KR20200099492A - 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩 - Google Patents

타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩에 관한 것이다. 본 발명에 따른 추출 장치에서는 추출 키트 내의 다공막에 타겟 물질이 바인딩 된 상태에서, 용출 용액과 이극성 용액이 순차적으로 통과할 때, 다공막에 잔존하는 용출 용액을 극성의 차이로 이극성 용액이 밀어내며, 수집 챔버에 수집된다. 그리고, 수집 챔버 내에서도 상이한 극성에 의해 용출 용액과 이극성 용액이 적층된 상태를 유지하는데, 수집 챔버 내의 이극성 용액이 자력 인가부의 자력에 의해 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 수집 챔버 내의 용출 용액이 회수 가능하게 된다. 이에 따라, 용출 용액이 이극성 용액과 함께 수집 챔버에 수집된 후, 자력에 의해 수집 챔버 내의 이극성 용액을 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서 용출 용액의 회수가 가능하게 된다.

Description

타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩{EXTRACTING APPARATUS, EXTRACTING METHOD AND FLUID FLOW CHIP FOR EXTRACTING TARGET SUBSTANCE}
본 발명은 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 원심 분리 방식을 이용하지 않거나 고속의 원심 분리를 적용하지 않으면서도 핵산과 같은 타겟 물질을 추출할 수 있는 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩에 관한 것이다.
의료 분야에 있어서 맞춤 의학을 구현하기 위한 효율적 진단 및 치료방법이 활발하게 개발되고 있는데, 핵산과 같은 타겟 물질의 추출 및 정제 과정은 생명공학, 분자 생물학, 생화학, 진단 검사 의학 등의 검사에서 핵심이 되는 과정이다.
근래에 비침습적인 액체생체검사가 높은 검출 정확도와 조기 발견 표지자로서의 가능성이 입증되어 기존의 조직생검의 실질적인 대안으로 주목받고 있는 가운데, 혈액 또는 기타 체액으로부터 cfDNA(cell free DNA), 엑소좀, CTC (Circulating Tumor Cell) 등의 분리 및 정제 기술의 수요가 늘어나고 있다.
신속하고 정확한 진단을 위한 대표적인 타겟 물질의 전처리 방법의 일 예로 스핀 컬럼(Spin column) 방식의 핵산 추출 과정은, 실리카 재질의 다공막을 포함하는 컬럼에 샘플과 핵산 추출을 위한 버퍼들을 순차적으로 흘려주는 과정을 포함한다. 결과적으로 스핀 컬럼 방식은 핵산을 다공막에 결합시킨 후 세척(Washing) 과정을 거쳐 핵산을 원하는 농도로 농축시켜 추출하는 방법이다. 도 1은 한국등록특허 제10-1495631호에 개시된 컬럼의 예를 도시한 도면이고, 도 2는 스핀 컬럼 방식을 통해 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 도면이다.
도 2를 참조하여 설명하면, 핵산을 포함하는 샘플을 컬럼에 투입한 후, 원심 분리기에서 원심 분리 과정을 거치게 되면, 샘플 내의 핵산이 다공막에 바인딩(Binding)된다. 그런 다음, 세척 용액을 컬럼에 주입하고 다시 원심 분리기를 통해 원심 분리 과정을 거치게 되면, 다공막에 잔존하는 불순물들이 제거된다. 여기서, 세척 과정은 핵산이나 핵산이 추출된 체액의 유형, 또는 이후의 핵산 처리 과정에 따라 다양한 세척 용액이 사용되거나 복수회 수행될 수 있다.
세척 과정이 완료되면, 다공막에 잔존하는 세척액이 완전히 제거되도록 건조(Drying) 과정을 거치게 되는데, 이 경우에도 일반적으로 원심 분리기를 통한 원심 분리 과정을 거치게 된다.
건조 과정이 완료되면 용출 용액(Elution buffer)을 컬럼에 주입한 후, 다시 원심 분리기를 통해 원심 분리 과정을 거치게 되면, 다공막에 바인딩되어 있던 핵산이 용출 용액과 함께 추출 가능하게 된다.
상기와 같이, 스핀 컬럼 방식을 이용한 핵산 추출의 경우, 대부분의 과정에서 원심 분리 과정을 거쳐야 하는데, 근래에 바인딩 과정이나 세척 과정에서는 음압을 이용하는 방안이 제안되고 있으나, 건조 과정이나 용출 과정, 특히 용출 과정에서 컬럼에 12,000G 이상이 인가되어야 하므로, 이를 음압으로 대체하기는 어려운 실정이다.
이와 같은 원심 분리 과정은 핵산을 추출하는데 있어, 각각의 과정에서 컬럼을 원심 분리기에 거치하고 다시 빼내는 과정을 거쳐야 하기 때문에, 하나의 칩에서 일련의 과정을 통해 핵산을 분리하는 것을 어렵게 하고 있다.
또한, 원심 분리기를 배치할 수 없는 현장 진단에서는 스핀 컬럼 방식을 적용하기 어려울 뿐만 아니라, 현장에서 추출한 샘플을 원심 분리기가 마련된 장소로 이동하는 과정에서 교차 오염의 우려가 있는 문제점이 있다.
또한, 일련의 과정이 사용자가 일일이 수작업으로 수행하여야 하기 때문에, 사용자의 숙련도에 따라 핵산 추출량이나 순도의 반복 정확성에 영향을 받게 된다.
이에, 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해소하기 위해 안출된 것으로서, 원심 분리 방식을 이용하지 않거나 고속의 원심 분리를 적용하지 않으면서도 핵산과 같은 타겟 물질을 추출할 수 있는 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적은 본 발명에 따라, 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에 있어서, 추출 키트와, 상기 추출 키트의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과, 상기 추출 키트 내에서 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막으로부터 상기 타겟 물질을 용출하는 용출 용액과, 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않은 이극성 용액과, 상기 다공막을 순차적으로 통과하는 상기 용출 용액 및 상기 이극성 용액이 적층된 상태로 수집되는 수집 챔버를 포함하고; 상기 이극성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 용출 용액과의 상이한 극성에 의해 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에 의해서 달성된다.
추가로, 상기 추출 장치에서 용출 용액은 자성을 가질 수 있고, 상기 수집 챔버로 자력을 인가하기 위한 자력 인가부를 포함할 수 있고, 상기 수집 챔버 내의 상기 자성 용액이 상기 자력 인가부의 자력에 의해 상기 용출 용액으로부터 물리적으로 분리된 상태에서, 상기 수집 챔버 내의 상기 용출 용액이 회수 가능할 수 있다. 여기서, 상기 자력 인가부는 상기 자성 용액이 상기 수집 챔버 내부의 벽면으로 뭉쳐 하부의 상기 용출 용액이 상부로 노출되도록 상기 수집 챔버의 측면으로 자력을 인가할 수 있다.
또한, 상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 이극성 용액은 무극성 용액일 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 이극성 용액은 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
그리고, 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 상기 다공막을 통과하기 위한 유동력을 상기 추출 키트에 인가하는 유동력 인가부를 더 포함할 수 있다.
그리고, 상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와, 상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며; 상기 유동력 인가부는 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압을 인가하거나 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압을 제공하는 압력 펌프를 포함할 수 있다.
한편, 상기 목적은 본 발명의 다른 실시 형태에 따라, 추출 장치가 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법에 있어서, (a) 내부에 다공막이 설치된 추출 키트를 마련하는 단계와, (b) 상기 다공막에 상기 타겟 물질이 바인딩되는 단계와, (c) 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 타켓 물질을 용출하는 단계와, (d) 상기 용출 용액과 상이한 극성을 갖는 이극성 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내는 단계와, (e) 상기 다공막을 순차적으로 통과한 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 수집 챔버에 수집되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법에 의해서도 달성된다.
상기 추출 방법에서, 상기 (b) 단계는 (b1) 상기 타겟 물질이 포함된 샘플이 상기 다공막을 통과하여 상기 타겟 물질이 상기 다공막에 바인딩되는 단계와; (b2) 상기 시료 키트 내에 세척 용액이 주입되는 단계와; (b3) 상기 세척 용액이 상기 다공막을 통과하여 상기 다공막이 세척되는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 이극성 용액은 무극성 용액일 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 이극성 용액은 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
그리고, 상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와, 상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며; 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액을 유동시키기 위한 유동력은 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압으로 인가되거나, 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압으로 인가될 수 있다.
한편, 상기 목적은 본 발명의 또 다른 실시 형태에 따라, 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩에 있어서, 칩 본체와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질이 포함된 샘플 용액이 저장되는 샘플 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 저장되는 용출 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않는 이극성 용액이 저장된 이극성 챔버와, 상기 칩 본체 내부에 형성되는 추출 챔버와, 상기 추출 챔버의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과, 상기 칩 본체에 설치되어, 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버 중 어느 하나를 상기 추출 챔버의 유입구와 선택적으로 연결하는 챔버 선택 밸브와, 상기 칩 본체 내부에 형성되고, 상기 추출 챔버의 배출구와 연결되는 수집 챔버를 포함하고; 상기 챔버 선택 밸브가 상기 추출 챔버를 상기 용출 용기와 상기 이극성 용기에 순차적으로 연결시켜 외부로부터의 유동력에 의해 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버 내의 상기 용출 용액 및 상기 이극성 용액이 유동하여 상기 추출 챔버의 상기 유입구를 통해 상기 다공막을 유입되어 상기 다공막을 순차적으로 통과하고, 상기 이극성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내어 상기 배출구를 통해 상기 수집 챔버로 수집된다.
그리고, 상기 칩 본체는 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버, 상기 이극성 챔버, 상기 추출 챔버 및 상기 수집 챔버가 형성되는 하부 본체와, 상기 하부 본체의 상부에 결합되는 상부 커버를 포함하고; 상기 하부 본체에는 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버를 상기 추출 챔버의 유입구와 연결하기 위한 유동 채널이 형성되고; 상기 유동 채널의 말단과 상기 추출 챔버의 상기 유입구는 상기 칩 본체의 상부로 개방되고, 상기 상부 커버를 통해 하부 본체에 결합되는 상기 챔버 선택 밸브가 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버에 각각 연결된 상기 유동 채널의 말단 중 어느 하나를 선택적으로 상기 추출 챔버의 상기 유입구와 연결시킬 수 있다.
그리고, 상기 하부 본체에 형성되어 세척 용액이 수용되는 적어도 하나의 세척 챔버와, 상기 하부 본체에 형성되어 상기 추출 챔버를 통과한 상기 샘플 용액과 상기 세척 용액을 저장하는 폐용액 챔버와, 상기 상부 커버를 통해 상기 하부 본체에 결합되고, 상기 추출 챔버의 상기 배출구를 상기 수집 챔버와 상기 폐용액 챔버 중 어느 하나와 선택적으로 연결하는 배출 선택 밸브를 더 포함하며; 상기 세척 챔버 내의 상기 세척 용액은 상기 샘플 용액의 상기 추출 챔버를 통과하면서 상기 샘플 용액 내의 상기 타겟 물질이 상기 다공막에 바인딩된 후 상기 다공막을 세척할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 세척 용액은 10 내지 100%의 알코올 수용액일 수 있다. 상기 알코올은 예컨대 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 또는 부탄올일 수 있다. 상기 세척 용액을 이용한 세척은 1회 또는 다회 수행될 수 있다.
또한, 상기 칩 본체는 상기 수집 챔버 및 상기 폐용액 챔버와 연결되고, 유체의 유동을 위한 외부로부터의 음압이 유입되는 음압 유입구를 더 포함하며; 상기 음압 유입구는 상기 배출 선택 밸브의 선택에 따라 상기 수집 챔버 또는 폐용액 챔버를 통해 상기 수집 챔버의 상기 배출구로 유동을 위한 음압을 인가할 수 있다.
그리고, 상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 이극성 용액은 무극성 용액일 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 이극성 용액은 이극성 입자가 분산된 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함할 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 다공막은 실리카 막, 이온 교환수지, 실리카 메쉬, 실리카 비드가 패킹된 패킹 튜브, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함하며; 상기 타겟 물질이 CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우, 상기 다공막은 이온 교환수지, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
그리고, 상기 타겟 물질은 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 타겟 물질은 생물학적 샘플에 포함되어 존재할 수 있으며, 여기서 상기 생물학적 샘플은 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함할 수 있고, 동물, 식물 또는 미생물 유래 세포 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk)일 수 있다. 예컨대, 상기 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 추출 장치, 추출 방법 및 유체 유동 칩은 액체 생검용 타겟 물질 추출을 위한 것일 수 있다.
도 1은 한국등록특허 제10-1495631호에 개시된 컬럼의 예를 도시한 도면이고,
도 2는 스핀 컬럼 방식을 통해 핵산을 추출하는 과정을 나타낸 도면이고,
도 3은 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치의 구성을 나타낸 도면이고,
도 4는 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치의 작동 원리를 설명하기 위한 도면이고,
도 5는 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법을 설명하기 위한 도면이고,
도 6은 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에서 수집 챔버에 수집된 용출 용액 및 이극성 용액에서 용출 용액을 회수하는 과정을 설명하기 위한 도면이고,
도 7은 본 발명의 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩의 사시도이고,
도 8은 도 7에 도시된 유체 유동 칩의 분해 사시도이고,
도 9의 (a)는 도 7에 도시된 유체 유동 칩의 평면도이고,
도 9의 (b)는 도 8에 도시된 유체 유동 칩의 하부 본체의 평면도이고,
도 10은 도 8의 X-X 선에 따른 단면도이고,
도 11 내지 도 14는 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 이용한 타겟 물질의 추출 과정을 설명하기 위한 도면이고,
도 15 내지 도18은 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 이용한 실험 결과를 설명하기 위한 도면이고,
도 19는 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 활용하여 실제 임상에서 환자의 혈액 분석을 통해 돌연변이 유전자를 모니터링하는 실험 결과를 나타낸 도면이다.
이하에서는 첨부된 도면을 참조하여 본 발명에 따른 실시예들을 상세히 설명한다.
도 3은 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치(100)의 구성을 나타낸 도면이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 본 발명에 따른 추출 장치(100)는 추출 키트(110), 다공막(120), 용출 용액(130) 및 이극성 용액(140)을 포함한다. 또한, 본 발명에 따른 추출 장치(100)는 수집 챔버(200, 도 6 참조) 및 유동력 인가부(150)를 포함할 수 있다.
추출 키트(110)는 유입구(111) 및 배출구(112)가 형성된 통 형상을 가지며, 본 발명에서는 원통 형상을 갖는 것을 예로 한다. 그리고, 유입구(111)를 통해 용출 용액(130) 및 이극성 용액(140)이 유입되며, 배출구(112)를 통해 다공막(120)을 통과한 용출 용액(130) 및 이극성 용액(140)이 배출된다. 본 발명에서는 배출구(112) 측의 내경이 좁아지는 형태를 갖는 것을 예로 한다.
다공막(120)은 추출 키트(110)의 내부에 설치되는데, 다공막(120)에는 타겟 물질(TS, 도 4 참조)이 바인딩된다. 여기서, 타겟 물질(TS)의 바인딩 과정은 기 공지된 방법, 예컨대 바인딩 단계, 세척 단계, 및 건조 단계를 포함할 수 있으며, 후술할 본 발명에 따른 추출 방법이나 유체 유동 칩(300)을 통해 바인딩될 수 있는바, 이에 대한 상세한 설명은 후술한다.
여기서, 본 발명에 따른 추출 장치(100)가 적용되는 타겟 물질(TS)은 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
상기 타겟 물질은 생물학적 샘플에 포함되어 존재할 수 있으며, 여기서 상기 생물학적 샘플은 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함할 수 있고, 동물, 식물 또는 미생물 유래 세포 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 뇌척수액, 눈물, 땀, 대변, 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk)일 수 있다. 예컨대, 상기 생물학적 샘플은 혈액 또는 혈장일 수 있다.
최근들어 최소침습형인 혈액검사, 오줌이나 타액을 이용한 비침습형 진단법등의 조기진단이 주목을 받고 있다. 혈액이나 타액에 포함된 다양한 바이오마커들 중 DNA나 RNA와 같은 분자를 검출하는 분자진단법을 통해 각종 감염질환, 종양, 유전질환을 검사할 수 있다. 혈액 속에는 엑소좀(exosome)/미세소포체 (microvesicle)와 같은 세포외소포체(extracellular vesicle, EV)를 비롯해 비세포 DNA (cell-free DNA, cfDNA), 세포외 RNA (exRNA: 마이크로 RNA (miRNA), 메신저 RNA (mRNA), long noncoding RNA (lncRNA)) 등 다양한 형태의 순환핵산(circulating nucleic acid, CNA)이 존재하는데, cfDNA 중 암세포로부터 유래한 순환종양 DNA (circulating tumor DNA, ctDNA)는 순환종양세포(circulating tumor cells, CTCs)와 더불어 암의 조기진단과 예후 판별에 유용하게 이용될 수 있다.
일 실시양태에서, 본 발명의 추출 장치가 적용되는 타겟 물질(TS)은 DNA이고, cfDNA 및/또는 ctDNA를 포함할 수 있다.
또한, 타겟 물질(TS)이 핵산인 경우, 다공막(120)은 실리카 막, 이온 교환수지, 실리카 메쉬, 실리카 비드가 패킹된 패킹 튜브, 타겟 물질(TS)과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 또한, 타겟 물질(TS)이 CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우, 다공막(120)은 이온 교환수지, 타겟 물질(TS)과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 이는 타겟 물질(TS)이 부착되거나 특이적으로 결합되어 다공막(120)에 바인딩될 수 있는 다양한 형태의 막 구조가 적용될 수 있다.
용출 용액(130)은 추출 키트(110) 내에서 다공막(120) 위에 적층된다. 그리고, 용출 용액(130)이 다공막(120)을 통과할 때, 다공막(120)에 바인딩된 타겟 물질(TS)이 용출 용액(130)에 용해되거나 용출 용액(130) 내부로 분산되어 용출 용액(130)과 함께 다공막(120)으로부터 이탈이 가능하게 된다.
용출 용액(130)으로는 염을 함유할 수 있는 수성 용액일 수 있다. 상기 염은 NH4 +, Na+, K+와 같은 1가 양이온, Ca2+, Mg2+와 같은 2가 양이온, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있고, 염 농도는 100 mM 이하, 80 mM 이하, 60 mM 이하, 40 mM 이하, 또는 20 mM 이하일 수 있다.
이극성 용액(140)은 용출 용액(130)과 상이한 극성을 가져, 추출 키트(110) 내에 주입될 때 용출 용액(130)과 섞이지 않는 상태로 유지된다. 추가적으로, 이극성 용액(140)은 자성을 갖도록 마련될 수 있다. 예컨대, 이극성 용액은 용출 용액(130)과 상이한 극성을 가지는 용액 내에 자성 입자가 분산되어 용액 전체가 자성을 갖는 형태를 가질 수 있다.
여기서, 이극성 용액(140)은, 도 3에 도시된 바와 같이, 추출 키트(110) 내에 서 용출 용액(130) 위에 적층되는데, 즉, 다공막(120), 용출 용액(130), 그리고 이극성 용액(140)이 적층되는 형태를 유지하여 용출 용액(130)이 다공막(120)을 통과한 다음 이극성 용액(140)이 다공막(120)을 통과하게 된다.
본 발명에서는 용출 용액(130)이 증류수와 같은 극성 용액이고, 이극성 용액(140)이 기름과 같은 무극성 용액인 것을 예로 한다. 일 예로, 타겟 물질(TS)이 핵산인 경우, 용출 용액(130)은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼가 적용될 수 있다. 여기서, 핵산 추출용 용출 버퍼는 핵산을 추출하는데 적용되는 상용의 버퍼 용액으로, 일 예로 10 mM Tris-Cl, 0.1 M EDTA, 20 μg/ml pancreatic RNase A, 0.5% SDS의 pH 8.0 혼합 용액이 적용될 수 있다. 이 때, 이극성 용액(140)은 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일이 적용될 수 있다.
상기와 같은 구성에 따라, 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)이 다공막(120)을 통과하기 위한 유동력이 유동력 인가부(150)를 통해 추출 키트(110)에 인가되면, 도 4의 (a)에 도시된 바와 같이, 용출 용액(130)이 먼저 다공막(120)을 통과하면서 다공막(120) 내의 타겟 물질(TS)과 함께 다공막(120) 반대측으로 유동하게 된다.
그런데, 용출 용액(130)이 다공막(120)을 모두 통과하면서 타겟 물질(TS)의 대부분을 다공막(120)으로부터 이탈시키기 위해 종래의 원심 분리 방식이 12,000G를 인가하였으나, 본 발명에 따른 추출 장치(100)에서는 용출 용액(130) 통과 다음에 이극성 용액(140)이 다공막(120)을 통과하면서, 도 4의 (b)에 도시된 바와 같이, 다공막(120) 내의 잔존하는 용출 용액(130)을 밀어내어 용출 용액(130)와 타겟 물질(TS)이 완전하게 다공막(120)으로부터 이탈 가능하게 된다. 이에 따라, 원심 분리기를 이용하지 않거나, 원심력을 이용하더라도 12,000G 이하의 압력에서도 용출 용액(130)을 이용한 타겟 물질(TS)의 추출이 가능하게 된다.
본 발명에서는 유동력 인가부(150)에 의해 인가되는 유동력이 양압 또는 음압과 같은 압력, 원심력, 중력, 또는 관성력을 포함할 수 있다. 예컨대, 유동력 인가부(150)는 추출 키트(110)의 유입구(111)를 통해 추출 키트(110) 내부로 양압을 인가하거나 배출구(112)를 통해 추출 키트(110) 내부로 음압을 제공하는 압력 펌프를 포함할 수 있으며, 압력 펌프의 구성으로 컴프레셔, 시린지 펌프, 튜브 연동식 펌프 등이 적용될 수 있다.
본 발명에서, 유동력 인가부(150)에 의해 인가되는 유동력은 -5 내지 -25 mmHg, 또는 0.7 내지 3.3kPa 범위의 압력일 수 있다.
또한, 원심력의 경우, 원심력을 이용하는 종래기술과 대비할 때, 보다 작은 회전 속도, 즉 상기와 같이, 12,000G 이하의 압력에서도 용이하게 분리가 가능하게 된다.
중력을 유동력으로 사용하는 경우, 다공막(120)의 용출 용액(103)에 대한 유동 저항이 작아서 중력의 힘으로도 다공막(120)을 통과할 수 있으나, 전부 통과하지 못하는 잔여의 용출 용액(130)이 다공막(120) 내에 잔존하더라도 중력만으로 다공막(120) 내부로 침투가 가능한 이극성 용액(140)을 사용하여 잔존하는 용출 용액(130)을 밀어내어 용출 용액(130)을 이용한 타겟 물질(TS)의 추출이 가능하게 된다.
또한, 관성력을 유동력으로 사용하는 경우, 다공막(120) 상부에 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)을 적층시킨 상태에서 중력방향으로 빠르게 이동 및 정지를 반복하여 발생하는 관성력을 이용하여 용출 용액(130)을 이용한 타겟 물질(TS)의 추출이 가능하게 된다.
한편, 추출 키트(110) 내의 다공막(120)을 순차적으로 통과한 용출 용액(130) 및 이극성 용액(140)은 추출 키트(110)의 배출구(112)와 연결된 수집 챔버(200)에 수집되는데, 도 6에 도시된 바와 같이, 상호 상이한 극성에 따라 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)이 적층된 상태로 수집된다. 그리고, 이극성 용액(140)의 자성을 이용하여 수집 챔버로부터 용출 용액(130)을 회수하는 과정을 거칠 수 있는데, 이에 대한 상세한 설명은 도 5 및 도 6을 참조하여 본 발명에 따른 타겟 물질(TS)을 추출하기 위한 추출 방법을 통해 설명한다.
먼저, 도 3에 도시된 바와 같이, 내부에 다공막(120)이 설치된 추출 키트(110)를 준비한다. 그리고, 추출 키트(110)의 다공막(120)에 타겟 물질(TS)이 바인딩된다. 도 5를 참조하여 보다 구체적으로 설명하면, 내부에 다공막(120)이 설치된 추출 키트(110)에 타겟 물질(TS)을 포함하는 포함된 샘플 용액을 주입한다(S40).
그런 다음, 샘플 용액의 유동을 위한 유동력이 추출 키트(110)에 인가되면, 샘플 용액이 다공막(120)을 통과하면서 샘플 용액 내의 타겟 물질(TS)이 다공막(120)에 바인딩된다(S41). 그런 다음, 추출 키트(110) 내부에 세척 용액을 주입하고(S42), 유동력이 인가되면 세척 용액이 다공막(120)을 통과하면서 다공막(120) 내부를 세척하게 된다(S43). 그리고, 세척 단계의 완료 후 건조 과정을 거치게 되면, 다공막(120) 내부에 타겟 물질(TS) 만의 바인딩이 완료된다.
그런 다음, 추출 키트(110)에 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)을 주입한다(S45,S46). 도 5에서는 용출 용액(130) 주입 후에 이극성 용액(140)을 주입하는 것을 예로 하여 나타내고 있으나, 용출 용액(130)이 극성의 증류수이고, 이극성 용액(140)이 비극성의 오일인 경우에는 그 주입 순서와 무관하게, 도 3에 도시된 바와 같이, 다공막(120) 위에 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)이 순차적으로 적층된다.
용출 용액(130)과 이극성 용액(140)의 주입이 완료된 후, 추출 키트(110)에 유동력을 인가하게 되면(S47), 상술한 바와 같이, 용출 용액(130)이 먼저 다공막(120)을 통과하고, 잔존하는 타겟 물질(TS)을 용출 용액(130)과 함께 이극성 용액(140)이 다공막(120) 외부로 밀어내어 잔존하는 타겟 물질(TS)이 용출 용액(130)과 함께 완전하게 추출이 가능하게 된다. 여기서, 추출 키트(110)에 유동력을 인가하는 방법은 상술한 바와 같은 바, 그 상세한 설명은 생략한다.
그리고, 이극성 용액(140)의 일부 또는 전부가 다공막(120)을 통과하면, 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)은 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 수집 챔버(200)에 수집된다(S48). 이 때, 수집 챔버(200) 내에서는 상호 상이한 극성에 따라 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)이, 도 6의 (a)에 도시된 바와 같이, 적층된 상태로 수집된다.
도 6의 (a)에 도시된 바와 같은 상태에서, 파이펫 팁(170)을 이용하여 하부의 용출 용액(130)을 회수하는 경우, 회수하는 과정에서 이극성 용액(140)의 일부가 함께 회수될 수 있다. 이에, 본 발명의 일례로서, 이극성 용액(140)은 자성을 갖는 것으로 할 수 있다.
이 경우, 도 6의 (b)에 도시된 바와 같이, 수집 챔버(200)의 외부에서 자력 인가부(160)가 자력을 추가로 인가하여(S49) 이극성 용액(140)을 용출 용액(130)으로부터 물리적으로 분리시킨 상태에서 용출 용액(130)을 회수할 수 있다(S50). 도 6의 (b)에서는 자력 인가부(160)가 영구 자석 형태를 갖는 것을 예로 하고 있으나, 전자석을 이용하는 것도 가능하다.
그리고, 도 6의 (b)에서는 자력 인가부(160)가 이극성 용액(140)이 수집 챔버(200)의 측면으로 뭉치도록 수집 챔버(200)의 측면으로 자력을 인가하는 것을 예로 하며, 이를 통해 도 6의 (c)에 도시된 바와 같이, 파이펫 팁(170)이 이극성 용액(140)을 거치지 않고 바로 용출 용액(130)에 담긴 상태로, 도 6의 (d)에 도시된 바와 같이, 용출 용액(130)의 회수가 가능하게 된다. 그리고, 용출 용액(130)이 회수된 후, 용출 용액(130)으로부터 타겟 물질(TS)을 추출하게 된다.
전술한 실시예에서는 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)이 추출 키트(110) 내에 주입되고 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)이 섞이지 않은 상태에서 다공막(120) 위에 적층된 상태로 유동력이 인가되는 것을 예로 하고 있다. 이외에도, 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)의 추출 키트(110) 내에서의 적층 과정 없이, 용출 용액(130)을 먼저 추출 키트(110) 내로 유동시켜 다공막(120)을 통과시키고 용출 용액(130)을 먼저 수집 챔버(200)로 수집한 후, 동일한 방법으로 이극성 용액(140)을 다공막(120)을 통과시켜 수집 챔버(200)로 수집되도록 마련될 수 있음은 물론이다.
이하에서는 도 7 내지 도 14를 참조하여 본 발명에 따른 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩(300)에 대해 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)은 상술한 추출 장치가 칩 형태로 구현된 예로서, 추출 키트(110)가 유체 유동 칩(300) 내에 추출 챔버(350)로 구현된 것을 예로 한다. 또한, 전술한 실시예에서의 유동력 인가부(150)는 도 11 내지 도 14에 도시된 음압 펌프(151) 및 압력 게이지(152)로 구성되는 것을 예로 하여 설명하며, 다공막(120)의 참조번호는 동일하게 사용한다.
도 7 내지 도 10을 참조하여 설명하면, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)은 칩 본체(310), 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323), 이극성 챔버(324), 추출 챔버(350), 다공막(120), 챔버 선택 밸브(330) 및 수집 챔버(325)를 포함한다.
칩 본체(310)는 투명 또는 반투명한 플라스틱 재질로 마련되는 것을 예로 하는데, 본 발명에서는 도 8에 도시된 바와 같이, 하부 본체(311) 및 상부 커버(312)를 포함하는 것을 예로 한다. 하부 본체(311)에는 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323), 이극성 챔버(324), 추출 챔버(350) 및 수집 챔버(325)가 형성되고, 이러한 챔버들을 연결하기 위한 유동 채널(371)들이 형성된다.
상부 커버(312)는 하부 본체(311)의 상부에 결합되는데, 상술한 챔버들의 전체 또는 일부분을 차단하며, 각 챔버를 개폐하기 위한 마개가 결합되는 구조를 가지며, 챔버 선택 밸브(330) 및 후술할 배출 선택 밸브(340)가 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)에 결합된다.
샘플 챔버(321)는 칩 본체(310)의 하부 본체(311) 내부에 형성되며, 타겟 물질이 포함된 샘플 용액이 저장된다. 그리고, 용출 챔버(323) 및 이극성 챔버(324)는 마찬가지로 칩 본체(310)의 하부 본체(311) 내부에 형성되어 각각 용출 용액 및 이극성 용액이 저장된다. 여기서, 용출 용액과 이극성 용액은 상술한 추출 장치(100)에 대응하는 바, 그 상세한 설명은 생략한다.
추출 챔버(350)는 칩 본체(310)의 하부 챔버 내부에 형성되는데, 상술한 추출 장치(100)의 추출 키트(110)에 대응한다. 즉, 추출 챔버(350) 내부에는, 도 7 및 도 10에 도시된 바와 같이, 타겟 물질이 바인딩되는 다공막(120)이 설치된다.
그리고, 수집 챔버(325)는 칩 본체(310)의 하부 본체(311) 내부에 형성되는데, 추출 챔버(350)의 배출구(352)(미도시)와 연결된다.
한편, 챔버 선택 밸브(330)는 칩 본체(310)에 설치되는데, 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323) 및 이극성 챔버(324) 중 어느 하나를 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 선택적으로 연결시킨다. 본 발명에서는 챔버 선택 밸브(330)가, 도 8에 도시된 바와 같이, 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)에 결합되는 것을 예로 한다.
도 8 및 도 9의 (b)를 참조하여 설명하면, 하부 본체(311)에는 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323) 및 이극성 챔버(324)를 각각 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 연결시키기 위한 유동 채널(371)이 형성된다. 이 때, 유동 채널(371)의 말단은, 도 9의 (b)에 도시된 바와 같이, 하부 본체(311)의 상부 표면으로 개방된 상태를 가지며, 마찬가지로, 추출 챔버(350)의 유입구(351) 또한 하부 본체(311)의 상부로 개방된 상태가 된다. 이 때, 챔버 선택 밸브(330)는 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)의 상부 표면에 결합되어 샘플 챔버(321), 용출 챔버(323) 및 이극성 챔버(324)에 각각 연결된 유동 채널(371)의 말단 중 어느 하나를 선택적으로 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 연결시키게 된다.
본 발명에서는 챔버 선택 밸브(330)가, 도 8에 도시된 바와 같이, 실리콘 재질의 개스킷(311), 챔버 스위칭 밸브(332), 그리고 이들을 고정하는 제1 고정 지그(333)를 포함하는 것을 예로 한다. 여기서, 개스킷(311)에는 각 유동 채널(371)의 말단과 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 연통되는 연통홀들이 형성되며, 챔버 스위칭 밸브(332)의 회전에 따라 추출 챔버(350)의 유입구(351)와 각 유동 채널(371) 중 어느 하나가 연통되는 구조를 갖게 된다.
한편, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)은 적어도 하나의 세척 챔버(322a,322b,322c), 폐용액 챔버(326) 및 배출 선택 밸브(340)를 포함할 수 있다.
세척 챔버(322a,322b,322c)는 하부 본체(311)에 형성되어 세척 용액이 수용되는데, 본 발명에서는 3개의 세척 챔버(322a,322b,322c)가 형성되는 것을 예로 한다. 그리고, 각각의 세척 챔버(322a,322b,322c)에는 에탄올의 농도가 상이한 세척 용액이 각각 수용되는데, 3개의 세척 챔버(322a,322b,322c)에서 에탄올의 농도가 낮은 세척 용액의 순으로 순차적으로 다공막(120)을 세척하도록 마련되는 것을 예로 한다.
폐용액 챔버(326)는 하부 본체(311)에 형성되어 추출 챔버(350)를 통과한, 샘플 용액 및 세척 용액과 같은 폐용액이 저장된다. 여기서, 배출 선택 밸브(340)는 상부 커버(312)를 통해 하부 본체(311)에 결합되는데, 추출 챔버(350)의 배출구(352)를 수집 챔버(325)와 폐용액 챔버(326) 중 어느 하나와 선택적으로 연결시킨다. 도 8에 도시된 바와 같이, 배출 선택 밸브(340)는 배출 스위칭 밸브(342)와 제2 고정 지그(343)로 구성되는 것을 예로 한다.
또한, 칩 본체(310)에는 수집 챔버(325) 및 폐용액 챔버(326)와 연결되는 음압 유입구(360)가 형성된다. 음압 유입부에는 음압 펌프(151)가 연결되어 유체의 유동을 위한 음압을 인가하게 된다. 즉, 음압 유입구(360)는 배출 선택 밸브(340)의 선택에 따라 수집 챔버(325) 또는 폐용액 챔버(326)를 통해 수집 챔버(325)의 배출구(352)로 유체의 유동을 위한 음압이 인가되는데, 이에 대한 상세한 설명은 후술한다.
상기와 같은 구성에 따라, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)을 이용하여 타겟 물질을 추출하는 과정을, 도 11 내지 14를 참조하여 상세히 설명한다.
먼저, 도 11에 도시된 바와 같이, 챔버 선택 밸브(330)가 추출 챔버(350)를 샘플 챔버(321)에 연결시킨 상태에서, 샘플 챔버(321)에 수용된 샘플 용액이 추출 챔버(350)에 주입되는 바인딩 단계가 수행된다.
바인딩 단계에서, 배출 선택 밸브(340)는, 도 11에 도시된 바와 같이, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 폐용액 챔버(326)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 샘플 챔버(321) 내의 샘플 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350) 내부로 바인딩된다. 여기서, 도 11 내지 도 14에서 굵은색으로 표시된 라인이 배출 선택 밸브(340) 및 챔버 선택 밸브(330)에 의해 연결되는 라인을 나타내고 있다.
그런 다음, 도 12에 도시된 바와 같이, 챔버 선택 밸브(330)가 추출 챔버(350)를 세척 챔버(322a,322b,322c)에 연결시킨 상태에서, 세척 챔버(322a,322b,322c)에 수용된 세척 용액이 추출 챔버(350)에 주입되는 세척 단계가 수행된다.
세척 단계에서, 배출 선택 밸브(340)는, 도 12에 도시된 바와 같이, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 폐용액 챔버(326)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 세척 챔버(322a,322b,322c) 내의 세척 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350) 내부로 주입된 후, 다공막(120)을 통과하면서 세척 과정을 거치게 되고, 다공막(120)을 통과한 세척 용액은 배출구(352), 배출 선택 밸브(340)를 거쳐 폐용액 챔버(326)로 배출된다.
도 11 내지 도 14에서는 하나의 세척 챔버(322a,322b,322c)가 적용된 예를 나타내고 있으나, 상술한 바와 같이, 3개의 세척 챔버(322a,322b,322c)로부터 3가지의 세척 용액이 순차적으로 유동하여 다공막(120)을 세척하도록 마련될 수 있음은 물론이다.
그리고, 상술한 바와 같이 세척 단계의 수행 후, 건조 단계가 진행될 수 있으며, 건조 단계의 완료 후, 챔버 선택 밸브(330)가 추출 챔버(350)와 용출 챔버(323)가 연결되도록 스위칭되어 용출 챔버(323) 내의 용출 용액이 추출 챔버(350) 내부로 유입된다.
이 때, 도 13에 도시된 바와 같이, 배출 선택 밸브(340)는 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 수집 챔버(325)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 용출 챔버(323) 내의 용출 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350) 내부로 주입되어 다공막(120)을 통과한 후, 수집 챔버(325)로 수집된다.
그런 다음, 챔버 선택 밸브(330)가, 도 14에 도시된 바와 같이, 추출 챔버(350)와 이극성 챔버(324)가 연결되도록 스위칭되어 이극성 챔버(324) 내의 이극성 용액이 추출 챔버(350) 내부로 주입되어 다공막(120)을 통과하면서 잔존하는 용출 용액을 밀어내어 용출 용액과 함께 수집 챔버(325)로 수집된다.
이 때, 도 14에 도시된 바와 같이, 배출 선택 밸브(340)는 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측과 수집 챔버(325)를 통해 음압 펌프(151)가 연결되도록 스위칭된다. 이를 통해, 추출 챔버(350)의 배출구(352) 측으로 인가되는 음압에 의해 이극성 챔버(324) 내의 이극성 용액이 챔버 선택 밸브(330)를 통해 추출 챔버(350)로 유동하고, 다공막(120)을 통과한 후 수집 챔버(325)로 수집된다.
상기 음압 펌프(151)은 예컨대 -5 내지 -25 mmHg, 또는 0.7 내지 3.3kPa 범위의 읍압을 적용할 수 있다.
추가적으로, 도 6에 도시된 바와 같이, 수집 챔버(325)의 외부에서 자력을 인가하여 이극성 용액을 용출 용액으로부터 물리적으로 분리시킨 후, 용출 용액을 회수하는 과정을 거침으로써, 용출 용액으로부터 타겟 물질의 추출이 가능하게 된다.
이하에서는, 도 15 내지 도 17를 참조하여 본 발명에 따른 타겟 물질(TS)을 추출하기 위한 유체 유동 칩(300)을 이용한 실험 결과에 대해 설명한다.
도 15는 기존의 원심 분리 방법(contrifugation), 이극성 용액(140)을 사용하지 않고 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)을 적용한 방법(w/o oil), 그리고 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)을 적용한 방법(with oil)을 통해 용출된 용출 용액(130)의 양을 나타낸 것으로, 추출 키트(110)에 주입된 전체 용출 용액(130)을 150 μL,100 μL 및 50 μL에 대해 각각 실험한 결과이다.
도 15에 도시된 바와 같이, 종래의 원심 분리 방법과 본 발명에 따른 추출 시스템(300)에 적용된 방법에서 추출된 용출 용액(130)의 양에 거의 차이가 없음을 확인할 수 있다. 또한, 이극성 용액(140)을 사용하지 않고 음압 만을 인가하는 경우와 비교할 때 현저한 차이가 나고 있음을 확인할 수 있으며, 이를 통해, 용출 용액(130)과 이극성 용액(140)의 사용에 따른 효과가 확인이 가능하게 된다.
도 16은 용출 용액(130)에서의 cfDNA의 농축량을 나타낸 도면으로, 원심 분리 방법(contrifugation)과, 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)을 적용한 방법(with oil)이 다양한 샘플에서 동일하게 나타나고 있음을 확인할 수 있다.
도 17은 본 발명에 따른 유체 유동 칩(300)에서 추출 키트(110)에 인가되는 음압에 따른 추출된 용출 용액(130)의 양을 나타낸 도면으로, -5에서 -25(mmHg)의 범위 내에서 큰 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있다.
도 18을 참조하여 설명하면, 실험에는 cfDNA standard 샘플을 사용하여 매우 적은 비율이 돌연변이 유전자 추출이 가능한지 여부를 실험하였다. 비교 실험을 위해 상용화된 원심분리방법인 QIA amp가 사용되었다. 그리고, 실험에 사용된 cfDNA standard 샘플은 Horizon 제품이 사용되었다. 샘플 용량은 500㎕이고, 총 4 개의 샘플 세트(0%, 0.1%, 1%, 5%)에서 PIK3CA E545K, EGFR L858R, KRAS G12D, NRAS Q61K의 ctDNA를 추출하는 실험이 진행되었다. 도 18에서 PIBEX가 본 발명에 따른 유체 유동 칩의 실험 결과이다.
도 18에 도시된 바와 같이, ctDNA 추출량이 기존의 원심 분리 방법이 적용된 QIA amp와 거의 동일함을 확인할 수 있으며, 돌연변이가 0.1%~6%의 매우 적은 비율임에도 불구하고 ctDNA 추출이 가능함을 확인하였다.
도 19는 본 발명에 따른 유체 유동 칩을 활용하여 실제 임상에서 환자의 혈액 분석을 통해 돌연변이 유전자를 모니터링하는 실험 결과를 나타낸 도면이다.
HER-2 타입의 유방암 환저의 혈장 500㎕를 활용하여 PIK3CA H1047R 돌연변이를 모니터링하였다.
간으로의 암 전이가 진행됨에 따라, 도 19의 (b)에 도시된 바와 같이, 혈액 속의 돌연변이 유전자가 증가되는 것을 확인할 수 있다. 간으로의 전이된 종양은 도 19의 (a)에 도시된 바와 같이 MRI 이미지를 통해 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 혈장 샘플의 준비
본 연구는 고려대학교 안암 병원의 기관생명윤리연구위원회 승인(IRB 프로젝트 No.: 2015-12-0016(ED15318) 및 혈액 샘플에 대한 모든 지원자의 동의서를 받은 후 진행하였다.
혈장 샘플로부터 cfDNA를 추출하기 위해, QIAamp circulating nucleic acid kit(55114; QIAGEN, Germany)를 사용하였다. 스핀 컬럼을 이용한 원심분리 기반 방법은 제조사의 권장 매뉴얼에 따라 수행하였다.
건강한 7명의 자원자로부터 혈액 샘플을 K2-EDTA 튜브에 수집하였다. 혈장을 1,900 g에서 10 분 동안 원심분리하고, 12,000g에서 15 분 동안 재원심분리하여 분리하였다. 50 mL 코니칼 튜브 내 5 mL의 혈장에 500 μL의 proteinase K 및 1.0 μg의 carrier RNA를 함유하는 4 mL의 lysate-buffer (ACL)를 첨가하였다. 30 초 동안 볼텍싱한 후, 혼합물을 60 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 9 mL의 바인딩 버퍼(ACB)를 첨가하였다. 30 초 동안 볼텍싱한 후, 총 부피 18.5 mL의 최종 혼합물을 얼음 위에서 5 분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 2. 본 발명에 따른 cfDNA 추출 장치 및 방법
6 챔버, 6-way 선택 밸브, 스핀 컬럼, 및 right angle 4-way 밸브, 수집 튜브, 폐기 챔버, 압력 게이지 및 진공 펌프로 구성된 시스템을 구축하였다. 샘플 챔버는 30 mL Luer-Lok 시린지 (302832; Becton Dickinson, USA)로 구성되고, 다른 챔버들은 1 mL Luer-Lok 시린지 (309628; Becton Dickinson, USA)로 구성되었다. 6-way 선택 밸브(V-241; UPCHURCH, USA)는 스핀 컬럼을 특정 챔버에 선택적으로 연결시킬 수 있다. QIAamp circulating nucleic acid kit(55114; QIAGEN, GERMANY)의 스핀 컬럼을 1.5-mL 마이크로튜브 reservoir(KRXS-V2; Elveflow, France)에 장착하고, 1/16-인치 직경의 peek tubing(1516 L; UPCHURCH, USA)으로 연결시켰다. 스핀 컬럼의 바닥을 thread adapter (D-646; UPCHURCH, USA)에 barbed swivel로 연결시켰다. 역류 방지를 위해 tubing connector(P-794; UPCHURCH, USA)로 연결된 체크 밸브(CV-3315; UPCHURCH, USA)를 추가했다. 시스템의 유동 경로를 스위칭하기 위해 right angle 4-way 밸브(V-101L; UPCHURCH, USA)를 수집 튜브 또는 폐기 챔버에 연결시켰다. 50 mL 팰콘 튜브(352070; Corning Inc., USA) 폐기 챔버 및 1.5 mL 마이크로튜브(MCT-150-C-S; AXYGEN, USA) 수집 튜브를 4-way valve에 각각 연결하였다. 폐기 챔버 및 수집 튜브 말달을 Y-barbed connector (P-863; UPCHURCH, USA)로 3/16-인치 튜브(LMT-55; SAINT-GOBAIN, France)와 연결시켰고, 이를 압력 게이지를 포함하는 진공 펌프(P704AC; GAST, USA)에 1/4-인치 튜브(KA22-50; INEXUS INC., South Korea)로 연결시켜 인가된 진공 압력을 모니터링하였다.
상술한 혈액 샘플 준비 과정에 따라 제조된 최종 혼합물을 상기 제작된 시스템에 적용하였다. 19.5 mL의 혼합물, 600 μL의 ACW1, 750 μL의 98% 에탄올, 150 μL의 용출 버퍼(AVE) 및 헤비 미네랄 오일(330760; Sigma-Aldrich, USA)을 각 챔버에 로딩하였다. DNA 바인딩에서 세척 단계까지의 각 단계를 3.3 kPa의 진공 압력 하에서 선택 밸브를 스위칭함으로써 제어하였다. 건조 단계에서, 선택 밸브를 마지막 세척 챔버와 연결되지 않도록 스위칭하였다. 추가적으로 상온의 공기 흐름을 3 분 동안 가하였다. 용출 단계에서, right angle 4-way 밸브를 실리카 멤브레인 상에서 용출 버퍼에 놓이도록 스위칭하면서, 선택 밸브를 용출 버퍼 챔버로 스위칭하였다. 용출 버퍼를 로딩한 후, 선택 밸브를 미네랄 오일 챔버로 스위칭하였다. 마지막으로, 미네랄 오일을 적층한 후, 4-way 밸브를 cfDNA 함유 수집 용출 버퍼로 스위칭하였다. 용출 버퍼가 수집 튜브에 충분히 수집되면, 진공 펌프를 끈 후 수집 튜브의 덮개를 열어 잔여 진공을 방출시켰다.
비록 본 발명의 몇몇 실시예들이 도시되고 설명되었지만, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 당업자라면 본 발명의 원칙이나 정신에서 벗어나지 않으면서 본 실시예를 변형할 수 있음을 알 수 있을 것이다. 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그 균등물에 의해 정해질 것이다.
100 : 추출 장치 110 : 추출 키트
111 : 유입구 112 : 배출구
120 : 다공막 130 : 용출 용액
140 : 이극성 용액 150 : 유동력 인가부
151 : 음압 펌프 152 : 압력 게이지
300 : 유체 유동 칩 310 : 칩 본체
311 : 하부 본체 312 : 상부 커버
321 : 샘플 챔버 322a,322b,322c : 세척 챔버
323 : 용출 챔버 324 : 이극성 챔버
325 : 수집 챔버 326 : 폐용액 챔버
330 : 챔버 선택 밸브 331 : 개스킷
332 : 챔버 스위칭 밸브 333 : 제1 고정 지그
340 : 배출 선택 밸브 342 : 배출 스위칭 밸브
343 : 제2 고정 지그 350 : 추출 챔버
351 : 유입구 352 : 배출구
360 : 음압 유입구 371 : 유동 채널

Claims (18)

  1. 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치에 있어서,
    추출 키트와,
    상기 추출 키트의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과,
    상기 추출 키트 내에서 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막으로부터 상기 타겟 물질을 용출하는 용출 용액과,
    상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않은 이극성 용액과,
    상기 다공막을 순차적으로 통과하는 상기 용출 용액 및 상기 이극성 용액이 적층된 상태로 수집되는 수집 챔버를 포함하고;
    상기 이극성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 용출 용액과의 상이한 극성에 의해 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 이극성 용액은 무극성 용액인 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 이극성 용액은 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 상기 다공막을 통과하기 위한 유동력을 상기 추출 키트에 인가하는 유동력 인가부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와,
    상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며;
    상기 유동력 인가부는 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압을 인가하거나 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압을 제공하는 압력 펌프를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  6. 추출 장치가 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법에 있어서,
    (a) 내부에 다공막이 설치된 추출 키트를 마련하는 단계와,
    (b) 상기 다공막에 상기 타겟 물질이 바인딩되는 단계와,
    (c) 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 타켓 물질을 용출하는 단계와,
    (d) 상기 용출 용액과 상이한 극성을 갖는 이극성 용액이 상기 다공막을 통과하면서 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내는 단계와,
    (e) 상기 다공막을 순차적으로 통과한 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 수집 챔버에 수집되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 (b) 단계는
    (b1) 상기 타겟 물질이 포함된 샘플이 상기 다공막을 통과하여 상기 타겟 물질이 상기 다공막에 바인딩되는 단계와;
    (b2) 상기 시료 키트 내에 세척 용액이 주입되는 단계와;
    (b3) 상기 세척 용액이 상기 다공막을 통과하여 상기 다공막이 세척되는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 이극성 용액은 무극성 용액인 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 장치.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 이극성 용액은 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 추출 키트는 상기 용출 용액과 상기 이극성 용액이 상기 추출 키트에 주입되는 유입구와, 상기 다공막을 통과한 상기 용출 용액이 배출되는 배출구를 포함하며;
    상기 용출 용액과 상기 이극성 용액을 유동시키기 위한 유동력은 상기 유입구를 통해 상기 추출 키트 내부로 양압으로 인가되거나, 상기 배출구를 통해 상기 추출 키트 내부로 음압으로 인가되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 추출 방법.
  11. 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩에 있어서,
    칩 본체와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질이 포함된 샘플 용액이 저장되는 샘플 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 타겟 물질의 용출을 위한 용출 용액이 저장되는 용출 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되어 상기 용출 용액과 상이한 극성을 가져 상기 용출 용액과 섞이지 않는 이극성 용액이 저장된 이극성 챔버와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되는 추출 챔버와,
    상기 추출 챔버의 내부에 설치되어 상기 타겟 물질이 바인딩되는 다공막과,
    상기 칩 본체에 설치되어, 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버 중 어느 하나를 상기 추출 챔버의 유입구와 선택적으로 연결하는 챔버 선택 밸브와,
    상기 칩 본체 내부에 형성되고, 상기 추출 챔버의 배출구와 연결되는 수집 챔버를 포함하고;
    상기 챔버 선택 밸브가 상기 추출 챔버를 상기 용출 용기와 상기 이극성 용기에 순차적으로 연결시켜 외부로부터의 유동력에 의해 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버 내의 상기 용출 용액 및 상기 이극성 용액이 유동하여 상기 추출 챔버의 상기 유입구를 통해 상기 다공막을 유입되어 상기 다공막을 순차적으로 통과하고, 상기 이극성 용액이 상기 다공막을 통과할 때 상기 다공막에 잔존하는 상기 용출 용액을 밀어내어 상기 배출구를 통해 상기 수집 챔버로 수집되는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 칩 본체는
    상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버, 상기 이극성 챔버, 상기 추출 챔버 및 상기 수집 챔버가 형성되는 하부 본체와,
    상기 하부 본체의 상부에 결합되는 상부 커버를 포함하고;
    상기 하부 본체에는 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버를 상기 추출 챔버의 유입구와 연결하기 위한 유동 채널이 형성되고;
    상기 유동 채널의 말단과 상기 추출 챔버의 상기 유입구는 상기 칩 본체의 상부로 개방되고, 상기 상부 커버를 통해 하부 본체에 결합되는 상기 챔버 선택 밸브가 상기 샘플 챔버, 상기 용출 챔버 및 상기 이극성 챔버에 각각 연결된 상기 유동 채널의 말단 중 어느 하나를 선택적으로 상기 추출 챔버의 상기 유입구와 연결시키는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 하부 본체에 형성되어 세척 용액이 수용되는 적어도 하나의 세척 챔버와,
    상기 하부 본체에 형성되어 상기 추출 챔버를 통과한 상기 샘플 용액과 상기 세척 용액을 저장하는 폐용액 챔버와,
    상기 상부 커버를 통해 상기 하부 본체에 결합되고, 상기 추출 챔버의 상기 배출구를 상기 수집 챔버와 상기 폐용액 챔버 중 어느 하나와 선택적으로 연결하는 배출 선택 밸브를 더 포함하며;
    상기 세척 챔버 내의 상기 세척 용액은 상기 샘플 용액의 상기 추출 챔버를 통과하면서 상기 샘플 용액 내의 상기 타겟 물질이 상기 다공막에 바인딩된 후 상기 다공막을 세척하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 칩 본체는 상기 수집 챔버 및 상기 폐용액 챔버와 연결되고, 유체의 유동을 위한 외부로부터의 음압이 유입되는 음압 유입구를 더 포함하며;
    상기 음압 유입구는 상기 배출 선택 밸브의 선택에 따라 상기 수집 챔버 또는 폐용액 챔버를 통해 상기 수집 챔버의 상기 배출구로 유동을 위한 음압을 인가하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  15. 제11항에 있어서,
    상기 용출 용액은 극성 용액이고, 상기 이극성 용액은 무극성 용액인 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 용출 용액은 극성의 증류수 또는 핵산 추출용 용출 버퍼를 포함하고, 상기 이극성 용액은 무극성의 미네랄 오일 또는 실리콘 오일을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 타겟 물질이 핵산인 경우, 상기 다공막은 실리카 막, 이온 교환수지, 실리카 메쉬, 실리카 비드가 패킹된 패킹 튜브, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함하며;
    상기 타겟 물질이 CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 경우, 상기 다공막은 이온 교환수지, 상기 타겟 물질과 특이적 결합이 가능한 작용기가 표면에 형성된 막 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 타겟 물질은 DNA 및 RNA를 포함하는 핵산, CTC(Circulating Tumor Cell)를 포함하는 세포, 엑소좀(Exosome)를 포함하는 세포외 소포체(Extracellular vesicles), 단백질 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 물질을 추출하기 위한 유체 유동 칩.
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100601974B1 (ko) * 2004-11-25 2006-07-18 삼성전자주식회사 비드의 상이한 레이저 흡수에 의한 핵산의 정제 장치 및방법
JP2012100657A (ja) * 2004-12-23 2012-05-31 I-Stat Corp 分子診断システム及び方法
KR101755925B1 (ko) * 2015-12-09 2017-07-07 현대자동차주식회사 자기유변유체 조성물
KR20180125814A (ko) * 2017-05-16 2018-11-26 에스케이텔레콤 주식회사 핵산 추출용 전처리 챔버, 그를 이용한 카트리지 및 핵산 추출 방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102071186A (zh) * 2009-11-19 2011-05-25 北京金麦格生物技术有限公司 一种从生物样品中快速分离病毒核酸的试剂盒及方法
KR101495631B1 (ko) 2012-03-30 2015-02-26 (주)어핀텍 원심분리 키트 및 이를 이용한 원심분리 방법
TW201412981A (zh) * 2012-09-28 2014-04-01 Accubiomed Co Ltd 氣壓式萃取核酸之方法及其裝置
WO2015157650A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Wako Pure Chemical Industries, Ltd Nucleic acid purification method
CN108841818B (zh) * 2018-03-13 2022-09-06 融智生物科技（青岛）有限公司 一种核酸提取方法及装置
CN108823061A (zh) * 2018-05-31 2018-11-16 西安交通大学 一种基于不混溶相界面张力的三腔室核酸提取装置及方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100601974B1 (ko) * 2004-11-25 2006-07-18 삼성전자주식회사 비드의 상이한 레이저 흡수에 의한 핵산의 정제 장치 및방법
JP2012100657A (ja) * 2004-12-23 2012-05-31 I-Stat Corp 分子診断システム及び方法
KR101755925B1 (ko) * 2015-12-09 2017-07-07 현대자동차주식회사 자기유변유체 조성물
KR20180125814A (ko) * 2017-05-16 2018-11-26 에스케이텔레콤 주식회사 핵산 추출용 전처리 챔버, 그를 이용한 카트리지 및 핵산 추출 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LEE, HOYOON 등, "Centrifugation-free extraction of circulating nucleic acids using immiscible liquid under vacuum pressure", Scientific Reports, 2018.04.03.(온라인 발행일), 8권, Article number 5467* *

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