ES2909766T3 - Células para producir anticuerpos humanos - Google Patents
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Abstract
Una célula B de pollo, en la que el locus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo se reemplaza por las secuencias de ADN de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y por las secuencias de ADN de una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, y en la que en el locus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo se insertan las secuencias de ADN de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y de una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, y en la que el locus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo se reemplaza por 25 o más secuencias de ADN de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano, y en la que en el locus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo se insertan 30 o más secuencias de ADN de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, en la que la célula B de pollo tiene la capacidad de expresar un anticuerpo humano en la superficie celular y también de secretar el anticuerpo humano en la disolución de cultivo.
Description
d e s c r ip c ió n
Células para producir anticuerpos humanos
Campo técnico
Se da a conocer una célula que produce un anticuerpo humano. M ás específicamente, se describe una célula B de pollo que produce un anticuerpo humano.
Antecedentes de la técnica
Un anticuerpo es útil para realizar la identificación de sustancias biológicas, el análisis de la función de las mismas, y similares, y también desempeña un papel importante en el tratamiento de enfermedades. Tal anticuerpo se une a un antígeno específico en un cuerpo vivo y provoca diversas reacciones inmunitarias protectoras in vivo, tales como citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), de modo que el anticuerpo reconoce una “sustancia extraña” a un cuerpo vivo y la elimina. Al prestar atención a la capacidad de tal anticuerpo, en los últimos años, se han desarrollado vigorosamente fármacos de anticuerpos. Con el fin de tratar una amplia variedad de enfermedades, es necesario suministrar de forma rápida y sencilla anticuerpos que reconocen diversos antígenos diana.
Hasta la fecha, como medio para preparar un grupo de anticuerpos que comprende características físicas y fisiológicas deseadas, se ha usado una técnica para producir un anticuerpo monoclonal. En un caso en el que se produce tal anticuerpo monoclonal, generalmente se ha aplicado un método de hibridoma que comprende fusionar células B generadas como resultado de inmunidad in vivo con mielomas. Sin embargo, este método tiene muchos problemas porque, por ejemplo, se produce tolerancia inmunológica debido al uso de inmunidad in vivo, y se necesita tiempo y esfuerzo para obtener finalmente un anticuerpo deseado.
Como técnica para superar el problema con respecto a la tolerancia inmunológica, se ha desarrollado un método que no utiliza inmunidad in vivo. Este método comprende incrustar un gen de fragmento variable de cadena sencilla (scFv ) que consiste en las regiones variables de diversos anticuerpos en una partícula de fago, luego permitir que el fago presente un producto génico de anticuerpo de cadena sencilla en la superficie del mismo, y luego obtener un clon que tiene una afinidad por un antígeno de interés de una biblioteca de anticuerpos de cadena sencilla presentada por este fago. Este método se denomina método de presentación en fagos. Esta técnica es excelente en cuanto a evitar la tolerancia inmunológica. Sin embargo, dado que el clon obtenido de la biblioteca de fagos es un clon de cadena sencilla, es necesario preparar un anticuerpo completo que consiste en dos cadenas de acuerdo con una técnica de ADN recombinante o similar. Además, puede generarse un cambio en la afinidad durante el proceso de convertir un anticuerpo de cadena sencilla en un anticuerpo completo, y, por tanto, puede haber un número considerable de casos en los que se necesita ajustar una secuencia de región variable. En consecuencia, en cuanto a tiempo y esfuerzo, no puede decirse que el método de presentación en fagos haya mejorado significativamente en comparación con el método que implica inmunidad in vivo.
Como métodos para superar el problema con respecto al método existente mencionado anteriormente para producir un anticuerpo monoclonal, se ha notificado un sistema ADLib (documento de patente 1 y documento no de patente 1) y un método para modificar adicionalmente tal sistema ADLib (documento de patente 2). El sistema ADLib es una técnica capaz de preparar de manera sencilla una variedad de anticuerpos con propiedades de unión deseadas a todos los tipos de antígenos. Este método es una técnica para obtener selectivamente un anticuerpo deseado a partir de una biblioteca de anticuerpos construida a partir de una línea celular derivada de células B de pollo DT40, en el que los genes de anticuerpos se han diversificado de manera autónoma. El sistema ADLib es superior a las técnicas anteriores, porque permite evitar la tolerancia inmunológica, lo que es una ventaja de una técnica de producción de anticuerpos de sistema in vitro, y porque puede obtenerse rápidamente un anticuerpo IgM completo.
En general, en un caso en el que se administra un anticuerpo como un producto farmacéutico a un animal o un ser humano, se requiere que el anticuerpo sea compatible con el tipo de la especie animal, al tiempo que se considera la minimización de la inmunogenicidad in vivo. Por tanto, utilizando una técnica de recombinación de ADN, se ha producido un anticuerpo quimérico reemplazando la región constante de un anticuerpo monoclonal producido en ratones o similares por una región constante humanizada, y también se ha producido un anticuerpo humanizado trasplantando la región determinante de complementariedad (CDR) del anticuerpo en un anticuerpo humano. Sin embargo, puede haber un caso en el que se produzca un cambio en la afinidad o función en el proceso de tal quimerización o humanización, por tanto, no puede decirse que la probabilidad de producir un anticuerpo humanizado que retenga las funciones originales sea alta. Además, tal anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado solo tiene una pequeña región derivada de otras especies animales, por tanto, su región determinante de complementariedad tiene inmunogenicidad, aunque su inmunogenicidad es menor que la del anticuerpo monoclonal original. Por tanto, tal anticuerpo quimérico o anticuerpo humanizado ha sido problemático en cuanto a la aparición de anti-anticuerpos.
Por tanto, se ha intentado producir un animal que genere un anticuerpo humano mediante la introducción de un gen de anticuerpo humano en un ratón. En el documento de patente 3, se ha trasplantado una microcélula de un fragmento
cromosómico que comprende un gen de anticuerpo humano en células ES de ratón, y luego, se ha producido un ratón quimérico a partir de las células ES, produciendo de ese modo un ratón quimérico que expresa un anticuerpo humano. Además, en el documento no de patente 2, se ha reemplazado ADN genómico en un Iocus génico de anticuerpo de ratón por el ADN genómico correspondiente en un Iocus génico de anticuerpo humano, para producir un ratón quimérico que expresa un anticuerpo humano. Por ambos métodos, es posible obtener un anticuerpo que tiene regiones determinantes de complementariedad que se derivan completamente de genes de anticuerpos humanos. Sin embargo, ya que se utiliza inmunidad in vivo en ambos métodos, permanecen todavía Ios problemas con respecto al tiempo y esfuerzo requeridos hasta que finalmente se obtiene un anticuerpo deseado.
En las circunstancias mencionadas anteriormente, incluso en el caso de usar el sistema ADLib, es necesario un método para producir un anticuerpo que tenga una secuencia de aminoácidos derivada de un ser humano a partir de células B de pollo para preparar un fármaco de anticuerpo. Además, con el fin de tratar diversas enfermedades, es necesaria una técnica de producción de manera sencilla de un grupo de anticuerpos que tengan diversas propiedades de reconocimiento de antígenos.
No obstante, a diferencia de un caso en el que se introduce un gen de anticuerpo humano en un ratón para “humanizarlo”, en un caso en el que se “humanizan” células B de pollo, una diferencia en el sistema de diversificación de un anticuerpo se vuelve problemática. En el caso de animales tales como un pollo, un conejo, un bovino o una oveja, hay una región en la que se agrupan Ios “pseudogenes”, en el sentido de 5' de una región variable de anticuerpo. La secuencia de Ios pseudogenes respectivos es similar a la de la región variable del anticuerpo y no se traduce por sí misma. Todas o parte de las secuencias de región variable se reescriben mediante secuencias de pseudogén por un fenómeno denominado conversión génica, de modo que se genera una variedad de secuencias. La diversificación de anticuerpos se produce como resultado de la recombinación V(D)J en animales tales como un ser humano o un ratón. Por el contrario, en animales tales como un pollo, un conejo, un bovino o una oveja, tal diversificación de anticuerpos se produce mediante un mecanismo denominado conversión génica que es completamente diferente de la recombinación. Además, dado que la región de pseudogén tiene una estructura que comprende un número extremadamente grande de secuencias repetitivas, es significativamente difícil analizar la secuencia de esta región. Por tanto, incluso a fecha de marzo de 2015, aún no se ha analizado la región de pseudogén de una cadena pesada de anticuerpo de pollo. Debido a tal diferencia en Ios mecanismos o un problema con respecto a la estructura de un Iocus génico de anticuerpo, se ha considerado extremadamente difícil construir un sistema para producir un anticuerpo humano deseado a partir de células B de pollo.
En tales circunstancias, se ha notificado que se produjo una línea celular reemplazando una región variable y una región de pseudogén presentes en el Iocus génico de anticuerpo de células DT40 por secuencias derivadas de seres humanos (documento de patente 3). En esta publicación, se ha reemplazado una región variable de anticuerpo de pollo por una secuencia génica que comprende proteínas fluorescentes, concretamente, una proteína verde fluorescente (GFP) y una proteína cian fluorescente (CFP), y una secuencia attP como sitio de reconocimiento de recombinasa, y entonces se ha producido una célula DT40, en la que se había insertado una región variable de anticuerpo humano y la secuencia de pseudogén mencionada después utilizando la recombinasa, y posteriormente, se ha confirmado la aparición de conversión génica (documentos no de patente 3 y 4). Sin embargo, ya que se ha usado una secuencia de región constante derivada de pollo, la molécula de anticuerpo expresada es un anticuerpo quimérico de ser humano-pollo y, por tanto, la inmunogenicidad del anticuerpo es extremadamente alta. Además, dado que la cadena ligera es una proteína de fusión de una cadena k derivada de ser humano y una cadena X derivada de pollo, la molécula de anticuerpo es en gran medida diferente de un anticuerpo humano nativo. Por tanto, con el fin de producir un anticuerpo usado para el tratamiento de seres humanos, es necesario llevar a cabo adicionalmente una operación de quimerización, y todavía es probable que la afinidad o las funciones cambien en el proceso de quimerización o humanización. Además, con respecto a la secuencia de la región de pseudogén usada en el presente documento, en el caso de una cadena ligera, se han utilizado una biblioteca minimalista que es una agrupación de secuencias artificiales, en la que un aminoácido en cada una de las secuencias de CDR de la región variable de anticuerpo humano insertada se ha sustituido con Tyr o Trp, y las secuencias en las que se han introducido mutaciones en la región marco de una variante de una región variable de anticuerpo humano existente de manera natural. Por otro lado, una cadena pesada de la misma está compuesta por una secuencia artificial en la que cada una de las secuencias de CDR de la región variable de anticuerpo humano insertada se ha sustituido con Tyr o Trp, y secuencias mutantes de las mismas. Estas secuencias se han diseñado con el fin de permitir que un pequeño número de pseudogenes correspondan a una variedad de antígenos. No se ha notificado un método para obtener un anticuerpo específico de antígeno en las células.
Lista de menciones
Documentos de patente
Documento de patente 1: Patente japonesa n.04214234
Documento de patente 2: WO 2008/047480
Documento de patente 3: WO 97/07671
Documentos no de patente
Documento no de patente 1: Seo et al., Nature Biotech, volumen 23, págs. 731-735, 2005
Documento no de patente 2: Recombinant Antibodies for Immunotherapy, págs. 100-108, 2009, Cambridge Press
Documento no de patente 3: Schusser et al., PLOS ONE, volumen 8 tema 11 e80108, 2013
Documento no de patente 4: Leighton et al., Frontiers in Immunology, volumen 6 artículo 126, 2015
Sumario
Problema técnico
En las circunstancias mencionadas anteriormente, un objeto es proporcionar células B de pollo, cada una de las cuales produce cada uno de diversos anticuerpos humanos.
Otro objeto es proporcionar un método para producir anticuerpos a partir de las células B de pollo.
Solución al problema
Los presentes inventores han realizado estudios intensivos con respecto a la producción de células que producen una variedad de anticuerpos humanos. Como resultado, los inventores han insertado o reemplazado los genes en la región variable y la región constante de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo humano en los loci génicos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo de células B de pollo, de modo que han tenido éxito en la obtención de células transformadas que expresan cada una un anticuerpo humano. Además, los presentes inventores han producido además células transformadas, en las que se ha insertado una pluralidad de secuencias de región variable de anticuerpo derivadas de ser humano como pseudogenes en la cadena ligera y la cadena pesada, y posteriormente, los inventores han tratado estas células con un inhibidor de HDAC, de modo que han confirmado que se ha producido conversión génica en las células transformadas, como en el caso de las células B de pollo originales. Además, los presentes inventores también han tenido éxito en la producción de un anticuerpo humano específico de antígeno a partir de las células transformadas.
Es decir, los presentes inventores han confirmado que se preparan las células mencionadas anteriormente, y a partir de cada una de las células preparadas, puede obtenerse un anticuerpo en el que la región variable se ha modificado de varias maneras, y luego han tenido éxito en la producción de una variedad de anticuerpos humanos.
La invención se refiere a las realizaciones definidas en las reivindicaciones. En particular, la invención se refiere a una célula B de pollo, en la que el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo se reemplaza por las secuencias de ADN de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y por las secuencias de A d N de una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano,
y en la que en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo se insertan las secuencias de ADN de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y de una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, y en la que el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo se reemplaza por 25 o más secuencias de ADN de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano, y en la que en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo se insertan 30 o más secuencias de ADN de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, en la que la célula B de pollo tiene la capacidad de expresar un anticuerpo humano en la superficie celular y también de secretar el anticuerpo humano en la disolución de cultivo.
Además, la invención se refiere a una biblioteca de células productoras de anticuerpos que consiste en células B de pollo de la invención. Además, la invención se refiere a un método para producir un anticuerpo humano a partir de la célula B de pollo de la invención, que comprende cultivar dicha célula B de pollo en condiciones de cultivo adecuadas para que la célula produzca un anticuerpo humano y obtener dicho anticuerpo.
Efectos ventajosos
Se hace posible obtener de manera sencilla y rápida anticuerpos humanos que reconocen una variedad de antígenos a partir de las células dadas a conocer en el presente documento.
Breve descripción de los dibujos
[Figura 1] La figura 1 es una vista que muestra esquemáticamente la estructura de un vector de direccionamiento para reemplazar la región constante de cadena ligera de anticuerpo y la región variable de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por la región constante de cadena ligera y la región variable de cadena ligera de un anticuerpo
derivado de ser humano (IgG). cpVI a cpV3: pseudogenes de pollo.
[Figura 2] La figura 2 es una vista que muestra esquemáticamente la estructura de un vector de direccionamiento para insertar una secuencia para confirmar la conversión génica (secuencia de confirmación de GC; un pseudogén humano que consiste en una secuencia derivada de una región variable de anticuerpo humano, lo mismo aplicado a continuación) en el sentido de 3' de la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40. cpVI a cpV3: pseudogenes de pollo.
[Figura 3] La figura 3 es una vista que muestra esquemáticamente la estructura de un vector de direccionamiento para delecionar la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40, y reemplazar la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de la célula DT40 por una secuencia de confirmación de GC. cpV25, cpVI: pseudogenes de pollo.
[Figura 4] La figura 4 es una vista que muestra esquemáticamente la estructura de un vector de direccionamiento para reemplazar la región constante de cadena pesada de anticuerpo y la región variable de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 por la región constante de cadena pesada y la región variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano (IgG) y también para insertar una secuencia de confirmación de GC en la misma.
[Figura 5] La figura 5 es una vista que muestra esquemáticamente los procedimientos para reemplazar las regiones génicas de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera de un anticuerpo derivado de ser humano, y la región génica de cadena ligera de anticuerpo así obtenida de la célula DT40. cpVI a cpV3: pseudogenes de pollo.
[Figura 6] La figura 6 es una vista que muestra esquemáticamente los procedimientos para reemplazar las regiones génicas de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por los genes de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera de anticuerpo derivado de ser humano, e insertar además una secuencia de confirmación de GC en el sentido de 3' de la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de la célula DT40, y la región génica de cadena ligera de anticuerpo de célula DT40 obtenida. cpVI a cpV3: pseudogenes de pollo; y hpVl y hpV2: pseudogenes humanos.
[Figura 7] La figura 7 es una vista que muestra esquemáticamente los procedimientos para reemplazar las regiones génicas de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por los genes de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera de anticuerpo derivado de ser humano, y delecionar adicionalmente la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de la célula DT40, y la región génica de cadena ligera de anticuerpo así obtenida de la célula DT40. cpV25 y cpVI: pseudogenes de pollo.
[Figura 8] La figura 8 es una vista que muestra esquemáticamente los procedimientos para reemplazar las regiones génicas de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por los genes de región variable de cadena ligera y región constante de cadena ligera de anticuerpo derivado de ser humano, y reemplazar adicionalmente la región de pseudogén de la célula DT40 por una secuencia de confirmación de GC, y la región génica de cadena ligera de anticuerpo de la célula DT40 obtenida. cpV25 y cpVI: pseudogenes de pollo; y hpVl y hpV2: pseudogenes humanos.
[Figura 9] La figura 9 muestra los resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular en la que se ha insertado una región génica de cadena ligera de anticuerpo derivado de ser humano en la región génica de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40, o una línea celular en la que la región génica de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 se ha reemplazado por un gen de cadena ligera de anticuerpo humano.
[Figura 10] La figura 10 es una vista que muestra esquemáticamente los procedimientos para convertir las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 en la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano, y la región génica de cadena pesada de anticuerpo así obtenida de la célula DT40.
[Figura 11] La figura 11 es una vista que muestra esquemáticamente los procedimientos para convertir las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 en el gen de región variable de cadena pesada y región constante de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano, e insertar además una secuencia de confirmación de GC en el sentido de 3' de la región de pseudogén de cadena pesada de la célula DT40, la región génica de cadena ligera de anticuerpo así obtenida de la célula DT40, y la estructura del vector de direccionamiento usado. hpVl y hpV2: pseudogenes humanos.
[Figura 12] La figura 12 muestra los resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular, en el que las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT4o se han reemplazado por genes de región variable de cadena pesada y región constante de cadena pesada de anticuerpo derivado de ser humano, y además, se ha insertado una secuencia de confirmación de GC en el sentido de 3' de la región de pseudogén de cadena pesada de la célula DT40.
[Figura 13] La figura 13 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para reemplazar la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por un pseudogén que consiste en una secuencia derivada de una región variable de Igy humana (pseudogén de cadena ligera humana), la región de cadena ligera de anticuerpo así obtenida de la célula DT40, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 14] La figura 14 es una vista que muestra esquemáticamente la estructura de un vector de direccionamiento para reemplazar la región constante de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 por la región génica de cadena pesada de IgGi humana.
[Figura 15] La figura 15 es una vista que muestra esquemáticamente la estructura de un vector de direccionamiento para introducir la región variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano y cinco pseudogenes que consisten en secuencias derivadas de región variable de Igy humana (pseudogenes de cadena pesada humana) en la región variable de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40.
[Figura 16] La figura 16 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para reemplazar las regiones génicas de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera de un anticuerpo derivado de ser humano, y luego insertar secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana (cinco secuencias) en el mismo, y la región génica de cadena ligera de anticuerpo así obtenida de la célula DT40. cpV25 y cpVI: pseudogenes de pollo.
[Figura 17] La figura 17 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para introducir la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano en las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40, y luego insertar secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana (cinco secuencias) en el mismo, y la región génica de cadena pesada de anticuerpo así obtenida de la célula DT40.
[Figura 18] La figura 18 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular, en el que la región génica de cadena ligera de anticuerpo y la región génica de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 se han reemplazado por genes de anticuerpos derivados de ser humano, y las secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana (cinco secuencias) se han insertado en Ios mismos.
[Figura 19] La figura 19 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para reemplazar las regiones génicas de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40 por la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera de un anticuerpo derivado de ser humano, y luego insertar secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana (15 secuencias) en el mismo, y la estructura del vector de direccionamiento usado. pV25 y pVI: pseudogenes de pollo.
[Figura 20] La figura 20 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para introducir la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano en las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40, y después insertar secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana (15 secuencias) en el mismo, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 21] La figura 21 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por un anticuerpo producido por una línea celular L15/H15, en el que la región génica de cadena ligera de anticuerpo y la región génica de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 se han reemplazado por las regiones génicas de un anticuerpo derivado de ser humano, y luego se han insertado secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana (15 secuencias) en el mismo.
[Figura 22] La figura 22 muestra Ios resultados mostrados en la figura 21, en la que Ios datos incorrectos se han corregido basándose en Ios datos antes de la fecha de prioridad.
[Figura 23] La figura 23 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para reemplazar la región variable de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 por la región variable de cadena pesada de un anticuerpo derivado de ser humano, y al mismo tiempo, insertar una secuencia de casete para RMCE en la región variable de cadena pesada de anticuerpo de la célula DT40, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 24] La figura 24 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para insertar 30 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la región génica de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 25] La figura 25 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular L15/H30, en el que la región génica de cadena ligera de anticuerpo y la región génica de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 se han reemplazado por las regiones génicas de un anticuerpo derivado de ser humano, y posteriormente, se han insertado 15 secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana en la cadena ligera y se han insertado 30 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la cadena pesada.
[Figura 26] La figura 26 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para insertar 30 secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana en la región génica de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 27] La figura 27 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular L30/H30, en el que la región génica de cadena ligera de anticuerpo y la región génica de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 se han reemplazado por las regiones génicas de un anticuerpo derivado de ser humano, y posteriormente, se han insertado 30 secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana en la cadena ligera y se han insertado 30 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la cadena pesada.
[Figura 28] La figura 28 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular L30/H15, en el que la región génica de cadena ligera de anticuerpo y la región génica de cadena pesada de anticuerpo de una célula DT40 se han reemplazado por las regiones génicas de un anticuerpo derivado de ser humano, y posteriormente, se han insertado 30 secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana en la cadena ligera y se han insertado 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la cadena pesada.
[Figura 29] La figura 29 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para insertar adicionalmente 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la región génica de cadena pesada de anticuerpo de la línea celular L30/H15 en la dirección directa o inversa de acuerdo con un método RMCE, para tener 30 secuencias de pseudogenes humanos en total, y la estructura del vector de direccionamiento usado. En la figura, Ios símbolos “dir” e “inv” indican la dirección directa e inversa, respectivamente. Lo mismo se aplica a otras figuras a continuación.
[Figura 30] La figura 30 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular, en el que se han insertado adicionalmente 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la línea celular L30/H15 en la dirección directa o inversa de acuerdo con el método RMCE (que es una línea celular L30/H15f15f en el caso de la dirección directa, y una línea celular L30/H15r15f en el caso de la dirección inversa).
[Figura 31] La figura 31 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para insertar adicionalmente 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en cada una de las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de la línea celular L30/H15f15f y la línea celular L30/H15r15f en la dirección directa o inversa, para tener 45 secuencias de pseudogenes humanos en total, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 32] La figura 32 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular (línea celular L30/H15f15f15f), en el que se han insertado adicionalmente 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la región génica de cadena pesada de anticuerpo de la línea celular L30/H15f15f en la dirección directa.
[Figura 33] La figura 33 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular (línea celular L30/H15r15r15f), en el que se han insertado adicionalmente 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la región génica de cadena pesada de anticuerpo de la línea celular L30/H15r15f en la dirección inversa.
[Figura 34] La figura 34 es una vista que muestra esquemáticamente Ios procedimientos para insertar adicionalmente 15 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en cada una de las regiones génicas de cadena pesada de anticuerpo de la línea celular L30/H15f15f y la línea celular L30/H15r15r15f en la dirección directa o inversa de acuerdo con el método RMCE, para tener 60 secuencias de pseudogenes humanos en total, y la estructura del vector de direccionamiento usado.
[Figura 35] La figura 35 muestra Ios resultados obtenidos analizando por citometría de flujo un anticuerpo producido por una línea celular, en el que se han insertado 30 secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana en la región génica de cadena ligera de anticuerpo de una célula DT40, y se han insertado 60 secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana en la región génica de cadena pesada de anticuerpo del mismo.
[Figura 36] La figura 36 muestra Ios resultados obtenidos separando una población celular que se une a una proteína plexina A4 de una línea celular L15/H15 tratada con TSA usando un sistema ADLib, y luego analizando la población celular mediante citometría de flujo.
[Figura 37] La figura 37 muestra Ios resultados obtenidos realizando clasificación de células individuales sobre una población de células en el área P5 de la figura 36, sembrando las células obtenidas sobre una placa de 96 pocilios para cultivarlas y llevando a cabo análisis ELISA sobre el sobrenadante celular en cada pocilio. El eje horizontal indica el número de cada fracción de pocilio de la placa de 96 pocilios, de la que se deriva el sobrenadante celular usado como muestra de medición. Inhibidor de tripsina: inhibidor de tripsina; SA: estreptavidina; OA: ovoalbúmina. y
[Figura 38] La figura 38 muestra Ios resultados obtenidos analizando anticuerpos secretados de Ios clones positivos n.0 62 y n.020 de acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western. Las muestras se trataron en condiciones de
reducción y sin reducción, y luego se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western sobre las muestras, usando un anticuerpo de cabra anti-lgGy humana.
[Figura 39] La figura 39 muestra los resultados obtenidos analizando anticuerpos secretados de los clones positivos n.0 62 y n.020 de acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western. Las muestras se trataron en condiciones de reducción y sin reducción, y luego se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western sobre las muestras, usando un anticuerpo de cabra anti-lgGy humana.
[Figura 40] La figura 40 muestra los resultados obtenidos analizando anticuerpos secretados de los clones positivos n.o 62 y n.o 20 de acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western. Las muestras se trataron en condiciones de reducción y sin reducción, y luego se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western sobre las muestras, usando un anticuerpo de cabra anti-lgM de pollo.
[Figura 41] La figura 41 muestra los resultados de un cribado primario de una población celular que se une a H ís-AP-hSema3A de la línea celular L15/H15 tratada con TSA, que se ha llevado a cabo usando un sistema ADLib.
[Figura 42] La figura 42 muestra los resultados de un cribado secundario, que se ha llevado a cabo después de la monoclonación de la población celular que se une a His-AP-hSema3A.
[Figura 43] La figura 43 muestra los resultados obtenidos analizando mediante inmunotransferencia de tipo Western un anticuerpo frente a His-AP-hSema3A secretado de los clones positivos después de la finalización del cribado secundario. Las muestras se trataron en condiciones de reducción y sin reducción, y luego se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western sobre las muestras, usando un anticuerpo de cabra anti-lgGy humana o un anticuerpo de cabra anti-lgGX humana.
[Figura 44] La figura 44 muestra los resultados de un cribado primario de una población celular que se une a lL-8 de una línea celular L30/H45 tratada con TSA, que se ha llevado a cabo usando un sistema ADLib.
[Figura 45] La figura 45 muestra los resultados de un cribado secundario, que se ha llevado a cabo después de la monoclonación de la población celular que se une a lL-8.
[Figura 46] La figura 46 muestra los resultados obtenidos analizando mediante inmunotransferencia de tipo Western un anticuerpo frente a lL-8 secretado de los clones positivos después de la finalización del cribado secundario. Las muestras se trataron en condiciones de reducción y sin reducción, y luego se llevó a cabo inmunotransferencia de tipo Western sobre las muestras, usando un anticuerpo de cabra anti-lgGy humana o un anticuerpo de cabra anti-lgGX humana.
Descripción
Se describe una célula B de pollo, en la que, en un Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de la misma, se insertan la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, o el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo se reemplaza por la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, y en un Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo del mismo, se insertan la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, o el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo se reemplaza por la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, y en un Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo del mismo, se insertan dos o más secuencias de ADN derivadas de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano, o el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo se reemplaza por dos o más secuencias de a D n derivadas de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano, y/o en un Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo del mismo, se insertan dos o más secuencias de ADN derivadas de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, o el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo se reemplaza por dos o más secuencias de ADN derivadas de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano.
La célula B puede ser una célula B productora de anticuerpos derivada de un pollo, y un ejemplo de la célula B puede ser una célula DT 40 de un pollo. Aparte de tales células DT40, pueden usarse también células B de un bovino, oveja, un conejo y similares, que tienen un sistema para diversificar secuencias de anticuerpos de acuerdo con conversión génica.
Además, aparte de la configuración mencionada anteriormente de modo que, en un Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo del mismo, se insertan la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, o el Iocus génico de la cadena ligera del anticuerpo se reemplaza por la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y una región constante de cadena ligera de anticuerpo
humano, y en un Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo del mismo, se inserta la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, o el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo se reemplaza por la totalidad o una parte de una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, y en un Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo del mismo, se insertan dos o más secuencias de ADN derivadas de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano, o el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo se reemplaza por dos o más secuencias de a Dn derivadas de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano, y/o en un Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo del mismo, se insertan dos o más secuencias de ADN derivadas de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, o el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo se reemplaza por dos o más secuencias de ADN derivadas de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, la célula B de pollo descrita en el presente documento también puede comprender mutaciones o modificaciones en otras regiones génicas y similares.
El término “ Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo” se usa en el presente documento para referirse a un Iocus génico en el que está presente un gen que codifica la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena ligera de un anticuerpo, y el término “ Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo” es un Iocus génico en el que está presente un gen que codifica la región variable de cadena pesada y la región constante de cadena pesada de un anticuerpo.
Además, el término “pseudogén” se usa en el presente documento para referirse a una secuencia de ADN que es similar a un gen funcional pero no funciona como gen de expresión. El Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo y el Iocus de pseudogén de cadena pesada de pollo están ubicados cada uno en el sentido de 5' del Iocus génico de cadena ligera y el Iocus génico de cadena pesada del anticuerpo, en el que está presente el gen funcional, y contribuyen a generar la diversidad como resultado de conversión génica. Un pseudogén no está presente en un Iocus génico de anticuerpo en el genoma humano, pero en la presente descripción, una secuencia de ADN que tiene una secuencia similar a una región variable de anticuerpo humano, que se ha introducido en un Iocus génico de anticuerpo de pollo con el fin de provocar la conversión génica con la región variable de anticuerpo humano insertada, se denomina colectivamente “pseudogén humano”.
Una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, que se han insertado en un Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo o se han reemplazado por una secuencia en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo, puede ser toda la secuencia de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano y la región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, o también puede ser parte de la secuencia. Además, la posición de la secuencia de ADN derivada de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo está deseablemente en el sentido de 5' de una posición, en la que se ha insertado la secuencia de ADN derivada de la región constante de cadena ligera de anticuerpo humano.
Del mismo modo, una secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano, que se han insertado en un Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo o se han reemplazado por una secuencia en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo, puede ser toda la secuencia de la región variable de cadena pesada humana y la región constante de cadena pesada humana, o también puede ser parte de la secuencia. Además, la posición de la secuencia de ADN derivada de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo está deseablemente en el sentido de 5' de una posición, en la que se ha insertado la secuencia de ADN derivada de la región constante de cadena pesada de anticuerpo humano.
Además, las posiciones de las secuencias de ADN derivadas de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y la región constante de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo están deseablemente en el sentido de 5' de las posiciones de la secuencia de ADN derivada de una región variable de cadena ligera de anticuerpo de pollo y una región constante de cadena ligera de anticuerpo de pollo. Del mismo modo, las posiciones de las secuencias de ADN derivadas de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y la región constante de cadena pesada de anticuerpo humano insertadas en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo están deseablemente en el sentido de 5' de las posiciones de la región variable de cadena pesada de anticuerpo de pollo y la región constante de cadena pesada de anticuerpo de pollo.
Las secuencias de ADN derivadas de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano, que se han insertado en el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo o se han reemplazado por las secuencias de ADN en el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (que también se denominan “secuencias de pseudogén de cadena ligera humana” en la presente descripción y dibujos) pueden ser las secuencias de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano conocidas. Tal información de secuencia también puede obtenerse de sitios web tales como V Base (http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php). Como tales secuencias de pseudogén de cadena ligera humana, pueden usarse secuencias de ADN que comprenden la totalidad o una parte de la CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano. Es deseable que cada CDR no sea idéntica a la secuencia de ADN de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano que se ha insertado
en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo o se ha reemplazado por la secuencia en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo, o a las CDR de otras secuencias de pseudogenes de cadena ligera humana. Además, es deseable que la región marco (FW) de la secuencia de pseudogén de cadena ligera humana sea idéntica a la de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano que se ha insertado en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo o se ha reemplazado por la secuencia en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo. Por ejemplo, cuando la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 5 se selecciona como región variable de cadena ligera de anticuerpo, las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 69 a SEQ ID NO: 88 y SEQ ID NO: 127 a SEQ ID NO: 141 puede usarse en combinación como pseudogén de cadena ligera.
Del mismo modo, las secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, que se han insertado en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo o se han reemplazado por las secuencias de ADN en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (que también se denominan “secuencias de pseudogén de cadena pesada humana” en la presente descripción y dibujos) pueden ser las secuencias de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano conocidas. Tal información de secuencia también puede obtenerse de sitios web tales como V Base (http://www2.mrclmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php). Como tales secuencias de pseudogén de cadena pesada humana, pueden usarse secuencias de ADN que comprenden la totalidad o una parte de la CDR1, CDR2 y CDR3 de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano. Es deseable que cada CDR no sea idéntica a la secuencia de ADN de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano que se ha insertado en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo o se ha reemplazado por la secuencia en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo, o a las CDR de otras secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana. Además, es deseable que las regiones marco (FW) de las secuencias de pseudogenes de cadena pesada humana sean idénticas a las de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano que se ha insertado en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo o se ha reemplazado por la secuencia en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo. Por ejemplo, cuando la secuencia de ADN de SEQ ID NO: 30 se selecciona como región variable de cadena pesada de anticuerpo, las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 89 a SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 127 a SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 147 a SEQ ID NO: 161 y SEQ ID NO: 165 a SEQ ID NO: 179 pueden usarse en combinación como pseudogén de cadena pesada.
La posición de las secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano insertadas en el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo está deseablemente en el sentido de 5' de la posición de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo. Además, cuando permanece una secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo, las secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano se ubican deseablemente en el sentido de 3' de la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo. Del mismo modo, la posición de las secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano insertadas en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo está deseablemente en el sentido de 5' de la posición de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo. Además, cuando permanece una secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo, la secuencia de ADN derivada de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano se ubica deseablemente en el sentido de 3' de la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo.
Además, las secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de anticuerpos humanos, que se insertan o sustituyen como un pseudogén en el sentido de 5' de la región variable de anticuerpo de pollo, pueden usarse o bien en la misma dirección que, o bien en la dirección opuesta a, la dirección de la secuencia de región variable de anticuerpo humano insertada o sustituida en la región variable de anticuerpo de pollo.
El número de secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano que se insertan en el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo, o se sustituyen (reemplazan) por pseudogenes en el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo, es preferiblemente de 2 o más, más preferiblemente 5 o más, 7 o más, 9 o más, 11 o más, 13 o más, además preferiblemente 15 o más, 20 o más, o 25 o más. Del mismo modo, el número de secuencias de ADN derivadas de las regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano, que se insertan en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo, o se sustituyen (reemplazan) por pseudogenes en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo, es preferiblemente de 2 o más, más preferiblemente 5 o más, 7 o más, 9 o más, 11 o más, 13 o más, además preferiblemente 15 o más, 20 o más, 25 o más, y lo más preferiblemente 30 o más.
Cabe señalar que la secuencia de ADN derivada de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano o la secuencia de ADN derivada de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano, que se usa en el presente documento, se considera que es una secuencia de ADN, cuando es una serie de secuencias homólogas de región variable continua contenidas en una región a lo largo de una región variable, y comprende uno cualquiera de FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3 y FW4.
El tipo de una cadena pesada de anticuerpo humano, que se inserta en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo, puede ser una cualquiera de una cadena y , una cadena s, una cadena a , una cadena 8 y una
cadena e. Es preferiblemente una cadena y. Por otro lado, el tipo de una cadena ligera de anticuerpo humano, que se inserta en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo de pollo y el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo puede ser o bien una cadena X o bien una cadena k .
Con el fin de usar la célula B transgénica de pollo para preparar una biblioteca de anticuerpos, la célula B de pollo preferiblemente no solo expresa un anticuerpo humano en la membrana celular de la misma, sino que también tiene la capacidad de secretar el anticuerpo humano en una disolución de cultivo. Por tanto, cuando se transcribe el gen de anticuerpo humano introducido, es necesario que tenga lugar apropiadamente corte y empalme alternativo similar a un mecanismo de control de la expresión in vivo. Por tanto, con respecto a la introducción de la región constante, es ideal usar una estructura genómica que sea completamente idéntica a la región constante de una región constante de cadena pesada de anticuerpo de pollo. Sin embargo, ya que la secuencia de nucleótidos de la región genómica de un pollo aún no se ha analizado a fecha de marzo de 20l5, esto no puede usarse. Se ha usado una secuencia de intrón en la secuencia genómica de una cadena pesada de anticuerpo de ratón, y como resultado, se han expresado satisfactoriamente un anticuerpo humano en la superficie de una membrana celular y un anticuerpo humano secretor al mismo tiempo. En consecuencia, también es posible usar, como sustituto, una secuencia de intrón derivada de animales mamíferos conocidos tales como un ratón o un ser humano.
Se usa un método de activación que implica recombinación homóloga como método para insertar un gen de anticuerpo humano en un Iocus génico de anticuerpo de pollo y/o reemplazar el gen en el Iocus génico de anticuerpo de pollo por un gen de anticuerpo humano. Además, como métodos para insertar secuencias derivadas de región variable de anticuerpo humano en la región de pseudogén en el Iocus génico de cadena de anticuerpo de pollo y/o reemplazar el gen en el Iocus génico de cadena de anticuerpo de pollo por un gen de anticuerpo humano, puede usarse preferiblemente un método de activación que implica recombinación homóloga y un método de intercambio de casete mediado por recombinasa (RMCE) que implica recombinación específica de sitio.
Como se describió anteriormente, una célula B de pollo producida como se describe en el presente documento significa una célula B de pollo, en la que se han insertado secuencias de ADN derivadas de un Iocus génico de anticuerpo humano, o que se han reemplazado por las secuencias de ADN derivadas del Iocus génico de anticuerpo humano; y una célula B de pollo, en la que se ha introducido adicionalmente una amplia variedad de mutaciones en la región variable de cadena ligera o cadena pesada de anticuerpo derivado de ser humano de la célula mencionada anteriormente. La diversificación de anticuerpos puede lograrse mediante la reorganización de la región variable que provocará la generación de diversas secuencias de región variable. Por tanto, una célula B de pollo producida como se describe en el presente documento también significa una célula B de pollo en la que se ha realizado un tratamiento de introducción de diversas mutaciones necesarias para la reorganización de la región variable. En el presente documento, Ios ejemplos del método de introducción de una mutación necesaria para la reorganización de la región variable, que puede usarse en el presente documento, incluyen métodos conocidos en el presente campo técnico, tales como un método de uso de células B en las que se han delecionado XRCC2 y XRCC3 (por ejemplo, Cumber et al., Nature Biotech. 204: 1129-11342002, publicación de patente Japonesa (Kokai) n .o2003-503750 a , etc.), un método para controlar la expresión de un gen AID (por ejemplo, Kanayama et al., Nucleic Acids Res. 34: e10., 2006, publicación de patente Japonesa (Kokai) n.o 2004-298072 a , etc.), y un método para relajar la cromatina para promover la conversión génica (por ejemplo, documento de patente 1, documento de patente 2, documento no de patente 1, etc.). Entre otros, es particularmente preferible un método para relajar la cromatina para promover la conversión génica.
Un ejemplo del método para relajar la cromatina en una célula B de pollo puede ser un método que comprende inhibir la actividad de histona desacetilasa (HDAC) existente en la célula B de pollo por un cierto método y, de ese modo, promover significativamente la conversión génica en la célula (para más detalles, véase el documento de patente 1, documento de patente 2, documento no de patente 1, etc. mencionados anteriormente). Como métodos para inhibir la actividad de h Da C existente en las células, puede usarse un método para tratar la célula B como se describe en el presente documento con un inhibidor de H D A c (véase el documento de patente 1 o el documento no de patente 1), un método para reducir o eliminar la función de un gen de HDAC en una célula B de pollo (véase el documento de patente 2), y similares. El inhibidor de HDAC no está particularmente limitado, siempre que sea capaz de inhibir la actividad de HDAc . Los ejemplos del inhibidor de HDAC que puede usarse en el presente documento incluyen tricostatina A (TSA), ácido butírico, ácido valproico, ácido suberoilanilidahidroxámico (SAHA), CBHA (bis-hidroxamida del ácido m-carboxicinámico), PTACH, apicidina, Scriptaid, M344, compuesto de A p Ha 8, BML-210, oxaflatina y MS-275. Aparte de estas sustancias, también puede usarse una proteína de tipo inactivo de la HDAC como diana de inhibición de la actividad (un negativo dominante) como una sustancia inhibidora, si es posible.
Cuando la función de un gen de HDAC se reduce o deleciona, las isoformas de la HDAC como diana cuya función génica va a reducirse o delecionarse varían dependiendo de una célula B productora de anticuerpos usada. La isoforma es preferiblemente un gen de HDAC2 (para más detalles, véase el documento de patente 2).
También se da a conocer en el presente documento una biblioteca de células productoras de anticuerpos que consiste en las células B de pollo descritas en el presente documento. La presente biblioteca de células significa una población de células B de pollo como se describe en el presente documento que producen anticuerpos que reaccionan con diversos antígenos. La célula B de pollo como se describe en el presente documento es una célula en la que se genera variación en la secuencia de región variable de un anticuerpo producido por la célula, mediante la inserción de
secuencias de ADN derivadas de regiones variables de anticuerpo derivadas de ser humano en un Iocus de pseudogén de anticuerpo de pollo, etc., y la secuencia de la región variable de anticuerpo se diversifica adicionalmente mediante un tratamiento de relajación de la cromatina, de modo que la célula pueda tener la capacidad de producir anticuerpos que reaccionan con diversos antígenos.
Por tanto, una población que comprende una pluralidad de células B de pollo como se describe en el presente documento puede ser una población de células que producen anticuerpos que reaccionan con diversos antígenos.
También se da a conocer un método para producir un anticuerpo a partir de la célula B de pollo descrita en el presente documento de t, y un anticuerpo producido.
El anticuerpo producido a partir de la célula B de pollo descrita en el presente documento es un anticuerpo humanizado, y más preferiblemente un anticuerpo humano. El anticuerpo humanizado significa un anticuerpo en el que una parte de una secuencia derivada de un gen de pollo está comprendida en la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo producido, y el anticuerpo humano significa un anticuerpo en el que la secuencia de aminoácidos completa de la cadena pesada o cadena ligera de un anticuerpo producido es una secuencia derivada de un gen humano.
Cuando la célula B de pollo como se describe en el presente documento se cultiva en condiciones de cultivo adecuadas para la célula, produce un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano. Se sabe que, en una línea celular derivada de células B de pollo tales como células DT40, se produce conversión génica en un Iocus génico de anticuerpo de la misma, aunque no se produce con alta eficiencia. Por tanto, tal conversión génica se produce también en la célula B de pollo descrita en el presente documento, y se logra variación primaria en Ios anticuerpos producidos mediante conversión génica que se produce en un Iocus génico del anticuerpo, en el que se ha insertado un gen de anticuerpo derivado de ser humano. Además, al relajar la cromatina en la célula B de pollo descrita en el presente documento, la eficiencia de conversión génica en el Iocus génico del anticuerpo aumenta aún más, de modo que puede prepararse una población de células B de pollo capaces de producir más anticuerpos diversos. Con el fin de seleccionar células B de pollo que producen anticuerpos que presentan la especificidad de antígeno deseada utilizando la relajación de la cromatina, puede usarse un sistema ADLib. La biblioteca de células productoras de anticuerpos mencionada anteriormente también puede prepararse utilizando el sistema ADLib (véase el documento de patente 1 o el documento no de patente 1).
Además, en particular, como método para obtener un anticuerpo deseado que reacciona con una proteína unida a membrana, puede utilizarse un método ADLib axCELL (célula que expresa antígeno, antigen expressing cell) (documento W02010/064454).
También se da a conocer un kit para producir la célula B de pollo como se describe en el presente documento o producir un anticuerpo.
El kit para producir la célula B de pollo comprende: un medio, suplementos y similares que son necesarios para el cultivo de la célula B de pollo; un vector usado para insertar una secuencia de ADN derivada de un gen de anticuerpo humano en el Iocus génico de anticuerpo de la célula B de pollo, o reemplazar el Iocus génico del anticuerpo de células B de pollo por la secuencia de ADN derivada del gen de anticuerpo humano; y reactivos. Además, el kit para producir la célula B de pollo también puede comprender: elementos necesarios para preparar una biblioteca de células productoras de anticuerpos, tal como un inhibidor de HDAC; y reactivos necesarios para reducir o eliminar la función de Ios genes de HDAC.
Por otro lado, el kit para producir un anticuerpo puede comprender, como reactivos para seleccionar un anticuerpo que tiene la especificidad de antígeno deseada, todos Ios tipos de elementos que se consideran necesarios para la producción del anticuerpo. Los ejemplos de tales reactivos incluyen diversos antígenos, perlas magnéticas, un reactivo para preparar tales perlas magnéticas, un anticuerpo marcado usado para seleccionar un anticuerpo y una placa necesaria para exámenes tales como ELISA, que son.
Ejemplos
Confirmación de la conversión génica
1. Preparación de vectores
1-1. Reemplazo de la región constante y la región variable de la cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX) (vector LC KI humano)
Para el reemplazo de la región constante y la región variable de IgX de pollo, se preparó un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 1. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) Región variable y región constante de IgX humana
Se usó ADNc preparado a partir de una línea celular de linfoma de Burkitt humano Ramos como molde, y la PCR se llevó a cabo usando un cebador sentido (TCCACCATGGCCTGGGCTCTG) (SEQ ID NO: 1) y un cebador antisentido (GTTGAGAACCTATGAACATTCTGTAGGGGCCAC) (SEQ ID NO: 2), de modo que se amplificaron la región variable y la región constante de una cadena ligera de anticuerpo humano (IgX). Las regiones amplificadas se clonaron en pGEM-T-Easy (Promega) para obtener pGEM-hIgG1-LC. Este plásrnido pGEM-hIgG1-LC se usó como molde, y la PCR se llevó a cabo usando un cebador sentido (ATTGGCGCGCCTCTCCAGGTTCCCTGGTGCAGGCACAGTCTGCCCTGACTC AGC) (SEQ ID NO: 3) y un cebador antisentido (TTCCATATGAGCGACTCACCTAGGACGGTCAGCTTGGTCC) (SEQ ID NO: 4), para obtener la región variable (SEQ ID NO: 5) de IgX humana.
Además, el pGEM-hIgG1-LC se usó como molde, y la PCR se llevó a cabo usando un cebador sentido (ATTGGCGCGCCTCTGCCTCTCTCTTGCAGGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTC) (SEQ ID NO: 6) y un cebador antisentido (GGAATTCCATATGGAGTGGGACTACTATGAACATTCTGTAGGGG) (SEQ ID NO: 7), para obtener la región constante (SEQ ID NO: 8) de IgX humana
(2) Brazo izquierdo
Se usó el ADN genómico de una línea de células B de pollo DT40 como molde, y la PCR se llevó a cabo usando un cebador sentido (GAGATCTCCTCCTCCCATCC) (SEQ ID NO: 9) y un cebador antisentido (CAAAGGACACGAc Ag AGCAA) (SEQ ID NO: 10), de modo que se amplificó una región que oscilaba entre en el sentido de 5' de la región variable de IgX de pollo y en el sentido de 3' de la región constante de la misma. Un alelo funcional se separó de un alelo no funcional mediante electroforesis. Se cortó el alelo funcional con un tamaño de aproximadamente 8,0 kpb, y después se clonó en pGEM-T-Easy para obtener el genoma de pGEM-cIgM-LC. Usando el genoma de pGEM-cIgM-LC como molde, la PCR se llevó a cabo con un cebador sentido (TGTCTCGAGTGAAGGTCACCAAGGATGG) (SEQ ID NO: 11) y un cebador antisentido (t TAAGCTTGGAGAGGAGAGAGGGGAGAA) (SEQ ID NO: 12), para obtener el brazo izquierdo mostrado en la SEQ ID NO: 13.
(3) Brazo central
Basándose en el análisis de secuencia del genoma de pGEM-cIgM-LC, se determinó la secuencia de una región de intrón ubicada entre la región variable y la región constante de IgX de pollo, y se sintetizó entonces el brazo central mostrado en la SEQ ID NO: 14 (en el que se insertó un gen de resistencia a blasticidina que tiene secuencias de IoxP en ambos extremos en el medio de la misma).
(4) Brazo derecho
Se determinó la secuencia de una región en el sentido de 3' de la región constante de IgX de pollo usando el genoma de pGEM-cIgM-LC, y se sintetizó entonces el brazo derecho mostrado en la SEQ ID NO: 15 (en donde se insertó un gen de resistencia a neomicina que tenía secuencias de Iox2272 en ambos extremos en el medio de la misma).
(5) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, la región variable de IgX humana, el brazo central, la IgGX humana, la región constante y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pBluescript para tener la estructura mostrada en la figura 1, para obtener un vector LC KI humano. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 16.
1-2. Activación en el sentido de 3' de la región del pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX) (vector KI-c - in )
Con el fin de insertar una secuencia para confirmar la conversión génica (una secuencia de confirmación de GC; un pseudogén humano que consiste en una secuencia derivada de la región variable de IgX humana) (SEQ ID NO: 17) en el sentido de 3' de la región del pseudogén de IgGX de pollo, en primer lugar se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 2. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) Brazo izquierdo
Se usó el ADN genómico de DT40 como molde, y se amplificó una región de 4,3 kb (pseudogenes (pV) 1 a 3) ubicada en el sentido de 5' del promotor en la región variable por PCR usando un cebador sentido (TTCTGTGAGCTGAGAAAAGGAGTGTA) (SEQ ID NO: 18) y un cebador antisentido (CCTGCATTGTGGCACAGCGGGGTT) (SEQ ID NO: 19), y luego se clonó en pCR4blunt-TOPO (Life Technologies) para obtener el genoma de pCR4-cIgM-LC pVI. Basándose en esta secuencia, se clonó una región que comprende pV1-3 (SEQ ID NO: 20), para obtener el brazo izquierdo.
(2) Brazo derecho
Basándose en la secuencia del genoma de pCR4-clgM-LCpV1 obtenida en la sección anterior, se clonó una porción que es una región entre pVI y el promotor (Se Q ID NO: 2 l), para obtener el brazo derecho.
(3) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, el gen de resistencia a neomicina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en el pCR4blunt-TOPO para tener la estructura mostrada en la figura 2, para obtener un vector KI-C-IN. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 22.
1-3. Inserción de la secuencia de confirmación de GC en el sentido de 3' de la región del pseudogén de la cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX) (vector KI-C-IN-C)
Con el fin de insertar una secuencia de confirmación de GC en el sentido de 3' de la región del pseudogén de IgGX de pollo, se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 2. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) Secuencia para la confirmación de GC
Basándose en la región variable de IgX humana clonada en 1-1 anterior, se diseñaron una secuencia mutante, en la que se insertaron 3 nucleótidos en cada CDR, y una secuencia mutante, en la que se delecionaron 3 nucleótidos de cada CDR, y estas secuencias mutantes se ligaron entonces entre sí usando la secuencia de región no traducida de una región de pseudogén de IgX de pollo para sintetizar una secuencia para la confirmación de GC (SEQ ID NO: 17). (2) Construcción del vector de direccionamiento
La secuencia para la confirmación de GC se incorporó en el vector KI-C-IN preparado en 1-2 anterior para tener la estructura mostrada en la figura 2, para obtener un vector KI-C-IN-C. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 23.
1-4. Deleción de la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX) (vector KI-C_DE)
Con el fin de delecionar la región de pseudogén de IgGX de pollo, se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 3. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) Brazo izquierdo
Se usó el ADN genómico de DT40 como molde, y se amplificó una región de aproximadamente 3,0 kb ubicada en el sentido de 5' de pV25 por PCR usando un cebador sentido (CGCTTTGTACGAACGTTGTCACGT) (SEQ ID NO: 24) y un cebador antisentido (TACCTGAAGGTCTCTTTGTGTTt Tg ) (SEQ ID NO: 25), y después se clonó en el pCR4blunt-TOPO para obtener el brazo izquierdo mostrado en la SEQ ID NO: 26.
(2) Brazo derecho
Se usó el mismo brazo derecho que el preparado en 1-2 anterior.
(3) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, el gen de resistencia a neomicina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en el pCR4blunt-TOPO para tener la estructura mostrada en la figura 3, para obtener un vector KI-C-DE. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 27.
1-5. Reemplazo de la región de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX) por la secuencia para la confirmación de GC (vector KIC-DE-C)
Con el fin de reemplazar la región de pseudogén de IgGX de pollo por una secuencia para la confirmación de GC, se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 3. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) secuencia de confirmación de GC
Se usó la secuencia de confirmación de GC preparada en 1-2 anterior.
(2) Construcción del vector de direccionamiento
La secuencia de confirmación de GC descrita anteriormente se incorporó en el vector KI-C-DE producido en 1-3 anterior para tener la estructura mostrada en la figura 3, para obtener un vector KI-C-DE-C. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 28.
1-6. Activación en la región constante y la región variable de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
Con el fin de sustituir una región que va desde la región variable de IgM de pollo (IgM) hasta la región constante |i1 de la misma por una cadena pesada de anticuerpo humano (IgGi), se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 4. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) Región constante de IgGi humana
Entre las secuencias obtenidas sometiendo el cromosoma 14 del genoma humano 32.33 que comprende IgGi humana a secuenciación al azar, se obtuvo una secuencia correspondiente a IgGi (n.0 de registro NW_001838121.1). Las secuencias de CHI correspondientes a la “región C” de “ IGH1”, una bisagra, CH2, CH3 y un dominio transmembrana se extrajeron de una secuencia entre el nucleótido 41520 y el nucleótido 43117, y después se diseñó una secuencia reemplazando el intrón por una secuencia derivada de lgG2a de ratón. Posteriormente, se obtuvo una secuencia de región constante de IgGi humana (SEQ ID NO: 29) por síntesis.
(2) Región variable de IgGi humana
Basándose en la secuencia de un gen de región variable de IgGi derivada de célula germinal humana, se diseñó una secuencia ligando las secuencias VH3-23, D5-12 y Jh l entre sí, y después se añadió una secuencia señal secretora derivada de pollo o una secuencia señal de corte y empalme a la secuencia para preparar una región variable de IgGi humana (SEQ ID NO: 30).
(3) Brazo izquierdo
Se usó el ADN genómico de DT40 como molde, y se amplificó una región que va desde una región en el sentido de 5' de una región variable de IgM de pollo hasta la región variable por PCR usando un cebador sentido (TTCCCGAAGCGAAAGCCGCGT) (SEQ ID NO: 31) y un cebador antisentido (ACTCACCGGAGGAGACGATGA) (SEQ ID NO: 32), y entonces se clonó un fragmento de aproximadamente 4,1 kbp, para obtener el genoma de pCR4 Blunt-TOPO-clgM-HC pVI. Basándose en esta secuencia, se diseñó y sintetizó el brazo izquierdo (SEQ ID NO: 33), al lado terminal 3' del cual se añadió una secuencia de VIox.
(4) Brazo central i
Basándose en la secuencia de aproximadamente 4,1 kbp que va desde la región en el sentido de 5' de la región variable de IgM de pollo hasta la región variable, que se había clonado tras la clonación descrita anteriormente del brazo izquierdo, se sintetizó el brazo central i correspondiente a una región de aproximadamente 1,4 kbp en el sentido de 5' de la región variable de IgM de pollo (SEQ ID No : 34).
(5) Brazo central 2
Se usó el ADN genómico de DT40 como molde, y se amplificó una región de aproximadamente 4,3 kbp ubicada en el sentido de 3' de la región variable de IgM de pollo por PCR usando un cebador sentido (GGGGATCCTGGGTCAGTCGAAGGGGGCG) (SEQ ID NO: 35) y un cebador antisentido (g TGCGGCCGCCAAAAGCGGTAAAATCCACCC) (SEQ ID NO: 36), y después se clonó, para obtener el brazo central 2 mostrado en la SEQ ID NO: 37.
(6) Brazo derecho
Se usó el ADN genómico de DT40 como molde, y se amplificó una región de aproximadamente 0,9 kbp que comprende una región constante de IgM de pollo |i2 por PCR usando un cebador sentido (CCAAACCACCTCCTGGTGTCC) (SEQ ID NO: 38) y un cebador antisentido (Ca Aa CCAAAACTACGGATTCTCTGACC) (SEQ ID NO: 39), y después se clonó, para obtener el brazo derecho mostrado en la SEQ ID NO: 40.
(7) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, el sitio de clonación múltiple, el brazo central i , la región variable de IgGi humana, el gen de resistencia a blasticidina, el brazo central 2, la región constante de IgGi humana, el gen de resistencia a neomicina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pBluescript para tener la estructura mostrada en la figura 4, para obtener un vector HC V-C humano. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 41. 1-7. Activación en la región constante, región variable y región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM) (vector HC Kl humano)
Con el fin de insertar una secuencia para confirmar la conversión génica (una secuencia de confirmación de GC; un pseudogén humano que consiste en una secuencia derivada de región variable de Igy humana), una región variable de IgGi humana y una región constante de IgGi humana en una región que va desde una región en el sentido de 3' de la región de pseudogén de IgM de pollo hasta una región constante |i1 de la misma, se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 4. Los métodos para preparar partes individuales se describirán a continuación.
(1) Región constante de IgGi humana
Se usó la secuencia de la región constante de IgGi humana descrita en 1-6 anterior.
(2) Región variable de IgGi humana
Se usó la región variable de IgGi humana descrita en i-6 anterior.
(3) Secuencia para confirmar la conversión génica
Basándose en la región variable de Igy humana diseñada en i-6 anterior, se diseñó una secuencia mutante delecionando un nucleótido de CDRi, se diseñó otra secuencia mutante delecionando dos nucleótidos de CDR2 y se diseñó otra secuencia mutante insertando un nucleótido en CDR3. Estas secuencias mutantes se ligaron entre sí usando la secuencia de región no traducida de una región de pseudogén de Igy de pollo para sintetizar una secuencia de confirmación de GC (SEQ ID NO: 42).
(4) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo descrito en i-6 anterior.
(5) Brazo central i
Se usó el brazo central i descrito en i-6 anterior.
(6) Brazo central 2
Se usó el brazo central 2 descrito en i-6 anterior.
(7) Brazo derecho
Se usó el brazo derecho descrito en i-6 anterior.
(8) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, la secuencia de confirmación de GC, el brazo central i , la región variable de IgGi humana, el gen de resistencia a blasticidina, el brazo central 2, la región constante de IgGi humana, el gen de resistencia a neomicina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pBluescript para tener la estructura mostrada en la figura 4, para obtener un vector HC Kl humano. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 43. i-8. Construcción de vector para expresar recombinasa Cre
Dado que se ha incorporado un gen de resistencia a fármacos en el vector producido anteriormente de tal manera que se han añadido secuencias de IoxP a ambos extremos del gen, se permite que la recombinasa Cre actúe sobre el vector después de la finalización de la transferencia génica, de modo que este gen pueda eliminarse. Por tanto, se incorporó un gen de recombinasa Cre mostrado en la SEQ ID NO: 44 en pEGFP-C1 (BD Bioscience, n.06084-i) para producir Cre_EGFP-Ci mostrado en la SEQ ID NO: 45.
2. Producción de líneas celulares en la cadena ligera de la cual se ha insertado o sustituido la secuencia humana Como huésped, se usó DT40, una línea celular derivada de células B de pollo. Se cultivó la DT40 mediante el siguiente método.
Usando una cámara termostática de CO2 , se cultivaron las células a 39,5°C en presencia del 5% de CO2. Se usó IMDM (Life Technologies) como medio, y se añadieron el 9% de FBS, el i % de suero de pollo, i00 unidades/ml de penicilina, i00 |ig/ml de estreptomicina y 50 |iM de monotioglicerol al medio, y luego se usó el medio así obtenido. A continuación en el presente documento, a menos que se especifique lo contrario, el “medio” indica un medio que tiene la composición mencionada anteriormente.
i6
Con el fin de evaluar la conversión génica en una cadena ligera, se prepararon cinco tipos de líneas celulares que se muestran en la siguiente tabla 1.
[Tabla 1]
Los métodos para producir estas líneas celulares se describirán a continuación.
2-1. Producción de líneas celulares en las que la región variable y la región constante se han reemplazado por regiones de tipo humano
El vector LC Kl humano producido en 1-1 anterior se linealizó con la enzima de restricción Notl, y luego se introdujo en células DT40 por electroporación. Las células resultantes se cultivaron en un medio, al que se habían añadido 2 mg/ml de G418 y 10 pg/ml de blasticidina, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se seleccionó una línea celular en la que se había producido sustitución génica en un Iocus génico de interés. El Cre_pEGFP-C1 producido en 1-8 anterior se introdujo en la línea celular seleccionada, y la línea celular resultante se sometió luego a clasificación de células individuales por citometría de flujo, para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células positivas para GFP se sometieron a genotipado por PCR, para obtener una línea celular 37-3, en la que pudo confirmarse la eliminación de Ios genes de resistencia a fármacos. Posteriormente, el vector Kl-C-lN producido en 1-2 anterior se linealizó con la enzima de restricción Notl, y luego se introdujo en la línea celular 37-3. Las células se cultivaron en un medio, al que se habían añadido 2 mg/ml de G418, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para obtener una línea celular LP1, en la que se había producido inserción génica en un Iocus génico de interés (figura 5).
2-2. Producción de línea celular en la que la región variable y la región constante se han reemplazado por regiones de tipo humano, y además, en la que la secuencia para confirmar la conversión génica (secuencia de GC) se ha insertado en el sentido de 3' de la región de pseudogén de pollo
El vector Kl-C-lN-C producido en 1-3 anterior se linealizó con la enzima de restricción Notl, y luego se introdujo en la línea celular 37-3 obtenida en la sección anterior. Las células resultantes se cultivaron en un medio, al que se habían añadido 2 mg/ml de G418, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para obtener una línea celular LP9, en la que se había producido inserción génica en un Iocus génico de interés (figura 6).
2-3. Producción de línea celular en la que la región variable y la región constante se han reemplazado por regiones de tipo humano, y además, en la que se ha delecionado la región de pseudogén de pollo
El vector Kl-C-DE producido en 1-4 anterior se linealizó con la enzima de restricción Notl, y luego se introdujo en la línea celular 37-3 obtenida en 2-1 anterior. Las células resultantes se cultivaron en un medio, al que se habían añadido 2 mg/ml de G418, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para obtener una línea celular LP18, en la que se había producido inserción génica en un Iocus génico de interés (figura 7).
2-4. Producción de línea celular en la que la región variable y la región constante se han reemplazado por regiones de tipo humano, y además, en la que la región de pseudogén de pollo se ha reemplazado por una secuencia para confirmar la conversión génica (secuencia de GC)
El vector Kl-C-DE-C producido en 1-5 anterior se linealizó con la enzima de restricción Notl, y luego se introdujo en la línea celular 37-3 obtenida en 2-1 anterior. Las células resultantes se cultivaron en un medio, a Ios que se habían añadido 2 mg/ml de G418, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para obtener una línea celular LP20, en la que se había producido sustitución génica en un Iocus génico de interés (figura 8).
3. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA).
3-1. Análisis por citometría de flujo
Se analizó un anticuerpo que se expresa en la superficie de las células de cada una de las líneas celulares producidas en 2 anterior. Se cultivó cada línea celular, y las células cultivadas se dispensaron entonces en una placa de 96 pocilios (Nunc, 249662) en una cantidad de 5 x 105 células/pocillo. Las células se lavaron con 150 |il de tampón FACS (PBS que contenía albúmina sérica bovina al 0,3% (BSA)) dos veces, y se añadieron 50 |il de una disolución de anticuerpo primario, que se había preparado diluyendo anticuerpo de cabra anti-lgM de pollo conjugado con FITC (Bethyl, A30-102F-20), anticuerpo de cabra anti-lgG humana conjugado con R-PE (específico de cadena gamma) (Southern Biotech, A2040-09) o anticuerpo de cabra anti-lambda humana conjugado con PE (Southern Biotech, 2070-09) con tampón FACS, 1000 veces, 50o veces y 500 veces, respectivamente, a las células resultantes. La mezcla se incubó en hielo en un lugar oscuro durante 30 minutos, y después se lavó con 150 |il de tampón FACS dos veces. Posteriormente, se añadieron 200 |il de una disolución de Pl, que se había diluido 1000 veces con tampón FACS, a la mezcla de reacción, y después se suspendió en la misma. Esta suspensión se sometió a un análisis de citometría de flujo, y se analizó la expresión de IgM de pollo e lgy humana (cadena pesada) o lgX humana (cadena ligera). Como resultado, se confirmó que, como se muestra en la figura 9, solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que se expresaron IgM de pollo e IgX humana en las líneas celulares transformadas LP1, LP9, LP18 y LP20. En todas las líneas celulares, no se observó la expresión de Igy que no hubiera experimentado transferencia génica.
3-2. Análisis de ELISA
Se midieron las concentraciones de IgM de pollo e IgGi humana, que se secretaron de las células producidas en 2 anterior en sobrenadantes de cultivo. Se suspendieron líneas celulares individuales en un medio que no contenía suero de pollo hasta una concentración de 4 x 105 células/ml, y luego se sembraron 2 mi de cada una de las suspensiones en cada pocilio de una placa de 24 pocilios, seguido de la realización de un cultivo durante 3 días. Posteriormente, se recuperó la disolución de cultivo, luego se filtró a través de un filtro de 0,22 |im y entonces se usó en la medición.
El método de medición de IgG es el siguiente. Se dispensaron 20 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-Fc purificado por afinidad 1,0 |ig/ml (Bethyl, A80-104A) en una placa 384 pocilios inmuno Maxisorp (Nunc, 464718), y después se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora o más, de modo que se inmovilizó en la placa. Posteriormente, el resultado en la placa se lavó con una disolución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%) cinco veces, luego se añadieron 50 |il de una disolución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %) a la misma, y la mezcla se hizo reaccionar después a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, se lavó la mezcla de reacción con una disolución de lavado cinco veces, se añadieron entonces 20 |i l de una muestra de medición o IgGI Lambda humana-UNLB (Southern Biotech, 0151L-01) que sirve como sustancia patrón a la misma, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado cinco veces, se añadieron entonces 20 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-Fc conjugado con HRP (Bethyl, A80-104P), que se había diluido 1000 veces con PBS que contenía BSA al 1 % y Tween 20 al 0,05 %, a la misma, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado cinco veces, se añadieron entonces 20 |il de TMB+ (Dako, S159985) a la misma, y la mezcla obtenida se sometió a una reacción de coloración a temperatura ambiente durante 3 minutos. Posteriormente, se añadieron 20 |il de ácido sulfúrico 1 N a la mezcla de reacción para finalizar la reacción. Usando Infinite M1000 (TECAN), se midió la absorbancia a 450 nm.
Para la medición de IgM, se usó el sistema de inmunoensayo AlphaLISA (Perkin Elmer). Se marcó anticuerpo de cabra anti-IgM de pollo (Bethyl, A30-102A) con biotina, empleando reactivo de mareaje con biotina Chromalink™ (SoluLink Inc., n.0 B1001-1005), de modo que se preparó un anticuerpo biotinilado. Posteriormente, se permitió que el anticuerpo de cabra anti-IgM de pollo (Bethyl, A30-102A) se uniera a perlas aceptaras AlphaLISA no conjugadas (Perkin Elmer), de modo que se prepararon perlas Alpha Sereen unidas a anticuerpos. Estos anticuerpos mareados con biotina y perlas Alpha Sereen unidas a anticuerpos se diluyeron cada uno con un tampón de ensayo (PBS que contenía BSA al 1 %) a concentraciones de 4,5 nM y 50 |ig/ml, respectivamente. Posteriormente, se mezclaron entre sí en cantidades iguales, para preparar una disolución de medición de la concentración de IgM de pollo. Se mezclaron 20 |il de la disolución de medición de la concentración de IgM de pollo con 5 |il de una muestra de medición o el suero de pollo (GIBCO, 16110) que sirve como sustancia patrón en una placa de 96 pocilios (Nunc), y la disolución mixta se dispensó luego en Alpha Plate-384 (Perkin Elmer) en una cantidad de 12,5 |il cada una. La disolución mixta se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 60 minutos, y posteriormente, se añadieron 12,5 |il de perlas donadoras de estreptavidina AlphaSereen (Perkin Elmer), que se habían ajustado a una concentración de 80 |ig/ml con un tampón de ensayo, a la disolución de reacción, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a temperatura ambiente en condiciones de protección contra la luz durante 30 minutos. Posteriormente, usando EnSpire (Perkin Elmer), se llevó a cabo un análisis.
Los resultados de la medición se muestran en la tabla 2. Se confirmó que, como con la DT40 de tipo silvestre, también se secretó IgM de pollo en las líneas celulares transformadas LP1, LP9, LP18 y LP20.
[Tabla 2]
4. Confirmación de la conversión génica
Las líneas celulares, en las que se había confirmado la expresión de IgT, humana (cadena ligera) en 3 anterior, se cultivaron en un medio que contenía 2,5 ng/ml de TSA durante 20 días, y luego se extrajo el ADN genómico de 1 x 106 células. Se usó este ADN genómico como molde, y se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47). Posteriormente, el resultante se purificó mediante extracción en gel de agarosa, y después se concentró usando el kit de purificación por PCR QIAGEN (QIAGEN). Usando el sistema de análisis de secuenciación de última generación de Roche Diagnostics, se analizó la secuencia de esta muestra, y se evaluó la presencia o ausencia de conversión génica basándose en si una secuencia génica idéntica a la secuencia de pseudogén humano insertado estaría presente o no en la región variable. Los resultados se muestran en la tabla 3. Se confirmó que no se había producido conversión génica en LP1 y LP18 que no comprendían la secuencia de pseudogén humano, mientras que tal conversión génica se había producido en LP9 y LP20 que tienen la secuencia de pseudogén humano.
[Tabla 3]
5. Producción de la línea celular, en la que la secuencia humana se ha insertado y/o sustituido en la cadena pesada
Para evaluar la conversión génica en una cadena pesada, se prepararon los tres tipos de líneas celulares que se muestran en la tabla 4.
[Tabla 4]
Los métodos para producir estas líneas celulares se describirán a continuación.
5-1. Producción de la línea celular en la que la región variable y la región constante de cadena pesada se han reemplazado por regiones de tipo humano
El vector HC V-C humano producido en 1-6 anterior se linealizó con la enzima de restricción SalI, y luego se introdujo en la línea celular 37-3 obtenida en 2-2 anterior. Las células resultantes se cultivaron en un medio, al que se habían añadido 2 mg/ml de G418 y 10 pg/ml de blasticidina, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvo una línea celular T18 en la que se había producido sustitución génica en un Iocus génico de interés (figura 10).
5-2. Producción de la línea celular en la que la región variable y la región constante de cadena pesada se han
reemplazado por regiones de tipo humano, y la secuencia para confirmar la conversión génica (secuencia de confirmación de GC) se ha insertado en el sentido de 3' de la región de pseudogén.
El vector HC Kl humano producido en 1-7 anterior se linealizó con la enzima de restricción Salí, y luego se introdujo en la línea celular 37-3 obtenida en 2-2 anterior. Las células resultantes se cultivaron en un medio, al que se habían añadido 2 mg/ml de G418 y 10 |i g/ml de blasticidina, durante de 7 a 10 días. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvieron las líneas celulares T i l y T12, en el que se había producido sustitución génica en un Iocus génico de interés (figura 11).
6. Confirmación de la expresión del anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
6-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3-1 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 5 anterior. Los resultados se muestran en la figura 12. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de ígM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron így e lgX humanas en las líneas celulares transformadas T18, T i l y T12.
6-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron Ios anticuerpos secretados de las células producidas en 5 anterior en un sobrenadante de cultivo. Los resultados se muestran en la tabla 5. Como con 6-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgGi humana a partir de T l8, T i l y T12, en las que se había introducido IgGi humana.
[Tabla 5]
7. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 6 anterior, se confirmó la conversión génica. El ADN genómico extraído por el método descrito en 4 anterior se usó como molde, y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 48) y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCg Cc ATCAGNNNNNNNNNNCGGTGACCAGGGTGCCCTG) (SEQ ID NO: 49).
Posteriormente, se llevó a cabo un análisis de secuencia basado en el método descrito en 4 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 6. Se confirmó que no se había producido en absoluto conversión génica en T18 que no contenía pseudogenes humanos, mientras que tal conversión génica se había producido en T i l y T12 que tienen una secuencia de pseudogén humano de este tipo.
[Tabla 6]
Producción de la línea celular L5/H5. en la que se ha insertado la región de pseudogén que consiste en cinco secuencias derivadas de región variable humana en cada una de la cadena ligera y la cadena pesada.
8. Producción de vectores
8-i. Activación en la región de pseudogén de anticuerpo de pollo (IgX)
Con el fin de sustituir la región de pseudogén de IgX de pollo por un pseudogén que consiste en una secuencia derivada de la región variable de IgX humana (un pseudogén de cadena ligera humana), se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 13. El método de producción se describirá a continuación.
(1) Diseño y producción de secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano (pVL5) Basándose en las secuencias génicas de regiones variables de cadena ligera X de inmunoglobulina, que no habían provocado recombinación V(D)J en el genoma humano en la base de datos, se seleccionaron cinco secuencias de cada una de CDR1, CDR2 y CDR3, y entonces se combinó con las mismas la secuencia marco de la región variable de IgX clonada en 1-1 anterior, para diseñar cinco secuencias, concretamente, pVLOOl (SEQ ID NO: 69), pVL002 (SEQ ID NO: 70), pVL003 (SEQ ID NO: 71), pVL004 (SEQ ID NO: 72) y pVL005 (SEQ ID NO: 73). Posteriormente, se diseñó una secuencia de pseudogén de cadena ligera humana pVL5 (SEQ ID NO: 50) que comprende estas secuencias, y después se sometió a síntesis génica.
(2) Producción del vector de direccionamiento
Basándose en el vector KI-C-DE producido en 1-4 anterior, se reemplazó la secuencia de confirmación de GC por la secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano pVL5 descrita en la sección anterior para producir un vector LCpV KI humano. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 51.
8-2. Sustitución de la región constante de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
Con el fin de sustituir la región constante de cadena pesada de IgM de pollo por IgGi humana, se produjo un vector de direccionamiento como se muestra en la figura 14. El método de producción se describirá a continuación.
(1) Región constante de IgGi humana
Se usó la región constante de IgGi humana producida en 1-6 anterior.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo central 2 producido en 1-6 anterior.
(3) Brazo derecho
Se usó el brazo derecho producido en 1-6 anterior.
(4) Producción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, la secuencia de región constante de IgGi humana, el gen de resistencia a neomicina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pBluescript para producir un vector CH KI humano. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 52.
8-3. Inserción en regiones variables y de pseudogén de IgM de pollo
(1) Región variable de IgGi humana
Se usó la región variable de IgGi humana producida en 1-6 anterior.
(2) Diseño y producción de secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano (pVH5) Basándose en las secuencias de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana en la base de datos, se seleccionaron cinco secuencias de cada una de CDR1, CDR2 y CDR3, y se entonces se combinó con las mismas la secuencia marco de la región variable clonada en 1-6 anterior, para diseñar cinco secuencias, concretamente, pVHOOl (SEQ ID NO: 89), pVH002 (SEQ ID NO: 90), pVH003 (SEQ ID NO: 91), pVH004 (SEQ ID NO: 92) y pVH005 (SEQ ID NO: 93). Posteriormente, se diseñó una secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano pVH5 (SEQ ID NO: 53) que comprende estas secuencias, y después se sometió a síntesis génica. (3) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo producido en 1-6 anterior.
(4) Brazo central
Se usó el brazo central 1 producido en 1-6 anterior.
(5) Brazo derecho
Se usó el brazo central 2 producido en 1-6 anterior. La secuencia confirmada del brazo derecho se muestra en la SEQ ID NO: 54.
(6) Producción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, la secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano pVH5, el brazo central, la secuencia de región variable de IgGi humana, el gen de resistencia a blasticidina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pBluescript para obtener un vector pVH VH Kl humano. La secuencia génica de este vector se muestra en la SEQ ID NO: 55.
9. Producción de la línea celular L5/H5, en la que se han introducido cinco pseudogenes humanos en cada uno de los loci génicos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo de pollo
El vector CH Kl humano producido en 8-2 anterior, el vector pVH VH Kl humano producido en 8-3 anterior y el vector LC pV Kl humano producido en 8-1 anterior se introdujeron en la línea celular 37-3 obtenida en 2-2 anterior, para producir una línea celular L5/H5 (figura 15).
El vector CH Kl humano, que se había linealizado con la enzima de restricción Salí, se introdujo en la línea celular 37 3, y entonces se cultivaron las células en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para g F p . Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que el gen de resistencia a fármacos se había eliminado.
Posteriormente, el vector pVH VH Kl humano, que se había linealizado con la enzima de restricción Salí, se introdujo en la línea celular 37-3, y entonces se cultivaron las células en un medio que contenía 10 |ig/ml de blasticidina. Las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que el gen de resistencia a fármacos se había eliminado.
Finalmente, el vector LC pV Kl humano, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en la línea celular 37-3, y entonces se cultivaron las células en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para obtener las líneas celulares B-B10 y J-D3, en cada una de las cuales se había producido sustitución en un Iocus génico de interés (figura 16 y figura 17).
10. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
10-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3-1 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 9 anterior. Los resultados se muestran en la figura 18. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de ígM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron így e lgX humanas en las líneas celulares transformadas B-B10 y J-D3.
10-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron Ios anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 9 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 7. Como con 10-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó lgG1 humana a partir de las líneas celulares transformadas B-B10 y J-D3.
[Tabla 7]
11. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 10 anterior, se confirmó la conversión génica. El ADN genómico extraído de las células, que se había cultivado en presencia de TSA durante 42 días, de acuerdo con el método descrito en 4 anterior, se usó como molde, y se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56) y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia de acuerdo con el método descrito en 4 anterior. Los resultados obtenidos analizando las secuencias de las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada en la línea celular B-B10 se muestran en la tabla 8 y la tabla 9, respectivamente. Se confirmó un clon que comprendía la secuencia derivada del pseudogén humano insertada tanto en las regiones variables de cadena ligera como de cadena pesada y, por tanto, se demostró que podía generarse una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica. Además, también se confirmó que podía generarse una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en la línea celular J-D3.
[Tabla 8]
Producción de la línea celular L15/H15. en el que se han insertado 15 secuencias derivadas de región variable humana en cada uno de los loci génicos de cadena ligera y cadena pesada de anticuerpo de pollo
12. Producción de vectores
12-1. Activación en regiones variables y constantes de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
Basándose en el método descrito en 1-1 anterior. se produjo un vector de direccionamiento. el vector Lambda-VL-CL KI 2.0, que se muestra en la figura 19.
(1) Región variable y región constante de IgX humana
Se usaron la región variable y la región constante producidas en 1-1 anterior.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo producido en 1-1 anterior.
(3) Brazo central
Se usó el brazo central producido en 1-1 anterior.
(4) Brazo derecho
Basándose en la secuencia de una región en el sentido de 3' de la región constante de una cadena ligera de anticuerpo de pollo. que se determinó en 1-1 anterior. se sintetizó el brazo derecho.
(5) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo. la región variable de IgX humana. el brazo central. la región constante de IgX humana y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pBluescript para tener la estructura mostrada en la figura 19. para obtener el vector Lambda-VL-CL KI 2.0 (SEQ ID NO: 58).
12-2. Desactivación del pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
(1) Región variable de IgX humana
Se usó la secuencia de región variable descrita en 1-1 anterior.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo descrito en 1-2 anteriormente.
(3) Brazo central
Se usó el brazo izquierdo descrito en 1-1 anterior como brazo central.
(4) Brazo derecho
Se usó el brazo central descrito en 1-1 anterior como brazo derecho.
(5) Sitio de clonación múltiple
Para la inserción de una secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano pVL15, se diseñó un sitio de clonación múltiple mostrado en la s Eq ID NO: 59.
(6) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, el gen de resistencia a neomicina, el sitio de clonación múltiple, el brazo central, la región variable de IgX humana, el gen de resistencia a blasticidina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pUC19, para construir un vector de direccionamiento pVL KI_pUC19_step5_BrRev (SEQ ID NO: 60), como se muestra en la figura 19.
12-3. Activación en regiones variables y de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano (pVL15)
Basándose en las secuencias de regiones variables de inmunoglobulina X humana en la base de datos, se seleccionaron 15 secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, y entonces se combinó con las mismas la secuencia marco de la región variable de IgX humana clonada en 1-1 anterior, para diseñar 15 secuencias, concretamente, pVLIOI (SEQ ID NO: 74), pV L102 (SEQ ID NO: 75), pVL103 (SEQ ID NO: 76), pV L104 (SEQ ID NO: 77), pV L105 (SEQ ID NO: 78), pVL106 (SEQ ID NO: 79), pV L107 (SEQ ID NO: 80), pV L108 (SEQ ID NO: 81), pV L109 (SEQ ID NO: 82), pVLIIO (SEQ ID NO: 83), p V L III (SEQ ID NO: 84), pVL112 (SEQ ID NO: 85), pVL113 (SEQ ID NO: 86), pVL114 (SEQ ID NO: 87) y pVL115 (SEQ ID NO: 88). Se diseñó una secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano pVL15 (S e Q ID NO: 61) que comprende estas secuencias, y después se sometió a síntesis génica.
(2) Construcción del vector de direccionamiento
La secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano descrita anteriormente pVL15 se incorporó en el sitio de clonación múltiple del pVL KI_pUC19_step6_BrRev producido en 12-2 anterior, para construir un vector de direccionamiento pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd (SEQ ID NO: 62) como se muestra en la figura 19.
12-4. Activación en la región constante de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
Se usó el vector CH KI humano producido en 8-2 anterior.
12-5. Activación en la región variable de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) Región variable de IgGi humana
Se usó la secuencia de región variable descrita en 1-6 anterior.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo central descrito en 1-6 anterior.
(3) Brazo derecho
Se usó el brazo derecho descrito en 1-6 anterior.
(4) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, la región variable de IgGi humana, el gen de resistencia a blasticidina y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pUC19, para producir un vector de direccionamiento H(X)O • Ii V(B)_074-009/No4 (SEQ ID NO: 63) como se muestra en la figura 20.
12-6. Activación en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano (pVH15)
Basándose en las secuencias de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana en la base de datos, se seleccionaron 15 secuencias de CDRI, CDR2 y CDR3, y entonces se combinó con las mismas la secuencia marco de la región variable de IgGi humana clonada en 1-6 anterior, para diseñar 15 secuencias, concretamente, pVHIOI (SEQ ID NO: 94), pVH102 (SEQ ID NO: 95), pVH103 (SEQ ID NO: 96), pVH104 (SEQ ID NO: 97), pVH105 (SEQ ID NO: 98), pVH106 (SEQ ID NO: 99), pVH107 (SEQ ID NO: 100), pVH108 (SEQ ID NO: 101), pVH109 (SEQ ID NO: 102), pVHIIO (SEQ ID NO: 103), p V H III (SEQ ID NO: 104), pVH112 (SEQ ID NO: 105), pVH113 (SEQ ID NO: 1O6), pVH114 (s Eq ID NO: 1O7) y pVH115 (SEQ ID NO: 1O8). Posteriormente, se diseñó una secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano pVH15 (SEQ ID NO: 64) ligando estas secuencias entre sí, y después se sometió a síntesis génica.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo descrito en 1-6 anterior.
(3) Brazo derecho
Se usó el brazo central descrito en 1-6 anterior.
(4) Sitio de clonación múltiple
Para la inserción de la secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano, se diseñó un sitio de clonación múltiple mostrado en la SEQ ID NO: 65.
(5) Recombinación específica del sitio usando recombinasa Cre (método RMCE)
Se sabe que, si se prolonga una región de secuencia de pseudogén, se reduce la eficiencia de transducción de la recombinación homóloga. Por tanto, con el fin de insertar fácilmente una secuencia de pseudogén usando recombinasa Cre, se aplicó un método RMCE. En primer lugar, se diseñó una secuencia de casete para RMCE que comprende una secuencia de loxm3 rev y una de secuencia loxm7 rev RE.
(6) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, el gen de resistencia a neomicina, la secuencia de casete para RMCE, el sitio de clonación múltiple, el brazo derecho y la región variable de IgGi humana se incorporaron en pUC19, y posteriormente, se incorporó la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano pVH15 en el sitio de clonación múltiple, para producir un vector de direccionamiento pVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_15pVH_RMCE (SEQ ID NO: 66) como se muestra en la figura 20.
13. Producción de líneas celulares
El vector Lambda-VL-CL Kl 2.O preparado en 12-1 anterior, el pVL KI_pUC19_step5_BrRev preparado en 12-2 anterior, el pVL Kl_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd preparado en i 2-3 anterior, el vector CH Kl humano preparado en 12-4 anterior, el H(X)O • Ii V(B)_074-0o9/no4 preparado en 12-5 anterior y el pVH Kl_pUC19_step3_pVH#odd_15pVH_RMCE preparado en 12-6 anterior se introdujeron cada uno en células DT4O, para producir líneas celulares.
En primer lugar, el vector CH Kl humano, que se había linealizado con la enzima de restricción Salí, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que el gen de resistencia a fármacos se había eliminado.
Posteriormente, el vector Lambda-VL-CL Kl 2.0, que se había linealizado con la enzima de restricción NoíI, se introdujo en DT40, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que el gen de resistencia a fármacos se había eliminado.
Posteriormente, el pVL Kl_pUC19_step5_BrRev, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que Ios genes de resistencia a fármacos se habían eliminado.
Posteriormente, el pVL Kl_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que Ios genes de resistencia a fármacos se habían eliminado.
Finalmente, el H(X)0 • Ii V(B)_074-009/No4 linealizado con la enzima de restricción Seal y pVH Kl_pUC19_step3_pVH#odd_15pVH_RMCE linealizado con la enzima de restricción Notl se introdujeron en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para Gf P. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para obtener las líneas celulares A12-3, A12-4, A12-5, B7-3, B7-9 y B7-11, de cada una de las cuales se habían eliminado Ios genes de resistencia a fármacos.
14. Confirmación de la expresión de anticuerpo (eitometría de flujo y ELISA)
14-1. Análisis por eitometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 13 anterior. Los resultados se muestran en la figura 21 y la figura 22. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron lgy e lgX humanas en las líneas celulares transformadas A12-3, A12-4, A12-5, B7-3, B7-9 y B7-11 (figuras 21 y 22). Cabe señalar que, dado que el histograma de lgX en A12-5 era incorrecto en la figura 21, se adjuntó a la misma la figura 22 que incluye datos correctos obtenidos antes de la fecha de prioridad.
14-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron Ios anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 13 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 10. Como con 10-1 anterior, se confirmó que solo se secretó lgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó lgG1 humana a partir de las líneas celulares transformadas A12-3, A12-4, A12-5, B7-3, B7-9 y B7-11.
[Tabla 10]
15. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 10 anterior, se confirmó la conversión génica. Usando, como molde, el ADN genómico extraído de las células, que se había cultivado durante 21 días o 42 días en presencia de TSA, por el método descrito en 4 anterior, se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56) y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia basándose en el método descrito en 4 anterior. Los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada en la línea celular B7-11 cultivada en presencia de TSA durante 21 días se muestran en la tabla 11 y la tabla 12, respectivamente. Los resultados (Ios 10 superiores) del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada en la línea celular B7-11 cultivada en presencia de TSA durante 42 días se muestran en la tabla 13 y la tabla 14, respectivamente. Se encontró un clon que comprendía una secuencia derivada de un pseudogén humano en las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, y se demostró que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica. Además, también se confirmó que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en otras líneas celulares.
[Tabla 11]
[Tabla 12]
[Tabla 13]
[Tabla 14]
Producción de la línea celular L15/H30. en la que se han insertado 15 regiones de pseudogén que consisten cada una en una secuencia derivada de región variable humana en la cadena ligera v se han insertado 30 de tales regiones de pseudogén en la cadena pesada.
16. Producción de vectores
16-1. Activación en regiones variables v constantes de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
Se usó el vector Lambda-VL-CL KI 2.0 producido en 12-1 anterior.
16-2. Desactivación del pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
Se usó pVL KI_pUC19_step5_Br Rev producido en 12-2 anterior.
16-3. Activación en pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
Se usó pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd producido en 12-3 anterior.
16-4. Activación en la región constante de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
Se usó el vector CH KI humano producido en 8-2 anterior.
16-5. Activación en la región variable de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) región variable de IgG1 humana
Se usó la secuencia de región variable descrita en 1-6 anterior.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo descrito en 1-6 anterior.
(3) Brazo central
Se usó el brazo central descrito en 1-6 anterior.
(4) Brazo derecho
Se usó el brazo derecho descrito en 1-6 anterior.
(5) Secuencia de casete para RMCE
Se usó la secuencia de casete para RMCE diseñada en 12-6 anterior.
(6) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo. el gen de resistencia a neomicina. la secuencia de casete para RMCE, el brazo central. la región
variable de IgGI humana y el brazo derecho descritos anteriormente se incorporaron en pUC19, para producir un vector de direccionamiento pVH KI_pUC19_step5_BsrRev_RMCE_cassette (s Eq ID NO: 109) como se muestra en la figura 23.
16-6. Activación en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano (pVH30)
Basándose en las secuencias de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana en la base de datos, se seleccionaron 30 secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, y entonces se combinó con las mismas la secuencia marco de la región variable de IgGi humana clonada en 1-6 anterior, para diseñar 30 secuencias, concretamente, pVHIOI (SEQ ID NO: 94), pVH102 (SEQ ID NO: 95), pVH103 (SEQ ID NO: 96), pVH104 (SEQ ID NO: 97), pVH105 (SEQ ID NO: 98), pVH106 (SEQ ID NO: 99), pVH107 (SEQ ID NO: 100), pVH108 (SEQ ID NO: 101), pVH109 (SEQ ID NO: 102), pVH110 (SEQ ID NO: 103), p V H III (SEQ ID NO: 104), pVH112 (SEQ ID NO: 105), pVH113 (SEQ ID NO: 106), pVH114 (SEQ ID NO: 107), pVH115 (SEQ ID NO: 108), pVH116 (SEQ ID NO: 110), pVH117 (SEQ ID NO: 111), pVH118 (SEQ ID NO: 112), pVH119 (SEQ ID NO: 113), pVH120 (SEQ ID NO: 114), pVH121 (SEQ ID NO: 115), pVH122 (SEQ ID NO: 116), pVH123 (SEQ ID NO: 117), pVH124 (SEQ ID NO: 118), pVH125 (SEQ ID NO: 119), pVH126 (SEQ ID NO: 120), pVH127 (SEQ ID NO: 121), pVH128 (SEQ ID NO: 122), pVH129 (SEQ ID NO: 123) y pVH130 (SEq ID NO: 124). Posteriormente, se diseñó una secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano pVH30 (SEQ ID NO: 125) ligando estas secuencias entre sí, y después se sometió a síntesis génica.
(2) Brazo izquierdo
Se usó el brazo izquierdo descrito en 1-6 anterior.
(3) Brazo derecho
Se usó el brazo derecho descrito en 1-6 anterior.
(4) Sitio de clonación múltiple
Para la inserción de la secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano, se diseñó un sitio de clonación múltiple mostrado en la SEQ ID NO: 65.
(5) Construcción del vector de direccionamiento
El brazo izquierdo, el gen de resistencia a neomicina, el sitio de clonación múltiple, el brazo derecho, la región variable de IgGi humana se incorporaron en pUC19, y posteriormente, se incorporó la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano pVH30 en el sitio de clonación múltiple, para producir un vector de direccionamiento pVH KI_pUC19_step3_pVH#odd_even (SEQ ID NO: 126) como se muestra en la figura 24.
17. Producción de líneas celulares
El vector Lambda-VL-CL Kl 2.0 producido en 12-1 anterior, el pVL KI_pUC19_step5Br Rev producido en 12-2 anterior, el pVL Kl_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd producido en 12-3 anterior, el vector CH Kl humano producido en 12-4 anterior, el pVH Kl_pUC19_step5_BsrRev_RMCE_cassette producido en 16-5 anterior y el pVH Kl_pUC19_step3_pVH#odd_even producido en 16-6 anterior se introdujeron cada uno en células DT40, para producir líneas celulares.
En primer lugar, el vector CH Kl humano, que se había linealizado con la enzima de restricción Salí, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Crep_EGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que el gen de resistencia a fármacos se había eliminado.
Posteriormente, el vector Lambda-VL-CL Kl 2.0, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en células DT40, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para Gf P. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que el gen de resistencia a fármacos se había eliminado.
Posteriormente, el pVL Kl_pUC19_step5_BrRev, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se
introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que Ios genes de resistencia a fármacos se habían eliminado.
Posteriormente, el pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que Ios genes de resistencia a fármacos se habían eliminado.
Además, el casete pVH Kl_pUC19_step5_BsrRev_RMCE, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que Ios genes de resistencia a fármacos se habían eliminado.
Finalmente, el pVH Kl_pUC19_step3_pVH#odd_even, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en las células, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés. Posteriormente, se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, y las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para G f P. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para obtener las líneas celulares n.0 7-7, n.o 11-3 y n.o 11-6, de cada una de las cuales se había eliminado el gen de resistencia a fármacos.
18. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
18-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 16 anterior. Los resultados se muestran en la figura 25. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron lgy e lgX humanas en las líneas celulares transformadas n.° 7-7, n.o 11-3 y n.o 11-6 (figura 25).
18-2. Análisis de ELISA
Se midieron Ios anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 17 anterior. La medición de IgG humana se llevó a cabo basándose en el método descrito en 3-2 anterior. El método para medir IgM de pollo es el siguiente.
Es decir, se dispensaron 20 |il de anticuerpo de cabra anti-IgM de pollo 1,0 |ig/ml (Bethyl, A30-102A) en una placa de 384 pocilios inmuno Maxisorp (Nunc, 464718), y después se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora o más, de modo que se inmovilizó en la placa. Posteriormente, se lavó el resultante con una disolución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %) cinco veces, y luego se añadieron 50 |il de una disolución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %) a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Posteriormente, se lavó el resultante con una disolución de lavado cinco veces, y entonces se añadieron 20 |il de una muestra de medición o suero de pollo (GIBCO, 16110) que sirve como sustancia patrón a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y entonces se añadieron 20 |il de anticuerpo de cabra anti-IgM de pollo conjugado con HRP (Bethyl, A30-102P), que se había diluido 5000 veces con PBS que contenía BSA al 1 % y Tween 20 al 0,05 % a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado cinco veces, entonces se añadieron 20 |il de TMB+ (Dako, S159985) a la misma, y la mezcla obtenida se sometió a una reacción de coloración a temperatura ambiente durante 3 minutos. Posteriormente, se añadieron 20 |il de ácido sulfúrico 1 N a la mezcla de reacción para finalizar la reacción. Usando Infinite M1000 (TECAN), se midió la absorbancia a 450 nm.
Los resultados se muestran en la tabla 15. Se confirmó que, como con 13-1 anterior, solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgG1 humana a partir de las líneas celulares transformadas n.o 7-7, n.o 11-3 y n.o 11-6.
[Tabla 15]
19. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 10 anterior, se confirmó la conversión génica. Usando, como molde, el ADN genómico extraído de las células, que se habían cultivado durante 42 días en presencia de TSA, por el método descrito en 4 anterior, se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56) y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia basándose en el método descrito en 4 anterior. Los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular n.° 11-6 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 16 y la tabla 17, respectivamente. Se encontró un clon que comprendía una secuencia derivada de pseudogén humano insertada adicionalmente en las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, y se demostró que se generaron más secuencias diferentes que en el caso de la línea celular L15/H15 como resultado de la conversión génica. Además, también se confirmó que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en otras líneas celulares.
[Tabla 16]
[Tabla 17]
Producción de la línea celular L30/H30. en la que se han insertado 30 regiones de pseudogén que consisten cada una en una secuencia derivada de región variable humana en la cadena ligera, v se han insertado 30 de tales regiones de pseudogén en la cadena pesada.
20. Activación en pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo (IgX)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano (pVL30)
Basándose en las secuencias de regiones variables de inmunoglobulina X humana en la base de datos. se seleccionaron 30 secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3, y entonces se combinó con las mismas la secuencia marco de la región variable de IgX humana clonada en 1-1 anterior. para diseñar 30 secuencias. concretamente. pVL101 (SEQ ID NO: 74). pVL102 (SEQ ID NO: 75). pVL103 (SEQ ID NO: 76). pVL104 (SEQ ID NO: 77). pVL105 (SEQ ID NO: 78). pVL106 (SEQ ID NO: 79). pVL107 (SEQ ID NO: 80). pVL108 (SEQ ID NO: 81). pVL109 (SEQ ID NO: 82). pVL110 (SEQ ID NO: 83). p V L III (SEQ ID NO: 84). pVL112 (SEQ ID NO: 85). pVL113 (SEQ ID NO: 86). pVL114 (SEQ ID NO: 87). pVL115 (SEQ ID NO: 88). pVL116 (SEQ ID NO: 127). pVL117 (SEQ ID NO: 128). pVL118 (SEQ ID NO: 129). pVL119 (SEQ ID NO: 130). pVL120 (SEQ ID NO: 131). pVL121 (SEQ ID NO: 132). pVL122 (SEQ ID NO: 133). pVL123 (SEQ ID NO: 134). pVL124 (SEQ ID NO: 135). pVL125 (SEQ ID NO: 136). pVL126 (SEQ ID NO: 137). pVL127 (SEQ ID NO: 138). pVL128 (SEQ ID NO: 139). pVL129 (SEQ ID NO: 140) y pVL130 (SEQ ID NO: 141). Posteriormente. se diseñó una secuencia de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo humano pVL30 (SEQ ID NO: 142) que comprende estas secuencias. v después se sometió a síntesis génica.
(2) Construcción del vector de direccionamiento
La secuencia de pseudogén humano pVL30 sintetizada en la sección anterior se incorporó en el sitio de clonación múltiple del pVL KI_pUC19_step6_Br Rev en 16-2 anterior. para construir un vector de direccionamiento pVL KI_pUC 19_step6_BrRev_#odd+even (Se Q ID NO: 143) como se muestra en la figura 26.
21. Producción de líneas celulares
El pVL KI_pUC19_step6_BrRev_#odd+even preparado en 20 anterior se introdujo en la línea celular L15/H30 producida en 17 anterior para producir líneas celulares.
El pVL KI_pUC19_step6_BrRev_#odd+even. que se había linealizado con la enzima de restricción NotI. se introdujo en la línea celular mencionada anteriormente. v la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 pg/ml de blasticidina. Posteriormente. las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR. para confirmar que se había producido sustitución en un locus génico de interés. Posteriormente. se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células. v las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente. las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR. para obtener las líneas celulares n.07-7-48-5. n.07-7-48-7 v n.07-7-48-10. de cada una de las cuales se habían eliminado los genes de resistencia a fármacos.
22. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo v ELISA)
22-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 21 anterior. Los resultados se muestran en la figura 27. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron Igy e IgT, humanas en las líneas celulares transformadas n.° 7-7-48-5, n.07-7-48-7 y n.07-7-48-10 (figura 27).
22-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 18-2 anterior, se midieron los anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 21 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 18. Como con 13-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgGi humana a partir de las líneas celulares transformadas n.o 7-7-48-5, n.o 7-7-48-7 y n.o 7-7-48-10.
[Tabla 18]
23. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 22 anterior, se confirmó la conversión génica. Usando, como molde, el ADN genómico extraído de las células, que se habían cultivado durante 42 días en presencia de TSA, por el método descrito en 4 anterior, se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56), y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia basándose en el método descrito en 4 anterior. Los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular n.° 7-7-48-10 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 19 y la tabla 20, respectivamente. Se encontró un clon que comprende la secuencia derivada de pseudogén humano insertada adicionalmente en las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, y se demostró que se generaron más secuencias diferentes aumentando el número de pseudogenes. Además, también se confirmó que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en otras líneas celulares.
[Tabla 19]
[Tabla 20]
Producción de la línea celular L30/H15. en la que se han insertado 30 regiones de pseudogén que consisten cada una en una secuencia derivada de región variable humana en la cadena ligera, v se han insertado 15 de tales regiones de pseudogén en la cadena pesada.
24. Producción de líneas celulares
El pVL KI_pUC19_step6_BrRev_#odd+ preparado en 20 anterior se introdujo en la línea celular L15/H15 A12-4 producida en 17 anterior para producir líneas celulares.
El pVL KI_pUC19_step6_BrRev_pVL#odd+even, que se había linealizado con la enzima de restricción Notl, se introdujo en la línea celular mencionada anteriormente. v la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418 y 10 pg/ml de blasticidina. Posteriormente. las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, para confirmar que se había producido sustitución en un locus génico de interés. Posteriormente. se introdujo Cre_pEGFP-C1 en las células, v las células resultantes se sometieron luego a clasificación celular para seleccionar células positivas para GFP. Posteriormente, las células seleccionadas se sometieron a genotipado por PCR, para obtener las líneas celulares A77-3 y A77-2, de cada una de las cuales se habían eliminado los genes de resistencia a fármacos.
25. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
25-1. Análisis por dtometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 24 anterior. Los resultados se muestran en la figura 28. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron Igy e IgT, humanas en las líneas celulares transformadas A77-3 y A77-2 (figura 28).
25-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron los anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 24 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 21. Como con 13-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgGi humana a partir de las líneas celulares transformadas A77-3 y A77-2.
[Tabla 21]
Producción de las líneas celulares L30/H15f15f y L30/H15r15f, en las que se han insertado 30 regiones de pseudogén que consisten cada una en una secuencia derivada de región variable humana en la cadena ligera y se han insertado 30 de tales regiones de pseudogén en la cadena pesada de acuerdo con el método RMCE.
26. Producción de vectores
26-1. Inserción adicional de 15 pseudogenes construidos en dirección directa en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano (pVH15a)
La pVH116, pVH117, pVH118, pVH119, pVH120, pVH121, pVH122, pVH123, pVH124, pVH125, pVH126, pVH127, pVH128, pVH129 y pVH130, que se habían diseñado en 16 anterior, se ligaron entre sí en la dirección directa, para producir pVH15a (SEQ ID NO: 144).
(2) Construcción del vector
Se insertaron la secuencia de Loxm3 rev, el gen de resistencia a neomicina, el terminador de poli A temprano de SV40, la región de poliadenilación de SV40, la secuencia de loxP for RE, pVH15a (dirección inversa) y la secuencia de loxm7 rev LE en un vector pUC57-Amp, para producir un vector RMCE_pVH1stKl_pVH15evenFor (SEQ ID NO: 145) como se muestra en la figura 29.
26-2. Inserción adicional de 15 pseudogenes construidos en dirección inversa en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
Se insertaron la secuencia de Loxm3 rev, el gen de resistencia a neomicina, el terminador de poli A temprano de SV40, la región de poliadenilación de SV40, la secuencia de loxP for RE, pVH15a (dirección inversa) y la secuencia loxm7 rev LE en un vector pUC57-Amp, para producir un vector RMCE_pVH1stKI_pVH15evenRev (SEQ ID NO: 146) como se muestra en la figura 29.
27. Producción de líneas celulares
Se produjo una línea celular L30/H15f15f introduciendo el RMCE_pVH1stKI_pVH15evenFor producido en 26-1 anterior en la línea celular L30/H15 producida en 24 anterior.
Se introdujo el RMCE_pVH1stKI_pVH15evenFor, junto con Cre_pEGFP-C1, en la línea celular mencionada anteriormente para inducir la recombinación específica de sitio, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvieron las líneas celulares 1-6-1 y 1-7-3, en las que se confirmó que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés.
Se produjo una línea celular L30/H15r15f Introduciendo la RMCE_pVH1stKI_pVH15evenRev producido en 26-2 en la línea celular L30/H15 producida en 24 anterior.
Se Introdujo el RMCE_pVH1stKI_pVH15evenRev, junto con CrepEGFP-C1, en la línea celular mencionada anteriormente para inducir la recombinación específica del sitio, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvieron las líneas celulares 2-1-1 y 7-3-2, en el que se confirmó que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés.
28. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
28-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 27 anterior. Los resultados se muestran en la figura 30. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron Igy e IgT, humanas en las líneas celulares transformadas 1 -6-1, 1-7-3, 2-1-1 y 7-3-2 (figura 30).
28-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron Ios anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 27 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 22. Como con 13-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgGi humana a partir de las líneas celulares transformadas 1 -6-1, 1-7-3, 2-1-1 y 7-3-2.
[Tabla 22]
29. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 10 anterior, se confirmó la conversión génica. Usando, como molde, el ADN genómico extraído de las células, que se habían cultivado durante 42 días en presencia de TSA, por el método descrito en 4 anterior, se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56), y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia basándose en el método descrito en 4 anterior. Los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular 1 -6-1 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 23 y la tabla 24, respectivamente, y Ios resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular 7 3-2 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 25 y la tabla 26, respectivamente. Se encontró un clon que comprende la secuencia derivada de pseudogén humano insertada adicionalmente en las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, y se demostró que se generó una variedad de secuencias como en el caso de la línea celular L30/H30. Además, también se confirmó que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en otras líneas celulares.
[Tabla 23]
[Tabla 24]
[Tabla 25]
[Tabla 26]
Producción de las líneas celulares L3Q/H15f15f15f v L3Q/H15r15r15f. en las que se han insertado 30 regiones de pseudogén que consisten cada una en una secuencia derivada de la región variable humana en la cadena ligera v se han insertado 45 de tales regiones de pseudogén en la cadena pesada de acuerdo con el método RMCE.
30. Producción del vector
30-1. Inserción adicional de 15 pseudogenes construidos en dirección directa en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano (pVH15b)
Basándose en las secuencias de una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina humana en la base de datos. se seleccionaron 15 secuencias de CDR1. CDR2 y CDR3 novedosas. v pVH131 (SEQ ID NO: 147). pVH132 (SEQ ID NO: 148). pVH133 (SEQ ID NO: 149). pVH134 (SEQ ID NO: 150). pVH135 (SEQ ID NO: 151). pVH136 (SEQ ID NO: 152). pVH137 (SEQ ID NO: 153). pVH138 (SEQ ID NO: 154). pVH139 (SEQ ID NO: 155). pVH140 (SEQ ID NO: 156). pVH141 (SEQ ID NO: 157). pVH142 (SEQ ID NO: 158). pVH143 (SEQ ID NO: 159). pVH144 (SEQ ID NO: 160) v pVH145 (SEQ ID NO: 161) se ligaron entre sí en la dirección directa para producir pVH15b (SEQ ID NO: 162).
(2) Construcción del vector
La secuencia de Loxm3 rev, el gen de resistencia a blasticidina, el terminador de poli A temprano de SV40, la región de poliadenilación de SV40, la secuencia de loxm7 rev RE, pVH15b (dirección directa) y la secuencia de IoxP for LE se insertaron en un vector pUC57-Amp, para producir un vector pVH15B-ver3_RMCE2nd_For (SEQ ID NO: 163) como se muestra en la figura 31.
30-2. Inserción adicional de 15 pseudogenes construidos en dirección inversa en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
La secuencia de Loxm3 rev, el gen de resistencia a blasticidina, el terminador de poli A temprano de SV40, la región de poliadenilación de SV40, la secuencia de loxm7 rev RE, pVH15b (dirección inversa) y secuencia de IoxP for LE se insertaron en un vector pUC57-Amp, para producir un vector pVH15B-ver3_RMCE2nd_Rev (SEQ ID NO: 164) como se muestra en la figura 3 l.
31. Producción de líneas celulares
Se produjo una línea celular L30/H15f15ff introduciendo el pVH15B-ver3_RMCE2nd_For producido en 30-1 anterior en la línea celular L30/H15f15f producida en 2 anterior.
El pVH15B-ver3_RMCE2nd_For, junto con Cre_pEGFP-C1, se introdujo en la línea celular mencionada anteriormente para inducir la recombinación específica de sitio, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvieron las líneas celulares 2-1-3, 2-1-11, 1 -n-1 y 2-n-3, en las que se confirmó que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés.
Se produjo una línea celular L30/H15r15r15f introduciendo el pVH15B-ver3_RMCE2nd_Rev producido en 27-2 anterior en la línea celular L30/H15r15f producida en 27 anterior.
El pVH15B-ver3RMCE2nd_Rev, junto con Cre_pEGFP-C1, se introdujo en la línea celular mencionada anteriormente para inducir la recombinación específica de sitio, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 10 |ig/ml de blasticidina. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvieron las líneas celulares 4-1-5, 4-1-7 y 3-1-11, en las que se confirmó que la sustitución se había producido en un Iocus génico de interés.
32. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
32-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 31 anterior. Los resultados se muestran en la figura 32 y la figura 33. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron Igy e IgX humanas en las líneas celulares transformadas 2-1-3, 2-1-11, 1 -n-1 y 2-n-3 (que se muestran en la figura 32), y en las líneas celulares transformadas 4-1-5, 4-1-7 y 3-1-11 (que se muestran en la figura 33).
32-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron Ios anticuerpos secretados de las células producidas en 31 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 27. Como con 13-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgGi humana a partir de las líneas celulares transformadas 2-1-3, 2-1-11, 1-n-1, 2-n-3, 4-1-5, 4-1-7 y 3-1-11.
[Tabla 27]
33. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 10 anterior, se confirmó la conversión génica. Usando, como molde, el ADN genómico extraído de las células, que se habían cultivado durante 42 días en presencia de TSA, por el método descrito en 4 anterior, se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se había añadido una secuencia de reconocimiento (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGC AGGC) (SEQ ID NO: 46), d, y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56), y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia basándose en el método descrito en 4 anterior. Los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular 2-1-3 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 28 y la tabla 29, y los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular 3-1-11 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 30 y la tabla 31, respectivamente. Se encontró un clon que comprende la secuencia derivada de pseudogén humano insertada adicionalmente en las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, y se demostró que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica. Además, también se confirmó que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en otras líneas celulares.
[Tabla 28]
[Tabla 29]
[Tabla 30]
[Tabla 31]
Producción de las líneas celulares L3Q/H15f15f15f v L3Q/H15r15r15r15f. en las que se han insertado 30 regiones de pseudogén que consisten cada una en una secuencia derivada de región variable humana en la cadena ligera v se han insertado 60 de tales regiones de pseudogén en la cadena pesada de acuerdo con el método RMCE.
34. Producción del vector
34-1. Inserción adicional de 15 pseudogenes construidos en dirección directa en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
(1) Secuencia de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo humano (pVH15c)
Basándose en las secuencias de regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina humana en la base de datos, se seleccionaron 15 secuencias de CDR1, CDR2 y CDR3 novedosas, y pVH146 (SEQ ID NO: 165), pVH147 (SEQ ID NO: 166), pVH148 (SEQ ID NO: 167), pVH149 (SEQ ID NO: 168), pVH150 (SEQ ID NO: 169), pVH151 (SEQ ID NO: 170), pVH152 (SEQ ID NO: 171), pVH153 (SEQ ID NO: 172), pVH154 (SEQ ID NO: 173), pVH155 (SEQ ID NO: 174), pVH156 (SEQ ID NO: 175), pVH157 (SEQ ID NO: 176), pVH158 (SEQ ID NO: 177), pVH159 (SEQ ID NO: 178) y pVHl60 (SEQ ID NO: 179) se ligaron entre sí en la dirección directa para producir pVH15c (SEQ ID NO: 180).
(2) Construcción del vector
La secuencia de Loxm3 rev, el gen de resistencia a neomicina, el terminador de poli A temprano de SV40, la región de poliadenilación de SV40, la secuencia de IoxP for RE, pVH15c (dirección de avance) y la secuencia de loxm7 rev LE se insertaron en un vector pUC57-Amp, para producir un vector pVH15ARMCE1st_Fw (SEQ ID NO: 181) como se muestra en la figura 34.
34-2. Inserción adicional de 15 pseudogenes construidos en dirección inversa en la región de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo (IgM)
La secuencia de Loxm3 rev, el gen de resistencia a neomicina, el terminador de poli A temprano de SV40, la región de poliadenilación de SV40, la secuencia de IoxP for RE, pVH15c (dirección inversa) y la secuencia de loxm7 rev LE se insertaron en un vector pUC57-Amp, para producir un vector pVH15A_RMCE1st_Rv (SEQ ID NO: 182) como se muestra en la figura 34.
35. Producción de líneas celulares
Se produjo una línea celular L30/H15f15f15f mediante la introducción del pVH15A_RMCE1st_Fw producido en 34-1 anterior en la línea celular L30/H15f15f producida en 31 anterior.
El pVH15A_RMCE1st_Fw, junto con Cre_PEGFP-C1, se introdujo en la línea celular mencionada anteriormente para inducir la recombinación específica de sitio, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvieron las líneas celulares ln l-3 , ln l-4 y I n l -5, en las que se confirmó que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés.
Se produjo una línea celular L30/H15r15r15r15f introduciendo el pVH15A_RMCE1st_Rv producido en 34-2 anterior en la línea celular L30/H15r15r15f producida en 31 anterior.
El pVH15ARMCElst Rv , junto con Cre_pEGFP-C1, se introdujo en la línea celular mencionada anteriormente para inducir la recombinación específica de sitio, y la mezcla obtenida se cultivó luego en un medio que contenía 2 mg/ml de G418. Posteriormente, las células en crecimiento se sometieron a genotipado por PCR, y se obtuvo una línea celular 3111-1, en la que se confirmó que se había producido sustitución en un Iocus génico de interés.
36. Confirmación de la expresión de anticuerpo (citometría de flujo y ELISA)
36-1. Análisis por citometría de flujo
Basándose en el método descrito en 3 anterior, se confirmó la expresión de un anticuerpo en las células producidas en 35 anterior. Los resultados se muestran en la figura 35. Se confirmó que solo se expresó IgM de pollo en DT40 de tipo silvestre, mientras que la expresión de IgM de pollo desapareció y, en su lugar, se expresaron Igy e IgX humanas en las líneas celulares transformadas ln l-3 , ln l-4 , ln l-5 y 3111-1 (figura 35).
36-2. Análisis de ELISA
Basándose en el método descrito en 3-2 anterior, se midieron Ios anticuerpos secretados a partir de las células producidas en 35 anterior. Los resultados se muestran en la tabla 32. Como con 13-1 anterior, se confirmó que solo se secretó IgM de pollo a partir de DT40 de tipo silvestre, mientras que se secretó IgGi humana a partir de las líneas celulares transformadas ln l-3 , ln l-4 , ln l-5 y 3111-1.
[Tabla 32]
37. Confirmación de la conversión génica
Usando las líneas celulares en las que se había confirmado la expresión de un anticuerpo en 10 anterior, se confirmó la conversión génica. Usando, como molde, el ADN genómico extraído de las células, que se habían cultivado durante 42 días en presencia de TSA, por el método descrito en 4 anterior, se amplificó una región variable de cadena ligera por PCR usando un cebador sentido al que se le había añadido una secuencia de reconocimiento (GTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNCAGGTTCCCTGGTGCA GGC) (SEQ ID NO: 46), y un cebador antisentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCTTGGTCCCTCCGCCGAA) (SEQ ID NO: 47), y se amplificó una región variable de cadena pesada por PCR usando un cebador sentido (CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGTCCGTCAGCGCTCTCT) (SEQ ID NO: 56), y un cebador antisentido al que se le había añadido una etiqueta de identificación (CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGNNNNNNNNNNTGGGGGGGGTTCATA TGAAG) (SEQ ID NO: 57). Posteriormente, se llevaron a cabo análisis de secuencia basándose en el método descrito en 4 anterior. Los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular ln l-3 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 33 y la tabla 34, y los resultados del análisis de secuencia realizado en las regiones variables de la cadena ligera y la cadena pesada en la línea celular 3111-1 (Ios 10 superiores) se muestran en la tabla 35 y la tabla 36, respectivamente. Se encontró un clon que comprende la secuencia derivada de pseudogén humano insertada adicionalmente en las regiones variables tanto de la cadena ligera como de la cadena pesada, y se demostró que se generaron más secuencias diversas como resultado de la conversión génica. Además, también se confirmó que se generó una variedad de secuencias como resultado de la conversión génica incluso en otras líneas celulares.
[Tabla 33]
[Tabla 34]
[Tabla 35]
[Tabla 36]
Selección de anticuerpos 1
38. Preparación del antígeno
Se seleccionó plexina A4 como proteína antigénica. La plexina A4 es una molécula que pertenece al tipo de plexina A, y se ha conocido como factor para controlar la extensión del axón en el nervio sensorial o el nervio simpático.
Como antígeno, se usó plexina A4, en la que se añadieron etiquetas FLAG a los extremos C terminales de un dominio Sema y un dominio PSI (plexina-semaforina-integrina) (la secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 68). Basándose en el n.0 de registro NM_020911 y el n.0 de registro EAW83796, se sintetizó la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 67, y después se insertó en un vector de expresión en el que se habían delecionado el gen de EBNA-1 y el gen de resistencia a higromicina de pCEP4 (Life Technologies, V044-50), construyendo así un vector de expresión de plexina A4.
El vector de expresión de plexina A4 obtenido se introdujo en células FreeStyle 293 (Life Technologies, R790-07), usando PEI (polietilenimina), de modo que se permitió que se expresara en las mismas. En ese momento, también se introdujo en las células un vector de expresión que comprendía un gen de EBNA-1, por separado. La expresión se llevó a cabo a escala de 3 l, y el cultivo se llevó a cabo durante 7 días.
Utilizando las etiquetas FLAG, se purificó una proteína de interés en el sobrenadante de cultivo. Se cargó una columna XK16/20 (GE Healthcare, 28-9889-37) con 2,5 ml de resina anti-M2-agarosa (Sigma, A2220), y después se equilibró con D-PBS(-) (Wako Puré Chemical Industries, Ltd., 045-29795). Posteriormente, se cargó el sobrenadante de cultivo en la misma, se lavó con D-PBS(-) y después se eluyó con D-PBS(-) que contenía 0,1 mg/ml de péptido FLAG (Sigma, F3290). El resultante se monitorizó con la absorbancia a 280 nm, y luego se recuperó una fracción correspondiente al pico. El peso molecular de la proteína recuperada se midió mediante SDS-PAg E y tinción con CBB, y luego se confirmó que el peso molecular obtenido correspondía al peso molecular de la proteína de interés.
Usando una membrana de ultrafiltración (Amicon, UFC08010808), se concentraron aproximadamente 24 ml de la fracción recuperada hasta un volumen de 2 ml, y luego, usando Hi Load 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare, 28 9893-35), se purificó la fracción por cromatografía de filtración en gel. La columna se equilibró con D-PBS(-), y la fracción recuperada se cargó entonces sobre la misma, seguido de elución con D-PBS(-). El resultante se monitorizó con la absorbancia a 280 nm, y luego se recuperó una fracción correspondiente al pico. El peso molecular de la proteína recuperada se midió mediante SDS-PAGE y tinción con CBB.
39. Selección del anticuerpo
39-1. Producción de perlas magnéticas de antígeno
Usando Dynabeads M-270 Carboxylic Acid (Life Technologies, 14305D) y Dynabeads M-270 Epoxy (Life Technologies, 14301) como perlas magnéticas, se permitió que estas perlas se unieran al antígeno de acuerdo con el manual de instrucciones. En este momento, se usó MPC-S (Life Technologies, DBA13346) como soporte magnético. Con respecto a Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, se lavaron 10 jj.1 de perlas con 20 |il de MES 25 mM (pH 5,0) tres veces, y se añadieron 10 |il de disolución de NHS 50 mg/ml y 10 |il de disolución de EDC 50 mg/ml a la disolución resultante. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos, y la disolución de reacción se lavó luego con 20 |il de MES 25 mM (pH 5,0) dos veces. Se retiró un sobrenadante de esta suspensión de perlas magnéticas, y se añadieron entonces a la suspensión 10 |il de disolución de proteína plexina A4, que se había ajustado a 0,6 mg/ml con MES 25 mM (pH 5,0). La mezcla obtenida se hizo reaccionar a 4°C durante la noche, mientras se sometía a agitación rotatoria. Posteriormente, se retiró un sobrenadante de la disolución de reacción, y luego se añadieron 20 |il de tampón de extinción (Tris-HCl 50 mM) a la misma, seguido de la reacción de la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos mientras se sometía a agitación rotatoria. Con respecto a Dynabeads M-270 Epoxy, se lavaron 10 |il de perlas con 20 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM tres veces, y posteriormente, se añadieron 13,3 |il de disolución de proteína plexina A4 ajustada a 0,45 mg/ml con tampón de fosfato de sodio 100 mM y 6,7 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM que contenía sulfato de amonio 3 M y se suspendieron en la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a 37°C durante la noche, mientras se sometía a agitación rotatoria. Después de la eliminación de un sobrenadante, los dos tipos de perlas se suspendieron conjuntamente en 1 ml de tampón de selección (PBS que contenía BSA al 1 %), y la suspensión obtenida se lavó luego con el mismo tampón que se mencionó anteriormente tres veces. Posteriormente, el resultante se suspendió en 200 |il de tampón de selección, y después se sometió a selección.
39-2. Selección por perlas magnéticas de antígeno
Se cultivó una línea celular L15/H15, B7-3, en un medio que contenía 2,5 ng/ml de TSA durante 3 semanas. Posteriormente, se lavaron aproximadamente 1 x 108 células con 10 ml de tampón de selección, y después se retiró un sobrenadante de la disolución de reacción. La disolución restante se lavó con 1 ml de tampón de selección, y después se suspendió en 950 |il de tampón de selección. A esta suspensión celular, se le añadieron 50 |il de las perlas
magnéticas de antígeno preparadas en 17-1 anterior, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a 4°C durante 30 minutos, mientras se agitaba por rotación. Posteriormente, usando KingFisher mL (Thermo, 540005o), se lavó la disolución de reacción con 0,5 ml de tampón de selección tres veces. Posteriormente, las células recuperadas se suspendieron en 20 ml de medio, la suspensión se sembró luego en una placa de 9 cm, y luego se cultivó en una incubadora de CO2 durante 7 días.
39-3. Cribado por citometría de flujo
Se recuperó la disolución de cultivo celular obtenida en 39-2 anterior, y luego se fraccionaron 3 x 106 células en un tubo de 1,5 ml. Las células se centrifugaron para eliminar un sobrenadante, y las células resultantes se lavaron luego con 1,5 ml de PBS para eliminar un sobrenadante. Usando el kit de biotinilación de NHS-PEG4 EZ-Link (marca registrada) (PIERCE, 21455), se preparó una proteína plexina A4 marcada con biotina, y entonces se añadieron 300 |il de disolución de tinción primaria (2,5 |ig/ml de disolución de proteína plexina A4 marcada con biotina) a la proteína. La mezcla obtenida se dejó en reposo a 4°C en condiciones de protección contra la luz durante 60 minutos. Posteriormente, se retiró el sobrenadante por centrifugación, y después se lavó el resultante con 500 |il de PBS dos veces. Después de eso, se añadieron al resultante 300 |il de disolución de tinción secundaria, en la que habían diluido anticuerpo de cabra específico anti-cadena gamma de IgG humana conjugado con R-FITC (Southern Biotech, A2040-02) y conjugado con estreptavidina PE (eBioscience, 12-4317-87) con tampón 1000 veces y 500 veces, respectivamente, y la mezcla obtenida se dejó en reposo a 4°C en condiciones de protección contra la luz durante 60 minutos. Posteriormente, se retiró el sobrenadante por centrifugación, y después se lavó el resultante con 500 |il de PBS dos veces. Se suspendió el resultante en 500 |il de tampón FACS (que contenía disolución de Pl (Invitrogen, P3566), que se había diluido 1000 veces con PBS). Esta muestra se sometió a un análisis de citometría de flujo. Los resultados se muestran en la figura 36. Se descubrió una población celular, en la que las señales tanto de la proteína plexina A4 como de IgGy eran altas, en el área P5.
39- 4. Cribado mediante el método de ELISA con antígeno inmovilizado
Se recuperó el sobrenadante de cultivo celular obtenido en 39-3 anterior, y se cribó un clon que reacciona con un antígeno de plexina A4 mediante un método ELISA con antígeno inmovilizado usando un antígeno de plexina A4 de este tipo.
En primer lugar, se dispensaron 20 |il de disolución que comprende una proteína de antígeno de plexina A4 2,5 |ig/ml y un control negativo que era un inhibidor de tripsina (Sigma, T6522), estreptavidina (Nacalai Tesque Inc., 32243) u ovoalbúmina (Sigma, A5503) en una placa de 384 pocilios inmuno Maxisorp (Nunc, 464718), y después se hizo reaccionar a 4°C durante la noche, de modo que se inmovilizó en la placa. Posteriormente, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05 %) tres veces, y después se añadieron a la misma 45 |il de disolución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %). La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado tres veces, luego se añadieron 25 |il de una muestra de medición a la misma, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado tres veces, luego se añadieron a la misma 25 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-Fc conjugado con HRP (Bethyl, A80-104P), que se había diluido 2000 veces con tampón PBS, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado tres veces, luego se añadieron 25 |il de TMB+ (Dako, S159985) a la misma, y la mezcla obtenida se sometió después a una reacción de coloración durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 25 |il de ácido sulfúrico 1 M a la mezcla de reacción, para terminar la reacción. Usando Infinite M1000 (TECAN), se midió la absorbancia a 450 nm. Los resultados se muestran en la figura 37. Se demostró que se generó un anticuerpo que reacciona específicamente con plexina A4 en casi todos los clones.
De acuerdo con el cribado en el que la citometría de flujo descrita en 39-3 anterior se combinó con el método ELISA con antígeno inmovilizado descrito en 39-4 anterior, pudo identificarse un clon positivo que se une específicamente a la plexina A4. Además del caso de B7-3, incluso en selecciones en las que se usaron la línea celular L15/H30 n.° 11 6 y la línea celular L30/H307-7-48-10, pudo identificarse un clon positivo que se une específicamente a la plexina A4.
40. Confirmación de la expresión del anticuerpo anti-plexina A4
40- 1. Análisis de ELISA
Entre los clones positivos identificados en 39-5 anterior, con respecto a los clones positivos n.° 62 y n.° 20, se midieron las concentraciones de IgM de pollo e IgGi humana secretadas en el sobrenadante de cultivo. Cada línea celular se suspendió en un medio que no contenía suero de pollo para dar como resultado 4 x 105 células/ml, y se sembró 1 ml de cada una de las suspensiones en una placa de 24 pocilios. Las células se cultivaron durante 3 días, y la disolución de cultivo se recuperó y después se filtró a través de un filtro de 0,22 |im. Posteriormente, las células resultantes se usaron en la medición.
El método para medir IgG es el siguiente. Se dispensaron 100 |il de anticuerpo de cabra anti-IgG humana-Fc purificado
por afinidad (Bethyl, A80-104A), que se había ajustado a 1,0 |ig/ml por dilución con PBS, en una placa F96 Maxisorp Nunc Immunoplate (Nunc, 464718), y después se hizo reaccionar a 4°C durante 1 hora, de modo que se inmovilizó en la placa. Posteriormente, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%) cinco veces, y después se añadieron 200 |il de disolución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %) a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 95 minutos. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y luego se añadieron 100 |il de una muestra de medición o IgGI humana Lambda-UNLB (Southern Biotech, 0151L-01) que sirve como una sustancia patrón a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y luego se añadieron a la misma 100 |il de anticuerpo de cabra anti-lgG humana-Fc conjugado con HRP (Bethyl, A80-104P), que se había diluido 1000 veces con PBS. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado tres veces, y luego se añadieron a la misma 100 |il de TMB+ (Dako, S159985). La mezcla obtenida se sometió a una reacción de coloración a temperatura ambiente durante 3 minutos, y luego se añadieron 20 |il de ácido sulfúrico 1 M a la misma, para terminar la reacción. Usando Infinite M1000 (TECAN), se midió la absorbancia a 450 nm.
El método para medir IgM es el siguiente. Se dispensaron 100 |il de anticuerpo de cabra anti-lgM de pollo (Bethyl, A30-102A), que se había diluido con PBS hasta 1,0 |ig/ml, en una placa F96 Maxisorp Nunc Immunoplate (Nunc, 439454), y después se hizo reaccionar a 4°C durante la noche, de modo que se inmovilizó en la placa. Posteriormente, la mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,05%) cinco veces, y después se añadieron 200 |il de disolución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %) a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 95 minutos. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y se añadieron a la misma 100 |il de suero de pollo (GIBCO, 16110) que sirve como muestra de medición o sustancia patrón. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y luego se añadieron a la misma 100 |il de IgM de anticuerpo de cabra anti-lgM de pollo conjugado con HRP (Bethyl, a 30-102P), que se había diluido 5000 veces con PBS que contenía BSA al 1 % y Tween 20 al 0,05 %. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y luego se añadieron a la misma 100 |il de TMB+ (Dako, S159985). La mezcla obtenida se sometió a una reacción de coloración a temperatura ambiente durante 3 minutos, y después se añadieron 100 |il de ácido sulfúrico 1 N a la misma, para terminar la reacción. Usando Infinite M1000 (TECAN), se midió la absorbancia a 450 nm.
Los resultados de la medición se muestran en la tabla 37. Se confirmó que se secretó IgGi humana a partir del clon n.° 20 y el clon n.° 62, y que el nivel de secreción de IgM de pollo era extremadamente pequeño.
[Tabla 37]
40-2. Análisis por inmunotransferencia de tipo Western
Se analizaron los anticuerpos secretados a partir de los clones positivos n.° 62 y n.° 20, que producen el anticuerpo reactivo con antígeno obtenido en 17-4 anterior, de acuerdo con inmunotransferencia de tipo Western.
Cada línea celular se suspendió en un medio que no contenía suero de pollo para dar como resultado 4 x 105 células/ml, y se sembró 1 ml de cada una de las suspensiones en una placa de 24 pocilios. Las células se cultivaron durante 3 días, y la disolución de cultivo que contenía la línea celular se recuperó y después se filtró a través de un filtro de 0,22 |i m (Millipore, SLGV J13 SL). Para la detección de lgy e IgX, se usó una muestra purificada con una columna de proteína A, y para la detección de IgM, se usó una muestra antes de la purificación. A una muestra usada en la detección en condiciones de reducción (muestra de reducción), se le añadió disolución de tratamiento de muestras de Tris-SDS-p-mercaptoetanol (COSMO BIO C o., Ltd., 423437) en una cantidad igual de la muestra mencionada anteriormente. Por otro lado, a una muestra usada en la detección en condiciones sin reducción (muestra sin reducción), se le añadió disolución de tratamiento de muestras de Tris-SDS (COSMO BIO C o., Ltd., 423420) en una cantidad igual de la muestra mencionada anteriormente. Posteriormente, la muestra de reducción se hizo reaccionar a 98°C durante 3 minutos, y la muestra sin reducción se hizo reaccionar a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, la muestra se sometió a electroforesis en un gel de poliacrilamida del 4 % al 20 % (COSMO BIO C o ., Ltd., 414879), y luego se transcribió sobre una membrana de nailon. Después de eso, se bloqueó con un tampón de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %), y después se hizo reaccionar con un anticuerpo primario (anticuerpo de cabra anti-IgG humana-fragmento Fc Ab-HRp (Betil, A80-104P), anticuerpo de cabra anti-IgG humana Lambda-HRP (Southern Biotech, 2070-05) y anticuerpo de cabra anti-IgG de pollo-HRP (Bethyl, A30-102P). El resultante se lavó con PBS que contenía Tween 20 al 0,1 % tres veces, y luego, se detectaron IgM de pollo, Igy humana (cadena pesada) e IgX humana (cadena ligera) mediante quimioluminiscencia usando ECL plus (GE Healthcare, RPN2132). Los
resultados se muestran en la figura 38 a la figura 40. De acuerdo con la Inmunotransferencla de tipo Western usando un anticuerpo anti-lgy, se detectó una banda de 55 kDa en condiciones de reducción, y se detectó una banda de aproximadamente 160 kDa en condiciones sin reducción (figura 38). De acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-IgX, se detectó una banda de 25 kDa en condiciones de reducción, y se detectó una banda de aproximadamente 160 kDa en condiciones sin reducción (figura 39). Además, de acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-lgM, no se detectaron señales (figura 40).
A partir de estos resultados, se confirmó que el anticuerpo producido por el clon positivo obtenido es un anticuerpo humano de longitud completa.
Selección de anticuerpos 2
41. Preparación del antígeno
Se seleccionó semaforina 3A (Sema3A) como proteína antigénica. Sema3A es una molécula que pertenece a la familia Sema3, y se ha conocido como un factor para controlar la extensión del axón en el nervio sensorial o el nervio simpático.
Como antígeno, se usó His-AP-hSema3A (SEQ ID NO: 183), en el que se añadieron una etiqueta His y fosfatasa alcalina humana (AP) al extremo N terminal de Sema3A. Se proporcionó una línea celular HEK293 que expresaba de manera estable esta proteína por el Departamento de Farmacología Molecular y Neurobiología, Universidad de la ciudad de Yokohama, Gradúate School of Medicine.
La expresión se llevó a cabo a úna escala de 4 l, y el cultivo se llevó a cabo durante 4 días. Utilizando etiquetas His, se purificó úna proteína de interés en el sobrenadante del cultivo. Se equilibraron 5 ml de HisTrap eXc EL (GE Healthcare, 17-3712-06) con disolución A (Na-fosfato 20 mM, NaCI 150 mM, imidazol 20 mM (pH 7,5), después se cargó un sobrenadante de cultivo en el mismo, y después se lavó con disolución A. Posteriormente, se llevó a cabo la elución por elución en gradiente en la que la disolución A se reemplazó linealmente por la disolución B (Na-fosfato 20 mM, NaCI 150 mM, imidazol 500 mM (pH 7,5)) a 25 volúmenes de columna. El resultante se monitorizó con la absorbancia a 280 nm, y luego se recuperó úna fracción correspondiente al pico. El peso molecular de la proteína recuperada se midió mediante SDS-PAGE y tinción con CBB, y luego se confirmó que el peso molecular obtenido correspondía al peso molecular de la proteína de interés.
Usando úna membrana de ultrafiltración (Amicon, UFC08010808), se concentraron aproximadamente 80 ml de la fracción recuperada hasta un volumen de 1,5 ml, y luego, usando Hi Load 16/600 Superdex 200 pg (GE Healthcare, 28-9893-35), la fracción se purificó por cromatografía de filtración en gel. La columna se equilibró con un tampón de elución (Na-fosfato 50 mM, NaCI 300 mM, arginina 400 mM, pH 7.0), y la fracción recuperada se cargó entonces sobre la misma, seguido de elución con el tampón de elución. El resultante se monitorizó con la absorbancia a 280 nm, y luego se recuperó úna fracción correspondiente al pico. El peso molecular de la proteína recuperada se midió mediante SDS-PAGE y tinción con CBB. Posteriormente, con el fin de eliminar la arginina del eluyente, se llevó a cabo la segunda cromatografía de filtración en gel con D-PBS(-). De manera similar, el resultante se monitorizó con la absorbancia a 280 nm, y luego se recuperó úna fracción correspondiente al pico. El peso molecular de la proteína recuperada se midió mediante SDS-PAGe y tinción con CBB.
42. Selección del anticuerpo
42-1. Producción de perlas magnéticas de antígeno
Usando Dynabeads M-270 Carboxylic Acid (Life Technologies, 14305D), Dynabeads M-270 Epoxy (Life Technologies, 14301) y Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown (Life Technologies, 10103D) como perlas magnéticas, se permitió que estas perlas se unieran al antígeno de acuerdo con el manual de instrucciones. En este momento, se usó MPC-S (Life Technologies, DBA13346) como soporte magnético. Con respecto a Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, se lavaron 40 |il de perlas con 80 |il de MES 25 mM (pH 5.0) tres veces, y se añadieron 40 |il de disolución de NHS 50 mg/ml y 40 |il de disolución de EDC 50 mg/ml a las perlas resultantes. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos, y la disolución de reacción se lavó luego con 80 |il de MES 25 mM (pH 5,0) dos veces. Se retiró un sobrenadante de esta suspensión de perlas magnéticas. Para la selección positiva, se añadieron 50,6 |il de disolución de proteína His-AP-hSema3A, que se había ajustado a 0,475 mg/ml con MES 25 mM (pH 5,0), a la disolución obtenida anteriormente para preparar úna suspensión. Para la selección negativa, se usó PBS en lugar de la disolución de antígeno, y se añadieron 50,6 |il de la disolución diluida con MES 25 mM (pH 5,0) a la disolución obtenida anteriormente para preparar úna suspensión. La suspensión obtenida se hizo reaccionar a 4°C durante la noche, mientras se sometía a agitación rotatoria. Posteriormente, se retiró un sobrenadante de la disolución de reacción, y luego se añadieron 80 |il de tampón de extinción (Tris-HCI 50 mM) a la misma, seguido de la reacción de la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos mientras se sometía a agitación rotatoria. Con respecto a Dynabeads M-270 Epoxy, se lavaron 40 |il de perlas con 80 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM tres veces. Posteriormente, para la selección positiva, se añadieron 53,3 |il de disolución de proteína His-AP-hSema3A ajustada
a 0,5 mg/ml con un tampón de fosfato de sodio 100 mM y 26,7 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM que contenía sulfato de amonio 3 M a las perlas obtenidas anteriormente para preparar una suspensión, y para la selección negativa, se usó PBS en lugar de la disolución de antígeno, y se añadieron 53,3 |il de la disolución diluida con MES 25 mM (pH 5,0) y 26,7 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM que contenía sulfato de amonio 3 M a las perlas obtenidas anteriormente para preparar una suspensión. La suspensión obtenida se hizo reaccionar a 37°C durante la noche, mientras se sometía a agitación rotatoria. Con respecto a Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown, se lavaron 8 |il de perlas con 80 |il de PBS tres veces. Posteriormente, para la selección positiva, se añadieron 101,9 |il de disolución de proteína His-AP-hSema3A que tenía una concentración de antígeno de 4,49 |iM a las perlas obtenidas anteriormente para preparar una suspensión, y para la selección negativa, se usaron 101,9 |il de PBS en lugar de la disolución de antígeno, y luego se añadió a las perlas obtenidas anteriormente para preparar una suspensión. La suspensión obtenida se hizo reaccionar a 4°C durante 10 minutos, mientras se sometía a agitación rotatoria. Después de la retirada de un sobrenadante, los tres tipos de perlas se suspendieron conjuntamente en 1 ml de tampón de selección (PBS que contenía BSA al 1 %), y la suspensión obtenida se lavó luego con el mismo tampón que se mencionó anteriormente tres veces. Posteriormente, se suspendió el resultante en 200 |il de tampón de selección, y después se sometió a selección.
42-2. Selección por microesferas magnéticas de antígeno
Se cultivó una línea celular L15/H15, B7-3, en un medio que contenía 2,5 ng/ml de TSA durante 86 días. Posteriormente, se lavaron aproximadamente 1,5 x 107 células con 10 ml de tampón de selección, y después se retiró un sobrenadante de la disolución de reacción. La disolución restante se lavó con 1 ml de tampón de selección, y después se suspendió en 950 |il de tampón de selección. A esta suspensión celular, se le añadieron 50 |il de las perlas magnéticas de antígeno para la selección negativa preparadas en 39-1 anterior, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a 4°C durante 30 minutos, mientras se agita por rotación. Posteriormente, usando KingFisher mL (Thermo, 540005o), se eliminaron las perlas magnéticas. Posteriormente, a esta suspensión celular, se le añadieron 50 |il de las perlas magnéticas de antígeno para la selección positiva, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a 4°C durante 30 minutos, mientras se agita por rotación. Posteriormente, usando KingFisher mL (Thermo, 540005o), se lavó la disolución de reacción con 1,7 ml de tampón de selección tres veces. Posteriormente, las células recuperadas se suspendieron en 20 ml de medio, la suspensión se sembró luego en una placa de 96 pocilios, y luego se cultivó en una incubadora de CO2.
42-3. Cribado primario
Se recuperó la disolución de cultivo celular obtenida en 42-2 anterior, y se cribó un clon que reaccionaba específicamente con un antígeno diana basándose en la reactividad antigénica de IgG secretora en ELISA con antígeno inmovilizado. Se dispensaron 20 |il de proteína antigénica y disolución de antígeno de control negativo (Hísubiquitina, ovoalbúmina, estreptavidina), que se había ajustado a 2,5 |ig/ml con PBS, en una placa de 384 pocilios inmuno Maxisorp (Nunc, 464718), y después se hizo reaccionar a 4°C durante la noche, de modo que se inmovilizó en la misma. El resultante se lavó con una disolución de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,o5%) cinco veces, y luego se añadieron 45 |il de una disolución de bloqueo (PBS que contenía BSA al 1 %) a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 115 minutos. La mezcla de reacción se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y luego se añadieron 25 |il de sobrenadante de cultivo a la misma. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente 130 minutos. Posteriormente, el resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, y se añadieron a la misma 25 |il de anticuerpo de cabra anti-lgG humana-Fc conjugado con HRP, que se había diluido 2000 veces con una disolución de bloqueo. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente 47 minutos. El resultante se lavó con una disolución de lavado cinco veces, luego se añadieron a la misma 25 |il de TMB+ (Dako, S159985), y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después durante 5 minutos. Posteriormente, se añadieron 25 |il de ácido sulfúrico 1 N a la mezcla de reacción, para terminar la reacción, y luego, usando un lector de microplacas, se midió la absorbancia a 450 nm (figura 41). La célula tiene una absorbancia de 0,1 o más y una razón S/N de 5 o más se determinó que era una célula positiva, y luego se sometió a cribado secundario.
42-4. Cribado secundario
Se recuperó el sobrenadante de cultivo celular obtenido en 42-3 anterior, y luego se sometió al cribado secundario de acuerdo con ELISA con antígeno inmovilizado basado en el método descrito en 42-3 anterior. La célula tiene una absorbancia de 0,5 o más y una razón S/N de 5 o más se determinó que era una célula positiva, y luego se sometió a monoclonación.
42-5. Cribado primario después de la monoclonación
Se recuperó el sobrenadante de cultivo celular obtenido en 42-4 anterior, y luego se sometió a cribado de acuerdo con ELISA con antígeno inmovilizado basado en el método descrito en 42-3 anterior. La célula tiene una absorbancia de 0,2 o más y una razón S/N de 5 o más se determinó que era una célula positiva, y luego se sometió a cribado secundario.
42- 6. Cribado secundario después de la monoclonación
Se recuperó el sobrenadante de cultivo celular obtenido en 42-5 anterior, y luego se sometió a cribado de acuerdo con ELISA con antígeno inmovilizado basado en el método descrito en 42-3 anterior. Se seleccionaron los clones positivos n.° 64, n.069 y n.077, que tenían una absorbancia de 0,5 o más y una razón S/N de 5 o más (figura 42).
43. Confirmación de la expresión del anticuerpo anti-His-AP-hSema3A
43- 1. Análisis de ELISA
Entre los clones positivos seleccionados en 42-6 anteriores, con respecto al clon positivo n.o 64, se midieron las concentraciones de IgM de pollo e IgGi humana secretadas en el sobrenadante de cultivo. El método de medición fue como se describió en 40-1 anterior.
Los resultados de la medición se muestran en la tabla 38. Se confirmó que, como con DT40 de tipo silvestre, se secretó IgG humana a partir del clon positivo n.° 64, y que la secreción de IgM de pollo no se observó.
[Tabla 38]
43-2. Análisis por inmunotransferencia de tipo Western
De acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western, se analizó un anticuerpo secretado a partir del clon positivo n.° 64 que produce un anticuerpo reactivo con antígeno obtenido en 42-6 anterior.
Cada línea celular se suspendió en un medio que no contenía suero de pollo para dar como resultado 4 x 105 células/ml, y se sembraron 20 ml de la suspensión en una placa de 9 cm. Las células se cultivaron durante 4 días, y se recuperó la disolución de cultivo que contenía la línea celular y después se filtró a través de un filtro de 0,22 |i m (Millipore, SLGV J13 SL). Para la detección de Igy e IgX, se usó una muestra purificada con una columna de proteína A, y para la detección de IgM, se usó una muestra antes de la purificación. A una muestra usada en la detección en condiciones de reducción (muestra de reducción), se le añadió disolución de tratamiento de muestras de Tris-SDS-pmercaptoetanol (COSMO BIO C o ., Ltd., 423437) en una cantidad igual de la muestra mencionada anteriormente. Por otro lado, a una muestra usada en la detección en condiciones sin reducción (muestra sin reducción), se le añadió disolución de tratamiento de muestras de Tris-SDS (COSMO BIO C o., Ltd., 423420) en una cantidad igual de la muestra mencionada anteriormente. Posteriormente, la muestra de reducción se hizo reaccionar a 98°C durante 3 minutos, y la muestra sin reducción se hizo reaccionar a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente, la muestra se sometió a electroforesis en XV PANTERA 5-20% T-HCL 10W (DRC, NXV-275HP), y después se transcribió sobre una membrana de PVDF. Después de eso, se bloqueó con un tampón de bloqueo (TBS que contenía leche desnatada al 5% y Tween 20 al 0,1 %), y después se hizo reaccionar con un anticuerpo primario (anticuerpo de cabra anti-IgG humana-fragmento Fc Ab-HRP (Betil, A80-104P) y anticuerpo de cabra anti-IgG humana Lambda-HRP (Southern Biotech, 2070-05)). El resultante se lavó con TBS que contenía Tween 20 al 0,1 % tres veces, y luego, se detectaron IgM de pollo, Igy humana (cadena pesada) e IgX humana (cadena ligera) mediante quimioluminiscencia usando sustrato Luminata Forte Western HRP (Millipore, WBLUF0100). Los resultados se muestran en la figura 43. De acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-Igy, se detectó una banda de 55 kDa en condiciones de reducción (figura 43a ), y se detectó una banda de aproximadamente 160 kDa en condiciones sin reducción (figura 43B). De acuerdo con la inmunotransferencia de tipo Western usando un anticuerpo anti-IgX, se detectó una banda de 25 kDa en condiciones de reducción (figura 43C), y se detectó una banda de aproximadamente 160 kDa en condiciones sin reducción (figura 43D).
A partir de estos resultados, se confirmó que el anticuerpo producido por el clon positivo obtenido es un anticuerpo humano de longitud completa.
Selección de anticuerpos 3
44. Preparación del antígeno
Se seleccionó IL-8 como proteína antigénica. IL-8 es un tipo de quimiocina. IL-8 muestra quimiotaxis a neutrófilos y linfocitos T, y tiene una actividad de promoción de la adhesión de leucocitos a células endoteliales vasculares o las funciones de los neutrófilos. Por tanto, se considera que IL-8 está asociada con enfermedad inflamatoria, artritis reumatoide y otras enfermedades, que se tratan con infiltración de neutrófilos.
Como antígenos, se usó IL-8 humana (Immune TECH, IT-401-003P) en la selección, y se usaron dos tipos de IL-8
humana (Immune TECH, IT-401-003P, y CELL Signaling Technology, 8921LF) en el cribado.
45. Selección del anticuerpo
45-1. Producción de perlas magnéticas de antígeno
Usando Dynabeads M-270 Carboxylic Acid (Life Technologies, 14305D), Dynabeads M-270 Epoxy (Life Technologies, 14301) y Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown (Life Technologies, 10103D) como perlas magnéticas, se permitió que estas perlas se unieran al antígeno de acuerdo con el manual de instrucciones. En este momento, se usó MPC-S (Life Technologies, DBA13346) como soporte magnético. Con respecto a Dynabeads M-270 Carboxylic Acid, se lavaron 35 |il de perlas con 70 |il de MES 25 mM (pH 5,0) tres veces, y se añadieron 35 |il de disolución de NHS 50 mg/ml y 35 |il de disolución de EDC 50 mg/ml a las perlas resultantes. La mezcla obtenida se hizo reaccionar a temperatura ambiente durante 30 minutos, y la disolución de reacción se lavó luego con 70 |il de MES 25 mM (pH 5,0) dos veces. Se retiró un sobrenadante de esta suspensión de perlas magnéticas. Para la selección positiva, se añadieron 35 |il de IL-8 (Immune TECH, IT-401-003P) ajustada a 0,6 mg/ml con MES 25 mM (pH 5,0) a la disolución obtenida anteriormente para preparar una suspensión. Para la selección negativa, se usó PBS en lugar de la disolución de antígeno, y se añadieron 35 |il de la solución diluida con MES 25 mM (pH 5,0) a la disolución obtenida anteriormente para preparar una suspensión. La suspensión obtenida se hizo reaccionar a 4°C durante la noche, mientras se sometía a agitación rotatoria. Posteriormente, se retiró un sobrenadante de la disolución de reacción, y después se añadieron 70 |il de tampón de extinción (Tris-HCl 50 mM) a la misma, seguido de la reacción de la mezcla a temperatura ambiente durante 15 minutos mientras se sometía a agitación rotatoria. Con respecto a Dynabeads M-270 Epoxy, se lavaron 35 |il de perlas con 70 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM tres veces. Posteriormente, para la selección positiva, se añadieron 46,7 |il de disolución de proteína IL-8 ajustada a 0,45 mg/ml con un tampón de fosfato de sodio 100 mM y 23,3 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM que contenía sulfato de amonio 3 M a la disolución obtenida anteriormente para preparar una suspensión, y para la selección negativa, se usó PBS en lugar de la disolución de antígeno, y se añadieron 46,7 |il de la disolución diluida con tampón de fosfato de sodio 100 mM y 23,3 |il de tampón de fosfato de sodio 100 mM que contenía sulfato de amonio 3 M a la disolución obtenida anteriormente para preparar una suspensión. La suspensión obtenida se hizo reaccionar a 37°C durante la noche, mientras se sometía a agitación rotatoria. Con respecto a Dynabeads His-Tag Isolation & Pulldown, se lavaron 7 |il de perlas con 70 |il de PBS tres veces. Posteriormente, para la selección positiva, se añadieron 70 |il de disolución de proteína IL-8 que tenía una concentración de antígeno de 5,75 |iM a la disolución obtenida anteriormente para preparar una suspensión, y para la selección negativa, se usaron 70 |il de PBS en lugar de la disolución de antígeno, y se añadió a la disolución obtenida anteriormente para preparar una suspensión. La suspensión obtenida se hizo reaccionar a 4°C durante 210 minutos, mientras se sometía a agitación rotatoria. Después de la retirada de un sobrenadante, los tres tipos de perlas se suspendieron conjuntamente en 1 ml de un tampón de selección (PBS que contenía BSA al 1 %), y la suspensión obtenida se lavó luego con el mismo tampón que se mencionó anteriormente tres veces. Posteriormente, el resultante se suspendió en 700 |il de tampón de selección, y después se sometió a selección.
45-2. Selección por microesferas magnéticas de antígeno
Se cultivó una línea celular L30/H15f15f15f, 2-1-3, en un medio que contenía 2,5 ng/ml de TSA durante 45 días. Posteriormente, se lavaron aproximadamente 1,5 x 107 células con lo ml de tampón de selección, y después se retiró un sobrenadante de la disolución de reacción. Las células restantes se lavaron con 10 ml de tampón de selección, y después se suspendieron en 950 |il de tampón de selección. A esta suspensión celular se le añadieron 50 |il de las perlas magnéticas de antígeno para la selección negativa preparadas en 39-1 anterior, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a 4°C durante 30 minutos, mientras se agitaba por rotación. Posteriormente, usando KingFisher mL (Thermo, 540005o), se eliminaron las perlas magnéticas. Posteriormente, a esta suspensión celular, se le añadieron 50 |il de las perlas magnéticas de antígeno para la selección positiva, y la mezcla obtenida se hizo reaccionar después a 4°C durante 30 minutos, mientras se agitaba por rotación. Posteriormente, usando KingFisher mL (Thermo, 540005o), la disolución de reacción se lavó con 1,7 ml de tampón de selección tres veces. Posteriormente, las células recuperadas se suspendieron en 20 ml de medio, la suspensión se sembró luego en una placa de 96 pocilios, y luego se cultivó en una incubadora de CO2.
45- 3. Cribado e identificación de clones positivos
De la misma manera que se describió en 42-3 a 42-6 anteriormente, se llevaron a cabo dos veces de cribado, monoclonación y dos veces de cribado para obtener el clon positivo n.° 117, n.0121 y n.0123. Los resultados del cribado primario después de la finalización de la selección se muestran en la figura 44, y los resultados del cribado secundario después de la finalización de la monoclonación se muestran en la figura 45.
46. Confirmación de la expresión del anticuerpo anti-IL-8
46- 1. Análisis de ELISA
Con respecto a los clones positivos n.o 117 y n.o 121 que generan anticuerpos reactivos con antígeno obtenidos en
Claims (12)
- r e iv in d ic a c io n e si . Una célula B de pollo, en la que el Iocus génlco de cadena ligera de anticuerpo de pollo se reemplaza por las secuencias de ADN de una reglón variable de cadena ligera de anticuerpo humano y por las secuencias de ADN de una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano,y en la que en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo de pollo se insertan las secuencias de ADN de una región variable de cadena pesada de anticuerpo humano y de una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano,y en la que el Iocus de pseudogén de cadena ligera de anticuerpo de pollo se reemplaza por 25 o más secuencias de ADN de regiones variables de cadena ligera de anticuerpo humano,y en la que en el Iocus de pseudogén de cadena pesada de anticuerpo de pollo se insertan 30 o más secuencias de ADN de regiones variables de cadena pesada de anticuerpo humano,en la que la célula B de pollo tiene la capacidad de expresar un anticuerpo humano en la superficie celular y también de secretar el anticuerpo humano en la disolución de cultivo.
- 2. La célula B de pollo según la reivindicación 1, en la que la posición de la secuencia de ADN de la región variable de cadena ligera de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena ligera de anticuerpo está en el sentido de 5' de la posición de la secuencia de ADN de la región constante de cadena ligera de anticuerpo humano, y la posición de la secuencia de ADN de la región variable de cadena pesada de anticuerpo humano insertada en el Iocus génico de cadena pesada de anticuerpo está en el sentido de 5' de la posición de la secuencia de ADN de la región constante de cadena pesada de anticuerpo humano.
- 3. La célula B de pollo según la reivindicación 1 o 2, en la que la cadena pesada de anticuerpo humano es una cadena y.
- 4. La célula B de pollo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la cadena ligera de anticuerpo humano es una cadena X o una cadena k .
- 5. La célula B de pollo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una célula DT40.
- 6. La célula B de pollo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que se ha sometido a un tratamiento para relajar la cromatina.
- 7. La célula B de pollo según la reivindicación 6, en la que el tratamiento para relajar la cromatina es la reducción o deleción de la función de la histona desacetilasa en la célula B de pollo.
- 8. La célula B de pollo según la reivindicación 7, en la que el método para reducir o delecionar la función de histona desacetilasa es la reducción o deleción de la expresión de un gen de histona desacetilasa en la célula B de pollo.
- 9. La célula B de pollo según la reivindicación 8, en la que la histona desacetilasa es HDAC2.
- 10. La célula B de pollo según la reivindicación 7, en la que el método para reducir o delecionar la función de la histona desacetilasa es un tratamiento con un inhibidor de HDAC.
- 11. Una biblioteca de células productoras de anticuerpos que consiste en células B de pollo según una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10.
- 12. Un método para producir un anticuerpo humano a partir de la célula B de pollo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende cultivar dicha célula B de pollo en condiciones de cultivo adecuadas para que la célula produzca un anticuerpo humano y obtener dicho anticuerpo.
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