CN110168374A - 用于对阿尔茨海默病的鉴别诊断的组合测试 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种组合的免疫红外测定法，用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类分为不同的疾病阶段。该方法可用于确保疾病诊断和患者分层。该测试考虑了体液中淀粉样‑β肽和Tau蛋白二级结构分布的变化的无标记检测。这种从天然到β‑片层富集的亚型的二级结构变化在临床疾病表现之前很多年就出现。现在，组合方法利用这种位移进行基于液体活组织检查的诊断。

Description

用于对阿尔茨海默病的鉴别诊断的组合测试
本发明提供了一种组合的免疫红外测定法，用于将阿尔茨海默病进行鉴别诊断和亚分类以分为不同的疾病阶段。该方法可用于确保疾病诊断和患者分层。该测试考虑了体液中淀粉样-β肽和Tau蛋白二级结构分布的变化的无标记检测。这种从天然到β-片层富集的亚型的二级结构变化对于Aβ和Tau延时发生，但在临床疾病表现之前很多年就出现。现在，组合方法利用这种位移进行基于液体活组织检查的诊断。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是最常见的神经退行性疾病之一，其影响全世界超过3500万人(Prince等人，London，UK doi:10.1111/j.0963-7214.2004.00293.x(2015))。AD的鉴别诊断和亚分类，特别是疾病的早期或前驱阶段的分类，在临床常规中仍然具有挑战性。目前需要用于早期检测AD的可靠生物标记物。但有保证和早期鉴别诊断是未来治疗干预的基础(Chiba，Neurodegenerative Diseases，Uday Kishore编辑，181–225.InTech doi:10.5772/55293(2013)；Thorsett和Latimer，Current Opinion Chem.Biol.4(4):377-82(2000))。因此，科学研究机构正在关注优选基于液体活检的简单诊断测试(Doecke，Arch.Biol.69(10):1318doi:10.1001/archneurol.2012.1282(2012)；Andreasen等人，J.Neurology，Neurosurgery and Psychiatry 64(3):298–305(1998)；Fiandaca等人，Frontiers in Neurology 6(Nov):1-13doi:10.3389/fneur.2015.00237(2015)；Mapstone等人，Nature Medicine 20(4):415-18.doi:10.1038/nm.3466(2014))。
在阿尔茨海默病中，大多数本身无序的淀粉样-β(Aβ)肽和Tau蛋白变为β-片层富集的亚型的二级结构变化被讨论为疾病进展期间的起始事件(Sarroukh等人，Cell.Mol.Life Sci.68(8):1429-38 doi:10.1007/s00018-010-0529-x(2011)；Cerf等人，Biochem.J.421(3):415-23 doi:10.1042/BJ20090379(2009)；等人，Prion 3(2):89-93(2009)；Sachse等人，PNAS 105(21):7462-66doi:10.1073/pnas.0712290105(2008)；Glabe，J.Biol.Chem.283(44):29639-43doi:10.1074/jbc.R800016200(2008)；Cavallucci等人，Mol.Neurobiol.doi:10.1007/s12035-012-8251-3(2012)；Haass和Selkoe，Nature Rev.Mol.Cell Biol.8(2):101-12doi:10.1038/nrm2101(2007)；Kolarova等人，Int.J.Alzheimer's Disease doi:10.1155/2012/731526(2012)；Yang等人，Devel.Brain Res.156(2):127-38doi:10.1016/j.devbrainres.2005.02.004(2005))。因此，提出了Tau聚集和沉积到神经元纤维缠结(NFT)中伴随Aβ聚集(Lo等人，Arch.Neurol.68(10):1257–66doi:10.1001/archneurol.2011.123(2011)；Bennett等人，Arch.Neurol.61(3):378-84doi:10.1001/archneur.61.3.378(2004)；Coomaraswamy等人，PNAS 107(17):7969-74doi:10.1073/pnas.1001056107(2010)；Braak和Braak，Acta Neuropathologica82(4):239-59doi:10.1007/BF00308809(1991)；Thal等人，J.Neuropath.Exp.Neurol.59(8):733-48.(2000)；Thal等人，Science of Aging Knowledge Environment 2006(6):re1doi:10.1126/sageke.2006.6.re1(2006))。
在临床中，常规神经心理学测试和脑脊液(CSF)中不同生物标记物水平的神经化学定量结果被用于现有技术的鉴别诊断。但是生物标记物浓度本身，如Aβ40、Aβ42、总Tau或过度磷酸化的Tau水平，可能与AD进展无关(Wiltfang等人，J Neurochem.，101(4):1053-59doi:10.1111/j.1471-4159.2006.04404.x(2007)，Gabelle等人，J Alzheimers Dis.，26(3):553-63doi:10.3233/JAD-2011-110515(2011)，Blennow等人，J Nutr Health Aging，13(3):205-8doi:10.1007/s12603-009-0059-0(2009))。此外，基于这些生物标记定量，鉴别诊断仍然具有挑战性。然而，正电子发射断层扫描(PET)和磁共振断层扫描(MRT)检测到聚集物(β-片层富集的蛋白累积)，例如人脑中的斑块。然而，PET和MRT是非常昂贵且耗时的技术，其不适用于前驱AD阶段的检测，因此仅提供疾病的中期/晚期阶段的确定。另一个缺点是在PET的情况下使用造影剂，其也给患者带来压力。除了已经提到的技术之外，基于荧光的免疫测定是新兴领域，尤其是酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于表面的荧光强度分布分析(sFIDA)。但是这些技术需要荧光标记的检测抗体，其可以影响分析的生物标记物的二级结构。此外，ELISA和sFIDA未显示关于蛋白质二级结构或二级结构分布的任何直接信息。此外，迄今为止，Tau蛋白的二级结构从未用于诊断或鉴别目的，因为所述技术缺乏构象敏感性。
为了确定这种二级结构变化，傅里叶变换红外-(FTIR)差异光谱是一种强有力的工具(和Gerwert，Chemphyschem 6(5):881-888doi:10.1002/cphc.200400504(2005))。由肽键的C＝O振动引起的酰胺I带的频率指示蛋白质骨架的二级结构。特别是，通过表面探测衰减全反射(ATR)技术的监测所得的频率向下位移至1630cm-1，可以可靠地检测体液中β-片层富集的生物标记亚型的增加。为了分析体液中特定蛋白质的二级结构分布，目标蛋白质必须选择性地结合在表面层内，这是通过抗体功能化内反射元件(IRE)实现的(Schartner等人，JACS 135(10):4079-87doi:10.1021/ja400253p(2013))。该方法用于提取和测定CSF和血浆中可溶性Aβ级分的二级结构分布，用于中度AD和疾病对照区分(Nabers等人，J.Biophotonics 9(3):224-34doi:10.1002/jbio.201400145(2016)；Nabers等人，Anal.Chem.Doi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016))。
相反，表面等离子体共振(SPR)、表面声波或石英晶体微量天平等技术用于分析蛋白质-配体或蛋白质药物相互作用。由于这些技术仅提供动力学信息，但没有光谱分解，因此它们无法揭示蛋白质内的直接二级结构变化。表面增强红外吸收(SEIRA)光谱等其他技术理论上可提供光谱分辨，但由于粗糙金表面的制备，测量的可重复性非常具有挑战性，因此无法为蛋白质二级结构转变分析提供稳健的平台。
WO 2015/121339提供了用于通过振动光谱法进行构象和二级结构分析的生物传感器，特别是用于复杂混合物例如体液中单个选定蛋白质的直接非侵入性定性二级结构分析。对于分析，不需要通过特殊的制备程序分离、浓缩或预处理所选物质。生物传感器适用于确定疾病进展，其中候选生物标记物蛋白的构象转变与疾病进展相关，其中生物标记物蛋白的最大酰胺I带的移位是指示疾病进展的分类物。考虑蛋白质错误折叠疾病，例如阿尔茨海默病、帕金森病、Creutzfeldt-Jakob病或亨廷顿病，这些信息与疾病进展密切相关。
发明内容
阿尔茨海默病(AD)是一种多因素蛋白病，包括两个主要的生物标志候选物的错误折叠。淀粉样-β肽(Aβ)和Tau蛋白均在疾病进展期间显示出增强的β-片层亚型。以前，脑脊液(CSF)和血浆中总Aβ级分中β-片层Aβ亚型含量的增加可用于通过免疫红外传感器的AD检测。在此，分别对来自疾病对照(DC)和痴呆阿尔茨海默类型(DAT)患者的300个样品分析可溶性Aβ(CSF，血浆)和Tau蛋白(CSF)的二级结构分布。Tau蛋白二级结构分布被证明是痴呆的一般标记物，不是特异性地用于DAT，但是Aβ和Tau的组合数据分析产生DC/DAT区分的诊断测定，准确度为93％。此外，综合数据评估显示在DAT的早期和晚期细分DAT患者的可能性，并且可以提供DC受试者的鉴别诊断。因此，本发明提供了：
(1)通过直接分析体液中可溶性淀粉样-β(Aβ)肽级分和可溶性Tau蛋白级分的二级结构分布，将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类分为不同疾病阶段的方法，包括以下步骤：
(a)在包含第一红外传感器元件的第一IR池中传导至少一通量的具有可溶性Aβ肽的体液，所述第一红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Aβ肽的受体，使IR光束通过所述第一IR池，并由此获得红外光谱；
(b)在包含第二红外传感器元件的第二IR池中传导至少一通量的具有可溶性Tau蛋白的体液，所述第二红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Tau蛋白受体，使IR光束通过所述第二IR池，并由此获得红外光谱；
和
(c)分析获得的红外光谱以确定体液中可溶性Aβ肽和可溶性Tau蛋白的二级结构分布，用于鉴别诊断，优选地，Aβ肽和/或Tau蛋白的酰胺I带的向下位移指示疾病阶段。
(2)上述方面(1)的优选实施方案，其中所述第一和第二红外传感器元件包括锗内部反射元件，该锗内部反射元件具有梯形或平行四边形形状并且在红外线中是透明的，具有足够的信噪比以检测酰胺I带，且Aβ肽或Tau蛋白的至少一种受体是分别能够特异性和构象独立地结合Aβ肽或Tau蛋白的抗体，并通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部锗反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用分别不与Aβ肽或Tau蛋白交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团，
(3)用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类为不同疾病阶段的试剂盒，其包含如上面(1)或(2)中定义的第一和第二红外传感器元件，
(4)一种用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类为不同疾病阶段的装置，所述装置包含如上面(1)或(2)所定义的第一和第二红外传感器元件，和
(5)上述(1)或(2)中定义的第一和第二红外传感器元件、上述(3)中定义的试剂盒或上述(4)中定义的装置的用途，其用于直接分析可溶性淀粉样-β(Aβ)肽级分和可溶性Tau蛋白级分在体液中的二级结构分布。
本发明基于用两个传感器元件单独检测Aβ和Tau。在这种情况下，分析和亚分类的基础是确定Aβ和Tau的二级结构分布，这两者分别从体液中提取。到目前为止，CSF中Tau蛋白的二级结构分布从未被考虑用于诊断目的。此外，将包括CSF中Tau的二级结构变化用于阿尔茨海默病检测提供的不仅仅是对诊断准确性的累加效应。分析Aβ(例如在CSF和/或血浆中)和Tau(例如在CSF中)的二级结构分布使得能够将阿尔茨海默病亚分类为轻度至重度疾病阶段，以及在AD与其他痴呆类型之间进行区分。
附图简述
图1：组合的免疫-红外测定的方案和分析原理。(A)使用抗体功能化免疫红外传感器分别提取CSF和/或血浆中存在的Aβ(1)和Tau(2)的总级分。检测到的Aβ和Tau二级结构分布由红外酰胺I最大值位置指示。
图2：用于DC和DAT区分的盒型图中显示的酰胺I最大值位置的分布，其基于CSF和血浆中的Aβ和CSF中的Tau的分析。两个诊断组显示出CSF中(p＝2.5*10-11，Kruskal-WallisANOVA，置信水平a＝0.05)和EDTA-血浆(p＝3.4*10-9)Aβ的酰胺I最大值的高显著性差异，以及CSF中Tau的中等显著性(p＝1.6*10-3)。在盒型图中，25/50/75％分位数显示为水平线，平均带位置显示为方形，±标准偏差显示为触须(whiskers)，且观察到的最小/最大值显示为交叉。
图3：对于61DC(灰色)和39DAT(黑色)样品，对CSF中的Tau、CSF中的Aβ和EDTA-血浆中的Aβ测定的酰胺I最大值位置的3D散射图。透明黑框内的数据点表示在所有三种测定中被鉴定为DAT的受试者。
图4：基于CSF中的Aβ二级结构分布(A)、EDTA-血浆中的Aβ(B)和CSF中的Tau蛋白(C)的测定，对DC(n＝61)和DAT(n＝39)区分的ROC曲线分析。按此顺序，实现了0.90、0.85和0.67的AUC。因此，计算出92％(Aβ，CSF)、85％(Aβ，血浆)和68％(Tau，CSF)的诊断准确度(D)。基于这些数据，单独的Tau二级结构分布更多地是痴呆的一般生物标记物而不是特定DAT检测。
图5：通过组合免疫红外测定对DAT和其他类型痴呆的鉴别诊断和疾病阶段分类的流程图。该测定基于体液中Aβ肽和Tau蛋白二级结构分布的测定。该分布由提取的生物标记物级分的红外构象敏感性酰胺I带的最大值位置表示。低于1643cm-1的辨别标记带的最大值被定义为患病。该程序适用于从CSF和血浆中提取的Aβ级分和来自CSF的Tau蛋白级分。当所有三种生物标记物值均高于或等于1643cm-1时，不会指定为痴呆。相反，低于1643cm-1的生物标记物值指示严重的DAT。当只有Tau酰胺I最大值低于标记物带时，将鉴定为其他类型的痴呆。
图6：代表Aβ(CSF/血浆)和Tau(CSF)的二级结构分布的酰胺I最大值的测定用于区分61个DC和39个DAT患者。因此，多数投票(黑色＝最大值<1643cm-1，灰色＝最大值≥1643cm-1)描绘了DC和DAT。因此，对于DC组仅观察到3个假阳性，对于DAT组观察到4个假阳性。与精神病学家(gernontopsychiatrist)和神经科医师的临床评估相比，对于组合数据分析，这导致特异性为95％，灵敏度为90％，因此整体诊断准确度为93％。
发明详述
免疫红外传感器及其制备在申请人的先前专利申请WO 2015/121339中描述，并且现在用于检测体液中Aβ和Tau的二级结构分布。IR传感器的生产包括使用优化的简化方案通过硅烷或硫醇化学在红外透明材料的表面上分别直接和紧密地固定Aβ或Tau的受体，即抗体。为了分析液体(例如血清，血浆或CSF)，将其以流动体系供给传感器。大分子物质通过抗体固定在功能化的传感器表面上。光学传感器元件特别适用于红外分析，并且可选地进一步用于通过另一种光学方法进行平行或替代分析，该另一种光学方法包括检测不同波长的荧光。
根据本发明，第一和第二IR池的红外透明材料独立地选自硅、锗、硒化锌、硒化镓和金刚石，并且优选为锗。
在本发明的一个优选实施例中，光学传感器元件具有内部反射元件，该内部反射元件包括具有梯形或平行四边形形状、纤维或杆状的几何形状的锗晶体。优选锗晶体是锗单晶，而特别优选梯形切口锗单晶。
进一步优选的是，锗晶体允许或提供红外光通过反射元件的一次、多于一次或多于三次的反射，特别优选的是多于五次反射或甚至超过二十次反射(优选为25次反射，其中具有13个主动感应反射)。为了在这种多次反射中允许与候选生物标记物蛋白接触，将生物标记物蛋白的受体接枝到所述内部锗反射元件的适当数量的表面上。
用于将受体和由此的大分子偶联到内部锗反射元件的硅烷和硫醇接头包括均质硅烷和硫醇接头、硅烷接头的混合物和硫醇接头的混合物。为了使受体/大分子短链接头紧密且密切地连接，优选使用具有不多于20个原子或不多于15个原子的有效接头链长(包括碳原子和杂原子)的接头。
这种短链接头包括具有下式之一的硅烷接头：
X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z，
X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z或
X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z，
和具有下式的硫醇接头：
WS-(CH2)n-Y-(CH2)n’-Z,
其中W为R1S-或H，X在每次出现独立地选自卤素和C1-6烷氧基，n为1至10的整数，n'为1至5的整数，R1在每次出现独立地选自C1-6烷基，Y选自化学键、-O-、-CO-、-SO2-、-NR2-、-S-、-SS-、-NR2CO-、-CONR2-、-NR2SO2-和-SO2NR2-(其中R2为H或C1-6烷基)，且Z为胺-反应性基团，包括-CO2H、-SO3H及其酯衍生物。
本发明的卤素包括氟、氯、溴和碘原子。C1-6烷基和C1-6烷氧基包括具有1至6个碳原子的直链、支链或环状的烷基或烷氧基基团，其可为饱和或不饱和的。在环烷基和烷氧基的情况下，其是指具有3至6个碳原子的那些。合适的C1-6烷基和C1-6烷氧基尤其包括甲基和甲氧基、乙基和乙氧基、正丙基和正丙氧基、异丙基和异丙氧基、环丙基和环丙氧基、正丁基和正丁氧基、叔丁基和叔丁氧基、环丁基和环丁氧基、正戊基和正戊氧基、环戊基和环戊氧基、正己基和正己氧基、环己基和环己氧基，等等。胺-反应性基团Z包括可与游离氨基反应的所有类型的官能团。其中，特别优选-CO2H、-SO3H及其酯衍生物(包括活性酯)。
上述式中的-(CH2)n-和-(CH2)n’-结构元件也可包含一个或多个双键和/或三键且可取代有一个或多个卤素原子如氟或取代有氘。
在本发明的一个优选实施方案中，光学传感器元件可通过硅烷化获得，并且在式(i)至(iii)的接头中，X独立地选自C1-6烷氧基，优选选自甲氧基和乙氧基，Y为-NHCO-，Z为-CO2H或其酯衍生物，且n是1至5的整数，n'是1至3的整数，优选n是3且n'是2。
在另一个实施方案中，光学传感器元件可通过硫醇化获得，并且在式(iv)的接头中，W是H，Y是化学键，Z是-CO2H或其酯衍生物，n是1至8的整数，且n'为1至5的整数，优选n为8，n'为4。特别优选的是12-巯基十二烷酸NHS酯。
在光学传感器元件的另一个优选实施方案中，Aβ肽和Tau蛋白的受体是特异性抗体。在Aβ肽的情况下，抗体是特异性结合Aβ肽的中心表位的抗体，例如抗体A8978(SigmaAldrich)，并且在Tau蛋白的情况下，抗体是特异性结合存在于所有Tau变体(包括磷酸化和截短变体，具有3至4个重复区的变体、或同种型)中的表位的抗体，例如抗体Tau-5(AHB0042，Thermo Fisher Scientific)。
不与候选生物标记物蛋白交叉反应的阻断物质包括酪蛋白、乙醇胺、L-赖氨酸、聚乙二醇、白蛋白及其衍生物，并且优选为酪蛋白。
在制备传感器元件的方法中，通过用H2O2/草酸处理进行氧化。此外，在该方法中，用短硅烷接头进行的硅烷化优选用具有下式的硅烷衍生物进行：
X3Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y，
X2(R1)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y或
X(R1)(R2)Si-(CH2)n-(CH2)n'-Y，
其中变量如上所定义。特别优选使用Y的定义中的CO2H或SO3H部分的酯衍生物，其可以是简单的C1-6烷基酯，但也可以是活化酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或任何其他活化酯衍生物。在该方法中还优选受体是抗体。进一步优选的是，阻断物质是酪蛋白。
在制备传感器元件的方法中，通过用HF(49％)处理进行表面活化。此外，在该方法中，用短硫醇接头进行的硫醇化优选用具有下式的硫醇接头进行：
WS-(CH2)n-Y-(CH2)n’-Z,
其中变量如上所定义。特别优选使用Y的定义中的CO2H或SO3H部分的酯衍生物，其可以是简单的C1-6烷基酯，但也可以是活化酯，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯或任何其他活化酯衍生物。在该方法中还优选受体是抗体。进一步优选的是，阻断物质是酪蛋白。
在用于制备传感器元件的方法中，光学传感器元件在室温下构建。可以基于IR光谱评估每个单独步骤。该验证步骤对于分析物的特定检测和准确测定的二级结构是必不可少的。
本发明方面(4)的装置具有掺入在合适的IR池(室)中的传感器元件。它还可以包括光(IR)发射元件、光(IR)检测元件和数据处理单元。对于通过另外的光学方法的并行检测，该装置可以进一步包括用于这种其它光学方法的光源和检测器元件，如用于不同波长的UV/Vis-荧光的光源和检测器元件。
本发明方面(1)的方法包括以下步骤：
(a)在包含第一红外传感器元件的第一IR池中传导至少一通量的具有可溶性Aβ肽的体液，所述第一红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Aβ肽的受体，使IR光束通过所述第一IR池，并由此获得红外光谱；
(b)在包含第二红外传感器元件的第二IR池中传导至少一通量的具有可溶性Tau蛋白的体液，所述第二红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Tau蛋白的受体，使IR光束通过所述第二IR池，并由此获得红外光谱；和
(c)通过鉴别诊断分析获得的红外光谱以确定体液中可溶性Aβ肽和可溶性Tau蛋白的二级结构分布。
在本发明的方法中，步骤(a)和(b)中应用的体液可以是包含生物标记物的任何复合体液，包括血清、血浆和CSF。其他合适的体液是泪液和乳头吸出液。
在优选实施方案中，该方法还包括在步骤(a)和(b)之前：将所述光学传感器元件安装在IR池中。另外/可选地，该方法可以进一步包括步骤(a')和(b')：通过施加受体的游离配体溶液来再生光学元件的表面。
步骤(a)和(b)中获得的光谱具有足够的信噪比以分辨酰胺I带。这允许分析步骤(c)中生物标记物蛋白的酰胺I带最大值的位移，以确定候选生物标记物蛋白的二级结构并进行鉴别诊断。
在另一个实施方案中，该方法的步骤(c)还包括将获得的红外光谱与可溶性Aβ肽和/或可溶性Tau的光谱与已知的二级结构和/或已知浓度进行比较。
在另一个实施方案中，该方法可以包括，替代或并行于红外分析，通过另一种光学方法的检测，包括不同波长的UV/Vis-荧光。值得注意的是，优选将免疫-ATR-FTIR振动光谱与平行荧光光谱相结合的方法。
方面(1)的方法允许/适用于测定体液中的可溶性Aβ肽和可溶性Tau，特别是用于在哺乳动物(人，动物)来源的体液，包括脑脊液、血液或血清中直接测定它们而没有预处理(即，没有单独的先前富集或纯化步骤)。该方法适用于在单独的(体外)或在线(直接测定患者体液)方式下测定候选生物标记物蛋白质。在两种情况下，该方法可以进一步包括阿尔茨海默病阶段的鉴别诊断和评估。
方面(1)的方法特别适用于以淀粉样蛋白-β和Tau作为候选生物标记物蛋白测定阿尔茨海默病的进展，其中Aβ肽的酰胺I带最大值从1647cm-1移至1640cm-1，优选阈值为1643cm-1+/-5cm-1，(或1643cm-1+/-3cm-1，或1643cm-1+/-1cm-1，或约1643cm-1)，并且Tau蛋白的酰胺I带最大值从1647cm-1移至1640cm-1，优选阈值为1643cm-1+/-5cm-1，(或1643cm-1+/-3cm-1，或1643cm-1+/-1cm-1，或约1643cm-1)，这指示阿尔茨海默病。该方法还特别适用于以淀粉样蛋白-β和Tau作为候选生物标记物蛋白来确定阿尔茨海默病的进展。这里，鉴别诊断提供了痴呆类型的确定临床特征，优选地，该方法包括检测来自CSF的Aβ(A)、来自血浆的Aβ(B)和来自CSF的Tau(C)的二级结构分布。特别地，本发明的方法能够鉴别诊断痴呆阿尔茨海默类型(DAT)和(疾病对照)，DAT患者被细分类为早期、中度和重度DAT，并且DC患者被分成健康对照、其它疾病和由不是阿尔茨海默病的起源引起的痴呆。值得注意的是，对于两种生物标记物，Aβ的(A)/(B)和Tau的(C)，辨别阈值(1643cm-1±5cm-1)将阿尔茨海默病和DC患者分开；和/或(A)、(B)和(C)的组合提供适用于确保的DAT诊断的生物标记物组。
为两种生物标记物建立简单的阈值分类物，类似于Nabers等人，Anal.Chem.Doi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016)和WO 2015/121339中所述的。因此，使用用于疾病对照(DC)和痴呆阿尔茨海默病型(DAT)区分的辨别光谱标记带，可以基于CSF Aβ分析以90％的诊断准确度区分两个诊断组。仅从血浆Aβ分析中观察到的预测准确度较低(84％)。此外，仅基于Tau蛋白二级结构分布的两组区分仍然不足，准确度为68％。但是将确定的来自CSF和血浆的Aβ的酰胺I频率与Tau的酰胺I频率组合成标记组，简单的多数投票分类物显示出显著更高的预测值。现在，可以实现93％的准确度和95％的特异性。高度特异性对于AD等无法治愈的疾病尤为重要，因为假阳性诊断可对有关方面产生严重的心理影响。但组合的数据分析显示了第二大优势。通过结合Aβ和Tau的数据，可以提供关于疾病阶段和其他类型痴呆适应症的更多信息。鉴别诊断的原理很简单。在第一步中，如Nabers等，Anal.ChemDoi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016)和WO 2015/121339中所述测定从CSF中提取的Aβ的可溶性级分的酰胺I最大值。因此，最大值大于或等于1643cm-1指示DC，最大值低于该频率指示DAT。在第二步中，将相同的程序应用于血浆样品。同样，确定每个样品的Aβ的酰胺I最大值。现在，如果两个值始终高于或低于标记物频率，则可以高精度地区分DC和DAT。但对于不一致的Aβ结果(CSF和血浆)，Tau蛋白二级结构分布可用作决策支持。另一方面，Tau蛋白质二级结构分布还证明了将DC和DAT组亚分类为由非阿尔茨海默病的其它来源引起的痴呆或亚分类为疾病的早期、中度或严重阶段的潜能。因此，可在DC组内鉴定帕金森病或血管性痴呆患者(AβCSF≥1643cm-1；Aβ血浆≥1643cm-1；Tau CSF<1643cm-1)。另一方面，DAT组可区分为早期(f.e.AβCSF<1643cm-1；Aβ血浆<1643cm-1；Tau CSF≥1643cm-1)、中度(AβCSF<1643cm-1；Aβ血浆≥1643cm-1；Tau CSF<1643cm-1)或(AβCSF≥1643cm-1；Aβ血浆<1643cm-1；Tau CSF<1643cm-1)、和严重(AβCSF<1643cm-1；Aβ血浆<1643cm-1；Tau CSF<1643cm-1)的疾病阶段。
通过以下实施例进一步描述本发明，然而，这些实施例不应解释为限制本发明。
实施例
材料和方法：使用与WO 2015/121339中相同的实验装置。
采样和预处理：在Essen大学医院通过腰部穿刺抽取脑脊液且等分，在液氮中快速冷冻，运输并储存在-80℃。在测量之前未对样品进行预处理，仅在37℃下解冻30秒并保持在冰上直至使用。
患者集合：先前已详细描述了疾病对照(DC)和痴呆阿尔茨海默类型(DAT)患者的样本获取和诊断的细节(Nabers等人，Anal.Chem.Doi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016))。在之前的研究中，使用免疫红外传感器分析了141个患者样本。在该集合中，随机选择100名患者进行本研究。从CSF和血浆中提取的Aβ的红外酰胺I数据来自(Nabers等人，Anal.Chem.Doi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016))。
溶液和试剂：
磷酸盐缓冲盐水(PBS-缓冲液)：137mM氯化钠(NaCl)，2.7mM氯化钾(KCl)，12mM总磷酸盐(以Na2HPO4和NaH2PO4形式)，pH 7.4。
酪蛋白阻断溶液：200mM氢氧化钠(NaOH)，1％(w/v)源自牛乳的酪蛋白(粉末)，pH用H3PO4调节至7.4.
硅烷化-溶液：使用的NHS-硅烷(N-(4,4,4-三乙氧基硅烷丁基)琥珀酰胺酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯)是合成的且如所述表征(Schartner等人，JACS135(10):4079-4087(2013))。
抗体：为了从各体液中提取Aβ，使用抗体A8978(批号：061M4773，Sigma Aldrich)。在Tau蛋白检测的情况下，使用抗体Tau-5(AHB0042，Thermo Fisher Scientific)。
进行测量：一般程序与WO 2015/121339中描述的程序相同。在具有液氮冷却的汞-镉-碲化物(MCT)检测器的Vertex 70V光谱仪(Bruker Optics GmbH，Ettlingen，Germany)上进行IR测量。在前后向干涉仪运动中以80kHz数据速率记录双侧干涉图，光谱分辨率为2cm-1，Blackman-Harris-3-Term-apodisation，Mertz相位校正和4次零填充。将参考光谱记录为200个干涉图的1000个样品光谱的平均值。基于Lambert-Beer定律(E＝-log(I/I0))，在平衡状态下记录空白传感器、具有2-丙醇的传感器、硅烷化表面、缓冲液、抗体或酪蛋白涂覆的表面的参考单通道光谱，实现了高灵敏度差异光谱。状态变化的吸光度是变化前后强度关系的负十进位对数。
工作流程：先前公布了用于CSF中Tau蛋白的FTIR光谱分析的传感器制备的细节(WO 2015/121339；Nabers等人，Anal.Chem.Doi:10.1021/acs.analchem.5b04286(2016)；Nabers等人，Journal of Biophotonics 9(3):224–34doi:10.1002/jbio.201400145(2016))。简言之，包括所有连接管的流通池的总体积为400μl。对于每次分析，每个样品的一个传感器元件用硅烷(Schartner等人，JACS 135(10):4079–87 doi:10.1021/ja400253p(2013))和抗体现场(freshly)官能化。在分析之前，表面用酪蛋白封闭溶液饱和。对于CSF和血浆中的Aβ检测，使用单克隆抗体A8978(Sigma Aldrich，aa 13-28)。Tau捕获由单克隆Tau-5抗体(Life Technology，aa 210-230)提供。为了分析，将50μl CSF或150μl EDTA-血浆分别以1ml/min的流速加入循环缓冲液中。
光谱的预处理：通过成比例减去参考光谱，除去水蒸气。基线校正光谱。
实施例1：Aβ和Tau蛋白质二级结构分布，用于精确的DC和DAT区分。
进行的研究包括来自61个DC和39个DAT患者的300个样品。之前描述了关于患者鉴别诊断的细节(Nabers等人，Anal.Chem.Doi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016))。通常，患者集合被分成DC和DAT受试者。DAT组进一步细分为阿尔茨海默病的早期、中度和重度阶段。对于少数DC患者，可获得完全鉴别诊断，包括患有由于非阿尔茨海默病的起源的痴呆症的患者，如帕金森病或血管性痴呆。为分析CSF和/或血浆中Aβ和Tau的二级结构分布，通过Nabers等人描述的免疫红外传感器从各自的液体中提取两种生物标记物(Nabers等人，Anal.Chem.Doi：10.1021/acs.analchem.5b04286(2016))。因此，通过表面固定的单克隆抗体A8978(Aβ的aa13-28)和Tau-5(aa210-230)分别从CSF或血浆中捕获Aβ和Tau。二级结构分布由记录的Aβ和Tau的酰胺I最大频率指示。在之前的研究中，建立了一个简单的阈值分类物，其辨别标记频率为1643cm-1，用于区分DC和DAT。在当前研究中使用相同的标记带。首先，确定每个患者样品中来自CSF的Aβ的酰胺I最大值。因此，低于1643cm-1的最大值位置指示DAT。接下来，鉴定了来自血液EDTA-血浆的Aβ的酰胺I最大值。最后，我们检测了CSF中提取的Tau蛋白级分的最大值。对于两种生物标记物和两种体液，在<1643cm-1相同定义了辨别标记物带，其指示DAT。DC和DAT组的酰胺I最大分布显示源自CSF(Kruskal-Wallis ANOVA；p＝2.5*10-11；置信水平β＝0.05)和血浆(p＝3.4*10-9)的Aβ的高度显著差异和对于来自CSF的Tau的显著不同(p＝1.6*10-3)(图2)。因此，与Aβ相比，观察到DAT受试者的Tau酰胺I最大值的较小偏移。DC的平均酰胺I最大值为1644cm-1，而DAT组为1642cm-1，相比之下，源自DC的CSF的Aβ为1645cm-1且对于DAT受试者为1641cm-1。来自血浆的Aβ显示DC的平均最大值为1648cm-1，DAT组的平均最大值为1641cm-1。基于这些分布(其也在图3中的3D散射图中显示，其中透明黑框指示DAT)，通过给出准确度、灵敏度和特异性来计算每个生物标记物本身的诊断性能。另外，通过扫描1630.5cm-1至1660.5cm-1之间的阈值并确定每个波数的灵敏度和特异性来进行接收器操作特征-(ROC-)曲线分析。与Nabers等人的结果相似，基于Aβ的分析的诊断准确度最高，其中CSF为90％(图4A、D；特异性89％，灵敏度92％，AUC 0.90)，相比之下，血浆中Aβ二级结构分布的分析为85％(图4B、D；特异性为90％，灵敏度为77％，0.85)。相反，基于CSF中Tau蛋白二级结构分布的DC和DAT区分仅显示出68％的诊断准确度(图4C、D；特异性67％，灵敏度69％，AUC 0.67)，表明单独的Tau不是DAT检测的适合的生物标记物。但是通过将所有三个生物标记物值添加到多数投票分类物中，从而基于所呈现的生物标记物组(两个最大值低于阈值＝患病，两个最大值高于阈值＝非DAT)做出诊断决定，诊断性能可以增加到特异性为95％，灵敏度为90％，因此与临床诊断相比，总体准确度为93％。因此，仅识别出61个DC中的3个假阳性和31个DAT中的4个假阴性。
实施例2：DC和DAT鉴别诊断的组合测定。
组合数据分析还提供了对两个诊断组进行细分类的潜力。这在图5中示意性地示出。例如，来自CSF和血浆的Aβ表明酰胺I最大值大于或等于1643cm-1，但是Tau酰胺I最大值低于1643cm-1，在这种情况下是另一种类型的痴呆可被组合的免疫红外测定指示(图5)。相反，当来自CSF和血浆的Aβ酰胺I最大值低于标记带但Tau最大值高于此值时，将显示DAT的早期状态。该程序适用于我们研究中的两个诊断组。来自CSF的Aβ的酰胺I最大值证明，在所有DC情况的69％中，最大值比来自CSF的Tau更高。这种效果可通过与Aβ相比更高的Tau蛋白无序特性来解释。另一方面，在所有DC情况的25％中，Aβ的最大值较低，而仅在所有情况的6％中，最大值相同。对于DAT组，这个关系被完全改变。其中所有DAT患者中只有31％产生的Aβ的酰胺I最大值大于Tau，62％显示较低的Aβ最大值(图6)。这支持了这样的假设：Aβ积聚是阿尔茨海默病进展中的早期和起始事件，并伴有Tau蛋白聚集。

Claims (15)

1.用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类分为不同疾病阶段的方法，其通过直接分析体液中可溶性淀粉样-β(Aβ)肽级分和可溶性Tau蛋白级分的二级结构分布，包括以下步骤：
(a)在包含第一红外传感器元件的第一IR池中传导至少一通量的具有可溶性Aβ肽的体液，所述第一红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Aβ肽的受体，所述Aβ肽的至少一种受体为能够特异性和构象独立地结合Aβ肽的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用不与Aβ肽交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团，使IR光束通过所述第一IR池，并从其获得红外光谱；
(b)在包含第二红外传感器元件的第二IR池中传导至少一通量的具有可溶性Tau蛋白的体液，所述第二红外传感器元件具有内部反射元件，所述内部反射元件具有红外透明材料的芯和至少一种直接接枝到所述芯的至少一个表面的Tau蛋白的受体，所述Tau蛋白的至少一种受体为能够特异性和构象独立地结合Tau蛋白的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用不与Tau蛋白交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团；使IR光束通过所述第二IR池，并从其获得红外光谱；和
(c)分析获得的红外光谱以确定所述体液中可溶性Aβ肽和可溶性Tau蛋白的二级结构分布以用于鉴别诊断，其中Aβ肽和/或Tau蛋白的酰胺I带的向下位移指示疾病阶段。
2.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二IR池的红外透明材料独立地选自硅、锗、硒化锌、硒化镓和金刚石，并且优选为锗。
3.权利要求1所述的方法，其中所述第一和第二红外传感器元件包含锗内部反射元件，该锗内部反射元件具有梯形或平行四边形形状并且在红外线中是透明的，具有足够的信噪比以检测酰胺I带，且所述Aβ肽或所述Tau蛋白的至少一种受体分别是能够特异性和构象独立地结合Aβ肽或Tau蛋白的抗体，并且通过短硅烷接头的硅烷化或通过短硫醇接头的硫醇化直接接枝到所述内部锗反射元件的至少一个表面上，使所述至少一种受体的可自由接近的胺基与短硅烷/硫醇接头上的胺反应性基团反应，并用分别不与Aβ肽或Tau蛋白交叉反应的阻断物质阻断短硅烷/硫醇接头上的剩余胺反应性基团。
4.权利要求1或3所述的方法，其中所述内反射元件
(i)是锗单晶，优选为梯形切口锗单晶；和/或
(ii)允许或提供多于一路红外线通过反射元件；和/或
(iii)进一步适用于通过另一种光学方法进行的替代或平行分析，该另一种光学方法包括检测不同波长的荧光；和/或
(iv)不与所述Aβ肽或所述Tau蛋白交叉反应的阻断物质选自酪蛋白、乙醇胺、L-赖氨酸、聚乙二醇、白蛋白及其衍生物。
5.权利要求1、3或4所述的方法，其中所述硅烷和硫醇接头包括均质硅烷和硫醇接头、硅烷接头的混合物和硫醇接头的混合物，且具有不多于20个原子或不多于15个原子的有效接头链长，优选地，该硅烷接头具有下式之一：
(i)X3Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z，
(ii)X2R1Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z或
(iii)X(R1)2Si-(CH2)n-Y-(CH2)n'-Z，
且该硫醇接头具有下式：
(iv)WS-(CH2)n-Y-(CH2)n’-Z,
其中W为R1S-或H，X在每次出现独立地选自卤素和C1-6烷氧基，n为1至10的整数，n'为1至5的整数，R1在每次出现时独立地选自C1-6烷基，Y选自化学键、-O-、-CO-、-SO2-、-NR2-、-S-、-SS-、-NR2CO-、-CONR2-、-NR2SO2-和-SO2NR2-(其中R2为H或C1-6烷基)，且Z为胺-反应性基团，包括-CO2H、-SO3H及其酯衍生物。
6.权利要求5所述的方法，其中所述红外传感器元件可通过以下获得：
(i)硅烷化，且在式(i)至(iii)的接头中，X独立地选自C1-6烷氧基，优选甲氧基和乙氧基，Y是-NHCO-，Z是-CO2H或其酯衍生物，且n为1至5的整数，n'为1至3的整数，优选n为3且n'为2；或者
(ii)硫醇化，且在式(iv)的接头中，W是H，Y是化学键，Z是-CO2H或其酯衍生物，且n是1至8的整数，n'是1至5的整数，优选n为8且n'为4。
7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其中
(i)与Aβ肽结合的受体是抗体，优选是与Aβ肽的中心表位特异性结合的抗体，包括抗体A8978；或
(ii)与Tau蛋白结合的受体是抗体，优选是特异性结合Tau的中间表位和结合存在于所有Tau变体中的表位的抗体，包括抗体Tau-5。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述方法提供阿尔茨海默病的区分，将其区分为早期/前驱、中度和重度疾病阶段，并且其中
(i)所提及的生物标记物的酰胺I最大值均低于辨别阈值(1643cm-1±5cm-1)指示重度疾病阶段，其中所述生物标记物为来自CSF的Aβ、来自血浆的Aβ和来自CSF的Tau；
(ii)两种生物标记物的酰胺I最大值低于辨别阈值(1643cm-1±5cm-1)指示中度疾病阶段，其中所述生物标记物的一种是来自CSF或血浆的Aβ，另一种是来自CSF的Tau，
(iii)一种或两种生物标记物(来自CSF和/或血浆的Aβ)的酰胺I最大值低于辨别阈值(1643cm-1±5cm-1)指示早期疾病阶段，所述生物标记物不是来自CSF的Tau。
9.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述鉴别诊断提供痴呆类型的确定的临床特征，优选地，该方法包括检测来自CSF的Aβ(A)、来自血浆的Aβ(B)和来自CSF的Tau(C)的二级结构分布，最优选地，该方法能够鉴别诊断痴呆阿尔茨海默类型(DAT)和(疾病对照)，DAT患者被细分类为早期、中度和重度的DAT，并且DC患者被分成健康对照、其它疾病和由不是阿尔茨海默病的起源引起的痴呆。
10.如权利要求9所述的方法，其中，
(i)对于两种生物标记物，Aβ的(A)和(B)以及Tau的(C)，辨别阈值(1643cm-1±5cm-1)将阿尔茨海默病和DC患者分开；和/或
(ii)(A)、(B)和(C)的组合提供适用于确定DAT诊断的生物标记物组。
11.权利要求1至10任一项所述的方法，其基于对体液的分析提供关于患者疾病状态的信息，其中所述生物标记蛋白的酰胺I带最大值的位移是指示疾病进展的分类物。
12.如权利要求11所述的方法，其中具有1638-1648cm-1值的阈值分类物是指示疾病进展的分类物。
13.一种用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类成不同疾病阶段的试剂盒，其包含如权利要求1至7任一项所述的第一和第二红外传感器元件。
14.一种用于将阿尔茨海默病鉴别诊断和亚分类成不同疾病阶段的装置，所述装置包括如权利要求1至7任一项所定义的第一和第二红外传感器元件。
15.如权利要求1至7任一项所述的第一和第二红外传感器元件、权利要求13的试剂盒或权利要求14的装置用于直接分析体液中的可溶性淀粉样-β(Aβ)肽级分和可溶性Tau蛋白级分的二级结构分布的用途。
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015121339A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM Biosensor for conformation and secondary structure analysis
EP3324186B1 (en) 2016-11-21 2020-09-16 Ruhr-Universität Bochum Method for the preselection of drugs for protein misfolding diseases
WO2023064437A1 (en) * 2021-10-15 2023-04-20 The Trustees Of Indiana University Methods for detecting fracture-related infection (fri)
CN115586336A (zh) * 2022-09-14 2023-01-10 杭州赛基生物科技有限公司 试剂盒及其制备方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2700933A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-26 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) Raman, infrared, or Raman-Infrared analysis of peripheral blood plasma protein structure and its relation to cognitive development in Alzheimer's disease
WO2015121339A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM Biosensor for conformation and secondary structure analysis

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2267897C (en) * 1996-10-09 2005-12-06 Symyx Technologies Infrared spectroscopy and imaging of libraries
JP2002040023A (ja) * 2000-07-28 2002-02-06 Mitsubishi Chemicals Corp アルツハイマー病の検出方法
US20030162230A1 (en) * 2000-09-27 2003-08-28 Reagan Kevin J. Method for quantifying phosphokinase activity on proteins

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2700933A1 (en) * 2012-08-20 2014-02-26 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (CSIC) Raman, infrared, or Raman-Infrared analysis of peripheral blood plasma protein structure and its relation to cognitive development in Alzheimer's disease
WO2015121339A1 (en) * 2014-02-14 2015-08-20 RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM Biosensor for conformation and secondary structure analysis

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREAS NABERS 等: "Amyloid-β-Secondary Structure Distribution in Cerebrospinal Fluid and Blood Measured by an Immuno-Infrared-Sensor: A Biomarker Candidate for Alzheimer’s Disease", 《ANALYTICAL CHEMISTRY》 *

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