ES2901973T3 - Uso del péptido similar a La1 aislado de veneno de Maurus palmatus como activador de la motilidad de los espermatozoides en mamíferos - Google Patents
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Abstract
Un agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1, para su uso como medicamento.
Description
DESCRIPCIÓN
Uso del péptido similar a La1 aislado de veneno de Maurus palmatus como activador de la motilidad de los espermatozoides en mamíferos
Campo de la invención
La presente invención se refiere al tratamiento de la infertilidad masculina por el incremento de la motilidad de los espermatozoides en técnicas de reproducción asistida in vitro o in vivo. La invención también se refiere al aumento de la fertilidad de animales machos en métodos de producción animal, que incluye la inseminación artificial.
Antecedentes de la invención
La infertilidad afecta a una de cada seis parejas, con, en uno de cada dos casos, una deficiencia de la pareja masculina.
La infertilidad masculina presenta fenotipos muy variables. Uno de los más comunes es la astenozoospermia, que se caracteriza por la disminución o ausencia de la motilidad de los espermatozoides [véase Publicover SJ, Barratt CL. Sperm motility: things are moving in the lab! Mol Hum Reprod. 2011 agosto; 17 (8): 453-6.]
La tecnología de reproducción asistida (TRA) es el término que se usa para describir los métodos usados para ayudar a las parejas e incluye, en función de la gravedad de la infertilidad masculina: inseminación intrauterina (IUI) para la fecundación in vitro (IVF) moderada e intrauterina Inyección citoplasmática de espermatozoides (ISCI) para hombres con disfunción espermática grave.
En algunos casos de azoospermia u oligozoospermia, se requiere la recuperación de espermatozoides directamente del testículo o del epidídimo.
La congelación de muestras de espermatozoides a menudo es necesaria en TRA. Sin embargo, una de las principales desventajas de la congelación de muestras es que los espermatozoides que se congelan previamente, una vez descongelados, tienen una motilidad reducida en comparación con las muestras frescas de esperma, con una menor cantidad de espermatozoides progresivos.
Además, en los animales de granja, para los que se usa mucho la inseminación artificial, AI, la disminución de la motilidad de los espermatozoides congelados significa que la concentración de espermatozoides en las pajitas debe aumentarse y esto reduce el éxito general del método.
El uso de agentes no tóxicos que pueden aumentar la motilidad de los espermatozoides presenta, por tanto, un fuerte valor terapéutico en el contexto de la reproducción médicamente asistida.
A medida que los espermatozoides maduran de manera heterogénea, los espermatozoides testiculares individuales que se recolectan de un paciente que presenta azoospermia u oligozoospermia a menudo se eligen para su uso en reproducción médicamente asistida, en base a su respuesta a las moléculas que activan la motilidad de los espermatozoides. En dependencia del país, muy pocas o ninguna, de estas moléculas están disponibles para uso clínico en la actualidad, lo que deja a los médicos sin herramientas para realizar esta selección.
Así como también de las técnicas de fecundación in vitro (IVF), estos agentes también son de interés para la inseminación artificial (AI), por ejemplo, donde se inyectan espermatozoides en el tracto vaginal o en el útero (IUI) de la hembra, porque aumentan la motilidad de los espermatozoides en el tracto genital femenino y, por lo tanto, aumentan las posibilidades de que se produzca la fertilización.
Por lo tanto, dichos agentes también impactan en la tasa de éxito de las técnicas de fertilización in vitro, no solo para uso terapéutico en humanos, sino también para uso de reproducción industrial en numerosas especies, como caballos, cerdos, ganado y aves, como por ejemplo, pavos.
En el pasado, se usaron inhibidores de la fosfodiesterasa no selectivos como la pentoxifilina (PTF) para aumentar la motilidad de los espermatozoides en humanos. Sin embargo, aunque estas moléculas muestran una mayor aceleración en los espermatozoides móviles, una desventaja significativa ha sido la estimulación prematura de la reacción del acrosoma (AR). Esto conduce a la incapacidad de los espermatozoides para penetrar en el ovocito una vez que lo alcanza.
Recientemente, se examinaron otros inhibidores de la EDP en un pequeño ensayo clínico [Tardif S, Madamidola OA, Brown SG, Frame L, Lefiévre L, Wyatt PG, Barratt CL, Martins Da Silva SJ. Clinically relevant enhancement of human sperm motility using compounds with reported phosphodiesterase inhibitor activity.Hum Reprod. 2014, 10 de octubre; 29(10):2123-35.] De 43 moléculas disponibles comercialmente con actividad inhibidora de PDE, seis mostraron un fuerte efecto sobre la motilidad deficiente en la Fase I, y en la Fase II tres de estos compuestos se identificaron como "candidatos prometedores para estudios posteriores".
Otro inhibidor de la PDE, la papaverina, también se considera una alternativa a la pentoxifilina (véase por ejemplo Terriou y otros 2015, Gynécologie Obstétrique et Fertilité 43, p. 786-790).
TERRIOU P Y OTROS: "Papaverine as a replacement for pentoxifylline to select thawed testicular or epididymal spermatozoa before ICSI", GYNECOLOGIE OBSTETRIQUE & FERTILITE, vol. 43, no. 12, 2015, páginas 786-790, se relaciona con el uso de papaverina.
Por lo tanto, todavía existe una gran necesidad de agentes no tóxicos que aumenten la motilidad de los espermatozoides para su uso en procedimientos de TRA que incluyen, por ejemplo, AI, IUI, IVF, incluida la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) para uso terapéutico en humanos. Existe la necesidad de agentes no tóxicos que activen la motilidad de los espermatozoides.
Existe la necesidad de agentes que permitan la selección de espermatozoides individuales para su uso en TRA, incluida la IVF, incluida la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ISCI).
También existe una gran necesidad de agentes que se puedan usar para aumentar la fertilidad masculina en procedimientos industriales de inseminación artificial en animales. En particular, existe la necesidad de moléculas que puedan aumentar el número de espermatozoides progresivos de una pajita (muestra) congelada.
Existe la necesidad de un agente que pueda aumentar la capacidad de fertilización de una población de espermatozoides contenida en una muestra para su uso en procesos industriales de inseminación artificial en animales.
Existe la necesidad de un agente que sea capaz de activar/incrementar la motilidad de los espermatozoides frescos así como también los previamente congelados.
Existe la necesidad de un agente que pueda activar la motilidad de los espermatozoides testiculares, epididimarios y/o eyaculados en aves, bovinos, porcinos, ovinos, como por ejemplo pollos y pavos, equinos, cabras y animales domésticos, en particular gatos y perros.
Existe la necesidad de agentes que puedan activar la motilidad de los espermatozoides testiculares, epididimarios y/o eyaculados en humanos.
Resumen de la invención
La presente invención se define en el conjunto de reivindicaciones.
Los inventores descubrieron un compuesto peptídico similar a La-1 que se puede usar para aumentar la motilidad de los espermatozoides de mamíferos. Los solicitantes demostraron que un péptido aislado del veneno del escorpión Maurus palmatus, previamente identificado como proteína similar a La1 [Abdel-Rahman, M.A, y otros Toxicon 74 (2013) Venom proteomic and venomous glands transcriptomic analysis of the Egyptian scorpion Scorpio Maurus palmatus (Arachnida: Scorpionidae) pp. 193-207] ] pero con función biológica desconocida, presenta una importante actividad biológica. La secuencia de péptidos es SEQ ID NO. 1.
La invención se refiere a un agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1, para su uso como medicamento.
De acuerdo con una modalidad de la invención, dicho agente peptídico similar a La-1 se puede usar para el tratamiento de la infertilidad masculina en mamíferos. En particular, la infertilidad masculina que se debe parcial o totalmente a la escasa movilidad de los espermatozoides, puede tratarse mediante el uso del agente peptídico similar a La-1 de la invención.
De acuerdo con una modalidad una realización de la invención, dicho agente peptídico similar a La-1 se puede usar para activar la motilidad de los espermatozoides de mamíferos. El contacto del agente con los espermatozoides de mamíferos puede aumentar su velocidad. Además, los espermatozoides inmóviles pueden volverse móviles.
De acuerdo con una modalidad de la invención, dichos espermatozoides se eligen entre espermatozoides de humanos, bovinos, porcinos, ovinos, equinos, caprinos y domésticos, en particular de gatos y perros.
De acuerdo con una modalidad de la invención, dichos espermatozoides pueden haberse congelado previamente, o haberse eyaculado recientemente, o recuperado del epidídimo o del testículo.
De acuerdo con una modalidad de la presente descripción, el agente peptídico similar a La-1 se puede poner en contacto in vitro, con los espermatozoides que se usarán en un procedimiento de inseminación artificial o en un procedimiento de fertilización in vitro, en particular, intracitoplasmático, inyección de espermatozoides (ICSI).
De acuerdo con una modalidad de la presente descripción, el agente peptídico similar a La-1 se puede poner en contacto in vivo, con espermatozoides para su uso en un procedimiento de inseminación natural o artificial.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede estar en forma de una composición farmacéutica para su administración al tracto vaginal y/o al cuello uterino de una hembra antes de la inseminación (inseminación artificial o natural).
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se puede usar en la selección de espermatozoides adecuados para un procedimiento de fertilización in vitro humana, en particular, inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
De acuerdo con una modalidad de la invención, los espermatozoides a tratar pueden tener una motilidad inicial de entre 1 y 30 pm/s.
De acuerdo con una modalidad de la invención, los espermatozoides a tratar pueden tener una motilidad inicial de al menos 30 pm/s.
También se describe un método de selección de espermatozoides para su uso en un procedimiento de fertilización in vitro humana que comprende las etapas:
a. poner en contacto una muestra de espermatozoides con una cantidad terapéuticamente efectiva de agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID No .1;
b. observar y medir la movilidad de los espermatozoides mediante el uso de al menos un parámetro elegido entre la velocidad de seguimiento, la velocidad de la trayectoria, la amplitud natural, la velocidad no progresiva y la velocidad progresiva;
c. seleccionar los espermatozoides con mayor movilidad de acuerdo con los criterios usados en el procedimiento de IVF particular que se usará.
También se describe un método para aumentar la fertilidad de un animal, que comprende:
a. incubar una muestra de espermatozoides de un animal con una cantidad terapéuticamente efectiva de agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1;
b. inseminar artificialmente al animal hembra con dicha muestra de espermatozoides y el agente peptídico similar a La-1;
c. medir la tasa de fertilidad.
Los solicitantes en ensayos observaron la superioridad del péptido similar a La-1 en comparación con la papaverina. Los solicitantes también demostraron que el péptido no presenta toxicidad en los espermatozoides y tiene un efecto duradero sobre la motilidad de los espermatozoides.
Breve descripción de los dibujos
Figuras 1A y 1B: Alineación de secuencia de péptido similar a La-1 de diferentes especies de escorpión mediante el uso del visor de secuencias de software CLC.
Figura 2A: Diagrama que muestra las definiciones del movimiento de los espermatozoides.
VCL: La velocidad curvilínea es la velocidad promedio de la cabeza del espermatozoide a lo largo de su trayectoria real.
VAP: La velocidad de trayectoria promedio es la velocidad promedio de la cabeza del espermatozoide a lo largo de su trayectoria promedio.
ALH: El desplazamiento lateral de la cabeza de los espermatozoides (ALH) se define como la amplitud de las variaciones de la trayectoria de la corriente de la cabeza de los espermatozoides en relación con la VAP.
VSL: La velocidad en línea recta es la velocidad promedio de la cabeza del espermatozoide a través de una línea recta que conecta la primera posición con su última posición.
Figura 2B: Resultados de la prueba de velocidad realizada en espermatozoides humanos tratados con el péptido SEQ ID NO 1.
A: % de activación con respecto al VCL inicial.
B: % de activación con respecto al VAP inicial.
C: % de activación con respecto a la ALH inicial.
D: % de activación con respecto al VSL inicial.
Figura 3: Medición de células móviles y células progresivas después de la incubación de espermatozoides testiculares de macaca (primate no humano) con (péptido de 7,8 Kda) y sin péptido (Control) SEQ ID NO. 1. Los espermatozoides móviles y los espermatozoides progresivos se caracterizaron por VAP> 1 pm/s y VAP> 30 pm/s y STR> 70 %, respectivamente. STR =VSL/VAP. Los análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot. Se usaron pruebas t para comparar los efectos del péptido similar a La1 sobre los parámetros de motilidad de los espermatozoides. Los datos representan la media ± s Em . Las pruebas estadísticas con valores de P de 2 colas < 0,05 se consideraron significativas.
Figura 4: Medición de la velocidad, VCL (pm/s) de espermatozoides testiculares de primates no humanos con (péptido de 7,8 Kda) y sin (Control) incubación con el péptido SEQ ID NO 1. Los espermatozoides móviles y los espermatozoides progresivos se caracterizaron por v A p > 1 pm/s y VAP> 30 pm/s y STR> 70 %, respectivamente. STR =VSL/VAP. Los análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot. Se usaron pruebas t para comparar los efectos del péptido similar a La1 sobre los parámetros de motilidad de los espermatozoides. Los datos representan la media ± SEM. Las pruebas estadísticas con valores de P de 2 colas < 0,05 se consideraron significativas.
Figura 5: Medición del % de células móviles y células progresivas después de la incubación de espermatozoides eyaculados humanos frescos (panel izquierdo) y congelados (panel derecho) con (péptido de 7,8 kDa) o sin (control) el péptido de acuerdo con s Eq ID NO. 1. Los espermatozoides móviles y los espermatozoides progresivos se caracterizaron por VAP> 1 pm/s y VAP> 30 pm/s y STR> 70 %, respectivamente. STR =VSL/VAP. Los análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot. Se usaron pruebas t para comparar los efectos del péptido similar a La1 sobre los parámetros de motilidad de los espermatozoides. Los datos representan la media ± SEM. Las pruebas estadísticas con valores de P de 2 colas < 0,05 se consideraron significativas.
Descripción detallada
En la presente invención, el término "activación de la motilidad" o "activación de la motilidad de los espermatozoides" debe entenderse en el sentido de aumentar la velocidad de los espermatozoides. Esto significa aumentar la velocidad no progresiva y, opcionalmente, la motilidad progresiva de los espermatozoides. El término también incluye el aumento de la velocidad de los espermatozoides inmóviles (es decir, aquellos que tienen una velocidad inicial de 0 pm/s).
En la presente invención, el término "agente activador de la motilidad de los espermatozoides" debe entenderse como un agente que aumenta la velocidad de los espermatozoides. Esto incluye aumentar la velocidad no progresiva y, opcionalmente, la velocidad progresiva. El agente también puede aumentar la velocidad de los espermatozoides inmóviles (es decir, los que tienen una velocidad inicial de 0 pm/s).
En la presente invención, el término "velocidad progresiva" debe entenderse como una velocidad de al menos 30 pm/s.
En la presente invención, el término "velocidad no progresiva" debe entenderse como una velocidad de entre 1 y 30 pm/s.
En la presente invención, el término "astenozoospermia" debe entenderse en el sentido de una motilidad espermática reducida. La astenozoospermia completa significa que los espermatozoides están inmóviles al 100 %.
En la presente invención, el término "espermatozoides progresivos" debe entenderse en el sentido de espermatozoides que tienen una velocidad de al menos 30 pm/s. En la presente invención, el término "biológicamente activo" debe entenderse en el sentido de que tiene una actividad de activación de la motilidad del esperma.
En la presente invención, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad suficiente para inducir un resultado biológico deseado. Ese resultado puede ser el alivio de los signos, síntomas o causas de una enfermedad, por cualquier otra alteración deseada de un sistema biológico. En particular, el resultado puede ser la activación de la motilidad de los espermatozoides.
En la presente invención, el término "homólogo" significa que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos.
En el texto actual, "Scorpio Maurus palmatus" y "Maurus palmatus" son sinónimos.
El agente peptídico similar a La-1
La presente invención se refiere a un agente peptídico similar a La-1 que presenta una actividad biológica. Específicamente, el agente peptídico similar a La-1 al que se refiere la presente invención puede activar los espermatozoides de mamífero. Por tanto, el agente se puede usar como un agente terapéuti
masculina en particular, para tratar la "astenozoospermia" u "oNgozoospermia". También se puede usar para aumentar la fertilidad de los animales con fines de producción animal.
La presente invención también proporciona composiciones que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de agente peptídico similar a La-1 que es útil para tratar la infertilidad masculina.
El péptido identificado por los inventores se aisló del veneno del escorpión Maurus palmatus y tiene 73 aminoácidos (sEq ID NO. 1) y un peso molecular de aproximadamente 7850 kDa. El solicitante identificó que el péptido también existe como propéptido (SEQ ID NO. 3) que tiene un sitio de escisión entre el aminoácido 24 y el aminoácido 25. Por tanto, el péptido N-terminal de 24 aminoácidos MEHALKSLLLICLVVFSFTSLCMG (SEQ ID No. 2) se escinde para dar el péptido SEQ ID NO. 1.
El propéptido SEQ ID NO. 3 se espera que tenga un nivel similar de actividad biológica a la SEQ ID NO. 1.
Los solicitantes descubrieron que el péptido contiene cuatro puentes disulfuro. La primera Cys está ubicada en la posición 29/98 de SEQ ID NO. 3 y el último en 96/98. Por lo tanto, ciertos truncamientos N-terminales de SEQ ID NO.
3, preferentemente que no rompan dichos puentes disulfuro y que retengan la actividad biológica, medida por la capacidad para activar espermatozoides de mamíferos, se consideran modalidades de la invención.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 comprende un truncamiento en el C terminal del péptido SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 3 que es biológicamente activo, medido por su capacidad para activar los espermatozoides de mamíferos.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el agente peptídico similar a La-1 comprende el péptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 1.
De acuerdo con otra modalidad, el agente peptídico similar a La-1 comprende el péptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 y/o SEQ ID NO. 3.
El péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 3 puede marcarse, por ejemplo, con una etiqueta de histidina u otra etiqueta de etiquetado usada para marcar proteínas. De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 comprende péptidos de acuerdo con SEQ ID NO. 1 que están etiquetados. De forma similar, los truncamientos de la SEQ ID NO. 3, que incluye la SEQ ID NO. 1, pueden estar marcados y el agente peptídico similar a La-1 puede comprender dichos truncamientos marcados.
La Figura 1 muestra la alineación de secuencia del péptido identificado, proteína similar a La-1 de S. Maurus palmatus con otras cinco especies- S. Urodacus yaschenkoí, H. Liocheles australasiae, S. Pandinus cavimanus, H. Opisthacanthus cayaporum y B. Mesobuthus martensii. La secuencia de consenso se indica en la línea inferior en letras sin color y el % de identidad se indica para cada aminoácido.
Los péptidos que tienen al menos el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 % o el 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEQ ID NO. 1 se espera que tenga la actividad biológica identificada para el péptido SEQ ID NO.
1. Estos péptidos también se consideran capaces de activar la motilidad de los espermatozoides de mamíferos y, por lo tanto, se consideran modalidades del agente peptídico similar a La-1 de la presente invención. Se espera que el péptido similar a La-1 de, por ejemplo, S. Urodacus yaschenkoí (Luna-Ramirez, K., Quintero-Hernandez, V., Vargas-Jaimes, L., Batista, C.V., Winkel, K.D., and Possani, L.D. (2013). Characterization ofthe venom from the Australian scorpion Urodacus yaschenkoi: Molecular mass analysis of components, cDNA sequences and peptides with antimicrobial activity. Toxicon. 63:44-54. doi: 10.1016/j.toxicon.2012.11.017. Epub@2012 Nov23., 44-54), H. Liocheles australasiae (Miyashita, M., Otsuki, J., Hanai, Y., Nakagawa, Y., and Miyagawa, H. (2007). Characterization of peptide components in the venom ofthe scorpion Liocheles australasiae (Hemiscorpiidae). Toxicon. 50, 428-437.), S. Pandinus cavimanus (Diego-Garcia, E., Peigneur, S., Clynen, E., Marien, T., Czech, L., Schoofs, L., and Tytgat, J. (2012). Molecular diversity o fthe telson and venom components from Pandinus cavimanus (Scorpionidae Latreille 1802): transcriptome, venomics and function. Proteomics. 12, 313-328), H. Opisthacanthus cayaporum (Silva,E.C., Camargos,T.S., Maranhao, A.Q., Silva-Pereira, I., Silva, L.P., Possani, L.D., and Schwartz, E.F. (2009). Cloning and characterization of cDNA sequences encoding for new venom peptides of the Brazilian scorpion Opisthacanthus cayaporum. Toxicon. 54, 252-261) y B. Mesobuthus martensii (Ma, Y., He, Y., Zhao, R., Wu,Y., Li, W., and Cao, Z. (2012). Extreme diversity of scorpion venom peptides and proteins revealed by transcriptomic analysis: implication for proteome evolution of scorpion venom arsenal. J. Proteomics. 75, 1563-1576) también activen la motilidad de los espermatozoides de mamíferos. Un agente peptídico similar a La-1 que comprende uno cualquiera o más de estos péptidos de la última especie también se considera como una modalidad de la invención.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente activador de la motilidad comprende al menos un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con la SEC ID NO. 1. El agente peptídico similar a La-1 puede ser un truncamiento en el N y C terminal biológicamente activo o un mutante de SEQ ID NO. 1 o de un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO 1. El agente puede comprender una mezcla de
cualquiera de dichos péptidos. Los péptidos se pueden mutar para modular su actividad biológica, por ejemplo incrementándola más, o aumentando la duración del efecto biológico o alterando otro parámetro farmacológico. Dichos péptidos se consideran parte de la invención.
De acuerdo con una modalidad de la invención, los péptidos incluidos en el agente activador se aíslan de sus fuentes naturales. Por ejemplo, el péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1 se puede aislar del escorpión Maurus palmatus. Por ejemplo, el péptido similar a La-1 de otras especies que incluyen, por ejemplo, U. yaschenkoí, L. australasiae, P.cavimanus y M. martensii se pueden aislar de sus fuentes naturales.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el péptido comprendido en el agente peptídico similar a La-1 es un péptido recombinante producido en un sistema de expresión adecuado, por ejemplo, en levadura, E. coli u otro sistema de expresión adecuado.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el agente peptídico similar a La-1 es la SEQ ID NO. 1 o la SEQ ID NO. 3, o un péptido homólogo producido en un sistema expresivo adecuado, por ejemplo, células E. Coli o Sf9.
En una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede comprender péptidos híbridos o de fusión de la SEQ ID NO. 1 o de péptidos homólogos, fusionados a otra secuencia de péptidos. La otra secuencia de péptidos puede tener una función que ayude al proceso de fertilización o estabilice el agente peptídico similar a La-1.
Los inventores sintetizaron el péptido de acuerdo con la SEQ ID NO. 1 mediante el uso de la Estrategia de Ligadura Química Nativa y se confirmó que conserva la actividad biológica asociada con el péptido aislado del veneno de Scorpio Maurus palmatus.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 es un péptido sintético producido mediante un método sintético adecuado conocido por la persona experta. Por ejemplo, se puede citar la Estrategia de Ligadura Química Nativa.
De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede comprender un péptido sintético de acuerdo con SEQ ID NO. 1, o un péptido homólogo.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede comprender un péptido que es un derivado sintético de SEQ ID NO. 1 o de péptidos homólogos como se describió anteriormente. Estos derivados pueden incluir derivados que son útiles para aumentar la estabilidad o mejorar otros parámetros fisicoquímicos o farmacocinéticos o farmacodinámicos, por ejemplo, PEGilación, hiperglicosilación o manosilación De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede comprender péptidos que son producidos sintéticamente y/o péptidos que son producidos por sistemas de expresión recombinantes y/o péptidos que son aislados de fuentes naturales.
En una modalidad preferida, el agente peptídico similar a La-1 comprende la SEQ ID NO. 1 o péptidos homólogos que son aislados de al menos una fuente natural, por ejemplo, del veneno de Maurus palmatus. En otra modalidad, el agente peptídico similar a La-1 comprende la SEQ ID nO. recombinante. 1 o péptidos homólogos que se expresaron en un sistema de expresión adecuado. En una modalidad preferida, el agente peptídico similar a La-1 comprende la SEQ ID NO. 1 o péptidos homólogos que se sintetizan químicamente. En otra modalidad, el agente peptídico similar a La-1 comprende una mezcla de los péptidos mencionados anteriormente.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede comprender péptidos que están en forma dimérica, trimérica o multimérica, siempre que retengan su actividad biológica.
El agente peptídico similar a La-1 se puede almacenar en tampones adecuados para uso inmediato o para almacenamiento a aproximadamente 4 °C. de acuerdo con una modalidad, el agente peptídico similar a La-1 se puede congelar. En ese caso, el agente peptídico similar a La-1 se puede almacenar en un tampón criogénico adecuado. Si se congela, el agente peptídico similar a La-1 se puede almacenar a -20 °C hasta aproximadamente 6 meses o durante períodos más largos a -80 °C.
El agente peptídico similar a La-1, cuando está en forma de solución, leche, suspensión o gel, se puede esterilizar mediante el uso de cualquier método adecuado para esterilizar péptidos, por ejemplo mediante filtración con un filtro de 0,22 |jm.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se puede liofilizar y almacenar a temperatura ambiente o4°C, o -20 °C o -80 °C, en función de las necesidades del usuario.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se puede almacenar en forma de polvo, fibra, copos, suspensión, solución o cualquier otra forma adecuada.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, el agente activador de la motilidad puede combinarse con al menos otro agente útil en los procedimientos de TRA, incluido un procedimiento de fertilización in vitro o en un procedimiento de reproducción asistida in vivo. Este otro agente puede ser un agente útil para aumentar la motilidad de los espermatozoides, estabilizar la muestra de espermatozoides o cualquier otra función útil en las técnicas de TRA.
El agente peptídico similar a La-1 tiene actividad biológica
El agente peptídico similar a La-1 de la invención es de uso terapéutico debido a su actividad biológica recientemente identificada. En una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se puede usar como medicamento.
En consecuencia, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden, como ingrediente activo, el agente peptídico similar a La-1, en asociación con un portador o diluyente farmacéutico. El agente peptídico similar a La-1 de acuerdo con una modalidad de la invención se puede administrar por vías que permitan que el agente entre en contacto con los espermatozoides. Por ejemplo, de acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se administra a las hembras por vía vaginal. En este caso, el agente peptídico similar a La-1 se puede formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración.
Las composiciones que contienen el agente peptídico similar a La-1 para administración vaginal pueden estar en cualquier forma adecuada, incluidas cremas o geles, preferentemente en forma de supositorio. Estas formas pueden contener, además del péptido activo, excipientes adecuados, conocidos por la persona experta.
Las composiciones se pueden administrar a seres humanos o animales. Las composiciones pueden estar en forma de solución, suspensión, gel, crema, leche, cápsula, tableta y/u otras formas adecuadas para la administración a seres humanos o animales.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se puede usar para el tratamiento de la infertilidad masculina en mamíferos, particularmente en humanos.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se puede usar para el tratamiento de astenozoospermia y/u oligozoospermia.
El solicitante demostró la actividad biológica del péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1 (véase Ejemplos 2, 3 y 4).
En el Ejemplo 2, Se incubaron muestras de espermatozoides humanos con soluciones del péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1. Los resultados mostrados en la Figura 2B demuestran un aumento en la motilidad de los espermatozoides después de la incubación. Además, cuanto más lentos eran los espermatozoides inicialmente, más efectivo era el péptido para aumentar su velocidad. El panel superior izquierdo muestra que los espermatozoides que tienen una velocidad de seguimiento inicial baja (unidades PV) tenían una activación de motilidad más alta en comparación con aquellos con velocidades de seguimiento iniciales más altas (CL). De manera similar, en el panel superior derecho, los espermatozoides que tenían una velocidad de trayectoria inicial baja (VAP) experimentaron aumentos de hasta un 80 %, mientras que los que tenían una VAP inicial de 60 pm/s tuvieron un aumento de aproximadamente un 20 % en la motilidad.
El panel inferior izquierdo de Figura 2B muestra los resultados de una prueba, donde se midió el efecto de incubación con el péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1 sobre la amplitud lateral del espermatozoide humano (ALH, véase la Figura 2A). El aumento porcentual se indica en el eje Y. Los espermatozoides que tenían una amplitud lateral inicial de menos de 3,5 pm tuvieron mayores aumentos que aquellos con valores iniciales de ALH más altos. En el panel inferior derecho, se midió el efecto del péptido sobre la velocidad progresiva (VSL). Los espermatozoides que tenían un avance inicial de velocidad de menos de 30 pm/s mostraron un aumento de entre el 20 y casi el 120 %, con solo un valor atípico. Aquellos con un VSL inicial de aproximadamente 40 pm/s mostraron un aumento de entre el 20 y el 55 %, mientras que aquellos con un VSL inicial de más de 60 pm/s mostraron un aumento del 5 al 20 % debido a la incubación con el péptido.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 aumenta la motilidad de los espermatozoides de mamíferos medida mediante el uso de al menos uno de los siguientes parámetros: velocidad de seguimiento, velocidad de trayectoria, amplitud natural, velocidad no progresiva y velocidad progresiva.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 es particularmente efectivo para el tratamiento de la astenozoospermia. De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 aumenta la motilidad progresiva (velocidad inicial de más de 30 pm/s) de los espermatozoides de mamíferos. En una modalidad preferida, el agente aumenta la motilidad no progresiva (velocidad inicial de entre 1 y 30 pm/s) de los espermatozoides de mamíferos.
En determinadas técnicas de reproducción artificial, como la fertilización in vitro (IVF), en particular, la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), es conveniente tratar los espermatozoides que se usarán con un agente para activar la motilidad de los espermatozoides. Este procedimiento también se puede usar en técnicas de
inseminación artificial, incluida la IUI. Este tratamiento puede comprender la etapa de incubar la muestra de espermatozoides que se usará con un agente activador.
De acuerdo con una modalidad de la presente descripción, el agente peptídico similar a La-1 se puede incubar con muestras de espermatozoides para su uso en técnicas de reproducción artificial, que incluyen IVF, en particular ICSI.
De acuerdo con una modalidad de la presente descripción, el agente peptídico similar a La-1 se puede incubar con muestras de espermatozoides para usar en métodos de inseminación artificial, por ejemplo IUI. En una modalidad de la invención, la inseminación artificial se puede realizar con fines terapéuticos, en humanos y/o animales.
En una modalidad de la invención, la inseminación artificial se puede llevar a cabo con fines no terapéuticos en animales. En este caso, el uso del agente peptídico similar a La-1 se puede usar para aumentar la fertilidad de los animales y/o aumentar la tasa de fertilización obtenida en procedimientos artificiales.
De acuerdo con una modalidad de la invención, la incubación del agente peptídico similar a La-1 con la muestra de espermatozoides se puede llevar a cabo de acuerdo con métodos conocidos por la persona experta.
El péptido que se va a usar puede estar presente en una solución adecuada, por ejemplo, en un medio que soporte la supervivencia o la capacitación de los espermatozoides. La concentración final del péptido (después de que se haya mezclado con el esperma) puede estar en el intervalo de 0,01 micromolar a 1 micromolar (pM). De acuerdo con una modalidad preferida de la invención, para los espermatozoides bovinos, se prefiere una concentración de 0,1 pM.
En general, se puede añadir una cantidad de la solución/suspensión de espermatozoides a un recipiente adecuado que contenga los espermatozoides que se van a tratar. Por ejemplo, para tratar 1 millón de células en 1 mililitro de medio de esperma, se puede añadir una cantidad de agente peptídico similar a La-1 en el intervalo de 0,1 a 0,2 nanomoles. Los espermatozoides pueden estar presentes en un tampón adecuado, por ejemplo, un medio conocido por permitir la supervivencia de los espermatozoides. Se puede citar, por ejemplo, medio talp para espermatozoides bovinos, medio M2 para espermatozoides de ratón, fluido humano sintético (HTF) para espermatozoides humanos o cualquier medio de espermatozoides que permita la supervivencia de los espermatozoides, por ejemplo, como se describió en Fraser LR (1993) In vitro capacitation and fertilization. Methods in enzymology 225, p. 239-253.
De acuerdo con una modalidad de la invención, para el tratamiento de espermatozoides bovinos en, por ejemplo, un método IUI, se prefiere una concentración final de agente peptídico similar a La-1 de 0,1 pm. El tiempo de incubación puede variar de 1 minuto a 20 minutos, preferentemente de 5 minutos a 15 minutos, con mayor preferencia de 8 minutos a 10 minutos. El tiempo de incubación puede, por supuesto, variar de acuerdo con la temperatura que se usó y la concentración del agente peptídico similar a La-1 que se usó y otros factores, pero la persona experta puede determinar fácilmente las condiciones de incubación adecuadas que se usarán.
De acuerdo con una modalidad de la invención, la temperatura de incubación puede variar de 35 °C a 39 °C, por ejemplo 38 °C.
Durante y/o después de la incubación con el agente activador de la motilidad, el aumento de la motilidad de los espermatozoides se puede medir por observación de la muestra de espermatozoides bajo un microscopio u otro medio de observación, o mediante el uso de una máquina clasificadora de células u otro aparato que permita medir motilidad de las células. Esto permite la selección de los espermatozoides en la muestra para su uso posterior en el procedimiento TRA.
De acuerdo con una modalidad de la invención, la motilidad de los espermatozoides se mide como uno cualquiera o más de los siguientes parámetros: velocidad de seguimiento, velocidad de trayectoria, amplitud natural, velocidad no progresiva y velocidad progresiva. Los parámetros que se prefieren son la velocidad no progresiva y la velocidad progresiva.
De acuerdo con una modalidad de la invención, los espermatozoides más móviles en la muestra de espermatozoides se pueden seleccionar para su uso en el procedimiento dado. Por ejemplo, se puede seleccionar el 10 %, el 20 %, el 30 %, el 40 % o el 50 % de los espermatozoides más móviles. Preferentemente, se selecciona el 50 % más móvil de los espermatozoides.
El número de espermatozoides seleccionados dependerá de la técnica de fertilización que se use.
Por ejemplo, para ICSI, el espermatozoide más móvil se usa para la introducción en el óvulo.
En las técnicas de IVF en las que el óvulo de mamífero se incuba con varios espermatozoides, se elige un número adecuado de espermatozoides.
En las técnicas de inseminación artificial, por ejemplo, en la IUI, se pueden usar sustancialmente todos los espermatozoides, o al menos el 50 %, o al menos el 60 %, o al menos el 70 %, o al menos el 80 %, o al menos el 90 % de se pueden usar los espermatozoides.
Alternativamente, no se realiza ninguna selección, y en el procedimiento se usa toda, o sustancialmente toda, la muestra de espermatozoides. Este puede ser el caso, por ejemplo, del uso de técnicas industriales de inseminación artificial para su uso en animales. En este caso, el agente peptídico similar a La-1 se usa para aumentar la fertilidad del animal macho. Esto conduce a un aumento en la tasa de fertilización obtenida en el procedimiento.
El agente peptídico similar a La-1 de acuerdo con diversas modalidades de la invención se puede usar para activar la motilidad de los espermatozoides de mamíferos. Las especies preferidas incluyen humanos, bovinos, porcinos, caprinos, ovinos, perros y gatos.
De acuerdo con otra modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se usa para aumentar la tasa de fertilización en una técnica de reproducción artificial en animales. Los animales preferidos son bovinos, ovinos y porcinos.
Para todas las técnicas mencionadas, en las que los espermatozoides se incuban in vitro con el agente peptídico similar a La-1, este último agente se puede eliminar opcionalmente antes de que la muestra de espermatozoides se introduzca en el mamífero hembra.
El ejemplo 3 demuestra que el agente peptídico similar a La-1 de acuerdo con una modalidad de la invención, que comprende el péptido de acuerdo con s Eq ID NO. 1, aumenta la tasa de fertilización en un experimento de fertilización in vitro en ratones. La tasa de fertilización se midió de acuerdo con el número de embriones de ratones en la etapa de dos células. Los resultados indican que en presencia del agente peptídico similar a La-1, la tasa de fertilización se incrementó en aproximadamente un 20 % en comparación con el control. Estos datos también indican que el agente peptídico similar a La-1 no es tóxico y no previene el desarrollo del embrión.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 aumenta la tasa de fertilización en un procedimiento de fertilización in vitro, en particular, ICSI. En particular, la ICSI se realiza en humanos.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 aumenta la tasa de fertilización en un procedimiento de inseminación artificial, en particular IUI. La IUI se puede realizar en humanos o animales por razones terapéuticas para tratar la infertilidad masculina.
En algunos varones infértiles, el proceso de maduración de los espermatozoides que tiene lugar en el epidídimo es disfuncional y es conveniente estimular el proceso de maduración en un tratamiento in vitro sobre los espermatozoides, que se extrajeron de los testículos. Una vez que los espermatozoides maduran, se pueden usar para procedimientos de fertilización in vitro.
El Ejemplo 4 describe cómo la incubación del péptido de acuerdo con SEQ NO.1 con espermatozoides testiculares de primates no humanos conduce a un aumento tanto de la velocidad no progresiva como de la velocidad progresiva de los espermatozoides en la muestra. Los resultados se muestran en las Figuras 3 y 4. El aumento de la motilidad en estos espermatozoides testiculares es comparable al que ocurre en el proceso de maduración que ocurre de forma habitual en el epidídimo.
Los espermatozoides testiculares que demostraron una motilidad aumentada después del tratamiento con el agente peptídico similar a La-1, de acuerdo con una modalidad de la invención, se pueden seleccionar para su uso en un procedimiento de IVF, por ejemplo, un procedimiento de ICSI. De acuerdo con una modalidad de la invención, se puede incubar una muestra de agente peptídico similar a La-1 con una muestra de espermatozoides testicular. El agente se usa a una concentración adecuada, por ejemplo, de 0,01 micromolar a 1 micromolar. Las muestras de espermatozoides se usan en concentraciones adecuadas, por ejemplo, 1 millón/ml. Por ejemplo, para tratar 1 millón de células en 1 mililitro de medio de esperma, se puede agregar una cantidad en el intervalo de 0,1 a 0,2 nanomoles.
La muestra de espermatozoides testicular puede estar presente en un tampón adecuado. El agente de activación se almacena, en general, en un tampón adecuado. El período de incubación puede ser de 1 minuto a 20 minutos y se controla visualmente mediante un microscopio u otros medios de observación o por otros medios, incluidos el uso de una máquina clasificadora de células.
En otra modalidad de la invención, el agente activador se usa para aumentar la motilidad de los espermatozoides en una muestra de espermatozoides del epidídimo. En este caso, se puede usar el mismo protocolo o uno similar a los descritos anteriormente.
El aumento de la motilidad de los espermatozoides se puede monitorear durante y/o después de la incubación con el agente peptídico similar a La-1. El aumento de la motilidad se puede medir mediante el uso de uno o más de los
siguientes parámetros: velocidad de seguimiento, velocidad de la trayectoria, amplitud natural, velocidad no progresiva y velocidad progresiva.
En una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se usa para aumentar la motilidad de los espermatozoides en una muestra de espermatozoides eyaculada.
En una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se usa para aumentar la motilidad de una muestra de espermatozoides que se congela previamente. La muestra de espermatozoides puede ser una muestra eyaculada o una que se toma del epidídimo o de los testículos.
Esto es particularmente relevante en las técnicas de reproducción artificial, donde a menudo las muestras de espermatozoides se congelan y se guardan para su uso posterior. Se sabe que la congelación de muestras de espermatozoides a menudo reduce su motilidad. En el Ejemplo 5, se incubaron muestras de espermatozoides humano fresco y congelado con el péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1. Se midió la motilidad progresiva y no progresiva de las muestras. Los resultados, que se muestran en la Figura 5, indican que la incubación con el agente peptídico similar a La-1 aumenta la motilidad progresiva así como también la motilidad no progresiva tanto en muestras de espermatozoides fresco (panel izquierdo) como en muestras congeladas (panel derecho). Los datos también sugieren que el efecto es mayor para las muestras congeladas que para las muestras frescas.
El agente activador también puede ponerse en contacto con los espermatozoides in vivo. En este caso, el agente activador se puede administrar localmente en la vagina o el cuello uterino de la hembra antes de que tenga lugar la inseminación.
En una modalidad de la invención, el agente activador de la motilidad está en forma de gel, cápsula, leche o crema u otra forma adecuada para la administración local en el tracto vaginal y/o el área cervical de la hembra. Por tanto, el agente activador de la motilidad se puede administrar localmente a la hembra en el área vaginal o cervical. Así, cuando la hembra se insemina, los espermatozoides entran en contacto con el agente activador.
En una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede estar presente con otros agentes que pueden ser los que de manera habitual están presentes en el medio o tampón que se usó para estabilizar las células y el agente peptídico, respectivamente.
De acuerdo con una modalidad de la invención de la invención, el agente peptídico similar a La-1 puede estar presente con otros agentes conocidos que pueden facilitar la fertilización, como por ejemplo, papaverina u otros agentes. Estos agentes adicionales pueden estar presentes cuando el agente peptídico similar a La-1 se usa para procedimientos de inseminación artificial o cuando se usa para inseminación natural.
En una modalidad de la invención, el agente peptídico similar a La-1 se usa para métodos de inseminación artificial, por ejemplo, IUI. Estos métodos también son objeto de la invención. La IUI se puede realizar en animales con fines industriales. En este caso, el agente peptídico similar a La-1 se usa para aumentar la fertilidad de los animales. El procedimiento de inseminación artificial se puede llevar a cabo mediante los métodos conocidos por la persona experta.
Por ejemplo, los espermatozoides que se usarán en la inseminación se puede poner en contacto con el agente peptídico similar a La-1 in vitro antes de que tenga lugar la inseminación. En este caso, tanto el agente peptídico similar a La-1 como los espermatozoides se incuban en un recipiente o jeringa adecuados. Los espermatozoides pueden estar presentes como semen o en un tampón de medio adecuado. El agente activador de la movilidad de los espermatozoides puede estar presente en un tampón adecuado.
El agente peptídico similar a La-1 se puede introducir dentro de la pajita de esperma, antes de congelar. De acuerdo con otra modalidad de la invención, durante un procedimiento de inseminación artificial, el péptido similar a La-1 se inyecta conjuntamente con el esperma.
De acuerdo con otra modalidad de la invención, durante un procedimiento de inseminación artificial, los espermatozoides y el agente peptídico similar a La-1 se pueden incubar juntos durante un cierto período de tiempo, por ejemplo, de 1 a 20 minutos, preferentemente de 5 a 15 minutos, antes de la inyección en el mamífero hembra.
Los espermatozoides y el agente peptídico similar a La-1 también se pueden mezclar sin una etapa de incubación específico justo antes de la inseminación.
Para la inseminación, los espermatozoides y el agente peptídico similar a La-1 se pueden inyectar en el tracto vaginal o el área cervical de la hembra. Los animales que se pueden usar en estos métodos incluyen bovinos, ovinos, equinos, perros y gatos, aves, por ejemplo pollos, pavos y otras aves que se producen industrialmente.
El agente peptídico similar a La-1 aumenta la tasa de fertilización del procedimiento. Esto tiene un enorme beneficio en tiempo y costo para el usuario, lo que le permite reducir el número de intervenciones realizadas por descendencia obtenida.
En un aspecto, se describe un método para aumentar la tasa de fertilización en un procedimiento de inseminación artificial en un animal. El método comprende las etapas de:
a) poner en contacto una muestra de espermatozoides de un animal con una cantidad terapéuticamente efectiva del agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1;
b) retirar opcionalmente el agente peptídico similar a La-1;
c) inseminar artificialmente al animal hembra con dicha muestra de espermatozoides y, si está presente, el agente peptídico similar a La-1;
d) medir la tasa de fecundidad.
Los siguientes son ejemplos que ilustran el efecto biológico del agente de motilidad de los espermatozoides y no son en modo alguno limitantes.
Ejemplo 1
Separación de veneno y aislamiento de péptidos similares a La-1
Origen del veneno
El veneno crudo de Maurus palmatus se obtuvo de Alphabiotoxine Laboratory (Montroeul-au-bois, BELGIUM) or Venomtech (Sandwich, Kent, UK). Se disolvieron diez mg de veneno crudo liofilizado en 500 pL de acetato de amonio 100 mM pH 6,8 y se centrifugaron a 10 000g durante 10 minutos. Se usaron doscientos cincuenta microlitros de sobrenadante para purificaciones adicionales.
Purificación por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC)
La separación se realizó en una columna de filtración en gel Superdex_peptide 10/300 GL, con elución a 0,5 ml/minuto en acetato de amonio 100 mM, pH 6,8. Se recogieron fracciones cada minuto y se monitoreó la absorbancia a 225 nm. Las fracciones se mantuvieron a -20 °C hasta que se llevó a cabo el cribado de bioactividad y el análisis de espectrometría de masas.
Purificación de péptido similar a La-1 a partir del veneno crudo de M. palmatus Prepurificación por extracción en fase sólida (SPE)
El veneno liofilizado crudo de M. palmatus (2 mg) se disolvió en 200 uL de ácido trifluoroacético al 0,1 % (TFA al 0,1 %) y se purificó previamente en dos SepPak C18 Light enlazados en serie (Waters Corporation, Milford, MA), siguiendo las instrucciones del fabricante y se eluyó con 3 ml de acetonitrilo (ACN) al 80 % en TFA al 0,1 %. La fracción eluida al 80 % se secó al vacío mediante el uso de un sistema de vacío rápido (Labconco, Freezone 2.5plus, Kansas City, MO) y se suspendió en TFA al 0,1 %.
Análisis por cromatografía líquida en línea acoplada a espectrometría de masas en tándem de ionización por electropulverización (LC-ESI-Ms /MS)
Se inyectó una fracción alícuota de un equivalente de 200 pg de veneno crudo para análisis LC-ESI-MS/MS en línea en un sistema HPLC HP-1290 de Agilent (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La separación se realizó en un Accucore C-is columna (2,1 mm x 150 mm de Thermo Scientific, Bremen, Alemania), mantenida a 35 °C y acoplada en línea a un Thermo Q-Exactive Orbitrap. El solvente A era ácido fórmico al 0,1 % y B era acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1 %. Se aplicó un gradiente lineal, que comienza desde 4 % B hasta 60 % B durante 120 minutos a régimen de flujo de 350 pL/minuto para fraccionar los componentes del veneno. El espectrómetro de masas de alta resolución se hizo funcionar en polaridad positiva y en modo dependiente de los datos. El Q-Exactive Orbitrap adquirió un escaneo de rango completo de 380 a 2000 Th (resolución 70000, objetivo AGC 3.106, IT máximo 200 ms) y luego fragmentó los diez iones peptídicos principales en cada ciclo (resolución 17500, objetivo AGC 105, IT máximo 100 ms, umbral de intensidad 2x104, excluyendo iones de carga no asignados, energía de colisión normalizada que se seleccionó en 27. A continuación, los iones originales se excluyeron de MS/MS durante los siguientes 15 segundos. El software Chemstation B.04.03 y Xcalibur™ 2.2 se usaron para controlar la HPLC y el espectrómetro de masas, respectivamente.
Aislamiento de péptido nativo similar a La-1 mediante HPLC de fase reversa
Para aislar la fracción bioactiva, se inyectó un equivalente de 1,7 mg de veneno crudo mediante el uso de un sistema HPLC HP-1290 de Agilent en las mismas condiciones de elución que se detallan anteriormente. Las fracciones se
recogieron a mano siguiendo la absorbancia controlada a 225 nm, se secaron al vacío y se mantuvieron secas hasta su uso.
Ejemplo 2
Prueba de velocidad que se realizó en espermatozoides humanos tratados con el péptido SEQ ID NO. 1
Los espermatozoides humanos se obtuvieron de la consulta de pacientes en el departamento de fertilidad de Grenoble, tras la aprobación del comité de ética y el consentimiento informado de los pacientes. Todos los pacientes dieron su consentimiento informado para la conservación de los espermatozoides remanentes en el biobanco Germetheque y su uso en estudios sobre fertilidad humana de acuerdo con la Declaración de Helsinki de 1975 sobre experimentación humana. El Comité Científico de Germetheque aprobó el diseño del presente estudio. El eyaculado se licuó a 37 °C durante 30 minutos y los espermatozoides se lavaron dos veces en medio de preparación de espermatozoides (Origio, Málov, Dinamarca) a 500 g durante 5 minutos. A continuación, se ajusta la concentración para el análisis CASA. Los espermatozoides también se congelaron con SpermFreeze (Fertipro NV, Beernem, Bélgica) para su posterior análisis como espermatozoides congelados.
Análisis de motilidad asistido por computadora (CASA)
Después de 10 minutos de incubación con el péptido de acuerdo con SEQ ID NO. 1 (natural o sintetizada), la suspensión de espermatozoides se colocó inmediatamente en una cámara de análisis (Leja Products BV, Países Bajos) de 100 pm de profundidad para espermatozoides de ratón y 20 pm de profundidad para espermatozoides humanos, NHP y bovino, y se mantuvo a 37 °C para el estudio cuantitativo microscópico del movimiento de los espermatozoides. Los parámetros de motilidad de los espermatozoides se midieron a 37 °C mediante el uso de un analizador de espermatozoides (Hamilton Thorn Research, Beverley). Los ajustes empleados para el análisis fueron los siguientes para humanos, NHP, bovinos y ratones, respectivamente: velocidad de adquisición (60; 60; 60; 60) Hz; número de fotogramas: (30; 20; 30;45); contraste mínimo: (80;80;80;50); tamaño mínimo de celda: (3;4;5;5); puerta de bajo tamaño estático: (0,85;0,79;0,1;0,3); puerta de alto tamaño estático: (4,24;2,52;3,4;1,95); puerta de baja intensidad estática: (0,39;0,62;0,3;0,5); puerta de alta intensidad estática: (1,4;1,4;1,7;1,3); puerta de mínima elongación: (0;2;8;0); puerta de alargamiento máximo: (85;50;97;87); factor de aumento: (1,89;1,89;1,89;0,7). Los parámetros de motilidad medidos fueron la velocidad curvilínea (VCL) y la amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza (ALH). Se analizó un mínimo de 100 espermatozoides móviles para cada ensayo. Los espermatozoides móviles se definieron por VAP> (1;1;1;1) y los espermatozoides progresivos se definieron por VAP>(25;25;50;30) y STR>(80;80;70;70).
Medición de la vitalidad de los espermatozoides.
Se mezclaron cuarenta pL de espermatozoides con 20 pL de eosina al 1 % diluido 9/1000 en NaCl y 20 pL de nigrosina al 10 % diluido 9/1000 en NaCl. A continuación, los espermatozoides se colocaron en capas sobre un portaobjetos de vidrio y se secaron. Se analizó un mínimo de 100 espermatozoides para cada ensayo.
Los datos se muestran en la Figura 2.
Ejemplo 3
Estudio de fertilización en ratones
Se recolectaron huevos de hembras OF1 maduras, sincronizadas con 5 unidades de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y 5 unidades de gonadotropina coriónica humana (hCG). Los espermatozoides se capacitaron durante 55 minutos en M162 % BSA (37 °C, 5 % CO2) y se introdujeron en gotitas que contenían ovocitos. El péptido activo se introdujo en gotitas al mismo tiempo. Los ovocitos se incubaron con 1,5 x 105 hasta 5 x 105 espermatozoides capacitados/ml (37 °C, 5 % CO2) en medio M16 y los espermatozoides sueltos se lavaron después de 4 horas de incubación. Veinticuatro horas después de la fertilización, se puntuaron las diferentes etapas, es decir, los ovocitos no fertilizados (incluidos los embriones abortados y correspondientes a los ovocitos fragmentados u ovocitos bloqueados después de la extrusión del segundo cuerpo polar) y los embriones de 2 células (como indicación de una fertilización exitosa).
Ejemplo 4
Activación de la motilidad en espermatozoides testiculares de macaca
Los testículos de macaca se recolectaron después de la eutanasia. Los túbulos seminíferos se rompieron mediante trituración manual en DMEM con una elevada concentración de glucosa. Se realizó un lavado a 37 °C durante 30 minutos y la fracción superior se lavó dos veces con DMEM con una elevada concentración de glucosa. La concentración de espermatozoides se ajustó para el análisis de espermatozoides asistido por ordenador (CASA).
Claims (14)
1. Un agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1, para su uso como medicamento.
2. Un agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1, para el tratamiento de la infertilidad masculina.
3. El agente peptídico similar a La-1 o el péptido biológicamente activo de la reivindicación 2, en donde el péptido La-1 activa la motilidad de los espermatozoides de mamíferos.
4. El agente peptídico similar a La-1 o el péptido biológicamente activo de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los espermatozoides de mamífero se eligen entre humanos, bovinos, porcinos, ovinos, equinos, caprinos y animales domésticos, en particular gatos y perros.
5. El agente peptídico similar a La-1 o el péptido biológicamente activo de acuerdo con las reivindicaciones 3 o 4, en donde se pone en contacto in vivo con el esperma.
6. El agente peptídico similar a La-1 o el péptido biológicamente activo de acuerdo con la reivindicación 5, en donde se encuentra en forma de una composición farmacéutica para administración en el tracto vaginal y/o cervical a una hembra antes de la inseminación.
7. El agente peptídico similar a La-1 o el péptido biológicamente activo de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 5, en donde se encuentra en forma de una composición farmacéutica para administración local al hombre, preferentemente mediante inyección en el epidídimo o testículo.
8. Un método in vitro para activar la motilidad de espermatozoides de mamíferos que comprende poner en contacto in vitro un agente peptídico similar a La-1 biológicamente activo que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1 con esperma.
9. El método de la reivindicación 8, en donde los espermatozoides de mamífero se eligen entre humanos, bovinos, porcinos, ovinos, equinos, caprinos y animales domésticos, en particular gatos y perros.
10. Un método in vitro de selección de espermatozoides para su uso en un procedimiento de fertilización in vitro humana que comprende las etapas:
a. poner en contacto una muestra de espermatozoides con una cantidad terapéuticamente efectiva de agente peptídico similar a La-1 biológicamente activo que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1;
b. observar y medir la movilidad de los espermatozoides mediante el uso de al menos un parámetro elegido entre la velocidad de seguimiento, la velocidad de la trayectoria, la amplitud natural, la velocidad no progresiva y la velocidad progresiva;
c. seleccionar los espermatozoides con mayor movilidad de acuerdo con los criterios usados en el procedimiento de IVF particular que se usará.
11. El método de la reivindicación 10, en donde los espermatozoides a tratar tienen una motilidad inicial de entre 1 y 30 |jm/s.
12. El método de la reivindicación 10, en donde los espermatozoides a tratar tienen una motilidad inicial de al menos 30 jm/s.
13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde los espermatozoides se eligen entre humanos, bovinos, porcinos, ovinos, equinos, caprinos y animales domésticos, en particular gatos y perros.
14. Un agente peptídico similar a La-1 que comprende la SEQ ID NO. 1 o un péptido biológicamente activo que tiene al menos 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 95 % de identidad de secuencia de aminoácidos con SEQ ID NO.1, para su uso en un método para aumentar la fertilidad de un animal.
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