ES2909336T3 - Composiciones para aislar un analito objetivo de una muestra heterogénea - Google Patents

Abstract

Una composición para aislar patógenos de una muestra heterogénea, la composición comprende: una muestra heterogénea que comprende un patógeno; y una pluralidad de conjuntos de partículas magnéticas, los miembros de cada conjunto se conjugan con diferentes anticuerpos que son específicos para un patógeno, en donde al menos dos de la pluralidad de conjuntos están en diferentes concentraciones diseñadas para la detección de un patógeno específico en dicha muestra heterogénea.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones para aislar un analito objetivo de una muestra heterogénea

Campo de la invención

La invención generalmente se refiere a composiciones que incluyen conjuntos de partículas magnéticas, los miembros de cada conjunto están conjugados con un anticuerpo específico para un patógeno.

Antecedentes

Los patógenos transmitidos por la sangre son un importante problema de salud. Un diagnóstico tardío o incorrecto de una infección bacteriana puede resultar en sepsis, una respuesta inflamatoria grave y, a menudo, mortal a la infección. La sepsis es la décima causa principal de muerte en los Estados Unidos. La detección temprana de infecciones bacterianas en sangre es la clave para prevenir la aparición de sepsis. Los métodos tradicionales de detección e identificación de infecciones transmitidas por la sangre incluyen cultivos de sangre y ensayos de susceptibilidad a los antibióticos. Esos métodos generalmente requieren el cultivo de células, lo que puede ser costoso y puede demorar hasta 72 horas. A menudo, se producirá un shock séptico antes de que se puedan obtener los resultados del cultivo celular.

El documento WO 2009/055587 A1 describe detectores de resonancia magnética de microbobina.

El documento US 2003/0003441 A1 describe un sistema portátil de detección de patógenos.

Wang y otros en Small 2010, Núm. 2. págs. 283- 289 describe sondas de nanopartículas magnético-ópticas multifunción para la detección, separación y ablación térmica simultáneas de múltiples patógenos.

El documento WO 2009/122216 A1 describe un sistema de ensayo en base a la separación inmunomagnética para detectar microorganismos en una muestra de alimentos.

Madonna y otros, Rapid Communications in Mass Spectrometry 2001; 15: 1068-1074 describen la detección de bacterias a partir de mezclas biológicas mediante el uso de separación inmunomagnética combinada con espectrometría de masas de tiempo de vuelo de desorción/ionización láser asistida por matriz.

El documento WO95/31481 A1 describe un método simple y rápido para la detección, identificación y enumeración de microorganismos viables específicos.

Otros han descrito métodos alternativos para la detección de patógenos, particularmente bacterias. Esos métodos incluyen métodos de detección molecular, métodos de detección de antígenos y métodos de detección de metabolitos. Los métodos de detección molecular, ya sea que impliquen la captura de híbridos o la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), requieren altas concentraciones de ADN purificado para la detección. Tanto los métodos de detección de antígenos como los de detección de metabolitos también requieren una cantidad relativamente grande de bacterias y tienen un alto límite de detección (generalmente > 104 CFU/mL), por tanto requieren una etapa de enriquecimiento antes de la detección. Este período de incubación/enriquecimiento está destinado a permitir el crecimiento de bacterias y un aumento en el número de células bacterianas para facilitar la identificación. En muchos casos, se necesita una serie de dos o tres incubaciones separadas para aislar la bacteria objetivo. Sin embargo, tales etapas de enriquecimiento requieren una cantidad significativa de tiempo (por ejemplo, al menos de unos pocos días a una semana) y pueden comprometer potencialmente la sensibilidad del ensayo al matar algunas de las células que se busca medir.

Existe la necesidad de métodos para aislar analitos objetivo, tales como bacterias, a partir de una muestra, tal como una muestra de sangre, sin una etapa de enriquecimiento adicional. También existe la necesidad de métodos de aislamiento de analitos objetivo que sean rápidos y sensibles para proporcionar datos para las decisiones de tratamiento del paciente en un marco de tiempo clínicamente relevante.

Resumen

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo con propósitos informativos. Además, cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

La presente invención proporciona composiciones para aislar patógenos desconocidos en una muestra biológica. La invención permite la detección rápida de patógenos desconocidos a niveles muy bajos en la muestra; por tanto permite la detección e identificación temprana y precisa del patógeno. La invención se lleva a cabo mediante el uso de conjuntos de partículas magnéticas, los miembros de cada conjunto están conjugados con un anticuerpo específico para un patógeno. Las composiciones de la invención pueden introducirse en una muestra de fluido corporal para crear una mezcla. La mezcla se incuba para permitir que las partículas se unan a cualquier patógeno en el fluido corporal y se aplica un campo magnético para capturar complejos de patógeno/partícula magnética en una superficie. Opcionalmente, la superficie se puede lavar con una solución de lavado que reduce la agregación de partículas, de esta manera se aíslan los complejos patógeno/partícula magnética. Una ventaja particular de las composiciones de la invención es la captura y el aislamiento de bacterias y hongos directamente de muestras de sangre a bajas concentraciones que están presentes en muchas muestras clínicas (tan bajas como 1 CFU/ml de bacterias en una muestra de sangre).

En ciertos aspectos, la invención proporciona un cóctel para aislar patógenos de una muestra heterogénea. El cóctel incluye una pluralidad de conjuntos de partículas magnéticas, los miembros de cada conjunto están conjugados con un anticuerpo específico para un patógeno. Los anticuerpos conjugados con las partículas pueden ser anticuerpos monoclonales o policlonales. Las composiciones de la invención pueden usarse con cualquier tipo de muestra heterogénea. En modalidades particulares, la muestra heterogénea es una muestra de sangre.

Dado que cada conjunto de partículas está conjugado con anticuerpos que tienen diferentes especificidades para diferentes patógenos, las composiciones de la invención pueden proporcionarse de manera que cada conjunto de partículas conjugadas con anticuerpos esté presente en una concentración diseñada para la detección de un patógeno específico en la muestra. Los conjuntos se proporcionan en diferentes concentraciones.

Para facilitar la detección de los diferentes conjuntos de complejos patógeno/partícula magnética, las partículas pueden marcarse de forma diferente. Cualquier marcador detectable se puede usar con las composiciones de la invención, tales como marcadores fluorescentes, radiomarcadores, marcadores enzimáticos, y otros. En modalidades particulares, el marcador detectable es un marcador detectable ópticamente, tal como un marcador fluorescente. Los ejemplos de marcas fluorescentes incluyen Cy3, Cy5, Atto, cianina, rodamina, fluorescencia, cumarina, BODIPY, alexa y colorantes múltiples conjugados.

Las composiciones de la invención pueden diseñarse para aislar únicamente bacterias grampositivas de una muestra. Alternativamente, las composiciones de la invención pueden diseñarse para aislar solo bacterias gramnegativas de una muestra. En ciertas modalidades, las composiciones de la invención están diseñadas para aislar bacterias grampositivas y gramnegativas de una muestra. En aún otras modalidades, las composiciones están diseñadas para aislar un patógeno específico de una muestra. Las especies bacterianas ilustrativas que pueden capturarse y aislarse mediante los métodos de la invención incluyen E. coli, Listeria, Clostridium, Mycobacterium, Shigella, Borrelia, Campylobacter, Bacillus, Salmonella, Staphylococcus, Enterococcus, Pneumococcus, Streptococcus y combinaciones de las mismas.

Las composiciones de la invención no se limitan a aislar patógenos de un fluido corporal y pueden diseñarse para aislar otros tipos de analitos objetivo, tales como hongos, proteínas, células, virus, ácidos nucleicos, receptores, ligandos, o cualquier molécula conocida en la técnica.

Las composiciones de la invención pueden usar cualquier tipo de partícula magnética. Las partículas magnéticas generalmente se dividen en dos grandes categorías. La primera categoría incluye partículas que son permanentemente magnetizables o ferromagnéticas; y la segunda categoría incluye partículas que demuestran un comportamiento magnético masivo solo cuando se someten a un campo magnético. Los últimos se denominan partículas magnéticamente sensibles. Los materiales que muestran un comportamiento magnéticamente sensible a veces se describen como superparamagnéticos. Sin embargo, los materiales que exhiben propiedades ferromagnéticas masivas, por ejemplo, óxido de hierro magnético, pueden caracterizarse como superparamagnéticos cuando se proporcionan en cristales de aproximadamente 30 nm o menos de diámetro. Los cristales más grandes de materiales ferromagnéticos, por el contrario, conservan las características del imán permanente después de la exposición a un campo magnético y tienden a agregarse a partir de entonces debido a la fuerte interacción partícula-partícula. En ciertas modalidades, las partículas son partículas superparamagnéticas. En otras modalidades, las partículas magnéticas incluyen al menos un 70 % en peso de partículas superparamagnéticas. En ciertas modalidades, las partículas superparamagnéticas tienen un diámetro de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 250 nm. En ciertas modalidades, la partícula magnética es una partícula magnética que contiene hierro. En otras modalidades, la partícula magnética incluye óxido de hierro o platino de hierro.

Otro aspecto de la invención proporciona una pluralidad de partículas magnéticas, en las que la pluralidad se funcionaliza de manera diferente de modo que la pluralidad de partículas se una a una pluralidad de diferentes patógenos en una muestra heterogénea.

Descripción Detallada

La invención generalmente se refiere a composiciones que incluyen conjuntos de partículas magnéticas, los miembros de cada conjunto están conjugados con un anticuerpo específico para un patógeno. Ciertas tecnologías y principios fundamentales se asocian con la unión de materiales magnéticos a entidades objetivo y, posteriormente, la separación mediante el uso de campos magnéticos y gradientes. Tales tecnologías y principios fundamentales se conocen en la técnica y se han descrito anteriormente, tales como los descritos en Janeway (Immunobiology, 6‘‘ edición, Garland Science Publishing).

Las composiciones de la invención pueden usar cualquier tipo de partícula magnética. La producción de partículas magnéticas y partículas para usar con la invención se conoce en la técnica. Ver, por ejemplo, Giaever (U.S.

3,970,518), Senyi y otros (U.S. 4,230,685), Dodin y otros (U.S. 4,677,055), Whitehead y otros (U.S. 4,695,393), Benjamin y otros (U.S. 5,695,946), Giaever (U.S. 4,018,886), Rembaum (U.S. 4,267,234), Molday (U.S. 4,452,773), Whitehead y otros (U.S. 4,554,088), Forrest (U.S. 4,659,678), Liberti y otros (U.S. 5,186,827), Own y otros (U.S.

4,795,698), y Liberti y otros (WO 91/02811).

Las partículas magnéticas generalmente se dividen en dos grandes categorías. La primera categoría incluye partículas que son permanentemente magnetizables o ferromagnéticas; y la segunda categoría incluye partículas que demuestran un comportamiento magnético masivo solo cuando se someten a un campo magnético. Los últimos se denominan partículas magnéticamente sensibles. Los materiales que muestran un comportamiento magnéticamente sensible a veces se describen como superparamagnéticos. Sin embargo, los materiales que exhiben propiedades ferromagnéticas masivas, por ejemplo, óxido de hierro magnético, pueden caracterizarse como superparamagnéticos cuando se proporcionan en cristales de aproximadamente 30 nm o menos de diámetro. Los cristales más grandes de materiales ferromagnéticos, por el contrario, conservan las características del imán permanente después de la exposición a un campo magnético y tienden a agregarse a partir de entonces debido a la fuerte interacción partícula-partícula. En ciertas modalidades, las partículas son partículas superparamagnéticas. En ciertas modalidades, la partícula magnética es una partícula magnética que contiene hierro. En otras modalidades, la partícula magnética incluye óxido de hierro o platino de hierro.

En ciertas modalidades, las partículas magnéticas incluyen al menos aproximadamente 10 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 20 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 30 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 40 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 50 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 60 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 70 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 80 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 90 % de partículas superparamagnéticas en peso, al menos aproximadamente 95 % de partículas superparamagnéticas en peso, o al menos aproximadamente 99 % de partículas superparamagnéticas en peso. En una modalidad particular, las partículas magnéticas incluyen al menos aproximadamente 70 % de partículas superparamagnéticas en peso.

En ciertas modalidades, las partículas superparamagnéticas tienen menos de 100 nm de diámetro. En otras modalidades, las partículas superparamagnéticas son de aproximadamente 150 nm de diámetro, son de aproximadamente 200 nm de diámetro, son de aproximadamente 250 nm de diámetro, son de aproximadamente 300 nm de diámetro, son de aproximadamente 350 nm de diámetro, son de aproximadamente 400 nm de diámetro, son aproximadamente 500 nm de diámetro, o son aproximadamente 1000 nm de diámetro. En una modalidad particular, las partículas superparamagnéticas tienen un diámetro de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 250 nm.

En ciertas modalidades, las partículas son partículas (por ejemplo, nanopartículas) que incorporan materiales magnéticos, o materiales magnéticos que se han funcionalizado, u otras configuraciones como se conocen en la técnica. En ciertas modalidades, pueden usarse nanopartículas que incluyen un material polimérico que incorpora material(es) magnético(s), tal como material(es) de nanometal. Cuando ese/esos material(es) o cristal(es) de nanometal, tal como el Fe³O⁴, son superparamagnéticos, pueden proporcionar propiedades ventajosas, tales como ser capaces de magnetizarse por un campo magnético externo y desmagnetizarse cuando el campo magnético externo se ha retirado. Esto puede ser ventajoso para facilitar el transporte de muestras dentro y fuera de un área donde la muestra se procesa sin una agregación indebida de partículas.

Se pueden emplear uno o más o varios nanometales diferentes, tales como Fe³O⁴, FePt o Fe, en una configuración de núcleo-cubierta para proporcionar estabilidad, y/o varios otros como se puede conocer en la técnica. En muchas aplicaciones, puede ser ventajoso tener un nanometal que tenga un momento saturado por volumen tan alto como sea posible, ya que esto puede maximizar las fuerzas relacionadas con el gradiente y/o puede mejorar una señal asociada con la presencia de las partículas. También puede ser ventajoso que la carga volumétrica en una partícula sea lo más alta posible, por la misma razón o razones similares. Para maximizar el momento proporcionado por un nanometal magnetizable, puede proporcionarse un cierto campo de saturación. Por ejemplo, para las partículas superparamagnéticas de Fe³O⁴, este campo puede ser del orden de aproximadamente 0,3 T.

El tamaño de la partícula que contiene nanometal puede optimizarse para una aplicación particular, por ejemplo, maximizar el momento cargado sobre un objetivo, maximizar la cantidad de partículas en un objetivo con una detectabilidad aceptable, maximizar el movimiento inducido por la fuerza deseada y/o maximizar la diferencia en el momento adjunto entre el objetivo marcado y los objetivos no específicamente unidos o agregados de partículas o partículas individuales. Si bien se hace referencia a la maximización mediante el ejemplo anterior, se contemplan otras optimizaciones o alteraciones, tales como minimizar o afectar de cualquier otra manera considerablemente las condiciones.

En una modalidad ilustrativa, se produce una partícula de polímero que contiene 80 % en peso de partículas superparamagnéticas de Fe³O⁴, o, por ejemplo, 90 % en peso de partículas superparamagnéticas superiores, al encapsular las partículas superparamagnéticas con un recubrimiento de polímero para producir una partícula que tiene un diámetro de aproximadamente 250 nm.

Cada conjunto de partículas magnéticas tiene un resto de unión específico al objetivo que permite que cada conjunto se una específicamente al objetivo de interés en la muestra heterogénea. El resto específica del objetivo puede ser cualquier molécula conocida en la técnica y dependerá del objetivo a capturar y aislar. Los ejemplos de restos de unión específica al objetivo incluyen ácidos nucleicos, proteínas, ligandos, anticuerpos, aptámeros, y receptores. En modalidades particulares, el resto de unión específica al objetivo es un anticuerpo, tal como un anticuerpo que se une a una bacteria particular. Las metodologías generales para la producción de anticuerpos, que incluyen los criterios a considerar al elegir un animal para la producción de antisueros, se describen en Harlow y otros (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, págs. 93-117, 1988). Por ejemplo, un animal de tamaño adecuado, tales como cabras, perros, ovejas, ratones o camellos, se inmuniza mediante la administración de una cantidad de inmunógeno, tal como la bacteria objetivo, eficaz para producir una respuesta inmunitaria. Un protocolo ilustrativo es el siguiente. El animal se inyecta con 100 miligramos de antígeno resuspendido en adyuvante, por ejemplo, el adyuvante completo de Freund, en dependencia del tamaño del animal, seguido tres semanas más tarde con una inyección subcutánea de 100 microgramos a 100 miligramos de inmunógeno con adyuvante en dependencia del tamaño del animal, por ejemplo, el adyuvante incompleto de Freund. Se administran inyecciones subcutáneas o intraperitoneales adicionales cada dos semanas con adyuvante, por ejemplo, adyuvante incompleto de Freund, hasta que se alcanza un título adecuado de anticuerpo en la sangre del animal. Los títulos ilustrativos incluyen un título de al menos aproximadamente 1:5000 o un título de 1:100 000 o más, es decir, la dilución que tiene una actividad detectable. Los anticuerpos se purifican, por ejemplo, mediante purificación por afinidad en columnas que contienen resina de proteína G o resina de afinidad específica del objetivo.

La técnica de inmunización in vitro de linfocitos humanos se utiliza para generar anticuerpos monoclonales. Las técnicas para la inmunización in vitro de linfocitos humanos son bien conocidas por los expertos en la técnica. Ver, por ejemplo, Inai, y otros, Histochemistry, 99(5):335 362, mayo de 1993; Mulder y otros, Hum. Immunol., 36(3):186 192, 1993; Harada, y otros, J. Oral Pathol. Med., 22(4):145 152, 1993; Stauber y otros, J. Immunol. Methods, 161 (2): 157 168, 1993; y Venkateswaran, y otros, Hybridoma, 11(6) 729 739, 1992. Estas técnicas pueden usarse para producir anticuerpos monoclonales reactivos con antígenos, que incluyen los anticuerpos monoclonales IgG e IgM específicos de antígeno.

Cualquier anticuerpo o fragmento del mismo que tenga afinidad y sea específico para la bacteria de interés está dentro del alcance de la invención proporcionada en la presente descripción. Las partículas inmunomagnéticas contra Salmonella se proporcionan en Vermunt y otros (J. Appl. Bact. 72:112, 1992). Las partículas inmunomagnéticas contra Staphylococcus aureus se proporcionan en Johne y otros (J. Clin. Microbiol. 27:1631, 1989). Las partículas inmunomagnéticas contra Listeria se proporcionan en Skjerve y otros (Appl. Env. Microbiol.

56:3478, 1990). Las partículas inmunomagnéticas contra Escherichia coli se proporcionan en Lund y otros (J. Clin. Microbiol. 29:2259, 1991).

Los métodos para unir el resto de unión específica al objetivo a la partícula magnética se conocen en la técnica. El recubrimiento de partículas magnéticas con anticuerpos se conoce bien en la técnica, véase, por ejemplo, Harlow y otros (Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), Hunter y otros (Immunoassays for Clinical Chemistry, págs.

147-162, eds., Churchill Livingston, Edinborough, 1983), y Stanley (Essentials in Immunology and Serology, Delmar, págs. 152-153, 2002). Tal metodología puede modificarse fácilmente por un experto en la técnica para unir otros tipos de restos de unión específica al objetivo a las partículas magnéticas. Ciertos tipos de partículas magnéticas recubiertas con un resto funcional están disponibles comercialmente en Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Dado que cada conjunto de partículas está conjugado con anticuerpos que tienen diferentes especificidades para diferentes patógenos, las composiciones de la invención pueden proporcionarse de manera que cada conjunto de partículas conjugadas con anticuerpos esté presente en una concentración diseñada para la detección de un patógeno específico en la muestra. En ciertas modalidades, todos los conjuntos se proporcionan a la misma concentración. Alternativamente, los conjuntos se proporcionan a diferentes concentraciones. Por ejemplo, las composiciones se pueden diseñar de manera que se añadan a la muestra conjuntos que se unan a bacterias grampositivas a una concentración de 2 * 109 partículas por/ml, mientras que se añadan a la muestra conjuntos que se unan a bacterias gramnegativas a una concentración de 4 * 109 partículas por/ml. Las composiciones de la invención no se ven afectadas por la reactividad cruzada de los anticuerpos. Sin embargo, en ciertas modalidades, los conjuntos se diseñan específicamente de modo que no haya reactividad cruzada entre diferentes anticuerpos y diferentes conjuntos.

Las composiciones de la invención pueden diseñarse para aislar únicamente bacterias grampositivas de una muestra. Alternativamente, las composiciones de la invención pueden diseñarse para aislar solo bacterias gramnegativas de una muestra. En ciertas modalidades, las composiciones de la invención están diseñadas para aislar bacterias grampositivas y gramnegativas de una muestra. Tales composiciones permiten el aislamiento de esencialmente todas las bacterias de una muestra.

En aún otras modalidades, las composiciones están diseñadas para aislar un patógeno específico de una muestra. Las especies bacterianas ilustrativas que pueden capturarse y aislarse mediante los métodos de la invención incluyen E. coli, Listeria, Clostridium, Mycobacterium, Shigella, Borrelia, Campylobacter, Bacillus, Salmonella, Staphylococcus, Enterococcus, Pneumococcus, Streptococcus y una combinación de las mismas. Estos conjuntos se pueden mezclar para aislar, por ejemplo, E. coli y Listeria; o E. coli, Listeria y Clostridium; o Mycobacterium, Campylobacter, Bacillus, Salmonella y Staphylococcus, etc. Se puede usar cualquier combinación de conjuntos y las composiciones de la invención variarán en dependencia del patógeno sospechado o patógenos a aislar.

La captura de una amplia gama de microorganismos objetivo simultáneamente se puede lograr mediante el uso de anticuerpos específicos para la clase objetivo, tales como anticuerpos pan-Grampositivos, anticuerpos pan-Gramnegativos o anticuerpos específicos para un subconjunto de organismos de una determinada clase. Además, se puede lograr una reactividad expandida al mezclar partículas de diferente reactividad. La adición de una alta concentración de partículas no específicas no interfiere con la eficiencia de captura de partículas específicas del objetivo. Similarmente, se pueden combinar varias preparaciones de partículas diferentes para permitir la captura eficiente de los patógenos deseados. En ciertas modalidades, las partículas se pueden usar a una concentración entre 1 * 108 y 5 * 1010 partículas/ml.

En ciertas modalidades, la cobertura ampliada se puede proporcionar al mezclar anticuerpos con diferente especificidad antes de unirlos a las partículas magnéticas. Los anticuerpos purificados se pueden mezclar y conjugar con partículas magnéticas activadas mediante el uso de métodos estándar conocidos en la técnica.

Para facilitar la detección de los diferentes conjuntos de complejos patógeno/partícula magnética, las partículas pueden marcarse de forma diferente. Cualquier marcador detectable se puede usar con las composiciones de la invención, tales como marcadores fluorescentes, radiomarcadores, marcadores enzimáticos, y otros. El marcador detectable puede ser detectable directa o indirectamente. En ciertas modalidades, el marcador exacta puede seleccionarse en base, al menos en parte, al tipo particular de método de detección usado. Ejemplos de métodos de detección incluyen detección radiactiva, detección de absorbancia óptica, por ejemplo, detección de absorbancia UV-visible, detección de emisión óptica, por ejemplo, fluorescencia; fosforescencia o quimioluminiscencia; dispersión Raman. Las marcas preferidas incluyen marcas detectables ópticamente, tales como marcas fluorescentes. Los ejemplos de marcas fluorescentes incluyen, pero no se limitan a, ácido 4-acetamido-4'-isotiocianatoestilbeno-2,2'disulfónico; acridina y derivados: acridina, isotiocianato de acridina; ácido 5-(2'-aminoetil)aminonaftaleno-1-sulfónico (EDANS); disulfonato de 4-amino-N-[3-vinilsulfonil)fenil]naftalimida-3,5; N-(4-anilino-1-naftil)maleimida; antranilamida; BODIPY; amarillo brillante; cumarina y derivados; cumarina, 7-amino-4-metilcumarina (AMC, Coumarin 120), 7-amino-4-trifluorometilculuarina (Coumaran 151); tintes de cianina; cianosina; 4',6-diaminidino-2-fenilindol (DAPI); 5'5"-dibromopirogalol-sulfonaftaleína (rojo de bromopirogalol); 7-dietilamino-3-(4'-isotiocianatofenil)-4-metilcumarina; pentaacetato de dietilentriamina; ácido 4,4'-diisotiocianatodihidro-estilbeno-2,2'-disulfónico; ácido 4,4'-diisotiocianatoestilbeno-2,2'-disulfónico; cloruro de 5-[dimetilamino] naftaleno-1-sulfonilo (DNS, dansilcloruro); 4-dimetilaminofenilazofenil-4-isotiocianato (DABITC); eosina y derivados; eosina, isotiocianato de eosina, eritrosina y derivados; eritrosina B, eritrosina, isotiocianato; etidio; fluoresceína y derivados; 5-carboxifluoresceína (FAM), 5-(4,6-diclorotriazin-2-il)aminofluoresceína (DTAF), 2',7' -dimetoxi-4'5'-dicloro-6-carboxifluoresceína, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, QFITC, (XRITC); fluorescamina; IR144; IR1446; isotiocianato de verde de malaquita; 4-metilumbeliferonaortocresolftaleína; nitrotirosina; pararosanilina; rojo fenol; B-ficoeritrina; o-ftaldialdehído; pireno y derivados: pireno, butirato de pireno, succinimidilo 1-pireno; puntos cuánticos de butirato; Rojo Reactivo 4 (Cibacron.TM. Rojo brillante 3B-A) rodamina y derivados: 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxirrodamina (R6G), lisamina rodamina B cloruro de sulfonilo rodamina (Rhod), rodamina B, rodamina 123, isotiocianato de rodamina X, sulforrodamina B, sulforodamina 101, cloruro de sulfonilo derivado de sulforodamina 101 (Texas Red); N,N,N',N'tetrametil-6-carboxirrodamina (TAMRA); tetrametil rodamina; isotiocianato de tetrametil rodamina (TRITC); riboflavina; ácido rosólico; derivados de quelatos de terbio; colorantes Atto, Cy3; Cy5; Cy5.5; Cy7; IRD 700; IRD 800; La Jolta Azul; ftalocianina; y naftalocianina. Los marcadores fluorescentes preferidos son cianina-3 y cianina-5. La invención contempla marcadores distintos de los marcadores fluorescentes, incluidos otros marcadores detectables ópticamente. Los métodos para unir marcas fluorescentes a partículas magnéticas o anticuerpos son conocidos en la técnica.

Las composiciones de la invención se pueden usar con cualquier muestra heterogénea. En modalidades particulares, las composiciones de la invención se usan para aislar un patógeno del fluido corporal. Un fluido corporal se refiere a un material líquido derivado, por ejemplo, de un humano u otro mamífero. Tales fluidos corporales incluyen, pero no están limitados a, mucosidad, sangre, plasma, suero, derivados séricos, bilis, flema, saliva, sudor, fluido amniótico, fluido mamario, orina, esputo, y fluido cefalorraquídeo (CSF), tal como CSF lumbar o ventricular. Un fluido corporal también puede ser un aspirado con aguja fina. Un fluido corporal también puede ser un medio que contiene células o material biológico.

En modalidades particulares, el fluido es sangre. Mediante el uso de las composiciones de la invención, las bacterias en una muestra de sangre pueden aislarse y detectarse a un nivel tan bajo como o incluso inferior a 1 CFU/ml. La sangre se puede recoger en un recipiente, tal como un tubo de recogida de sangre (por ejemplo, VACUTAINER, tubo de ensayo diseñado específicamente para venopunción, disponible comercialmente de Becton, Dickinson y compañía). En ciertas modalidades, se añade una solución que previene o reduce la agregación de factores de agregación endógenos, tal como la heparina en el caso de la sangre.

Luego, la muestra de sangre se mezcla con las composiciones de la invención para generar una mezcla que se deja incubar de forma que las composiciones de la invención se unan a al menos una bacteria de la muestra de sangre. El tipo o tipos de bacterias que se unirán a las composiciones de la invención dependerán del diseño de la composición, es decir, qué partículas conjugadas con anticuerpos se usan. La mezcla se deja incubar por un tiempo suficiente para permitir que la composición se una al patógeno en la sangre. El proceso de unión de la composición a los patógenos asociados a un momento magnético con el patógeno y, por tanto, permite manipular el patógeno a través de las fuerzas generadas por los campos magnéticos sobre el momento magnético adjunto.

En general, el tiempo de incubación dependerá del grado deseado de unión entre el patógeno y las composiciones de la invención (por ejemplo, la cantidad de momento que se uniría convenientemente al patógeno), la cantidad de momento por objetivo, la cantidad de tiempo de mezcla, el tipo de mezcla, los reactivos presentes para promover la unión y el sistema químico de unión que se emplea. El tiempo de incubación puede ser de unos 5 segundos a unos pocos días. Los tiempos de incubación ilustrativos varían de aproximadamente 10 segundos a aproximadamente 2 horas. La unión se produce en una amplia variedad de temperaturas, generalmente entre 15 °C y 40 °C.

En ciertas modalidades, se añade una solución tampón a la muestra junto con las composiciones de la invención. Un tampón ilustrativo incluye Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato a una concentración de aproximadamente 75 mM. Se ha descubierto que la composición del tampón, los parámetros de mezcla (velocidad, tipo de mezcla, tal como rotación, agitación, etc., y temperatura) influyen en la unión. Es importante mantener la osmolalidad de la solución final (por ejemplo, Sangre tampón) para mantener una alta eficacia del marcado. En ciertas modalidades, los tampones usados en los métodos de la invención se diseñan para prevenir la lisis de las células sanguíneas, facilitar la unión eficiente de objetivos con partículas magnéticas y reducir la formación de agregados de partículas. Se ha encontrado que la solución tampón que contiene 300 mM de NaCl, Tris-HCl 75 mM pH 8,0 y Tween 20 al 0,1 % cumple con estos objetivos de diseño.

Sin estar limitado por ninguna teoría o mecanismo de acción particular, se cree que el cloruro de sodio es el principal responsable del mantenimiento de la osmolalidad de la solución y de la reducción de la unión no específica de la partícula magnética a través de la interacción iónica. El Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato es un compuesto amortiguador bien establecido que se usa con frecuencia en biología para mantener el pH de una solución. Se ha encontrado que la concentración de 75 mM es beneficiosa y suficiente para una alta eficiencia de unión. Igualmente, Tween 20 se usa ampliamente como un detergente suave para disminuir la unión no específica debido a las interacciones hidrófobas. Diversos ensayos usan Tween 20 a concentraciones que varían de 0,01 % a 1 %. La concentración de 0,1 % parece ser óptima para el marcado eficiente de bacterias, mientras se mantienen intactas las células sanguíneas.

Se pueden usar compuestos adicionales para modular la eficiencia de captura al bloquear o reducir la interacción no específica con componentes sanguíneos y partículas magnéticas o patógenos. Por ejemplo, se pueden usar compuestos quelantes, tales como EDTA o EGTA, para prevenir o minimizar las interacciones que son sensibles a la presencia de iones Ca2+ o Mg2+.

Un enfoque alternativo para lograr una alta eficiencia de unión mientras se reduce el tiempo requerido para la etapa de unión es usar un mezclador estático u otros dispositivos de mezcla que proporcionen una mezcla eficiente de muestras viscosas a altas velocidades de flujo, tal como a 5 ml/min. En una modalidad, la muestra se mezcla con tampón de unión en una proporción de, o aproximadamente, 1:1, mediante el uso de un conector de interfaz de mezcla. La muestra diluida luego fluye a través de un conector de interfaz de mezcla donde se mezcla con nanopartículas específicas del objetivo. Se pueden acoplar conectores de interfaz de mezcla adicionales que proporcionan la mezcla de muestras y nanopartículas específicas de antígeno aguas abajo para mejorar la eficiencia de unión. El caudal combinado de la muestra marcada se selecciona de manera que sea compatible con el procesamiento aguas abajo.

Después de la unión de las composiciones de la invención al patógeno en la muestra para formar complejos patógeno/partícula magnética, se aplica un campo magnético a la mezcla para capturar los complejos en una superficie. Los componentes de la mezcla que no se unen a las partículas magnéticas no se verán afectados por el campo magnético y permanecerán libres en la mezcla. Los métodos y aparatos para separar complejos objetivo/partícula magnética de otros componentes de una mezcla son conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede acoplar una malla de acero a un imán, se puede configurar un canal o canales lineales con imanes adyacentes, o se pueden usar imanes cuadripolares con flujo anular. Otros métodos y aparatos para separar complejos objetivo/partícula magnética de otros componentes de una mezcla se muestran en Rao y otros (U.S.

6,551,843), Liberti y otros (U.S. 5,622,831), Hatch y otros (U.S. 6,514,415), Benjamin y otros (U.S. 5,695,946), Liberti y otros (U.S. 5,186,827), Wang y otros (U.S. 5,541,072), Liberti y otros (U.S. 5,466,574), y Terstappen y otros (U.S.

6,623,983).

En ciertas modalidades, la captura magnética se logra con alta eficiencia mediante el uso de una celda de captura de flujo continuo con varios imanes de barra de tierras raras potentes colocados perpendicularmente al flujo de la muestra. Cuando se usa una cámara de flujo con una sección transversal de la ruta de flujo de 0,5 mm x 20 mm (h x w) e imanes de NdFeB de 7 bar, la velocidad de flujo puede ser de hasta 5 ml/min o más, mientras se logra una eficiencia de captura cercana al 100 %.

El tipo de separación magnética descrito anteriormente produce una captura eficiente de un analito objetivo y la eliminación de la mayoría de los componentes restantes de una mezcla de muestra. Sin embargo, tal proceso produce una muestra que contiene un porcentaje muy alto de partículas magnéticas que no se unen a los analitos objetivo debido a que las partículas magnéticas típicamente se añaden en exceso, así como también las entidades objetivo no específicas. Las entidades objetivo no específicas pueden, por ejemplo, unirse a una eficiencia mucho menor, por ejemplo, el 1% del área superficial, mientras que un objetivo de interés puede cargarse al 50 % o casi el 100 % del área superficial disponible o sitios antigénicos disponibles. Sin embargo, incluso el 1 % de carga puede ser suficiente para impartir la fuerza necesaria para atrapar en una celda de flujo de gradiente magnético o cámara de muestra.

Por ejemplo, en el caso de la unión inmunomagnética de bacterias u hongos en una muestra de sangre, la muestra puede incluir: objetivos unidos a una concentración de aproximadamente 1/ml o una concentración menor de aproximadamente 106/ml; partículas de fondo a una concentración de aproximadamente 107/ml a aproximadamente 1010/ml; y objetivos no específicos a una concentración de aproximadamente 10/ml a aproximadamente 105/ml. La presencia de partículas magnéticas que no se unen a los analitos objetivo y entidades objetivo no específicas en la superficie que incluye los complejos objetivo/de partículas magnéticas interfiere con la capacidad de detectar con éxito el objetivo de interés. La captura magnética de la mezcla resultante, y el contacto cercano de partículas magnéticas entre sí y los objetivos unidos, resultan en la formación de agregado que es difícil de dispensar y que puede ser resistente o inadecuado para las etapas de procesamiento o análisis posteriores. En orden de eliminar las partículas magnéticas que no están unidas a los analitos objetivo y las entidades objetivo no específicas, la superficie se puede lavar con una solución de lavado que reduce la agregación de partículas, de esta manera los complejos objetivo/partícula magnética se aíslan de las partículas magnéticas que no están unidas a analitos objetivo y entidades diana no específicas. La solución de lavado minimiza la formación de agregados.

Puede usarse cualquier solución de lavado que imparta una carga negativa neta a la partícula magnética que no sea suficiente para interrumpir la interacción entre el resto específico del objetivo de la partícula magnética y el analito objetivo. Sin estar limitado por ninguna teoría o mecanismo de acción en particular, se cree que la unión de las moléculas cargadas negativamente en la solución de lavado a las partículas magnéticas proporciona carga negativa neta a las partículas y facilita la dispersión de partículas agregadas no específicamente. Al mismo tiempo, la carga negativa neta no es suficiente para interrumpir la fuerte interacción entre el resto específico de la diana de la partícula magnética y el analito objetivo (por ejemplo, una interacción anticuerpo-antígeno). Las soluciones ejemplares incluyen heparina, Tris-HCl, Tris-borato-EDTA (TBE), Tris-acetato-EDTA (TAE), Triscacodilato, HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfónico), PBS (solución salina tamponada con fosfato), PIPES (piperazina-N,N'-bis(ácido 2-etanosulfónico), MES (ácido 2-N-morfolino)etanosulfónico), Tricina (N-(Tri(hidroximetil)metil)glicina) y agentes tampón similares. En ciertas modalidades, solo se realiza un único ciclo de lavado. En otras modalidades, se realiza más de un ciclo de lavado.

En modalidades particulares, la solución de lavado incluye heparina. Para modalidades en las que la muestra de fluido corporal es sangre, la heparina también reduce la probabilidad de coagulación de los componentes sanguíneos después de la captura magnética. Los objetivos unidos se lavan con tampón que contiene heparina de 1 a 3 veces para eliminar los componentes sanguíneos y reducir la formación de agregados.

Una vez que se aíslan los complejos de objetivo/partículas magnéticas, el objetivo puede analizarse por una multitud de tecnologías existentes, tales como NMR en miniatura, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), espectrometría de masa, marcaje fluorescente y visualización mediante el uso de observación microscópica, hibridación fluorescente in situ (FISH), ensayos de sensibilidad a los antibióticos en base al crecimiento, y una variedad de otros métodos que pueden realizarse con objetivo purificado sin contaminación significativa de otros componentes de la muestra. En una modalidad, las bacterias aisladas se lisan con una solución caotrópica y el ADN se une a la resina de extracción de ADN. Después del lavado de la resina, el ADN bacteriano se eluye y se usa en RT-PCR cuantitativa para detectar la presencia de especies y/o subclases específicas de bacterias.

En otra modalidad, las bacterias capturadas se eliminan de las partículas magnéticas a las que están unidas y la muestra procesada se mezcla con anticuerpos marcados con fluorescencia específicos para las bacterias o tinción de Gram fluorescente. Después de la incubación, la mezcla de reacción se filtra a través de un filtro de 0,2 pm a 1,0 pm para capturar las bacterias marcadas y permitir que la mayoría de las partículas libres y las marcas fluorescentes pasen a través del filtro. Las bacterias se visualizan en el filtro utilizando técnicas microscópicas, por ejemplo, observación microscópica directa, escaneo láser u otros métodos automatizados de captura de imágenes. La presencia de bacterias se detecta a través del análisis de imágenes. Después de la detección positiva mediante técnicas visuales, las bacterias se pueden caracterizar aún más mediante PCR o métodos genómicos.

La detección de bacterias de interés puede realizarse mediante el uso de sondas de ácido nucleico siguiendo los procedimientos que se conocen en la técnica. Los procedimientos adecuados para la detección de bacterias mediante el uso de sondas de ácido nucleico se describen, por ejemplo, en Stackebrandt y otros (U.S. 5,089,386), King y otros (WO 90/08841), Foster y otros (WO 92/15883), y Cossart y otros (WO 89/06699).

Un ensayo de sonda de ácido nucleico adecuado generalmente incluye tratamiento de muestra y lisis, hibridación con sonda(s) seleccionada(s), captura híbrida y detección. La lisis de la bacteria es necesaria para liberar el ácido nucleico para las sondas. Las moléculas objetivo de ácido nucleico se liberan mediante el tratamiento con cualquiera de varios agentes de lisis, que incluyen álcalis (tal como NaOH), sales de guanidina (tal como tiocianato de guanidina), enzimas (tal como lisozima, mutanolisina y proteinasa K), y detergentes. La lisis de las bacterias, por lo tanto, libera tanto ADN como ARN, particularmente ARN ribosómico y ADN cromosómico, los cuales pueden utilizarse como moléculas objetivo con la selección adecuada de una sonda adecuada. El uso de ARNr como la(s) molécula(s) objetivo(s) puede ser ventajoso debido a que los ARNr constituyen un componente significativo de la masa celular, lo que proporciona de esta manera una abundancia de moléculas objetivo. El uso de sondas de ARNr también mejora la especificidad para las bacterias de interés, es decir, la detección positiva sin reactividad cruzada inconveniente que puede conducir a falsos positivos o detección falsa.

La hibridación incluye la adición de las sondas de ácido nucleico específicas. En general, la hibridación es el procedimiento mediante el cual se combinan dos ácidos nucleicos parcial o completamente complementarios, en condiciones de reacción definidas, de manera antiparalela para formar enlaces de hidrógeno específicos y estables. La selección o rigurosidad de las condiciones de hibridación/reacción se define por la longitud y la composición base de la sonda/dúplex objetivo, así como también por el nivel y la geometría del emparejamiento incorrecto entre las dos cadenas de ácido nucleico. La rigurosidad también se rige por tales parámetros de reacción como temperatura, tipos y concentraciones de agentes desnaturalizantes presentes y el tipo y concentración de especies iónicas presentes en la solución de hibridación.

La fase de hibridación del ensayo de la sonda de ácido nucleico se realiza con una sola sonda seleccionada o con una combinación de dos, tres o más sondas. Se seleccionan las sondas que tienen secuencias que son homólogas a secuencias de ácido nucleico únicas del organismo objetivo. En general, se utiliza una primera sonda de captura para capturar moléculas híbridas formadas. La molécula híbrida se detecta luego mediante el uso de una reacción de anticuerpos o mediante el uso de una segunda sonda detectora que puede marcarse con un radioisótopo (tal como el fósforo-32) o un marcador fluorescente (tal como la fluoresceína) o un marcador quimioluminiscente.

La detección de bacterias de interés también puede realizarse mediante el uso de técnicas de PCR. Una técnica de PCR adecuada se describe, por ejemplo, en Verhoef y otros (WO 92/08805). Tales protocolos pueden aplicarse directamente a las bacterias capturadas en las partículas magnéticas. La bacteria se combina con un tampón de lisis y las moléculas objetivo de ácido nucleico recogidas se utilizan como plantilla para la reacción de PCR.

Para la detección de las bacterias seleccionadas mediante el uso de anticuerpos, las bacterias aisladas se ponen en contacto con anticuerpos específicos para las bacterias de interés. Como se señaló anteriormente, pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales, pero en cualquier caso tienen afinidad por la bacteria particular a detectar. Estos anticuerpos se adherirán/unirán al material de la bacteria objetivo específica. Con respecto al marcado de los anticuerpos, estos se marcan directa o indirectamente con marcas usadas en otros inmunoensayos conocidos. Las marcas directas pueden incluir moléculas fluorescentes, quimioluminiscentes, bioluminiscentes, radiactivas, metálicas, de biotina o enzimáticas. Los expertos en la técnica conocen bien los métodos para combinar estas marcas con los anticuerpos u otras macromoléculas. Los ejemplos incluyen los métodos de Hijmans, W. y otros (1969), Clin. Exp. Immunol. 4, 457-, para isotiocianato de fluoresceína, el método de Goding, J. W. (1976), J. Immunol. Meth. 13, 215-, para el isotiocianato de tetrametilrodamina, y el método de Ingrall, E. (1980), Meth. in Enzymol. 70, 419-439 para enzimas.

Estos anticuerpos detectores también pueden marcarse indirectamente. En este caso, la molécula de detección real se une a un anticuerpo secundario u otra molécula con afinidad de unión por el anticuerpo antibacteriano de la superficie celular. Si se usa un anticuerpo secundario, es preferentemente un anticuerpo general para una clase de anticuerpo (IgG e IgM) de la especie animal usada para elevar los anticuerpos antibacterianos de la superficie celular. Por ejemplo, el segundo anticuerpo puede conjugarse con una enzima, ya sea fosfatasa alcalina o peroxidasa. Para detectar el marcador, después de que las bacterias de interés se ponen en contacto con el segundo anticuerpo y se lavan, el componente aislado de la muestra se sumerge en una solución que contiene un sustrato cromogénico ya sea para fosfatasa alcalina o peroxidasa. Un sustrato cromogénico es un compuesto que puede escindirse por una enzima para que resulte en la producción de algún tipo de señal detectable que solo aparece cuando el sustrato se escinde de la molécula base. El sustrato cromogénico es incoloro, hasta que reacciona con la enzima, momento en el que se produce un producto de color intenso. Por lo tanto, el material de las colonias de bacterias adheridas a la lámina de membrana se volverá de un color azul/púrpura/negro intenso o marrón/rojo, mientras que el material de otras colonias permanecerá incoloro. Los ejemplos de moléculas de detección incluyen sustancias fluorescentes, tales como el 4-metilumbeliferil fosfato, y sustancias cromogénicas, tales como el 4-nitrofenilfosfato, 3,3', 5,5'-tetrametilbencidina y 2,2'-azino-di-[3-ethelbenz-sulfonato de tiazoliano (6)]. Además de la fosfatasa alcalina y la peroxidasa, otras enzimas útiles incluyen p-galactosidasa, p-glucuronidasa, aglucosidasa, p-glucosidasa, a-manosidasa, galactosa oxidasa, glucosa oxidasa y hexoquinasa.

La detección de bacterias de interés mediante el uso de NMR puede lograrse de la siguiente manera. En el uso de la NMR como metodología de detección, en la que se entrega una muestra a una bobina detectora centrada en un imán, el objetivo de interés, tal como una bacteria marcada magnéticamente, puede administrarse por un medio fluido, tal como un fluido sustancialmente compuesto de agua. En tal caso, el objetivo marcado magnéticamente puede pasar de una región de campo magnético muy bajo a una región de campo magnético alto, por ejemplo, un campo producido por un imán de Tesla de aproximadamente 1 a aproximadamente 2. De esta manera, la muestra puede atravesar un gradiente magnético, acercarse al imán y salir del imán. Como puede verse a través de las ecuaciones 1 y 2 debajo, el objetivo puede experimentar una fuerza que empuja hacia el imán en la dirección del flujo de muestra que se acerca al imán, y una fuerza hacia el imán en la dirección opuesta del flujo al salir del imán El objetivo puede experimentar una fuerza de retención que atrapa al objetivo en el imán si el flujo no es suficiente para superar la fuerza del gradiente.

m punto (del B) = F Ecuación 1

vt = -F/(6*p*n*r) Ecuación 2

donde n es la viscosidad, r es el diámetro de la partícula, F es la fuerza del vector, B es el campo del vector, y m es el momento del vector de la partícula.

Los campos magnéticos en una trayectoria hacia un imán pueden no ser uniformes en la dirección transversal con respecto al flujo hacia el imán. Como tal, puede haber una fuerza transversal que atrae objetivos hacia el lado de un recipiente o un conducto que proporciona el flujo de muestra al imán. Generalmente, el tiempo que le toma a un objetivo alcanzar la pared de un conducto se asocia con la velocidad terminal y es menor al aumentar la viscosidad. La velocidad terminal se asocia con la fuerza de arrastre, que puede ser indicativa de flujo lento en ciertos casos. En general, puede ser ventajoso tener una alta viscosidad para proporcionar una mayor fuerza de arrastre de manera que un objetivo tenderá a transportarse con el flujo de fluido a través del imán sin que quede atrapado en el imán o contra las paredes del conducto.

Los fluidos newtonianos tienen una característica de flujo en un conducto, tal como una tubería redonda, por ejemplo, que es parabólica, de manera que la velocidad de flujo es cero en la pared y máxima en el centro, y que tiene una característica parabólica con radio. La velocidad disminuye en una dirección hacia las paredes, y es más fácil atrapar magnéticamente los objetivos cerca de las paredes, ya sea con gradientes transversales que ejercen fuerza sobre el objetivo hacia la pared del conducto, o en gradientes longitudinales suficientes para evitar el flujo objetivo en la tubería en cualquier posición. Con el fin de proporcionar una fuerza de arrastre de fluido favorable para evitar que las muestras queden atrapadas en el conducto, puede ser ventajoso tener una condición de flujo de tapón, en el que la velocidad del fluido es sustancialmente uniforme en función de la posición radial en el conducto. Cuando se emplea la detección de NMR en relación con una muestra que fluye, la detección puede basarse en una perturbación de la señal de agua de NMR causada por un objetivo marcado magnéticamente (Sillerud y otros, JMR (Journal of Magnetic Resonance), vol. 181, 2006). En tal caso, la muestra puede excitarse en el momento 0, y después de algún retraso, tal como aproximadamente 50 ms o aproximadamente 100 ms, puede producirse una medición aceptable (basada en una señal de NMR detectada). Alternativamente, tal medición puede producir inmediatamente después de la excitación, con la detección continua durante un tiempo, tal como aproximadamente 50 ms o aproximadamente 100 ms. Puede ser ventajoso detectar la señal de NMR durante períodos de tiempo sustancialmente más largos después de la excitación.

A manera de ejemplo, la detección de la señal de NMR puede continuar durante un período de aproximadamente 2 segundos para registrar información espectral a alta resolución. En el caso del flujo parabólico o newtoniano, la perturbación excitada en el momento 0 generalmente se difumina debido a que el agua alrededor de la fuente de perturbación viaja a diferentes velocidades, en dependencia de la posición radial en el conducto. Además, la información espectral puede perderse debido a los efectos de difuminado o mezcla del movimiento diferencial del fluido de muestra durante la detección de la señal. Cuando se realiza una aplicación de detección de NMR que implica una muestra de fluido que fluye, puede ser ventajoso proporcionar un flujo de muestra en forma de tapón para facilitar el contraste de NMR conveniente y/o la detección de señal de NMR conveniente.

El movimiento diferencial dentro de un fluido newtoniano que fluye puede tener efectos nocivos en ciertas situaciones, tal como una situación en la que se desea la detección de NMR localizada espacialmente, como en la imagen por resonancia magnética. En un ejemplo, un objeto magnético, tal como una bacteria marcada magnéticamente, fluye a través del detector de NMR y su presencia y localización se detectan mediante el uso de técnicas MRI. La detección puede ser posible debido al campo magnético del objeto magnético, ya que este campo perturba el campo magnético del fluido en las proximidades del objeto magnético. La detección del objeto magnético se mejora si el fluido cerca del objeto permanece cerca del objeto. En estas condiciones, se puede permitir que la perturbación magnética actúe durante más tiempo en cualquier elemento de volumen dado del fluido, y los elementos de volumen del fluido de esta manera afectados permanecerán en una proximidad espacial cercana. Tal perturbación magnética más fuerte y localizada se detectará más fácilmente mediante el uso de técnicas de NMR o MRI.

Si se usa un fluido newtoniano para transportar los objetos magnéticos a través del detector, la velocidad de los elementos de volumen de fluido dependerá de la posición radial en el conducto de fluido. En tal caso, el fluido cerca de un objeto magnético no permanecerá cerca del objeto magnético a medida que el objeto fluye a través del detector. El efecto de la perturbación magnética del objeto sobre el fluido circundante puede difuminarse en el espacio, y la fuerza de la perturbación en cualquier elemento de volumen de fluido puede reducirse debido a que ese elemento no permanece dentro del rango de la perturbación. La perturbación más débil y menos localizada en el fluido de la muestra puede ser indetectable mediante el uso de técnicas de NMR o MRI.

Ciertos líquidos, o mezclas de líquidos, exhiben perfiles de flujo no parabólicos en conductos circulares. Tales fluidos pueden exhibir perfiles de flujo no newtonianos en otras formas de conducto. El uso de tal fluido puede resultar ventajoso como el fluido de detección en una aplicación que emplea un dispositivo de detección basado en NMR. Cualquier efecto ventajoso puede atribuirse a la alta viscosidad del fluido, un perfil de flujo tipo tapón asociado con el fluido y/u otras características atribuidas al fluido que facilitan la detección. Como ejemplo, un fluido de fluidificación por cizallamiento de alta viscosidad puede exhibir un perfil de velocidad de flujo que sea sustancialmente uniforme a través de las regiones centrales de la sección transversal del conducto. El perfil de velocidad de tal fluido puede pasar a un valor cero o muy bajo cerca o en las paredes del conducto, y esta región de transición puede limitarse a una capa muy delgada cerca de la pared.

No todos los fluidos, o todas las mezclas de fluidos, son compatibles con la metodología de detección de NMR. En un ejemplo, una mezcla de glicerol y agua puede proporcionar una alta viscosidad, pero la medición de NMR se degrada debido a que se detectan señales de NMR separadas del agua y las moléculas de glicerol que forman la mezcla. Esto puede obstaculizar la sensibilidad del detector de NMR. En otro ejemplo, el componente no acuoso de la mezcla fluida se puede elegir para que no tenga señal de NMR, lo que puede lograrse mediante el uso de un componente fluido perdeuterado, por ejemplo, o mediante el uso de un componente fluido perfluorado. Este enfoque puede sufrir la pérdida de intensidad de la señal ya que una porción del fluido en la bobina de detección no produce una señal.

Otro enfoque puede ser usar un componente de fluido secundario que constituya solo una pequeña fracción de la mezcla total de fluido. Tal componente de fluido secundario de baja concentración puede producir una señal de NMR de intensidad insignificante en comparación con la señal del componente principal del fluido, que puede ser agua. Puede ser ventajoso usar un componente de fluido secundario de baja concentración que no produce una señal de NMR en el detector. Por ejemplo, puede usarse un componente de fluido secundario perfluorado o perdeuterado.

La mezcla de fluidos utilizada en el detector de NMR puede incluir uno, dos o más de dos componentes secundarios además del componente de fluido principal. Los componentes de fluido empleados pueden actuar en colaboración para producir las características de flujo de fluido deseadas, tales como alta viscosidad y/o flujo de tapón. Los componentes de fluido pueden ser útiles para proporcionar características de fluido que son ventajosas para el rendimiento del detector de NMR, por ejemplo, al proporcionar tiempos de relajación de NMR que permiten un funcionamiento más rápido o intensidades de señal más altas.

Un fluido no newtoniano puede proporcionar ventajas adicionales para la detección de objetos mediante técnicas de NMR o MRI. Como ejemplo, los objetos que se detectan pueden tener sustancialmente la misma velocidad a medida que pasan a través de la bobina de detección. Esta velocidad característica puede permitir algoritmos más simples o más robustos para el análisis de los datos de detección. Como otro ejemplo, los objetos que se detectan pueden tener una velocidad fija, conocida y uniforme. Esto puede resultar ventajoso en dispositivos donde se necesita la posición del objeto detectado en momentos posteriores, tal como en un dispositivo que tiene una cámara de secuestro o una cámara de detección secundaria aguas abajo de la bobina de detección de NMR o MRI, por ejemplo.

En una modalidad ilustrativa, se logró con éxito el suministro de muestra dentro y fuera de un imán cilíndrico 1,7T mediante el uso de un medio de suministro de fluido que contenía goma de xantano al 0,1 % a 0,5 % en agua. Tal suministro es adecuado para proporcionar un flujo sustancialmente similar a un tapón, una alta viscosidad, tal como de aproximadamente 10 cP a aproximadamente 3.000 cP, y un buen contraste de NMR en relación con el agua. La goma de xantano actúa como un fluido no newtoniano, que tiene características de un fluido no newtoniano que se conocen bien en la técnica, y no compromete las características de la señal de NMR convenientes para una buena detección en un modo de operación conveniente.

En ciertas modalidades, los métodos de la invención son útiles para la detección directa de bacterias en la sangre. Tal proceso se describe aquí. La muestra se recoge en un tubo de heparina de sodio mediante punción venosa, el volumen de muestra aceptable es de 1 ml a 10 ml. La muestra se diluye con tampón de unión y se añaden a la muestra partículas superparamagnéticas que tienen restos de unión específicos del objetivo, seguido de incubación en una incubadora con agitación a 37 °C durante aproximadamente 30 min a 120 min. También pueden usarse métodos de mezcla alternativos. En una modalidad particular, la muestra se bombea a través de un mezclador estático, de modo que se añaden a la muestra tampón de reacción y partículas magnéticas a medida que la muestra se bombea a través del mezclador. Este proceso permite la integración eficiente de todos los componentes en una sola pieza fluídica, evita piezas móviles y recipientes de incubación separados y reduce el tiempo de incubación. La captura de los objetivos marcados permite la eliminación de componentes sanguíneos y la reducción del volumen de muestra de 30 ml a 5 ml. La captura se realiza en una variedad de configuraciones de imán/flujo. En ciertas modalidades, los métodos incluyen la captura en un tubo de muestra en una plataforma de agitación o la captura en un dispositivo de flujo continuo a un caudal de 5 ml/min, lo que resulta en un tiempo total de captura de 6 min.

Después de la captura, la muestra se lava con tampón de lavado que incluye heparina para eliminar los componentes sanguíneos y las partículas libres. La composición del tampón de lavado está optimizada para reducir la agregación de partículas libres, al tiempo que mantiene la integridad de los complejos partícula/objetivo.

El método de detección se basa en un detector de NMR en miniatura sintonizado a la resonancia magnética del agua. Cuando la muestra es magnéticamente homogénea (sin objetivos unidos), la señal de NMR del agua es claramente detectable y fuerte. La presencia de material magnético en la bobina del detector perturba el campo magnético, lo que resulta en una reducción en la señal del agua. Uno de los principales beneficios de este método de detección es que no hay fondo magnético en las muestras biológicas, lo que reduce significativamente los requisitos de rigurosidad del procesamiento de la muestra. Además, dado que la señal detectada se genera por el agua, hay una amplificación de señal incorporada que permite la detección de una sola bacteria marcada.

Ejemplos

Ejemplo 1: Muestra

Las muestras de sangre de voluntarios sanos se enriquecieron con concentraciones clínicamente relevantes de bacterias (1-10 CFU/ml), que incluyeron tanto cepas de laboratorio como aislamientos clínicos de las especies bacterianas que se encuentran con mayor frecuencia en las infecciones del torrente sanguíneo.

Ejemplo 2: Preparación de anticuerpos

Con el fin de generar IgG policlonal, específica para bacterias pan-grampositivas, se inmunizó una cabra mediante la administración, primero de antígenos bacterianos suspendidos en el ganglio linfático intra adyuvante completo de Freund, seguido de inyección subcutánea de antígenos bacterianos en adyuvante incompleto de Freund en intervalos de 2 semanas. Los antígenos se prepararon para la producción de anticuerpos haciendo crecer bacterias a fase exponencial (OD⁶⁰⁰ = 0,4-0,8). Después de la cosecha de la bacteria por centrifugación, la bacteria se inactivó mediante el uso de fijación de formalina en formaldehído al 4 % durante 4 horas a 37 °C. Después de 3 lavados de bacterias con PBS (15 minutos de lavado, centrifugación durante 20 minutos a 4.000 rpm), se midió la concentración de antígeno mediante el uso del ensayo BCA y el antígeno se usó a 1 mg/ml para la inmunización. Para generar IgG específica de bacterias Gram-positivas, se utilizaron varias especies bacterianas para la inoculación: Estafilococo dorado, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecium y Enterococcus fecalis.

El suero inmune se purificó mediante el uso de cromatografía de afinidad en una columna de proteína G sefarosa (GE Healthcare), y la reactividad se determinó mediante el uso de ELISA. Los anticuerpos que reaccionan de forma cruzada con bacterias y hongos gramnegativos se eliminaron por absorción de IgG purificada con bacterias y hongos gramnegativos fijados con formalina. Los organismos fijados con formalina se prepararon de forma similar a la descrita anteriormente y se mezclaron con IgG. Después de la incubación por 2 horas a temperatura ambiente, la preparación se centrifugó para eliminar las bacterias. La preparación final de anticuerpos se aclaró por centrifugación y se usó para la preparación de partículas magnéticas específicas de antígeno.

Se generaron IgG pan-Gramnegativas de manera similar mediante el uso de Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens y otras bacterias gram-negativas inactivadas como inmunógenos. La fracción IgG del suero se purificó mediante el uso de cromatografía de afinidad con proteína G como se describe anteriormente. Similarmente, se generaron anticuerpos específicos del objetivo mediante la inoculación de cabras mediante el uso de bacterias fijadas con formalina, la inmunización se realizó con 2 o más organismos estrechamente relacionados. Ejemplo 3: Preparación de partículas magnéticas específicas de antígeno

Las partículas superparamagnéticas se sintetizaron al encapsular nanopartículas de óxido de hierro (5-15 nm de diámetro) en un núcleo de látex y marcarlas con IgG de cabra. Las nanopartículas que contienen ferrofluido en disolvente orgánico se precipitaron con etanol, las nanopartículas se suspendieron nuevamente en solución acuosa de estireno y tensioactivo Hitenol BC-10, y se emulsionaron mediante el uso de sonicación. La mezcla se dejó equilibrar durante la noche con agitación y se filtró a través de filtros de 1,2 y 0,45 |jm para lograr un tamaño de micela uniforme. Se añadieron estireno, ácido acrílico y divinilbenceno en tampón de carbonato a pH 9,6. La polimerización se inició en una mezcla a 70 °C con la adición de K²S²O⁸ y la reacción se dejó completar durante la noche. Las partículas sintetizadas se eliminaron 3 veces con SDS al 0,1 % mediante el uso de captura magnética, se filtraron a través de filtros de 1,2, 0,8 y 0,45 jm y se usaron para la conjugación de anticuerpos.

La producción de partículas resultó en una distribución de tamaños que puede caracterizarse por un tamaño promedio y una desviación estándar. En el caso del marcado y la extracción de bacterias de la sangre, se encontró que el tamaño promedio para un rendimiento óptimo era entre 100 y 350 nm, por ejemplo, entre 200 nm y 250 nm. Las IgG purificadas se conjugaron con partículas preparadas mediante el uso de química EDC/sulfo-NHS estándar. Después de la conjugación, las partículas se resuspendieron en BSA al 0,1 % que se usa para bloquear sitios de unión no específicos en la partícula y para aumentar la estabilidad de la preparación de la partícula.

Ejemplo 4: Marcado de células raras mediante el uso de un exceso de nanopartículas magnéticas

Las bacterias, presentes en la sangre durante la infección del torrente sanguíneo, se marcaron magnéticamente mediante el uso de las partículas superparamagnéticas preparadas en el Ejemplo 3 anterior. Las muestras enriquecidas como se describe en el Ejemplo 1 se diluyeron 3 veces con un tampón de unión basado en Tris y partículas específicas del objetivo, seguido de una incubación en una plataforma de agitación a 37 °C durante un máximo de 2 horas. La concentración óptima de partículas se determinó por titulación y se encontró que estaba en el rango entre 1 * 108 y 5 * 1010 partículas/mL. Después de la incubación, los objetivos marcados se separaron magnéticamente seguido de un paso de lavado diseñado para eliminar los productos sanguíneos. Ver el ejemplo 5 más abajo.

Ejemplo 5: Captura magnética de bacterias unidas

La sangre, incluidas las bacterias objetivo marcadas magnéticamente y el exceso de partículas libres, se inyectó en una celda de captura de flujo continuo con varios imanes de barra de tierras raras potentes colocados perpendicularmente al flujo de la muestra. Con el uso de una cámara de flujo con una sección transversal de paso de flujo de 0,5 mm * 20 mm (h * w) e imanes de NdFeB de 7 bar, se logró un caudal de hasta 5 ml/min. Después de hacer fluir la mezcla a través del canal en presencia del imán, se hizo fluir a través del canal una solución de lavado que incluía heparina. Los objetivos unidos se lavaron con tampón que contenía heparina una vez para eliminar los componentes sanguíneos y reducir la formación de agregados de partículas magnéticas. Para lavar eficazmente los objetivos unidos, se retiró el imán y el material magnético capturado se resuspendió en un tampón de lavado, seguido de una nueva aplicación del campo magnético y la captura del material magnético en la misma celda de captura de flujo continuo.

La eliminación de los objetivos marcados capturados fue posible después de alejar los imanes de la cámara de captura y eluir con un flujo de solución tampón.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para aislar patógenos de una muestra heterogénea, la composición comprende:

una muestra heterogénea que comprende un patógeno; y

una pluralidad de conjuntos de partículas magnéticas, los miembros de cada conjunto se conjugan con diferentes anticuerpos que son específicos para un patógeno,

en donde al menos dos de la pluralidad de conjuntos están en diferentes concentraciones diseñadas para la detección de un patógeno específico en dicha muestra heterogénea.

2. Una pluralidad de partículas magnéticas funcionalizadas de manera diferente, de modo que la pluralidad de partículas se une a una pluralidad de patógenos diferentes en una muestra heterogénea, en donde al menos algunas de las partículas funcionalizadas de manera diferente están en diferentes concentraciones diseñadas para la detección de un patógeno específico en dicha muestra heterogénea.

3. La composición de la reivindicación 1 o las partículas de la reivindicación 2, en donde las partículas están marcadas de manera diferente.

4. La composición de la reivindicación 1 o partículas de la reivindicación 3, en donde el marcador es un marcador óptico.

5. La composición de la reivindicación 1 o partículas de la reivindicación 4, en donde el marcador óptico es un marcador fluorescente.

6. La composición de la reivindicación 1 o las partículas de la reivindicación 2, en donde los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.

7. La composición de la reivindicación 1 o las partículas de la reivindicación 2, en donde los anticuerpos son anticuerpos policlonales.

8. La composición de la reivindicación 1 o las partículas de la reivindicación 2, en donde el patógeno son bacterias grampositivas.

9. La composición de la reivindicación 1 o las partículas de la reivindicación 2, en donde el patógeno son bacterias gramnegativas.

10. La composición de la reivindicación 1 o las partículas de la reivindicación 2, en donde el patógeno son bacterias grampositivas y gramnegativas.