KR20190089928A - 알츠하이머병의 감별 진단을 위한 조합 어세이 - Google Patents

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클라우스 게르베르트
안드레아스 나버스
요나스 샤르트너
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루르-우니베어지테트 보쿰
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Abstract

본 발명은 알츠하이머병의 상이한 병기로의 감별 진단 및 하위분류를 위한 조합된 면역-적외선 어세이를 제공한다. 상기 방법은 보증된 질환 진단 및 환자 층화에 적용될 수 있다. 상기 어세이는 체액 중의 아밀로이드-베타 펩티드 및 Tau 단백질의 2차 구조 분포 내의 변화를 표지 없이 검출하는 것을 고려한다. 천연형으로부터 β-시트 농축 동형체로의 이러한 2차 구조 변화는 임상적 질환 발현의 수년 전에 나타난다. 이제, 상기 조합 방법은 액체 생검을 기반으로 하는 진단에 대해 이러한 변화를 이용한다.

Description

알츠하이머병의 감별 진단을 위한 조합 어세이
본 발명은 알츠하이머병의 상이한 병기(disease stage)로의 감별 진단 및 하위분류를 위한 조합된 면역-적외선 어세이를 제공한다. 상기 방법은 보증된 질환 진단 및 환자 층화에 적용될 수 있다. 상기 어세이는 체액 중의 아밀로이드-베타 펩티드 및 Tau 단백질의 2차 구조 분포 내의 변화를 표지 없이 검출하는 것을 고려한다. 천연형으로부터 β-시트 농축 동형체(isoform)로의 이러한 2차 구조 변화는 Aβ 및 Tau에 대해 시간 지연이 발생하지만, 임상적 질환 발현의 수년 전부터 나타난다. 이제, 상기 조합 방법은 액체 생검을 기반으로 하는 진단에 대해 이러한 변화를 이용한다.
알츠하이머병(AD)은 세계적으로 35,000,000명이 넘는 사람들에게 영향을 미치는 가장 빈번한 신경퇴행성 질환 중 하나이다(Prince et al., London, UK doi:10.1111/j.0963-7214.2004.00293.x (2015)). AD의 감별 진단 및 하위분류, 특히 초기 또는 전조 병기로의 감별 진단 및 하위분류는 여전히 임상적으로 어려움이 있다. AD의 조기 검출을 위한 신뢰할 만한 바이오마커에 대한 필요성이 현재 요구되고 있다. 그러나, 보증된 초기 감별 진단은 미래의 치료 중재를 위한 기본이다(Chiba, Neurodegenerative Diseases, edited by Uday Kishore, 181-225. InTech doi:10.5772/55293 (2013); Thorsett and Latimer, Current Opinion Chem. Biol. 4(4):377-82 (2000)). 따라서, 과학 연구 기관들은 바람직하게는 액체 생검을 기반으로 하는 간단한 진단 시험에 초점을 맞추고 있다(Doecke, Arch. Biol. 69(10):1318 doi:10.1001/archneurol.2012.1282 (2012); Andreasen et al., J. Neurology, Neurosurgery and Psychiatry 64(3):298-305 (1998); Fiandaca et al., Frontiers in Neurology 6(Nov):1-13 doi:10.3389/fneur.2015.00237 (2015); Mapstone et al., Nature Medicine 20(4):415-18. doi:10.1038/nm.3466 (2014)).
알츠하이머병에서, 대부분의 내재적인 장애성 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드 및 Tau 단백질의 β-시트 농축 동형체로의 2차 구조 변화가 질환 진행 동안의 초기 이벤트로 논의된다(Sarroukh et al., Cell. Mol. Life Sci. 68(8):1429-38 doi:10.1007/s00018-010-0529-x (2011); Cerf et al., Biochem. J. 421(3):415-23 doi:10.1042/BJ20090379 (2009); Farich, et al., Prion 3(2):89-93 (2009); Sachse et al., PNAS 105(21):7462-66 doi:10.1073/pnas.0712290105 (2008); Glabe, J. Biol. Chem. 283(44):29639-43 doi:10.1074/jbc.R800016200 (2008); Cavallucci et al., Mol. Neurobiol. doi:10.1007/s12035-012-8251-3 (2012); Haass and Selkoe, Nature Rev. Mol. Cell Biol. 8(2):101-12 doi:10.1038/nrm2101 (2007); Kolarova et al., Int. J. Alzheimer's Disease doi:10.1155/2012/731526 (2012); Yang et al., Devel. Brain Res. 156(2):127-38 doi:10.1016/j.devbrainres.2005.02.004 (2005)). 이에 의해, Tau의 신경원섬유 덩어리(NFT)로의 응집 및 침착이 Aβ 응집을 수반할 것으로 제안된다(Lo et al., Arch. Neurol. 68(10):1257-66 doi:10.1001/archneurol.2011.123 (2011); Bennett et al., Arch. Neurol. 61(3):378-84 doi:10.1001/archneur.61.3.378 (2004); Coomaraswamy et al., PNAS 107(17):7969-74 doi:10.1073/pnas.1001056107 (2010); Braak and Braak, Acta Neuropathologica 82(4):239-59 doi:10.1007/BF00308809 (1991); Thal et al., J. Neuropath. Exp. Neurol. 59(8):733-48. (2000); Thal et al., Science of Aging Knowledge Environment 2006(6):re1 doi:10.1126/sageke.2006.6.re1 (2006)).
임상에서, 신경심리 시험 및 뇌척수액(CSF)에서 다양한 바이오마커 수준의 신경화학적 정량 결과가 최신 감별 진단에 사용된다. 그러나, Aβ40, Aβ42와 같은 바이오마커 농축물 자체, 총 Tau 또는 과인산화된 Tau 수준은 AD 진행과 관련이 없을 수도 있다(Wiltfang et al., J Neurochem., 101(4):1053-59 doi:10.1111/j.1471-4159.2006.04404.x (2007), Gabelle et al., J Alzheimers Dis., 26(3):553-63 doi:10.3233/JAD-2011-110515 (2011), Blennow et al., J Nutr Health Aging, 13(3):205-8 doi:10.1007/s12603-009-0059-0 (2009)). 또한, 이들 바이오마커 정량화에 기초하는 경우, 감별 진단학은 여전히 어려움이 있다. 그러나, 양전자 방출 단층촬영(PET) 및 자기 공명 단층촬영(MRT)은 인간 뇌의 플라크와 같은 (β 시트 농축된 단백질로부터 축적된) 응집체를 검출한다. 그럼에도 불구하고, PET 및 MRT는 매우 비싸고 시간 소모적인 기술이어서 전조 AD 단계의 검출에는 적용할 수 없으므로 단지 중등도/후기 단계의 질환의 결정만을 제공한다. PET의 경우에, 추가의 단점은 조영제의 사용이며, 이는 또한 환자에게 스트레스를 준다. 전술된 기술 이외에, 형광 기반의 면역 어세이, 특히 효소 결합 면역흡착 어세이(ELISA) 및 표면-기반 형광 강도 분포 분석(sFIDA)이 부상하는 분야이다. 그러나, 이들 기술들은 형광 표지된 검출 항체를 필요로 하며, 이는 분석되는 바이오마커의 2차 구조에 영향을 끼칠 수 있다. 또한, ELISA 및 sFIDA는 단백질 2차 구조 또는 2차 구조 분포에 대한 어떠한 직접적인 정보도 드러내지 않았다. 또한, Tau 단백질의 2차 구조는 상술된 기술들의 결여된 입체구조적(민감도 때문에 현재까지 진단 또는 감별 목적으로 이용되지 않았다.
푸리에 변환 적외선-(Fourier-transform infrared-: FTIR-) 차이 분광학은 이러한 2차 구조 변화를 결정하기 위한 강력한 수단이다(Kotting and Gerwert, Chemphyschem 6(5):881-888 doi:10.1002/cphc.200400504 (2005)). 펩티드 결합의 C=O 진동에 의해 야기되는 아미드 I 밴드의 주파수(frequency)는 단백질 골격의 2차 구조를 나타낸다. 특히, 체액 중 β-시트 농축 바이오마커 동형체의 증가는 표면 프로빙 약화된 총 반사(ART) 기술로 모니터링되는 1630 cm-1로의 주파수 다운시프트(downshift)에 의해 신뢰성 있게 검출된다. 체액 중의 특이 단백질의 2차 구조 분포를 분석하기 위해, 목적 단백질을 표면 층 내에 선택적으로 결합시켜야 하며, 이는 항체-작용화된 내부 반사 엘리먼트(IRE)로 달성된다(Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)). 이 방법은 중등도 AD 및 질환 대조군 감별을 위해 CSF 및 혈장으로부터의 가용성 Aβ 분획을 추출하고 2차 구조 분포를 결정하는 데 적용되었다(Nabers et al., J. Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016); Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)).
대조적으로, 표면 플라스몬 공명(SPR), 표면 음향파 또는 수정 크리스탈 마이크로밸런스와 같은 기술은 단백질-리간드 또는 단백질 약물 상호작용을 분석하는 데 이용된다. 이들 기술들은 단지 동역학 정보만을 제공할 뿐 어떠한 스펙트럼 분해능을 제공하지 않기 때문에, 단백질 내의 직접적인 2차 구조 변화를 드러낼 수 없다. 표면 강화된 적외선 흡수(SEIRA) 분광학과 같은 추가의 기술이 이론적으로는 스펙트럼 분해능을 제공하나, 거친 금 표면의 제조 때문에 측정의 재현성이 매우 어려워 단백질 2차 구조 전이 분석을 위한 견고한 플랫폼을 제공하지 않는다.
WO 2015/121339는, 특히 진동 분광법으로 예컨대 체액과 같은 복잡한 혼합물 내의 단일 선택된 단백질의 직접적인 비침습적 정성적 2차 구조 분석을 위한, 입체구조(conformation) 및 2차 구조 분석을 위한 바이오센서를 제공한다. 분석을 위해, 선택된 물질이 분리되거나 농축되거나 특정 제조 절차에 의해 전처리될 필요가 없다. 바이오센서는 후보 바이오마커 단백질의 입체구조적 전이가 질환의 진행과 연관되는 질환의 진행을 결정하기에 적합하며, 여기서 바이오마커 단백질의 아미드 I 밴드 최댓값(maximum)의 시프트는 질환의 진행을 나타내는 분류자(classifier)이다. 예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 크로이츠펠트-야콥병 또는 헌팅톤병과 같은 단백질 미스폴딩 질환을 감안할 때, 이러한 정보는 질환 진행과 결정적으로 관련된다.
알츠하이머병(AD)은 2개의 두드러진 바이오마커 후보물의 미스폴딩을 포함하는 다요인성 단백질병증(proteopathy)이다. 아밀로이드-베타 펩티드(Aβ) 및 Tau 단백질 모두 질환 진행 동안 증가된 β-시트 동형체를 보인다. 이전에, 뇌척수액(CSF) 및 혈장의 총 Aβ 분획 중 β-시트 Aβ 동형체의 증가된 함량이 면역-적외선 센서에 의해 AD 검출에 적용될 수 있었다. 여기서는, 질환 대조군(DC) 및 알츠하이머형 치매(Dementia Alzheimer type: DAT) 환자로부터의 300개 샘플을 각각 가용성 Aβ(CSF, 혈장) 및 Tau 단백질(CSF)의 2차 구조 분포와 관련하여 분석되었다. Tau 단백질 2차 구조 분포는 치매의 일반적 마커일뿐 구체적으로 DAT에 대해서는 마커가 아닌 것으로 입증되었으나, Aβ 및 Tau의 조합된 자료 분석은 93%의 정확도로 DC/DAT 감별을 위한 진단 어세이를 제공하였다. 또한, 조합된 자료 평가는 DAT의 초기 및 후기 단계의 DAT 환자를 세분하는 잠재력을 나타내었으며 DC 피험체의 감별 진단을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명은 하기를 제공한다.
(1) 하기 단계를 포함하는, 체액 중의 가용성 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드 분획 및 가용성 Tau 단백질 분획의 2차 구조 분포의 직접 분석에 의해 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하기 위한 방법:
(a) 적외선 투과 재료의 코어를 갖는 내부 반사 엘리먼트 및 상기 코어의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅된 Aβ 펩티드에 대한 적어도 하나의 수용체를 갖는 제1 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는 제1 IR 셀에서, 가용성 Aβ 펩티드를 갖는 체액의 적어도 하나의 플럭스(flux)를 전도하고, 상기 제1 IR 셀을 통해 IR 빔을 제공하며, 이로부터 적외선 스펙트럼을 얻는 단계;
(b) 적외선 투과 재료의 코어를 갖는 내부 반사 엘리먼트 및 상기 코어의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅된 Tau 단백질에 대한 적어도 하나의 수용체를 갖는 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는 제2 IR 셀에서, 가용성 Tau 단백질을 갖는 체액의 적어도 하나의 플럭스를 전도하고, 상기 제2 IR 셀을 통해 IR 빔을 제공하며, 이로부터 적외선 스펙트럼을 얻는 단계; 및
(c) 얻어진 적외선 스펙트럼을 분석하여 감별 진단을 위한 체액 중의 가용성 Aβ 펩티드 및 가용성 Tau 단백질의 2차 구조 분포를 결정하는 단계로서, 바람직하게는 Aβ 펩티드 및/또는 Tau 단백질의 아미드 I 밴드의 다운시프트가 병기를 나타내는 것인 단계.
(2) 상기 양태 (1)의 바람직한 실시형태에서, 상기 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트는, 사다리꼴 또는 평행사변형 모양이고 아미드 I 밴드를 검출하기에 충분한 시그널 대 노이즈 비로 적외선에서 투명한 게르마늄 내부 반사 엘리먼트, 및 각각 Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질에 대해 특이적이며 입체구조적으로 독립적인 결합을 할 수 있는 항체이고, 상기 적어도 하나의 수용체의 자유롭게 접근 가능한 아민 기를 짧은 실란/티올 링커 상의 아민 반응성 기와 반응시키고 짧은 실란/티올 링커 상의 남은 아민 반응성 기를 각각 Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질과 교차 반응하지 않는 차단 물질로 차단시키는 짧은 실란 링커에 의한 실란화 또는 짧은 티올 링커에 의한 티올화에 의해 상기 내부 게르마늄 반사 엘리먼트의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅되는 Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질에 대한 적어도 하나의 수용체를 포함함,
(3) 상기 (1) 또는 (2)에서 정의된 바와 같은 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는, 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하기 위한 키트,
(4) 상기 (1) 또는 (2)에서 정의된 바와 같은 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는, 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하기 위한 디바이스, 및
(5) 상기 (1) 또는 (2)에서 정의된 바와 같은 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트, 상기 (3)에서 정의된 바와 같은 키트 또는 상기 (4)에서 정의된 바와 같은 디바이스의 체액 중의 가용성 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드 분획 및 가용성 Tau 단백질 분획의 2차 구조 분포를 직접 분석하기 위한 용도.
본 발명은 2개의 센서 엘리먼트를 사용하는 Aβ 및 Tau의 별도의 검출에 기초한다. 이와 관련하여, 분석 및 하위분류는 체액으로부터 따로 추출된 Aβ 및 Tau의 2차 구조 분포의 측정에 기초한다. 지금까지, CSF 중의 Tau 단백질의 2차 구조 분포는 진단 목적으로 고려된 바 없었다. 또한, 알츠하이머병 검출을 위해 CSF로부터의 Tau의 2차 구조 변화를 포함시키는 것은 진단 정확도에 대한 부가적인 효과 이상을 제공한다. Aβ(예컨대, CSF 및/또는 혈장 중의 Aβ) 및 Tau(예컨대, CSF 중의 Tau)의 2차 구조 분포를 분석하는 것은 경도 내지 중증 병기의 알츠하이머병의 하위분류 및 AD와 다른 치매 유형 간의 감별을 가능하게 한다.
도 1: 조합된 면역-적외선 어세이 및 분석 원리의 개략도. (A) CSF 및/또는 혈장에 존재하는 Aβ(1) 및 Tau(2)의 총 분획물은 항체 작용화된 면역-적외선 센서를 사용하여 따로 추출되었다. 검출된 Aβ 및 Tau 2차 구조 분포는 적외선 아미드 I 최댓값 위치에 의해 표시된다.
도 2: CSF 및 혈장 중의 Aβ의 분석에 기초한 DC 및 DAT 식별을 위한 박스-플롯으로 도시되는 아미드 I 최댓값 위치의 분포. 두 진단 그룹 모두 CSF(p=2.5*10-11, Kruskal-Wallis ANOVA, 신뢰 수준 a=0.05) 및 EDTA-혈장(p=3.4*10-9)으로부터의 Aβ의 아미드 I 최댓값에서 매우 유의한 차이 및 CSF(p=1.6*10-3)로부터의 Tau에 대해 적당한 유의성을 나타내었다. 박스-플롯에서, 25/50/75% 변위치는 수평선으로, 평균 밴드 위치는 사각형으로, ± 표준 편차는 위스커(whisker)로, 관측된 최소/최대 값은 십자형으로 표시된다.
도 3: 61개의 DC(회색) 및 39개의 DAT(검정색) 샘플에 대해 CSF 중의 Tau, CSF 중의 Aβ 및 EDTA-혈장 중의 Aβ에 대해 결정된 아미드 I 최댓값 위치의 3D-산포도. 투명 검정 박스 내의 자료 점은 3개의 어세이 모두에서 DAT로 확인되는 피험체를 나타낸다.
도 4: CSF 중의 Aβ 2차 구조 분포(A), EDTA-혈장 중의 Aβ 2차 구조 분포(B) 및 CSF 중의 Tau 단백질 2차 구조 분포(C)의 결정에 근거하는 DC(n=61) 및 DAT(n=39) 감별에 대한 ROC-곡선 분석. 이 순서대로 0.90, 0.85 및 0.67의 AUC가 달성되었다. 따라서, 92%(Aβ CSF), 85%(Aβ 혈장) 및 68%(Tau, CSF)의 진단 정확도가 계산되었다(D). 이들 자료에 기초할 때, Tau 2차 구조 분포 단독은 특정 DAT 검출에 대한 것 보다는 치매에 대한 일반적 바이오마커인 것으로 더 많이 보인다.
도 5: 조합된 면역-적외선 어세이에 의한 DAT 및 다른 유형의 치매의 감별 진단 및 병기 분류를 위한 절차의 도표. 어세이는 체액 중의 Aβ 펩티드 및 Tau 단백질 2차 구조 분포의 결정에 기초한다. 이 분포는 추출된 바이오마커 분획의 적외선 입체구조 민감성 아미드 I 밴드의 최댓값 위치에 의해 표시된다. 1643 cm-1의 식별 마커 밴드 미만의 최댓값은 질환으로 정의된다. 이러한 절차는 CSF 및 혈장로부터의 추출된 Aβ 분획 및 CSF로부터의 Tau 단백질 분획에 대해 적용된다. 모든 3개의 바이오마커 값이 1643 cm-1 이상인 경우, 어떠한 치매도 할당되지 않는다. 대조적으로, 1643 cm-1 미만의 바이오마커 값은 중증 DAT를 나타낸다. 다른 유형의 치매는 단지 Tau 아미드 I 최댓값이 마커 밴드 미만인 경우에 확인될 것이다.
도 6: Aβ(CSF/혈장) 및 Tau(CSF)의 2차 구조 분포를 나타내는 아미드 I 최댓값의 결정을 61명의 DC 환자 및 39명의 DAT 환자의 감별에 사용하였다. 이에 의해, 다수표(검정색 = 최댓값 < 1643 cm-1 및 회색 = 최댓값 ≥ 1643 cm-1)는 DC 및 DAT를 나타내었다. 따라서, DC 그룹에 대해 단지 3개의 거짓 양성 및 DAT 그룹에 대해 4개가 관측되었다. 이 결과는 95%의 특이도, 90%의 민감도를 나타내므로, 노인정신의학자 및 신경학자에 의한 임상 평가와 비교하여 조합 자료 분석에 대해 93%의 총 진단 정확도를 나타낸다.
면역-적외선 센서 및 이들의 제조는 본 출원인의 이전 특허 출원인 WO 2015/121339에 기재되며, 이제 체액 중의 Aβ 및 Tau 모두의 2차 구조 분포의 검출을 위해 적용된다. IR-센서의 제조는, 최적화되고 단순화된 프로토콜로 실란 또는 티올 화학을 통해 적외선 투과 재료의 표면 상에, 각각 Aβ 또는 Tau에 대한 수용체, 즉 항체의 직접적이고 친밀한 고정화를 포함한다. 액체(예컨대, 혈청, 혈장 또는 CSF)를 분석하기 위해서, 유동 시스템의 센서에 공급된다. 거대분자 물질이 작용화된 센서 표면 상의 항체에 의해 고정화된다. 광학적 센서 엘리먼트는 적외선 분석에 특히 적합하며, 임의로 추가로 상이한 파장에서의 형광 검출을 포함하는 다른 광학적 방법에 의한 병행 또는 대체 분석에 적합하다.
본 발명에 따라, 제1 및 제2 IR 셀의 적외선 투과 재료는 규소, 게르마늄, 셀렌화아연, 셀렌화갈륨 및 다이아몬드로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 게르마늄이다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 광학적 센서 엘리먼트는 사다리꼴 또는 평행사변형 모양의 섬유 또는 막대 형상의 기하학을 갖는 게르마늄 결정을 포함하는 내부 반사 엘리먼트를 갖는다. 게르마늄 결정은 게르마늄 단결정인 것이 바람직하고, 사다리꼴 컷 게르마늄 단결정이 특히 바람직하다.
게르마늄 결정은 반사 엘리먼트를 통해 1개, 1개 초과 또는 3개 초과의 적외선 반사를 가능하게 하거나 이를 제공하는 것이 더욱 바람직하고, 5개 초과 또는 심지어 20개 초과의 반사가 특히 바람직하다(13개의 능동적으로 감지된 반사를 갖는 25개 반사가 바람직하다). 이러한 다수 반사에서 후보 바이오마커 단백질과의 접촉을 허용하기 위해, 바이오마커 단백질에 대한 수용체는 적합한 수의 상기 내부 게르마늄 반사 엘리먼트 표면에 그래프팅된다.
수용체 및 따라서 거대분자의 내부 게르마늄 반사 엘리먼트에의 커플링에 사용되는 실란 및 티올 링커는 균질한 실란 및 티올 링커, 실란 링커의 혼합물 및 티올 링커의 혼합물을 포함한다. 수용체/거대분자와 단쇄 링커의 견고하고 친밀한 연결을 가능하게 하기 위해, 바람직하게는 20개 이하의 원자 또는 15개 이하의 원자의 (탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는) 효과적인 링커 쇄 길이를 갖는 링커가 사용된다.
이러한 단쇄 링커는, 하기 화학식 중 하나를 갖는 실란 링커:
X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z 또는
X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
및 하기 화학식을 갖는 티올 링커:
WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
를 포함하고, 여기서, W는 R1S- 또는 H이고, X는 각각의 경우에서 할로겐 및 C1-6 알콕시로부터 독립적으로 선택되고, n은 1 내지 10의 정수이고, n'는 1 내지 5의 정수이고, R1은 각각의 경우에서 C1-6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Y는 화학 결합, -O-, -CO-, -SO2-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2SO2- 및 -SO2NR2-(여기에서, R2는 H 또는 C1-6 알킬임)로부터 선택되고, Z는 -CO2H, -SO3H 및 이들의 에스테르 유도체를 포함하는 아민 반응성 기이다.
본 발명에서 할로겐은 불소, 염소, 브롬 및 요오드 원자를 포함한다. C1-6 알킬 및 C1-6 알콕시는 포화 또는 불포화될 수 있는 탄소수 1 내지 6의 선형, 분지형 또는 고리형 알킬 또는 알콕시 기를 포함한다. 고리형 알킬 및 알콕시 기의 경우, 3 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 것을 의미한다. 적합한 C1-6 알킬 및 C1-6 알콕시 기는 특히 메틸 및 메톡시, 에틸 및 에톡시, n-프로필 및 n-프로폭시, 이소-프로필 및 이소-프로폭시, 사이클로프로필 및 사이클로프로폭시, n-부틸 및 n-부톡시, 3차-부틸 및 3차-부톡시, 사이클로부틸 및 사이클로부톡시, n-펜틸 및 n-펜톡시, 사이클로펜틸 및 사이클로펜톡시, n-헥실 및 n-헥소시, 사이클로헥실 및 사이클로헥소시 등을 포함한다. 아민 반응성 기 Z는 유리 아미노 기와 반응성인 모든 유형의 작용기를 포함한다. 그 중, -CO2H, -SO3H 및 이들의 에스테르 유도체(활성 에스테르 포함)가 특히 바람직하다.
상기 화학식에서 -(CH2)n- 및 -(CH2)n'- 구조 요소는 또한 불소와 같은 하나 이상의 할로겐 원자 또는 중수소로 치환될 수 있는 하나 이상의 이중 및/또는 삼중 결합을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시형태에서, 광학적 센서 엘리먼트는 실란화에 의해 얻을 수 있고, 화학식 (i) 내지 (iii)의 링커에서 X는 C1-6 알콕시기, 바람직하게는 메톡시 및 에톡시 기로부터 독립적으로 선택되고, Y는 -NHCO-이고, Z는 -CO2H 또는 이들의 에스테르 유도체이고, n은 1 내지 5의 정수이고, n'는 1 내지 3이 정수이고, 바람직하게는 n은 3이고 n'는 2이다.
또 다른 실시형태에서, 광학적 센서 엘리먼트는 티올화에 의해 얻을 수 있고, 화학식 (iv)의 링커에서 W는 H이고, Y는 화학 결합이고, Z는 -CO2H 또는 이들의 에스테르 유도체이고, n은 1 내지 8의 정수이고, n'는 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 n은 8이고, n'는 4이다. 12-머캅토도데칸산 NHS 에스테르가 특히 바람직하다.
광학적 센서 엘리먼트의 또 다른 바람직한 실시형태에서, Aβ 펩티드 및 Tau 단백질에 대한 수용체는 특이 항체이다. Aβ 펩티드의 경우, 항체는 항체 A8978(Sigma Aldrich)과 같은 Aβ 펩티드의 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이고, Tau 단백질의 경우, 항체는 항체 Tau-5(AHB0042, Thermo Fisher Scientific)와 같은 모든 Tau 변이체(인산화되고 절두된 변이체, 3 또는 4개의 반복 영역을 갖는 변이체 또는 동형체를 포함)에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이다.
후보 바이오마커 단백질과 교차 반응하지 않는 차단 물질은 카세인, 에탄올아민, L-리신, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민 및 이들의 유도체를 포함하고, 바람직하게는 카세인이다.
센서 엘리먼트를 제조하는 방법에서, 산화는 H2O2/옥살산으로의 처리로 수행된다. 또한, 상기 방법에서 짧은 실란 링커에 의한 실란화는 바람직하게는 하기 화학식을 갖는 실란 유도체로 수행되고:
X3Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y,
X2(R1)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y 또는
X(R1)(R2)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y,
상기 식에서, 변수는 상기 정의된 바와 같다. Y의 정의에서 CO2H 또는 SO3H 모이어티의 에스테르 유도체가 사용되는 것이 특히 바람직하며, 이는 단순 C1-6 알킬 에스테르일 수 있으나 또한 활성화된 에스테르, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 또는 임의의 다른 활성화된 에스테르 유도체일 수 있다. 또한 상기 방법에서 수용체는 항체인 것이 바람직하다. 차단 물질은 카세인인 것이 더욱 바람직하다.
센서 엘리먼트를 제조하는 방법에서, 표면 활성화는 HF(49%)로의 처리로 수행된다. 또한, 상기 방법에서 짧은 티올 링커에 의한 티올화는 하기 화학식을 갖는 티올 링커로 바람직하게 수행되며:
WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
상기 식에서, 변수는 상기 정의된 바와 같다. Y의 정의에서 CO2H 또는 또는 SO3H 모이어티의 에스테르 유도체가 사용되는 것이 특히 바람직하며, 이는 단순 C1-6 알킬 에스테르일 수 있으나 또한 활성화된 에스테르, 예컨대 N-하이드록시숙신이미드 에스테르 또는 임의의 다른 활성화된 에스테르 유도체일 수 있다. 또한 상기 방법에서 수용체는 항체인 것이 바람직하다. 차단 물질은 카세인인 것이 더욱 바람직하다.
센서 엘리먼트를 제조하는 방법에서, 광학적 센서 엘리먼트는 실온 하에 제조된다. 모든 단일 단계는 IR-스펙트럼에 기초하여 평가될 수 있다. 이 검증 단게는 분석물의 특이적 검출 및 정확한 2차 구조 결정에 필수적이다.
본 발명의 양태 (4)의 디바이스는 적합한 IR 셀(챔버) 내에 삽입된 센서 엘리먼트를 갖는다. 광(IR) 방출 엘리먼트, 광(IR) 검출 엘리먼트 및 자료 처리 유닛을 더 포함할 수 있다. 추가의 광학적 방법에 의한 병행 검출을 위해, 디바이스는 상이한 파장에서 이러한 추가의 광학적 방법을 위한 광원 및 검출기 엘리먼트, 예컨대 UV/Vis-형광을 위한 광원 및 검출기를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 양태 (1)의 방법은 하기 단계를 포함한다:
(a) 적외선 투과 재료의 코어를 갖는 내부 반사 엘리먼트 및 상기 코어의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅된 Aβ 펩티드에 대한 적어도 하나의 수용체를 갖는 제1 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는 제1 IR 셀에서, 가용성 Aβ 펩티드를 갖는 체액의 적어도 하나의 플럭스를 전도하고, 상기 제1 IR 셀을 통해 IR 빔을 제공하며, 이로부터 적외선 스펙트럼을 얻는 단계;
(b) 적외선 투과 재료의 코어를 갖는 내부 반사 엘리먼트 및 상기 코어의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅된 Tau 단백질에 대한 적어도 하나의 수용체를 갖는 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는 제2 IR 셀에서, 가용성 Tau 단백질을 갖는 체액의 적어도 하나의 플럭스를 전도하고, 상기 제2 IR 셀을 통해 IR 빔을 제공하며, 이로부터 적외선 스펙트럼을 얻는 단계; 및
(c) 얻어진 적외선 스펙트럼을 분석하여 감별 진단에 의한 체액 중의 가용성 Aβ 펩티드 및 가용성 Tau 단백질의 2차 구조 분포를 결정하는 단계.
본 발명의 방법에서, 단계 (a) 및 (b)에 적용되는 체액은, 혈청, 혈장 및 CSF를 포함하는, 바이오마커를 포함하는 임의의 복합 체액일 수 있다. 추가의 적합한 체액은 눈물액 및 젖꼭지 흡인액이다.
바람직한 실시형태에서, 상기 방법은 (a) 및 (b) 전에 IR 셀 내에 상기 광학적 센서 엘리먼트를 설치하는 단계를 추가로 포함한다. 추가로/달리, 상기 방법은 단계 (a') 및 (b'): 수용체를 위한 유리 리간드의 용액을 적용하여 광학적 엘리먼트의 표면을 재생하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
단계 (a) 및 (b)에서 얻어진 스펙트럼은 아미드 I 밴드를 분해하기에 충분한 시그널 대 노이즈 비를 갖는다. 이는 단계 (c)에서 바이오마커 단백질의 아미드 I 밴드 최댓값의 시프트를 분석하여 후보 바이오마커 단백질의 2차 구조를 결정하고 감별 진단을 수행하게 한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법의 단계 (c)는 얻어진 적외선 스펙트럼을 공지된 2차 구조 및/또는 공지된 농도를 갖는 가용성 Aβ 펩티드 및/또는 가용성 Tau의 스펙트럼과 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 상기 방법은 상이한 파장에서 UV/Vis-형광을 포함하는 다른 광학적 방법에 의한 대체적 또는 적외선 분석과 병행하는 검출을 포함할 수 있다. 특히, 상기 방법은 면역-ATR-FTIR 진동 분광학을 병행 형광 분광학과 조합하는 것이 바람직하다.
양태 (1)의 방법은, 특히 전처리 없이(즉, 별도의 선행 농축 또는 정제 단계 없이) 뇌척수액, 혈액 또는 혈청을 포함하는 포유동물(인간, 동물) 기원의 체액 중에서 가용성 Aβ 펩티드 및 가용성 Tau를 직접적으로 결정하기 위한, 체액 중의 가용성 Aβ 펩티드 및 가용성 Tau를 측정하는 것을 가능하게 하고/하거나 이에 적합하다. 상기 방법은 별도(시험관내) 또는 온라인(환자에서 체액의 직접적 결정) 방식으로 후보 바이오마커 단백질을 결정하는 데 적합하다. 두 경우 모두에서, 상기 방법은 알츠하이머병 단계의 감별 진단 및 평가를 추가로 포함할 수 있다.
양태 (1)의 방법은 후보 바이오마커 단백질로서 아밀로이드-베타 및 Tau를 사용하여 알츠하이머병의 진행을 결정하는 데 특히 적합하며, 여기서 바람직하게는 1643 cm-1 +/- 5 cm-1, (또는 1643 cm-1 +/- 3 cm-1 또는 1643 cm-1 +/- 1 cm-1 또는 약 1643 cm-1)의 역치(threshold)와 함께, 1647 cm-1로부터 1640 cm-1로의 Aβ 펩티드의 아미드 I 밴드 최댓값의 시프트 및 바람직하게는 1643 cm-1 +/- 5 cm-1, (또는 1643 cm-1 +/- 3 cm-1 또는 1643 cm-1 +/- 1 cm-1 또는 약 1643 cm-1)의 역치와 함께, 1647 cm-1로부터 1640 cm-1로의 Tau 단백질의 아미드 I 밴드 최댓값의 시프트는 알츠하이머병을 나타낸다. 상기 방법은 또한 후보 바이오마커 단백질로서 아밀로이드-베타 및 Tau를 사용하여 알츠하이머병의 진행을 결정하는 데 특히 적합한다. 여기서, 감별 진단은 치매 유형의 보증된 임상 프로필을 제공하며, 바람직하게는 상기 방법은 CSF로부터의 Aβ(A), 혈장으로부터의 Aβ(B) 및 CSF로부터의 Tau(C)의 2차 구조 분포의 검출을 포함한다. 특히, 상기 방법은 알츠하이머형 치매(DAT) 및 질환 대조군(DC)의 감별 진단을 가능하게 하며, DAT 환자는 초기, 중등도 및 중증 DAT로 하위분류되고, DC 환자는 건강한 대조군, 다른 질환 및 알츠하이머병 이외의 또 다른 원인에 기인한 치매로 구분된다. 특히, 2개의 바이오마커, Aβ에 대한 (A)/(B) 및 Tau에 대한 (C) 모두에 대해, 식별 역치(1643 cm-1 ± 5 cm-1)는 알츠하이머병 환자와 DC 환자를 구분하고/하거나; (A), (B) 및 (C)의 조합은 보증된 DAT 진단에 적용 가능한 바이오마커 패널을 제공한다.
간단한 역치 분류자가 문헌(Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016) 및 WO 2015/121339)에 기술된 것과 유사하게 두 바이오마커 모두에 대해 확립된다. 이에 의해, 질환 대조군(DC) 및 알츠하이머형 치매(DAT) 감별을 위한 식별 스펙트럼 마커 밴드를 사용함으로써, 두 진단 그룹 모두가 CSF Aβ 분석에 기초하여 90%의 진단 정확도로 구분될 수 있었다. 혈장 Aβ 분석 단독으로부터 관측된 예측 정확도는 낮았다(84%). 또한, 단지 Tau 단백질 2차 구조 분포에만 기초한 두 그룹의 구분은 68%의 정확도로 불충분했다. 그러나, CSF 및 혈장으로부터의 Aβ의 결정된 아미드 I 주파수를 마커 패널에 대해 Tau의 것과 조합함으로써, 단순 다수표 분류자가 상당히 높은 예측 값을 나타내었다. 이제, 93%의 정확도 및 95%의 특이도가 달성되었다. 거짓 양성 진단은 관련 당사자에 대해 심각한 심리적 결과를 가질 수 있으므로, 높은 특이도는 AD와 같은 난치병에 특히 중요하다. 그러나, 조합된 자료 분석은 제2의 커다란 이점을 입증했다. Aβ 및 Tau의 자료를 조합함으로써, 병기에 대한 더 많은 정보 및 다른 유형의 치매에 대한 표시가 제공될 수 있다. 감별 진단법에 대한 원리는 간단하다. 제1 단계에서, CSF로부터 추출된 가용성 Aβ 분획의 아미드 I 최댓값을 문헌(Nabers et al., Anal. Chem Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016) 및 WO 2015/121339)에 기술된 바와 같이 결정하였다. 이에 의해, 1643 cm-1 이상의 최댓값이 DC를 나타내고, 이러한 주파수 미만의 최댓값이 DAT를 나타내었다. 제2 단계에서, 혈장 샘플에 대해 동일한 절차를 적용하였다. 다시, 각 샘플에 대해 Aβ의 아미드 I 최댓값을 결정하였다. 이제, 두 값이 모두 일관되게 마커 주파수 초과 또는 미만인 경우, DC와 DAT 사이의 감별이 높은 정확도로 수행될 수 있었다. 그러나, 일치하지 않는 Aβ 결과(CSF 및 혈장)에 대해서는, Tau 단백질 2차 구조 분포가 결정 지지자로서 사용될 수 있었다. 다른 한편, Tau 단백질 2차 구조 분포는 또한 DC 및 DAT 그룹을 알츠하이머 이외의 또 다른 원인에 기인한 치매로 또는 질환의 초기, 중등도 또는 중증 단계로 하위분류하는 잠재력을 입증하였다. 이와 함께, 파킨슨병 또는 혈관성 치매 환자가 DC 그룹 내에서 확인될 수 있었다(Aβ CSF ≥1643 cm-1; Aβ 혈장 ≥1643 cm-1; Tau CSF <1643 cm-1). 다른 한편, DAT 그룹은 질환의 초기(예컨대, Aβ CSF <1643 cm-1; Aβ 혈장 <1643 cm-1; Tau CSF ≥1643 cm-1), 중등도(Aβ CSF <1643 cm-1; Aβ 혈장 ≥1643 cm-1; Tau CSF <1643 cm-1) 또는 (Aβ CSF ≥1643 cm-1; Aβ 혈장 <1643 cm-1; Tau CSF <1643 cm-1), 및 중증(Aβ CSF <1643 cm-1; Aβ 혈장 <1643 cm-1; Tau CSF <1643 cm-1) 단계로 감별될 수 있었다.
본 발명은 하기 실시예로 추가로 기술되지만 이는 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실시예
재료 및 방법: WO 2015/121339에서와 동일한 실험 구성이 이용되었다.
샘플링 및 전처리:
CSF를 요추천자로 뽑아내고, 대학 병원 에센(Essen)에서 분액하고, 액체 질소에 급속 냉동하고, 운반하고, -80℃에서 저장하였다. 샘플을 측정 전에 전처리하지 않았으며, 단지 30초 동안 37℃에서 해동하였으며, 사용할 때까지 얼음에 보관하였다.
환자 집단: 질환 대조군(DC) 및 알츠하이머형 치매(DAT) 환자의 샘플 취득 및 진단에 대한 세부 사항은 이전에 상세히 기술되어 있다(Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). 이전 연구에서, 141명의 환자 샘플을 면역-적외선 센서를 사용하여 분석하였다. 이러한 집단에서 100명의 환자를 본 연구를 위해 무작위로 선발하였다. CSF 및 혈장으로부터 추출된 Aβ의 적외선 아미드 I 자료는 문헌(Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016))으로부터 채택하였다.
용액 및 시약:
포스페이트 완충된 식염수(PBS-버퍼): 137 mM 염화나트륨(NaCl), 2.7 mM 염화칼륨(KCl), 12 mM 총-포스페이트(Na2HPO4 및 NaH2PO4의 형태), pH 7.4.
카세인 차단-용액: 200 mM 수산화나트륨(NaOH), 우유로부터의 1%(w/v) 카세인(분말), H3PO4로 pH 7.4로 조절됨.
실란화-용액: 사용된 NHS-실란(N-(4,4,4-트리에톡시실란부틸)숙시남산 2,5-디옥소피롤리딘-1-일 에스테르)를 문헌(Schartner et al., JACS 135(10):4079-4087 (2013))에 기재된 바와 같이 합성하고 특성화하였다.
항체: 각각의 체액으로부터 Aβ 추출을 위해 항체 A8978(로트 번호: 061M4773, Sigma Aldrich)를 사용하였다. Tau 단백질 검출의 경우엔, 항체 Tau-5(AHB0042, Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.
측정 수행: 일반 절차는 WO 2015/121339에 기술된 것과 동일하다. IR-측정은 액체 질소 냉각된 수은-카드뮴-텔루라이드(MCT) 검출기를 갖는 버텍스(Vertex) 70V 분광기(Bruker Optics GmbH, Ettlingen, Germany) 상에서 수행되었다. 양면 인터페로그램은 2 cm-1의 스펙트럼 해상도, 블랙맨-하리스-3-텀-아포디세이션(Blackman-Harris-3-Term-apodisation), 메르츠(Mertz)-위상 보정 및 4회의 제로 필링으로 80 kHz 자료 속도에서 전-후방 간섭계 이동에서 기록되었다. 참조 스펙트럼은 평균 1000, 200개 인터페로그램의 샘플 스펙트럼으로 기록되었다. 평형 상태에서 블랭크 센서, 2-프로판올을 갖는 센서, 실란화된 표면, 버퍼, 항체 또는 카세인 코팅된 표면의 참조 단일 채널 스펙트럼의 기록은 람베르트-베르(Lambert-Beer) 법칙(E=-log(I/I0)에 기초한 고감도 차이 분광학을 가능하게 하였다. 상태 변화의 흡광도는 변화 전후의 강도 관계의 음의 십진 로그이다.
워크플로우: CSF 중의 Tau 단백질의 FTIR-분광 분석을 위한 센서 제조의 세부 사항은 이전에 공개되었다(WO 2015/121339; Nabers et al., Anal. Chem. Doi:10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016); Nabers et al., Journal of Biophotonics 9(3):224-34 doi:10.1002/jbio.201400145 (2016)). 간단히, 모든 커넥션 튜브를 포함한 플로우-셀의 총 용적은 400 μl였다. 각각의 분석을 위해, 샘플당 하나의 센서 엘리먼트를 실란(Schartner et al., JACS 135(10):4079-87 doi:10.1021/ja400253p (2013)) 및 항체로 새로이 작용화하였다. 분석 전, 표면을 카세인 차단 용액으로 포화시켰다. CSF 및 혈장 중의 Aβ 검출을 위해, 모노클로날 항체 A8978(Sigma Aldrich, aa 13-28)을 사용하였다. 모노클로날 Tau-5 항체(Life Technology, aa 210-230)로 Tau를 캡처하였다. 분석을 위해, 50 μl의 CSF 또는 150 μl의 EDTA-혈장을 각각 1 ml/min의 유속으로 순환 버퍼에 첨가하였다.
스펙트럼의 전처리: 참조 스펙트럼의 스케일링된 공제에 의해 수증기를 제거하였다. 스펙트럼은 기준선을 보정하였다.
실시예 1: 정확한 DC 및 DAT 감별을 위한 Aβ 및 Tau 단백질 2차 구조 분포
수행된 연구는 61명의 DC 및 39명의 DAT 환자로부터의 300개 샘플을 포함하였다. 환자 감별 진단에 대한 세부 사항은 이전에 기술되어 있다(Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016)). 일반적으로, 환자 집단을 DC 및 DAT 피험체로 구분하였다. DAT 그룹은 초기, 중등도 및 중증 상태의 알츠하이머병으로 더욱 하위분류되었다. 파킨슨병 또는 혈관성 치매와 같은 알츠하이머병 원인에 기인하지 않는 치매를 겪는 환자를 포함하는 소수의 DC 환자에 대해, 완전한 감별 진단이 입수가능했다. CSF 및/또는 혈장 중의 Aβ 및 Tau의 2차 구조 분포의 분석을 위해, 두 바이오마커 모두를 문헌(Nabers et al., Anal. Chem. Doi: 10.1021/acs.analchem.5b04286 (2016))에 기술된 바와 같이 면역-적외선 센서에 의해 각각의 유체로부터 추출하였다. 따라서, Aβ 및 Tau는 각각 표면 고정된 모노클로날 항체 A8978(Aβ의 aa13-28) 및 Tau-5(aa210-230)에 의해 CSF 또는 혈장으로부터 별도로 캡쳐되었다. 2차 구조 분포는 Aβ 및 Tau의 기록된 아미드 I 최댓값 주파수에 의해 표시되었다. 이전 연구에서, 단순 역치 분류자는 DC 및 DAT 식별에 대해 1643 cm-1의 식별 마커 주파수로 확립되었다. 동일한 마커 밴드를 본 연구에 사용하였다. 먼저, CSF로부터의 Aβ의 아미드 I 최댓값을 각각의 환자 샘플에 대해 결정하였다. 이에 의해, 1643 cm-1 미만의 최댓값 위치는 DAT를 나타내었다. 다음으로, 혈액 EDTA-혈장으로부터의 Aβ의 아미드 I 최댓값을 확인하였다. 마지막으로, CSF 중의 추출된 Tau 단백질 분획의 최댓값을 검출하였다. 식별 마커 밴드는 DAT를 나타내는 <1643 cm-1에서 두 마이오마커 모두 및 두 체액 모두에 대해 동일하게 정의되었다. DC 및 DAT 그룹의 아미드 I 최댓값 분포는 CSF(Kruskal-Wallis ANOVA; p=2.5*10-11; 신뢰 수준 β=0.05) 및 혈장(p=3.4*10-9)으로부터의 Aβ에 대해 매우 유의한 차이를 나타내었으며, CSF로부터의 Tau(p=1.6*10-3)에 대해서는 유의하게 상이했다(도 2). 따라서, Aβ와 비교하여 Tau 아미드 I 최댓값의 보다 작은 시프트가 DAT 피험체에 대해 관측되었다. DC 피험체에 대해 1645 cm-1 및 DAT 피험체에 대해 1641 cm-1를 갖는 CSF로부터의 Aβ와 비교하여, Tau의 평균 아미드 I 최댓값은 DC 그룹에 대해 1644 cm-1이고 DAT 그룹에 대해 1642 cm-1이었다. 혈장으로부터의 Aβ는 DC 그룹에 대해 1648 cm-1 및 DAT 그룹에 대해 1641 cm-1의 평균 최댓값을 나타내었다. 이러한 분포에 기초하여, 또한 DAT를 나타내는 투명한 검정 박스를 갖는 도 3의 3D-산포도에 도시되는 바와 같이, 정확도, 민감도 및 특이도를 제공함으로써 각각의 바이오마커의 진단 성능이 홀로 계산되었다. 추가로, 수신기 작동 특성-(Receiver Operating Characteristic-: ROC-) 곡선 분석이 1630.5 cm-1 내지 1660.5 cm-1의 역치를 스캐닝하고 각각의 파수에서 민감도 및 특이도를 결정함으로써 수행되었다. 나베르스(Nabers) 등의 결과와 유사하게, Aβ 기반 분석의 진단 정확도는, 혈장에서 85%를 갖는 Aβ 2차 구조 분포 분석과 비교하여(도 4B, 도 4D; 특이도 90%, 민감도 77%, 0.85), CSF에 대해 90%로 가장 높았다(도 4A, 도 4D; 특이도 89%, 민감도 92%, AUC 0.90). 대조적으로, CSF에서 Tau 단백질 2차 구조 분포에 기초한 DC 및 DAT 감별은 단지 68%의 진단 정확도를 나타내었으며(도 4C, 도 4D; 특이도 67%, 민감도 69%, AUC 0.67), 이는 Tau 단독은 DAT 검출을 위한 적합한 바이오마커가 아님을 나타낸다. 그러나, 3개의 바이오마커 값 모두를 다수표 분류자에 추가하여 제시된 바이오마커 패널에 기초한 진단 결정을 함으로써(역치 미만의 2개의 최댓값 = 병에 걸림, 역치 초과의 2개의 최댓값 = DAT 아님), 진단 성능은 95%의 특이도, 90%의 민감도 및 따라서 임상 진단과 비교하여 93%의 총 정확도로 증가될 수 있었다. 이와 함께, 61개의 DC 중 단지 3개의 거짓 양성 및 31개의 DAT 중 4개의 거짓 음성이 확인되었다.
실시예 2: DC 및 DAT 감별 진단을 위한 조합 어세이
조합된 자료 분석은 두 진단 그룹 모두를 하위분류하는 잠재력을 제공했다. 이를 도 5에 개략적으로 도시했다. 예컨대, CSF 및 혈장으로부터의 Aβ는 1643 cm-1 이상의 아미드 I 최댓값을 나타내나, Tau 아미드 I 최댓값은 1643 cm-1 미만이면, 이 경우 조합된 면역-적외선 어세이에 의해 또 다른 유형의 치매가 잠재적으로 지시될 수 있다(도 5). 대조적으로, CSF 및 혈장으로부터의 Aβ의 아미드 I 최댓값은 마커 밴드 미만이나 Tau 최댓값은 초과하는 경우, DAT의 초기 상태가 표시될 것이다. 이러한 절차는 우리의 연구 내의 두 진단 그룹 모두에 적용되었다. CSF로부터의 Aβ의 아미드 I 최댓값은 모든 DC 케이스의 69%에서 CSF로부터의 Tau보다 높은 최댓값 값을 입증하였다. 이 효과는 Aβ와 비교하여 Tau 단백질의 보다 높은 장애적 특성에 의해 설명될 수 있다. 다른 한편으로, 모든 DC 케이스의 25%에서 최댓값은 Aβ에 대해 보다 낮았으며, 단지 모든 케이스의 6%에서만 최댓값이 동일하였다. 이러한 관계는 DAT 그룹에 대해서는 완전히 변했다. 여기에서는 모든 DAT 환자의 단지 31%만이 Tau 보다 Aβ에 대해 더 큰 아미드 I 최댓값을 보였으며, 62%는 낮은 Aβ 최댓값을 보였다(도 6). 이는 Aβ 축적이 알츠하이머병의 초기 및 시작 이벤트에 있고 Tau 단백질 응집이 동반된다는 가설을 뒷받침한다.

Claims (15)

  1. 체액 중의 가용성 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드 분획 및 가용성 Tau 단백질 분획의 2차 구조 분포의 직접 분석에 의해 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하는 방법으로서,
    (a) 적외선 투과 재료의 코어를 갖는 내부 반사 엘리먼트 및 상기 코어의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅된 Aβ 펩티드에 대한 적어도 하나의 수용체를 갖는 제1 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는 제1 IR 셀에서, 가용성 Aβ 펩티드를 갖는 체액의 적어도 하나의 플럭스(flux)를 전도하고; 상기 제1 IR 셀을 통해 IR 빔을 제공하며; 이로부터 적외선 스펙트럼을 얻는 단계로서, 상기 Aβ 펩티드에 대한 적어도 하나의 수용체는, Aβ 펩티드에 대해 특이적이며 입체구조적으로 독립적인 결합을 할 수 있는 항체이고, 상기 적어도 하나의 수용체의 자유롭게 접근 가능한 아민 기를 짧은 실란/티올 링커 상의 아민 반응성 기와 반응시키고 짧은 실란/티올 링커 상의 남은 아민 반응성 기를 Aβ 펩티드와 교차 반응하지 않는 차단 물질로 차단시키는 짧은 실란 링커에 의한 실란화 또는 짧은 티올 링커에 의한 티올화에 의해 상기 내부 반사 엘리먼트의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅되는 것인 단계;
    (b) 적외선 투과 재료의 코어를 갖는 내부 반사 엘리먼트 및 상기 코어의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅된 Tau 단백질에 대한 적어도 하나의 수용체를 갖는 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는 제2 IR 셀에서, 가용성 Tau 단백질을 갖는 체액의 적어도 하나의 플럭스를 전도하고; 상기 제2 IR 셀을 통해 IR 빔을 제공하며; 이로부터 적외선 스펙트럼을 얻는 단계로서, 상기 Tau 단백질에 대한 적어도 하나의 수용체는, 각각 Tau 단백질에 대해 특이적이며 입체구조적으로 독립적인 결합을 할 수 있는 항체이고, 상기 적어도 하나의 수용체의 자유롭게 접근 가능한 아민 기를 짧은 실란/티올 링커 상의 아민 반응성 기와 반응시키고 짧은 실란/티올 링커 상의 남은 아민 반응성 기를 Tau 단백질과 교차 반응하지 않는 차단 물질로 차단시키는 짧은 실란 링커에 의한 실란화 또는 짧은 티올 링커에 의한 티올화에 의해 상기 내부 반사 엘리먼트의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅되는 것인 단계; 및
    (c) 얻어진 적외선 스펙트럼을 분석하여 감별 진단을 위한 체액 중의 가용성 Aβ 펩티드 및 가용성 Tau 단백질의 2차 구조 분포를 결정하는 단계로서, 여기서 Aβ 펩티드 및/또는 Tau 단백질의 아미드 I 밴드의 다운시프트가 병기를 나타내는 것인 단계
    를 포함하는, 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 및 제2 IR 셀의 적외선 투과 재료가 규소, 게르마늄, 셀렌화아연, 셀렌화갈륨 및 다이아몬드로부터 독립적으로 선택되고, 바람직하게는 게르마늄인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트가, 사다리꼴 또는 평행사변형 모양이고 아미드 I 밴드를 검출하기에 충분한 시그널 대 노이즈 비로 적외선에서 투명한 게르마늄 내부 반사 엘리먼트, 및 각각 Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질에 대해 특이적이며 입체구조적으로 독립적인 결합을 할 수 있는 항체이고, 상기 적어도 하나의 수용체의 자유롭게 접근 가능한 아민기를 짧은 실란/티올 링커 상의 아민 반응성 기와 반응시키고 짧은 실란/티올 링커 상의 남은 아민 반응성 기를 각각 Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질과 교차 반응하지 않는 차단 물질로 차단시키는 짧은 실란 링커에 의한 실란화 또는 짧은 티올 링커에 의한 티올화에 의해 상기 내부 게르마늄 반사 엘리먼트의 적어도 하나의 표면에 직접적으로 그래프팅되는 Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질에 대한 적어도 하나의 수용체를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 내부 반사 엘리먼트가
    (i) 게르마늄 단결정, 바람직하게는 사다리꼴 컷 게르마늄 단결정이고/이거나;
    (ii) 반사 엘리먼트를 통해 1회 초과의 적외선 통과를 허용 또는 제공하고/하거나;
    (iii) 상이한 파장에서의 형광 검출을 포함하는 다른 광학적 방법에 의한 대체 또는 병행 분석에 추가로 적합하고/하거나;
    (iv) Aβ 펩티드 또는 Tau 단백질과 교차 반응하지 않는 차단 물질이 카세인, 에탄올아민, L-리신, 폴리에틸렌 글리콜, 알부민 및 이들의 유도체 중에서 선택되는 것인 방법.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 실란 및 티올 링커가 균질한 실란 및 티올 링커, 실란 링커의 혼합물 및 티올 링커의 혼합물을 포함하고, 20개 이하의 원자 또는 15개 이하의 원자의 효과적인 링커 쇄 길이를 갖고, 바람직하게는 실란 링커가 하기 화학식 중 하나를 갖고:
    (i) X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
    (ii) X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z 또는
    (iii) X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
    티올 링커가 하기 화학식을 가지며:
    (iv) WS-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z,
    여기서, W는 R1S- 또는 H이고, X는 각각의 경우에서 할로겐 및 C1-6 알콕시로부터 독립적으로 선택되고, n은 1 내지 10의 정수이고, n'는 1 내지 5의 정수이고, R1은 각각의 경우에서 C1-6 알킬로부터 독립적으로 선택되고, Y는 화학 결합, -O-, -CO-, -SO2-, -NR2-, -S-, -SS-, -NR2CO-, -CONR2-, -NR2SO2- 및 -SO2NR2-(여기에서, R2는 H 또는 C1-6 알킬임)로부터 선택되고, Z는 -CO2H, -SO3H 및 이들의 에스테르 유도체를 포함하는 아민 반응성 기인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 적외선 센서 엘리먼트가
    (i) 실란화에 의해 얻을 수 있고, 화학식 (i) 내지 (iii)의 링커에서 X가 C1-6 알콕시기, 바람직하게는 메톡시 및 에톡시 기로부터 독립적으로 선택되고, Y가 -NHCO-이고, Z가 -CO2H 또는 이들의 에스테르 유도체이고, n이 1 내지 5의 정수이고, n'가 1 내지 3의 정수이고, 바람직하게는 n이 3이고 n'가 2이거나; 또는
    (ii) 티올화에 의해 얻을 수 있고, 화학식 (iv)의 링커에서 W가 H이고, Y가 화학 결합이고, Z가 -CO2H 또는 이들의 에스테르 유도체이고, n이 1 내지 8의 정수이고, n'가 1 내지 5의 정수이고, 바람직하게는 n이 8이고, n'가 4인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) Aβ 펩티드에 결합하는 수용체가 항체, 바람직하게는 항체 A8978를 포함하는, Aβ 펩티드의 중심 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체이거나; 또는
    (ii) Tau 단백질에 결합하는 수용체가 항체, 바람직하게는 항체 Tau-5를 포함하는, Tau의 중간 에피토프 및 모든 Tau 변이체에 존재하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 알츠하이머병의 초기/전조, 중등도 및 중증 병기로의 감별을 제공하고,
    (i) CSF로부터의 Aβ, 혈장으로부터의 Aβ 및 CSF로부터의 Tau의 언급된 바이오마커 모두의 아미드 I 최댓값(maximum)이 식별 역치(1643 cm-1 ± 5 cm-1) 미만인 경우 중증 병기를 나타내고,
    (ii) 하나는 CSF 또는 혈장으로부터의 Aβ이고 다른 하나는 CSF로부터의 Tau인 2개의 바이오마커의 아미드 I 최댓값이 식별 역치(1643 cm-1 ± 5 cm-1) 미만인 경우 중등도 병기를 나타내고,
    (iii) CSF로부터의 Tau를 제외한 1 또는 2개의 바이오마커(CSF 및/또는 혈장로부터의 Aβ)의 아미드 I 최댓값이 식별 역치(1643 cm-1 ± 5 cm-1) 미만인 경우 초기 병기를 나타내는 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 감별 진단이 치매 유형에 대해 보증된 임상 프로필을 제공하고, 바람직하게는 상기 방법은 CSF로부터의 Aβ(A), 혈장으로부터의 Aβ(B) 및 CSF로부터의 Tau(C)의 2차 구조 분포의 검출을 포함하고, 가장 바람직하게는 상기 방법은 알츠하이머형 치매(Dementia Alzheimer type: DAT) 및 질환 대조군(Disease Control: DC)의 감별 진단을 가능하게 하고, DAT 환자는 초기, 중등도 및 중증 DAT로 하위분류되고, DC 환자는 건강한 대조군, 다른 질환 및 알츠하이머병 이외의 또 다른 원인에 기인한 치매로 구분되는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    (i) Aβ에 대한 (A) 및 (B) 및 Tau에 대한 (C)의 두 마커 모두에 대해, 식별 역치(1643 cm-1 ± 5 cm-1)가 알츠하이머병 환자와 DC 환자를 구분하고/하거나;
    (ii) (A), (B) 및 (C)의 조합이 보증된 DAT 진단에 적용 가능한 바이오마커 패널을 제공하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 체액의 분석에 기초하여 환자의 질환 상태에 대한 정보를 제공하고, 바이오마커 단백질의 아미드 I 밴드 최댓값의 시프트가 병의 진행을 나타내는 분류자인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 1638 내지 1648 cm-1의 값을 갖는 역치 분류자가 병의 진행을 나타내는 분류자인 방법.
  13. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는, 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하기 위한 키트.
  14. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트를 포함하는, 알츠하이머병을 상이한 병기로 감별 진단 및 하위분류하기 위한 디바이스.
  15. 체액 중의 가용성 아밀로이드-베타(Aβ) 펩티드 분획 및 가용성 Tau 단백질 분획의 2차 구조 분포를 직접 분석하기 위한 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 제1 및 제2 적외선 센서 엘리먼트, 제13항의 키트 또는 제14항의 디바이스의 용도.
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