KR102443818B1 - 생물학적 유체의 순차적 처리 - Google Patents

Abstract

일회용 세트의 일부인 중공 원통형 원심 처리 챔버(300) 내에서 처리 단계에 의해 혈액, 아페레시스 혈액, 골수 혈액, 제대혈, 버피 코트 또는 배양 세포와 같은 불투명 또는 투명 생물학적 유체의 순차적 처리를 위한 공정이 제공된다. 세척, 배양, 형질도입, 분리, 밀도 구배 분리, 희석 및 부피 조절로부터 선택된 3가지 이상의 상이한 절차가 수행되고, 각각의 상기 절차는 단일의 일회용 세트의 처리 챔버 내에 주어진 처리 프로파일에 따라 한번 수행되거나 또는 복수 회 반복된다. 각각의 절차는 처리 챔버 내로의 유입, 처리 챔버 내에서의 작동, 피스톤(310)의 변위에 의한 처리 챔버로부터의 배출을 포함한다. 적어도 3가지의 절차가 처리 챔버 및 이의 일회용 세트 내에서 전체 순차적 작업을 구성하도록 순차적으로 수행된다. 제1 응용은 인간 혈액 세포 또는 줄기 세포와 자기 비드의 결합을 위한 배양이다. 제2 응용은 형질도입이며, 이에 의해 바이러스에 의해 인간 혈액 세포 또는 줄기 세포 내로 외부 유전 물질을 유입된다. 제3 응용은 혈액 세포 또는 줄기 세포의 재생가능 농도 및 부피를 달성하기 위하여 생물학적 유체를 재조절하는 것이다.

Description

생물학적 유체의 순차적 처리{SEQUENTIAL PROCESSING OF BIOLOGICAL FLUIDS}

본 발명은 세척, 배양, 형질도입, 분리, 밀도 구배 분리, 희석 및 부피 조절을 포함하는 처리 단계에 의해 혈액, 아페레시스 혈액, 골수 혈액, 제대혈, 버피 코트 또는 배양 세포와 같은 생물학적 유체의 처리를 위한 시스템에 관한 것이다.

제EP-B-0 912 250(C.FELL)호의 내용은 본원에 참고 문헌으로 포함되며, 생물학적 유체를 처리하여 성분으로 분리하는 시스템을 기술하며, 상기 시스템은 첨가제 용액을 위한 분리된 구성요소 및 선택적으로 하나 이상의 추가 용기 및 분리되는 생물학적 유체를 수용하기 위한 일련의 용기를 포함한다. 중공 원심 처리 챔버는 처리 챔버와 회전 구동 유닛의 결합에 의해 회전축 주위에서 회전 가능하다. 처리 챔버는 처리될 생물학적 유체 및 생물학적 유체의 처리된 성분에 대한 축방향 입구/출구를 갖는다. 이 입구/출구는 가변 부피의 분리 공간으로 이어지고, 여기서 생물학적 유체의 전체 원심 분리 처리가 수행된다. 처리 챔버는 처리 챔버의 단부 벽으로부터 연장되는 일반적으로 원통형인 벽을 포함하며, 이 일반적으로 원통형인 벽은 회전축과 동축인 중공의 개방 원통형 공간을 차지하는 중공 처리 챔버를 그 내에 형성하고, 축방향 입구/출구는 중공 처리 챔버 내로 개방되도록 일반적으로 원통형 벽과 동축을 이루는 단부 벽 내에 제공된다. 처리 챔버는 일반적으로 원통형 벽 내에 피스톤과 같은 축방향 이동가능 부재를 포함한다.

가변 부피의 분리 공간은 일반적으로 원통 벽에 의해 그리고 처리 챔버의 일반적으로 원통형 벽에 포함 된 축방향 이동가능 부재에 의해 처리 챔버의 상부에 형성되며, 이동가능 부재의 축방향 이동은 분리 공간의 부피를 가변시키고, 이동가능 부재는 원심 처리 중에 또는 이후에 출구르 통하여 분리 공간으로부터 처리된 생물학적 유체 성분을 배출시키고 원심 처리 이전에 또는 중에 입구를 통하여 분리 공간 내로 처리되는 생물학적 유체의 선택된 양을 유입시키기 위하여 처리 챔버 내에서 축방향으로 이동할 수 있다. 이동가능 부재의 위치를 모니터링하여 유입된 생물학적 유체의 양 및 분리된 성분의 배출을 제어하는 수단이 제공된다. 상기 시스템은 처리 챔버와 선택된 용기 사이의 선택적 연통을 형성하거나 처리 챔버와 용기를 연통해제 상태로 배열하기 위한 분배 밸브 장치를 추가로 포함한다.

제EP-B-1 144 026호에 따라서, 이러한 시스템은 조혈 줄기 세포의 분리 및 일반적으로 실험실 처리에서와 같이 이전에 고려되지 않은 새로운 응용을 포함하여 시스템의 사용에 대한 더 큰 가능성을 제공하는 분리 및 비분리 이송 모드로 작동하도록 배열된다.

제EP-B-0 912 250호 및 제EP-B-1 144 026호에 따른 시스템은 생물학적 유체의 분리를 위해 작동하도록 설계되어 있으며, 많은 분리 응용, 특히 밀폐된 살균 환경을 갖는 일회용 세트의 일부인 처리 또는 혼합 챔버를 이용하여 공여자 또는 환자로부터 성분의 온-라인 분리를 위해 매우 다가인 것으로 밝혀졌다. 이 시스템은 상표 세팍스(Sepax) 하에 바이오세이프 에스에이(Biosafe SA)에 의해 상업화되었다.

세팍스 시스템은 과거에는 환자 동원 이후에 골수, 제대혈 또는 말초 혈액과 같은 혈액원에서 유래된 버피 코트에 현탁하는 조혈, 간엽 또는 지방 유래 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포를 함유한 혈액 및 혈액 유도체 생성물을 처리하기 위하여 이용되었다.

가장 전형적인 응용은 혈액 또는 혈액 유도체의 부피 감소 처리이다. 이렇게 함으로써, 혈장 및 대부분의 적혈구 세포가 고갈되고, 혈장 및 적혈구 세포 내에 현탁하는 줄기 세포 및 본질적으로 백혈구를 포함하는 버피 코트 층이 선택 가능한 부피로 수집된다. 선택한 최종 부피를 기준으로 사용자의 필요에 따라 더 많은 혈장 및 적혈구를 부가될 수 있다.

세팍스 기술이 종종 사용되는 제2 응용은 세척 응용이다. 줄기 세포 농축 생성물은 전형적으로 48 시간 이내에 사용하지 않으면 냉동보존된다. 줄기 세포를 포함하는 세포 생성물이 이식을 위해 필요한 경우, 해동 절차가 수행된 후 잔류 독성 디메틸설폭사이드(DMSO)에 의해 이식되는 동안 부작용을 제거하기 위한 세척 절차가 수행되도록 권장된다.

제3 응용은 부피를 감소시키는 것이 필요한 생성물과 밀도 구배 매질을 혼합하는 것으로 구성된다. 침강(sedimentation) 동안, 구배 밀도 매질은 혈장 및 단핵 세포 및 림프구 세포 집단 이후이지만 원심 분리 공정 중에 과립구 및 적혈구 세포 이전에 층을 생성 할 것이다. 세팍스 기술은 적혈구 세포가 없는 배지에서 현탁하는 백혈구 세포 및 줄기 세포를 추출할 수 있다. 이는 공여자와 수혜자 간에 사소한 또는 주요 불일치가 있을 때 특히 이식에 적합하다.

지금까지 세팍스 기술로 수행된 대부분의 응용은 줄기 세포를 함유한 혈액 및 혈액 유도체에 초점을 맞추었으며 이는 통상 880ml보다 상당히 작은 부피를 갖는다. 또한, 알려진 세팍스 응용은 본질적으로 부피 농도 또는 세척 응용과 같이 생성물과 함께 단일의 처리 기능을 가장 많이 수행하는 것으로 제한된다. 세팍스의 또 다른 제한은 처리될 생산물이 모두 생산물에 적혈구를 포함하고 있고, 이 장치는 적혈구와 피스톤 간격(in-piston gap) 사이의 전이를 결정하는 필수 요소로서 광학 센서를 사용한다.

다른 시스템은 생물학적 유체 처리에 대해 공지되어 있으며, 예를 들어 제WO 2009/072003호의 시스템은 원심 보울 및 결합된 샘플 분리 유닛을 포함하는 샘플 처리 유닛을 포함한다. 이러한 시스템은 순차적인 절차를 수행할 수 있지만 구성 및 작동은 세팍스 시스템과 매우 상이하며, 이는 세팍스 시스템의 고유한 한계점을 개선하기 위한 유용한 지침을 제공하지 않는다.

본 발명은 생물학적 유체를 처리 또는 혼합하고 및/또는 시약 및/또는 희석액과 생물학적 유체를 혼합하기 위하여 중공 원통형 원심 처리 챔버 내에서 세척, 배양, 형질도입, 분리, 밀도 구배 분리, 희석 및 부피 조절을 포함하는 처리 단계에 의해 혈액, 아페레시스 혈액, 골수 혈액, 제대혈, 버피 코트(buffy coat) 또는 배양 세포와 같은 불투명 또는 투명 생물학적 유체의 순차적 처리를 위한 공정에 관한 것으로,

원심 처리 챔버는 분리 공간 내로 또는 분리 공간으로부터 생물학적 유체를 유입 또는 배출시키기 위하여 처리 챔버 내에서 분리 공간의 부피를 변화시키도록 축방향으로 이동가능한 피스톤과 같은 축방향 이동가능 부재를 이의 원통형 벽에 수용하고, 처리 챔버는 생물학적 유체 및 시약 및/또는 희석액을 수용하는 일회용 세트의 일부이고, 일회용 세트는 밀폐된 멸균 환경을 갖는다.

본 발명에 따라서, 단일 일회용 세트의 일부로서 단일 처리 챔버를 사용하여 세척, 배양, 형질도입, 분리, 밀도 구배 분리, 희석 및 부피 조절로부터 선택된 3가지 이상의 상이한 절차가 수행되고, 각각의 상기 절차는 단일의 일회용 세트의 처리 챔버 내에 주어진 처리 프로파일에 따라 한번 수행되거나 또는 복수 회 반복된다. 각각의 절차는 이동식 챔버 내에서 축방향으로 이동시킴으로써 생성된 처리 챔버 내로의 유입, 처리 챔버 내에서 작동 및 이동식 챔버를 축방향으로 이동시킴으로써 생성된 처리 챔버로부터의 배출을 포함한다. 3가지 이상의 상이한 절차가 처리 챔버 및 그의 단일 일회용 세트 내에서의 전체 순차적 작업으로서 상이한 절차의 연쇄 순서(chained sequence)를 구성하도록 처리 챔버 내에서 순차적으로 수행된다. 상기 3가지 이상의 상이한 절차 모두를 수행하기 위하여 필요한 모든 생물학적 유체, 시약 및/또는 희석액은 전체 순차적 작업을 위해 사용된 단일 일회용 세트의 밀폐된 멸균 환경에 수용된다.

일 응용에서, 처리 챔버 내에서 순차적인 작업을 구성하는 연쇄 순서는 하기 순서의 절차, 사전 세척; 시약의 첨가 및 배양; 사후 세척으로 수행된다. 이 응용은 예를 들어 인간의 혈액 세포 또는 줄기 세포 내에 자기 비드를 결합시키는 것을 포함한다.

또 다른 응용에서, 세척, 희석, 원심 분리, 희석, 생성물의 부피 조절의 절차가 순차적으로 수행된다. 이 응용은 예를 들어, 림프구 T 세포 또는 다른 인간의 세포로 바이러스 형질도입을 위한 것을 포함한다.

또 다른 응용에서, 사전 해동, 세척, 샘플링 및 희석, 부피 조절/추출의 절차가 순차적으로 수행된다. 이 응용은 예를 들어 세포 생성물의 다수의 도즈(dose)의 도징을 재조절하는 것을 포함한다.

예시로서, 다양한 절차가 통상 다음의 단계를 포함한다.

세척 단계는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 세포 기반 생성물로 처리 챔버의 충전, 세척 용액으로 처리 챔버의 잔여 용량 충전, 주어진 시간(t) 및 주어진 G 힘에서 스피닝, 폐기물 백 내에서 세척 용액의 추출 및 배출 수집 백 내에 세포를 수용하는 원하는 최종 부피의 추출.

배양 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 세포 기반 생성물로 처리 챔버의 충전, 배양 비드로 처리 챔버의 충전, 일정한 시간 간격으로 처리 챔버의 양-방향 혼합에 의한 배양 수행, 최종적으로 수집 백 내에서 배양된 생성물의 추출 및 수집.

형질도입 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 세포 기반 생성물로 처리 챔버 내에서 세포 생성물의 충전, 생물학적 바이러스로 처리 챔버 충전, 형질도입을 수행하기 위하여 주어진 시간(t) 동안에 그리고 주어진 G 힘으로의 스피닝, 배출 수집 백 내에서 형질도입된 생성물의 추출.

분리 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 세포 기반 생성물로 처리 챔버의 충전, 주어진 시간(t) 동안에 그리고 주어진 G 힘으로의 스피닝에 의해 생성물 분리, 배출 수집 백 내에 세포를 포함하는 성분 층 및 폐기물 백 내에서 원치 않는 성분을 챔버로부터 추출.

밀도 구배 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 밀도 구배 매질로 스피닝 처리 챔버를 충전, 세포 기반 생성물로 스피닝 처리 챔버를 서서히 충전, 주어진 시간(t) 중에 주어진 G 힘에서 스피닝에 의해 성분들로 용액의 분리, 배출 수집 백 내에서 밀도 구배 매질의 일부 및 세포를 함유하는 성분 층 및 폐기물 백 내에서 원치 않는 성분을 챔버로부터 추출.

농축 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 세포 기반 생성물로 처리 챔버의 충전, 주어진 시간(t) 중에 주어진 G 힘에서 원심분리에 의해 세포의 농축, 폐기물 백 내에서 원치 않는 성분을 챔버로부터 추출 및 배출 수집 백 내에서 농축된 세포의 수집.

희석 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 원하는 최종 세포 농축이 달성될 필요가 있는 경우 초기 세포 기판 생성물의 특성화, 세포 기반 생성물로 처리 챔버의 충전, 원하는 부피 또는 세포 농축 희석 비율을 기초로 매질 및 영양분 용액 내에서 세포를 분유시키기 위하여 또는 미리계산된 부피의 함염 용액으로 처리 챔버의 충전 지속, 처리 챔버로부터 유체의 충전 및 추출 중에 희석되거나 또는 현탁된 세포 용액 용액의 혼합을 위하여 일정한 시간 간격으로 처리 챔버의 양방향 혼합, 배출 수집 백 내에서 희석된 세포 용액을 챔버로부터 추출.

대안의 처리 옵션은 원하는 희석 비율을 기초로 계산된 부피의 함염물 또는 매질 용액으로 처리 챔버를 충전하고, 그 뒤에 세포 생성물을 수용하는 배출 수집 백 내에서 챔버의 함염물 또는 매질 용액을 추출하는 것이다.

부피 조절 절차는 전형적으로 다음의 단계를 포함한다: 미리희석된 용액 또는 세포 기반 생성물로 처리 챔버의 충전, 원하는 개수의 도즈 및 배출 부피를 선택, 각각의 도즈 이후에 중단을 수행하거나 또는 상이한 백으로 자동 변환에 의해 처리 챔버로부터 다수의 도즈의 추출 및 다음의 도즈가 추출되어야 하는 목표 백을 사용자가 선택하도록 요청함.

처리 챔버는 통상 이동가능 피스톤을 포함하고, 피스톤(또는 다른 이동가능 부재)의 위치는 적외선 센서에 의해 모니터링된다.

하나의 전체적인 순차적 작업을 위한 처리 챔버 내에서 처리된 액체의 부피는 처리 챔버의 최대 처리 부피의 최대 16배일 수 있다. 예를 들어, 순차적 작업을 위한 부피는 처리 챔버 내에서 전술된 분리 공간의 최대 부피에 의해 나타날 수 있는 처리 챔버의 최대 처리 부피의 4배, 8배, 또는 16배일 수 있다.

처리 챔버는 바람직하게는 사용자 개재 없이 일회용 세트의 백을 전환시키기 위하여 2가지의 생물학적 첨가제를 선택하기 위해 일회용 세트의 튜빙을 제어하는 2개의 외부 핀치 밸브와 연계된다.

본 발명의 공정을 수행하기 위한 시스템은 예를 들어 공지된 세팍스 기술에 따라 일회용 세트의 중공 원심 또는 혼합 처리 챔버를 수용하는 캐비닛을 포함한다.

본 발명의 연쇄적 상이한 절차의 일 이점이 전술된 것보다 더 큰 부피, 예를 들어, 최대 4 리터를 처리할 할 수 있고, 반면 이전에 처리된 부피는 최대 880ml이다. 따라서, 이는 상기에서 제안된 바와 같이 세팍스 기술의 부피 제한을 극복한다.

또한 모든 종류의 백혈구 세포(혈소판, 단핵구, 림프구, 과립구)로의 처리로 확장할 수 있지만 이전의 처리는 본질적으로 줄기 세포와 적혈구 세포에만 국한된다. 이것은 적혈구에 사용된 이전의 광학 센서를 대체하여 투명한 유체를 처리하는 동안 정확하게 피스톤 위치를 측정하도록 설계된 알고리즘을 갖춘 적외선 센서를 사용함으로써 구현될 수 있다.

세팍스 시스템은 소프트웨어에 의해 바이러스와 같은 2가지의 생물학적 첨가제를 자동으로 선택하여 챔버를 프라이밍하고 재현탁을 위한 매질 용액으로 전환하고 사용자 개입 없이 백을 전환하기 위한 2개의 핀치 밸브로 유리하게 구성된다.

본 발명의 제1 응용은 림프구 T 세포, B 세포 또는 조혈 줄기 세포와 같이 인간 혈액 세포 또는 줄기 세포와 자기 비드의 결합을 위한 배양으로 구성된다. 제2 응용은 바이러스에 의해 인간 혈액 세포 또는 줄기 세포로 외부 유전 물질이 유입되는 형질도입이다. 제3 응용은 혈액 세포 또는 줄기 세포의 재현가능 농도 및 부피를 달성하기 위하여 생물학적 유체를 재조절하는 것이다.

도 1a는 본 발명의 제1 응용의 흐름도.
도 1b는 제1 응용의 완료된 다이어그램.
도 2a는 본 발명의 제2 응용의 흐름도.
도 2b는 제2 응용의 완료된 다이어그램.
도 3a는 본 발명의 제3 응용의 흐름도.
도 3b는 제3 응용의 완료된 다이어그램.
도 4는 본 발명에 따른 공정을 수행하기 위하여 장치의 처리 챔버를 수용하는 캐비닛의 사시도.
도 5는 주어진 응용을 수행하기 위하여 본 발명에 따른 공정 내에서 사용가능한 일회용 키트 또는 세트의 다이어그램.

응용 1: 인간 혈액 세포 또는 줄기 세포로 자기 비드의 결합

제1 응용은 인간 혈액 세포 또는 줄기 세포, 예를 들어 림프구 T 세포, 림프구 B 세포 또는 자기 피드를 갖는 조혈 줄기 세포의 자성 비드의 블렌딩에 관한 것이다.

이 응용은 하기 절차, 세척, 희석, 배양 및 세척을 수행하는 순서를 도시한다.

제1 단계는 생물학적 영양분을 첨가함으로써 세포를 수화하고 인간의 혈소판, 응집물, 응고물 등과 같은 불필요한 요소를 제거하기 위하여 일반적으로 골수 채취로부터 드물게 유발되고 말초 혈액 줄기 세포 수집을 위한 아페레시스(apheresis) 절차에서 유발되는 세포 기반 생성물을 사전조절하는 것과 관련된다. 생성물이 미리 동결보존된 경우 디메틸 설폭사이드와 같은 동결 방지 용액이 이 단계를 통하여 제거되어야 한다.

그 뒤에, 제2 단계는 미리조절된 생물학적 생성물에 자기 비드 또는 착색 매질 또는 스테인의 도즈(dose)와 시약의 도즈를 추가하는 것과 관련된다.

제3 단계는 용액의 배양과 관련된다. 이 단계의 목적은 자기 비드를 표적화된 세포에 결합시키거나, 활성화된 세포를 광역학 치료에 매우 민감하게 만들거나, 또는 표적화된 세포와 다양한 메커니즘을 통해 다른 용액을 결합시키는 것이다. 이 단계에서 배양은 상온에서 일정 시간 동안, 일반적으로 용액을 일정하게 혼합하면서 분리 챔버에서 30 분의 전형적인 시간으로 10 분에서 최대 2 시간까지 시작하여 수행될 수 있다. 이는 또한 예를 들어 WO 2014/181158 A1에 기술된 장치를 통해 혈액 백에서 제어된 온도, 시간 및 일정한 혼합 하에서 수행될 수 있고, 상표 스마트-맥스(Smart-Max)하에 바이오세이프 에스에이(Biosafe SA)에 의해 상업화된다. 이러한 장치는 가요성 저장 백에 수용된 생물 표본을 조절된 온도에서 혼합하기 위해 제공되고, 가요성 저장 백이 보관 이외에 생물학적 표본의 수집, 냉동 보관 또는 이송에 사용될 수 있다.

마지막으로 최종 단계는 표적화된 세포의 부적절한 선택이나 또는 카운팅을 방지하기 위하여 표적화된 세포에 부착되지 않은 비결합 비드와 같은 과량의 시약을 제거하기 위한 또 다른 세척 단계 또는 매질 교환에 의한 착색 공정을 중단시키거나 또는 상청액을 통한 다른 용액의 제거 이후에 새로운 매질 내의 세포의 현탁에 관한 것이다.

모든 이들 단계는 예를 들어 상기 세팍스 테크놀로지(Sepax technology)를 사용하여 살균 환경에서 자동화 시스템 하에서 순차적으로 수행된다.

제1 응용이 도 1a 및 도 1b에 도시된다. 도 1a에 도시된 바와 같이 공정의 이 응용은 사전세척 단계(10), 뒤이어 시약 첨가 단계(20) 및 배양 단계(30)를 포함한다. 시약 첨가 단계(20)와 배양 단계(30)는 루프(40)를 통해 n회 반복된다. 그 뒤에 최종 배양된 생성물이 사후 세척 단계(50)가 수행된다.

도 1b에 도시된 바와 같이,

● 사전세척 단계(10)는 적용가능한 경우 전형적으로 아페레시스 절차로부터 세포 기반 생성물의 세척 단계, 혈소판 제거 단계 및 DMSO 제거 단계를 포함한다. 생성물은 세포가 너무 농축되지 않고 세포의 수화를 방지하기 위하여 주어진 부피로 재현탁된다.

● 시약 첨가 단계(20)는 특정 부피의 자기 비드 및/또는 세포 염색제 또는 활성 시약을 첨가하는 단계를 포함한다.

● 배양 단계(30)에서, 세포는 예를 들어, 세팍스 시스템과 같은 원심 처리 및 분리 챔버 내에서 또는 외부에서 특정 시간 동안에 첨가된 시약과 혼합된다. 이러한 것이 외부에서 수행되는 경우 혼합 및 온도 제어를 위하여 스마트-맥스(Smart-Max)와 같은 장치에 세포 백이 배치된다.

● 사후세척 단계(50)는 적용되는 바와 같이 시약(예를 들어, 비드)을 제거하기 위하여 제공된다.

응용 2: 림프구 T 세포로의 바이러스 형질도입

제2 응용은 바이러스의 첨가에 의해 림프구 T 세포 또는 조혈 줄기 세포와 같은 다른 인간 세포의 형질 도입과 관련된다. 이 응용은 세척, 희석, 형질도입, 희석, 부피 조절과 같은 절차를 순차적으로 수행하는 것을 나타낸다.

제1 단계는 혈소판, 응집물, 응고물 또는 세포 파편과 같은 불필요한 요소를 제거하기 위하여 세척 절차를 수행함으로써 세포 배양 공정 이후에 팽창된 세포로부터 또는 말초 혈액 줄기 세포를 수집하기 위한 아페레시스 절차로부터 통상 유발되는 세포기반 생성물을 미리조절하는 것이다. 불필요한 요소가 제거되면, 세포는 또한 생물학적 영양분을 첨가함으로써 재수화되고, 고정된 원하는 부피로 현탁될 수 있다. 배지는 세포가 또한 이전에 배양되는 경우 제어되어야 하며, 또한 생성물이 이전에 동결보존되는 경우 디메틸 설폭사이드가 제거되어야 한다.

그 뒤에 제1 단계는 형질도입을 위해 이후에 사용된 바이러스를 함유하는 용액으로 제1 단계에서 미리조절된 생물학적 생성물을 희석시키는 단계를 포함한다. 이 문헌에서, 통상 바이러스를 함유하는 용액이 세포를 함유하는 원심 챔버 내에서 프라이밍된다.

제3 단계는 세포를 현탁 매질로부터 분리하고 형질도입 공정을 개시하기 위해 이를 바이러스와 밀접하게 접촉시키기 위해 1200에서 1700 g 사이에서 고속으로 스피닝하는 단계를 포함한다. 높은 g-힘에서 스피닝시킴으로써 T 림프구는 매질과 분리되어 원심분리 챔버의 외부 표면에 부탁될 것이다. 동시에, 챔버에 유입된 바이러스는 분리 챔버의 유체에 분산되고, 밀접한 접촉은 바이러스와 함께 T 림프구 세포의 형질도입 공정을 개시한다.

고-스피닝 공정의 종료 시에, 원하는 최종 부피에 도달되도록 용액은 배지 용액, 또는 함염 용액으로 희석된다. 최종적으로 전체 용액은 추후 사용을 위해 도즈가 여러 회 사용될 필요가 있는 경우 하나 또는 몇몇의 용액 백 내에 분할될 수 있다.

이 제2 응용은 도 2a 및 도 2b에 도시된다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 공정의 이 응용은 세척 단계(60), 이후에 희석 단계(70) 및 고-스피닝 작업(80), 그 뒤에 희석 단계(90) 및 생성물을 n개의 백으로 분할하기 위한 선택적 분할 단계(100)를 포함한다.

도 2b에 도시된 바와 같이:

● 세척 단계(60)는 수 완충액으로 세포 배양 또는 아페레시스 절차로부터 통상적으로 유발되는 세포기반 생성물을 세척한다.

● 희석 단계(70)에서 특정 부피의 바이러스가 세팍스 시스템의 분리 챔버 내에서 세포에 첨가된다.

● 이는 그 뒤에 높은 g-힘 및 긴 스피닝 지속 기간을 통하여 바이러스가 세포와 밀접접촉하도록 하기 위하여 세팍스 원심 처리 챔버 내에서 고-스피닝 단계(80)가 가해진다.

● 희석 단계(90)에서 배지는 타겟 부피에 도달되도록 첨가된다.

● 분할 단계(100)에서, 총 부피는 n개의 더 작은 백으로 분할된다. 이는 백을 변경하고 클램프(clamp)를 개방/밀폐하기 위한 수동 개재(manual intervention)를 필요로 한다.

응용 3: 도징(Dosing)의 재조절(환자 주입을 위한 정확한 도징을 포함한, 동결보존 이후)

이 응용은 세척, 분리, 희석, 부피 조절과 같은 순차적 절차를 수행하는 순서를 나타낸다. 일반적으로 표준 자가 이식 설정에서는 미리조절된 환자에서 아페레시스 절차가 수행된다. 화학 요법이나 방사선 요법을 받는 기간 동안 환자의 미리조절로 인해 혈액 세포와 조혈 줄기 세포가 풍부한 말초 혈액이 동결보존된다. 일단 환자가 치료를 받으면, 환자의 세포는 이식되기 전에 해동되고 재조절된다.

제3 응용은 동결보존된 아페레시스 용액으로부터 시작하여 동일한 혈액 세포 또는 줄기 세포 농도를 갖는 세포 생성물을 다수의 도즈를 얻기 위한 반복가능한 자동 방법이다.

제1 단계는 예를 들어 상표 스마트-맥스로 상업화되고 제WO 2014/181158 A1호에 기술된 장치를 사용하여 제어된 온도 및 혼합 환경 하에 세포 생성물을 해동하는 것에 관한 것이다. 이러한 장치는 제어된 온도에서 가요성 저장 백에 수용된 생물학적 표본을 혼합하기 위한 것으로, 가요성 저장 백은 보관에 추가로 생물학적 표면의 수집, 냉동 저장 또는 운반을 위해 제공될 수 있다.

그 다음, 제1 단계는 동결 보존제, 동결보존 공정 중에 형성된 응집물 또는 심지어 응고물(clot)를 제거하는 세척 절차를 수행하는 단계로 구성된다. 그 뒤에 제3 단계는 세포 농도를 측정하기 위한 샘플 채취 단계로 구성됩니다. 샘플은 세포 농도 계산에 필요한 세포 계수기 또는 유동 세포 계측기(flow-cytometer)와 같은 티어스(tierce) 기술을 통해 분석된다. 세포의 실제 밀도가 계산되면 원하는 세포 농도에 도달하기 위해 자동화된 세팍스 플랫폼에서 희석 계수를 조절할 수 있다. 이전의 두 단계를 통해 재현가능하고 균질화된 세포 농도를 수집 공정이나 환자와 독립적으로 수득할 있다.

표적화된 세포 농도가 얻어지면, 세팍스 시스템은 사용자가 각각의 백에서 분할되어야 하는 부피 또는 총 세포 용액을 수용해야하는 백의 개수를 선택할 수 있다. 이렇게 함으로써, 동일한 세포 농도를 모두 함유하는 일정한 개수의 백 또는 백 당 부피 도즈(부피 dose)가 달성될 수 있다.

이 제3 응용은 도 3a 및 도 3b에 도시된다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 공정의 이 응용은 해동 단계(110), 그 후에 세척 단계(120), 샘플링 단계(130) 및 희석 단계(140)를 포함한다. 제1 추출 단계(150)는 루프(160)를 통하여 n회 반복하여 백으로 x ml를 추출한다. 제2 추출 단계(170)는 품질 제어 백으로 y ml 추출하고, 이 단계는 전형적으로 한번만 m회 반복된다.

도 3b에 도시된 바와 같이,

● 해동 작업(110)은 세포 생성물을 해동하기 위하여 제공된다.

● 세척 작업(120)에서, 동결방지제가 제거된다.

● 샘플링 작업(130)에서, 세척된 세포는 샘플링을 위해 배출 백으로 추출된다.

● 이 작업은 수동 샘플 추출을 필요로 한다.

● 희석 단계(140)에서, 세포 농도는 환자 도징을 위해 조절된다.

● 제1 추출 단계(150)는 정확한 환자 도징을 위해 백을 이송하도록 주어진 부피의 세포를 추출한다. 이는 백을 변경하고 클램프를 개방/밀폐하기 위한 수동 개재를 필요로 한다.

● 제2 추출 단계(170)는 품질 제어(멸균 시험)를 위해 마지막 m개의 백을 준비한다. 전형적으로 m=1임.

도 4는 본 발명을 수행하기 위한 장치의 처리 챔버를 수용하기 위한 캐비닛(200)의 사시도이며, 상기 장치는 EP-B-0 912 250 및 EP-Bl 144 026호에 따른 시스템의 일부이고 이의 내용은 본원에 전체가 참조로 인용된다. 도시된 바와 같이, 캐비닛(200)은 시스템의 일반적으로 원통형 원심 처리 챔버(도시되지 않음) 내에 수용하기 위한 스윙 클로져(220)를 상부에서 갖는 상향 돌출된 부분 원통형 하우징(210)을 포함한 전방을 갖는다. 이 돌출 전방에서, 부분 원통형 하우징(210)은 삽입된 원통형 처리 챔버 및 이의 내용물을 보기 위한 윈도우(215)를 갖는다. 캐비닛(200)의 후방에는 일회용 세트의 백을 매달기 위한 상향 연장 포스트(부분 절단된 상태로 도시됨)가 있다. 캐비닛(200)의 후방에는 또한 통합 소프트웨어에 따라 처리 프로토콜의 파라미터를 디스플레이하기 위한 디스플레이 스크린(240)이 있다. 캐비닛(200)의 측면(250)은 평평하고, 이들 평평한 측면(250) 중 적어도 하나는 캐비닛(200)과 연계된 일회용 세트의 튜빙을 수용하기 위한 슬롯(270)을 갖는 2개?M 피치 밸브(260)가 제공되며, 이 튜빙은 캐비닛의 측면(250) 상에 지지된 일회용 세트의 2개의 백으로 유도된다. 피치 밸브(260) 위에는 튜빙을 유도하기 위한 돌출부(265)가 있다. 이들 2개의 핀치 밸브(260)는 캐비닛(200)과 관련된 소프트웨어에 의해, 처리 챔버를 프라이밍하고 재현탁을 위한 매질 용액을 전환하기 위해 바이러스와 같은 2 가지의 생물학적 첨가제를 자동적으로 선택하여 사용자 개재 없이 백을 전환시킬 수 있다.

도 5는 3가지의 기술된 응용 모두를 수행하기 위하여 본 발명에 따른 공정에서 사용하기 위한 일회용 세트 또는 키트의 레이아웃을 도식적으로 도시한다. 일회용 세트는 챔버(300) 내에 가변 부피의 처리 공간(320)을 형성하는 피스톤(310) 또는 이동식 피스톤(310)을 수용하는 원심 처리 챔버(300)를 포함한다. 챔버(300)는 5-웨이 밸브(340)로 튜빙 라인(330)을 통하여 연결된다. 상기 밸브(340)의 하나의 출구는 함염 용액 또는 다른 생성물을 위한 유입 스파이크(304) 및 함염 용액 또는 다양한 다른 생성물을 위한 백(394a, 304b)에 연결하기 위하여 분기되는 튜빙 라인(350)에 의해 연결된다. 밸브(340)의 다른 출구는 튜빙 라인(360)에 의해 폐기물 백(303)에 연결된다. 밸브(340)의 제3 출구는 다른 생물학적 유체의 혈액 백 또는 백들의 연결을 위하여 입구 스파이크(301)에 튜빙 라인(370) 및 필터(372)를 통하여 연결된다. 밸브(340)의 제4 출구는 일련의 출구 스파이크(302)로 튜빙 라인(380)을 통하여 연결되고 연결 백(305)으로 분기된다. 튜빙 라인(380)은 또한 샘플링 포트(382) 및 샘플링 필로우(384)로 유도된다.

다양한 튜빙 라인이 사용 중에 일부가 자동으로 작동될 수 있거나 또는 일회용 세트가 설치될 때 수동 작동될 수 있는 핀치 밸브(352)와 끼워맞춤된다(예를 들어, 도 4에서 자기 작동식 핀치 밸브(260) 참조).

기술된 키트 또는 일회용 세트는 심지어 백이 스파이크(301, 302, 304)에 연결된 상태에서 밀봉된 살균 환경을 형성한다.

비드세척

비드세척 응용의 경우, 하나 또는 2개의 아페레시스 혈액 유닛이 유입 스파이크(301)를 통하여 키트에 연결될 수 있다. 그 다음, 혈액 아페레시스 유닛은 임의의 파편, 응고물 및 임의의 원치 않은 잔여물을 제거하기 위하여 유입 필터(372)를 통하여 여과된다.

사전 세척 단계는 세포를 세척하는 것으로 구성되며, 이를 위해 함염 용액(NaCl)과 같은 세척 용액이 스파이크(304)를 사용하여 연결되거나 하나의 이용가능한 백(304a)에 충전된다. 일단 사전 세척 단계가 끝나면, 폐기물 용액은 폐기물 백(303)으로 방향전환되고 세포는 챔버(300) 내에 잔류한다. 그 다음, 제1 단계는 제1 이용가능한 백(304b)에 충전되는 처리 챔버(300) 내에 자기 비드를 포함하는 시약을 첨가하는 단계로 구성된다. 그 다음 배양 단계가 챔버(300) 내에서 수행된다.

마지막으로, 사전 세척 단계에서와 동일한 식염수 용액을 펌핑하여 사후 세척 단계를 수행하고 마지막으로 자기 비드와 함께 배양된 세포를 수집 백(305) 또는 스파이크(302)에 의해 연결된 임의의 맞춤 백에서 추출한다.

형질도입

바이러스 형질도입 응용에 관련하여, 제1 단계는 아페레시스 유닛(들)을 유입 스파이크(들)(301)에 연결하고, 함염 용액을 스파이크(304)에 연결하고, 바이러스를 함유하는 용액을 백(304a)에 첨가하고, 백(304b) 내의 세포 영양분을 위한 매질 용액을 첨가하며, 스파이크(302)를 통해 최종적으로 3개의 백까지 다수의 배출 백을 연결하는 것을 포함한다.

제 1 단계는 1에서 입력 백을 통해 아 페레 시스 장치를 펌핑 한 다음 스파이크 (304)에 의해 연결된 염수 용액을 통해 세척 한 다음 챔버가 챔버 (300)에 남아 있고 바이러스 용액 (백 (304a)으로부터)이 챔버 (300) 용액을 높은 스핀 력으로 원심 분리 한 다음, 용액을 백 (bag) (304b)으로부터 배양 매질 중에 현탁시키고, 최종적으로 용액을 스파이크 (302)에 연결된 최대 3 개의 백에서 동등하거나 상이한 용적으로 나누었다.

제1 단계는 1에서 유입 백을 통해 아페레시스 유닛을 펌핑한 다음 스파이크(304)에 의해 연결된 함염 용액을 통해 세척한 다음 세포가 챔버(300)에 잔류하고 바이러스 용액(백 (304a)으로부터)을 챔버(300)에 첨가하고, 상기 용액은 스핀 력으로 원심분리된 다음, 용액을 백(304b)으로부터 배양 매질 중에 현탁시키고, 최종적으로 용액을 스파이크(302)에 연결된 최대 3개의 백에서 동등하거나 상이한 부피로 분할된다.

재조절 및 도즈

이 응용으로, 제1 동결보존된 혈액 유닛이 해동된다. 그 다음, 해동된 혈액 용액의 백이 유입 스파이크(301)에 연결되고 용액은 챔버(300)로 펌핑된다. 그 다음, 이전에 연결된 함염 용액이 스파이크(304)를 통해 연결되거나 또는 사용가능한 백(403a)이 챔버(300) 내의 아페레시스 유닛을 세척하는데 사용된다. 일단 세포가 세척되면, 챔버(300) 내의 부분 또는 전체 세포 용액이 수집 백(305)에서 추출되고, 이어서 샘플링 포트(382)를 통해 세포 농도를 측정하기 위해 샘플이 취해진다. 그 다음, 부피는 다시 챔버(300) 내부로 펌핑될 수 있고, 스파이크(304) 또는 이용가능한 백(304a)에 연결된 백으로부터 함염 용액으로 희석되고, 출력 스파이크(302) 상에 연결된 몇몇의 백으로 분할될 수 있다.

키트는 샘플이 층류 외측으로 취해질 필요가 있는 경우 샘플링 필로우(384)를 갖는 저온제조 라인 및 추가 냉동을 위해 최종 용액이 동결방지제 용액과 함께 첨가될 필요가 있는 경우 튜빙 경로(386) 내에서 저항성이 있는 DMSO를 선택적으로 포함한다.

Claims (11)

1. 생물학적 유체의 처리 또는 혼합과, 시약 및 희석액 중 적어도 하나와 생물학적 유체의 혼합 중 어느 하나 또는 둘 모두를 위한 중공 원통형 원심 처리 챔버 내에서 세척, 배양, 형질도입, 분리, 밀도 구배 분리, 희석 및 부피 조절을 포함하는 처리 단계에 의해 불투명 및 투명 생물학적 유체의 순차적 처리를 위한 공정으로서, 원심 처리 챔버는 분리 공간 내로 또는 분리 공간으로부터 생물학적 유체를 유입 또는 배출시키기 위하여 처리 챔버 내에서 분리 공간의 부피를 변화시키도록 축방향으로 이동가능한 축방향 이동가능 부재를 그의 원통형 벽 내에 수용하고, 처리 챔버는 시약 및 희석액 중 적어도 하나와 생물학적 유체를 수용하는 일회용 세트의 일부이고, 일회용 세트는 밀폐된 멸균 환경을 가지는, 공정이며,
   단일 일회용 세트의 일부로서 단일 처리 챔버를 사용하여, 개별 절차로서 사전 세척 및 사후 세척을 포함하는 세척, 배양, 형질도입, 분리, 밀도 구배 분리, 희석 및 부피 조절로부터 선택된 3가지 이상의 상이한 절차가 수행되고, 각각의 상기 절차는 단일 일회용 세트의 처리 챔버 내에 주어진 처리 프로파일에 따라 한번 수행되거나 또는 복수 회 반복되고, 각각의 상기 절차는 이동가능 부재를 축방향으로 이동시킴으로써 생성된 처리 챔버 내로의 유입, 처리 챔버 내에서의 작동 및 이동가능 부재를 축방향으로 이동시킴으로써 생성된 처리 챔버로부터의 배출을 포함하고, 상기 3가지 이상의 상이한 절차는 처리 챔버 및 그의 단일 일회용 세트 내에서의 전체 순차적 작업으로서 상이한 절차의 연쇄 순서(chained sequence)를 구성하도록 처리 챔버 내에서 순차적으로 차례로 연쇄되고, 상기 3가지 이상의 상이한 절차 모두를 수행하기 위하여 필요한 시약 및 희석액 중 적어도 하나와 모든 생물학적 유체는 전체 순차적 작업을 위해 사용된 단일 일회용 세트의 밀폐된 멸균 환경에 수용되는 것을 특징으로 하는 공정.
2. 제1항에 있어서, 처리 챔버 내에서 전체 순차적인 작업을 구성하는 연쇄 순서는 하기 순서의 절차
   (i) 사전 세척, 시약의 첨가 및 배양, 사후 세척,
   (ii) 세척, 희석, 원심 분리, 희석, 생성물의 부피 조절, 및
   (iii) 사전 해동, 세척, 샘플링 및 희석, 부피 조절/추출 중 하나를 포함하는 공정.
3. 제2항에 있어서, 사전 세척, 시약의 첨가 및 배양, 사후 세척의 절차가 순차적으로 수행되는 공정.
4. 제3항에 있어서, 인간의 혈액 세포 또는 줄기 세포 내에 자기 비드를 결합시키기 위한 것인 공정.
5. 제2항에 있어서, 세척, 희석, 원심 분리, 희석, 생성물의 부피 조절의 절차가 순차적으로 수행되는 공정.
6. 제5항에 있어서, 림프구 T 세포 또는 다른 인간의 세포 내의 바이러스 형질도입을 위한 것인 공정.
7. 제2항에 있어서, 사전 해동, 세척, 샘플링 및 희석, 부피 조절/추출의 절차가 순차적으로 수행되는 공정.
8. 제7항에 있어서, 세포 생성물의 다수의 도즈(dose)의 도징을 재조절하기 위한 것인 공정.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 이동가능 부재의 위치는 적외선 센서에 의해 모니터링되는 공정.
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 하나의 전체 순차적 작업을 위해 하나의 일회용 세트의 처리 챔버 내에서 처리된 액체의 부피는 처리 챔버의 최대 처리 부피의 4배 내지 16배인 공정.
11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 처리 챔버는 사용자 개재 없이 일회용 세트의 백을 전환시키기 위하여 2가지의 생물학적 첨가제를 선택하기 위해 일회용 세트의 튜빙을 제어하는 2개의 외부 핀치 밸브와 연계되는 공정.

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