ES2920492T3 - Aparato y procedimiento para la producción automatizada de células modificadas por ingeniería genética a partir de líquidos biológicos - Google Patents
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Abstract
La invención se relaciona con un aparato automatizado adecuado para la preparación de células transformadas genéticamente de fluidos biológicos que comprenden una unidad operativa y una cámara de procesamiento hueco concéntrico giratorio capaz de procesar automáticamente muestras biológicas, como las células sanguíneas blancas de la aféresis, la médula ósea o las células cultivadas., para fabricar células genéticamente modificadas. La unidad de funcionamiento es rotatable alrededor de su centro alrededor de un eje horizontal y la cámara de procesamiento es rotatable alrededor de su eje del rotor central perpendicular con el eje giratorio de la unidad de operación. Dicha cámara de procesamiento se puede operar a altas velocidades de rotación cuando se orientan verticalmente para generar fuerza centrífuga en la muestra contenida que permite la separación de sólidos de líquidos y a bajas velocidades o por serie de rotaciones rápidas en sentido de las agujas del reloj y en sentido antihorario cuando se orientan horizontalmente para incubación, resuspensión sólida y resuspensión sólida y resuspensión sólida y Cuentas magnéticas ANGICA MAGNÉTICA. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Aparato y procedimiento para la producción automatizada de células modificadas por ingeniería genética a partir de líquidos biológicos
Campo de la invención
La invención se refiere a un aparato automatizado y procedimiento para la producción de células modificadas por ingeniería genética a partir de líquidos biológicos. En particular, el aparato permite la preparación de disoluciones terapéuticas y procesamiento de líquido biológico mediante modificación por ingeniería genética de células, separación de células a partir de líquidos y lavado, concentrado y dilución de células mediante la aplicación de tratamiento físico a líquidos biológicos, tal como centrifugación, separación magnética y mezclado de líquidos en el contexto de productos relacionados con terapia génica.
Antecedentes de la invención
La terapia génica, basada en modificación por ingeniería genética de células madre o células T con receptores de antígenos quiméricos, se usa actualmente con pacientes y ofrece resultados sin precedentes contra varias formas de cáncer. El producto terapéutico se produce generalmente de la siguiente manera: se realiza la recogida de glóbulos blancos a partir de líquidos corporales de pacientes. A partir de esta recogida, tiene que lavarse y aislarse un subconjunto de células de interés. Estas relativamente pocas células aisladas se modificarán genéticamente mediante la acción de un vector viral. Las células modificadas tienen que expandirse de nuevo para dar un gran cultivo. La producción de estas terapias se realiza generalmente por técnicos humanos en salas blancas y está sujeta a estrictos procedimientos normalizados de trabajo. El trabajo de seres humanos afecta negativamente a la calidad y reproducibilidad del producto terapéutico final y debe aplicarse automatización para aumentar el éxito en la producción de un producto terapéutico aplicable.
El documento WO 2009/072003 A2 (MILTENYI BIOTEC GMBH [DE]; MILTENYI STEFAN [DE]; SCHIMMELPFENNIG WINFRIED) da a conocer un sistema, que comprende: a) una unidad de procesamiento de muestras, que comprende un orificio de entrada y un orificio de salida acoplados a un recipiente rotatorio que tiene al menos una cámara de muestra, estando la unidad de procesamiento de muestras configurada para proporcionar una primera etapa de procesamiento a una muestra o para hacer rotar el recipiente para aplicar una fuerza centrífuga a una muestra depositada en la cámara y separar al menos un primer componente y un segundo componente de la muestra depositada; y b) una unidad de separación de muestras acoplada al orificio de salida de la unidad de procesamiento de muestras, comprendiendo la unidad de separación de células un elemento de soporte de columna de separación, una bomba y una pluralidad de válvulas configuradas para controlar al menos parcialmente el flujo de líquido a través de un conjunto de circuitos de líquido y una columna de separación posicionada en el elemento de soporte, estando la columna de separación configurada para separar componentes marcados y no marcados de muestra que se hace fluir a través de la columna.
En el documento US 2017/218331 A1 (MILTENYI STEFAN [DE] ET AL) se da a conocer un dispositivo de modificación de células, que comprende una cámara de centrifugación con al menos una superficie de modificación de células con un vector normal que tiene un ángulo de 135 - 45° con respecto al eje de rotación de la cámara de centrifugación, en el que la cámara de centrifugación comprende al menos un orificio de entrada/salida y las células que van a modificase se inmovilizan en las superficies de modificación de células mediante la rotación de la cámara de centrifugación a de 2 a 2000 g. Además, la invención se refiere a un método para modificar células que comprende las etapas de - introducir células en un dispositivo de modificación de células, que comprende una cámara de centrifugación con al menos una superficie de modificación de células con un vector normal que tiene un ángulo de 135 - 45° con respecto al eje de rotación de la cámara de centrifugación en el que y que comprende al menos un orificio de entrada/salida, - inmovilizar las células sobre las superficies de modificación de células mediante la rotación de la cámara de centrifugación a de 2 a 2000 g - mantener la rotación de la rotación de la cámara de centrifugación hasta que se modifican las células.
En el documento WO 2016/118780 A1 (HUTCHINSON FRED CANCER RES [US]) se describe una plataforma para el aislamiento, producción y formulación ex vivo de células genéticamente modificadas. La plataforma usa un dispositivo de uso cerca del paciente y/o portátil con capacidad para software que hace que la terapia génica esté más ampliamente disponible.
El documento US 2005/054506 A1 (BRADLEY BRUCE J [US]) describe una cámara de separación centrífuga de uso particular para separar microbios. La cámara tiene una forma cónica ensanchada hacia arriba y un surco de recogida de muestras en su punto más ancho. Se recoge una muestra en el surco de muestras a medida que gira la cámara. Cuando se ralentiza hasta detenerse, el sobrenadante se hunde hasta la parte inferior de la cámara, dejando la muestra en el surco de muestras al que puede accederse fácilmente.
El documento WO 2016/097889 A1 (BIOSAFE SA [CH]) da a conocer un procedimiento para el procesamiento secuencial de líquidos biológicos opacos y transparentes tales como sangre completa, sangre de aféresis, sangre de
médula ósea, sangre de cordón umbilical, capa leucocítica o células cultivadas mediante etapas de procesamiento en una cámara (300) de procesamiento centrífuga cilíndrica hueca que forma parte de un conjunto desechable. Al menos tres procedimientos diferentes seleccionados de lavado, incubación, transducción, separación, separación por gradiente de densidad, dilución y ajuste del volumen se llevan a cabo, cada uno, una vez o de manera repetida varias veces según un perfil de procesamiento dado en la cámara de procesamiento. Cada procedimiento implica una entrada en la cámara de procesamiento, una operación en la cámara de procesamiento y una salida de la cámara de procesamiento mediante desplazamiento de un pistón (310). Los al menos tres procedimientos diferentes se encadenan secuencialmente uno después de otro para constituir una operación secuencial global en la cámara de procesamiento y su conjunto desechable. Una primera aplicación es la incubación para unir perlas magnéticas con células madre o células sanguíneas humanas. Una segunda aplicación es la transducción mediante la cual se inserta material genético foráneo en células madre o células sanguíneas humanas mediante un virus. Una tercera aplicación es el reacondicionamiento de líquidos biológicos para lograr una concentración y volúmenes reproducibles de células sanguíneas o células madre.
Tal como se notifica, ya se han realizado esfuerzos por automatizar la producción de células modificadas por ingeniería genética. Sin embargo, las tecnologías del estado de la técnica, tales como las mostradas a modo de ejemplo en los documentos WO 2016/097889 A1 o WO 2009/072003 A2, no pueden actualmente realizar toda la producción de células modificadas por ingeniería genética en una única cámara de procesamiento. Las dificultades residen en la variación del tamaño de cultivo a lo largo del procedimiento y partes del procedimiento, tales como, respectivamente, aislamiento de células o expansión de células final hasta el número de células deseado final o aislamiento de células, tienen que realizarse en otro dispositivo aumentando la complejidad del procedimiento y el posible deterioro del producto final.
Breve descripción de la invención
Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar un aparato automatizado adecuado para la preparación de células genéticamente transformadas. Este aparato está compuesto por una unidad operativa y una cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria adecuada para realizar procesamiento de células. La forma de la unidad operativa es hexagonal y puede rotar alrededor de un árbol que pasa por su centro y es perpendicular al eje de rotación de la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria. La unidad operativa alberga la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y, mediante su rotación, puede orientar la cámara de procesamiento en diferentes posiciones que confieren diferentes operaciones posibles a dicha cámara de procesamiento. La unidad operativa presenta diferentes funciones en sus seis caras y presenta, en una cara, un alojamiento que sujeta la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, puede templar la cámara y está equipado con una matriz magnética accionable. Finalmente, la matriz magnética accionable puede ajustarse estrechamente al borde de la cámara de procesamiento hueca concéntrica para ejercer un campo magnético en la cámara. La cámara de procesamiento hueca rotatoria, realizando la centrifugación cuando está orientada en vertical, puede separar sólidos a partir de un líquido y, cuando está orientada en horizontal, puede realizar la resuspensión de sólidos e incubación en disolución. La cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está caracterizada por su forma y está compuesta por una parte superior que es una semiesfera con la parte redondeada orientada hacia arriba con un agujero en la parte más superior; y en los bordes de la semiesfera que forman un ángulo perpendicular con la esfera, posicionados a entre una cuarta parte y la mitad de la altura total de la cámara de procesamiento concéntrica rotatoria, comienza la parte inferior, que se estrecha hacia abajo para dar una forma de embudo que sigue una curva arqueada cóncava con un segundo agujero en la parte más inferior. La cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está equipada con un estator de entrada en la parte superior y un estator de salida en la parte inferior que permiten bombear líquidos al interior y al exterior de la cámara. Además, la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está conectada en sus estatores tanto inferior como superior a dos conjuntos independientes compuestos por una cabeza de bomba peristáltica desechable conectada a una cabeza de válvula selectora rotatoria de múltiples vías desechable conectada a varias bolsas de reactivo o de producto que forman un kit desechable de un único uso. Finalmente, la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria presenta un tapón accionable conformado para ajustarse en su agujero inferior. Puede engancharse o desengancharse por medio de un accionador para bloquear y desbloquear respectivamente la salida de líquido de la cámara de procesamiento.
Otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento en el presente documento definido como conjunto de operaciones realizadas mediante la unidad operativa y la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria tales como llenado de la cámara de procesamiento, vaciado de la cámara de procesamiento, centrifugación para separar sólidos a partir de líquidos, resuspensión de agregados, incubación de célula y/o reactivos, expansión de cultivo celular, separación magnética y ajuste del volumen permitiendo realizar el procedimiento de producción de células modificadas por ingeniería genética.
Otros objetivos y ventajas de la invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a partir de una revisión de la siguiente descripción detallada, que se realiza con referencia a los siguientes dibujos ilustrativos y las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
El aparato y los procedimientos se describen por medio de dibujos técnicos en los que:
La figura 1 representa una vista en sección transversal de la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria. La figura 2 representa una vista en sección transversal de la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria con sus estatores de entrada y de salida.
La figura 3 es una vista en sección transversal enfocada del estator de entrada.
La figura 4 es una vista en sección transversal enfocada del estator de salida y sus modos de funcionamiento.
La figura 5 es una ilustración esquemática de la amplitud de movimiento y rotación de la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria cuando está montada en la unidad operativa.
La figura 6 es una ilustración en perspectiva de la matriz magnética accionable.
La figura 7 es un esquema del kit desechable usado y sus reactivos asociados.
La figura 8 es una ilustración en perspectiva de la unidad operativa montada con un kit desechable.
La figura 9a es un diagrama de flujo de una operación de separación de sólidos biológicos.
La figura 9b es un diagrama de flujo de una operación de separación magnética de células de interés.
La figura 9c es un diagrama de flujo de una operación de resuspensión de agregados y una operación de incubación de reactivos y/o células.
La figura 9d es un diagrama de flujo de una operación de expansión de cultivo celular.
Descripción detallada de la invención
Aunque en la práctica o pruebas de la presente invención pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Las publicaciones y solicitudes comentadas en el presente documento se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento debe interpretarse como una admisión de que la presente invención no tenga derecho a anteceder a tal publicación gracias a una invención previa. Además, los materiales, métodos y ejemplos son sólo ilustrativos y no se pretende que sean limitativos.
En el caso de conflicto, regirá la presente memoria descriptiva, incluyendo las definiciones.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica a la que pertenece el objeto en el presente documento. Tal como se usan en el presente documento, las siguientes definiciones se proporcionan con el fin de facilitar la comprensión de la presente invención.
El término “comprender” se usa de manera general en el sentido de incluir, es decir, que permite la presencia de una o más características o componentes.
Tal como se usan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, las formas en singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Tal como se usa en el presente documento, el término cámara de procesamiento, sin o seguido por cualquier combinación de los términos rotatoria, concéntrica y hueca, se refiere al mismo objeto.
Tal como se usa en el presente documento, el término tapón o tapón accionable se refiere a un obturador con el fin de obstruir el flujo de un líquido.
Tal como se usan en el presente documento, los términos rotación a baja velocidad, es una velocidad de rotación de entre 2 y 100 rpm; centrifugación es una velocidad de rotación que genera entre 2000 y 6000 G; y rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj son rotaciones a entre 2 y 400 rpm durante entre 1 y 10 s.
Tal como se usa en el presente documento, el término tiempo suficiente, cuando se refiere a expansión celular, es de entre 12 y 24 horas; de 2 a 20 minutos cuando se refiere a resuspensión de sólidos; de 2 a 30 minutos cuando se refiere a centrifugación; de 15 min a 8 horas cuando se refiere a incubación lentiviral.
Tal como se usa en el presente documento, el término temperatura compatible con patrón de cultivo celular, es de entre 32 y 38°C cuando se refiere a expansión de cultivo celular o incubación.
Tal como se usa en el presente documento, el término recuento celular satisfactorio, se refiere a un número de células de entre 108 y 1010 células o más.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar un aparato automatizado adecuado o adaptado para la preparación de células genéticamente transformadas a partir de líquidos biológicos que comprende:
(i) una unidad (80) operativa que puede rotar alrededor de su centro alrededor de un eje (19) horizontal,
(ii) un árbol (16) de eje central que sujeta la unidad (80) operativa proporcionando soporte y potencia eléctrica, en el que la unidad (80) operativa comprende una cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria que tiene:
- una parte superior que es una semiesfera con la parte redondeada orientada hacia arriba con un agujero (3) sobresaliente en su parte más superior;
- bordes (7) inferiores de la semiesfera posicionados entre una cuarta parte y la mitad de la altura total de la cámara (1) de procesamiento concéntrica rotatoria formando un ángulo perpendicular con la parte inferior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica que se estrecha hacia abajo para dar una forma (6) de embudo que sigue una curva arqueada cóncava con un agujero (4) inferior en su parte más inferior;
y en el que dicha unidad (80) operativa está configurada para desplazar dicha cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria desde una posición (14) vertical hasta una (15) horizontal que confieren diferentes operaciones a dicho aparato automatizado.
Preferiblemente, la cámara (1) de procesamiento concéntrica rotatoria comprende además uno o más agujeros (5) laterales circularmente dispuestos por encima del agujero (4) inferior.
En una realización de la invención, la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está equipada con un estator (8) de entrada en su parte superior y un estator (10) de salida en su parte inferior que permiten bombear líquidos al interior y al exterior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria.
En particular, un tapón (13) accionable conformado para ajustarse al agujero (4) inferior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria puede engancharse (32) o desengancharse (34) para bloquear o desbloquear respectivamente el uno o más agujeros (5) laterales circularmente dispuestos.
En una realización preferida, la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está conectada en sus estatores tanto (10) inferior como (8) superior a dos conjuntos independientes compuestos por una cabeza (58, 60) de bomba peristáltica desechable conectada a una cabeza (57, 61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías desechable conectada a varias bolsas de reactivo o de producto para formar un kit (66) desechable.
Preferiblemente, la unidad (80) operativa está conformada como un prisma (96) hexagonal que presenta diferentes funciones para cada una de las seis caras (87, 88, 89, 91, 92, 95) de unidad operativa y que puede albergar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en un alojamiento (95) de rotor en una de las caras.
Según una realización preferida de la invención, las seis caras (87, 88, 89, 91, 92, 95) de unidad operativa de la unidad (80) operativa comprenden;
dos caras que son cámaras (87, 89) diseñadas por ingeniería para el almacenamiento de bolsas de líquido que pueden estar a temperatura controlada;
una cara que es una cámara (95) de alojamiento de rotor que sujeta la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y está equipada con una matriz (70) magnética accionable;
una cara (91) que comprende una interfaz (86) de usuario así como puntos de unión para una cabeza (58) de bomba peristáltica y cabeza (57) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías;
una cara (92) que comprende puntos de unión para una cabeza (60) de bomba peristáltica y cabeza (61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías y,
una cara (88) que contiene conectores de entrada/salida de datos, conectores de potencia así como ventilación para control de temperatura.
Preferiblemente, la matriz (70) magnética accionable consiste en una forma arqueada diseñada para ajustarse al borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria cuando se engancha y que comprende además uno o más imanes (73) de alta intensidad de campo magnético tales como imanes de neodimio de alta intensidad de campo magnético.
En particular, la invención se refiere a un aparato compuesto por dos partes principales: (i) una unidad operativa (figura 8) que puede rotar alrededor de su centro alrededor de un eje horizontal y se sujeta por un árbol que proporciona soporte y potencia eléctrica y (ii) una cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria (figura 1) que está instalada en dicha unidad operativa. La invención, por medio de su unidad operativa que actúa sobre la cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, puede procesar, de una manera automatizada, muestras biológicas, tales como glóbulos blancos procedentes de aféresis, médula ósea o células cultivadas, para producir células modificadas por ingeniería genética. La cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está equipada con un estator de entrada (figura 3) y un estator de salida (figura 4) y puede rotar alrededor de su eje de rotor central perpendicular con el eje de rotación de la unidad operativa (figura 5). Dicha cámara de procesamiento puede hacerse funcionar a velocidades de rotación altas cuando está orientada en vertical para generar fuerza centrífuga sobre la muestra contenida y a velocidades bajas o mediante series de rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj cuando está orientada en horizontal para la incubación y resuspensión de sólidos (figura 9). La cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está conectada en sus estatores tanto inferior como superior a dos conjuntos independientes compuestos por una cabeza de bomba peristáltica desechable conectada a una cabeza de válvula selectora rotatoria de múltiples vías desechable conectada a varias bolsas de reactivo o de producto que forman son de un kit desechable (figura 7).
Unidad operativa
La unidad (80) operativa es un sistema activo y está conformada como tres prismas hexagonales unidos en las bases (96). El prisma hexagonal central es regular mientras que los prismas adyacentes presentan bases hacia fuera que son más pequeñas que sus bases hacia dentro, lo cual forma un efecto de sección decreciente que hace que los dos lados del dispositivo sean más pequeños que la porción central que está compuesta por el prisma hexagonal regular. La unidad (80) operativa presenta diferentes funciones para cada una de sus seis caras (87, 88, 89, 91, 92, 95) y puede albergar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en un alojamiento (95) de rotor en una de las caras. La unidad (80) operativa puede rotar alrededor de su centro alrededor de un eje (19) horizontal que pasa a través del árbol (16).
La rotación de la unidad (80) operativa se realiza mediante un motor (17) eléctrico ubicado dentro de la unidad (80) operativa junto al árbol (16) central. Un segundo motor (18) eléctrico, también ubicado en la unidad (80) operativa, acciona la rotación de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria. Ambos motores (17, 18) eléctricos son independientes uno de otro, permitiendo la característica innovadora y ventajosa de que la rotación de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria puede realizarse en múltiples orientaciones en el espacio (figura 5). Esta característica permite el uso de la cámara (1) de procesamiento en una posición (14) vertical para actuar como cuerpo centrífugo para separar sólidos a partir de una suspensión (figura 9a) y en una posición (15) horizontal como incubadora para la expansión de cultivo celular (figura 9c 2) o para la resuspensión de sólidos en una disolución (figura 9c). La orientación de la unidad (80) operativa puede controlarse mediante varios botones (83) convenientemente ubicados en la superficie de las caras de la unidad (80) operativa. La unidad (80) operativa alberga el kit (66) desechable conteniendo lugares en las seis caras en los que pueden instalarse diferentes elementos del kit.
En la cara (87) trasera superior reside una cámara para almacenamiento de reactivos. En la cara (91) delantera superior adyacente reside la interfaz (86) de usuario así como unos medios para unir la cabeza (57) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías de entrada y la cabeza (58) de bomba peristáltica desechable de entrada. En la cara delantera adyacente reside el alojamiento (95) de rotor, para instalar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria. En la cara (92) delantera inferior adyacente residen medios para la unión de la cabeza (60) de bomba peristáltica desechable de salida así como la cabeza (61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías de salida. En la cara (89) trasera inferior adyacente reside una cámara para almacenar los residuos (62), productos (63) finales y orificio (64) de muestreo. En la cara (88) trasera residen los conectores de transferencia de datos de entrada y de salida así como la conexión de potencia secundaria y las rejillas de ventilación de intercambiador térmico.
La cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está instalada en el alojamiento (95) de rotor por medio de puntos de unión en el estator (8) de entrada y el estator (10) de salida. El estator (10) de salida inferior de la cámara (1) de procesamiento se instala sujetándolo con abrazaderas a una cavidad (12) rotatoria. La cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria se hace rotar a lo largo de su eje (14, 15) mediante esta cavidad (12) rotatoria que se acciona por un motor (17) eléctrico. El estator (8) de entrada superior de la cámara (1) de procesamiento se instala sujetándolo con abrazaderas al alojamiento (95) de rotor. El tapón (13) accionable que permite cerrar la salida (5, 11) de cámara de procesamiento cuando se engancha (32) el tapón se acciona mediante un accionador lineal que está instalado en el alojamiento (95) de rotor. Dentro del alojamiento (95) de rotor, en la
parte trasera, reside la matriz (70) magnética que puede llevarse cerca del borde (7) de cámara de procesamiento por medio de un accionador, aplicando un intenso campo magnético al interior de la cámara (1) de procesamiento. Esta característica ventajosa permite la separación de perlas magnéticas (figura 8b) a partir de una disolución (103) dentro de la cámara (1) de procesamiento. El alojamiento (95) de rotor está cerrado con una pantalla (81) protectora transparente sujeta mediante puntos (82) de unión. El espacio del alojamiento (95) de rotor puede calentarse o enfriarse hasta temperaturas compatibles con patrones de cultivo celular mediante un conjunto de intercambiadores térmicos ubicados en la cara (88) trasera de la unidad (80) operativa.
La matriz (70) magnética está estructuralmente conformada para ajustarse estrechamente a la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, más precisamente al borde (7) entre la parte superior e inferior de la cámara de procesamiento, cuando se pone en contacto. Está conformada como un segmento de anillo o un arco y abarca varios imanes (73) de alta intensidad de campo magnético, tales como, pero sin limitarse a, de neodimio, todos ellos posicionados cerca unos de otros con su eje central perpendicular a la superficie de cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria. Un sensor (72) de proximidad está montado encima del cuerpo de la matriz (70) magnética para evaluar la proximidad de la matriz magnética a la superficie (1) de cámara de procesamiento. La matriz magnética puede moverse linealmente mediante la acción de un accionador lineal sobre el árbol (71).
La cara (91) delantera superior permite la instalación de la cabeza (58) de bomba peristáltica desechable de entrada y la cabeza (57) de selector rotatorio de múltiples vías desechable de entrada. La cara (92) delantera inferior permite la instalación de la cabeza (60) de bomba peristáltica desechable de salida así como la cabeza (61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías de salida. Los puntos de unión están diseñados para una instalación de kit inequívoca con numeración y guías a prueba de errores. Los tubos (56) de plástico se sujetan a la superficie mediante abrazaderas (84) incorporadas de una manera clara y ordenada para una configuración de sistema inequívoca. Una pantalla (86) de interfaz de usuario y una pantalla (90) que visualiza el estado de sistema y procedimiento, ubicadas en la cara delantera superior, se hacen funcionar mediante un panel (93) direccional de cuatro direcciones y un teclado numérico. El programa para la unidad (80) operativa puede establecerse por el operario mediante la interfaz (86) de usuario o mediante un terminal remoto y las directrices de instalación del kit (66) desechable se proporcionan en el panel (90) de avance de procedimiento.
Las caras (87) trasera superior y (89) trasera inferior son dos cámaras que pueden abrirse y cerrarse para almacenar las bolsas de reactivos y disoluciones. Las dos cámaras de almacenamiento de bolsas tienen forma de bastidor para albergar varias bolsas y varios litros de disolución. Las bolsas de reactivos se bloquean en la cámara por medio de tiras así como una cubierta de plástico transparente, lo cual resulta práctico para inspección visual. Todos los tubos (56) pueden salir de las cámaras a través de conductos (85, 94), que sujetan los tubos de una manera ordenada, para conectarse al resto del kit (66) desechable. Las cámaras pueden calentarse o enfriarse mediante un conjunto de intercambiadores térmicos ubicados en la cara (88) trasera de la unidad (80) operativa.
La cara que contiene los conectores (88) está ubicada en la parte trasera. Está equipada con conectores de datos de entrada y de salida tales como, pero sin limitarse a, USB, RS232 y RJ45, para control de aparato remoto y actualizaciones de firmware. Las rejillas de ventilación de calentadores e intercambiadores térmicos, así como entradas de potencia secundarias, están ubicadas en esta cara.
Kit desechable
Los kits (66) desechables de un único uso están compuestos por una cámara (1) de procesamiento concéntrica rotatoria, conectada tanto en su estator (8) de entrada como en su estator (10) de salida a dos conjuntos independientes compuestos por una cabeza (58, 60) de bomba peristáltica desechable conectada a una cabeza (57, 61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías desechable. La válvula selectora rotatoria de múltiples vías puede conectarse a varias bolsas de reactivos de calidad médica, bolsas de plástico vacías de calidad médica para la recogida o muestreo y tubos de conexión.
Los reactivos usados con este kit son normalmente muestras biológicas, tales como glóbulos blancos procedentes de aféresis, médula ósea o células cultivadas; así como tampones, tales como tampones compatibles con cultivo celular, solución salina y disoluciones iónicas; medio de crecimiento de cultivo celular; disoluciones virales, tales como diluciones de vectores lentivirales o vectores de ARN; suspensiones de perlas activantes, suspensiones de perlas magnéticas de unión y reactivos para desprendimiento de perlas magnéticas.
Para mostrar esto a modo de ejemplo, pueden usarse perlas de separación magnéticas para la purificación de, pero sin limitarse a, tipos de células CD34+, CD20+ y CD19+ y que después pueden modificarse mediante vectores lentivirales para la producción de células T con receptores de antígenos quiméricos o terapias génicas basadas en células madre hematopoyéticas.
En una realización, los reactivos del kit que se usan consisten en una bolsa (54) de muestra biológica de paciente conectada a una unidad (55) de filtración de perlas, bolsa (50) de tampón fosfato, bolsa (51) de medio de crecimiento de cultivo celular, una bolsa que contiene una suspensión (52) de perlas magnéticas, una bolsa que
contiene una disolución (53) de vector lentiviral y un pasador (59) de entrada para la adición de una bolsa de reactivos adicional. Todas están conectadas a una cabeza (57) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías desechable mediante tubos (56) de calidad médica conectados a una cabeza (58) de bomba peristáltica desechable conectada al estator (8) de entrada de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria. Una bolsa (62) de residuos generalmente grande, que puede albergar más que el volumen total de reactivo líquido, una bolsa (63) de recogida, un orificio (64) de muestreo y un orificio (65) de conexión de bolsa están conectados a una cabeza (61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías de salida conectada a una cabeza (60) de bomba peristáltica desechable de salida conectada al estator (10) de salida de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria.
Cámara de procesamiento hueca concéntrica rotatoria
La forma de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está caracterizada por dos partes, una parte superior esférica y una parte inferior en forma de embudo estrecha. La parte superior de la cámara es una semiesfera con un agujero sobresaliente en la parte (3) más superior alineado con el centro de la esfera parcial. En los bordes (7) de la esfera parcial, posicionados entre una cuarta parte y la mitad de la altura total de la cámara de procesamiento concéntrica, preferiblemente a una tercera parte, comienza la parte inferior, que se estrecha hacia abajo para dar una forma (6) de embudo que sigue una curva arqueada cóncava con un segundo agujero en la parte (4) más inferior. Varios agujeros (5) en la pared de cámara de procesamiento están ubicados cerca por encima del agujero (4) inferior. El borde (7) de cámara de procesamiento está caracterizado por un ángulo específico, que sirve como ubicación para que se agreguen sólidos y se unan tras la centrifugación (figura 9a). La parte más inferior de la cámara (30) de procesamiento concéntrica rotatoria está conformada para ajustarse a una cavidad (12) rotatoria cuando está montada en la unidad (80) operativa. La cavidad (12) rotatoria está conectada a un motor (17) eléctrico. La cámara (1) de procesamiento presenta un núcleo (2) hueco que puede recibir disoluciones de células, muestras biológicas o suspensiones biológicas turbias. Generalmente se fabrica de material de plástico de calidad médica, tal como, pero sin limitarse a; poli(tereftalato de etileno) o poliestireno, y puede tener modificaciones en superficie apropiadas para la aplicación de interés.
La parte inferior de la cámara (4) de procesamiento está caracterizada por un agujero central en el que el tapón (13) accionable se ajusta en la cámara y varios agujeros (5) laterales que cubre el tapón (31) cuando se engancha (32) que sirve como salida para el líquido cuando se desengancha (34) el tapón, y la parte inferior de esta cámara está diseñada por ingeniería para ajustarse y unirse a un estator (10) de salida.
El estator (8) de entrada está ubicado en la parte superior de la cámara (3) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y parcialmente insertado en la misma. Está diseñado por ingeniería para sujetar la cámara (1) de procesamiento al tiempo que todavía permite su rotación y que fluyan líquidos al interior de la misma. El estator (8) de entrada está caracterizado por dos partes unidas entre sí. Una parte (21) inferior que encierra una unidad (22a) de apoyo impermeable y unidades (23a) de sellado rotatorias enroscadas sobre una parte (20) superior. La parte (20) superior del estator (8) está caracterizada por una llave de entrada conectada a un accesorio (24) macho enroscable conectado al tubo (56). Cuando se introduce mediante bombeo, el líquido entrará en la cámara (2) centrífuga concéntrica hueca a través de la entrada (9) en la parte superior del estator (20).
El estator (10) de salida, ubicado en la parte inferior de la cámara (4) de procesamiento concéntrica, está diseñado por ingeniería de tal manera que la cámara (1) de procesamiento puede sujetarse, hacerse rotar y pueden fluir líquidos fuera de la misma. Esta salida (10) está caracterizada por un estator realizado en dos partes enroscadas entre sí. Está compuesto por una parte (25) superior que encierra dos unidades (22b) de apoyo impermeables y unidades (23b) de sellado rotatorias que forman una cámara (27) de salida de líquido que encierra los agujeros (5) laterales inferiores de rotor que permiten que pase el líquido. La parte (25) superior del estator (10) inferior se sujeta al rotor mediante una arandela (29) de retención y se aprieta mediante la parte inferior enroscable del estator (26). La parte (25) superior del estator (10) inferior está caracterizada por una llave de salida conectada a un accesorio (28) macho enroscable conectado al tubo (56).
En el centro del estator (10) inferior, un tapón (13) accionable se ajusta en la cámara (1) de procesamiento concéntrica. El tapón (13) accionable puede engancharse, actuando como obturador (32) de líquido, y desengancharse, permitiendo que fluya el líquido (34). Cuando se extrae mediante bombeo, el líquido saldrá de la cámara (1) de procesamiento concéntrica hueca rotatoria a través de la salida (11) en el estator (10) inferior. El tapón (13) accionable es un elemento en dos partes compuesto por una parte blanda de caucho (31) biocompatible, que se ajusta en la parte inferior de la cámara (4) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, y un árbol (33) de accionamiento que se ajusta en un accionador. El tapón (13) se engancha (32) o desengancha (34) por medio de un accionador y rota con la cámara (1) de procesamiento.
La cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria puede rotar alrededor de un eje (14, 15) central en ambos sentidos y puede rotar alrededor de un eje (19) externo perpendicular por medio de la unidad (80) operativa. La unidad (80) operativa puede desplazar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica desde una posición (14) vertical hasta una (15) horizontal.
La forma específica de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria es necesaria para realizar las operaciones presentadas en la siguiente sección. La parte inferior, conformada como un embudo arqueado cóncavo, es crítica para permitir que se acumule líquido rápidamente en la salida (5) de líquido y se evacúe de manera eficiente. Además, el ángulo (6) en la salida, cuando el tapón (13) accionable está enganchado (32), no es vertical. Tras la centrifugación, cuando la cámara (1) de procesamiento está en vertical (14), permite generar una fuerza ascendente sobre el líquido desplazándolo en el borde (7) de cámara de procesamiento. El radio desde el eje (14) de rotación hasta el borde (7) de cámara de procesamiento es lo suficientemente grande como para obtener una fuerza centrífuga compatible con el procesamiento celular a velocidades de rotación técnicamente razonables. El ángulo en el borde (7) de cámara de procesamiento permite, cuando tiene lugar la centrifugación, que los sólidos se agreguen y permanezcan unidos. Cuando está orientada en horizontal (15), la semiesfera superior permite almacenar más volumen en la cámara (1) de procesamiento y que la superficie de contacto entre líquido y aire en la cámara de procesamiento sea lo suficientemente grande con respecto a patrones de cultivo celular.
Procedimiento u operaciones
La producción automatizada de disoluciones terapéuticas basadas en células se realiza por medio del aislamiento y la transformación viral de células de interés a partir de un líquido biológico. El procedimiento de fabricación anteriormente mencionado se realiza mediante operaciones secuenciales, tales como llenado de la cámara de procesamiento, vaciado de la cámara de procesamiento, separación de materia sólida biológica a partir de una suspensión mediante centrifugación, suspensión y mezclado de materia sólida biológica en un líquido o disolución de reactivo de interés, incubación de perlas magnéticas de unión con una suspensión biológica, separación de células de interés magnéticamente marcadas a partir de una suspensión biológica mediante separación de perlas magnéticas usando una matriz magnética, transformación de células de interés usando un vector lentiviral o un vector de ARN, modificación del volumen de disolución, cultivo de células de interés y expansión de estas células en la cámara de procesamiento.
En particular, otro objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos que incluye la separación de sólidos biológicos, resuspensión de agregados, incubación de reactivos y/o células, separación magnética de células de interés y expansión de cultivo celular en una cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria que puede recibir líquidos y puede hacerse funcionar en múltiples orientaciones en el espacio por medio de una unidad (80) operativa equipada con un conjunto de reactivos y bolsas que son parte de un kit (66) desechable y que puede realizar:
- cuando está orientada en vertical (14), centrifugación con el fin de separar líquidos a partir de sólidos y ajuste del volumen;
- cuando está orientada en horizontal (15), resuspensión de sólidos, unión magnética a perlas magnéticas, incubación en disolución y mezclado y ajuste del volumen;
y en el que el conjunto de operaciones para realizar dicho procesamiento de líquidos biológicos comprende una combinación encadenada y/o repetición de procedimientos de ajuste del volumen y centrifugación cuando la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está en vertical (14) y,
rotación a baja velocidad, rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj, unión magnética a perlas magnéticas, incubación en disolución y mezclado cuando la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está en horizontal (15).
En una realización, la invención proporciona un procedimiento para la separación de sólidos biológicos que se realiza mediante:
- posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) mediante una rotación de la unidad (80) operativa y llenarla con una suspensión (100) biológica que después se centrifuga haciendo girar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria a lo largo de su eje (14) durante un tiempo establecido a una velocidad establecida para generar una fuerza centrífuga, lo cual da como resultado que los sólidos biológicos se separan del líquido y se agregan (102) en el borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria;
- seguido por detener progresivamente la rotación de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, dando como resultado que la fase (101) líquida fluye hacia abajo y la fase (102) sólida queda unida al borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria;
- bombeándose la fase (101) líquida resultante hacia fuera en el estator (10) de salida.
En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para la resuspensión de agregados que se realiza mediante:
posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en horizontal (15) mediante una rotación de la unidad (80) operativa, y
hacer rotar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria alrededor de su eje (15) horizontal mediante una serie de rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj durante un tiempo establecido, y
desprender el sólido (102) agregado obtenido y suspenderlo en la fase (106) líquida.
En aún otra realización, la invención proporciona un procedimiento para la incubación de reactivos y/o células, que se realiza mediante:
posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en horizontal (15) mediante una rotación de la unidad (80) operativa, mezclar la suspensión (106) biológica en la cámara (1) de procesamiento con un reactivo de interés y hacer rotar la cámara (1) de procesamiento concéntrica alrededor de su eje central mediante una rotación a baja velocidad durante un tiempo establecido a una temperatura establecida.
Otro objetivo de la invención también es proporcionar un procedimiento para la separación magnética de células de interés, que se realiza mediante:
- incubar una suspensión (103) biológica con perlas (104) de selección magnética de unión; orientar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria a una posición (15) horizontal mediante una rotación de la unidad (80) operativa; poner la matriz (70) magnética cerca del borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, dando como resultado la atracción de las perlas (104) magnéticas;
- hacer rotar la unidad (80) operativa para posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) con la matriz (70) magnética mantenida en estrecho contacto con el borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, lo cual da como resultado que la suspensión (103) no deseada fluye a la parte inferior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y después se bombea hacia fuera en una bolsa (62) de residuos mientras que las células de interés, unidas a las perlas (104) magnéticas, permanecen magnéticamente en el borde (7); y retraer la matriz (70) magnética para permitir que las perlas (104) magnéticas fluyan libremente.
Todavía otro objetivo de la invención es proporcionar un procedimiento para la expansión de cultivo celular, que se realiza mediante:
tener una suspensión (106) de células homogénea que reside en medio de cultivo celular dentro de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria orientada en horizontal (15) mediante la acción de la unidad (80) operativa que realiza rotación a baja velocidad para realizar una operación de incubación durante un tiempo suficiente;
después de dicho tiempo suficiente, se orienta la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) mediante la acción de la unidad (80) operativa y se realiza un muestreo mediante un orificio (64) de muestreo con el fin de evaluar el estado del cultivo (106) celular; lo cual en el caso de necesitar una renovación del medio, se realiza una operación de separación de sólidos biológicos evacuándose el medio (101) de cultivo antiguo a partir de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y se añade nuevo medio (105) de cultivo celular,
el procedimiento va seguido por una resuspensión de agregados seguida por incubación adicional hasta que el recuento celular es satisfactorio.
Llenado y vaciado de la cámara de procesamiento:
El llenado de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria puede realizarse de diversas maneras. 1. Se orienta la cámara (1) de procesamiento en vertical (14) por medio de la unidad (80) operativa con el estator (8) de entrada orientado hacia arriba. Se engancha (32) el tapón (13) accionable bloqueando los agujeros (5) de salida de cámara. Se activa la cabeza (58) de bomba peristáltica conectada al estator (8) de entrada con el fin de bombear un reactivo de interés dentro de la cámara (2) de procesamiento.
2. Se orienta la cámara (1) de procesamiento en horizontal (15) por medio de la unidad (80) operativa. Se engancha (32) el tapón (13) accionable. Se activa la cabeza (58) de bomba peristáltica conectada al estator (8) de entrada con el fin de bombear un reactivo de interés dentro de la cámara (2) de procesamiento.
3. Se orienta la cámara (1) de procesamiento en horizontal (15) por medio de la unidad (80) operativa. Se
desengancha (34) el tapón (13) accionable. Se activa la cabeza (60) de bomba peristáltica conectada al estator (10) de salida con el fin de bombear un reactivo de interés dentro de la cámara (2) de procesamiento. Este caso es particular ya que la parte generalmente denominada estator (10) de salida pasa a ser un estator de entrada.
El vaciado de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria puede realizarse de una manera sencilla. Se orienta la cámara (1) de procesamiento en vertical (14) por medio de la unidad (80) operativa con el estator (8) de entrada orientado hacia arriba. Se desengancha (34) el tapón (13) accionable descubriendo los agujeros (5) de salida de cámara de procesamiento. Se activa la cabeza (60) de bomba peristáltica conectada al estator (10) de salida con el fin de bombear la disolución que reside en la parte inferior de la cámara (6) de procesamiento fuera de la cámara (2) de procesamiento. Se engancha (32) de nuevo el tapón (13) accionable cuando la cámara (1) de procesamiento está vacía.
Operación de separación de sólidos biológicos
Una operación de separación de sólidos biológicos (figura 9a) se realiza normalmente de la siguiente manera:
9a 1: Se posiciona la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) mediante una rotación de la unidad (80) operativa y se carga una disolución de células, líquido biológico o suspensión (100) biológica turbia a través de la entrada (9) en la cámara (2) de procesamiento y fluye hasta la parte (6) inferior. Se engancha (32) el tapón (13) accionable forzando que el líquido permanezca en la cámara (2) de procesamiento. 9a 2: Se hace girar rápidamente la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica alrededor del eje (14) vertical para producir una fuerza centrífuga durante un tiempo establecido. La suspensión fluirá hacia la parte superior de la cámara de procesamiento y se acumulará en la parte (7) más grande de la cámara (1) de procesamiento. Los sólidos biológicos se separarán del líquido y se agregarán en el borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica formando una fase (101) líquida transparente y una fase (102) sólida.
9a 3: Se detiene lentamente la rotación de la cámara (1) centrífuga hueca concéntrica. La fase (101) líquida transparente fluirá hacia abajo hasta la parte (6) inferior de la cámara (2) hueca. La fase (102) sólida permanecerá unida a la parte (7) de rotor más grande.
9a 4: Se desengancha (34) el tapón (13) accionable permitiendo bombear el líquido transparente fuera de la cámara (2) de procesamiento hueca concéntrica a través de la salida (11). La cámara (1) de procesamiento puede llenarse con un nuevo líquido de interés para su lavado adicional o llenarse con otro volumen de suspensión que va a separarse.
Operación de resuspensión de agregados:
Una operación de resuspensión de agregados (figura 9c) se realiza normalmente de la siguiente manera:
9c 1: Se pone la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica, con sólidos (102) centrifugados unidos al borde (7) de cámara de procesamiento tras la centrifugación, en una posición (15) horizontal mediante una rotación de la unidad (80) operativa. Se carga una disolución (105) transparente que puede ser, pero no está limitada a, medio de cultivo celular o tampón, a través de la entrada (9) y fluye hasta el lado (7) de cámara de procesamiento. Se hace rotar la cámara (1) de procesamiento siguiendo una serie de rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj que desprenden el sólido (102) agregado y lo suspenden en la fase (105) líquida.
9c 2: Se detiene la rotación y se obtiene (106) una suspensión de células homogénea. La cámara (1) de procesamiento puede sujetarse en horizontal (15) para incubar adicionalmente la suspensión o puede orientarse en vertical (14) para el procesamiento adicional mediante rotación de la unidad (80) operativa.
Operación de incubación de reactivos y/o células:
Una operación de incubación de reactivos y/o células (figura 9c 2) se realiza normalmente de la siguiente manera: 9c 2: Se posiciona la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en horizontal (15) mediante una rotación de la unidad (80) operativa y se mezcla la suspensión (106) biológica presente en la cámara con, pero sin limitarse a, un reactivo de interés, un vector lentiviral o perlas magnéticas de unión. Se hace rotar la cámara (1) de procesamiento concéntrica alrededor de su eje (15) central mediante una rotación lenta durante un tiempo establecido. Puede ajustarse la temperatura para satisfacer necesidades de incubación.
Operación de separación magnética de células de interés
Una operación de separación magnética de células de interés (figura 9b) se realiza normalmente de la siguiente manera:
9b 1: Se carga una suspensión de perlas (104) magnéticas para el reconocimiento de características celular de interés a través de la entrada (9) dentro de la cámara (2) de procesamiento hueca concéntrica que contiene una disolución de células, muestras biológicas o una suspensión (103) biológica turbia y fluye a la parte inferior de la cámara (6) de procesamiento.
9b 2: Se pone la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en una posición (15) horizontal mediante una rotación de la unidad (80) operativa y se incuba la disolución o bien mediante rotación lenta o bien mediante rotación lenta en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj alrededor del eje (15) de cámara de procesamiento durante un tiempo establecido a una temperatura establecida. Se detiene la rotación y se separan las perlas (104) magnéticas a partir de la disolución (103) biológica mediante deposición.
9b 3: Se lleva la matriz (70) magnética al lado (7) de cámara de procesamiento concéntrica, atrayendo y separando adicionalmente las perlas (104) magnéticas a partir de la disolución (103) biológica.
9b 4: Se hace rotar la unidad (80) operativa para posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) con la matriz (70) magnética mantenida en estrecho contacto con el borde (7) de cámara de procesamiento. La suspensión (103) no deseada fluye a la parte inferior de la cámara (6) de procesamiento concéntrica.
9b 5: Se evacúa la disolución biológica no deseada a partir de la cámara (2) centrífuga hueca concéntrica a través de la salida (11). Las células de interés todavía están unidas a las perlas (104) magnéticas por medio de la matriz (70) magnética. Se engancha (32) el tapón (13) accionable y puede retraerse la matriz (70) magnética para liberar las perlas magnéticas o puede bombearse un líquido al interior de la cámara (2) de procesamiento concéntrica para lavar adicionalmente las células (104) unidas.
Operación de expansión de cultivo celular:
Una operación de expansión de cultivo celular (figura 9d) se realiza normalmente de la siguiente manera:
9d 1: Una suspensión (106) de células homogénea que va a expandirse reside en medio de cultivo celular dentro de la cámara (2) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria.
9d 2: Se orienta la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en horizontal (15) mediante la acción de la unidad (80) operativa. Se hace rotar lentamente la cámara de procesamiento para realizar una operación de incubación (figura 9c 2) a una temperatura establecida.
9d 3: Tras un tiempo establecido, se orienta la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) mediante la acción de la unidad (80) operativa. Se desengancha (34) el tapón (13) accionable y se realiza el muestreo a través del orificio (64) de muestreo con el fin de evaluar el estado del cultivo (106) celular. Si no hay necesidad de renovar el medio de cultivo (106) celular, la unidad (80) operativa vuelve a 9d 2.
9d 4 a 9d 6: Se necesita renovar el medio de cultivo. Se realiza una operación de separación de sólidos biológicos (figura 9a). Se evacúa el medio (101) de cultivo antiguo (figura 9d 6) a partir de la cámara (2) de procesamiento y se añade nuevo medio (105) de cultivo celular.
9d 7: Se realiza una operación de resuspensión de agregados (figura 9c) y se deja incubar el cultivo (106) celular (figura 9c 2) hasta que el recuento celular es satisfactorio.
Los expertos en la técnica apreciarán que la invención descrita en el presente documento es propensa a variaciones y modificaciones distintas de las descritas específicamente. Debe entenderse que la invención incluye todas de tales variaciones y modificaciones sin alejarse del espíritu o las características esenciales de la misma. La invención también incluye todas las etapas, características, composiciones y compuestos mencionados o indicados en esta memoria descriptiva, de manera individual o colectiva, y todas y cada una de las combinaciones o dos o más cualesquiera de dichas etapas o características. Por tanto, debe considerarse que la presente divulgación en todos los aspectos es ilustrativa y no restrictiva, indicándose el alcance de la invención por las reivindicaciones adjuntas, y se pretende que todos los cambios que entren dentro del significado y alcance de equivalencia queden abarcados en la misma.
A lo largo de esta memoria descriptiva se mencionan diversas referencias, cada una de las cuales se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad.
La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, tales ejemplos son ejemplares de métodos de puesta en práctica de la presente invención y no se pretende que limiten alcance de la invención.
Ejemplo 1: En una aplicación, se aíslan células CD32+, se transforman y se purifican a partir de glóbulos blancos recogidos mediante aféresis para producir células madre hematopoyéticas resistentes a VIH. Los reactivos y el kit se preparan de la siguiente manera: una bolsa de producto de aféresis (de 500 a 800 ml), una bolsa de tampón fosfato sin calcio o magnesio (300 ml), una disolución de lentivirus cargada para la desactivación del gen de CCR5 (de 50 a 100 ml), una disolución de perlas magnéticas que se dirigen específicamente a células CD34+ (de 5 a 10 ml), una disolución de medio de crecimiento de cultivo celular de Eagle modificado con alto contenido en glucosa (1,5 I), una bolsa de residuos (2 I) y una bolsa de recogida de producto final (100 ml). El operario orienta la unidad (80) operativa para que la cámara (87) de reactivo esté orientada hacia él usando los botones (83) de orientación de unidad operativa. Se colocan las bolsas de reactivos en la cámara (87) de cara de reactivos y se bloquean en su sitio usando tiras. Se fijan los tubos al conducto (85) de salida de una manera ordenada y se cierra la cámara con la cubierta de plástico transparente. El operario orienta la unidad (80) operativa para que la segunda cara (91) esté orientada hacia él con el fin de instalar la cabeza (57) de válvula rotatoria de múltiples vías de entrada y la cabeza (58) de bomba peristáltica. El operario se asegura de que los tubos están sujetos con abrazaderas (84) a la superficie de cara antes de orientar la cámara (95) de rotor delante de él. Se coloca la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria ajustando en primer lugar el estator (10) de salida y el tapón (13) accionable en la cavidad (12) rotatoria. Se sujeta el estator (8) de entrada con abrazaderas en la cavidad en la parte superior de la cámara (95) de rotor. Se bloquea el vidrio (81) de cubierta de seguridad para cerrar la cámara (95) rotatoria. El operario orienta la unidad (80) operativa para que la tercera cara (92) esté orientada hacia él con el fin de instalar la cabeza (61) de válvula rotatoria de múltiples vías de salida y la cabeza (60) de bomba peristáltica. El operario fija los tubos (56) de una manera ordenada en el conducto (94) de entrada de cámara de salida y hace rotar la unidad (80) operativa para colocar las bolsas (62) de residuos y (63) de producto final en su cámara (89) apropiada así como la salida (64) de tubo de muestreo en su cavidad. Se lanza el procesamiento de células seleccionando el método en la unidad (80) operativa mediante la interfaz (86) de usuario o mediante un terminal remoto. El operario procede a una autocomprobación semiautomatizada para garantizar la progresión óptima. Se pone la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en una posición (14) vertical mediante la acción de la unidad (80) operativa. Se ceban las líneas con tampón fosfato antes de cargar la muestra de paciente en la cámara (2) de procesamiento. Se realiza una operación de separación de materia sólida biológica (figura 9a) y se bombea el líquido resultante al interior de la bolsa (62) de residuos. Se bombea tampón fosfato al interior de la cámara de procesamiento (2, 50 ml) y se realiza una operación de resuspensión de agregados biológicos (figura 9c). Se repiten dos veces las dos operaciones anteriores para lavar exhaustivamente la muestra. Después se realiza una operación de incubación (figura 9c2) con perlas de separación magnética. Se realiza tres veces una operación de separación magnética (figura 9b), las dos primeras veces con tampón fosfato (50 ml) y la última con medio de crecimiento de cultivo celular bombeado al interior de la cámara de procesamiento (2, de 2 a 10 ml). Se realiza una operación de incubación (figura 9c 2) con el vector lentiviral. Se realiza de nuevo tres veces una operación de separación magnética (figura 8b), las dos primeras veces con tampón fosfato (50 ml) y la última con medio de crecimiento de cultivo celular (50 ml). Se realiza una operación de expansión de cultivo celular hasta que el recuento celular alcanza 109 células. Se realiza una operación de separación de materia sólida biológica (figura 9a) y se bombea el líquido resultante al interior de la bolsa (62) de residuos. Se realiza una operación de resuspensión de agregados biológicos (figura 9c) y se recoge toda la disolución en la bolsa (63) de producto final.
Ejemplo 2: Este ejemplo ilustra la preparación de células madre autólogas congeladas, para el trasplante en el caso del tratamiento de cáncer. Se deja descongelar una bolsa de células madre de paciente seleccionadas (20 ml). Se conecta a un kit desechable (una variación de 66) compuesto por los siguientes reactivos: una bolsa de tampón fosfato sin calcio o magnesio (300 ml), una disolución de medio de crecimiento de cultivo celular de Eagle modificado con alto contenido en glucosa (1,5 I), una bolsa de residuos (2 I) y una bolsa de recogida de producto final (100 ml). Se instala el kit desechable (una variación de 66) y se prepara la unidad (80) operativa para realizar un procedimiento tal como se presenta en el ejemplo 1. Se realiza una operación de separación de materia sólida biológica (figura 9a) y se bombea el líquido resultante al interior de la bolsa (62) de residuos. Se bombea tampón fosfato al interior de la cámara de procesamiento (2, 50 ml) y se realiza una operación de resuspensión de agregados biológicos (figura 9c). Se repiten las dos operaciones anteriores dos veces para lavar exhaustivamente la muestra, la última con medio de crecimiento de cultivo celular (50 ml). Se realiza una operación de expansión de cultivo celular hasta que el recuento celular alcanza 109 células. Se realiza una operación de separación de materia sólida biológica (figura 9a) y se bombea el líquido resultante al interior de la bolsa (62) de residuos. Se realiza una operación de resuspensión de agregados biológicos (figura 9c) y se recoge toda la disolución en la bolsa (63) de producto final.
Claims (13)
- REIVINDICACIONESi. Aparato automatizado adecuado para la preparación de células genéticamente transformadas a partir de líquidos biológicos que comprende:(i) una unidad (80) operativa que puede rotar alrededor de su centro alrededor de un eje (19) horizontal, (ii) un árbol (16) de eje central que sujeta la unidad (80) operativa proporcionando soporte y potencia eléctrica,caracterizado porque la unidad (80) operativa comprende una cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria que tiene- una parte superior que es una semiesfera con la parte redondeada orientada hacia arriba con un agujero (3) sobresaliente en su parte más superior;- bordes (7) inferiores de la semiesfera posicionados a entre una cuarta parte y la mitad de la altura total de la cámara (1) de procesamiento concéntrica rotatoria formando un ángulo perpendicular con la parte inferior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica que se estrecha hacia abajo para dar una forma (6) de embudo que sigue una curva arqueada cóncava con un agujero (4) inferior en su parte más inferior; y en el que dicha unidad (80) operativa está configurada para desplazar dicha cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria desde una posición (14) vertical hasta una (15) horizontal que confieren diferentes operaciones a dicho aparato automatizado.
- 2. Aparato automatizado según la reivindicación 1, en el que la cámara (1) de procesamiento concéntrica rotatoria comprende además uno o más agujeros (5) laterales circularmente dispuestos por encima del agujero (4) inferior.
- 3. Aparato automatizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está equipada con un estator (8) de entrada en su parte superior y un estator (10) de salida en su parte inferior que permiten bombear líquidos al interior y al exterior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria.
- 4. Aparato automatizado según cualquiera de las reivindicaciones 2-3, en el que un tapón (13) accionable conformado para ajustarse al agujero (4) inferior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria puede engancharse (32) o desenganchase (34) para bloquear o desbloquear respectivamente el uno o más agujeros (5) laterales circularmente dispuestos.
- 5. Aparato automatizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está conectada en sus estatores tanto (10) inferior como (8) superior a dos conjuntos independientes compuestos por una cabeza (58, 60) de bomba peristáltica desechable conectada a una cabeza (57, 61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías desechable conectada a varias bolsas de reactivo o de producto para formar un kit (66) desechable.
- 6. Aparato automatizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la unidad (80) operativa está conformada como un prisma (96) hexagonal que presenta diferentes funciones para cada una de las seis caras (87, 88, 89, 91, 92, 95) de unidad operativa y que puede albergar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en un alojamiento (95) de rotor en una de las caras.
- 7. Aparato automatizado según la reivindicación 6, en el que las seis caras (87, 88, 89, 91, 92, 95) de unidad operativa comprenden:dos caras que son cámaras (87, 89) diseñadas por ingeniería para el almacenamiento de bolsas de líquido que pueden estar a temperatura controlada;una cara que es una cámara (95) de alojamiento de rotor que sujeta la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y está equipada con una matriz (70) magnética accionable;una cara (91) que comprende una interfaz (86) de usuario así como puntos de unión para una cabeza (58) de bomba peristáltica y cabeza (57) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías;una cara (92) que comprende puntos de unión para una cabeza (60) de bomba peristáltica y cabeza (61) de válvula selectora rotatoria de múltiples vías y,una cara (88) que contiene conectores de entrada/salida de datos, conectores de potencia así como ventilación para control de temperatura.
- 8. Aparato automatizado según la reivindicación 7, en el que la matriz (70) magnética accionable consiste en una forma arqueada diseñada para ajustarse al borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria cuando se engancha y que comprende además uno o más imanes (73) de alta intensidad de campo magnético.
- 9. Procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos incluyendo separación de sólidos biológicos, resuspensión de agregados, incubación de reactivos y/o células, separación magnética de células de interés y expansión de cultivo celular en una cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria que puede recibir líquidos y puede hacerse funcionar en múltiples orientaciones en el espacio por medio de una unidad (80) operativa equipada con un conjunto de reactivos y bolsas que son parte de un kit (66) desechable y que puede realizar:- cuando está orientada (14) en vertical, centrifugación con el fin de separar líquidos a partir de sólidos y ajuste del volumen;- cuando está orientada (15) en horizontal, resuspensión de sólidos, unión magnética a perlas magnéticas, incubación en disolución y mezclado y ajuste del volumen;caracterizado porque el conjunto de operaciones para realizar dicho procesamiento de líquidos biológicos comprende una combinación encadenada y/o repetición de procedimientos de ajuste del volumen y centrifugación cuando la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está en vertical (14) y, rotación a baja velocidad, rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj, unión magnética a perlas magnéticas, incubación en disolución y mezclado cuando la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria está en horizontal (15).
- 10. Procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos según la reivindicación 9, en el que la operación para la separación de sólidos biológicos se realiza mediante:- posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) mediante una rotación de la unidad (80) operativa y llenarla con una suspensión (100) biológica que después se centrifuga haciendo girar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria a lo largo de su eje (14) durante un tiempo establecido a una velocidad establecida para generar una fuerza centrífuga, lo cual da como resultado que los sólidos biológicos se separan del líquido y se agregan (102) en el borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria;- seguido por detener progresivamente la rotación de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, dando como resultado que la fase (101) líquida fluye hacia abajo y la fase (102) sólida queda unida al borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria;- bombeándose la fase (101) líquida resultante hacia fuera en el estator (10) de salida.
- 11. Procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos según la reivindicación 9, en el que la operación para la resuspensión de agregados se realiza mediante:posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en horizontal (15) mediante una rotación de la unidad (80) operativa, yhacer rotar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria alrededor de su eje (15) horizontal mediante una serie de rotaciones secuenciales rápidas en el sentido de las agujas del reloj y el sentido contrario a las agujas del reloj durante un tiempo establecido, ydesprender el sólido (102) agregado obtenido y suspenderlo en la fase (106) líquida.
- 12. Procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos según la reivindicación 9, en el que la operación para la incubación de reactivos y/o células se realiza mediante:posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en horizontal (15) mediante una rotación de la unidad (80) operativa, mezclar la suspensión (106) biológica en la cámara (1) de procesamiento con un reactivo de interés y hacer rotar la cámara (1) de procesamiento concéntrica alrededor de su eje central mediante una rotación a baja velocidad durante un tiempo establecido a una temperatura establecida.
- 13. Procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos según la reivindicación 9, en el que la operación para la separación magnética de células de interés se realiza mediante:- incubar una suspensión (103) biológica con perlas (104) de selección magnética de unión; orientar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria a una posición (15) horizontal mediante una rotación de la unidad (80) operativa; poner la matriz (70) magnética cerca del borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, dando como resultado la atracción de las perlas (104) magnéticas;- hacer rotar la unidad (80) operativa para posicionar la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) con la matriz (70) magnética mantenida en estrecho contacto con el borde (7) de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria, lo cual da como resultado que la suspensión (103) no deseada fluye a la parte inferior de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y después se bombea hacia fuera a una bolsa (62) de residuos mientras que las células de interés, unidas a las perlas (104) magnéticas, permanecen magnéticamente en el borde (7); y retraer la matriz (70) magnética para permitir que las perlas (104) magnéticas fluyan libremente.Procedimiento para el procesamiento de líquidos biológicos según la reivindicación 9, en el que la operación para la expansión de cultivo celular se realiza mediante:tener una suspensión (106) de células homogénea que reside en medio de cultivo celular dentro de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria orientada en horizontal (15) mediante la acción de la unidad (80) operativa que realiza la rotación a baja velocidad para realizar una operación de incubación durante un tiempo suficiente;después de dicho tiempo suficiente, se orienta la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria en vertical (14) mediante la acción de la unidad (80) operativa y se realiza un muestreo mediante un orificio (64) de muestreo con el fin de evaluar el estado del cultivo (106) celular; lo cual, en el caso de necesitar una renovación de medio, se realiza una operación de separación de sólidos biológicos evacuándose el medio (101) de cultivo antiguo a partir de la cámara (1) de procesamiento hueca concéntrica rotatoria y se añade nuevo medio (105) de cultivo celular,el procedimiento va seguido por una resuspensión de agregados seguida por incubación adicional hasta que el recuento celular es satisfactorio.
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