ES2941264T3 - Método para aumentar la vida útil y motilidad del esperma animal utilizando un inhibidor del canal de potasio Slo3 - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un método para aumentar la vida útil de los espermatozoides animales que comprende poner en contacto dichos espermatozoides con un inhibidor del canal de potasio Slo3. La invención también se refiere al uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3, para aumentar la vida útil del esperma animal o la motilidad del esperma animal capacitado, que comprende poner en contacto un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma. Además, la invención se refiere a un instrumento de inseminación artificial para uso en la inseminación artificial de un animal, que comprende esperma animal en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3. La invención también se refiere a un método para inseminar artificialmente a un animal utilizando dicho instrumento de inseminación artificial. Eventualmente, la invención se relaciona con un método para aumentar la fertilidad de un animal, que comprende poner en contacto el esperma de dicho animal con un inhibidor del canal de potasio Slo3; luego inseminar artificialmente dicho animal con dicho esperma. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Método para aumentar la vida útil y motilidad del esperma animal utilizando un inhibidor del canal de potasio Slo3

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un inhibidor de un canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la vida útil del esperma animal (es decir, no humano). La invención también se relaciona con un inhibidor de un canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la motilidad del esperma animal (es decir, no humano), en particular del esperma capacitado. La invención también se relaciona con un instrumento de inseminación artificial, un método in vitro para inseminar artificialmente a un animal, así como un inhibidor del canal de potasio Slo3 para usar en un método para aumentar la fertilidad de un animal. La presente invención también se relaciona con el uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3 para aumentar la vida útil del esperma animal (es decir, no humano), al uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3 para aumentar la motilidad de esperma capacitado animal (es decir, no humano), un método para aumentar la vida útil del esperma animal (es decir, no humano) y un método para aumentar la motilidad del esperma animal capacitado (es decir, no humano).

Antecedentes de la invención

La prevalencia de la inseminación artificial (AI) es cercana al 100 % en la reproducción del ganado lechero, donde se deposita semen en el tracto vaginal o útero de la hembra, con el fin de aumentar el uso de semen masculino de alto valor genético. Sin embargo, la rata de concepción de ganado por inseminación artificial ha disminuido durante los últimos veinte años. Un factor importante que contribuye a la baja rata de concepción es la imposibilidad de determinar el momento de ovulación.

Cuando falla la concepción, es necesario repetir la inseminación artificial (AI), por ejemplo, en el ganado hembra, lo que impone una carga a los ganaderos. Por lo tanto, existe la necesidad de un método de inseminación artificial con una rata de concepción mejorada. La congelación de esperma suele ser necesaria en las tecnologías de reproducción artificial, en particular para el esperma bovino. Para la inseminación artificial del ganado se suele utilizar semen congelado en alícuotas en pajillas de semen y conservado en nitrógeno líquido.

Una pajilla de semen para la crioconservación generalmente se prepara diluyendo el semen en al menos un diluyente (generalmente en un diluyente primario y luego en un diluyente secundario, que generalmente es el diluyente primario complementado con el agente crioprotector). Las pajillas se llenan con este semen diluido y se congelan.

Los espermatozoides (esperma) son células y, por lo tanto, son sensibles a la congelación. Se debe agregar al menos un crioprotector al diluyente para evitar la muerte celular. El glicerol, azúcares (glucosa, fructosa, lactosa y rafinosa) y lípidos (yema de huevo o lípidos sintéticos) suelen utilizarse como crioprotectores para mejorar la rata de supervivencia y la capacidad de fertilización de los espermatozoides después de la congelación y descongelación. A pesar del uso de crioprotectores en diluyentes, la congelación generalmente afecta negativamente la viabilidad del esperma. De hecho, los espermatozoides que han sido previamente congelados, una vez descongelados, tienen una motilidad reducida en comparación con las muestras de semen fresco. La crioconservación conduce a la disminución de la motilidad, viabilidad y vida útil del esperma. Los agentes que activan la motilidad y/o conservan la motilidad, en particular después de la congelación, pueden tener un impacto positivo en la rata de éxito de la reproducción artificial en numerosas especies, como caballos, cerdos, ganado y aves de corral (por ejemplo, pavos).

Otro inconveniente del proceso de congelación es la aceleración del proceso de maduración del esperma, conocido como capacitación. La capacitación es una etapa necesaria de maduración, que normalmente ocurre en el tracto femenino. Aunque necesaria, la capacitación conduce a cambios espermáticos irreversibles y eventualmente a daños que disminuyen la calidad del semen, motilidad y capacidad de fertilizar un ovocito. La capacitación está asociada con un fuerte aumento de la actividad metabólica y disminuye la vida útil general del esperma dentro del tracto reproductivo femenino. Esto es particularmente dañino cuando la inseminación no está sincronizada con la ovulación.

Santi C.M. et al. (2010), "The Slo3 sperm-specific potassium channel plays a vital role in male fertility", Febs letters, vol.

584, p. 1041-1046, describe cómo un canal de potasio SLo3 en funcionamiento es esencial para la fertilidad masculina. Los autores demuestran esto mediante el uso de una mutación nula del gen anulado SLo3 (Kcnu1). Brenker C. (2014), "The Ca2+ activated K+ current of human sperm is mediated by Slo3", ELIFE, 1 de enero de 2014, explora las diferencias entre las funciones del canal Slo 3 en esperma humano y en esperma de ratón. Los autores:

- identifican la proteína Slo3 en el flagelo del esperma humano,

- divulgan que, en esperma humano, la corriente K+ principal (ksper) se activa débilmente por el pH intracelular (pHi) y más fuertemente por Ca2+ (esto es contrario al caso del esperma de ratón),

- muestran que el Slo3 de ratón no es activado por Ca2+ intracelular, y

- muestran que el clofilio inhibe irreversiblemente el Slo3 humano.

Navarro et al. (2008), "Ion channel that control fertility in mammalian spermatozoa", Int. J. Dev. Biol. 52, pág. 607-613, resume las corrientes de los canales de iones que se han medido directamente en el esperma de los mamíferos y sus funciones fisiológicas en el proceso de fertilización. El documento indica que las corrientes predominantes fueron 1) un corriente de Ca2+ selectiva que requiere la expresión de los genes 4 mCatSper y 2) un rectificador retardado de corriente K+ con propiedades más similares a mSLo3.

El documento US 6815539 B1, publicado el 9 de noviembre de 2004, divulga secuencias aisladas de ácidos nucleicos y aminoácidos de Slo3, anticuerpos contra Slo3 y métodos de selección de inhibidores de Slo3.

Por tanto, existe la necesidad de agentes que puedan aumentar la rata de concepción para uso en procedimientos industriales de inseminación artificial de animales (en particular mamíferos y aves, más particularmente mamíferos domésticos y aves de corral), en particular cuando la inseminación artificial requiere la congelación de esperma.

Sumario de la invención

Los inventores han descubierto que los inhibidores del canal de potasio Slo3, en particular bario, mibefradil, clofilio y/o quinidina, más particularmente clofilio y/o quinidina, pueden usarse para aumentar la vida útil del esperma animal.

Esto conduce a un aumento del tiempo de almacenamiento del esperma y a una mejora de la capacidad del esperma para fertilizar después de un largo período (por ejemplo, 24 horas o 48 horas) de capacitación. De acuerdo con la invención, la motilidad del esperma capacitado aumenta sorprendentemente, en particular después de un largo período (por ejemplo, 24 horas o 48 horas) de capacitación. El aumento de la vida útil del esperma hace posible que el esperma, en particular el esperma capacitado, introducido antes de la ovulación, permanezca vivo durante más tiempo en el tracto reproductivo femenino y muestren motilidad y capacidad para fertilizar un ovocito en el sitio de ovulación en la fecha de ovulación de la hembra, por ejemplo, la vaca, lo que permite aumentar la rata de concepción de una población animal.

Por lo tanto, la invención se relaciona con un inhibidor de un canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la vida útil de esperma animal, en donde dicho inhibidor se pone en contacto in vivo con dicho esperma animal y dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con un inhibidor de un canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la motilidad de esperma animal capacitado, en donde dicho inhibidor se pone en contacto in vivo con dicho esperma animal capacitado y dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se refiere al uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3 para aumentar la vida útil del esperma animal, que comprende ponerse en contacto in vitro con un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se refiere al uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3 para aumentar la motilidad de esperma animal capacitado, que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal capacitado, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se refiere a un instrumento de inseminación artificial que comprende esperma animal en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3, en donde dicho esperma animal no es esperma humano. Dicho instrumento de inseminación artificial es preferiblemente una pajilla de semen para crioconservación.

La invención también se refiere a un método in vitro para inseminar artificialmente a un animal, que comprende el uso de dicho instrumento de inseminación artificial.

La invención también se refiere a un inhibidor del canal de potasio Slo3 para uso en un método para aumentar la fertilidad de un animal, comprendiendo dicho método las siguientes etapas sucesivas:

a) Poner en contacto el esperma de dicho animal con el inhibidor del canal de potasio Slo3;

b) Inseminar artificialmente a dicho animal con el esperma procedente de la etapa a), en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La presente invención también se refiere a un método para aumentar la vida útil del esperma animal, que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal, en donde dicho esperma animal no es esperma humano. La presente invención también se refiere a un método para aumentar la motilidad de esperma animal capacitado, que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal capacitado, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La presente invención se define en el conjunto de reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención

El canal de potasio Slo3 se conoce como un canal de potasio clave involucrado en la capacitación. La eliminación genética de Slo3 conduce a la infertilidad masculina y los inhibidores del canal de potasio Slo3 se conocen como bloqueadores de la fertilización, al prevenir la hiperpolarización del esperma y la afluencia de Ca2+ que ocurre durante la capacitación, dos eventos que se sabe que son necesarios para la competencia de fertilidad del esperma.

Como resultado de la intensa investigación llevada a cabo por los inventores sobre la supervivencia de los espermatozoides en pajillas para inseminación artificial y sobre la capacidad de fertilizar y la motilidad del esperma animal, en particular del esperma capacitado, los presentes inventores han encontrado que la vida útil del esperma animal y la motilidad del esperma animal capacitado pueden mejorarse sorprendentemente cuando se prepara una pajilla para inseminación artificial que comprende el semen en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3. La vida útil del esperma animal también puede mejorar sorprendentemente cuando el semen recién eyaculado está en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3. La motilidad del esperma capacitado animal también se puede mejorar sorprendentemente cuando el esperma recién eyaculado se pone en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3 y se capacitan en un medio capacitador que contiene un inhibidor del canal de potasio Slo3.

Se describe un inhibidor del canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la fertilidad de un animal en métodos de producción animal, incluidos los métodos de inseminación artificial en los que el esperma está en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3.

En la presente invención, el término "A y/o B" significa "A", o "B", o "A y B".

En la presente invención, un "medio de capacitación" es un medio en el cual los espermatozoides pueden sufrir capacitación.

En la presente invención, un "medio de congelación" (o medio protector) es un medio que protege las células de los daños causados por la congelación. Un medio de congelación suele contener al menos un agente crioprotector. El medio de congelación está generalmente comprendido dentro de un instrumento de inseminación artificial.

En la presente invención, un "medio de maduración" es un medio que favorece la maduración de los ovocitos desde el estadio GV (vesícula germinal) hasta el estadio MII (metafase II). Los ovocitos en el estadio MII son "ovocitos maduros".

En la presente invención, un "medio fertilizante" significa un medio, generalmente una solución, que comprende esperma capacitado y ovocitos maduros.

De acuerdo con la invención, "aumentar la vida útil del esperma" significa que el porcentaje de la población de esperma con capacidad fertilizante aumenta después de un cierto tiempo de incubación cuando se utiliza el inhibidor del canal Slo3 en un medio que contiene el esperma a aproximadamente 37 ° C, en comparación con el caso donde no se utiliza dicho inhibidor, todo lo demás permanece igual, sin dañar la capacidad de fertilizar de la población de esperma.

El tiempo de incubación varía en función de las especies diana. Para la mayoría de las especies, 12 horas es suficiente para observar el efecto técnico.

Esto se mide por el porcentaje de embriones de 2 células producidos después de la fertilización de ovocitos maduros, cuando la incubación de esperma previa a la fertilización se realizó en un medio de capacitación (como el que se ejemplifica a continuación: medio de capacitación Sp-TALP) a aproximadamente 37 ° C. En consecuencia, corresponde a un aumento dentro de un intervalo respectivamente del 10 % al 60 % a las 24 horas de incubación (por ejemplo, 30 %) y del 10 % al 50 % a las 48 horas de incubación (por ejemplo, 45 %).

De acuerdo con la invención, "aumentarla motilidad de esperma capacitado"significa que la motilidad total de la población de esperma capacitado, expresada en porcentaje, aumenta después de un cierto tiempo de incubación cuando se utiliza el inhibidor del canal Slo3 en un medio que contiene el esperma a aproximadamente 37 ° C, con respecto al caso donde no se utiliza el inhibidor, todo lo demás permanece igual.

Esto se mide por incubación en un medio de capacitación (como el que se ejemplifica a continuación: medio de capacitación Sp-TALP) durante 24 horas a aproximadamente 37 ° C. En consecuencia, corresponde a un aumento dentro de un intervalo de 100 % a 500 % (por ejemplo, 400 %).

En otras palabras, la presencia de un inhibidor del canal de potasio Slo3 en un medio que contiene el esperma, manteniendo todo lo demás igual, aumenta la motilidad del esperma capacitado.

Para las definiciones anteriores, el medio que contiene el esperma suele ser un medio conservante o un medio protector. Esto es por ejemplo un medio de congelación o un medio de capacitación.

En la presente invención, el término "motilidad" es la capacidad del esperma para moverse espontánea y activamente, consumiendo energía en el proceso. Para los espermatozoides, esto se trata de un movimiento de tipo nado realizado por el latido regular de su flagelo, es decir, una motilidad flagelar.

En la presente invención, el término "capacitación" significa la maduración de los espermatozoides animales que se requiere para hacerlos competentes para fertilizar un ovocito (una vez que se someten a esta etapa final de maduración, el esperma penetra las capas protectoras circundantes de los ovocitos, lo que implica la reacción del acrosoma). Un período de capacitación es un período durante el cual tiene lugar la capacitación. Un período de capacitación posiblemente puede durar después de que tenga lugar la capacitación. De acuerdo con la invención, "esperma capacitado" significa esperma incubado durante un período mínimo de tiempo en un medio de capacitación. Este período de tiempo varía en función de la especie diana (por ejemplo, generalmente es de unos 45 minutos para el ratón y de unas 4 horas para el bovino). El medio de capacitación generalmente contiene albúmina de suero bovino para esperma de ratón y albúmina de suero bovino y heparina para esperma bovino.

Como sabe la persona experimentada, la capacitación conduce a cambios en el patrón de motilidad del esperma, que se pueden medir con un sistema CASA, y la fosforilación de proteína en sus residuos de tirosina, que se puede medir en inmunoprecipitación western.

Por ejemplo, de acuerdo con la invención, la capacitación del esperma se mide con inmunoprecipitación western antifosfotirosina como se describe en " Capacitation of mouse spermatozoa. I. Correlation between the capacitation state and protein tyrosine phosphorylation. Visconti PE et al, Development. 1995 abril; 121(4):1129-37"

En resumen, el esperma lavado se resuspendió en regulador de muestra Laemmli sin p-mercaptoetanol y se hirvió durante 5 minutos. Después de centrifugación, se añadió p-mercaptoetanol al 5 % a los sobrenadantes y la mezcla se hirvió de nuevo durante 5 minutos. Extractos proteicos equivalentes a 1-2 * 106 de esperma se cargaron por carril y se sometieron a SDS-PAGE. Las proteínas resueltas se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se trataron con gelatina de piel de pescado al 20 % (Sigma) en PBS-T, luego se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con anticuerpo anti-fosfotirosina (clon 4G10, Millipore) (1:10,000); esto fue seguido por 1 hora de incubación con un anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano picante. La inmunorreactividad se detectó utilizando reactivos del kit de detección de quimioluminiscencia y una estación ChimidocTM (Biorad).

De acuerdo con la invención, "contactar" significa "poner en contacto con". Preferiblemente, poner en contacto es mezclar.

En la presente invención, el término "rata de concepción" significa una medida de la fertilidad animal. Suele calcularse dividiendo el número de hembras preñadas por el número total de inseminaciones.

De acuerdo con la invención, los animales son preferentemente mamíferos y aves, más preferentemente mamíferos domésticos y aves de corral.

En la presente invención, el inhibidor del canal de potasio Slo3 se utiliza generalmente en una cantidad eficaz. El término "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad suficiente para inducir un resultado biológico deseado. Aquí, el resultado es un aumento de la vida útil o de la motilidad del esperma. La "cantidad eficaz" depende del inhibidor del canal de potasio Slo3. Generalmente es como sigue:

-0.5 a 5 mM, preferiblemente 1 a 2.5 mM, más preferiblemente 1.5 a 2.5 mM, cuando el inhibidor del canal de potasio Slo3 es bario;

- 1 a 100 mM, preferiblemente 10 a 30 mM, más preferiblemente 15 a 25 mM, cuando el inhibidor del canal de potasio Slo3 es mibefradil;

-0.1 a 50 |^j M, preferiblemente 0.1 a 5 j M, más preferiblemente 0.2 a 1 j M, cuando el inhibidor del canal de potasio Slo3 es clofilio;

-0.1 a 50 j M, preferiblemente 5 a 30 j M, más preferiblemente 20 a 30 j M, cuando el inhibidor del canal de potasio Slo3 es quinidina.

Esta concentración molar generalmente se calcula o se deduce del volumen total del medio de congelación o medio de capacitación, que se encuentra en forma de gotitas. De acuerdo con la invención, el instrumento artificial comprende preferiblemente un medio de congelación y esperma. Este medio de congelación comprende el inhibidor del canal de potasio Slo3. Preferiblemente, estos constituyentes se han mezclado todos juntos.

El bario es una sal de bario como el cloruro de bario o sulfato de bario. El sulfato de bario, que se conoce como agente de radiocontraste, es el compuesto inorgánico con la fórmula química BaSO4, número CAS 7727-43-7.

Mibefradil es dicloruro de mibefradil, el nombre actual de (1S,2S)-2-(2-((3-(1H-benzo[d]imidazol-2-il)propil) (metil)amino)etil)-6-fluoro-1-isopropil-1,2,3,4-tetrahidronaftalen-2-il 2-metoxiacetato, conocido bajo el nombre comercial Posicor de Roche, número CAS 116644-53-2. Es conocido como agente antihipertensivo y agente contra la angina de pecho crónica.

Clofilio es el nombre actual de 4(-4(clorofenil)butil-dietil-heptilamonio (nombre IUPAC), número CAS 68379-02-2. Es conocido como agente antiarrítmico (clase III).

La quinidina es el nombre actual de (9S)-6'-metoxicinconan-9-ol (nombre IUPAC), número CAS 56-54-2. Es conocido como un agente antiarrítmico (clase Ia).

Las realizaciones preferidas de acuerdo con la invención comprenden al menos una de las siguientes características:

- el esperma animal se elige entre esperma de bovinos, porcinos, ovinos, aves, tales como pollos y pavos, equinos, caprinos y mascotas, tales como gatos y perros;

- el inhibidor del canal de potasio Slo3 es bario, mibefradil, clofilio y/o quinidina, preferiblemente clofilio y/o quinidina, más preferiblemente clofilio;

- dicho contacto se lleva a cabo in vitro o in vivo;

- dicho esperma animal ha sido previamente congelado y descongelado, o ha sido recién eyaculado, o recuperado del epidídimo, o del testículo.

La invención también se relaciona con un inhibidor del canal de potasio Slo3, para uso en el aumento de la vida útil del esperma animal, en donde dicho inhibidor se pone en contacto in vivo con dicho esperma animal y dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con el uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3, para aumentar la vida útil del esperma animal, que comprende contactar in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal, en el que dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con un método para aumentar la vida útil del esperma animal que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con un inhibidor del canal de potasio Slo3, para uso en el aumento de la motilidad del esperma animal capacitado, en donde dicho inhibidor se pone en contacto in vivo con dicho esperma animal capacitado y dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con el uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3, para aumentar la motilidad del esperma animal capacitado, que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal capacitado, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con un método para aumentar la motilidad del esperma animal capacitado que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal capacitado, en donde dicho esperma animal no es esperma humano. La invención también se relaciona con un instrumento de inseminación artificial que comprende esperma animal en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

La invención también se relaciona con un método in vitro para inseminar artificialmente a un animal, que comprende el uso del instrumento de inseminación artificial de acuerdo con la invención.

De acuerdo con las realizaciones preferidas del uso del inhibidor del canal de potasio Slo3 para aumentar la fertilidad de un animal de acuerdo con la invención,

- dicha etapa de contacto se lleva a cabo en una hembra administrando inhibidor de la composición del canal de potasio Slo3 en el tracto vaginal y/o cervical de dicha hembra, y dicha etapa de inseminación artificial es una inseminación de dicha hembra por dicho esperma animal; y/o

- dicha etapa de contacto se lleva a cabo en un macho preferentemente mediante inyección en el epidídimo o testículo de dicho macho, y dicha etapa de inseminación artificial es una inseminación de una hembra por dicho esperma animal; y/o - dicha etapa de inseminación artificial se lleva a cabo mediante el uso de un instrumento de inseminación artificial; y/o - dicha etapa de inseminación artificial se lleva a cabo mediante el uso de una pajilla de semen para crioconservación.

El medio de congelación dentro de la pajilla de la presente invención comprende preferiblemente aditivos generalmente adecuados, conocidos por la persona experimentada, como al menos un agente crioprotector como alcoholes (glicerol, propanodiol), aldehídos (formamida), azúcares (sacarosa, rafinosa, trehalosa) o dimetilsulfóxido (DMSO) y un diluyente como yema de huevo, proteínas de leche o azúcar.

El inhibidor del canal de potasio Slo3 puede administrarse por vías que permitan el contacto del inhibidor con el esperma, en formas de dosificación farmacéuticas apropiadas para cada vía de administración tales como una solución, suspensión, gel, crema, leche, cápsula, comprimido y/u otras formas adecuadas para la administración a animales.

Por ejemplo, de acuerdo con una realización de la invención, el inhibidor del canal de potasio Slo3 se administra a hembras por vía vaginal en cualquier forma adecuada, incluidas cremas o geles, preferiblemente en forma de supositorio.

Las técnicas de la presente invención se entenderán fácilmente considerando los dibujos adjuntos:

La Figura 1 es una ilustración parcial esquemática de un instrumento 10 de inseminación artificial de acuerdo con la invención.

La Figura 2 es un diagrama esquemático que ilustra el impacto del clofilio en un medio de capacitación de esperma de ratón, mostrando el porcentaje de embriones de 2 células frente (vs) a ovocitos maduros 48 horas post fertilización con respecto al tiempo de incubación del esperma antes de la fertilización (en horas, h) para cada una de las dos soluciones probadas (control y solución de clofilio 5 ^j M ).

La Figura 3 comprende dos diagramas esquemáticos, Figura 3A y Figura 3B respectivamente, que ilustran el impacto del clofilio en un medio de capacitación de esperma de ratón antes de la fertilización (12 horas de incubación), al mostrar el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos maduros 24 horas post fertilización, obtenidos para cada una de las soluciones probadas (control y clofilio), respectivamente para una solución de clofilio 0.2 ^{j M} (Figura 3A) y para una solución de clofilio 5 ^{j M} (Figura 3B).

La Figura 4 es un diagrama esquemático que ilustra el porcentaje de motilidad (en términos de VCL, en jm/s) en un medio de capacitación de esperma de ratón antes de la fertilización (12 horas de incubación) mostrando la motilidad de cada una de las soluciones probadas (control y clofilio 0.2 ^{j M ).}

La Figura 5 comprende dos diagramas esquemáticos, respectivamente Figura 5A y Figura 5B, que ilustran respectivamente el impacto del clofilio en un medio de capacitación de esperma bovino previo a la fertilización (24 horas de incubación), al mostrar el porcentaje de embriones bovinos de 2 células frente a ovocitos maduros 48 horas post fertilización (Figura 5A) y el porcentaje de blastocistos bovinos frente a ovocitos maduros medidos 9 días post fertilización (Figura 5B), en ambos casos para cada una de las soluciones probadas (control 0 horas, control 24 horas, clofilio 24 horas).

La Figura 6 comprende dos diagramas esquemáticos, Figura 6A y Figura 6B respectivamente, que ilustran respectivamente el impacto del clofilio en la motilidad del esperma bovino (en términos de VCL, en pm/s), el esperma se incuba 24 horas en un medio de capacitación antes de la evaluación CASA, para cada una de las soluciones probadas (control, clofilio 0.2 pM, clofilio 0.5 pM, clofilio 1 pM y clofilio 5 pM) (Figura 6A) y la motilidad total (%), para cada una de las soluciones probadas (control, clofilio 0.2 pM, clofilio 0.5 pM, clofilio 1 pM y clofilio 5 pM) (Figura 6B).

La Figura 7 es un diagrama esquemático que ilustra el impacto del lavado de clofilio en el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos maduros 24 horas post fertilización por esperma bovino. El esperma bovino se congeló con un medio de control ("control") o un medio que contenga clofilio 0.2 pM ("clofilio"), descongelado y utilizado ya sea inmediatamente ("0h"), 24 horas después ("24h") o 48 horas después ("48h") para la fertilización. Se probaron dos condiciones: después de descongelar, el esperma se centrifugó y se diluyó ya sea con una solución de control ("clofilio lavado") o una solución que contiene clofilio 0.2 pM ("clofilio").

La Figura 8 es un diagrama esquemático que ilustra el impacto del clofilio en la motilidad del esperma bovino (en términos de VCL, en pm/s), presentando el esperma una velocidad suficiente (VCL > 150 pm/s), siendo el esperma incubado 0 horas o 24 horas en un medio de capacitación previa evaluación CASA, para cada una de las soluciones probadas (control o clofilio 0.2 pM).

La Figura 9 es un diagrama esquemático que ilustra el impacto de la quinidina en un medio de capacitación (12 horas de incubación), mostrando el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos maduros 24 horas después de la fertilización por esperma de ratón para cada una de las soluciones probadas (control, quinidina 5 pM, quinidina 10 pM, quinidina 25 pM y quinidina 100 pM).

La figura 1 es una vista esquemática en sección longitudinal de una pajilla 10 para la conservación de una dosis predeterminada de sustancia de base líquida, en particular semen animal diluido.

La pajilla 10 comprende un recipiente que es un tubo 11 y un tapón 12. Se utiliza para la inseminación artificial del ganado, en particular bovino.

El tubo 11 es convencionalmente de material plástico extrudido, con un diámetro interior por ejemplo de 1.6 o 2.5 mm y una longitud del orden de 133 mm. El tubo 11 es un manguito sustancialmente cilindrico parcialmente llenado por el esperma diluido en medio de congelación. Este tubo es capaz de congelarse y descongelarse sin cambiar sus propiedades y sin lixiviar ninguna sustancia en su contenido.

El tapón 12 suele ser del tipo de tres partes descrito originalmente en la Patente francesa 995878, correspondiente a la Patente británica 669 265, es decir, formado por dos tapones 13 y 14 hechos de una sustancia fibrosa que encierra un polvo 15 que, en contacto con un líquido, es capaz de transformarse en una pasta o gel impermeable adhiriéndose a la pared del tubo de manera que el tapón es hermético al líquido.

En el estado inicial, mostrado en la figura 1, el tapón 12 está dispuesto cerca del extremo 16 del tubo 11 y se prevé que, en el estado lleno, la dosis de sustancia líquida que debe conservarse en la pajilla 10 se coloca entre el tapón 12 y el extremo 17 del tubo 11 más alejado del tapón 12. Para llenar la pajilla 10, el extremo 16 se pone en comunicación con una fuente de vacío mientras que el extremo 17 se pone en comunicación con un recipiente que contiene la sustancia a introducir en la pajilla.

El aire contenido inicialmente entre el tapón 12 y el extremo 17 es aspirado a través del tapón mientras la sustancia avanza en el tubo hasta encontrar el tapón 12, por el extremo 18 del mismo que está vuelto hacia el extremo 17 del tubo 11, que es decir el final del tapón 12 que se aprecia a la derecha en la figura 1.

Si es necesario, la pajilla se suelda cerca de uno o ambos de sus dos extremos 16 o 17 y se almacena en frío.

Para vaciar la pajilla 10, si es necesario después de cortar las porciones de extremo soldados y descongelar, se inserta en el tubo 11 una varilla que viene a apoyarse en el extremo 19 del tapón 12 (dicho extremo está situado en el lado opuesto del extremo 18). Mediante esta varilla se hace deslizar el tapón 12 a modo de pistón hacia el extremo 17 o el extremo que corresponda después de cortar la porción soldada, lo que provoca la expulsión de la dosis de sustancia que había sido introducida en la pajilla.

Las figuras 2, 3 (3A y 3B), 4, 5 (5A y 5B), 6 (6A y 6B), 7, 8 y 9 se explican en los siguientes ejemplos.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Impacto del clofilio en la vida útil y motilidad de esperma de ratón

Estas pruebas se realizaron en esperma de ratón y ovocitos MII maduros. Se ilustran en las Figuras 2 a 4.

El esperma de ratón se obtuvo por trituración manual de caudae epididímido del macho y se les permitió nadar en medio M2 (de Sigma) durante 10 minutos. La composición del medio M2 en g/L es la siguiente: 0.25 de CaCh; 0.1649 de MgSO4 (anhidro); 0.35635 de KCI; 0.162 de K2HPO4; 0.35 de NaHCOa; 5.53193 de NaCl; albúmina, fracción bovina V 4.0; 1.0 de D-Glucosa; HEPES (para ácido 4-(2-hidroxietil)-1 -piperazina etanosulfónico) X 5.42726 de Na; ácido pirúvico X 0.0363 de Na; ácido DL-láctico * 2.95 de Na).

A continuación, el esperma se capacitó en medio M16 (de Sigma) con BSA libre de ácidos grasos al 2 % (para albúmina de suero bovino) (denominado "medio M16-BSA") a 37 ° C en una incubadora CO2 al 5 % v/v por diferentes tiempos como se especifica. El medio M16 es un medio comercial y de uso común para fertilización in vitro y cultivo de embriones en etapa de preimplantación.

La composición del medio M16 en g/L es la siguiente: 0.25137 de cloruro de calcio.2H2O; 0.143276 de sulfato de magnesio (anhidro); 0.356349 de cloruro de potasio; 0.161959 de fosfato de potasio monobásico; 5.5319304 de cloruro de sodio; 4.0 de fracción de albúmina bovina V; 1.0 de glucosa; 0.01 de rojo fenol.Na; 0.0363 de ácido pirúvico.Na y 2.61 de ácido DL-láctico.Na

Se recolectaron ovocitos de hembras OF1 maduras, sincronizados con 5 unidades de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) y 5 unidades de gonadotropina coriónica humana (HCG). Los cúmulos se cosecharon directamente de la ampolla y se inyectó esperma en las gotitas M16 que contenían el cúmulo.

1. La primera prueba se relacionaba con la capacidad del esperma de ratón para fertilizar ovocitos cuando se incubaban antes de la fertilización en un medio de capacitación que contenía clofilio con respecto a un medio de control, que es el mismo medio de capacitación, pero sin clofilio. El medio de capacitación fue medio M16-BSA.

El medio de control fue el medio M16-BSA que contenía el esperma. Se comparó con el mismo medio que además incluía clofilio a una concentración de 5 pM (en el medio M16-BSA que contenía el esperma).

El esperma se incubó en medio M16-BSA con o sin clofilio y luego se agregó a gotitas M16 que contenían el cúmulo que comprende los ovocitos. Los embriones de dos células se contaron 48 horas post inseminación (n = 3). El número de ovocitos que alcanzaron la etapa de dos células se contó 48 horas después de la fertilización.

Estos resultados se muestran en la Figura 2 que es un diagrama esquemático que muestra el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos maduros 48 horas post fertilización con respecto al tiempo de incubación (en horas, h) para cada una de las soluciones probadas ("ctrl" para "control" y "clofilio 5 yM").

A las 48 horas, el clofilio tiene un efecto positivo para periodos de incubación cortos (< 3 horas) y para periodos de incubación largos (> 3 horas), ya que para ambos un número similar de ovocitos alcanzó los estadios de 2 células. Para el período de incubación de 3 horas, el porcentaje de estadios de 2 células no es significativamente diferente al del control. Por otro lado, se observó un mayor número de estadios de 2 células con el tratamiento con clofilio que el observado con el control durante largos períodos de incubación (> 3 horas). Debido a que la capacidad del esperma en la solución de control para fertilizar el ovocito es mínima a las 12 horas, comparamos en una segunda prueba el efecto del clofilio para una incubación de esperma de 12 horas antes de la fertilización.

2. La segunda prueba se relaciona con la dosis de clofilio a utilizar para la incubación previa a la fertilización.

Se probaron dos concentraciones diferentes de clofilio: 0.2 pM de clofilio y 5 pM de clofilio (en el medio M16-BSA que contiene el esperma).

El tiempo de incubación del esperma previo a la fertilización fue de 12 horas.

Los resultados se muestran en la Figura 3A, que ilustra el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos MII maduros 24 horas post fertilización obtenidos para el "control" y para una solución de clofilio 0.2 pM ("clofilio 0.2 yM") y en la Figura 3B que ilustra el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos MII maduros 24 horas post fertilización obtenidos para el "control"y para una solución de clofilio 5 pM ("clofilio 0.5yM").

Se puede ver que concentraciones tan bajas como clofilio 0.2 pM mejoran resultado de la fertilización de ratón in vitro. Sugiriendo que ambas concentraciones (0.2 pM y 5 pM) son potentes.

3. La viabilidad de esperma de ratón se determinó mediante la medición de la motilidad del esperma. El análisis de la motilidad se realizó mediante análisis de semen asistido por computadora (análisis CASA). El análisis CASA siempre se realizó en los ejemplos usando un CEROS™, Hamilton Thorne Bioscience, Estados Unidos. Así se midió VCL.

Como sabe la persona experimentada, VCL (Velocidad Curvilínea) es la velocidad promedio de la cabeza del esperma a lo largo de su recorrido real.

Para este análisis, las muestras se diluyeron a 0.1 106/mL. La muestra diluida se incubó durante 12 horas a 37 ° C en un medio de capacitación de medio M16-BSA, con o sin clofilio 0.2 pM.

Para la medición CASA, se colocaron 10 pL de la muestra en portaobjetos 2X-CEL, 100 mm de profundidad, Leja Products B.V., Países Bajos, colocados en la etapa de calentamiento (37 ° C) del CEROS™. Se analizaron un total de 10 campos seleccionados automáticamente.

La Figura 4 es un diagrama esquemático que ilustra el porcentaje de motilidad del esperma (en términos de VCL, en pm/s), es decir, el impacto del clofilio en la velocidad del esperma, después de un período de 12 horas de capacitación, para cada una de las soluciones probadas (control y clofilio 0.2 pM). Se observó que el esperma tratado con clofilio 0.2 pM ("clofilio 0.2 ^j M") tiene una velocidad mayor que el esperma "control" (es decir, no tratado).

Ejemplo 2: impacto del tratamiento con clofilio en la vida útil y motilidad de esperma bovino congelado

Estas pruebas se realizaron en esperma bovino. Se ilustran en las Figuras 5 y 6. Se realizaron experimentos similares de fertilización in vitro como en el Ejemplo 1 utilizando esperma bovino congelado y ovocitos maduros in vitro.

Preparación de esperma y evaluación de motilidad

El esperma bovino se obtuvo por eyaculación. El eyaculado se diluyó 1:1 en Optixcell. Después de 10 minutos de incubación a 34 °C, el semen se diluyó hasta una concentración final de 57 millones de espermatozoides/mL en Optixcell. Optixcell es un regulador de citrato TRIS que contiene liposomas extruidos a partir de lecitinas de yema de huevo, glicerol y antibióticos descritos por la CEE (Directiva 88/407/CEE). El semen diluido se enfrió lentamente a 4 ° C (3 a 4 horas de equilibración en un baño de agua templado), se llenaron pajillas de 0.25 ml y luego se congelaron en un congelador de rata controlada a una rata de enfriamiento de 5 ° C/minuto desde 4 ° C a -10 ° C, 40 ° C/minuto de -10 ° C a -110 ° C, 15 ° C/minuto de -110 ° C a -140 ° C/minuto. A continuación, las pajillas se almacenaron en nitrógeno líquido hasta fertilización in vitro.

Las pajillas se descongelaron en un baño de agua a 37 ° C durante 45 segundos. Cada pajilla se limpió con etanol a 70 ° antes de abrirla. Los 0.25 ml de semen descongelado de cada pajilla se colocaron en capas bajo 4 ml de medio de capacitación Sp-TALP en un tubo cónico de 15 ml. La composición del medio Sp-TALP en mM es la siguiente: NaCl (114.0); KCI (3.2); NaH2PO4 (0.3); 60 % de lactato de Na (10); MgCh(0.5); HEPES (10); NaHCOa (25); Piruvato de Na (1) y 50 pg/mL de gentamicina; pH ajustado a 7.4 con 6 mg/ml de BSA (albúmina de suero bovino) y 2 pg/ml de heparina.

El esperma se centrifugó y se resuspendió en 4 ml de medio de capacitación Sp-TALP con o sin clofilio (0.2 pM). El esperma se mantuvo a 37 ° C bajo condiciones de humedad saturada durante 0 horas o 24 horas.

Para la motilidad, el esperma se incubó con clofilio 0.2, 0.5, 1 y 5 pM diluido en el medio de capacitación durante 24 horas a 37 ° C bajo condiciones de humedad saturada. La motilidad del esperma se midió mediante análisis de semen asistido por computadora (análisis CASA). El análisis CASA se realizó utilizando un CEROS™, Hamilton Thorne Bioscience, Estados Unidos. A continuación, se midió la VCL (velocidad curvilínea).

Etapa de fertilización

Al final del período de incubación, el esperma se centrifugó y el sedimento se resuspendió en los 100 pL de la solución restante en el tubo. Se midió la concentración de esperma y se inyectaron 750000 células de esperma en una gotita de fertilización (500 pl) que contenía ovocitos bañándose en medio de fertilización. La composición del medio de fertilización de IVF en mM es la siguiente: NaCl 114.0; KCI 3.2; NaH2PO40.3; lactato de Na 10.0; CaCh2.0; MgCh 0.5; NaHCOa 25.0; MEM (para Medio Esencial Mínimo) Solución de aminoácidos 50X (de Life Technologies) 2 % vol/vol. El medio IVF comprende también 6 mg/ml de BSA, piruvato 0.2 mM, 50 pg/ml de gentamicina, 23.5 pg/ml de heparina, 20 pM/ml de penicilamina, 10 pM de hipotaurina y 2 pM/ml de epinefrina. El cocultivo de esperma (1.5 M/mL) y complejos de ovocitos cúmulos (COC) se realizó a 38.5 ° C bajo una atmósfera gaseosa de CO2 al 5 % v/v y humedad saturada durante 48 horas y luego se evaluó el resultado de la fertilización.

Preparación de ovocitos

Los ovarios bovinos se recolectaron dentro de las 3 horas post sacrificio y se llevaron al laboratorio en solución salina (0.9 %) con cobertura de antibiótico (kanamicina) entre 25 ° C y 35 ° C. Los complejos de cúmulo-ovocitos (COC) se recuperaron de folículos antrales de 2 a 8 mm mediante aspiración manual con una aguja estéril de calibre 18 unida a una jeringa estéril de 5 ml llena con medio de recolección (PVA al 1 % v/v (poli(alcohol vinílico)), NaHCO34.2 mM, HEPES 10 mM, glutamina 2 mM, 50 UI/mL de penicilina y 50 pg/mL de estreptomicina en medio M199). Solo se seleccionaron COC de grado 1 y 2 para su posterior procesamiento. Se maduraron grupos de 30 COC en una placa de 4 pozos con 500 pL de medio de maduración de ovocitos durante 24 horas a 38.5 ° C en una atmósfera gaseosa con CO2 al 5 % y humedad saturada.

La composición del medio M199 en mM es la solución compleja llamada M0393 de Sigma-Aldrich que comprende sales inorgánicas tales como 0.1396 g/L de cloruro de calcio, 0.4 g/L de cloruro de potasio, 8 g/L de cloruro de sodio; aminoácidos tales como 0.1 g/L de L-glutamina y 0.0668 g/L de ácido L-glutámico; vitaminas; y otros componentes.

El medio de maduración de ovocitos era un medio M199 modificado, que comprende solución de complejo de sales de Earle de medio M199 de Life Technologies (llamado 31150-022) y glutamina 2 mM, piruvato de sodio 0.2 mM, cisteamina 0.1 mM, 50 |jg/ml de gentamicina, FBS al 10 % v/v (suero fetal bovino) y 0.2 |jg/ml de EGF (factor de crecimiento epidérmico).

Evaluación de la fertilización y desarrollo embrionario

Los ovocitos se extrajeron de los pozos de fertilización 24 horas después de la fertilización, se trataron con agitación por vórtice durante 2 minutos para eliminar las células del cúmulo y se lavaron 3 veces pasándolos a través de platos con medio de recolección. Los presuntos cigotos se cultivaron luego en placas de 4 pozos con 500 jL de medio de cultivo de embriones cubiertos con 250 jL de aceite mineral equilibrado durante 24 horas y luego se midió el número de ovocitos sometidos a escisión. El medio de cultivo fue 10 % RD-mKSOM/aa de Momozawa et al., Journal of Reproduction and Development, vol. 57, núm. 6, 681-689, 2011. La rata de escisión fue evaluada a las 48 horas y la rata de blastocistos el día 9 post fertilización.

La composición del medio RD-mKSOM/aa en mM es la siguiente: NaCl 98.6; KCI 2.5; CaCl21.71; KH2PO40.35; MgSO4 0. 2. piruvato de Na 0.3; lactato de Na 3.0; NaHCOs25; HEPES 10.0; L-Glutamina aminoácidos esenciales y no esenciales; 5 jg/m L de insulina; 5 jg/m L de transferrina; 5 ng/mL de selenita de Na; EDTA 10 jM , 65 jg/m l de sulfato de dibekacina suplementado con 10 % de RD (v/v) y correspondiente a la mezcla 1:1 de RPMI y MEM de Dubelcoo.

1. La primera prueba se relaciona con la capacidad del esperma bovino capacitado para fertilizar ovocitos cuando se incubaban antes de la fertilización durante un largo período de tiempo en un medio que contiene clofilio 0.2 jM de con respecto a un medio de control sin clofilio. Se siguió el desarrollo de los embriones de 2 células hasta el estadio de blastocisto. El período de incubación del esperma previo a la fertilización fue de 24 horas.

El medio fue el medio sp-TALP suplementado con 6 mg/ml de BSA y 2 jg/m l de heparina.

El esperma se incubó en medio sp-TALP con o sin clofilio durante un período de 24 horas y luego se agregaron a gotitas que contenían ovocitos. Los embriones de dos células se contaron 48 horas post inseminación (n = 3).

Los primeros resultados se muestran en la Figura 5A que es un diagrama esquemático que ilustra el porcentaje de embriones bovinos de 2 células frente a ovocitos maduros obtenidos 48 horas post fertilización, para cada una de las soluciones probadas: control a las 0 horas ("control 0h") (semen utilizado inmediatamente después de la descongelación), control a las 24 horas ("control 24h") (correspondiente a esperma incubado en sp-TALP 24 horas antes de la fertilización) y clofilio a las 24 horas ("clofilio 24h") (correspondientes a esperma incubado en sp-TALP que contenía clofilio 0.2 jM 24 horas antes de la fertilización).

Los segundos resultados se muestran en la Figura 5B, que es un diagrama esquemático que ilustra el porcentaje de blastocistos frente a ovocitos maduros obtenidos 9 días después de la fertilización, para cada una de las (mismas) soluciones probadas: "control 0h", "control 24h" y "clofilio 24h".

Estos resultados muestran que el clofilio mejora el rendimiento de blastocistos bovinos cuando la fertilización se realiza con esperma capacitado durante 24 horas.

2. La viabilidad del esperma capacitado se determinó mediante la medición de la motilidad del esperma. El análisis de motilidad se llevó a cabo como en el Ejemplo 1.3.

Los primeros resultados se muestran en la Figura 6, que ilustra la motilidad (en términos de VCL, en jm/s), es decir, la velocidad del esperma, siendo el esperma incubado 24 horas en un medio de capacitación previo a CASA, para cada una de las soluciones probadas: control ("[0 yM]"), clofilio 0.2 jM ("[0.2 yM ]" o "[0.2]"), clofilio 0.5 jM ("[0.5 yM ]" o "[0.5]"), clofilio 1 jM ("[1 yM ]" o "[1]") y clofilio 5 jM ("[5yM]" o "[5]") (Figura 6A) y que ilustra la motilidad total (%), para cada una de las soluciones probadas "[0yM]", "[0.2yM]" (o "[0.2]"), "[0.5yM]" (o "[0.5]"), "[1 yM ]"(o "[1]") y "[5yM]" (o "[5]") (Figura 6B).

Como es conocido por la persona experimentada, la "motilidad total" indica el porcentaje total de esperma que se mueven en cualquier dirección (VAP > 1jm/s).

Se observó que la población de esperma tratada con clofilio 0.2 jM , clofilio 0.5 jM o clofilio 1 jM tiene una mayor velocidad que la población de esperma no tratada (es decir, control), para cada uno de los criterios.

Ejemplo 3: Impacto de clofilio agregado durante el proceso de preparación de semen y antes del proceso de congelación de esperma bovino en la vida útil

Para estar lo más cerca posible del posible uso de campo, el esperma se congeló con clofilio antes de probar su capacidad para mejorar la fertilización. Se probaron dos condiciones: en la primera, el clofilio estuvo presente durante el período de incubación del esperma, y en la segunda, el esperma se lavó para eliminar el clofilio con el fin de imitar la condición que puede ocurrir en el tracto reproductivo femenino.

Las pajillas que contenían clofilio se obtuvieron como se describe a continuación. El eyaculado bovino se dividió en dos fracciones y se diluyó 1:1 en Optixcell (Fracción 1) u Optixcell que contenía clofilio 0.2 jM (Fracción 2). Después de 10 minutos de incubación a 34 ° C, el semen se diluyó hasta una concentración final de 57 millones de espermatozoides/ml en Optixcell (Fracción 1) u Optixcell que contenía clofilio 0.2 pM (Fracción 2). El semen diluido se congeló como se describió anteriormente y se almacenó en nitrógeno líquido hasta fertilización in vitro.

Se utilizaron dos tipos de pajillas: pajillas de control y pajillas que contenían clofilio. Para las pajillas que contenían clofilio, se probaron dos condiciones: lavadas y no lavadas. El medio de lavado es un medio de uso común, sp-TALP, para el manejo de esperma bovino y cuya composición se describe anteriormente. Para condiciones "no lavado", el esperma se incubó con sp-TALP que contenía clofilio 0.2 pM.

El protocolo del procedimiento de lavado es el siguiente:

- Para el control a las 0 horas (etiquetado "control 0h"), después de descongelación, se eliminó el medio de congelación mediante un primer lavado con sp-TALP, luego se realizó un segundo lavado con sp-TALP y finalmente se inyectó esperma en las gotitas que contenían ovocitos maduros;

- Para el medio de congelación que comprende clofilio a las 0 horas (etiquetado "clofilio 0h"), después de la descongelación, se eliminó el medio de congelación mediante un primer lavado con sp-TALP que contenía clofilio 0.2 pM, luego se realizó un segundo lavado con sp-TALP que contenía clofilio 0.2 pM y finalmente se inyectó esperma en las gotitas que contenían ovocitos maduros;

- Para el control a las 24 horas o 48 horas (etiquetados respectivamente "control 24h" o "control 48h"), después de descongelación, se eliminó el medio de congelación mediante un primer lavado con sp-TALP, luego se realizó una incubación de 24 horas o 48 horas en sp-TALP y finalmente se realizó un segundo lavado con sp-TALP, seguido de la inyección en las gotitas que contenían ovocitos maduros;

- Para el medio de congelación que contenía clofilio a las 24 horas o 48 horas, después de la descongelación, el medio de congelación se eliminó mediante un primer lavado con sp-TALP, luego una incubación de 24 horas o 48 horas en sp-TALP (etiquetado como "clofilio lavado 24h" o "clofilio lavado 48h") o sp-TALP que contiene clofilio 0.2 pM (etiquetado "clofilio 24h" o "clofilio 48h") y finalmente se realizó un segundo lavado con sp-TALP, seguido inmediatamente por la inyección en las gotitas que contenían ovocitos maduros.

Los resultados se muestran en la Figura 7, que ilustra el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos maduros 24 horas post fertilización obtenidos para cada una de las condiciones de incubación de 24 horas y 48 horas para los diferentes medios y procesos (como se explicó anteriormente).

Se sacaron dos conclusiones de estos experimentos. Primero, cuando el clofilio está presente, su efecto positivo sobre el resultado del embrión duró 48 horas. En segundo lugar, en condiciones de lavado, el efecto positivo a las 24 horas sigue presente, aunque menor. Sin embargo, a las 48 horas de incubación, el efecto ya no está presente.

Ejemplo 4: Impacto de clofilio (agregado durante el proceso de preparación del semen y antes del proceso de congelación) del esperma bovino en la motilidad de la subpoblación espermática que presenta una velocidad curvilínea suficiente

La población de esperma presenta una gran diversidad en cuanto a su velocidad, con un intervalo de 0 a 400 pm por segundo. Sin embargo, solo esperma que presenta una velocidad suficiente puede cruzar las capas protectoras que rodean al huevo y, por lo tanto, son competentes para fertilizar huevos. Para tener esto en cuenta, se seleccionó esperma que presentaba un VCL > 150 pm/s y se midió su velocidad en diferentes tiempos (0 horas y 24 horas) en condición control o en presencia de clofilio.

El esperma se congeló sin clofilio (control) y con clofilio antes de probar su motilidad. En el segundo caso, el clofilio estuvo presente durante el período de incubación del esperma y durante el período de capacitación.

Las pajillas de control (es decir, sin clofilio) se obtuvieron como se describe anteriormente en el párrafo del ejemplo 2 sobre preparación de esperma.

Se obtuvieron pajillas bovinas que contenían clofilio como se describe anteriormente en el ejemplo 3.

El eyaculado bovino se dividió en dos fracciones y se diluyó 1:1 en Optixcell (Fracción 1) u Optixcell que contenía clofilio 0.2 pM (Fracción 2). Después de 10 minutos de incubación a 34 ° C, el semen se diluyó hasta una concentración final de 57 millones de espermatozoides/ml en Optixcell (Fracción 1) u Optixcell que contenía clofilio 0.2 pM (Fracción 2). El semen diluido se congeló como se describió anteriormente y se almacenó en nitrógeno líquido hasta fertilización in vitro.

Así, se utilizaron dos tipos de pajillas: pajillas de control y pajillas que contenían clofilio (0.2 pM). Las pajillas se descongelaron en un baño de agua a 37 °C durante 45 segundos. Cada pajilla se limpió con etanol a 70 ° antes de abrir. Los 0.25 ml de semen descongelado de la pajilla de control se colocaron en capas bajo 4 ml de medio de capacitación Sp-TALP en un tubo cónico de 15 ml. Los 0.25 ml de semen descongelado de la pajilla con clofilio se colocaron en capas bajo 4 ml de medio de capacitación Sp-TALP que contenía clofilio 0.2 pM en un tubo cónico de 15 ml.

El esperma se centrifugó y se resuspendió en 200 pL de medio de capacitación Sp-TALP con o sin clofilio (0.2 pM). El esperma se almacenó a 37 °C bajo condiciones de humedad saturada durante 0 horas o 24 horas.

Se seleccionaron los espermatozoides que presentaban un VCL > 150 pm/s y se midió su motilidad utilizando CASA, realizado como anteriormente en condiciones de control o en presencia de clofilio.

Los resultados se muestran en la Figura 8, que ilustra el impacto del clofilio en la motilidad de esperma bovino (en términos de VCL, en |jm/s), presentando el esperma una velocidad suficiente (VCL > 150 |jm/s), siendo el esperma incubado 0 horas o 24 horas en un medio de capacitación previa evaluación CASA, para cada una de las soluciones probadas (control o clofilio 0.2 jM).

En la Figura 8, "NS" significa "No significativo".

La figura 8 muestra claramente que en presencia de clofilio durante 24 horas en el medio de capacitación, la subpoblación de esperma con VCL > 150 jm /s tiene una velocidad media superior. Por tanto, se mejora la motilidad de este esperma incubado durante 24 horas en medio de capacitación con clofilio.

Ejemplo 5: Impacto del tratamiento con quinidina en la vida útil del esperma de ratón

Se probó otro inhibidor del canal de potasio: quinidina.

La prueba se relacionó con la capacidad del esperma de ratón para fertilizar ovocitos, siendo incubado el esperma antes de la fertilización en un medio que contenía quinidina con respecto a un medio de control, sin quinidina.

El medio de control fue el medio M16-BSA que contenía el esperma ("control"). Se comparó con el mismo medio que además incluía quinidina, a diversas concentraciones de quinidina 5 jM ("quinidina 5 yM"), quinidina 10 jM ("quinidina 10yM"), quinidina 25 jM ("quinidina 25yM") y quinidina 100 jM ("quinidina 100yM").

Los resultados se muestran en la Figura 9, que ilustra el porcentaje de embriones de 2 células frente a ovocitos maduros 24 horas después de la fertilización por esperma de ratón para cada una de las soluciones probadas (como se explicó anteriormente).

Se observó que el esperma incubado durante 12 horas con quinidina 25 jM tienen una mejor vida útil que el esperma no tratado (es decir, control).

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Inhibidor de un canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la vida útil del esperma animal, en donde dicho inhibidor se pone en contacto in vivo con dicho esperma animal y dicho esperma animal no es esperma humano.

2. Inhibidor de un canal de potasio Slo3 de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho esperma animal se elige entre esperma bovino, porcino, ovino, de aves, equino, caprino y de mascotas.

3. Inhibidor de un canal de potasio Slo3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde dicho inhibidor del canal de potasio Slo3 es bario, mibefradil, clofilio y/o quinidina.

4. Inhibidor de un canal de potasio Slo3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho esperma animal ha sido previamente congelado y descongelado, o ha sido recién eyaculado, o recuperado del epidídimo, o del testículo.

5. Inhibidor de un canal de potasio Slo3 para uso en el aumento de la motilidad del esperma animal capacitado, en donde dicho inhibidor se pone en contacto in vivo con dicho esperma animal capacitado y dicho esperma animal no es esperma humano.

6. Uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3, para aumentar la vida útil del esperma animal, que comprende contactar in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

7. Uso de un inhibidor del canal de potasio Slo3, para aumentar la motilidad del esperma animal capacitado, que comprende contactar in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal capacitado, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

8. Un instrumento de inseminación artificial que comprende esperma animal en contacto con un inhibidor del canal de potasio Slo3, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

9. Un instrumento de inseminación artificial de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el instrumento de inseminación artificial es una pajilla de semen para crioconservación.

10. Un método in vitro para inseminar artificialmente a un animal, que comprende el uso del instrumento de inseminación artificial de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9.

11. Inhibidor del canal de potasio Slo3 para uso en un método para aumentar la fertilidad de un animal, comprendiendo dicho método las siguientes etapas sucesivas:

a) Poner en contacto el esperma de dicho animal con el inhibidor del canal de potasio Slo3;

b) Inseminar artificialmente a dicho animal con el esperma procedente de la etapa a), en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

12. Inhibidor del canal de potasio Slo3 de acuerdo con la reivindicación 11, en donde dicha etapa de contacto se lleva a cabo en una hembra mediante la administración del inhibidor de la composición del canal de potasio Slo3 en el tracto vaginal y/o cervical de dicha hembra, y dicha etapa de inseminación artificial es una inseminación de dicha hembra por dicho esperma animal.

13. Inhibidor del canal de potasio Slo3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, en donde dicha etapa de contacto se lleva a cabo en un macho preferiblemente mediante inyección en el epidídimo o testículo de dicho macho, y dicha etapa de inseminación artificial es una inseminación de una hembra por dicho esperma animal.

14. Inhibidor del canal de potasio Slo3 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde dicha etapa de inseminación artificial se lleva a cabo mediante el uso del instrumento de inseminación artificial de la reivindicación 8 o 9.

15. Método para aumentar la vida útil del esperma animal, que comprende poner en contacto in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.

16. Método para aumentar la motilidad de esperma animal capacitado, que comprende contactar in vitro un inhibidor del canal de potasio Slo3 con dicho esperma animal capacitado, en donde dicho esperma animal no es esperma humano.