CN112534040A - 由生物流体自动制备基因工程细胞的设备和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种适用于从生物流体制备基因转化细胞的自动化设备,该设备包括操作单元和旋转同心中空处理室,该处理室能够自动处理生物样品(例如来自单采血液、骨髓或培养细胞的白细胞),以制造基因工程细胞。操作单元可围绕水平轴线绕其中心旋转,并且处理腔室可绕其中心转子轴线旋转,该中心转子轴线垂直于操作单元的旋转轴线。所述处理室在垂直定向时可在高转速下运行,以在所含样品上产生离心力,从而使固体与液体分离,并且在水平定向时,低速旋转或进行一系列快速连续顺时针和逆时针旋转,以进行培养、固体再悬浮和磁珠磁性附着。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于从生物流体制造基因工程细胞的自动化设备和方法。特别地,该设备允许制备治疗溶液,通过基因工程细胞处理生物流体,从流体中分离细胞并进行细胞洗涤,通过对生物流体应用物理处理来浓缩和稀释,例如在基因治疗相关产品的背景下的离心,磁力分离和流体混合。
背景技术
基于干细胞或嵌合抗原受体T细胞基因工程的基因疗法目前正用于患者,并针对多种形式的癌症提供了前所未有的结果。该治疗产品通常如下制造:从患者体液中收集白细胞。从该收集物中,必须洗涤并分离感兴趣的细胞子集。这些相对较少的分离细胞将通过病毒载体的作用进行基因修饰。修饰的细胞必须扩增为大的培养物。这些疗法的制造通常由人类技术人员在洁净室中进行,并遵守严格的标准操作程序。人类劳动会对最终治疗产品的质量和可重复性产生负面影响,应采用自动化以提高生产适用治疗产品的成功率。
WO 2009/072003A2(MILTENYI BIOTEC GMBH[DE];MILTENYI STEFAN[DE];SCHIMMELPFENNIG WINFRIED)公开了一种系统,该系统包括:a)样品处理单元,其包括输入端口和输出端口,该输出端口连接至旋转容器,该旋转容器具有至少一个样品室,该样品处理单元配置为对样品提供第一处理步骤或旋转容器,以便对沉积在该室中的样品施加离心力,并分离沉积样品的至少第一组分和第二组分;以及b)样品分离单元,其连接至样品处理单元的输出端口,细胞分离单元包括分离柱保持器、泵和多个阀,该阀配置为通过设置在保持器中的流体回路和分离柱至少部分地控制流体流动,该分离柱配置为分离流过该柱的样品的标记和未标记的组分。
在US 2017/218331A1(MILTENYI STEFAN[DE]ET AL)中,公开了一种细胞修饰装置,其包括离心室,该离心室具有至少一个细胞修饰表面,该表面具有法向矢量,该法向矢量相对于离心室旋转轴呈135-45°,其中离心室包括至少一个输入/输出端口,并且通过以2-2000g旋转离心室,将待修饰细胞固定在细胞修饰表面上。此外,该发明涉及一种用于修饰细胞的方法,该方法包括以下步骤:将细胞引入细胞修饰装置中,该细胞修饰装置包括离心室,该离心室具有至少一个细胞修饰表面,该表面具有与离心室旋转轴成135-45°角的法向矢量,其中,离心室包括至少一个输入/输出端口;通过以2-2000g旋转离心室,将细胞固定在细胞修饰表面上;保持离心室的旋转直到细胞修饰完成。
在WO 2016/118700A1(HUTCHINSON FRED CANCER RES[US])中,描述了用于体外分离、生产和配制基因修饰细胞的平台。该平台利用软件支持的即时和/或便携设备,使基因治疗的应用更加广泛。
US 2005/054506A1(BRADLEY BRUCE J[US])描述了一种特别用于分离微生物的离心分离室。该室具有向上张开的圆锥形形状,并在其最宽处有一个样品收集槽。随着腔室旋转,样品被收集在样品槽中。当减速停止时,上清液会沉入腔室的底部,将样品留在可轻松存取的样品槽中。
WO 2016/097889A1(BIOSAFE SA[CH])公开了一种通过中空圆柱形离心处理室(300)中的处理步骤连续处理不透明和透明的生物流体(例如全血,单采血液,骨髓血,脐带血,血沉棕黄层或培养的细胞)的方法,该处理室是一次性装置的一部分。根据处理腔室中的给定处理概况,分别执行一次或重复多次从洗涤、培养、转导、分离、密度梯度分离、稀释和体积调节中选择的至少三种不同的步骤。每个步骤都涉及到处理室中的输入、处理室中的操作以及通过活塞(310)的位移从处理室中的输出。至少三个不同的步骤一个接一个地依次链接,以构成处理室及其一次性装置中的一个整体连续操作。第一个应用是将磁珠与人血细胞或干细胞结合的培养。第二个应用是转导,通过这种转导,外源遗传物质通过病毒插入人血细胞或干细胞。第三个应用是修复生物流体以达到血细胞或干细胞的可再生浓度和体积。
如所报道的,已经尝试使基因工程细胞的制造自动化。但是,诸如WO2016/097889A1或WO 2009/072003A2中示例的那些现有技术,当前不能在单个处理腔室中执行整个基因工程细胞制造。困难在于培养物大小随过程和过程的部分而变化,例如必须相应地在另一装置中进行细胞分离或最终细胞扩增至最终所需的细胞数或细胞分离,这增加了过程复杂性和最终产品潜在的损坏。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种适于制备基因转化细胞的自动化设备。该设备由操作单元和适合于进行细胞处理的旋转同心中空处理室组成。操作单元的形状是六边形的,并且能够围绕经过其中心并且垂直于旋转同心中空处理室的旋转轴线的轴旋转。操作单元容纳旋转同心中空处理室,并且通过其旋转可以将处理室定向在不同的位置,从而为所述处理室提供不同的可能操作。该操作单元在其六个面上具有不同的功能,并且在一个面上具有一个壳体,该壳体保持旋转同心中空处理室,可以对所述室进行调节并配备有可操作的磁阵列。最终,可操作的磁阵列可以紧密配合同心中空处理室的边缘以在室中施加磁场。旋转的中空处理室可以通过在垂直取向时进行离心来分离固体与液体,并且在水平取向时可以进行固体重悬和溶液培养。旋转同心中空处理室的特征在于其形状,它由一个半球形的顶部组成,其圆形部分朝上,在最顶部有一个孔;底部在半球的边缘与球形成直角,位于旋转同心处理室总高度的四分之一到一半之间,开始向下变窄为呈凹拱形的漏斗形,在最底部有第二个孔。旋转同心中空处理室在顶部装有进口定子,在底部装有出口定子,从而允许将液体泵入和泵出腔室。此外,旋转同心中空处理室在其底部和顶部定子上连接到两个独立的装置,这两个装置由一次性蠕动泵头组成,该蠕动泵头与一次性多路旋转选择器阀头相连,该一次性多路旋转选择器阀头与多个试剂袋或产品袋相连,形成单独使用的一次性试剂盒。最终,旋转的同心中空处理室具有可操作的塞子,其形状适合于其底部孔。它可以通过致动器接合或分离,以分别阻塞和疏通处理室液体出口。
本发明的另一个目的是提供一种方法,该方法在此定义为通过操作单元和旋转同心中空处理室执行的一组操作,例如填充处理室、清空处理室、离心以从液体中分离出固体、聚集体重悬、细胞和/或试剂培养、细胞培养扩增、磁性分离和体积调节,从而可以进行基因工程细胞的生产过程。
通过阅读随后的详细说明和所附权利要求,本发明的其他目的和优点对于本领域技术人员将变得显而易见,该详细说明参考以下说明性附图进行。
附图说明
通过技术附图描述该装置和方法,其中:
图1示出了旋转同心中空处理室的截面图。
图2示出了旋转同心中空处理室及其入口和出口定子的截面图。
图3是入口定子的放大截面图。
图4是出口定子及其功能模式的放大截面图。
图5是旋转同心中空处理室安装在操作单元上时的旋转和运动范围的示意图。
图6是可操作磁阵列的透视图。
图7是所使用的一次性试剂盒及其相关试剂的示意图。
图8是安装有一次性试剂盒的操作单元的透视图。
图9a是生物固体分离操作的流程图。
图9b是感兴趣的细胞操作的磁分离的流程图。
图9c是聚集体重悬操作以及试剂和/或细胞培养操作的流程图。
图9d是细胞培养扩增操作的流程图。
具体实施方式
尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中,但是下面描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用整体并入本文。本文讨论的出版物和申请仅是由于其在本申请的提交日期之前公开而提供的。本文中的任何内容均不得解释为承认本发明无权凭借在先发明而早于此类出版物。另外,材料、方法和实施例仅是说明性的,并不是为了限制。
在发生冲突的情况下,以包括定义的本说明书为准。
除非另有定义,否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本文主题所属领域的技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本文所使用的,提供以下定义以促进对本发明的理解。
术语“包括”通常以包含的含义使用,也就是说,允许存在一个或多个特征或组件。
如说明书和权利要求书中所使用的,单数形式的“一”和“该”包括复数引用,除非上下文另外明确指出。
如本文所使用的,术语处理室,无论其前面是否使用术语旋转、同心和中空的任何组合,均指相同的物体。
如本文所使用的,术语塞子或可操作塞子是指用于阻止液体流动的塞子。
如本文中所使用的,术语低速旋转是在2至100rpm之间的旋转速度。离心是在2000至6000G之间产生的转速;顺时针和逆时针快速连续旋转是2到400rpm之间旋转1到10s。
如本文中所使用的,术语足够的时间,当指细胞扩增时,是12至24小时;当指固体重悬时,是2至20分钟;当指离心时,是2至30分钟;当指慢病毒培养时,是15分钟到8小时。
如本文中所使用的,当涉及细胞培养扩增或培养时,与细胞培养标准相容的温度是在32至38℃之间。
如本文中所使用的,术语“令人满意的细胞数”是指108至1010个细胞之间或更多的细胞数目。
本发明的一个目的是提供一种适用于或适于从生物流体制备基因转化细胞的自动化设备,其包括:
(i)可绕水平轴线(19)绕其中心旋转的操作单元(80),
(ii)保持操作单元(80)并提供支撑和电力的中轴线轴(16),
其中,操作单元(80)包括一个旋转同心中空处理室(1),该室具有:
-半球形的顶部,其圆形部分朝上,在其最顶部有一个突出的孔(3);
-位于旋转同心处理室(1)总高度的四分之一和一半之间的半球的底边(7),与同心中空处理室(1)的底部形成垂直角,其向下变窄成遵循凹拱形曲线的漏斗形状(6),在其最底部具有底孔(4);
并且其中所述操作单元(80)配置为将所述旋转同心中空处理室(1)从竖直位置(14)移动到水平位置(15),从而使所述自动化设备具有不同的操作。
优选地,旋转同心处理室(1)还包括圆形地布置在底孔(4)上方的一个或多个侧孔(5)。
在本发明的一个实施方式中,旋转同心中空处理室(1)在其顶部装有入口定子(8),在其底部装有出口定子(10),以允许液体被泵入和泵出旋转同心中空处理室(1)。
特别地,成形为适合于旋转同心中空处理室(1)的底孔(4)的可操作塞(13)可被接合(32)或脱离(34),以分别阻塞或疏通一个或多个圆形布置的侧孔(5)。
在一个优选的实施方式中,旋转同心中空处理室(1)在其底部定子(10)和顶部定子(8)上连接到两个独立的装置,该装置由一次性蠕动泵头(58、60)组成,该泵头连接到一次性多路旋转选择器阀头(57、61),多路旋转选择器阀头与多个试剂袋或产品袋连接,以形成一次性试剂盒(66)。
优选地,操作单元(80)成形为六角棱柱(96),其六个操作单元面(87、88、89、91、92、95)的每一个具有不同的功能,并且可以在一个面上的转子壳体(95)中容纳旋转同心空心处理室(1)。
根据本发明的一个优选实施方式,操作单元(80)的六个操作单元面(87、88、89、91、92、95)包括:
作为腔室的两个面(87、89),设计用于存储可控温液体袋;
作为转子壳体腔室的一个面(95),其保持旋转同心中空处理室(1),并装有可操作的磁阵列(70);
一个面(91),包括一个用户界面(86)以及用于蠕动泵头(58)和多路旋转选择器阀头(57)的多个连接点;
一个面(92),包括用于蠕动泵头(60)和多路旋转选择器阀头(61)的多个连接点,以及
一个面(88),包含数据输入/输出连接器、电源连接器以及用于温度控制的通风孔。
优选地,可操作磁阵列(70)呈弓形形状,设计成在接合时匹配旋转同心中空处理室(1)的边缘(7),并且还包括一个或多个高磁场强度磁体(73),例如高磁场强度的钕磁体。
特别地,本发明涉及一种由两个主要部分组成的设备:(i)操作单元(图8),该操作单元可围绕水平轴线绕其中心旋转,并由提供支撑和电力的轴保持,以及(ii)安装在所述操作单元上的旋转同心中空处理室(图1)。本发明,通过其作用在旋转同心中空处理室上的操作单元,可以以自动化方式处理生物样品,例如来自单采血液、骨髓或培养细胞的白细胞,以制造基因工程细胞。旋转同心中空处理室配有入口定子(图3)和出口定子(图4),并且可绕其垂直于操作单元的旋转轴线的中心转子轴线旋转(图5)。所述处理室在垂直定向时可在高转速下运行,以在所容纳样品上产生离心力,而在水平定向时可以低速或通过一系列顺时针和逆时针快速连续旋转而操作,以进行培养和固体重悬浮(图9)。旋转同心空心处理室在其底部和顶部定子处连接到两个独立的装置上,这两个装置由一次性蠕动泵头组成,该蠕动泵头连接到一次性多路旋转选择器阀头,该阀头与一次性试剂盒的多个试剂或产品袋部分相连(图7)。
操作单元
操作单元(80)是主动系统,并且成形为在底座处连接的三个六角棱柱(96)。中心六角棱柱是规则的,而相邻的棱柱具有向外的底边,该向外的底边比它们的向内的底边小,这形成了逐渐变细的效果,使设备的两侧小于由规则六角棱柱所组成的中心部分。操作单元(80)的六个面(87、88、89、91、92、95)的每一个都具有不同的功能,并且可将旋转的同心中空处理室(1)容纳在一个面上的转子壳体(95)中。操作单元(80)可绕穿过轴(16)的水平轴线(19)绕其中心旋转。
操作单元(80)的旋转由位于操作单元(80)内部且靠近中心轴(16)的电动机(17)执行。同样位于操作单元(80)中的第二电动机(18)驱动旋转同心中空处理室(1)的旋转。两个电动机(17、18)彼此独立,从而允许创新和有益的特征,即旋转同心中空处理室(1)的旋转可以在空间中在多个方向上进行操作(图5)。该特征允许在垂直位置(14)利用处理室(1),从而作为离心体以从悬浮液中分离出固体(图9a),而在水平位置(15)中则用作细胞培养扩增的培养器(图9c 2)或用于固体重悬于溶液中(图9c)。可以通过方便地位于操作单元(80)的面的表面上的多个按钮(83)来控制操作单元(80)的取向。操作单元(80)通过在六个面上可安装试剂盒的不同元件的包含位置来容纳一次性试剂盒(66)。
在顶部背面(87)上存在一个用于试剂存储的腔室。用户界面(86)以及用于连接入口多路旋转选择器阀头(57)和入口一次性蠕动泵头(58)的装置位于相邻的顶部正面(91)上。转子壳体(95)位于相邻的正面上,用于安装旋转同心中空处理室(1)。在相邻的底部前面(92)上,设有用于连接出口一次性蠕动泵头(60)以及出口多路旋转选择器阀头(61)的装置。在相邻的底部背面(89)上,设有用于存储废物(62)、最终产品(63)和采样口(64)的腔室。在背面(88)上,放置有输入和输出数据传输连接器以及辅助电源连接和热交换器通风格栅。
旋转同心中空处理室(1)通过入口定子(8)和出口定子(10)上的连接点安装在转子壳体(95)中。通过将处理室(1)的底部出口定子(10)夹在旋转的插座(12)上来安装它。通过由电动机(17)驱动的旋转插座(12)使旋转同心中空处理室(1)沿其轴线(14、15)旋转。通过将处理室(1)的顶部入口定子(8)夹在转子壳体(95)上来安装它。当塞子被接合(32)时允许关闭处理室出口(5、11)的该可操作塞子(13)由安装在转子壳体(95)中的线性致动器驱动。在转子壳体(95)内部,磁阵列(70)位于后方,该磁阵列可以通过致动器带到处理室边缘(7)附近,从而向处理室(1)的内部施加强磁场。该有利特征允许将磁珠(图8b)与处理室(1)内部的溶液(103)分离。转子壳体(95)用由连接点(82)保持的透明保护屏(81)封闭。可以通过位于操作单元(80)的背面(88)中的一组热交换器将转子壳体(95)的空间加热或冷却至与细胞培养标准相适应的温度。
磁阵列(70)在结构上成形为当接触时紧密地贴合到旋转同心中空处理室(1),更精确地贴合到处理室的顶部和底部部分之间的边缘(7)。它的形状为环形段或拱形,并包含多个高磁场强度的磁体(73),例如但不限于钕,所有磁体放置在一起,它们的中心轴线都垂直于旋转同心中空加工室(1)表面。接近传感器(72)安装在磁阵列(70)的主体的顶部上,以评估磁阵列与处理室表面(1)的接近程度。磁阵列可通过线性致动器在轴(71)上的作用线性移动。
顶部正面(91)允许安装入口一次性蠕动泵头(58)和入口一次性多路旋转选择器头(57)。底部正面(92)允许安装出口一次性蠕动泵头(60)以及出口多路旋转选择器阀头(61)。连接点设计用于带有编号和防错指南的明确试剂盒安装。塑料管(56)通过内置夹子(84)以清晰有序的方式固定在表面上,用于明确的系统设置。通过四向方向键(93)和键盘来操作位于顶部正面上的用户界面屏幕(86)和显示系统和过程状态的屏幕(90)。操作单元(80)的程序可以由操作员通过用户界面(86)或通过远程终端设置,并且一次性试剂盒(66)的安装指南位于过程进展面板(90)上。
顶部背面(87)和底部背面(89)是两个可以打开和关闭以存储试剂袋和溶液的腔室。两个袋子存储室为机架形,可容纳多个袋子和数升溶液。试剂袋通过皮带和透明的塑料盖(这对于目视检查很实用)被锁定在腔室中。所有的管(56)都可以通过以有序的方式保持所述管的导管(85、94)离开腔室,以连接到一次性试剂盒(66)的其余部分。可以通过位于操作单元(80)背面(88)上的一组热交换器对腔室进行加热或冷却。
包含连接器的面(88)位于背面。它配备了输入和输出数据连接器,例如但不限于USB、RS232和RJ45,用于远程设备控制和固件升级。热交换器和加热器通风格栅以及辅助电源入口位于此面上。
一次性试剂盒
单性使用的一次性试剂盒(66)由旋转同心处理室(1)组成,在其进口定子(8)和出口定子(10)处连接到由一次性蠕动泵头(58,60)组成的两个独立的装置上,所述泵头连接到一次性多路旋转选择器阀头(57、61)。多路旋转选择器阀可以连接到多个医用级试剂袋、用于收集或采样的医用级空塑料袋以及连接管。
该试剂盒使用的试剂通常是生物样品,例如来自单采血液、骨髓或培养细胞的白细胞;以及缓冲液,例如与细胞培养兼容的缓冲液、盐溶液和离子溶液;细胞培养生长介质;病毒溶液,例如慢病毒载体或RNA载体的稀释液;活化珠的悬浮液,结合磁珠的悬浮液和用于磁珠分离的试剂。
为了举例说明,磁性分离珠可用于但不限于纯化CD34+、CD20+和CD19+细胞类型,其随后可用慢病毒载体修饰以生产嵌合抗原受体T细胞或基于基因疗法的造血干细胞。
在一个实施方式中,所使用的试剂盒包括连接至珠过滤单元(55)的患者生物样品袋(54)、磷酸盐缓冲液袋(50)、细胞培养生长介质袋(51)、装有磁珠悬浮液的袋(52)、装有慢病毒载体溶液的袋(53)和用于添加其他试剂袋的入口针(59)。它们都通过医用级管(56)连接到一次性多路旋转选择器阀头(57),该阀头连接到一次性蠕动泵头(58),该蠕动泵头连接到旋转同心中空处理室(1)的入口定子(8)。通常能够容纳大于液体试剂总体积的大废物袋(62)、收集袋(63)、采样端口(64)和袋连接端口(65)被连接到出口多路旋转选择器阀头(61),其被连接到出口(60)一次性蠕动泵头,该一次性蠕动泵头连接到旋转同心中空处理室(1)的出口定子(10)。
旋转同心中空处理室
旋转同心中空处理室(1)的形状由球形顶部和窄漏斗形底部两部分表征。腔室的顶部是一个半球形,在其最顶部上有一个与部分球的中心对齐的突出孔(3)。在位于同心处理室总高度的四分之一和一半之间(优选三分之一处)的部分球的边缘(7)处,底部开始向下变窄为漏斗形(6),该漏斗形遵循凹拱形曲线,在最底部有第二孔(4)。处理室壁上的多个孔(5)紧靠底部孔(4)的上方。处理室边缘(7)的特征在于特定的角度,其用作固体在离心作用下聚集并附着的位置(图9a)。旋转同心处理室的最底部(30)成形为当安装在操作单元(80)上时适合旋转插座(12)。旋转插座(12)连接到电动机(17)。
处理室(1)具有中空核心(2),该中空核心(2)能够容纳细胞溶液、生物样品或混浊的生物悬浮液。它通常由医用塑料制成,例如但不限于;聚对苯二甲酸乙二醇酯或聚苯乙烯,并且可以具有适合感兴趣的应用的表面改性。
处理室(4)的底部的特征在于中心孔和多个侧孔(5),通过中心孔将可操作塞子(13)固定在该腔室上,当接合时(32)塞子(31)覆盖侧孔,当塞子脱离时(34)侧孔用作液体出口,该腔室的底部设计成可匹配并连接到出口定子(10)。
入口定子(8)位于旋转同心中空处理室(3)的顶部,并部分插入其中。它设计为可在保持处理室(1)的同时仍允许其旋转并允许流体流入其中。入口定子(8)的特征在于两个相互连接的部分。底部(21)包围防水轴承单元(22a)和拧在顶部(20)上的旋转密封单元(23a)。定子(8)的顶部(20)的特征在于,入口嘴连接到与管(56)相连的螺纹式阳接头(24)。当泵入时,液体将通过定子(20)顶部的入口(9)进入中空同心离心室(2)。
设计位于同心处理室(4)底部的出口定子(10),以便可以保持、旋转处理室(1)并使流体从其中流出。该出口(10)的特征在于定子,该定子由拧在一起的两个部分制成。它包括一个顶部(25),其包围两个防水轴承单元(22b)和旋转密封单元(23b),形成了一个液体出口腔室(27),该液体出口腔室包围转子底部侧孔(5),允许液体通过。底部定子(10)的顶部(25)通过卡环(29)固定在转子上,并通过定子的螺纹式底部(26)紧固。底部定子(10)的顶部(25)的特征在于,出口嘴连接到与管(56)连接的螺纹式阳接头(28)。
在底部定子(10)的中心,一个可操作塞子(13)装入同心处理室(1)中。可操作塞子(13)可以接合,充当液体塞子(32),然后脱离,允许液体流动(34)。泵出后,液体将通过底部定子(10)上的出口(11)离开旋转中空同心处理室(1)。可操作塞子(13)是由两部分组成的元件,包括安装在旋转同心中空处理室的底部(4)的生物相容性橡胶(31)的柔软部分以及安装到致动器中的驱动轴(33)。塞子(13)通过致动器接合(32)或脱离(34),并随处理室(1)旋转。
旋转的同心中空处理室(1)可绕中心轴线(14、15)在两个方向上旋转,并可绕垂直的外轴线(19)通过操作单元(80)旋转。操作单元(80)可以将同心中空处理室(1)从垂直位置(14)移动到水平位置(15)。
旋转同心中空处理室(1)的特定形状对于执行以下部分中介绍的操作是必需的。成形为凹拱形漏斗的底部,对于使液体迅速积聚在流体出口(5)并有效地排空至关重要。此外,当可操作塞子(13)接合(32)时,出口处的角度(6)不是垂直的。离心时,当处理室(1)处于垂直位置(14)时,它可以在流体上产生向上的力,在处理室边缘(7)将其移动。从旋转轴线(14)到处理室边缘(7)的半径足够大,以在技术上合理的转速下获得与细胞处理兼容的离心力。处理室边缘(7)处的角度允许离心发生时,固体聚集并保持附着。当水平定向(15)时,顶部半球允许在处理室(1)中存储更多的体积,并且相对于细胞培养标准,允许处理室中的流体与空气的界面足够大。
工艺或操作
通过从生物流体中分离和病毒转化感兴趣的细胞,可以自动生产基于细胞的治疗溶液。上述制造过程是通过连续操作执行的,例如填充处理室、清空处理室、通过离心将生物固体物质从悬浮液中分离、将生物固体物质悬浮在感兴趣的液体或试剂溶液中并进行混合、利用圣物悬浮液培养结合磁珠、使用磁阵列通过磁珠分离从生物悬浮液中分离磁性标记的感兴趣的细胞、使用慢病毒载体或RNA载体转化感兴趣的细胞、改变溶液体积、培养感兴趣的细胞以及在处理室中扩增这些细胞。
特别地,本发明的另一个目的是提供一种用于处理生物流体的方法,该方法包括生物固体分离、聚集体重悬、试剂和/或细胞培养、感兴趣的细胞的磁性分离以及在旋转同心中空处理室(1)中的细胞培养扩增,所述处理室可以容纳流体,并可以通过操作单元(80)在空间中以多个方向操作,所述操作单元配备了一次性试剂盒(66)的一组试剂和袋部分,并且能够执行以下操作:
-垂直定向时(14)离心分离,以使液体与固体分离并调节体积;
-水平定向时(15)固体重悬,磁珠磁性附着,溶液培养和混合以及体积调节;
并且其中执行所述生物流体处理的一组操作包括以下步骤的链式组合和/或重复:当旋转同心中空处理室(1)垂直(14)时的体积调节和离心,以及当旋转同心中空处理室(1)水平(15)时的低速旋转、顺时针和逆时针快速连续旋转、磁珠磁性附着、溶液培养和混合。
在一个实施方式中,本发明提供了一种用于生物固体分离的方法,该方法通过以下步骤进行:
-通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)垂直(14)定位,并向其中填充生物悬浮液(100),然后通过使旋转同心中空处理室(1)沿其轴线(14)在设定的时间以设定的速度旋转进行离心,以产生离心力,使得生物固体从液体中分离出来,并在旋转同心中空处理室(1)的边缘(7)上聚集(102);
-随后逐渐停止旋转同心中空处理室(1)的旋转,使得液相(101)向下流动,并且固相(102)仍然附着在旋转同心中空处理室(1)的边缘(7)上;
-所得的液相(101)在出口定子(10)处被泵出。
在另一个实施方式中,本发明提供了一种用于聚集体重悬浮的方法,该方法通过以下步骤执行:
通过操作单元(80)的旋转将旋转的同心中空处理室(1)水平(15)定位,并且
通过一系列顺时针和逆时针快速连续旋转,使旋转同心中空处理室(1)绕其水平轴线(15)旋转设定的时间,以及
分离获得的聚集固体(102)并将其悬浮在液相(106)中。
在又一个实施方式中,本发明提供了用于试剂和/或细胞培养的方法,其通过以下步骤进行:
通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)水平(15)定位,将处理室(1)中的生物悬浮液(106)与感兴趣的试剂混合,并使同心处理室(1)绕其中心轴在设定温度下以低速旋转设定的时间。
本发明的另一个目的是提供一种用于磁分离感兴趣细胞的方法,该方法通过以下步骤进行:
-将生物悬浮液(103)与结合的磁性选择珠(104)一起培养;通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)定向到水平位置(15)。使磁阵列(70)靠近旋转同心中空处理室(1)的边缘(7),从而导致磁珠(104)的吸引;
-旋转操作单元(80),以使旋转同心中空处理室(1)垂直(14)定位,同时磁阵列(70)与旋转同心中空处理室(1)的边缘(7)保持紧密接触,使得多余的悬浮液(103)流入旋转同心中空处理室(1)的底部,然后被泵送到废物袋(62),而附着在磁珠(104)上的感兴趣的细胞磁性地留在边缘(7)上;撤销磁阵列(70)以使磁珠(104)自由流动。
本发明的又一个目的是提供一种用于细胞培养扩增的方法,该方法通过以下步骤进行:
通过操作单元(80)的作用,使滞留在水平定向(15)的旋转同心中空处理室(1)内的细胞培养介质中的均质细胞悬液(106)低速旋转,从而进行足够的时间的培养操作;
在所述足够的时间之后,通过操作单元(80)的作用使旋转同心中空处理室(1)垂直定向(14),并通过采样口(64)进行采样,以评估细胞培养物(106)状态;在需要更新介质的情况下,通过从旋转同心中空处理室(1)抽空旧培养介质(101)来执行生物固体分离操作,并添加新的细胞培养介质(105),
然后再进行聚集体重悬,然后进一步培养直至细胞计数令人满意。
填充和清空处理室:
可以以各种方式填充旋转同心中空处理室(1)。
1.通过操作单元(80)将处理室(1)垂直定向(14),使入口定子(8)朝上。可操作塞子(13)接合(32),阻塞腔室出口孔(5)。连接到入口定子(8)的蠕动泵头(58)被激活,以便将感兴趣的试剂泵送到处理室(2)内。
2.通过操作单元(80)将处理室(1)水平定向(15)。所述可操作塞子(13)被接合(32)。连接到入口定子(8)的蠕动泵头(58)被激活,以便将感兴趣的试剂泵送到处理室(2)内。
3.通过操作单元(80)将处理室(1)水平定向(15)。脱离(34)可操作塞子(13)。连接到出口定子(10)的蠕动泵头(60)被激活,以便将感兴趣的试剂泵送到处理室(2)内。这种情况是特别的,因为通常称为出口定子(10)的部分成为入口定子。
清空旋转同心中空处理室(1)可以通过一种方法进行。通过操作单元(80)使处理室(1)垂直定向(14),使入口定子(8)朝上。使可操作塞子(13)脱离(34),露出处理室出口孔(5)。连接到出口定子(10)的蠕动泵头(60)被激活,以便将残留在处理室底部(6)的溶液泵出处理室(2)。当处理室(1)为空时,可操作塞子(13)再次接合(32)。
生物固体分离操作
生物固体分离操作(图9a)通常如下执行:
9a 1:通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)垂直定位(14),细胞溶液、生物流体或混浊的生物悬浮液(100)通过入口(9)在处理室(2)中加载,并流到底部(6)。可操作塞子(13)接合(32),迫使流体停留在处理室(2)中。
9a 2:同心中空处理室(1)绕垂直轴线(14)快速旋转,以在设定的时间内产生离心力。悬浮液将流向处理室的顶部并积聚在处理室(1)的最大部分(7)。生物固体将与液体分离并聚集在同心中空处理室(1)的边缘(7)上,形成澄清的液相(101)和固相(102)。
9a 3:同心中空离心室(1)的旋转缓慢停止。澄清的液相(101)将向下流到中空室(2)的底部(6)。固相(102)将保持附着在最大的旋转部(7)上。
9a 4:脱离(34)可操作塞子(13),以使澄清液体通过出口(11)从同心中空处理室(2)泵出。处理室(1)可以填充新的感兴趣液体以进行进一步洗涤,也可以填充另一体积的待分离悬浮液。
聚集体重悬操作:
聚集体重悬操作(图9c)通常如下执行:
9c 1:在离心后离心固体(102)附着在处理室边缘(7)上,通过操作单元(80)的旋转使同心中空处理室(1)进入水平位置(15)。可以是但不限于细胞培养介质或缓冲液的澄清溶液(105)通过入口(9)加载,并流到处理室一侧(7)。在一系列顺时针和逆时针快速连续旋转之后,处理室(1)旋转,以分离聚集的固体(102)并将其悬浮在液相(105)中。
9c 2:停止旋转,并获得均质细胞悬浮液(106)。处理室(1)可以水平放置(15)以进一步培养悬浮液,也可以垂直放置(14),以便通过操作单元(80)的旋转进行进一步处理。
试剂和/或细胞培养操作:
试剂和/或细胞培养操作(图9c 2)通常如下执行:
9c 2:旋转同心中空处理室(1)通过操作单元(80)的旋转而水平定位(15),并且存在于该室中的生物悬浮液(106)与感兴趣试剂、慢病毒载体或结合磁珠混合(但不限于此)。同心处理室(1)通过缓慢旋转设定的时间绕其中心轴线(15)旋转。可以调节温度以满足培养需要。
感兴趣的细胞的磁分离操作
感兴趣的细胞的磁分离操作(图9b)通常如下进行:
9b 1:用于识别感兴趣的细胞特征的磁珠(104)悬浮液通过入口(9)载入包含细胞溶液、生物样品或混浊的生物悬浮液(103)的同心中空处理室(2)内,并流到处理室的底部(6)。
9b 2:通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)置于水平位置(15),并通过绕处理室轴线(15)的缓慢旋转或缓慢顺时针和逆时针旋转将溶液在设定温度下培养设定的时间。停止旋转,并通过沉积使磁珠(104)与生物溶液(103)分离。
9b 3:将磁阵列(70)带到同心处理室一侧(7),吸引磁性珠(104)并将其与生物溶液(103)进一步分离。
9b 4:旋转操作单元(80),以使旋转同心中空处理室(1)垂直(14)定位,同时磁阵列(70)保持与处理室边缘(7)紧密接触。多余的悬浮液(103)流到同心处理室的底部(6)。
9b 5:不需要的生物溶液通过出口(11)从同心中空离心室(2)中排出。感兴趣的细胞仍通过磁阵列(70)附着在磁珠(104)上。可操作塞子(13)被接合(32),并且磁阵列(70)可以撤销以释放磁珠,或者可以将液体泵送到同心处理室(2)中以进一步清洗附着的细胞(104)。
细胞培养扩增操作:
细胞培养扩增操作(图9d)通常如下执行:
9d 1:待扩增的均质细胞悬浮液(106)驻留在旋转同心中空处理室(2)内的细胞培养介质中。
9d 2:旋转同心中空处理室(1)在操作单元(80)的作用下水平定向(15)。缓慢旋转处理室,以在设定温度下执行培养操作(图9c 2)。
9d 3:经过设定的时间后,旋转同心中空处理室(1)在操作单元(80)的作用下垂直定向(14)。脱离(34)可操作塞子(13),并经由采样端口(64)执行采样,以便评估细胞培养物(106)的状态。如果不需要更新细胞培养(106)介质,则操作单元(80)将恢复为9d 2。
9d 4至9d 6:需要更新培养介质。进行生物固体分离操作(图9a)。从处理室(2)中排空旧培养介质(101)(图9d 6),并添加新细胞培养介质(105)
9d 7:进行聚集体重悬操作(图9c),并允许细胞培养物(106)进行培养(图9c 2),直到细胞计数令人满意为止。
本领域技术人员将理解,本文描述的发明除了具体描述的之外,还可以进行变化和修改。应当理解,本发明包括所有这样的变化和修改,而不背离其精神或基本特征。本发明还单独或共同地包括在本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。因此,本公开应被认为在所有方面是说明性的,而不是限制性的,本发明的范围由所附权利要求书指示,并且等同含义和范围内的所有改变均应包含在其中。
在整个说明书中引用了各种参考文献,每个参考文献均通过引用整体并入本文。
参考以下实施例将更充分地理解前述描述。然而,这些实施例是实施本发明的方法的示例,无意于限制本发明的范围。
实施例1:在一种应用中,从通过单采血液收集的白细胞分离、转化和纯化CD32+细胞,以产生抗HIV的造血干细胞。试剂和试剂盒的制备如下:一袋单采血液产品(500至800毫升),一袋不含钙或镁的磷酸盐缓冲液(300毫升),用于敲除CCR5基因的慢病毒溶液(50到100毫升),专门针对CD34+细胞的磁珠溶液(5到10毫升),高葡萄糖修饰的Eagle细胞培养生长介质溶液(1.5升),废物袋(2升)和最终产物收集袋(100毫升)。操作员使用操作单元定向按钮(83)定向操作单元(80),使试剂室(87)面向他。试剂袋放置在试剂室(87)中,并使用皮带将其锁定在适当的位置。管以有序的方式固定在出口管道(85)上,腔室用透明塑料盖封闭。操作人员定向操作单元(80),使第二面(91)面向他,以便安装入口多路旋转阀头(57)和蠕动泵头(58)。操作人员在将转子室(95)置于其面前之前,确保管子被夹(84)在所述面的表面上。通过首先将出口定子(10)和可操作塞子(13)安装在旋转插座(12)中,放置旋转同心中空处理室(1)。入口定子(8)夹在转子室(95)顶部的插座中。安全盖玻璃(81)被锁定以关闭旋转室(95)。操作员定向操作单元(80)使第三面(92)面向他,以便安装出口多路旋转阀头(61)和蠕动泵头(60)。操作员将管(56)以有序的方式固定在输出室入口管道(94)中,并旋转操作单元(80),将废物袋(62)和最终产品袋(63)放入其适当的室(89)中,以及将采样管出口(64)插入其插座。通过经由用户界面(86)或经由远程终端在操作单元(80)上选择方法来启动细胞处理。操作员进行半自动自检以确保最佳进度。在操作单元(80)的作用下,旋转同心中空处理室(1)进入垂直位置(14)。在将患者样品加载到处理室(2)之前,用磷酸盐缓冲液装填线路。进行生物固体物质分离操作(图9a),然后将获得的液体泵入废物袋(62)。将磷酸盐缓冲液泵入处理室(2,50毫升)中,然后进行生物聚集体重悬操作(图9c)。重复前两步操作两次以彻底洗涤样品。然后进行利用磁分离珠的培养操作(图9c2)。进行三次磁分离操作(图9b),前两次用磷酸盐缓冲液(50毫升),最后一次用泵入处理室(2,2毫升至10毫升)的细胞培养生长介质。进行利用慢病毒载体的培养操作(图9c 2)。再次进行三次磁分离操作(图8b),前两次使用磷酸盐缓冲液(50毫升),最后一次使用细胞培养生长介质(50毫升)。进行细胞培养扩增操作,直至细胞计数达到109个细胞。进行生物固体物质分离操作(图9a),然后将获得的液体泵入废物袋(62)。进行生物聚集体重悬操作(图9c),并将所有溶液收集在最终产品袋(63)中。
实施例2:该实施例说明了癌症治疗的情况下用于移植的冷冻自体干细胞制备。将一袋选定的患者干细胞(20毫升)解冻。它被连接到一个由以下试剂组成的一次性试剂盒(66的变型):一袋不含钙或镁的磷酸盐缓冲液(300毫升),一种高葡萄糖修饰的Eagle细胞培养生长介质溶液(1.5升),一个废物袋(2升)和一个最终产品收集袋(100毫升)。安装了一次性试剂盒(66的变型),并准备了操作单元(80)以执行示例1所示的过程。进行生物固体物质分离操作(图9a),然后将获得的液体泵入废物袋(62)。将磷酸盐缓冲液泵入处理室(2,50毫升)中,然后进行生物聚集体重悬操作(图9c)。重复前两步操作两次,以彻底洗涤样品,最后一次用细胞培养生长介质(50毫升)。进行细胞培养扩增操作直至细胞计数达到109个细胞。进行生物固体物质分离操作(图9a),然后将获得的液体泵入废物袋(62)。进行生物聚集体重悬操作(图9c),并将所有溶液收集在最终产品袋中(63)。
Claims (14)
1.一种适用于从生物流体制备基因转化细胞的自动化设备,包括:
(i)可绕水平轴线(19)绕其中心旋转的操作单元(80),
(ii)保持操作单元(80)的中轴线轴(16),提供支撑和电力,
其特征在于,操作单元(80)包括旋转同心中空处理室(1),其具有
-半球形的顶部,圆形部分朝上,在其最顶部有一个突出的孔(3);
-位于旋转同心处理室(1)总高度的四分之一和一半之间的半球的底边(7),与同心中空处理室(1)的底部形成垂直角,其向下变窄成遵循凹拱形曲线的漏斗形状(6),在其最底部具有底孔(4);
并且其中所述操作单元(80)配置为将所述旋转同心中空处理室(1)从竖直位置(14)移动到水平位置(15),从而使所述自动化设备具有不同的操作。
2.根据权利要求1所述的自动化设备,其中,所述旋转同心处理室(1)还包括圆形地布置在所述底孔(4)上方的一个或多个侧孔(5)。
3.根据权利要求1-2中任一项所述的自动化设备,其中,所述旋转同心中空处理室(1)在其顶部装有入口定子(8),在其底部装有出口定子(10),以允许液体被泵入旋转同心中空处理室(1)泵入和从中泵出。
4.根据权利要求2-3中的任一项所述的自动化设备,其中,成形为适合于旋转同心中空处理室(1)的底孔(4)的可操作塞子(13)可以被接合(32)或脱离(34),以分别阻塞或疏通一个或多个圆形布置的侧孔(5)。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的自动化设备,其中,所述旋转同心中空处理室(1)在其底部定子(10)和顶部定子(8)处连接至由一次性蠕动泵头(58、60)组成的两个独立的装置,所述一次性蠕动泵头连接到与多个试剂或产品袋连接的一次性多路旋转选择器阀头(57、61),从而形成一次性试剂盒(66)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的自动化设备,其中,所述操作单元(80)被成形为六角棱柱(96),所述六角棱柱的六个操作单元面(87、88、89、91、92、95)中的每一个具有不同的功能,并且可以将旋转同心中空处理室(1)容纳在一个面上的转子壳体(95)中。
7.根据权利要求6所述的自动化设备,其中,所述六个操作单元面(87、88、89、91、92、95)包括:
设计用于存储可控温液体袋的作为腔室的两个面(87、89);
作为转子壳体室的一个面(95),其保持旋转同心中空处理室(1),并装有可操作磁阵列(70);
一个面(91),包括用户界面(86)以及用于蠕动泵头(58)和多路旋转选择器阀头(57)的连接点;
一个面(92),包括用于蠕动泵头(60)和多路旋转选择器阀头(61)的连接点,以及
一个面(88),包括数据输入/输出连接器、电源连接器以及用于温度控制的通风孔。
8.根据权利要求7所述的自动化设备,其中,所述可操作磁阵列(70)呈弓形形状,所述弓形形状设计成在接合时适合于所述旋转同心中空处理室(1)的边缘(7),并且还包括一个或多个高磁场强度磁体(73)。
9.一种处理生物流体的方法,包括在旋转同心中空处理室(1)中的生物固体分离、聚集体重悬、试剂和/或细胞培养,感兴趣的细胞的磁分离以及细胞培养扩增,所述处理室可以接收流体并可以通过操作单元(80)在多个方向上进行操作,所述操作单元(80)配备了一套一次性试剂盒(66)的试剂和袋部分,并且能够执行以下操作:
-垂直定向时(14)离心,以使液体与固体分离并调节体积;
-水平定向时(15)固体重悬,磁珠磁性附着,溶液培养和混合以及体积调节;
其特征在于,执行所述生物流体处理的一组操作包括,当旋转的同心中空处理室(1)垂直(14)时,体积调节和离心的链式组合和/或重复,
当旋转同心中空处理室(1)水平(15)时,低速旋转、顺时针和逆时针快速连续旋转、磁珠磁性附着、溶液培养和混合。
10.根据权利要求9所述的处理生物流体的方法,其中用于生物固体分离的操作通过以下步骤进行:
-通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)垂直定位(14),并向其中填充生物悬浮液(100),然后通过旋转同心中空处理室(1)沿其轴线(14)在设定的时间以设定的速度旋转进行离心,以产生离心力,使得生物固体从液体中分离出来,并在旋转同心中空处理室(1)的边缘(7)上聚集(102);
-随后逐渐停止旋转同心中空处理室(1)的旋转,使得液相(101)向下流动,固相(102)仍然附着在旋转同心中空处理室(1)的边缘(7)上;
-所得的液相(101)在出口定子(10)处被泵出。
11. 根据权利要求9所述的生物流体的处理方法,其中,用于聚集体重悬的操作通过以下步骤进行:
通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)水平定位(15),并且
通过一系列顺时针和逆时针快速连续旋转使旋转同心中空处理室(1)绕其水平轴线(15)旋转设定时间,以及
分离获得的聚集固体(102)并将其悬浮在液相(106)中。
12.根据权利要求9所述的生物流体的处理方法,其中,用于试剂和/或细胞培养的操作通过以下步骤进行:
通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)水平定位(15),将处理室(1)中的生物悬浮液(106)与感兴趣的试剂混合,并使同心处理室(1)在设定温度下绕其中心轴线低速旋转设定时间。
13.根据权利要求9所述的生物流体的处理方法,其中,用于感兴趣细胞的磁分离的操作通过以下步骤进行:
-将生物悬浮液(103)与结合的磁性选择珠(104)一起培养;通过操作单元(80)的旋转将旋转同心中空处理室(1)定向到水平位置(15),使磁阵列(70)靠近旋转同心中空处理室(1)的边缘(7),从而导致磁珠(104)的吸引;
-旋转操作单元(80),以使旋转同心中空处理室(1)垂直(14)定位,同时磁阵列(70)与旋转同心中空处理室(1)的边缘(7)保持紧密接触,使得多余的悬浮液(103)流入旋转同心中空处理室(1)的底部,然后被泵送到废物袋(62),而附着在磁珠(104)上的感兴趣的细胞磁性地停留在边缘(7)上;撤销磁阵列(70)以使磁珠(104)自由流动。
14.根据权利要求9所述的生物流体的处理方法,其中,用于细胞培养扩增的操作通过以下步骤进行:
使滞留在通过操作单元(80)的作用而水平定向(15)的旋转同心中空处理室(1)内的细胞培养介质中的均质细胞悬液(106)低速旋转,从而进行足够的时间的培养操作;
在所述足够的时间之后,通过操作单元(80)的作用使旋转的同心中空处理室(1)垂直定向(14),并通过采样口(64)进行采样,以评估细胞培养物(106)状态;在需要更新介质的情况下,通过从旋转同心中空处理室(1)排空旧培养介质(101)来执行生物固体分离操作,并添加新的细胞培养介质(105),
然后再进行聚集体重悬,然后进一步培养直至细胞计数令人满意。
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