ES2908937T3

ES2908937T3 - Ensayo combinado para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Alzheimer

Info

Publication number: ES2908937T3
Application number: ES17801707T
Authority: ES
Inventors: Klaus Gerwert; Andreas Nabers; Jonas Schartner
Original assignee: Betasense GmbH
Current assignee: Betasense GmbH
Priority date: 2016-11-21
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2022-05-04
Anticipated expiration: 2037-11-21
Also published as: CA3044342A1; AU2017360097A1; JP2019537727A; WO2018091743A1; EP3542165B1; EP3542165A1; JP7117476B2; IL266778A; EP3324187B1; KR20190089928A; US20190285651A1; CN110168374A; ES2791962T3; EP3324187A1

Abstract

Método para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad mediante análisis directo de la distribución de estructura secundaria de una fracción de péptido amiloide-beta (Ab) soluble y una fracción de proteína Tau soluble en líquidos corporales, que comprende las etapas de (a) dirigir, en una primera celda de IR que comprende un primer elemento de sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente a los infrarrojos y al menos un receptor para el péptido Ab directamente injertado en al menos una superficie de dicho núcleo, siendo dicho al menos un receptor para el péptido Ab anticuerpos que pueden unirse de manera específica y conformacionalmente independiente al péptido Ab, al menos un flujo de un líquido corporal con péptido Ab soluble, transmitir un haz de IR a través de dicha primera celda de IR y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo; (b) dirigir, en una segunda celda de IR que comprende un segundo elemento de sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente a los infrarrojos y al menos un receptor para la proteína Tau directamente injertado en al menos una superficie de dicho núcleo, siendo dicho al menos un receptor para la proteína Tau anticuerpos que pueden unirse de manera específica y conformacionalmente independiente a la proteína Tau, al menos un flujo de un líquido corporal con proteína Tau soluble, transmitir un haz de IR a través de dicha segunda celda de IR y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo; y (c) analizar los espectros de infrarrojos obtenidos para determinar la distribución de estructura secundaria del péptido Ab soluble y de la proteína Tau soluble en los líquidos corporales para el diagnóstico diferencial, en el que una disminución de la banda de amida I del péptido Ab y de la proteína Tau es indicativa del estadio de la enfermedad.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo combinado para el diagnóstico diferencial de la enfermedad de Alzheimer

La invención proporciona un ensayo de inmunoinfrarrojos combinado para el diagnóstico diferencial y la subdasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad. El método puede aplicarse para obtener un diagnóstico de enfermedad garantizado y la estratificación del paciente. El ensayo considera la detección sin etiquetas del cambio en la distribución de estructura secundaria del péptido amiloidebeta y la proteína Tau en líquidos corporales. Este cambio en la estructura secundaria de isoformas nativas a enriquecidas en láminas p se produce de manera diferida para Ap y Tau, pero aparece años antes de la manifestación clínica de la enfermedad. En la actualidad, el método combinado utiliza este cambio para el diagnóstico basado en biopsias líquidas.

Antecedentes de la invención

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una de las enfermedades neurodegenerativas más frecuentes que afecta a más de 35 millones de personas en todo el mundo (Prince et al., Londres, R.U. doi:10.1111/j.0963-7214.2004.00293.x (2015)). El diagnóstico diferencial y la subclasificación de EA, especialmente en los estadios tempranos o prodrómicos de la enfermedad, sigue siendo un desafío en la rutina clínica. La necesidad de biomarcadores fiables para la detección temprana de EA se encuentra actualmente bajo demanda. Sin embargo, los diagnósticos diferenciales tempranos y garantizados son fundamentales para futuras intervenciones terapéuticas (Chiba, Neurodegenerative Diseases, editado por Uday Kishore, 181-225. InTech doi:10.5772/55293 (2013) ; Thorsett y Latimer, Current Opinion Chem. Biol. 4(4):377-82 (2000)). Por tanto, los institutos de investigación científica están centrándose en pruebas de diagnóstico sencillas, preferiblemente basadas en biopsias líquidas (Doecke, Arch. Biol. 69( 10): 1318 doi:10.1001/archneurol.2012.1282 (2012); Andreasen et al., J. Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 64(3):298-305 (1998); Fiandaca et al., Frontiers in Neurology 6(Nov):1-13 doi:10.3389/fneur.2015.00237 (2015); Mapstone et al., Nature Medicine 20(4):415-18. doi:10.1038/nm.3466 (2014) ).

En la enfermedad de Alzheimer, se plantea un cambio en la estructura secundaria del péptido amiloide-beta (Ap) y la proteína Tau, en su mayoría intrínsecamente desordenados, para dar isoformas enriquecidas en láminas p como acontecimiento iniciador durante la evolución de la enfermedad (Sarroukh et al., Cell. Mol. Life Sci.

68(8):1429-38 doi:10.1007/s00018-010-0529-x (2011); Cerf et al., Biochem. J. 421(3):415-23 doi: 10.1042/BJ20090379 (2009); Fandrich, et al., Prion 3(2):89-93 (2009); Sachse et al., PNAS 105(21):7462-66 doi:10.1073/pnas.0712290105 (2008); Glabe, J. Biol. Chem. 283(44):29639-43 doi:10.1074/jbc.R800016200 (2008); Cavallucci et al., Mol. Neurobiol. doi:10.1007/s12035-012-8251-3 (2012); Haass y Selkoe, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8(2):101-12 doi:10.1038/nrm2101 (2007); Kolarova et al., Int. J. Alzheimer's Disease doi:10.1155/2012/731526 (2012); Yang et al., Devel. Brain Res. 156(2):127-38 doi:10.1016/j.devbrainres.2005.02.004 (2005)). De ese modo, se sugiere que la agregación y deposición de Tau en ovillos neurofibrilares (NFT) acompaña a la agregación de Ap (Lo et al., Arch. Neurol. 68(10):1257-66 doi:10.1001/archneurol.2011.123 (2011); Bennett et al., Arch. Neurol. 61(3):378-84 doi:10.1001/archneur.61.3.378 (2004); Coomaraswamy et al., PNAS 107(17):7969-74 doi:10.1073/pnas.1001056107 (2010); Braak y Braak, Acta Neuropathologica 82(4):239-59 doi: 10.1007/BF00308809 (1991); Thal et al., J. Neuropath. Exp. Neurol. 59(8):733-48 (2000); Thal et al., Science of Aging Knowledge Environment 2006(6):re1 doi:10.1126/sageke.2006.6.re1 (2006)).

En la rutina clínica, se usan pruebas neuropsicológicas y resultados cuantitativos neuroquímicos de niveles de diversos biomarcadores en líquido cefalorraquídeo (LCR) para el diagnóstico diferencial del estado de la técnica. Sin embargo, las propias concentraciones de biomarcadores, como el nivel de Ap40, Ap42, Tau total o Tau hiperfosforilada, pueden no correlacionarse con la evolución de la EA (Wiltfang et al., J Neurochem., 101(4):1053-59 doi:10.1111/j.1471-4159.2006.04404.x (2007), Gabelle et al., J Alzheimers Dis., 26(3):553-63 doi: 10.3233/JAD-2011-110515 (2011), Blennow et al., J Nutr Health Aging, 13(3):205-8 doi:10.1007/s12603-009-0059-0 (2009)). Además, basándose en la cuantificación de estos biomarcadores, el diagnóstico diferencial sigue siendo un desafío. Sin embargo, la tomografía por emisión de positrones (TEP) y la tomografía por resonancia magnética (TRM) detectan agregados (acumulados a partir de proteínas enriquecidas en láminas p) tales como placas en el cerebro humano. No obstante, la TEP y la TRM son técnicas muy costosas y que requieren mucho tiempo, que no son aplicables para la detección de estadios prodrómicos de la EA y, por tanto, sólo proporcionan la determinación de los estadios moderados/tardíos de la enfermedad. En el caso de TEP, una desventaja adicional es el uso de agentes de contraste, que también estresan a los pacientes. Además de las técnicas ya mencionadas, los inmunoensayos basados en fluorescencia constituyen un campo emergente, especialmente el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y el análisis de distribución de intensidad de fluorescencia basado en superficie (sFIDA). Sin embargo, estas técnicas requieren anticuerpos de detección marcados con fluorescencia, que pueden influir en la estructura secundaria del biomarcador analizado. Además, el ELISA y el sFIDA no revelaron ninguna información directa sobre la estructura secundaria de la proteína ni la distribución de estructura secundaria. Además, hasta la fecha nunca se ha usado la estructura secundaria de la proteína Tau con fines diagnósticos o diferenciales debido a la falta de sensibilidad conformacional de las técnicas mencionadas.

Con el fin de determinar tal cambio en la estructura secundaria, la espectroscopía de diferencia de infrarrojos con transformada de Fourier (FTIR) es una herramienta potente (Kotting y Gerwert, Chemphyschem 6(5):881-888 doi:10.1002/cphc.200400504 (2005)). La frecuencia de la banda de amida I provocada por la vibración de C=O del enlace peptídico es indicativa de la estructura secundaria de la estructura principal de la proteína. Especialmente, el aumento de las isoformas de biomarcador enriquecidas en láminas p en líquidos corporales se detecta de manera fiable por una disminución de la frecuencia hasta 1630 cm-1 monitorizada mediante la técnica de reflexión total atenuada (ATR) por exploración de superficie. Con el fin de analizar la distribución de estructura secundaria de una proteína específica en líquidos corporales, la proteína de interés debe unirse selectivamente en el interior de la capa superficial, lo que se logra con un elemento de reflexión interna (IRE) funcionalizado con anticuerpos (Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)). Este método se aplicó para la extracción y determinación de la distribución de estructura secundaria de la fracción de Ap soluble de LCR y plasma sanguíneo para la diferenciación de EA moderada y control de la enfermedad (Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016); Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)).

En cambio, se usan técnicas tales como resonancia de plasmón superficial (SPR), ondas acústicas superficiales o microbalanza de cristal de cuarzo para analizar interacciones proteína-ligando o proteína-fármaco. Puesto que estas técnicas sólo proporcionan información cinética, pero no resolución espectral, no pueden revelar un cambio directo en la estructura secundaria dentro de una proteína. Técnicas adicionales tales como espectroscopía de absorción de infrarrojos potenciada en superficie (SEIRA) proporcionarían, en teoría, resolución espectral, pero la reproducibilidad de las mediciones supone un gran reto debido a la preparación de las superficies de oro rugosa y, por tanto, no proporciona una plataforma robusta para el análisis de la transición de la estructura secundaria de la proteína.

El documento WO 2015/121339 proporciona un biosensor para el análisis de la conformación y la estructura secundaria, en particular para el análisis cualitativo directo no invasivo de la estructura secundaria de una única proteína seleccionada dentro de una mezcla compleja, como, por ejemplo, un líquido corporal, mediante métodos espectroscópicos vibracionales. Para el análisis, no se requiere que la sustancia seleccionada esté aislada, concentrada ni pretratada mediante un procedimiento preparativo especial. El biosensor es adecuado para la determinación de la evolución de una enfermedad, en la que una transición conformacional de una proteína biomarcadora candidata está asociado con la evolución de la enfermedad, en la que un cambio del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la evolución de la enfermedad. Teniendo en cuenta enfermedades por plegamiento erróneo de la proteína como, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob o la enfermedad de Huntington, esta información está relacionada de manera crucial con la evolución de la enfermedad.

Breve descripción de la invención

El contenido de la invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

La enfermedad de Alzheimer (EA) es una proteopatía multifactorial que incluye el plegamiento erróneo de dos candidatos a biomarcador destacados. Ambos, el péptido amiloide-beta (Ap) y la proteína Tau, muestran isoformas de láminas p potenciadas durante la evolución de la enfermedad. Previamente, pudo aplicarse un aumento del contenido de isoformas de Ap de láminas p en la fracción de Ap total en líquido cefalorraquídeo (LCR) y plasma sanguíneo para la detección de EA mediante un sensor inmunoinfrarrojo. En este caso, se analizaron 300 muestras de pacientes con control de enfermedad (DC) y demencia tipo Alzheimer (DAT) en cuanto a la distribución de estructura secundaria de Ap soluble (LCR, plasma sanguíneo) y la proteína Tau (LCR), respectivamente. La distribución de estructura secundaria de la proteína Tau demostró ser un marcador general de demencia, no específicamente para DAT, pero un análisis de datos combinados de Ap y Tau dio lugar a un ensayo de diagnóstico para la diferenciación de DC/DAT con una precisión del 93%. Además, la evaluación de datos combinados mostró la posibilidad de subdividir a los pacientes con DAT en estadios tempranos y tardíos de DAT y puede proporcionar un diagnóstico diferencial de sujetos con DC.

Por tanto, la invención proporciona

(1) un método para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad mediante análisis directo de la distribución de estructura secundaria de una fracción de péptido amiloide-beta (Ap) soluble y una fracción de proteína Tau soluble en líquidos corporales, que comprende las etapas de

(a) dirigir, en una primera celda de IR que comprende un primer elemento de sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente a los infrarrojos y al menos un receptor para el péptido Ap directamente injertado en al menos una superficie de dicho núcleo, siendo dicho al menos un receptor para el péptido Ap anticuerpos que pueden unirse de manera específica y conformacionalmente independiente al péptido Ap, al menos un flujo de un líquido corporal con péptido Ap soluble, transmitir un haz de IR a través de dicha primera celda de IR y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo;

(b) dirigir, en una segunda celda de IR que comprende un segundo elemento de sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente a los infrarrojos y al menos un receptor para la proteína Tau directamente injertado en al menos una superficie de dicho núcleo, siendo dicho al menos un receptor para la proteína Tau anticuerpos que pueden unirse de manera específica y conformacionalmente independiente a la proteína Tau, al menos un flujo de un líquido corporal con proteína Tau soluble, transmitir un haz de IR a través de dicha segunda celda de IR y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo; y

(c) analizar los espectros de infrarrojos obtenidos para determinar la distribución de estructura secundaria del péptido Ap soluble y de la proteína Tau soluble en los líquidos corporales para el diagnóstico diferencial, en el que una disminución de la banda de amida I del péptido Ap y de la proteína Tau es indicativa del estadio de la enfermedad.

La invención proporciona además un kit para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad, que comprende elementos de sensor infrarrojo primero y segundo según la presente invención.

La invención también proporciona un dispositivo para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad, comprendiendo dicho dispositivo elementos de sensor infrarrojo primero y segundo según la presente invención.

La invención proporciona además un uso de los elementos de sensor infrarrojo primero y segundo según la presente invención, del kit según la presente invención o del dispositivo según la presente invención, para el análisis directo de la distribución de estructura secundaria de una fracción de péptido amiloide-beta (Ap) soluble y una fracción de proteína Tau soluble en líquidos corporales.

Por tanto, la invención proporciona

(2) una realización preferida del aspecto (1) anterior, en la que dichos elementos de sensor infrarrojo primero y segundo comprenden un elemento de reflexión interna de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo,

(3) un kit para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad, que comprende elementos de sensor infrarrojo primero y segundo tal como se define en el punto (1) ó (2) anterior,

(4) un dispositivo para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad, comprendiendo dicho dispositivo elementos de sensor infrarrojo primero y segundo tal como se define en el punto (1) ó (2) anterior, y

(5) el uso de los elementos de sensor infrarrojo primero y segundo tal como se define en el punto (1) ó (2) anterior, del kit tal como se define en el punto (3) anterior o del dispositivo tal como se define en el punto (4) anterior, para el análisis directo de la distribución de estructura secundaria de una fracción de péptido amiloidebeta (Ap) soluble y una fracción de proteína Tau soluble en líquidos corporales.

La presente invención se basa en la detección independiente de Ap y Tau con dos elementos de sensor. En este contexto, el análisis y la subclasificación se basan en la determinación de la distribución de estructura secundaria de Ap y Tau, ambos extraídos por separado de líquidos corporales. Hasta la fecha, nunca se ha considerado la distribución de estructura secundaria de la proteína Tau en LCR con fines diagnósticos. Además, incluir el cambio en la estructura secundaria de Tau de LCR para la detección de la enfermedad de Alzheimer proporciona más de un efecto aditivo sobre la precisión de diagnóstico. Analizar la distribución de estructura secundaria de Ap (por ejemplo, en LCR y/o plasma sanguíneo) y Tau (por ejemplo, en LCR) permite la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en estadios de leves a graves de la enfermedad y la diferenciación entre EA y otros tipos de demencia.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: esquema del ensayo de inmunoinfrarrojos combinado y principio del análisis. (A) Se extrajeron por separado la fracción total de Ap (1) y Tau (2) presentes en LCR y/o plasma usando un sensor inmunoinfrarrojo funcionalizado con anticuerpos. La distribución de estructura secundaria de Ap y Tau detectada se indica por la posición del máximo de amida I de infrarrojos.

Figura 2: distribución de la posición del máximo de amida I tal como se muestra en gráficos de cajas para la discriminación de DC y DAT basándose en el análisis de Ap en LCR y plasma y de Tau en LCR. Ambos grupos de diagnóstico mostraron una diferencia significativamente alta en el máximo de amida I de Ap de LCR (p=2,5*10-11, ANOVA de Kruskal-Wallis, nivel de confianza a=0,05) y EDTA-plasma (p=3,4*10-9) y una significación moderada para Tau de LCR (p=1,6*10-3). En los gráficos de cajas, los cuantiles 25/50/75% se muestran como líneas horizontales, la posición de banda promedio como un cuadrado, la desviación estándar como bigotes y los valores mínimos/máximos observados como una cruz.

Figura 3: gráfico de dispersión tridimensional de la posición del máximo de amida I tal como se determina para Tau en LCR, Ap en LCR y Ap en EDTA-plasma para 61 muestras de DC (gris) y 39 de DAT (negro). Los puntos de datos dentro de la caja negra transparente indican sujetos que se identifican como DAT en los tres ensayos.

Figura 4: análisis de la curva ROC para la diferenciación de DC (n=61) y DAT (n=39) basándose en la determinación de la distribución de estructura secundaria de Ap en LCR (A), Ap en EDTA-plasma (B) y proteína Tau en LCR (C). En este orden, se logró una AUC de 0,90, 0,85 y 0,67. Por tanto, se calculó una precisión de diagnóstico del 92% (Ap, LCR), del 85% (Ap, plasma) y del 68% (Tau, LCR) (D). Basándose en estos datos, parece que la distribución de estructura secundaria de Tau sola es más bien un biomarcador general para demencia que para la detección específica de DAT.

Figura 5: diagrama del procedimiento para el diagnóstico diferencial y la clasificación del estadio de la enfermedad de DAT y otros tipos de demencia mediante el ensayo de inmunoinfrarrojos combinado. El ensayo se basa en la determinación de la distribución de estructura secundaria del péptido Ap y la proteína Tau en líquidos corporales. Esta distribución se representa por la posición del máximo de la banda de amida I sensible a la conformación por infrarrojos de la fracción de biomarcador extraída. Un máximo por debajo de la banda de marcador discriminadora de 1643 cm-1 se define como enfermo. Este procedimiento se aplica a la fracción de Ap extraída de LCR y plasma y a la fracción de proteína Tau de LCR. No se asignará demencia cuando los tres valores de biomarcador sean superiores o iguales a 1643 cm-1. En cambio, valores de biomarcador por debajo de 1643 cm-1 indican DAT grave. Se identificarán otros tipos de demencia cuando sólo el máximo de amida I de Tau esté por debajo de la banda de marcador.

Figura 6: se usó la determinación del máximo de amida I, que representa la distribución de estructura secundaria de Ap (LCR/plasma) y Tau (LCR), para la diferenciación de 61 pacientes con DC y 39 con DAT. De ese modo, un voto mayoritario (negro = máximo < 1643 cm-1 y gris = máximo > 1643 cm-1) representaba DC y DAT. Por tanto, sólo se observaron 3 falsos positivos para el grupo de DC y 4 para el grupo de DAT. Esto da como resultado una especificidad del 95%, una sensibilidad del 90% y, por tanto, una precisión de diagnóstico global del 93% para el análisis de datos combinados en comparación con la evaluación clínica por parte de gerontopsiquiatras y gerontoneurólogos.

Descripción detallada de la invención

Los sensores inmunoinfrarrojos y su producción se describen en la solicitud de patente previa del solicitante WO 2015/121339 y que se aplica ahora para la detección de la distribución de estructura secundaria tanto de Ap como de Tau en líquidos corporales. La producción de los sensores IR incluye la inmovilización directa e íntima de receptores para Ap o Tau, respectivamente, es decir, anticuerpos, sobre la superficie del material transparente a los infrarrojos mediante la química de silano o tiol con un protocolo simplificado optimizado. Para analizar el líquido (por ejemplo, suero, plasma sanguíneo o LCR), este se alimenta al sensor en un sistema de flujo. La sustancia macromolecular se inmoviliza por el anticuerpo sobre la superficie funcionalizada del sensor. Los elementos de sensor óptico son particularmente adecuados para el análisis por infrarrojos y opcionalmente además para el análisis paralelo o alternativo mediante otro método óptico que incluye la detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

Según la invención, el material transparente a los infrarrojos de las celdas de IR primera y segunda se selecciona independientemente de silicio, germanio, seleniuro de zinc, seleniuro de galio y diamante, y preferiblemente es germanio.

En una realización preferida de la invención, los elementos de sensor óptico tienen un elemento de reflexión interna que comprende un cristal de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo, geometría con forma de fibra o varilla. Se prefiere que el cristal de germanio sea un monocristal de germanio, mientras que se prefiere particularmente un monocristal de germanio de corte trapezoidal.

Además, se prefiere que el cristal de germanio permita o contemple uno, más de uno o más de tres reflexiones de la luz infrarroja a través del elemento de reflexión, se prefieren particularmente más de cinco reflexiones o incluso más de veinte reflexiones (se prefieren 25 reflexiones con 13 reflexiones detectadas de manera activa). Para permitir el contacto con la proteína biomarcadora candidata en tales reflexiones múltiples, el receptor para la proteína biomarcadora se injerta en el número apropiado de superficies de dicho elemento de reflexión interna de germanio.

Los grupos de unión de silano y tiol que pueden utilizarse para acoplar el receptor, y por tanto la macromolécula, con el elemento de reflexión interna de germanio incluyen grupos de unión de silano y tiol homogéneos, mezclas de grupos de unión de silano y mezclas de grupos de unión de tiol. Para permitir una unión estrecha e íntima de los grupos de unión de cadena corta del receptor/macromolécula, preferiblemente pueden utilizarse grupos de unión que tienen una longitud de cadena de grupo de unión efectiva (incluyendo átomos de carbono y heteroátomos) de no más de 20 átomos o no más de 15 átomos.

Tales grupos de unión de cadena corta incluyen grupos de unión de silano que tienen una de las siguientes fórmulas:

X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,

X²R1Si-(CH²)n-Y-(CH²)n'-Z, o

X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,

y los grupos de unión de tiol tienen la siguiente fórmula:

WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,

en las que W es R1S- o H, X en cada aparición se selecciona independientemente de halógeno y alcoxilo C^1-6, n es un número entero de 1 a 10, n' es un número entero de 1 a 5, R1 en cada aparición se selecciona independientemente de alquilo C^1-6, Y se selecciona de un enlace químico, -O-, -CO-, -SO²-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2s O²- y -SO²NR²-(en los que R2 es H o alquilo C^1-6) y Z es un grupo reactivo con aminas que incluye -CO²H, -SO³H y derivados de éster de los mismos.

El halógeno incluye un átomo de flúor, cloro, bromo y yodo. El alquilo C^1-6y el alcoxilo C^1-6incluyen grupos alquilo o alcoxilo lineales, ramificados o cíclicos que tienen 1 a 6 átomos de carbono que pueden estar saturados o insaturados. En el caso de grupos alquilo y alcoxilo cíclicos, estos se refieren a aquellos que tienen de 3 a 6 átomos de carbono. Los grupos alquilo C^1-6y alcoxilo C^1-6adecuados incluyen, entre otros, metilo y metoxilo, etilo y etoxilo, n-propilo y n-propoxilo, iso-propilo e iso-propoxilo, ciclopropilo y ciclopropoxilo, n-butilo y n-butoxilo, terc-butilo y terc-butoxilo, ciclobutilo y ciclobutoxilo, n-pentilo y n-pentoxilo, ciclopentilo y ciclopentoxilo, n-hexilo y n-hexoxilo, ciclohexilo y ciclohexoxilo, etc. El grupo reactivo con aminas Z incluye todos los tipos de grupos funcionales que son reactivos con un grupo amino libre. Entre ellos, son particularmente preferidos -CO²H, -SO3H y derivados de éster de los mismos (incluyendo ésteres activos).

Los elementos estructurales -(CH²)n- y -(CH²)n- en las fórmulas anteriores también pueden contener uno o más dobles y/o triples enlaces y pueden estar sustituidos con uno o más átomos de halógeno tales como flúor o con deuterio.

Los elementos de sensor óptico pueden obtenerse mediante silanización y, en los grupos de unión de las fórmulas (i) a (iii), X se selecciona independientemente de grupos alcoxilo C^1-6, preferiblemente de los grupos metoxilo y etoxilo, Y es -NHCO-, Z es -CO²H o un derivado de éster del mismo, y n es un número entero de 1 a 5 y n' es un número entero de 1 a 3, preferiblemente n es 3 y n' es 2.

Alternativamente, los elementos de sensor óptico pueden obtenerse mediante tiolación y, en los grupos de unión de fórmula (iv), W es H, Y es un enlace químico, Z es -CO²H o un derivado de éster del mismo, y n es un número entero de 1 a 8 y n' es un número entero de 1 a 5, preferiblemente n es 8 y n' es 4. Se prefiere particularmente un éster de NHS del ácido 12-mercaptododecanoico.

Según la invención, los receptores para el péptido Ap y la proteína Tau son anticuerpos específicos. En el caso del péptido Ap, el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente al epítopo central del péptido Ap, tal como el anticuerpo A8978 (Sigma Aldrich), y en el caso de la proteína Tau, el anticuerpo es un anticuerpo que se une específicamente a un epítopo presente en todas las variantes de Tau (incluyendo las variantes fosforiladas y truncadas, variantes con de 3 a 4 regiones de repetición, o isoformas), tal como el anticuerpo Tau-5 (AHB0042, Thermo Fisher Scientific).

La sustancia bloqueante que no reacciona de manera cruzada con la proteína biomarcadora candidata incluye caseína, etanolamina, L-lisina, polietilenglicoles, albúminas y derivados de los mismos, y preferiblemente es caseína.

En un método para preparar los elementos de sensor, la oxidación se realiza mediante el tratamiento con H²O²/ácido oxálico. Además, en el método, la silanización con los grupos de unión de silano cortos se realiza preferiblemente con un derivado de silano que tiene las siguientes fórmulas:

X3Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y,

X2(R1)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y, O

X(R1)(R2)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y,

en las que las variables son tal como se definieron anteriormente. Se prefiere particularmente que se use un derivado de éster del resto CO²H o SO³H en la definición de Y, que puede ser un éster de alquilo C^1-6sencillo, pero también puede ser un éster activado tal como un éster de N-hidroxisuccinimida o cualquier otro derivado de éster activado.

Además, se prefiere que la sustancia bloqueante sea caseína.

En un método para preparar los elementos de sensor, la activación de superficie se realiza mediante el tratamiento con HF (49%). Además, en el método, la tiolación con los grupos de unión de tiol cortos se realiza preferiblemente con grupos de unión de tiol que tienen la siguiente fórmula:

WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,

en la que las variables son tal como se definieron anteriormente. Se prefiere particularmente que se use un derivado de éster del resto CO²H o SO³H en la definición de Y, que puede ser un éster de alquilo C^1-6sencillo, pero también puede ser un éster activado tal como un éster de N-hidroxisuccinimida o cualquier otro derivado de éster activado. Además, se prefiere que la sustancia bloqueante sea caseína.

En un método para preparar los elementos de sensor, los elementos de sensor óptico se fabrican a temperatura ambiente. Puede evaluarse cada etapa individual basándose en los espectros de IR. Esta etapa de validación es esencial para la detección específica y la determinación precisa de la estructura secundaria del analito.

El dispositivo del aspecto (4) de la invención tiene los elementos de sensor incorporados en una celda (cámara) de IR adecuada. Además, puede incluir un elemento emisor de luz (IR), un elemento detector de luz (IR) y una unidad de procesamiento de datos. Para la detección paralela mediante un método óptico adicional, el dispositivo puede incluir además una fuente de luz y un elemento detector para tal método óptico adicional, tal como una fuente de luz y elementos detectores para fluorescencia UV/Vis, a diferentes longitudes de onda.

El método del aspecto (1) de la invención comprende las etapas tal como se definieron anteriormente.

En el método de la invención, los líquidos corporales aplicados en las etapas (a) y (b) pueden ser cualquier líquido corporal complejo que comprenda el biomarcador, incluyendo suero, plasma sanguíneo y LCR. Líquidos corporales adecuados adicionales son líquido lagrimal y líquido de succión del pezón.

En una realización preferida, el método comprende además, antes de las etapas (a) y (b): instalar dicho elemento de sensor óptico en la celda de IR. De manera adicional/alternativa, el método puede comprender además las etapas (a') y (b'): regenerar la superficie del elemento óptico mediante la aplicación de una disolución de ligando libre para el receptor.

El espectro obtenido en las etapas (a) y (b) tiene una relación señal/ruido suficiente como para resolver la banda de amida I. Esto permite el análisis del cambio del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora en la etapa (c) para determinar la estructura secundaria de las proteínas biomarcadoras candidatas y realizar el diagnóstico diferencial.

En una realización adicional, la etapa (c) del método comprende además comparar el espectro de infrarrojos obtenido con un espectro del péptido Ap soluble y/o de la Tau soluble con una estructura secundaria conocida y/o con una concentración conocida.

En otra realización, el método puede comprender, de manera alternativa o paralela al análisis por infrarrojos, la detección mediante otro método óptico, incluyendo fluorescencia de UV/Vis, a diferentes longitudes de onda. En particular, se prefiere un método que combine espectroscopía vibracional de inmuno-ATR-FTIR con espectroscopía de fluorescencia paralela.

El método del aspecto (1) permite/es adecuado para determinar el péptido Ap soluble y la Tau soluble en líquidos corporales, en particular para determinarlos directamente en líquidos corporales de origen mamífero (ser humano, animal), incluyendo líquido cefalorraquídeo, sangre o suero, sin pretratamiento (es decir, sin una etapa de enriquecimiento o purificación previa independiente). El método es adecuado para la determinación de la proteína biomarcadora candidata de manera independiente (in vitro) o en línea (determinación directa del líquido corporal en el paciente). En ambos casos, el método puede comprender además el diagnóstico diferencial y la evaluación de los estadios de la enfermedad de Alzheimer.

El método del aspecto (1) es particularmente adecuado para la determinación de la evolución de la enfermedad de Alzheimer con amiloide-beta y Tau como proteínas biomarcadoras candidatas, en el que un cambio del máximo de la banda de amida I del péptido Ap desde 1647 cm-1 hasta 1640 cm-1, preferiblemente con un valor de umbral de 1643 cm-1 /- 5 cm-1 (o 1643 cm-1 /- 3 cm-1, o 1643 cm-1 /- 1 cm-1, o aproximadamente 1643 cm-1) y un cambio del máximo de la banda de amida I de la proteína Tau desde 1647 cm-1 hasta 1640 cm-1, preferiblemente con un valor de umbral de 1643 cm-1 /- 5 cm-1 (o 1643 cm-1 /- 3 cm-1, o 1643 cm-1 /- 1 cm-1, o aproximadamente 1643 cm-1) son indicativos de enfermedad de Alzheimer. El método también es particularmente adecuado para la determinación de la evolución de la enfermedad de Alzheimer con amiloidebeta y Tau como proteínas biomarcadoras candidatas. En este caso, el diagnóstico diferencial contempla un perfil clínico garantizado del tipo de demencia, preferiblemente el método comprende la detección de la distribución de estructura secundaria de Ap de LCR (A), Ap de plasma sanguíneo (B) y Tau de LCR (C). En particular, el método de la invención permite el diagnóstico diferencial de demencia tipo Alzheimer (DAT) y control de enfermedad (DC), subclasificándose los pacientes con DAT en DAT temprana, moderada y grave, y separándose los pacientes con DC en controles sanos, otras enfermedades y demencia debida a un origen distinto de la enfermedad de Alzheimer. En particular, para ambos biomarcadores, (A)/(B) para Ap y (C) para Tau, un umbral discriminador (1643 cm-1 5 cm-1) separa los pacientes con enfermedad de Alzheimer y DC; y/o la combinación de (A), (B) y (C) proporciona un panel de biomarcadores aplicable para un diagnóstico de DAT garantizado.

Se establece un clasificador de umbral simple para ambos biomarcadores similar al descrito en Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016) y el documento WO 2015/121339. De ese modo, usando una banda de marcador espectral discriminadora para la diferenciación de control de enfermedad (DC) y demencia tipo Alzheimer (DAT), pudieron separarse ambos grupos de diagnóstico con una precisión de diagnóstico del 90% basándose en el análisis de Ap de LCR. La precisión predictiva observada a partir del análisis de Ap de plasma sanguíneo únicamente fue menor (84%). Además, la separación de ambos grupos basándose sólo en la distribución de estructura secundaria de la proteína Tau siguió siendo insuficiente con una precisión del 68%. Sin embargo, al combinar las frecuencias de amida I determinadas de Ap de LCR y plasma sanguíneo con las de Tau en un panel de marcadores, un clasificador de voto mayoritario simple demostró valores predictivos significativamente mayores. Ahora, podría lograrse una precisión del 93% y una especificidad del 95%. Una alta especificidad es crucial especialmente para enfermedades incurables tales como la EA, porque un diagnóstico falso positivo puede tener graves consecuencias psicológicas para la parte afectada. Sin embargo, el análisis de datos combinados demostró una segunda gran ventaja. Al combinar los datos de Ap y Tau, puede proporcionarse más información sobre el estadio de la enfermedad e indicaciones para otros tipos de demencia. El principio para el diagnóstico diferencial es sencillo. En una primera etapa, se determinó el máximo de amida I de la fracción soluble extraída de Ap de LCR tal como se describe en Nabers et al., en Anal. Chem Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016) y el documento WO 2015/121339. De ese modo, un máximo superior o igual a 1643 cm-1 era indicativo de DC y un máximo por debajo de esta frecuencia era indicativo de ^dA^t. En una segunda etapa, se aplicó el mismo procedimiento a muestras de plasma sanguíneo. De nuevo, se determinaron los máximos de amida I de Ap para cada muestra. Ahora, si ambos valores eran sistemáticamente superiores o inferiores a la frecuencia del marcador, podría realizarse una diferenciación entre DC y DAT con una alta precisión. Sin embargo, para los resultados inconsistentes de Ap (LCR y plasma), podría usarse la distribución de estructura secundaria de la proteína Tau como respaldo de la decisión. Por otro lado, la distribución de estructura secundaria de la proteína Tau también demostró la posibilidad de subclasificar el grupo de DC y DAT en demencia debida a un origen distinto de Alzheimer o en un estadio temprano, moderado o grave de la enfermedad. De esta manera, pudieron identificarse pacientes con enfermedad de Parkinson o demencia vascular dentro del grupo de DC (Ap de LCR > 1643 cm-1; Ap de plasma > 1643 cm-1; Tau de LCR < 1643 cm-1). Por otro lado, el grupo de DAT pudo diferenciarse en estadios tempranos (por ejemplo, Ap de LCR < 1643 cm-1; Ap de plasma < 1643 cm-1; Tau de LCR > 1643 cm-1), moderados (Ap de LCR < 1643 cm-1; Ap de plasma > 1643 cm-1; Tau de LCR < 1643 cm-1) o (Ap de LCR > 1643 cm-1; Ap de plasma < 1643 cm-1; Tau de LCR < 1643 cm-1) y graves (Ap de LCR < 1643 cm-1; Ap de plasma < 1643 cm-1; Tau de LCR < 1643 cm-1) de la enfermedad.

La invención se describe además mediante los siguientes ejemplos que, sin embargo, no deben interpretarse como limitativos de la invención.

Ejemplos

Materiales y métodos: se usaron las mismas configuraciones experimentales que en el documento WO 2015/121339.

Muestreo y pretratamiento: se extrajo LCR mediante punción lumbar y se tomaron alícuotas en e1Hospital Universitario de Essen, se ultracongelaron en nitrógeno líquido, se enviaron y se almacenaron a -80°C. Las muestras no se pretrataron antes de la medición, sólo se descongelaron a 37°C durante 30 segundos y se mantuvieron en hielo hasta su uso.

Colectivo de pacientes: los detalles de la adquisición de muestras y el diagnóstico de pacientes con control de enfermedad (DC) y demencia tipo Alzheimer (DAT) se han descrito con detalle previamente (Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). En el estudio anterior, se analizaron 141 muestras de pacientes usando el sensor inmunoinfrarrojo. De este colectivo, se seleccionaron aleatoriamente 100 pacientes para el presente estudio. Los datos de amida I por infrarrojos de Ap extraído de LCR y plasma sanguíneo se adoptaron de (Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)).

Disoluciones y reactivos:

Solución salina tamponada con fosfato (tampón PBS): cloruro de sodio (NaCI) 137 mM, cloruro de potasio (KCI) 2,7 mM, fosfato total 12 mM (en forma de Na2HPO4 y NaH2PO4), pH 7,4.

Disolución bloqueante de caseína: hidróxido de sodio (NaOH) 200 mM, caseína al 1% (p/v) de leche bovina (polvo), pH ajustado con H³PO⁴a 7,4.

Disolución de silanización. se sintetizó y caracterizó el NHS-silano usado (éster 2,5-dioxopirrolidin-1-ílico del ácido N-(4,4,4-trietoxisilanobutil)succinámico) tal como se describió (Schartner et al., JACS 135(10):4079-4087 (2013)).

Anticuerpo. para la extracción de Ap del líquido corporal respectivo, se empleó el anticuerpo A8978 (n.° de lote: 061M4773, Sigma Aldrich). En el caso de la detección de proteína Tau, se usó el anticuerpo Tau-5 (AHB0042, Thermo Fisher Scientific).

Realización de la medición: el procedimiento general es idéntico al descrito en el documento WO 2015/121339. Se realizaron mediciones de IR en un espectrómetro Vertex 70V (Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Alemania) con detector de telururo de mercurio y cadmio (MCT) enfriado con nitrógeno líquido. Se registraron interferogramas de doble cara en el movimiento hacia delante y hacia atrás del interferómetro a una velocidad de transmisión de datos de 80 kHz con una resolución espectral de 2 cm-1, apodización de Blackman-Harris de 3 términos, corrección de fase de Mertz y formateo a bajo nivel 4 veces. Se registraron espectros de referencia como un promedio de 1000, espectros de muestra de 200 interferogramas. El registro de espectros de canal único de referencia del sensor de blanco, sensor con 2-propanol, la superficie silanizada, los tampones, el anticuerpo o la superficie recubierta con caseína en estados en equilibrio permitió una espectroscopía de diferencia de alta sensibilidad basada en la ley de Lambert-Beer (E=-log(I/Iü). La absorbancia del cambio de estado es el logaritmo decimal negativo de la relación de intensidades antes y después del cambio. Flujo de trabajo: los detalles de la preparación del sensor para el análisis por espectroscopía FTIR de la proteína Tau en LCR se publicaron previamente (documento WO 2015/121339; Nabers et al., Anal. Chem. Doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016); Nabers et al., Journal of Biophotonics 9(3):224-34 doi: 10.1002/jbio.201400145 (2016)). En resumen, el volumen total de la celda de flujo, incluyendo todos los tubos de conexión, ascendió a 400 |il. Para cada análisis, se funcionalizó nuevamente un elemento de sensor por muestra con silano (Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)) y anticuerpo. Antes del análisis, se saturó la superficie con una disolución bloqueante de caseína. Para la detección de Ap en LCR y plasma sanguíneo, se usó el anticuerpo monoclonal A8978 (Sigma Aldrich, aa 13-28). La captura de Tau se proporcionó por el anticuerpo monoclonal Tau-5 (Life Technology, aa 210-230). Para el análisis, se añadieron 50 |il de LCR o 150 |il de EDTA-plasma al tampón de circulación con una velocidad de flujo de 1 ml/min, respectivamente. Pretratamiento de los espectros: mediante la sustracción escalada de un espectro de referencia, se retiró el vapor de agua. Los espectros se corrigieron con respecto a la línea base.

Ejemplo 1: distribución de estructura secundaria de Ap y proteína Tau para la diferenciación precisa de DC y DAT.

El estudio realizado incluía 300 muestras de 61 pacientes con DC y 39 con DAT. Los detalles sobre el diagnóstico diferencial de los pacientes se describieron previamente (Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016). En general, se separó el colectivo de pacientes en sujetos con DC y DAT. El grupo de DAT se subclasificó adicionalmente en estadios tempranos, moderados y graves de la enfermedad de Alzheimer. Para un pequeño número de pacientes con DC, había disponible un diagnóstico diferencial completo que incluía pacientes que padecen demencia de origen distinto a la enfermedad de Alzheimer, tal como enfermedad de Parkinson o demencia vascular. Para el análisis de la distribución de estructura secundaria de Ap y Tau en LCR y/o plasma, se extrajeron ambos biomarcadores del líquido respectivo mediante un sensor inmunoinfrarrojo tal como describieron Nabers et al. (Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). Por tanto, se capturaron por separado Ap y Tau de LCR o plasma mediante los anticuerpos monoclonales A8978 (aa 13-28 de Ap) y Tau-5 (aa 210-230) inmovilizados en superficie, respectivamente. La distribución de estructura secundaria se indicó por la frecuencia del máximo de amida I registrada de Ap y Tau. En el estudio anterior, se estableció un clasificador de umbral simple con una frecuencia de marcador discriminadora de 1643 cm_1 para la diferenciación de DC y DAT. Se usó la misma banda de marcador en el presente estudio. En primer lugar, se determinó el máximo de amida I de Ap de LCR para cada muestra de paciente. De ese modo, una posición del máximo por debajo de 1643 cm-1 era indicativa de DAT. A continuación, se identificó el máximo de amida I de Ap de EDTA-plasma sanguíneo. Finalmente, se detectó el máximo de la fracción de proteína Tau extraída en lCr. Se definió de manera idéntica la banda de marcador discriminadora para ambos biomarcadores y ambos líquidos corporales a < 1643 cm-1 como indicativa de DAT. La distribución del máximo de amida I del grupo de DC y DAT mostró diferencias altamente significativas para Ap de LCR (ANOVA de Kruskal-Wallis; p=2,5*10-11; nivel de confianza p=0,05) y plasma sanguíneo (p=3,4*10-9) y significativamente diferentes para Tau (p=1,6*10-3) de LCR (figura 2). Por tanto, se observó un cambio más pequeño del máximo de amida I de Tau para sujetos con DAT en comparación con Ap. La media del máximo de amida I de Tau fue 1644 cm-1 para el grupo de DC y 1642 cm-1 para el grupo de DAT en comparación con Ap de LCR con 1645 cm-1 para sujetos con DC y 1641 cm-1 para sujetos con DAT. El Ap de plasma sanguíneo reveló una media del máximo de 1648 cm-1 para el grupo de Dc y 1641 cm-1 para el grupo de DAT. Basándose en estas distribuciones, también mostrado en un gráfico de dispersión tridimensional en la figura 3 con una caja negra transparente que indica DAT, se calculó el rendimiento de diagnóstico de cada biomarcador por sí mismo proporcionando la precisión, la sensibilidad y la especificidad. De manera adicional, se realizaron análisis de la curva de característica operativa del receptor (ROC) explorando el umbral entre 1630,5 cm-1 y 1660,5 cm-1 y determinando la sensibilidad y la especificidad a cada número de ondas. De manera similar a los resultados de Nabers et al., la precisión de diagnóstico del análisis basado en Ap fue la más alta con un 90% para LCR (figuras 4A, D; especificidad del 89%, sensibilidad del 92%, AUC de 0,90) en comparación con el análisis de la distribución de estructura secundaria de Ap en plasma sanguíneo con un 85% (figuras 4B, D; especificidad del 90%, sensibilidad del 77%, AUC de 0,85). En cambio, la diferenciación de DC y DAT basada en la distribución de estructura secundaria de proteína Tau en LCR sólo reveló una precisión de diagnóstico del 68% (figuras 4C, D; especificidad del 67%, sensibilidad del 69%, AUC de 0,67), lo que indica que Tau sola no es un biomarcador apropiado para la detección de DAT. Sin embargo, al añadir los tres valores de biomarcador a un clasificador de voto mayoritario, tomando de ese modo una decisión de diagnóstico basada en el panel de biomarcadores presentado (dos máximos por debajo del umbral = enfermo, dos máximos por encima del umbral = sin DAT), pudo aumentarse el rendimiento de diagnóstico hasta una especificidad del 95%, una sensibilidad del 90% y, por tanto, hasta una precisión global del 93% en comparación con el diagnóstico clínico. De esta manera, sólo se identificaron 3 falsos positivos de los 61 DC y 4 falsos negativos de los 31 DAT.

Ejemplo 2: ensayo combinado para el diagnóstico diferencial de DC y DAT.

El análisis de datos combinados también proporcionó la posibilidad de subclasificar ambos grupos de diagnóstico. Esto se muestra esquemáticamente en la figura 5. Por ejemplo, el Ap de LCR y plasma demuestra un máximo de amida I superior o igual a 1643 cm-1, pero el máximo de amida I de Tau es inferior a 1643 cm-1, en este caso posiblemente podría indicarse otro tipo de demencia mediante el ensayo de inmunoinfrarrojos combinado (figura 5). En cambio, cuando los máximos de amida I de Ap de LCR y plasma están por debajo de la banda de marcador pero el máximo de Tau está por encima, se mostrará un estadio temprano de DAT. Se aplicó este procedimiento a ambos grupos de diagnóstico del presente estudio. El máximo de amida I de Ap de LCR demostró, en el 69% de todos los casos de DC, un mayor valor del máximo que Tau de LCR. Este efecto puede explicarse por las mayores propiedades de desorden de la proteína Tau en comparación con Ap. Por otro lado, en el 25% de todos los casos de DC, el máximo fue menor para Ap, y sólo en el 6% de todos los casos, los máximos fueron idénticos. Esta relación cambió por completo para el grupo de DAT. En el mismo, sólo el 31% de todos los pacientes con DAT dieron lugar a un máximo de amida I para Ap mayor que para Tau, el 62% mostraron un máximo de Ap menor (figura 6). Esto respalda la hipótesis de que la acumulación de Ap es un acontecimiento iniciador y temprano en la evolución de la enfermedad de Alzheimer y está acompañada por la agregación de la proteína Tau.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método para el diagnóstico diferencial y la subdasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad mediante análisis directo de la distribución de estructura secundaria de una fracción de péptido amiloide-beta (Ap) soluble y una fracción de proteína Tau soluble en líquidos corporales, que comprende las etapas de

(b) dirigir, en una segunda celda de IR que comprende un segundo elemento de sensor infrarrojo que tiene un elemento de reflexión interna con un núcleo de un material transparente a los infrarrojos y al menos un receptor para la proteína Tau directamente injertado en al menos una superficie de dicho núcleo, siendo dicho al menos un receptor para la proteína Tau anticuerpos que pueden unirse de manera específica y conformacionalmente independiente a la proteína Tau, al menos un flujo de un líquido corporal con proteína Tau soluble, transmitir un haz de IR a través de dicha segunda celda de IR y obtener un espectro de infrarrojos a partir del mismo; y (c) analizar los espectros de infrarrojos obtenidos para determinar la distribución de estructura secundaria del péptido Ap soluble y de la proteína Tau soluble en los líquidos corporales para el diagnóstico diferencial, en el que una disminución de la banda de amida I del péptido Ap y de la proteína Tau es indicativa del estadio de la enfermedad.

2. Método según la reivindicación 1, en el que

(i) el material transparente a los infrarrojos de las celdas de IR primera y segunda se selecciona independientemente de silicio, germanio, seleniuro de zinc, seleniuro de galio y diamante, y preferiblemente es germanio; y/o

(ii) la sustancia bloqueante que no reacciona de manera cruzada con el péptido Ap o la proteína Tau se selecciona de caseína, etanolamina, L-lisina, polietilenglicoles, albúminas y derivados de los mismos.

3. Método según la reivindicación 1, en el que dichos elementos de sensor infrarrojo primero y segundo comprenden un elemento de reflexión interna de germanio que tiene forma de trapezoide o paralelogramo.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el elemento de reflexión interna

(i) es un monocristal de germanio, preferiblemente es un monocristal de germanio de corte trapezoidal; y/o (ii) contempla más de un pase de la luz infrarroja a través del elemento de reflexión; y/o

(iii) además, es adecuado para el análisis alternativo o paralelo mediante otro método óptico que incluye la detección de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que

(i) el receptor que se une al péptido Ap es un anticuerpo que se une específicamente al epítopo central del péptido Ap, incluyendo el anticuerpo A8978; o

(ii) el receptor que se une a la proteína Tau es un anticuerpo que se une específicamente al epítopo central de Tau y a un epítopo presente en todas las variantes de Tau, incluyendo el anticuerpo Tau-5.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el método proporciona la diferenciación de la enfermedad de Alzheimer en los estadios tempranos/prodrómicos, moderados y graves de la enfermedad, y en el que

(i) los máximos de amida I de los biomarcadores mencionados, Ap de LCR, Ap de plasma sanguíneo y Tau de LCR, están todos por debajo del umbral discriminador (1643 cm-1 5 cm-1), que son indicativos de un estadio grave de la enfermedad,

(ii) los máximos de amida I de dos biomarcadores, uno es Ap de LCR o plasma sanguíneo y el otro es Tau de LCR, por debajo del umbral discriminador (1643 cm-1 5 cm-1) son indicativos de un estadio moderado de la enfermedad,

(iii) los máximos de amida I de uno o dos biomarcadores (Ap de LCR y/o plasma sanguíneo), pero no Tau de LCR, por debajo del umbral discriminador (1643 cm-15 cm-1) son indicativos de un estadio temprano de la enfermedad.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el diagnóstico diferencial contempla un perfil clínico garantizado del tipo de demencia, preferiblemente el método comprende la detección de la distribución de estructura secundaria de Ap de LCR (A), Ap de plasma sanguíneo (B) y Tau de LCR (C), lo más preferiblemente el método permite el diagnóstico diferencial de demencia tipo Alzheimer (DAT) y un control de enfermedad (DC),

en el que los pacientes con DAT se subclasifican en DAT temprana, moderada y grave, y los pacientes con DC se separan en controles sanos, otras enfermedades y demencia debida a un origen distinto de la enfermedad de Alzheimer.

8. Método según la reivindicación 7, en el que

(i) para ambos biomarcadores, (A) y (B) para Ap y (C) para Tau, un umbral discriminador (1643 cm-1 5 cm-1) separa los pacientes con enfermedad de Alzheimer y DC; y/o

(ii) la combinación de (A), (B) y (C) proporciona un panel de biomarcadores aplicable para un diagnóstico de DAT garantizado.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que proporciona información sobre el estado de enfermedad del paciente basándose en el análisis de líquidos corporales, en el que un cambio del máximo de la banda de amida I de la proteína biomarcadora es un clasificador indicativo de la evolución de la enfermedad.

10. Método según la reivindicación 9, en el que un clasificador de umbral con un valor de 1638-1648 cm-1 es un clasificador indicativo de la evolución de la enfermedad.

11. Kit para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad, que comprende elementos de sensor infrarrojo primero y segundo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

12. Dispositivo para el diagnóstico diferencial y la subclasificación de la enfermedad de Alzheimer en los diferentes estadios de la enfermedad, comprendiendo dicho dispositivo elementos de sensor infrarrojo primero y segundo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

13. Uso de los elementos de sensor infrarrojo primero y segundo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, del kit según la reivindicación 11 o del dispositivo según la reivindicación 12, para el análisis directo de la distribución de estructura secundaria de una fracción de péptido amiloide-beta (Ap) soluble y una fracción de proteína Tau soluble en líquidos corporales.