dominio de bolsillo de sustrato como se define en SEQ ID NO: 6;
(iii) dicha EZH2 mutante es un mutante Y641, opcionalmente seleccionado entre Y641F, Y641H, Y641N e Y641S;
(iv) la EZH2 mutante tiene una mutación en la posición de aminoácido 677, 687, 674, 685 o 641 de SEQ ID NO: 1;
(v) dicha EZH2 mutante tiene una o más mutaciones seleccionadas del grupo que consiste en una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 677 de SEQ ID NO: 1 (A677G); una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 687 de SEQ ID NO: 1 (A687V); una sustitución de metionina (M) por el residuo de tipo salvaje valina (V) en la posición de aminoácido 674 de SEQ ID NO: 1 (V674M); una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 685 de SEQ ID NO: 1 (R685H); una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 685 de SEQ ID NO: 1 (R685C); una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 322 de SEQ ID NO: 3 (N322S), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 288 de SEQ ID NO: 3 (R288Q), una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de tipo salvaje treonina (T) en la posición de aminoácido 573 de SEQ ID NO: 3 (T573I), una sustitución de ácido glutámico (E) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664E), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 458 de SEQ ID NO: 5 (R458Q), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 249 de SEQ ID NO: 3 (E249K), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 684 de SEQ ID NO: 3 (R684C), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 628 de SEQ ID NO: 21 (R628H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 501 de SEQ ID NO: 5 (Q501H), una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 192 de SEQ ID NO: 3 (D192N), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664V), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje valina (V) en la posición de aminoácido 704 de SEQ ID NO: 3 (V704L), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje prolina (P) en la posición de aminoácido 132 de SEQ ID NO: 3 (P132S), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 669 de SEQ ID NO: 21 (E669K), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 255 de SEQ ID NO: 3 (A255T), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 726 de SEQ ID NO: 3 (E726V), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 571 de SEQ ID NO: 3 (C571Y), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 145 de SEQ ID NO: 3 (F145C), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693T), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 145 de SEQ ID NO: 3 (F145S), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 109 de SEQ ID NO: 21 (Q109H), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje fenilalanina (F) en la posición de aminoácido 622 de SEQ ID NO: 21 (F622C), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 135 de SEQ ID NO: 3 (G135R), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 168 de SEQ ID NO: 5 (R168Q), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 159 de SEQ ID NO: 3 (G159R), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 310 de SEQ ID NO: 5 (R310C), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 561 de SEQ ID NO: 3 (R561H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 634 de SEQ ID NO: 21 (R634H), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje glicina (G) en la posición de aminoácido 660 de SEQ ID NO: 3 (G660R), una sustitución de cisteína (C) por el residuo de tipo salvaje tirosina (Y) en la posición de aminoácido 181 de SEQ ID NO: 3 (Y181C), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje histidina (H) en la posición de aminoácido 297 de SEQ ID NO: 3 (H297R), una sustitución de serina (S) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 612 de SEQ ID NO: 21 (C612S), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje histidina (H) en la posición de aminoácido 694 de SEQ ID NO: 3 (H694Y), una sustitución de alanina (A) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 664 de SEQ ID NO: 3 (D664A), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 150 de SEQ ID NO: 3 (I150T), una sustitución de arginina (R) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 264 de SEQ ID NO: 3 (I264R), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje prolina (P) en la posición de aminoácido 636 de SEQ ID NO: 3 (P636L), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje isoleucina (I) en la posición de aminoácido 713 de SEQ ID NO: 3 (I713T), una sustitución de prolina (P) por el residuo de tipo salvaje glutamina (Q) en la posición de aminoácido 501 de SEQ ID NO: 5 (Q501P), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 243 de SEQ ID NO: 3 (K243Q), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje ácido glutámico (E) en la posición de aminoácido 130 de SEQ ID NO: 5 (E130D), una sustitución de glicina (G) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 509 de SEQ ID NO: 3 (R509G), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 566 de SEQ ID NO: 3 (R566H), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 677 de SEQ ID NO: 3 (D677H), una sustitución de asparagina (N) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 466 de SEQ ID NO: 5 (K466N), una sustitución de histidina (H) por el residuo de tipo salvaje arginina (R) en la posición de aminoácido 78 de SEQ ID NO: 3 (R78H), una sustitución de metionina (M) por el residuo de tipo salvaje lisina (K) en la posición de aminoácido 1 de SEQ ID NO: 6 (K6M), una sustitución de leucina (L) por el residuo de tipo salvaje serina (S) en la posición de aminoácido 538 de SEQ ID NO: 3 (S538L), una sustitución de glutamina (Q) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 149 de SEQ ID NO: 3 (L149Q), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 252 de SEQ ID NO: 3 (L252V), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje leucina (L) en la posición de aminoácido 674 de SEQ ID NO: 3 (L674V), una sustitución de valina (V) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 656 de SEQ ID NO: 3 (A656V), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 731 de SEQ ID NO: 3 (Y731D), una sustitución de treonina (T) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 345 de SEQ ID NO: 3 (A345T), una sustitución de ácido aspártico (D) por el residuo de tipo salvaje alanina (A) en la posición de aminoácido 244 de SEQ ID NO: 3 (Y244D), una sustitución de triptófano (W) por el residuo de tipo salvaje cisteína (C) en la posición de aminoácido 576 de SEQ ID NO: 3 (C576W), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 640 de SEQ ID NO: 3 (N640K), una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 675 de SEQ ID NO: 3 (N675K), una sustitución de tirosina (Y) por el residuo de tipo salvaje ácido aspártico (D) en la posición de aminoácido 579 de SEQ ID NO: 21 (D579Y), una sustitución de isoleucina (I) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de SEQ ID NO: 3 (N693I), y una sustitución de lisina (K) por el residuo de tipo salvaje asparagina (N) en la posición de aminoácido 693 de Se Q ID NO: 3 (N693K);
(vi) dicha EZH2 mutante tiene un marco de lectura en la posición de aminoácido 730, 391, 461, 441, 235, 254, 564, 662, 715, 405, 685, 64, 73, 656, 718, 374, 592, 505, 730, o 363 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21 o la posición de nucleótido correspondiente de la secuencia de ácido nucleico que codifica SEQ ID NO: 3, 5 o 21;
(vii) dicha EZH2 mutante tiene una deleción de ácido glutámico (E) y leucina (L) en las posiciones de aminoácidos 148 y 149 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21; o
(viii) dicha EZH2 mutante tiene una mutación sin sentido en la posición de aminoácido 733, 25, 317, 62, 553, 328, 58, 207, 123, 63, 137 o 60 de SEQ ID NO: 3, 5 o 21.
11. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4 o el compuesto para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, en la que la composición de la reivindicación 1 se administra a un sujeto, y dicho sujeto ha demostrado resistencia a uno cualquiera de los componentes de la composición de la reivindicación 1 cuando se administra como agente único.
12. El compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que el compuesto de fórmula 44, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en combinación con otros agentes terapéuticos, se usa para inhibir la proliferación de células cancerosas.
13. La composición para su uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 o el compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en las que el cáncer es linfoma, leucemia o melanoma.
14. La composición o compuesto para su uso según la reivindicación 13, en los que el linfoma se selecciona del grupo que consiste en linfoma no Hodgkin, linfoma folicular y linfoma difuso de células B grandes; o en los que la leucemia es leucemia mielógena crónica (CML).
15. La composición para su uso según la reivindicación 3 o la reivindicación 4 o el compuesto para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, en los que la afección precancerosa son los síndromes mielodisplásicos (MDS, anteriormente conocidos como preleucemia).
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