ES2906639T3 - Moléculas de unión a CD38 y PD-L1 - Google Patents
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Abstract
Una molécula biespecífica que comprende al menos un dominio anti-CD38 y al menos un dominio anti-PD-L1, que son capaces de unirse simultáneamente a los antígenos CD38 y PD-L1, respectivamente, dicha molécula biespecífica es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras, en donde cada cadena pesada comprende a. una región Fc que comprende dominios Bisagra-CH2-CH3, b. cuya región Fc se une a la cadena pesada Fab (CH1-VH) del anticuerpo 1 (Ab1), c. que se une a su vez a la cadena pesada Fab (CH1-VH) del anticuerpo 2 (Ab2), mediante una secuencia enlazadora polipeptídica derivada de bisagra, en donde dicha secuencia enlazadora polipeptídica enlaza el extremo N-terminal de dicho dominio VH de cadena pesada Fab de Ab1 con el C-terminal de dicho dominio CH1 de Ab2, y las cuatro cadenas ligeras comprenden cadenas ligeras Fab (CL-VL) de Ab1 y cadenas ligeras Fab (CL-VL) de Ab2 asociadas con sus dominios de cadena pesada afines; Ab1 y Ab2 son diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD38 y anticuerpos anti-PD- L1.
Description
DESCRIPCIÓN
Moléculas de unión a CD38 y PD-L1
La invención se refiere a anticuerpos de unión a CD38/PD-L1, dirigidos a CD38 y PD-L1, métodos para la producción de estas moléculas, composiciones y usos de las mismas.
Antecedentes de la invención
El mieloma múltiple (MM) es la tercera neoplasia maligna hematológica más común con 114.000 casos en todo el mundo por año. A pesar de los avances en el tratamiento, el MM sigue siendo una de las pocas neoplasias malignas hematológicas con una necesidad médica no cubierta. Una vez que los pacientes progresan a través de la terapia de primera línea y presentan una enfermedad recidivante o refractaria (r/r), las opciones de tratamiento son muy limitadas. Sin embargo, en los últimos años se han desarrollado antígenos diana tumorales (TAA, de sus siglas en inglés) anti-MM. Se aprobó un anticuerpo anti-CD38, daratumumab, para el tratamiento de pacientes con MM recidivante y actualmente se están desarrollando otros anticuerpos anti-CD38 (isatuximab y MOR-202, que se describe en la Patente de EE.UU. US 8.263.746). Sin embargo, existe la necesidad de mejorar las respuestas que actualmente se encuentran en el intervalo de 30-35%. Se demostró que la actividad de los anticuerpos anti-CD38 se puede potenciar mediante terapias inmunomoduladoras (por ejemplo, lenalidomida), que estimulan el sistema inmunitario de los pacientes. Además, se demostró que uno de los mecanismos de resistencia de las células tumorales de MM a las terapias con anticuerpos se asocia con el aumento de la señalización de las rutas de los inhibidores de puntos de control (por ejemplo, PD-1/PD-L1). Por lo tanto, existe una oportunidad de mejorar la citotoxicidad de los anticuerpos anti-CD38 frente a las células tumorales de MM y, al mismo tiempo, activar el sistema inmunitario al inhibir las rutas de los inhibidores de puntos de control (por ejemplo, PD-1/PD-L1).
En condiciones fisiológicas, PD-L1 juega un papel importante como protección frente a la autoinmunidad al regular a la baja el sistema inmunitario. Se expresa en células inmunitarias "similares a APC" (células T, células NK, macrófagos, DCs mieloides, células B, células epiteliales, células endoteliales vasculares) y células tumorales. PD-L1 se une a sus receptores afines PD-1 y B7-1, y regula negativamente las células inmunitarias (células T, células NK, etc), al inhibir su proliferación y activación.
En condiciones patológicas, PD-L1 se expresa altamente por células tumorales (>90% de pacientes con MM) y se asocia con mal pronóstico. Los anticuerpos bloqueadores dirigidos a rutas de puntos de control inmunitarios (anti-PD-1, anti-CTLA-4, anti-PD-L1, etc) han demostrado una actividad notable en diferentes tipos de cáncer (pulmón, melanoma, etc). Se han observado signos de eficacia en MM, sin embargo, la actividad de esta clase de terapias prometedoras aún no es óptima en MM. Una de las razones podría ser que las moléculas, que poseen un perfil beneficioso de actividad/efectos secundarios (por ejemplo, anti-PD-L1) requieren un bloqueo/saturación casi estequiométrico de sus dianas para producir el máximo efecto inmunoestimulador en las células T.
Por lo tanto, el direccionamiento específico de los anticuerpos anti-PD-L1 al lugar tumoral (por ejemplo, direccionamiento a las células cancerosas CD38+) puede ayudar a administrar las terapias anti-PD-L1 al lugar donde se requiere estimulación inmunitaria, y puede dar como resultado una estimulación máxima de las células inmunitarias que permita el bloqueo completo de PD-L1 en células tumorales y del microambiente. Dicha activación de células inmunitarias dirigida a lugares tumorales también puede reducir la activación sistémica de las células inmunitarias, prevenir efectos secundarios adversos, y permitir una mayor dosificación de anticuerpos terapéuticos. Genmab anunció públicamente estudios de daratumumab en combinación con atezolizumab en un tumor sólido y en mieloma múltiple (anuncio del 21 de marzo de 2016).
En un póster fechado el 5 de diciembre de 2015 en la 57a reunión y exposición anual, Orlando, FL, por la Sociedad Americana de Hematología, Moore et al informaron sobre la eficacia de un anticuerpo biespecífico anti-CD38 x anti-CD3 en el tratamiento del mieloma múltiple.
Compendio de la invención
Para aprovechar la capacidad citotóxica de las células T, las células BK y otras células inmunitarias para el tratamiento del mieloma múltiple (MM) y otros cánceres, preferentemente cánceres CD38+, se diseñaron moléculas biespecíficas con dos sitios de unión (específicas para CD38 y PD-L1, respectivamente). Las moléculas biespecíficas de la invención eliminan la inhibición del sistema inmunitario asociada con la interacción de PD-1 sobre células T y células NK y PD-L1, expresado sobre células tumorales y del microambiente tumoral. Tales moléculas son útiles para tratar cánceres, especialmente el mieloma múltiple o cualquier cáncer CD38+, que sobreexpresa PD-L1, y crece en los microambientes de las células inmunitarias que expresan PD-L1 (células dendríticas plasmocitoides, células supresoras derivadas de mieloides) que inhiben aún más las células T y células NK. Las moléculas de la invención facilitan la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, de sus siglas en inglés), la fagocitosis y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, de sus siglas en inglés) de las células tumorales CD38+/PD-L1+, así como las células PD-L1+ de las células del microambiente tumoral.
La invención se establece en el conjunto de reivindicaciones adjunto.
Según la invención, los anticuerpos biespecíficos CD38/PD-L1, que comprenden dominios anti-CD38 y anti-PD-LI, se modifican genéticamente. Estos anticuerpos CD38/PD-L1 biespecíficos son capaces de unirse simultáneamente a ambos antígenos.
En una realización preferida, los anticuerpos CD38/PD-L1 biespecíficos se expresan en células CHO y se purifican mediante cromatografía de afinidad empleando resinas de Proteína A. Las propiedades de unión a anticuerpos se caracterizan en ensayos in vitro. Se unen simultáneamente tanto a CD38 como a PD-L1 en el ensayo ELISA.
Los cuatro anticuerpos Fab tetravalentes biespecíficos, que tienen la estructura de la Figura 1A o 1B se denominan BiXAb®, una marca comercial de Biomunex Therapeutics.
El anticuerpo de la invención es biespecífico y bivalente para CD38 y PD-L1. Los anticuerpos biespecíficos de unión a antígeno de la invención son anticuerpos biespecíficos de longitud completa que consisten en una "cadena pesada compuesta" continua (formada por la cadena pesada natural de IgG de mAb1 seguida de enlazadores y la cadena pesada Fab de mAb2), que se construye de una Fc (Bisagra-CH2-CH3) seguida de la cadena pesada Fab del anticuerpo 1 (CH1-VH) y la cadena pesada Fab sucesiva (CH1-VH) del anticuerpo 2, esta última se une mediante una secuencia enlazadora polipeptídica derivada de bisagra, y la cadena pesada compuesta resultante durante la expresión de la proteína, se asocia con la segunda cadena pesada compuesta idéntica, mientras que las cadenas ligeras (LC) Fab coexpresadas del anticuerpo 2 y del anticuerpo 1 se asocian con sus dominios de cadena pesada afines para formar la molécula en tándem final F(ab')2-Fc; siendo el anticuerpo 1 (Ab1) y el anticuerpo 2 (Ab2) diferentes y seleccionados del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD38 (daratumumab, isatuximab, MOR-202 o cualquier otro anticuerpo anti-CD38) y anticuerpos anti-PD-L1 (atezolizumab, durvalumab, avelumab, MDX-1105 o cualquier otro anticuerpo anti-PD-L1).
Los anticuerpos BiXAb® se pueden unir de forma bivalente tanto a CD38 como a PD-L1.
Otro objetivo de la invención es un método para preparar los anticuerpos biespecíficos de la invención, dicho método comprende las siguientes etapas: a) cultivar en medio y condiciones de cultivo adecuados una célula huésped que expresa una cadena pesada de anticuerpo como se define anteriormente, y cadenas ligeras de anticuerpo como se define anteriormente; y b) recuperar dichos anticuerpos producidos del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.
La invención hace uso de vectores recombinantes, en particular vectores de expresión, que comprenden polinucleótidos que codifican las cadenas pesada y ligera definidas en la presente memoria, asociados con elementos de control de la transcripción y la traducción que son activos en la célula huésped elegida. Los vectores que se pueden emplear para construir vectores de expresión de acuerdo con la invención son conocidos en sí mismos, y se elegirán en particular en función de la célula huésped que se pretenda utilizar. Preferiblemente, dicha célula huésped se transforma con un polinucleótido que codifica una cadena pesada y dos polinucleótidos que codifican dos cadenas ligeras diferentes. Dichos polinucleótidos se pueden insertar en un mismo vector de expresión, o en vectores de expresión separados. El método para producir los anticuerpos de la invención comprende cultivar dicha célula huésped y recuperar dichos fragmentos de unión a antígeno o anticuerpo de dicho cultivo.
Leyendas de las figuras
Las Figuras 1A y 1B son representaciones esquemáticas de un anticuerpo biespecífico de la invención, que comprende dos cadenas pesadas, y cuatro cadenas ligeras.
La Figura 2 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de anticuerpos biespecíficos BiXAbs 4218, 4219 y 5104 en condiciones reductoras.
La Figura 3 muestra una electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de BiXAbs 4218, 4219 y 5104 en condiciones no reductoras.
La Figura 4 muestra el ensayo de unión ELISA para BiXAbs 4218 y 4219.
La Figura 5 muestra la electroforesis en gel de poliacrilamida SDS de BiXAb-6567 en condiciones reductoras y no reductoras. Carril 1: la migración de BiXAb-6567 en condiciones reductoras; carril 2: marcadores de peso molecular con el peso de cada banda indicado; carril 3: la migración de BiXAb-6567 en condiciones no reductoras.
La Figura 6 muestra el análisis de cromatografía de exclusión por tamaño de BiXAb-6567.
La Figura 7 muestra los perfiles de fusión de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1) y BiXAb-6567 como se determinó mediante calorimetría de barrido digital.
La Figura 8A muestra los perfiles de unión de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1) y BiXAb-6567 en un ELISA de unión directa al antígeno CD38. La Figura 8B muestra los perfiles de unión de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1) y BiXAb-6567 en un ELISA de unión directa al antígeno PD-L1. La Figura 8C muestra el perfil de unión de BiXAb-6567 en un ELISA de unión a antígeno dual (PD-L1 y CD38).
Las Figuras 9A a 9C muestran perfiles de clasificación de células activadas por fluorescencia de los dos mAbs parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1) y BiXAb-6567 en tres líneas celulares diferentes, Figura 9A: mieloma múltiple RPMI-8226, Figura 9B: células CHO transfectadas de manera estable con CD38 de longitud completa, y Figura 9C: línea celular SKOV-3 de cáncer de ovario.
La Figura 10 muestra los perfiles de unión de la titulación en la línea celular CHO-CD38 de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1), BiXAb-6567, y el anticuerpo anti-CD20 de control negativo.
La Figura 11 muestra los perfiles de actividad citotóxica de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1), BiXAb-6567, y dos anticuerpos de control negativo, anti-CD20 y anti-HER2, en un ensayo ADCC que emplea una línea celular de mieloma múltiple, RPMI-8226, como células diana y células mononucleares no preactivadas y no fraccionadas como células efectoras.
La Figura 12 muestra los perfiles de actividad citotóxica de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1), BiXAb-6567, y dos anticuerpos de control negativo, anti-CD20 y anti-HER2, en un ensayo ADCC con la línea celular CHO-CD38 como células diana y células mononucleares no preactivadas y no fraccionadas como células efectoras. La Figura 13 muestra los perfiles de actividad citotóxica de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1), BiXAb-6567, y dos anticuerpos de control negativo, anti-CD20 y anti-HER2, en un ensayo ADCC con la línea celular SKOV-3 como células diana y células NK preactivadas y enriquecidas con IL-12 como células efectoras.
La Figura 14 muestra los perfiles de actividad citotóxica de los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 y anti-PD-L1), BiXAb-6567, y dos anticuerpos de control negativo, anti-CD20 y anti-HER2, en un ensayo ADCC con la línea celular SKOV-3 como células diana y células NK preactivadas y enriquecidas con IL-15 como células efectoras.
Descripción detallada
Definiciones:
La estructura básica de una molécula de anticuerpo natural es una estructura cuaternaria tetramérica en forma de Y que consiste en dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas, unidas por interacciones no covalentes y por enlaces disulfuro entre cadenas.
En las especies de mamíferos, hay cinco tipos de cadenas pesadas: u, 5, £, y , y M, que determinan la clase (isotipo) de inmunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, respectivamente. El dominio variable N-terminal (VH) de la cadena pesada va seguido de una región constante, que contiene tres dominios (numerados CH1, CH2, y CH3 desde el extremo N hasta el extremo C) en las cadenas pesadas y , a, y 5, mientras que la región constante de las cadenas pesadas m y £ se compone de cuatro dominios (numerados CH1, CH2, CH3 y CH4 desde el extremo N-terminal hasta el extremo C-terminal). Los dominios CH1 y CH2 de IgA, IgG, e IgD están separados por una bisagra flexible, que varía en longitud entre las diferentes clases y en el caso de IgA e IgG, entre los diferentes subtipos: IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4 tienen bisagras de 15, 12, 62 (o 77), y 12 aminoácidos, respectivamente, e IgA1 e IgA2 tienen bisagras de 20 y 7 aminoácidos, respectivamente.
Hay dos tipos de cadenas ligeras: A y k , que se pueden asociar con cualquiera de los isotipos de cadenas pesadas, pero ambas son del mismo tipo en una molécula de anticuerpo dada. Ambas cadenas ligeras parecen ser funcionalmente idénticas. Su dominio variable N-terminal (VL) es seguido por una región constante que consiste en un solo dominio denominado CL.
Las cadenas pesada y ligera se emparejan mediante interacciones proteína/proteína entre los dominios CH1 y CL, y mediante interacciones VH/VL y las dos cadenas pesadas se asocian mediante interacciones proteína/proteína entre sus dominios CH3. La estructura de la molécula de inmunoglobulina se estabiliza generalmente mediante enlaces disulfuro intercatenarios entre los dominios CH1 y CL y entre las bisagras.
Las regiones de unión a antígeno corresponden a los brazos de la estructura en forma de Y, que consisten en la cadena ligera completa emparejada con los dominios VH y CH1 de la cadena pesada, y se denominan Fragmentos Fab (para el Fragmento de unión al antígeno). Los fragmentos Fab se generaron primero a partir de moléculas de inmunoglobulina nativa mediante digestión con papaína, que escinde la molécula de anticuerpo en la región bisagra, en el lado amino-terminal de los enlaces disulfuro entre cadenas, liberando así dos brazos de unión a antígeno idénticos. Otras proteasas, tal como la pepsina, también escinden la molécula de anticuerpo en la región bisagra, pero en el lado carboxilo terminal de los enlaces disulfuro entre cadenas, liberando fragmentos que consisten en dos fragmentos Fab idénticos y que permanecen unidos a través de enlaces disulfuro; la reducción de enlaces disulfuro en los fragmentos F(ab')2 genera fragmentos Fab'.
La parte de la región de unión al antígeno correspondiente a los dominios VH y VL se denomina fragmento Fv (para el Fragmento variable); contiene las CDRs (regiones determinantes de la complementariedad), que forman el lugar de unión al antígeno (también denominado parátopo).
La región efectora del anticuerpo que es responsable de su unión a las moléculas o células efectoras, corresponde al tallo de la estructura en forma de Y, y contiene los dominios CH2 y CH3 emparejados de la cadena pesada (o los dominios CH2, CH3 y CH4, dependiendo de la clase de anticuerpo), y se denomina la región Fc (para el Fragmento cristalizable).
Debido a la identidad de las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras, las moléculas de anticuerpos naturales tienen dos sitios de unión a antígeno idénticos y, por lo tanto, se unen simultáneamente a dos epítopos idénticos. Un anticuerpo "se une específicamente" a un antígeno diana si se une con mayor afinidad, avidez, más fácilmente, y/o con mayor duración que a otras sustancias. La "unión específica" o la "unión preferencial" no requiere necesariamente (aunque puede incluir) unión exclusiva. En general, pero no necesariamente, la referencia a la unión significa unión preferencial.
Los términos "sujeto", "individuo", y "paciente" se emplean indistintamente en la presente memoria y se refieren a un mamífero que se está evaluando para el tratamiento y/o que se está tratando. Los sujetos pueden ser seres humanos, pero también pueden incluir otros mamíferos, particularmente aquellos mamíferos útiles como modelos de laboratorio para enfermedades humanas, por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, etc.
El término "tratamiento" o "tratar" se refiere a una acción, aplicación o terapia, en donde un sujeto, incluido un ser humano, se somete a asistencia médica con el propósito de mejorar la afección del sujeto, directa o indirectamente. Particularmente, el término se refiere a reducir la incidencia, o aliviar los síntomas, eliminar la recurrencia, prevenir la recurrencia, prevenir la incidencia, mejorar los síntomas, mejorar el pronóstico, o una combinación de los mismos en algunas realizaciones. El experto en la materia entendería que el tratamiento no da como resultado necesariamente la ausencia total o la eliminación de los síntomas. Por ejemplo, con respecto al cáncer, "tratamiento" o "tratar" se puede referir a la desaceleración del crecimiento, la proliferación, o la metástasis de células neoplásicas o malignas, la prevención o el retraso del desarrollo del crecimiento, la proliferación, o la metástasis de células neoplásicas o malignas, o alguna combinación de los mismos.
Diseño de los anticuerpos biespecíficos preferidos:
La invención proporciona anticuerpos tetravalentes biespecíficos, que comprenden dos sitios de unión a cada una de sus dianas, y un dominio Fc funcional que permite la activación de funciones efectoras, tal como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), la fagocitosis, y la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Los anticuerpos de la invención son anticuerpos de longitud completa. Comprenden preferiblemente cadenas pesadas y cadenas ligeras de inmunoglobulinas humanas, preferiblemente IgG, aún más preferiblemente IgG1. Las cadenas ligeras son preferiblemente cadenas ligeras Kappa.
En una realización preferida, el enlazador de la invención conecta dos pares de dominios Fab IgG en un formato de anticuerpo biespecífico tetra-Fab, cuya secuencia de aminoácidos comprende las secuencias de cadena pesada de al menos dos Fab unidos por un enlazador, seguido por el secuencia bisagra nativa, seguida de la secuencia Fc de IgG, coexpresada con las secuencias de cadena ligera de IgG apropiadas.
Un ejemplo de los anticuerpos de la invención, que tienen una estructura similar a IgG, se ilustra en las Figuras 1A y 1B.
Los anticuerpos biespecíficos de la invención comprenden
- una cadena pesada continua construida de un Fc (Bisagra-CH2-CH3)
- seguido por la cadena pesada Fab del anticuerpo 1 (CH1-VH) y la cadena pesada Fab sucesiva (CH1-VH) del anticuerpo 2, esta última unida por una secuencia enlazadora polipeptídica derivada de bisagra, - y durante la expresión de la proteína, la cadena pesada resultante se ensambla en dímeros, mientras que las cadenas ligeras del anticuerpo 1 y el anticuerpo 2 coexpresadas (VL-CL) se asocian con sus cadenas pesadas afines para formar la molécula final en tándem F(ab)'2-Fc, siendo diferentes el anticuerpo 1 (Ab1) y el anticuerpo 2 (Ab2).
Ab1 y Ab2, al ser diferentes, se seleccionan independientemente del grupo que consiste en un anticuerpo anti-CD38 (tal como daratumumab) y un anticuerpo anti-PD-L1 (tal como atezolizumab).
Daratumumab se une a un epítopo CD38 único en la región C-terminal del CD38 humano, los aminoácidos 233 a 246 y 267 a 280, siendo los aminoácidos en las posiciones 272 y 274 particularmente importantes para la unión. Ventajosamente, Ab1 y/o Ab2 pueden ser anticuerpos que se unen al mismo epítopo, o epítopo superpuesto (por ejemplo, con un solapamiento de al menos 4 aminoácidos) con respecto a daratumumab.
En otra realización, Ab1 y/o Ab2 pueden ser anticuerpos que se unen al mismo epítopo, o al epítopo superpuesto con respecto a atezolizumab.
En una realización particular, la molécula biespecífica es un anticuerpo biespecífico que comprende, preferiblemente consiste en, a) dos cadenas pesadas, que comprende cada una, preferiblemente que consiste en, SEQ ID NO:1 y b) cuatro cadenas ligeras, dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:2, las otras dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:3. Dicho anticuerpo biespecífico se denomina BiXAb-4218.
En otra realización particular, la molécula biespecífica es un anticuerpo biespecífico que comprende, preferiblemente que consiste en, a) dos cadenas pesadas, que comprenden cada una, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:4 y b) cuatro cadenas ligeras, dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:5, las otras dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:6. Dicho anticuerpo biespecífico se denomina BiXAb-4219.
En otra realización particular, la molécula biespecífica es un anticuerpo biespecífico que comprende, preferentemente que consiste en, a) dos cadenas pesadas, que comprende cada una, preferiblemente que consiste en, SEQ ID NO:7 y b) cuatro cadenas ligeras, dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:8, las otras dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:9. Dicho anticuerpo biespecífico se denomina BiXAb-5104.
En una realización preferida, la molécula biespecífica es un anticuerpo biespecífico que comprende, preferiblemente consiste en, a) dos cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende, preferiblemente consiste en, SEQ ID NO:10 y b) cuatro cadenas ligeras, dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:11, las otras dos que comprenden, preferiblemente que consisten en, SEQ ID NO:12. Dicho anticuerpo biespecífico se denomina BiXAb-6567.
La cadena pesada (SEQ ID NO:10) comprende
- VH de daratumumab (SEQ ID NO:22)
- Dominio CH1 (IgG1 humana de alotipo G1m(3) con mutaciones L124Q y S188V) de Fab daratumumab (SEQ ID NO:23)
- Enlazador AP (SEQ ID NO:15)
- VH de atezolizumab (SEQ ID NO:24)
- Dominio CH1 (IgG1 humana de alotipo G1 m(3) con la mutación T192D) de Fab atezolizumab (SEQ ID NO:25) - Bisagra de IgG1 humana (SEQ ID NO:26)
- Dominio CH2 de IgG1 humana (SEQ ID NO:27)
- Dominio CH3 de IgG1 humana de alotipo G1 m(3) (SEQ ID NO:28)
La cadena ligera SEQ ID NO:11 comprende
- VL de daratumumab (SEQ ID NO:29)
- Dominio CKappa de daratumumab con mutaciones V133T y S176V (SEQ ID NO:30)
La cadena ligera SEQ ID NO:12 comprende
- VL de atezolizumab (SEQ ID NO:31)
- Dominio CKappa de atezolizumab con mutaciones S114A y N137K (SEQ ID NO:32)
Diseño de los enlazadores
El enlazador polipeptídico, también denominado "secuencia enlazadora polipeptídica derivada de bisagra" o "enlazador pseudo bisagra", comprende la totalidad o parte de la secuencia de la región bisagra de una o más inmunoglobulina(s) seleccionada(s) entre IgA, IgG, e IgD, preferiblemente de origen humano. Dicho enlazador polipeptídico puede comprender toda o parte de la secuencia de la región bisagra de una sola inmunoglobulina. En este caso, dicha inmunoglobulina puede pertenecer al mismo isotipo y subclase que la inmunoglobulina de la que deriva el dominio CH1 adyacente, o a un isotipo o subclase diferente. Alternativamente, dicho enlazador polipeptídico puede comprender la totalidad o parte de las secuencias de las regiones bisagra de al menos dos inmunoglobulinas de diferentes isotipos o subclases. En este caso, la porción N-terminal del enlazador polipeptídico, que sigue directamente al dominio CH1, consiste preferiblemente de toda o parte de la región bisagra de una
inmunoglobulina que pertenece al mismo isotipo y subclase que la inmunoglobulina de la que se deriva dicho dominio CH1.
Opcionalmente, dicho enlazador polipeptídico puede comprender además una secuencia de 2 a 15, preferiblemente de 5 a 10 aminoácidos N-terminales del dominio CH2 de una inmunoglobulina.
La secuencia del enlazador polipeptídico normalmente consiste en menos de 80 aminoácidos, preferiblemente menos de 60 aminoácidos, aún más preferiblemente menos de 40 aminoácidos.
En algunos casos, se pueden emplear secuencias de regiones bisagra nativas; en otros casos, se pueden llevar mutaciones puntuales a estas secuencias, en particular, el reemplazo de uno o más restos de cisteína en las secuencias bisagra de IgG1, IgG2 o IgG3 nativas por alanina o serina, para evitar enlaces disulfuro intracadena o entre cadenas no deseados.
En una realización particular, la secuencia enlazadora polipeptídica comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos EPKX1CDKX2HX3X4PPX5PAPELLGGPX6X7PPXsPX9PX10GG (SEQ ID NO:13), en donde X1, X>, X3, X4, X5, X6 , X7, X8 , X9, X10, idénticos o diferentes, son cualquier aminoácido. En particular, la secuencia del enlazador polipeptídico puede comprender o consistir en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPGGPPGPGPGPGGG (SEQ ID NO:14);
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPAPAPAGG (SEQ ID NO:15);
EPKSCDKTHTSPPAPAPELLGGPAAPPGPAPGGG (SEQ ID NO:16);
EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:17) y
EPKSCDKTHTSPPSPAPELLGGPSTPPTPSPSGG (SEQ ID NO:18).
Un ejemplo no limitativo de un enlazador polipéptido derivado de bisagra que se puede emplear en un fragmento de unión a antígenos multiespecífico de la invención es un polipéptido que tiene SEQ ID NO:17. Dicho polipéptido consiste en la secuencia de longitud completa de la bisagra de IgG1 humana, seguida de los 9 aminoácidos N-terminales de la CH2 de IgG1 humana (APELLGGPS, SEQ ID NO:19), de una parte de la secuencia de la bisagra de IgA1 humana (TPPTPSPS, SEQ ID NO:20), y por el dipéptido GG, añadido para proporcionar flexibilidad suplementaria al enlazador. En otra realización preferida, la secuencia del enlazador polipeptídico derivado de bisagra es SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:18.
En una realización particular, X1, X2 y X3, idénticos o diferentes, son Treonina (T) o Serina (S).
En otra realización particular, X1, X2 y X3, idénticos o diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) e Ile (I), aún más preferiblemente X1, X2 y X3, idénticos o diferentes, puede ser Ala (A) o Gly (G).
Alternativamente, X1, X2 y X3, idénticos o diferentes, pueden ser Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), preferiblemente Leu (L), Glu (E), o Gln (Q).
En una realización particular, X4 y X5, idénticos o diferentes, son cualquier aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Serina (S), Cisteína (C), Alanina (A), y Glicina (G).
En una realización preferida, X4 es Serina (S) o Cisteína (C).
En un aspecto preferido, X5 es Alanina (A) o Cisteína (C).
En una realización particular, X6, X7, Xs, X9, X10, idénticos o diferentes, son cualquier aminoácido distinto de Treonina (T) o Serina (S). Preferiblemente X6, X7, Xs, X9, X10, idénticos o diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en Ala (A), Gly (G), Val (V), Asn (N), Asp (D) e Ile (I).
Alternativamente, X6, X7, Xs, X9, X10, idénticos o diferentes, pueden ser Leu (L), Glu (E), Gln (Q), Met (M), Lys (K), Arg (R), Phe (F), Tyr (T), His (H), Trp (W), preferiblemente Leu (L), Glu (E), o Gln (Q). En una realización preferida, X6, X7, Xs, X9, X10, idénticos o diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en Ala (A) y Gly (G).
En una realización más preferida, X6 y X7 son idénticos y se seleccionan preferiblemente del grupo que consiste en Ala (A) y Gly (G).
En una realización preferida, la secuencia del enlazador polipeptídico comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO:13, en donde
X1, X2 y X3, idénticos o diferentes, son Treonina (T), Serina (S);
X4 es Serina (S) o Cisteína (C);
X5 es Alanina (A) o Cisteína (C);
X6, X7, X8, X9, X10, idénticos o diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en Ala (A) y Gly (G).
En otra realización preferida, la secuencia del enlazador polipeptídico comprende o consiste en la secuencia SEQ ID NO: 13, en donde
X1, X2 y X3, idénticos o diferentes, son Ala (A) o Gly (G);
X4 es Serina (S) o Cisteína (C);
X5 es Alanina (A) o Cisteína (C);
X6, X7, X8, X9, X10, idénticos o diferentes, se seleccionan del grupo que consiste en Ala (A) y Gly (G).
Producción de los anticuerpos biespecíficos:
El experto se puede referir a la solicitud de patente internacional WO2013/005194, para técnicas generales de expresión de anticuerpos multiespecíficos.
En la presente memoria se describe también un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica una cadena proteica del anticuerpo de la invención. Dicho polinucleótido también puede comprender secuencias adicionales: en particular, puede comprender de manera ventajosa una secuencia que codifica una secuencia líder o un péptido señal que permite la secreción de dicha cadena proteica. Se describen también células huésped transformadas con dicho polinucleótido.
Normalmente, las secuencias de aminoácidos de diferentes anticuerpos monoclonales anti-CD38 y anti-PDL-1 se emplean para diseñar las secuencias de ADN, opcionalmente después de la optimización de codones para la expresión en mamíferos. Para la cadena pesada, se sintetizan ADNs que codifican los péptidos señal, la región variable y el dominio CH1 constante de Fab1 seguidos del enlazador bisagra y la región variable y el dominio CH1 constante de Fab2 con secuencias flanqueantes para la digestión con enzimas de restricción. Para la cadena ligera, se sintetizan ADNs que codifican los péptidos señal y las regiones Kappa variables y constantes.
Los ácidos nucleicos que codifican cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de la invención se insertan en vectores de expresión. Las cadenas ligera y pesada se pueden clonar en los mismos o diferentes vectores de expresión. Los segmentos de ADN que codifican cadenas de inmunoglobulina se unen operativamente a secuencias de control en el/los vector(es) de expresión que garantizan la expresión de polipéptidos de inmunoglobulina. Dichas secuencias de control incluyen una secuencia señal, un promotor, un potenciador, y una secuencia de terminación de la transcripción. Los vectores de expresión normalmente son replicables en los organismos huéspedes bien como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Normalmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, por ejemplo, tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.
En un ejemplo, las secuencias que codifican tanto la cadena pesada como la ligera (por ejemplo, las secuencias que codifican un VH y un VL, un VH-CH1 y un VL-CL, o una cadena pesada de longitud completa y una cadena ligera de longitud completa) se incluyen en un vector de expresión. En otro ejemplo, cada una de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo se clona en un vector individual. En el último caso, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se pueden cotransfectar en una célula huésped para la expresión de ambas cadenas, que se pueden ensamblar para formar anticuerpos intactos in vivo o in vitro. Alternativamente, el vector de expresión que codifica la cadena pesada y el o los que codifican las cadenas ligeras se pueden introducir en diferentes células huésped para la expresión de cada una de las cadenas pesada y ligera, que se pueden purificar y ensamblar después para formar anticuerpos intactos in vitro.
En una realización particular, una célula huésped se cotransfecta con tres vectores de expresión independientes, tales como plásmidos, que conduce a la coproducción de las tres cadenas (en concreto, la cadena pesada HC, y dos cadenas ligeras LC1 y LC2, respectivamente) y a la secreción del anticuerpo biespecífico.
Más especialmente, los tres vectores se pueden emplear de manera ventajosa en la siguiente proporción molecular de 2:1:1 (HC: LC1: LC2).
Los vectores recombinantes para la expresión de los anticuerpos descritos en la presente memoria normalmente contienen un ácido nucleico que codifica las secuencias de aminoácidos del anticuerpo unidas operativamente a un promotor, bien constitutivo o inducible. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en procariotas, eucariotas, o ambos. Los vectores típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo. Los vectores contienen opcionalmente casetes de expresión genérica que contienen al menos una secuencia terminadora independiente, secuencias que permiten la replicación del casete tanto en eucariotas como en procariotas, es decir, vectores lanzadera, y marcadores de selección para sistemas procariotas y eucariotas.
Los anticuerpos biespecíficos como se describe en la presente memoria se pueden producir en sistemas de expresión procarióticos o eucarióticos, tales como bacterias, levaduras, hongos filamentosos, plantas, insectos (por ejemplo, utilizando un vector de baculovirus), y células de mamíferos. No es necesario que los anticuerpos recombinantes de la invención estén glicosilados o expresados en células eucariotas; sin embargo, generalmente se prefiere la expresión en células de mamífero. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea de riñón embrionario humano (células 293), células de riñón de hámster bebé (células BHK), células de ovario de hámster chino/- o DHFR (células CHO, CHO-S, CHO-DG44, Flp-in-CHO), células renales de mono verde africano (células VERO), y células hepáticas humanas (células Hep G2).
Se prefiere el cultivo de células de tejido de mamífero para expresar y producir los polipéptidos porque se han desarrollado en la técnica varias líneas de células huésped adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas, e incluyen las líneas de células CHO, varias líneas de células Cos, células HeLa, preferiblemente líneas celulares de mieloma (tal como NS0), o células B transformadas o hibridomas.
En una realización más preferida, los anticuerpos biespecíficos de la invención se producen mediante el empleo de una línea celular CHO, más ventajosamente líneas celulares CHO-S o CHO-DG-44 o sus derivados.
Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tal como un origen de replicación, un promotor, y un potenciador, y sitios de información de procesamiento necesarios, tal como sitios de unión a ribosomas, sitios de empalme de ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias de terminación transcripcional. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, o citomegalovirus.
Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (por ejemplo, las secuencias que codifican la cadena pesada y ligera y las secuencias de control de la expresión) se pueden transferir a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían según el tipo de huésped celular. Por ejemplo, se puede emplear el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación para otros huéspedes celulares. (Véase en general Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press, 2a ed., 1989). Cuando las cadenas pesada y ligera se clonan en vectores de expresión separados, los vectores se cotransfectan para obtener la expresión y el ensamblaje de inmunoglobulinas intactas.
Las células huésped se transforman o transfectan con los vectores (por ejemplo, mediante transfección química o métodos de electroporación) y se cultivan en medios nutritivos convencionales (o se modifican según corresponda) para inducir promotores, seleccionar transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. La expresión de los anticuerpos puede ser transitoria o estable.
Preferiblemente, los anticuerpos biespecíficos se producen mediante métodos de expresión estable, en los que las líneas celulares transfectadas de forma estable con el ADN que codifica todas las cadenas polipeptídicas de un anticuerpo biespecífico, tal como BiXAb-6567, son capaces de una expresión sostenida, lo que permite la fabricación de productos terapéuticos. Por ejemplo, la expresión estable en una línea celular CHO es particularmente ventajosa. Una vez expresados, los anticuerpos completos, sus dímeros, cadenas ligeras y pesadas individuales, u otras formas de inmunoglobulina de la presente invención se pueden aislar o purificar adicionalmente para obtener preparaciones sustancialmente homogéneas para ensayos y aplicaciones adicionales. Se pueden emplear métodos estándar de purificación de proteínas conocidos en la técnica. Por ejemplo, los procedimientos de purificación adecuados pueden incluir fraccionamiento en columnas de inmunoafinidad o de intercambio iónico, precipitación con etanol, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), precipitación con sulfato de amonio, y filtración en gel (véase en general Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Se prefieren inmunoglobulinas sustancialmente puras de al menos aproximadamente 90 a 95% de homogeneidad, y lo más preferido de 98 a 99% o más de homogeneidad, para usos farmacéuticos.
La producción in vitro permite aumentar la escala para proporcionar grandes cantidades de los anticuerpos biespecíficos deseados de la invención. Dichos métodos pueden emplear cultivos en suspensión homogéneos, por ejemplo, en un reactor airlift o en un reactor de agitación continua, o un cultivo celular inmovilizado o atrapado, por ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, en microesferas de agarosa o cartuchos cerámicos.
Derivados mutados y mutaciones:
Las secuencias polipeptídicas que se unen a CD38 pueden derivar de cualquier anticuerpo anti-CD38, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en daratumumab, isatuximab, MOR-202 o sus derivados mutados.
Las secuencias polipeptídicas que se unen a PD-L1 pueden derivar de cualquier anticuerpo anti-PD-L1, por ejemplo, seleccionado del grupo que consiste en atezolizumab, durvalumab, avelumab, MDX-1105 o sus derivados mutados. El término "derivado mutado", "mutante", o "variante funcional" designa una secuencia que difiere de la secuencia parental a la que se refiere, mediante deleción, sustitución o inserción de uno o varios aminoácidos. Preferiblemente,
el derivado mutado muestra preferiblemente al menos 80%, preferiblemente al menos 85%, aún más preferiblemente al menos 90% de homología de secuencia con la secuencia nativa. En una realización particular, las mutaciones no afectan sustancialmente a la función del anticuerpo.
Los derivados mutados, o variantes funcionales, pueden comprender una cadena VH que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 85% (por ejemplo, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia enumeradas en la presente memoria, una cadena VL que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos 85% (por ejemplo, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%) idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia enumeradas en la presente memoria, o ambas. Estas variantes son capaces de unirse a CD38 y PD-L1. En algunos ejemplos, las variantes poseen una afinidad de unión al antígeno similar en relación con los anticuerpos de referencia descritos anteriormente (por ejemplo., que tienen una KD inferior a 1 x 10-7 M, 10-8 M, preferiblemente menos de 1 x 10-9 o 1 x 10-10 M).
La afinidad de la unión se define mediante los términos ka (constante de velocidad de disociación), kd (constante de velocidad de disociación), o KD (disociación en equilibrio).Normalmente, la unión específica cuando se emplea con respecto a un anticuerpo se refiere a un anticuerpo que se une específicamente a ("reconoce") su diana(s) con un valor de afinidad (KD) inferior a 10-7 M, preferiblemente menos de 10-8 M, por ejemplo, menos de 10-9 M o 10-10 M. Un valor de KD más bajo representa una afinidad de unión más alta (es decir, una unión más fuerte), por lo que un valor de KD de 10-9 indica una mayor afinidad de unión que un valor KD de 10-8.
El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos se determina empleando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de proteína de interés. Cuando existen espacios entre dos secuencias, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. Cuando se emplean los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo., XBLAST y NBLAST).
En otras realizaciones, las variantes funcionales descritas en la presente memoria pueden contener una o más mutaciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) que preferiblemente no ocurren en los restos que se prevé que interaccionen con una o más de las CDRs.
En la presente memoria se describen derivados mutados, o variantes funcionales, que son sustancialmente idénticos al anticuerpo de referencia.
El término "sustancialmente idéntico" o "insustancial" significa que las secuencias de aminoácidos relevantes (por ejemplo, en las regiones marco (FRs), CDRs, VH, o dominio VL) de una variante difieren insustancialmente (por ejemplo, que incluyen sustituciones de aminoácidos conservadoras) en comparación con un anticuerpo de referencia, tal que la variante tiene actividades de unión sustancialmente similares (por ejemplo, afinidad, especificidad, o ambas) y bioactividades en relación con el anticuerpo de referencia. Tal variante puede incluir cambios menores de aminoácidos, por ejemplo, 1 o 2 sustituciones en una secuencia de 5 aminoácidos de una región específica. En general, se pueden realizar más sustituciones en las regiones FR, en contraste con las regiones CDR, siempre que no afecten negativamente a la función de unión del anticuerpo (tal como reducir la afinidad de unión en más del 50% en comparación con el anticuerpo original). En alguna realización, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o superior, entre el anticuerpo original y el modificado. En algunas realizaciones, el anticuerpo modificado tiene la misma especificidad de unión y tiene al menos el 50% de la afinidad del anticuerpo original.
Las sustituciones conservadoras producirán moléculas que tienen características funcionales y químicas similares a las de la molécula a partir de la cual se realizan dichas modificaciones. Por ejemplo, una "sustitución conservadora de aminoácidos" puede implicar una sustitución de un resto de aminoácido nativo con otro resto de manera que haya poco o ningún efecto sobre la polaridad o carga del resto de aminoácido en esa posición. Las sustituciones de aminoácidos deseados (ya sean conservadoras o no conservadoras) se pueden ser determinar por los expertos en la técnica. Por ejemplo, se pueden emplear sustituciones de aminoácidos para identificar restos importantes de la secuencia de la molécula, o para aumentar o disminuir la afinidad de las moléculas descritas en la presente memoria. Las variantes que comprenden una o más sustituciones conservadoras de aminoácidos se pueden preparar según métodos para alterar la secuencia polipeptídica conocidos por los expertos en la técnica, tal como se encuentran en las referencias que recopilan tales métodos, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989, o Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley e Hijos, Inc., Nueva York. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D.
La presente divulgación también proporciona variantes de anticuerpos con propiedades biológicas mejoradas del anticuerpo, tal como una afinidad de unión más alta o más baja, o con propiedades de ADCC alteradas en células que expresan CD38 y/o PD-L1.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo, o mediante la síntesis de péptidos. Dichas modificaciones incluyen, por ejemplo, deleciones, y/o inserciones y/o sustituciones de restos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Se realiza cualquier combinación de eliminación, inserción, y sustitución para conseguir la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas. Las moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se pueden preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio), mutagénesis por PCR, y mutagénesis en casete de una variante preparada anteriormente o una versión no variante (natural) del anticuerpo. En una realización, el valor de la constante de disociación en equilibrio (KD) de los anticuerpos de la invención es inferior a 10-7 M, particularmente inferior de 10-8 M, 10-9 M o 10-10 M. La afinidad de unión se puede determinar empleando técnicas conocidas en la técnica, tal como ELISA o análisis de interacción bioespecífica (por ejemplo, empleando resonancia de plasmones superficiales), u otras técnicas conocidas en la técnica.
Cualquiera de las moléculas descritas en la presente memoria se puede examinar para determinar sus propiedades, tal como la actividad de unión a antígeno, la especificidad de unión a antígeno, y las funciones biológicas, siguiendo métodos de rutina.
Cualquiera de las moléculas descritas en la presente memoria se puede modificar para que contenga fracciones no proteicas adicionales que se conocen en la técnica y están fácilmente disponibles, por ejemplo, mediante pegilación, hiperglucosilación. Las modificaciones que pueden mejorar la vida media en suero son de interés.
A lo largo de la presente descripción, las secuencias de aminoácidos se definen según Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed. Servicio de Salud Pública, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Md. (1991).
Las mutaciones se pueden localizar en dominios constantes. De hecho, los anticuerpos biespecíficos comprenden de manera ventajosa fragmentos Fab que tienen mutaciones en la interfaz de los dominios CH1 y CL, dichas mutaciones facilitan el emparejamiento afín de cadena pesada/cadena ligera y evitan su emparejamiento incorrecto. En una realización preferida, en la presente memoria se describen anticuerpos biespecíficos, que comprenden • dos fragmentos Fab con diferentes dominios CH1 mutados y CL mutados, que consisten en
a) Fragmento Fab que tiene dominios CH1 mutados y C-Kappa mutados derivados de una IgG1/Kappa humana, y los dominios VH y VL de Ab1,
b) Fragmento Fab que tiene dominios CH1 mutados y C-Kappa mutados derivados de una IgG1/Kappa humana y los dominios VH y VL de Ab2,
c) un dominio constante de cadena ligera mutado que se deriva del dominio constante kappa humano, los fragmentos Fab están dispuestos en tándem en el siguiente orden
- el extremo C-terminal del dominio CH1 mutado del fragmento Fab Ab1 está unido al extremo N-terminal del dominio VH del fragmento Ab2 Fab a través de un enlazador polipeptídico,
- la región bisagra de una IgG1 humana que une el extremo C-terminal del dominio CH1 mutado del fragmento Ab2 con el extremo N-terminal del dominio CH2,
- los dominios CH2 y CH3 dimerizados de una IgG 1 humana.
En ejemplos particulares, se describen anticuerpos biespecíficos, en donde el dominio Fab CH1 de uno de Ab1 o Ab2 es un dominio mutado que deriva del dominio CH1 de una inmunoglobulina mediante la sustitución del resto de treonina en la posición 192 de dicho dominio CH1 por un ácido aspártico y el dominio CL afín es un dominio mutado que deriva del dominio CL de una inmunoglobulina mediante la sustitución del resto de asparagina en la posición 137 de dicho dominio CL por un resto de lisina y la sustitución del resto de serina en la posición 114 de dicho dominio CL por un resto alanina, y/o en donde el dominio Fab CH1 de uno u otro Ab1 o Ab2 es un dominio mutado que deriva del dominio CH1 de una inmunoglobulina por sustitución del resto leucina en la posición 124 de dicho dominio CH1 por una glutamina y sustitución del resto de serina en la posición 188 de dicho dominio CH1 por un resto de valina, y el dominio CL afín es un dominio mutado que deriva del dominio CL de un inmunoglobulina por sustitución del resto de valina en la posición 133 de dicho dominio CL por un resto de treonina y sustitución del resto de serina en la posición 176 de dicho dominio CL por un resto de valina.
Los anticuerpos de la invención pueden estar glicosilados o no, o pueden mostrar una variedad de perfiles de glicosilación. En una realización preferida, los anticuerpos no están glicosilados en la región variable de las cadenas pesadas, pero están glicosilados en la región Fc.
Determinados derivados mutados pueden usar formas humanizadas del anticuerpo de referencia. En un enfoque de humanización, las regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) y otros aminoácidos determinados de las regiones variables del ratón donante se injertan en las regiones aceptoras variables humanas y después se unen a las regiones constantes humanas. Véase, por ejemplo, Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Patente U.S. N.25.225.539.
Usos terapéuticos:
El anticuerpo biespecífico de la invención es útil como medicamento, en particular para tratar el cáncer.
El término "cáncer", como se emplea en la presente memoria, incluye cualquier cáncer, especialmente una neoplasia maligna hematológica, y cualquier otro cáncer caracterizado por la expresión o sobreexpresión de CD38 o PD-L1, y especialmente aquellos cánceres caracterizados por la expresión conjunta de CD38 y PD-L1.
Ejemplos de cánceres son el linfoma o la leucemia, tal como el linfoma no Hodgkin (LNH), la leucemia linfocítica aguda (LLA), la leucemia mieloide aguda (LMA), la leucemia linfocítica crónica (LLC), la leucemia mielógena crónica (LMC), o el mieloma múltiple (MM), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón, leiomioma.
La molécula biespecífica como se define en la presente memoria se puede formular en una composición, por ejemplo, una composición farmacéutica, que contiene una molécula biespecífica como se define en la presente memoria, formulada junto con un vehículo farmacéutico.
Como se emplea en el presente memoria, un "vehículo farmacéutico" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, o agentes isotónicos y retardantes de la absorción, que son compatibles fisiológicamente. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo, mediante inyección o infusión).
La composición se puede administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica. La vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados.
Para administrar el anticuerpo biespecífico de la invención mediante determinadas vías de administración, puede ser necesario recubrir el anticuerpo biespecífico de la invención, o administrar conjuntamente el anticuerpo biespecífico de la invención, con un material para evitar su inactivación. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico de la invención se puede administrar a un sujeto en un vehículo apropiado, por ejemplo, liposomas, o un diluyente. Los diluyentes aceptables farmacéuticamente incluyen disoluciones tampón salinas y acuosas. Los vehículos farmacéuticos incluyen disoluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de disoluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticamente es conocido en la técnica.
Estas composiciones también pueden contener adyuvantes, tales como conservantes, agentes humectantes, emulsionantes y dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos se puede garantizar mediante procedimientos de esterilización y mediante la inclusión de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, o ácido sórbico. También puede ser deseable incluir en las composiciones agentes isotónicos, tales como cloruro de sodio. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable se puede realizar mediante la inclusión de agentes que retrasan la absorción.
Los niveles de dosificación reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas descritas en la presente memoria pueden variar para obtener una cantidad del ingrediente activo, que sea eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición, y modo de administración en particular, sin ser tóxico para el paciente.
El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares empleadas de la presente invención, la vía de administración, el momento de la administración, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales empleados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la afección, la salud general y el historial médico previo del paciente que se está tratando, y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico de la invención se puede administrar a una dosis de 0,2-20 mg/kg de 3 veces por semana a 1 vez por mes.
La presente invención, descrita por tanto en general anteriormente, se entenderá más fácilmente con referencia a los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustración y no pretenden limitar la presente invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1. Preparación de anticuerpos biespecíficos BiXAb-4218, BiXAb-4219 y BiXAb-5104
Síntesis de genes
Las secuencias de aminoácidos de diferentes anticuerpos monoclonales anti-CD38 y anti-PDL-1 se emplearon para diseñar las secuencias de ADN después de la optimización de codones para la expresión en mamíferos utilizando el programa GeneScript. Para la cadena pesada, los ADNs que codifican los péptidos señal, la región variable y el dominio CH1 constante de Fab1 siguieron al enlazador bisagra y la región variable y el dominio CH1 constante de Fab2 con secuencias flanqueantes para la digestión con enzimas de restricción se sintetizaron mediante GeneScript. Para la cadena ligera, los ADNs que codifican los péptidos señal y las regiones Kappa variables y constantes se sintetizaron mediante GeneScript.
Se llevaron a cabo reacciones de PCR utilizando PfuTurbo Hot Start para amplificar los insertos que se digirieron después con Notl Apal y Notl HindIII para las cadenas pesada y ligera, respectivamente. Los fragmentos de cadena pesada digeridos doblemente se ligaron con el vector de expresión patentado de Evitria digerido con Notl Apal en el cual ya estaban insertados los dominios CH1 bisagra CH2 CH3 de IgG1 humana. Los fragmentos de cadena ligera doblemente digeridos se ligaron con el vector patentado de Evitria tratado con NotI HindIII. Los ADNs plasmídicos se verificaron mediante secuenciación de ADN bicatenario.
Expresión, Purificación y Caracterización
Para una expresión a escala de 50 mL, se mezcló un total de 50 pg de ADN plasmídico en el vector patentado de Evitria (25 pg de cadena pesada 12,5 pg de cada cadena ligera, LC1 y LC2) en un tubo Eppendorf de 1,5 mL, se añadió 1 mL de medio CHO SFM que contiene 25 pL de 3 mg/mL de PEI pH 7,0, se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla de DNA-PEI se cargó en 49 mL de células CHO-S FreeStyle™ a 1-2 x 106 células/mL en un matraz de agitación de 125 mL. Las células se agitaron durante 6 días más. El sobrenadante se recogió mediante centrifugación de las células a 3.000 rpm durante 15 minutos. El sobrenadante recogido se purificó con resina de Proteína A. La electroforesis se realizó en condiciones reductoras y no reductoras empleando geles Gel Biorad Stain-Free 4 - 15% y el tampón de ejecución correspondiente. Las muestras se prepararon combinando los anticuerpos BiXAb® purificados con tampón de muestra SDS 2x y calentando durante 5 minutos a 95°C. La preparación de las muestras reducidas incluyó la adición del agente reductor NuPAGE antes del calentamiento. El peso molecular aparente se determinó utilizando patrones sin teñir de proteína Ladder Precision Plus (Biorad). La Figura 2 presenta el patrón SDS-PAGE de anticuerpos CD38/PD-L1 en condiciones reductoras. Se observan dos bandas correspondientes a la cadena pesada compuesta y dos cadenas ligeras que migran conjuntamente y tienen el peso molecular esperado. La Figura 3 presenta el patrón SDS-PAGE de anticuerpos CD38/PD-L1 en condiciones no reductoras.
La banda dominante a 250 kDa corresponde a la molécula BiXAb® CD38/PD-L1 completa como se esperaba.
Para el ensayo ELISA de placa de unión de antígeno dual, se emplearon los siguientes reactivos: CD38 humano recombinante, marcaje de Fc (Creative BioMart); PD-L1 humano biotinilado, Avi Tag (AcroBiosystems); Estreptavidina-HRP, (Biotechne RD-Systems). La proteína de fusión CD38-Fc humana se recubrió con 100 pL/pocillo a 2 pg/mL en PBS 1x pH 7,4 en placas Maxisorp a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron 5 veces con PBS 1 x que contiene Tween-20 al 0,05% (PBST 1x), después se bloquearon con leche descremada al 3%/PBST 1 x a 200 pL/pocillo con agitación a temperatura ambiente durante 1 hora. A una disolución madre de 1 mg/ml se añadieron 100 pL/pocillo de BiXAb® 4218 y BiXAb® 4219 comenzando con una dilución 1/500 en PBS 1x a una serie de diluciones 1:3. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación, seguido de 5 lavados con PBST 1x. Se añadieron 100 pL/pocillo de 1 pg/mL de biotina-proteína PD-L1 humana en PBS 1x y las placas se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 5 lavados con PBST 1x, se añadieron 100 pL/pocillo de 0,1 pg/mL de HRP conjugada con estreptavidina en PBS 1x. Las placas se agitaron a temperatura ambiente durante 1 hora, seguido de 5 lavados con PBST 1x. Se añadieron 100 pL/pocillo de sustrato TMB en PBS 1 x para el desarrollo del color. Los datos se recogieron a 405 nm durante 0,1 s por pocillo en un lector de placas multifunción Victor II. La Figura 4 demuestra los perfiles de unión a antígeno dual de dos CD38/PD-L1 BiXAbs®. Este perfil confirma que ambos tipos de dominios de unión de estas moléculas (dominios anti-CD38 y dominios anti-PD-L1) se unen a sus dianas de antígeno afines.
Ejemplo 2. Preparación del anticuerpo biespecífico de la invención BiXAb-6567
Síntesis de genes
Las secuencias de aminoácidos de anti-CD38 (daratumumab) y anti-PDL1 (atezolizumab) se emplearon para diseñar las secuencias de ADN, después de la optimización de codones para la expresión en mamíferos, utilizando el programa GeneScript. Estos anticuerpos se denominan como mAbs anti-CD38 "parental" y anti-PD-L1 "parental". La construcción de ADN de la cadena pesada se diseñó como sigue: péptido señal (SEQ ID NO:21), seguido de la secuencia SEQ ID NO:10 [que consiste en la región variable, seguida del dominio CH1 constante de Fab1 (antiCD38), en la que se introdujeron las mutaciones Leu para Gln y Ser para Val en las posiciones de Kabat 124 y 188, respectivamente, seguido del enlazador, seguido de la región variable, seguido del dominio CH1 constante de Fab2 (anti-PD-L1), en la que se introdujo la mutación Thr para Asp en la posición 192 de Kabat]; se introdujeron secuencias flanqueantes para la digestión con enzimas de restricción en ambos extremos de la construcción de ADN de cadena pesada. La construcción de ADN para la cadena ligera se diseñó como sigue: péptido señal (SEQ ID NO:21), seguido de la región variable, seguido de la región Kappa constante. Para la cadena ligera anti-CD38, se introdujeron mutaciones en las posiciones de Kabat 143 (Leu para Gln) y 188 (Ser para Val) en el dominio Kappa constante. Para la cadena ligera anti-PDL1, se introdujeron mutaciones en las posiciones Kabat 133 (Val para Thr) y 176 (Ser para Val) en el dominio Kappa constante. Todas las construcciones de ADN se sintetizaron mediante Gene Art.
Se llevaron a cabo reacciones de PCR, empleando PfuTurbo Hot Start, para amplificar los insertos, que se digirieron después con Notl y Apal, y Notl y HindIII para las cadenas pesada y ligera, respectivamente. Los fragmentos de cadena pesada digeridos doblemente se ligaron con el vector de expresión pcDNA3.1 tratado con NotI y Apal (Invitrogen) en el que ya se habían insertado la bisagra de IgG 1 humana seguida de los dominios CH2-CH3. Los fragmentos de cadena ligera doblemente digeridos se ligaron con el vector de expresión pcDNA3.1 tratado con NotI y HindIII (Invitrogen). Los ADNs plasmídicos se verificaron mediante secuenciación de ADN bicatenario.
Expresión y Purificación
El anticuerpo biespecífico BiXAb-6567 se produjo empleando la expresión genética transitoria al cotransfectar 3 genes codificados en vectores separados en una relación molecular 2:1:1 = HC:LC1 :LC2 (1 cadena pesada continua (HC) y 2 cadenas ligeras (LC)) en células CHO-S adaptadas a medio en suspensión sin suero (medio CHO SFM-II, Life Technologies™). Normalmente, para la expresión a escala de 50 mL, se mezclaron un total de 50 pg de ADN plasmídico (25 pg de cadena pesada, 12,5 pg de cadena ligera anti-CD38 y 12,5 pg de cadena ligera anti-PD-L1) en un tubo Eppendorf de 1,5 mL, después se añadió 1 mL de medio CHO SFM que contiene 25 pL de reactivo de transfección PEI de 3 mg/mL pH 7,0 (Polyplus), y la reacción se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La mezcla de ADN-PEI se añadió posteriormente a 49 mL de células CHO-S Invitrogen FreeStyle de Life Technologies™ a 1~2x 106/mL en un matraz de agitación de 125 mL. Las células se agitaron durante 6 días. El sobrenadante se recogió por centrifugación a 3.000 rpm durante 15.minutos. Se determinó el título de expresión de BiXAb-6567 en el sobrenadante utilizando biosensores de proteína A de ForteBio (Octet® Systems). BiXAb-6567 se purificó después en resina de afinidad de proteína A (MabSelect SuRe, GE Healthcare Life Sciences). El anticuerpo se eluyó de la proteína A empleando glicina 0,1 M, pH 3,5, y el eluato se neutralizó con TRIS 1 M. El anticuerpo purificado, en PBS de Dulbecco (Lonza), se filtró de forma estéril (filtros estériles de 0,2 pM, Techno Plastic Products AG), y la concentración final se determinó leyendo la densidad óptica (DO) a 280 nm (Eppendorf BioSpectrometer®).
BiXAab-6567 normalmente muestra un buen título de expresión (> 180 mg/litro) en la expresión transitoria de CHO. Este nivel de expresión es comparable al nivel de expresión observado con los anticuerpos monoclonales convencionales.
Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS
Para evaluar la calidad del BiXAb-6567 purificado, realizamos SDS-PAGE (sistema de electroforesis automatizado Experion™, BioRad). En presencia de dodecilsulfato de sodio (SDS) en el tampón de ejecución, la velocidad a la que un anticuerpo migra en el gel depende principalmente de su tamaño, lo que permite la determinación del peso molecular. Este ensayo se realizó en condiciones no reductoras y en condiciones reductoras; estas últimas permitieron la ruptura de los enlaces disulfuro y, por lo tanto, la visualización de cadenas polipeptídicas individuales (las cadenas ligeras y la cadena pesada). Los datos SDS-PAGE se presentan en la Figura 5. En condiciones no reductoras, se mantiene la estructura cuaternaria del anticuerpo, y el peso molecular observado debe representar la suma de los pesos moleculares de las diferentes cadenas pesadas y ligeras. El anticuerpo biespecífico de la invención (BiXAb-6567) consiste en seis cadenas: dos cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras. El peso molecular teórico de BiXab-6567 es de 244,40 kDa, sin tener en cuenta las modificaciones postraduccionales (PTM, de sus siglas en inglés), por ejemplo, N-glicosilación en la Fc en asparagina 297. El gel se calibró empleando una mezcla de patrones de peso molecular conocido. Los datos no reductores muestran una banda de ejecución principal cercana al peso molecular estándar de 250 kDa, que está según el peso molecular calculado y la glicosilación esperada de dos asparaginas en la posición 297 en el dominio Fc. En condiciones reductoras, el ditiotreitol (DTT) desnaturaliza aún más el BiXAb-6567 al reducir los enlaces disulfuro y romper la estructura cuaternaria y, por lo tanto, las seis cadenas polipeptídicas deberían migrar por separado en el gel según su peso molecular. Las dos cadenas pesadas idénticas de BiXAb-6567 migraron conjuntamente como una sola banda, y los dos pares de cadenas ligeras, debido a su peso molecular casi idéntico, migraron conjuntamente como la segunda banda. Por lo tanto, los datos muestran dos bandas principales, de aproximadamente 75 kDa y 25 kDa, en base a la movilidad de los patrones de peso molecular. Cada cadena pesada poseía un sitio de N-glicosilación en la asparagina 297, lo que explica la amplitud de la banda de mayor peso molecular y el peso molecular observado ligeramente superior al calculado (75,44 kDa); este ensanchamiento es típico de las proteínas glicosiladas. Los pesos moleculares calculados de las cadenas ligeras de anti-CD38 (23,40 kDa) y anti-PD-L1 (23,36 kDa) son muy similares y, por lo tanto, dieron como resultado su migración conjunta.
En conclusión, la SDS-PAGE de BiXAb-6567 muestra los perfiles esperados, tanto en condiciones no reductoras como reductoras, y estuvo de acuerdo con los pesos moleculares teóricos calculados, al tener en cuenta la existencia de un sitio de N-glicosilación en la cadena pesada.
Análisis de cromatografía de exclusión por tamaño
La agregación de proteínas se observa con frecuencia en moléculas de proteínas modificadas genéticamente. Realizamos una cromatografía analítica de exclusión por tamaño (SEC) para evaluar el contenido de especies de alto peso molecular de la preparación de BiXAb-6567 purificada por afinidad en una sola etapa (véase Expresión y purificación de variantes). Empleamos una columna SEC-s3000 (300x 7,8 mm) (BioSep) y un sistema Aktapurifier 10 (GE Healthcare); el ensayo se realizó a una velocidad de flujo de 1 mL/min empleando tampón PBS pH 7,4.
El cromatograma SEC presentado en la Figura 6 demuestra que el pico principal corresponde al tamaño esperado del BiXAb-6567 monomérico; este pico representa el 98,2% del total de la muestra. Además, se observó un pequeño pico correspondiente a especies de mayor peso molecular (posiblemente dímeros); este pico representa el 1,8% del total de la muestra. Por lo tanto, concluimos que el contenido porcentual de especies de mayor peso molecular es menor, y es similar a los anticuerpos monoclonales convencionales producidos en sistemas de expresión de CHO. La forma estrecha y simétrica del pico monomérico sugiere que BiXAb-6567 estaba correctamente ensamblado y representado por una sola especie.
Ejemplo 3. Caracterización de BiXAb-6567 mediante calorimetría diferencial de barrido
Se empleó la calorimetría diferencial de barrido (DSC) para comparar la estabilidad térmica de BiXAb-6567, del mAb anti-CD38 parental, y del mAb anti-PD-L1 parental. Se empleó un sistema MicrocalTM VP-Capillary DSC (Malvern Instruments) para realizar experimentos de calorimetría diferencial de barrido.
Todas las muestras se centrifugaron (20.000x g, 5 minutos, 4°C), y se cuantificó su contenido de proteínas antes del análisis DSC empleando un espectrofotómetro Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific) que emplea el programa de análisis de IgG. Para el ensayo, todas las muestras se diluyeron en PBS hasta una concentración final de 1 mg/mL. El tiempo de pre-equilibrado fue de 3 minutos y los termogramas resultantes se adquirieron entre 20 y 110°C a una velocidad de barrido de 60°C/h, un período de filtrado de 25 segundos, y medio de retroalimentación. Antes del análisis de la muestra, se midieron 5 escaneos de tampón/tampón para estabilizar el instrumento, y se realizó un escaneo de tampón/tampón entre cada escaneo de proteína/tampón. Los datos se ajustaron a un modelo de desdoblamiento no basado en 2 estados, con la transición previa y posterior ajustada mediante la sustracción de la referencia.
Las curvas DSC presentadas en la Figura 7 (que cubre el intervalo de 50 a 100°C) demuestra la manera en que las regiones Fv individuales pueden conducir a diferentes perfiles de desdoblamiento de Fab; este experimento también demuestra que las regiones Fv dictan las estabilidades aparentes de los Fabs. El perfil de DSC del mAb anti-CD38 muestra dos transiciones: un pico grande que tiene una Cp máx de 170 Kcal/mol/°C y una Tm1 de 70,9°C, correspondiente al desdoblamiento de los dominios CH2 y Fab, y un pico pequeño que tiene una Cp máx de 20 Kcal/mol/°C y una Tm2 de 81,5°C, correspondiente al desdoblamiento del dominio CH3. El perfil de DSC del mAb anti-PD-L1 muestra dos transiciones: un pico pequeño que tiene una Cp máx de 20 Kcal/mol/°C y una Tm1 de 69,9°C, correspondiente al desdoblamiento del dominio CH2, y un pico grande que tiene una Cp máx de 160 Kcal/mol/°C y una Tm2 de 83,4°C, correspondientes al desdoblamiento de los dominios CH3 y Fab.
El perfil DSC de BiXAb-6567 también muestra dos transiciones con dos picos grandes. El primer pico tiene una Cp máx de 130 Kcal/mol/°C y una Tm1 de 71,5°C, y corresponde al desdoblamiento de los dominios CH2 y Fab del mAb anti-CD38; el segundo pico tiene una Cp máx de 170 Kcal/mol/°C y una Tm2 de 81,5°C, y corresponde al desdoblamiento de los dominios CH3 y Fab del mAb anti-PD-L1. Por lo tanto, el perfil de DSC de BiXAb-6567 se parecía a la superposición de los dos perfiles de DSC de los dos mAbs parentales, e ilustra el excelente ensamblaje y la estabilidad de BiXAb-6567. La Tonset (temperatura de inicio, de sus siglas en inglés) de BiXAb-6567 (63,3°C) era similar al de los mAbs parentales (Tonset anti-CD38=63,5°C y Tonset anti-PD-L1=63,2°C), lo que indica que BiXAb-6567 posee propiedades de estabilidad similares a las de los anticuerpos parentales. El AH calculado de BiXAb-6567 era de 1560 kcal/mol, lo que refleja el mayor tamaño de la molécula biespecífica en relación con los dos anticuerpos parentales (anti-CD38 AH=963 kcal/mol y anti-PD-L1 AH=820 kcal/mol).
Definiciones:
Tm o temperatura de desnaturalización/fusión es el punto en el que la concentración de las especies plegadas y desplegadas es igual, y es el punto medio de la transición de desdoblamiento. Como parámetro, describe la susceptibilidad de la proteína a la desnaturalización térmica y, por lo tanto, se relaciona con la estabilidad de la proteína. Cuanto mayor es la Tm, más estable será la proteína.
Tonset es la temperatura a la que comienza la transición de desdoblamiento. Los valores de este parámetro son normalmente de 5 a 10°C inferiores a la Tm. También es un parámetro que describe la estabilidad de la proteína, pero con respecto a la resistencia a la desnaturalización térmica.
AH es la entalpia calorimétrica de desdoblamiento, y refleja la interrupción de las interacciones intramoleculares en la proteína (es decir, la ruptura de las interacciones intra e interdominio). El proceso de desdoblamiento térmico es endotérmico y, por lo tanto, produce valores de entalpía positivos. La entalpía calorimétrica (AH) es el área bajo el pico de transición de desdoblamiento térmico.
Ejemplo 4. Propiedades de unión libre de células de BiXAb-6567
Ensayo ELISA en placa de unión directa al antígeno CD38
Se emplearon 100 pl de mAb parental, anti-CD38 o anti-PDL1, cada uno a una concentración de 3 pg/mL, preparados por dilución con PBS pH 7,4, para recubrir placas Maxisorp a 4°C durante la noche. Además, se empleó BiXAb-6567, a una concentración de 5 pg/mL, preparado por dilución con PBS pH 7,4, para recubrir placas Maxisorp a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron 5 veces con PBS 1x que contiene Tween-20 al 0,05% (PBST), y después se bloquearon con 200 pL/pocillo de BSA al 1% en PBS 1x a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, las placas se lavaron 5 veces con PBST 1x. Se preparó una serie de diluciones triples de siete puntos de CD38 His recombinante/marcado con Flag (Creative Biomart) en PBS 1x, comenzando con 1 pg/mL; se añadieron 100 pL de cada etapa de dilución por pocillo de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, y se lavaron 5 veces con PBST 1x. Se añadieron 100 pL/pocillo de HRP conjugado con anticuerpo anti-Flag-Tag (Abcam), diluido 10.000 veces en PBS 1x, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 5 lavados con PBST 1x, se añadieron 100 pL/pocillo de sustrato TMB en PBS 1x para la lectura colorimétrica, y las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente para el desarrollo del color. Los datos del ensayo se recogieron empleando un lector de microplacas Victor2 (Perkin Elmer) a 650 nm.
BiXAb-6567 muestra una curva de unión dependiente de la dosis muy similar a la del anticuerpo anti-CD38 parental (Figura 8A). La CE50 de unión a CD38 para ambos anticuerpos era como sigue: CE50[BiXAb-6567] = 171 ng/mL y CE50[anti-CD38] = 199 ng/mL. Este resultado sugiere que BiXAb-6567 posee dominios Fab anti-CD38 ensamblados correctamente, ya que presenta una unión similar a la del mAb anti-CD38 parental. El mAb anti-PDL1 parental, empleado como control negativo, no mostró ninguna unión, como se esperaba.
Ensayo ELISA de placa de unión directa al antígeno PDL1.
Se emplearon 100 pL de proteína PD-L1 humana biotinilada (AcroBiosystems) a una concentración de 1 pg/mL, preparada por dilución con PBS 1x pH 7,4, para recubrir placas Maxisorp a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron 5 veces con PBST, y después se bloquearon con 200 pL/pocillo de BSA al 1% en PBS 1x a temperatura ambiente durante 2 horas. Posteriormente, las placas se lavaron 5 veces con PBST 1x. Se preparó una serie de diluciones triples de siete puntos del mAb anti-CD38 (comenzando en 0,3 mg/mL), o del mAb anti-PD-L1 (comenzando en 0,3 mg/mL), o BiXAb-6567 (comenzando en 0,5 mg /mL) en PBS 1x; se añadieron 100 pL de cada etapa de dilución por pocillo de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se lavaron 5 veces con PBST 1x. Se añadieron 100 pL/pocillo de HRP conjugado con anticuerpo antihumano (IgG H&L) (Abliance), diluido 5000 veces en PBS 1x, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 5 lavados con PBST 1x, se añadieron 100 pL/pocillo de sustrato TMB en PBS 1x para la lectura colorimétrica, y las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente para el desarrollo del color. Los datos del ensayo se recogieron empleando un lector de microplacas Victor2 (Perkin Elmer) a 650 nm.
BiXAb-6567 muestra una curva de unión dependiente de la dosis muy similar a la del anticuerpo anti-PD-L1 parental (Figura 8B). La CE50 de unión a PD-L1 para ambos anticuerpos era como sigue: CE50[BiXAb-6567] = 93 ng/mL y CE50[anti-PD-L1] = 72 ng/mL. Este resultado sugiere que BiXAb-6567 posee dominios Fab anti-PD-L1 ensamblados correctamente, ya que presenta una unión similar a la del mAb anti-PD-L1 parental. El mAb anti-CD38 parental, utilizado como control negativo, no mostró ninguna unión, como se esperaba.
Ensayo ELISA de unión a antígeno dual
Se emplearon 100 pL de CD38 recombinante humano marcado con Fc (Creative BioMart), a 2 pg/mL preparado por dilución con PBS 1x pH 7,4, para recubrir placas Maxisorp a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron 5 veces con PBST 1 x y después se bloquearon con 200 pL/pocillo de BSA al 1% en PBS 1x a temperatura ambiente durante 2 horas. Las placas se lavaron 5 veces con PBST1x. Se preparó una serie de diluciones triples de siete puntos en PBS 1 x de BiXAb-6567 (comenzando en 1 pg/mL), y se añadieron 100 pL de cada etapa de dilución por pocillo de ensayo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora, y después se lavaron 5 veces con PBST 1 x. Se añadieron 100 pL/pocillo de 1 pg/mL de PD-L1 humano biotinilado (AcroBiosystems) en PBS 1x, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 5 lavados con PBST 1x, se añadieron 100 pL/pocillo de 0,1 pg/mL de HRP conjugada con estreptavidina (Biotechne) preparada por dilución con PBS 1x. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de 5 lavados con PBST 1x, se añadieron 100 pL/pocillo de sustrato TMB en PBS 1x para la lectura colorimétrica, y las placas se incubaron durante 15 minutos a temperatura ambiente para el desarrollo del color. Los datos del ensayo se recogieron empleando un lector de microplacas Victor2 (Perkin Elmer) a 650 nm.
BiXAb-6567 muestra una curva de unión dependiente de la dosis en el formato ELISA dual, lo que sugiere que posee dominios Fab anti-CD38 y anti-PD-L1 ensamblados correctamente (Figura 8C). Esto demuestra que BiXAb
6567 es un anticuerpo biespecífico capaz de unirse a CD38 y PD-L1 simultáneamente con CE50 = 144 ng/mL. Ninguno de los dos mAbs parentales, anti-CD38 o anti-PDL1, muestra unión alguna en este formato de ELISA dual, como se esperaba.
Ejemplo 5. Determinación de la actividad de unión relativa por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS)
Se cultivaron células CHO-CD38 (células CHO transfectadas de manera estable con CD38 humano de longitud completa) en medio DMEM-Glutamax-I enriquecido con 100 pg/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, de suero de ternero fetal al 10% y 500 pg/ml de geneticina. Se cultivaron células SKOV-3 y células RPMI-8226 en medio RPMI 1640-Glutamax-I, enriquecido con 100 pg/ml de penicilina, 100 pg/ml de estreptomicina, y suero de ternera fetal al 10%.
Se emplearon 3x105 células (CHO-CD38, o SKOV-3, o RPMI-8226) por cada muestra. Las células se lavaron 1 vez con la disolución de PBA (PBS enriquecido con BSA al 1% y azida de sodio al 0,05%). Para la determinación de los perfiles FACS, las células se tiñeron con los respectivos anticuerpos a una concentración de 50 pg/ml en un volumen de 30 pl. Para la titulación de BiXAb-6567 y el anticuerpo anti-CD38 parental, y posterior determinación de los parámetros de unión, se tiñeron células CHO-CD38 con los respectivos anticuerpos a las concentraciones indicadas en un volumen de 30 pl. Las células se incubaron durante 30 minutos en hielo y después se lavaron 2 veces con 1 ml de disolución de PBA. Las células se incubaron con anticuerpos secundarios específicos de Fc gamma IgG anti humano o kappa anti-humano marcados fluorescentemente en hielo y en la oscuridad durante 30 minutos, y después se lavaron 2 veces con 1 ml de disolución de PBA; por último, las células se volvieron a suspender en un volumen final de 500 pl de disolución de PBA. Las muestras se analizaron utilizando bien un citómetro de flujo Epics-XL o bien un Navios (Beckman Coulter). En cada experimento se adquirieron 10.000 eventos.
Los perfiles de unión de BiXAb-6567 y los anticuerpos parentales anti-CD38 y anti-PD-L1 se presentan en las Figuras 9A-C. Elegimos ensayar una línea celular de mieloma múltiple, RPMI-8226, que expresa niveles altos de CD38 y niveles insignificantes de PD-L1 (Figura 9A); una línea celular CHO-CD38 que expresa un nivel muy alto de CD38 debido a un CD38 de longitud completa transfectado de manera estable (Figura 9B); y una línea celular SKOV-3 de cáncer de ovario, que se sabe que expresa PD-L1 (Figura 9C). Estos perfiles muestran un solo pico para BiXAb-6567 que es muy similar a los perfiles de ambos anticuerpos parentales en las 3 líneas celulares. Esto sugiere que BiXAb-6567 está plegado correctamente y posee atributos de unión similares a los de los anticuerpos parentales. Como se esperaba, CHO-CD38 expresa sólo CD38 y no PD-L1, mientras que SKOV-3 expresa sólo PD-L1 y no CD38.
Para confirmar cuantitativamente que las propiedades de unión de BiXAb-6567 son similares a las del anticuerpo anti-CD38 parental, se realizó una titulación de BiXAb-6567 y el anticuerpo parental anti-CD38 empleando células CHO-CD38, como se presenta en la Figura 10. Se determinó que la CE50 de BiXAb-6567 era 17,1 nM y que la del anti-CD38 parental era 8,5 nM, lo que confirma las propiedades de unión similares de los dominios Fab anti-CD38 en BiXAb-6567 y en el anticuerpo anti-CD38 parental. Los controles negativos en este experimento, los anticuerpos anti-PD-L1 y anti-CD20, demuestran que, como se esperaba, no se unen a las células CHO-CD38.
Ejemplo 6. Citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) con células mononucleares no preactivadas no fraccionadas (MNC)
Se cultivaron células CHO-CD38, SKOV-3, y RPMI-8226 como se describe en el Ejemplo 5 anterior. Para la preparación de MNC se empleó el siguiente procedimiento. La sangre periférica recién extraída se anticoaguló con citrato. Posteriormente, se estratificaron 5 ml de disolución Ficoll-Paque PLUS con 6 ml de sangre total anticoagulada. Las muestras se centrifugaron durante 20 minutos a 2.500 rpm a temperatura ambiente sin parar la centrifugación. Las MNC se recogieron de la interfaz plasma/Ficoll. La suspensión de células MNC se diluyó 1:10 en PBS y se centrifugó durante 5 minutos a 1.800 rpm a temperatura ambiente. Se eliminó el sobrenadante, y se lisaron los eritrocitos mediante la adición de 45 ml de agua destilada helada a la suspensión celular durante 30 segundos, después de lo cual se añadieron 5 ml de PBS 10x. Las células se centrifugaron durante 5 minutos a 1800 rpm a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS 1x para eliminar las plaquetas. Finalmente, las células se volvieron a suspender en 5 ml de medio de cultivo celular. El número de células se ajustó para conseguir una proporción de células efectoras : células tumorales de 40:1 en los ensayos de ADCC.
Para el ensayo ADCC de liberación de 51Como, se incubaron 1x106 células diana (RPMI 8226, SKOV-3, o CHO-CD38) con 100 pCi de 51Cromo en 200 pl de PBS durante 2 horas a 37°C y 5% de CO2. Después de 2 horas de incubación, las células se lavaron tres veces con 7 ml de medio y finalmente se volvieron a suspender a una concentración de 0,1 x 106 células/ml. Se incubaron células diana (5.000 células/pocillo) y MNC en presencia de anticuerpos en una placa de microtitulación de 96 pocillos (200 pl de volumen de ensayo) durante 3 horas a 37°C y 5% de CO2. Para la determinación de la lisis máxima de células diana (= cpm máxima) se añadió Triton X-100. Para determinar las células diana basales de liberación de 51Cromo (= cpm basal), las células no se manipularon más. Después de 4 horas de incubación, las placas de microtitulación se centrifugaron durante 5 minutos a 2.000 rpm y 25 pl de sobrenadante se mezclaron con 125 pl de Optiphase Supermix (Perkin Elmer) y se incubaron en una
incubadora con agitación durante 1 minuto. Las muestras se analizaron en un instrumento contador beta MicroBeta TriLux (Perkin Elmer). La lisis de células diana se calculó empleando la siguiente fórmula:
% lisis = (cpm experimental - cpm basal)/(cpm máxima - cpm basal) x 100.
Todas las mediciones se realizaron por triplicado.
Se realizaron ensayos ADCC de células CD38+ (RPMI-8226 y CHO-CD38) empleando como células efectoras MNC no preactivadas (Figuras 11 y 12). Los ensayos muestran una potente citotoxicidad de BiXAb-6567 y el anticuerpo anti-CD38 en células RPMI-8226 con CE50 de 0,8 nM y 0,3 nM, respectivamente; en células CHO-CD38, la citotoxicidad de BiXAb-6567 y el anticuerpo anti-CD38 tenían CE50 de 0,2 nM y 0,07 nM, respectivamente. Anti-pD-L1 muestra una actividad mínima en ambas líneas celulares; dos mAbs de control negativo, anti-CD20 y anti-HER2, no facilitaron ninguna lisis, como se esperaba. Estos resultados demuestran la potente actividad ADCC de BMX-6567 frente a las células CD38+, que es similar a la del anticuerpo anti-CD38 parental.
Ejemplo 7. ADCC con células NK preactivadas enriquecidas
Se cultivaron células SKOV3, RPMI 8226, y células CHO-CD38 como se describe en el Ejemplo 5. Se prepararon MNC como se describe en el Ejemplo 6. Se aislaron las células NK de las MNC mediante selección negativa empleando el "Kit de aislamiento de células NK, humano" (Miltenyi) según las instrucciones del fabricante. Las células NK se cultivaron durante la noche a una densidad de siembra de 2x106 células/ml en medio RPMI enriquecido con suero fetal bovino al 10%. Se añadió IL-12 o IL-15 hasta una concentración final de 10 ng/ml. Los ensayos de ADCC se realizaron como se describe en el Ejemplo 5 con la excepción de que la proporción de células efectoras : células tumorales se mantuvo en 10:1 y la duración de la reacción se redujo a 3 horas.
Las propiedades ADCC del resto anti-PD-L1 del BiXAb-6567 se ensayaron en la línea celular SKOV-3 PD-L1 empleando células NK enriquecidas preactivadas bien con IL-12 o con IL-15. Los resultados se presentan en las Figuras 13 y 14. Este experimento compara las propiedades ADCC de BiXAb-6567 con las del anticuerpo anti-PD-L1 parental; como control positivo se empleó un anticuerpo anti-HER2, y como controles negativos se emplearon un anticuerpo anti-CD20 y el anticuerpo parental anti-CD38 ya que las células SKOV-3 son PD-L1+/HER2+/CD20-/CD38-. Las Figuras 13 y 14 demuestran la potente actividad ADCC de BiXAb-6567 y de los anticuerpos anti-PD-L1 parentales, independientemente de si se empleó IL-12 o IL-15 en el cultivo de células NK. La CE50 de BiXAb-6567 y los anticuerpos anti-PD-L1 parentales eran 0,007 nM y 0,03 nM, respectivamente, cuando se empleó IL-12. Los perfiles eran incluso más similares cuando se empleó IL-15; sin embargo, los ajustes de la curva no convergieron, impidiendo así el cálculo de los valores de CE50. Estos resultados demuestran la potente actividad ADCC de BMX-6567 frente a las células PD-L1+, que es similar a la del anticuerpo anti-PD-L1 parental.
Claims (11)
1. Una molécula biespecífica que comprende al menos un dominio anti-CD38 y al menos un dominio anti-PD-L1, que son capaces de unirse simultáneamente a los antígenos CD38 y PD-L1, respectivamente, dicha molécula biespecífica es un anticuerpo de longitud completa que comprende dos cadenas pesadas y cuatro cadenas ligeras, en donde cada cadena pesada comprende
a. una región Fc que comprende dominios Bisagra-CH2-CH3,
b. cuya región Fc se une a la cadena pesada Fab (CH1-VH) del anticuerpo 1 (Ab1),
c. que se une a su vez a la cadena pesada Fab (CH1-VH) del anticuerpo 2 (Ab2), mediante una secuencia enlazadora polipeptídica derivada de bisagra, en donde dicha secuencia enlazadora polipeptídica enlaza el extremo N-terminal de dicho dominio VH de cadena pesada Fab de Ab1 con el C-terminal de dicho dominio CH1 de Ab2,
y las cuatro cadenas ligeras comprenden cadenas ligeras Fab (CL-VL) de Ab1 y cadenas ligeras Fab (CL-VL) de Ab2 asociadas con sus dominios de cadena pesada afines;
Ab1 y Ab2 son diferentes y se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos anti-CD38 y anticuerpos anti-PD-L1.
2. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde Ab1 es un anticuerpo anti-CD38, y Ab2 es un anticuerpo anti-PD-L1.
3. La molécula biespecífica de la reivindicación 1, en donde Ab1 es un anticuerpo anti-PD-L1, y Ab2 es un anticuerpo anti-CD38.
4. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo anti-CD38 se selecciona del grupo que consiste en daratumumab, isatuximab, y MOR-202.
5. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el anticuerpo anti-PD-L1 se selecciona del grupo que consiste en atezolizumab, durvalumab, avelumab, y MDX-1105.
6. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde los dominios CH1 y CL de Ab1 tienen una secuencia diferente de los dominios CH1 y CL de Ab2.
7. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el dominio CH1 de Fab de uno de Ab1 o Ab2 es un dominio mutado que deriva del dominio CH1 de una inmunoglobulina mediante la sustitución del resto de treonina en la posición 192 de dicho dominio CH1 por un ácido aspártico y el dominio CL afín es un dominio mutado que deriva del dominio CL de una inmunoglobulina por sustitución del resto de asparagina en la posición 137 de dicho dominio CL por un resto de lisina y sustitución del resto de serina en la posición 114 de dicho dominio CL por un resto de alanina, y/o en donde el dominio CH1 de Fab de uno u otro Ab1 o Ab2 es un dominio mutado que deriva del dominio CH1 de una inmunoglobulina por sustitución del resto leucina en la posición 124 de dicho dominio CH1 por una glutamina y sustitución del resto de serina en la posición 188 de dicho dominio CH1 por un resto de valina, y el dominio CL afín es un dominio mutado que deriva del dominio CL de una inmunoglobulina por sustitución del resto de valina en la posición 133 de dicho dominio CL por un resto de treonina y sustitución del resto de serina en la posición 176 de dicho dominio CL por un resto de valina.
8. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende, preferiblemente consiste en a) dos cadenas pesadas, cada una de las cuales comprende, preferiblemente consiste en, SEQ ID NO:10 y b) cuatro cadenas ligeras, dos de las cuales comprende, preferiblemente consisten en, SEQ ID NO:11, las otras dos comprenden, preferiblemente consisten en, SEQ ID NO:12.
9. Un método para producir la molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, comprendiendo dicho método las siguientes etapas:
a. cultivar en un medio y condiciones de cultivo adecuados una célula huésped que expresa una cadena pesada de anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y una cadena ligera de anticuerpo como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, y
b. recuperar dichos anticuerpos producidos del medio de cultivo o de dichas células cultivadas.
10. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso como medicamento.
11. La molécula biespecífica de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de un cáncer, preferiblemente un mieloma múltiple, linfoma o leucemia.
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