CN116785408A - 从蝎子毒液分离的la1-样肽作为哺乳动物中的精子活动性的激活剂的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及增加精子活动性的La‑1‑样肽试剂。其无毒，且其可用于治疗人中的男性不育症，且也可用于增加动物中的生育力。其可用于人工生殖技术，诸如体外受精(IVF)，包括胞质内精子注射(ICSI)。La‑1‑样肽试剂也可用于人工授精技术，诸如胞质内子宫注射(IUI)。

Description

从蝎子毒液分离的LA1-样肽作为哺乳动物中的精子活动性的 激活剂的用途
本申请是2017年6月1日提交的同名发明专利申请201780033598.6的分案申请。
【发明领域】
本发明涉及通过体外或体内辅助生殖技术改善精子活动性来治疗男性或雄性不育症。本发明还涉及在动物生产方法(包括人工授精)中增加雄性动物的生育力。
【发明背景】
不育症影响六分之一的夫妇，其中在两个病例中就有一个是男性伴侣的缺陷。
男性或雄性不育症呈现高度可变的表型。其中最常见的之一是弱精子症，其特征在于精子活动性的下降或缺乏[参见Publicover SJ,Barratt CL.Spermmotility:thingsare moving in the lab！Mol Hum Reprod.2011Aug；17(8):453-6]。
辅助生殖技术(ART)是用于描述用于帮助夫妇的方法的术语，且根据男性不育症的严重程度包括：用于具有轻度精子功能障碍的男性的子宫内授精(IUI)，用于具有中度精子功能障碍的男性的体外受精(IVF)，和用于具有重度精子功能障碍的男性的胞质内精子注射(ICSI)。
在无精子症或少精子症的一些病例中，需要直接从睾丸或附睾回收精子。
在ART中经常需要冷冻精子样品。然而，冷冻样品的主要缺点是，已经先前冷冻的精子，一旦解冻，与新鲜精子样品相比具有降低的活动性，具有较低量的前向运动精子。
此外，在大量使用人工授精AI的农场动物中，冷冻精子的活动性降低意味着必须增加吸管中的精子浓度，并且这降低该方法的总体成功。
因此，使用能够增加精子活动性的无毒试剂在医学辅助生殖的背景下具有强烈的治疗价值。
由于精子以异质方式成熟，经常选择已经从呈现无精子症或少精子症的患者收集的个别睾丸精子用于医学辅助生殖中，这基于它们对激活精子活动性的分子的反应。根据国家，这些分子中如今只有非常少的分子或没有分子可用于临床用途，因此使临床医生在没有工具的情况下进行这种选择。
与用于体外受精(IVF)技术一样，这些试剂也适用于人工授精(AI)，例如，其中精子被注入女性或雌性的阴道或子宫(IUI)中，因为它们增加精子在女性或雌性生殖道中的活动性，且因此增加受精发生的机会。
因此，此类试剂也影响体外受精技术的成功率，不仅用于人中的治疗用途，而且还用于许多物种(如马、猪、牛和禽类等例如火鸡)中的工业繁殖用途。
在过去，非选择性磷酸二酯酶抑制剂如己酮可可碱(PTF)用于增加人中的精子活动性。然而，尽管这些分子确实在活动的精子中显示增加的加速，但显著的缺点是顶体反应(AR)的过早刺激。这导致精子一旦到达卵子却无法穿透卵母细胞。
最近，已经在小型临床试验中检查了其它PDE抑制剂[Tardif S,Madamidola OA,Brown SG,Frame L,Lefievre L,Wyatt PG,Barratt CL,Martins Da SilvaSJ.Clinically relevant enhancement of human sperm motility using compoundswith reported phosphodiesterase inhibitor activity.Hum Reprod.2014,Oct 10；29(10):2123-35]。在具有PDE抑制活性的43种市售分子中有6种在I期中显示对不良活动性的强烈影响，并且在II期中，这些化合物中有3种被鉴定为“可用于进一步研究的有希望的候选化合物”。
另一种PDE抑制剂(罂粟碱)也已被认为是己酮可可碱的替代物(参见例如Terriou等人2015,Gynecologie Obstetrique et Fertilite 43,p.786-790)。
因此，仍然强烈需要增加待用于ART程序(包括例如AI、IUI、IVF，包括用于人中的治疗用途的胞质内精子注射(ICSI))中的精子细胞的活动性的无毒试剂。需要激活精子的活动性的无毒试剂。
需要允许选择用于包括IVF(包括细胞质内精子注射(ICSI))的ART的个别精子的试剂。
还强烈需要在动物中的工业人工授精程序中可用于增加雄性生育力的试剂。具体而言，需要能够增加来自冷冻吸管的前向运动精子(样品)的数量的分子。
需要能够增加用于动物中的工业人工授精程序中的样品中含有的精子群体的受精能力的试剂。
需要能够激活/增加新鲜精子以及先前已经冷冻的精子的活动性的试剂。
需要能够激活牛、猪、绵羊、禽类(例如鸡和火鸡)、马、山羊和家畜(特别是猫和狗)中的睾丸、附睾和/或射精精子的活动性的试剂。
需要能够激活人中的睾丸、附睾和/或射精精子的活动性的试剂。
【发明概述】
本发明人已经发现了一种La-1样肽化合物，其可用于增加哺乳动物精子的活动性。本申请人已经证明先前被鉴定为La1-样蛋白[Abdel-Rahman,M.A,等人Toxicon74(2013)Venom proteomic and venomous glands transcriptomic analysis of theEgyptian scorpion Scorpio Maurus palmatus(Arachnida:Scorpionidae)pp.193-207]但生物功能未知的从蝎子(scorpion Maurus palmatus)的毒液中分离的肽呈现重要的生物活性。该肽的序列是SEQ ID NO：1。
本发明涉及包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂，其用作药物。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可用于治疗哺乳动物中的雄性不育症。具体而言，可以使用本发明的La-1-样肽试剂治疗部分或完全由于精子活动性差导致的雄性不育症。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可用于激活哺乳动物精子的活动性。所述试剂与哺乳动物精子的接触可以增加其速度。此外，非活动性精子可以变得能动。
根据本发明的实施方案，所述精子选自来自人、牛、猪、绵羊、马、山羊和家畜(特别是猫和狗)的精子。
根据本发明的实施方案，所述精子可以已经预先冷冻，或已经新鲜射精，或从附睾或从睾丸回收。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以在体外与精子接触，所述精子待用于人工授精程序中或体外受精程序(特别是胞质内精子注射(ICSI))中。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以在体内与精子接触，所述精子待用于天然或人工授精程序中。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以呈用于在授精(人工或天然授精)之前施用于女性或雌性的阴道和/或子宫颈的药物组合物的形式。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可用于选择合适的精子用于人体外受精程序(特别是胞质内精子注射(ICSI))。
根据本发明的实施方案，待处理的精子可以具有1至30μm/s的初始活动性。
根据本发明的实施方案，待处理的精子可以具有至少30μm/s的初始活动性。
本发明还涉及选择用于人体外受精程序的精子的方法，其包括以下步骤：
(a)使精子样品与治疗有效量的包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂接触。
(b)使用至少一种选自跟踪速度、路径速率、自然幅度、非前向运动速率和前向运动速率的参数来观察和测量精子活动性；
(c)根据用于待使用的特定IVF程序中的标准选择活动性最高的精子。
本发明还涉及增加动物的生育力的方法，其包括：
(a)将来自动物的精子样品与治疗有效量的包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂孵育；
(b)用所述精子样品和La-1-样肽试剂将雌性动物人工授精；
(c)测量生育率。
本申请人在测试中已经观察到La-1-样肽与罂粟碱相比的优越性。本申请人还已经显示，所述肽对精子没有毒性，并且对精子活动性具有长期持续的影响。
【附图简要说明】
图1A和1B：使用软件CLC序列观察器的来自不同蝎子物种的La-1-样肽的序列比对。
图2A：显示精子活动性的定义的图。
VCL：曲线速率是精子头部通过其真实路径的平均速率。
VAP：平均路径速率是精子头部通过其平均轨迹的平均速率。
ALH：精子头部的侧向移位(ALH)被定义为精子头部的当前路径相对于VAP的变化的幅度。
VSL:直线速率是精子头部通过连接第一位置至其最后位置的直线的平均速率。
图2B：对用肽SEQ ID NO：1处理的人精子进行的速率测试的结果。
A：关于初始VCL的％激活。
B：关于初始VAP的％激活。
C：关于初始ALH的％激活。
D：关于初始VSL的％激活。
图3：来自猕猴(非人灵长类动物)的睾丸精子与肽SEQ ID NO 1孵育(7.8Kda肽)和不与肽SEQ ID NO：1孵育(对照)之后的活动细胞和前向运动细胞的测量。活动精子和前向运动精子的特征分别在于VAP>1μm/s和VAP>30μm/s和STR>70％。STR＝VSL/VAP。用SigmaPlot进行统计学分析。t检验用于比较La-1-样肽对精子活动性参数的影响。数据代表平均值±SEM。具有双尾P值≤0.05的统计检验被认为是显著的。
图4：与肽SEQ ID NO 1孵育(7.8Kda肽)和不与肽SEQ ID NO：1孵育(对照)的来自非人灵长类动物的睾丸精子的速率、VCL(μm/s)的测量。活动精子和前向运动精子的特征分别在于VAP>1μm/s和VAP>30μm/s和STR>70％。STR＝VSL/VAP。用SigmaPlot进行统计学分析。t检验用于比较La-1-样肽对精子活动性参数的影响。数据代表平均值±SEM。具有双尾P值<0.05的统计检验被认为是显著的。
图5：新鲜(左侧小图)和冷冻(右侧小图)人射精精子与根据SEQ ID NO：1的肽孵育(7.8kDa肽)或不与根据SEQ ID NO：1的肽孵育(对照)之后的％活动细胞和前向运动细胞的测量。活动精子和前向运动精子的特征分别在于VAP>1μm/s和VAP>30μm/s和STR>70％。STR＝VSL/VAP。用SigmaPlot进行统计学分析。t检验用于比较La-1-样肽对精子活动性参数的影响。数据代表平均值±SEM。具有双尾P值≤0.05的统计检验被认为是显著的。
【详述】
在本发明中，术语“活动性激活”或“精子活动性激活”应理解为意指增加精子的速率。这意指增加精子的非前向运动速率和任选地前向运动活动性。该术语还包括增加非活动精子(即，具有0μm/s的初始速度的精子)的速率。
在本发明中，术语“精子活动性激活剂”应理解为增加精子的速率的试剂。这包括增加非前向运动速率和任选地前向运动速率。该试剂还可以增加非活动精子(即，具有0μm/s的初始速度的精子)的速率。
在本发明中，术语“前向运动速率(progressive velocity)”应理解为意指至少30μm/s的速率。
在本发明中，术语“非前向运动速率(non-progressive velocity)”应理解为意指1至30μm/s的速率。
在本发明中，术语“弱精子症”应理解为意指精子活动性降低。完全的弱精子症意味着100％不动精子。
在本发明中，术语“前向运动精子”应理解为意指具有至少30μm/s的速率的精子。在本发明中，术语“生物活性”应理解为意指具有激活精子活动性的活性。
在本发明中，术语“治疗有效量”是指足以诱导期望生物结果的量。对于生物系统的任何其它期望的改变，该结果可以是疾病的体征、症状或原因的减轻。具体而言，该结果可以是精子活动性的激活。
在本发明中，术语“同源的”意指具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性。
在本文中，“蝎子(Scorpio Maurus palmatus)”和“蝎子(Maurus palmatus)”是同义的。
【La-1-样肽试剂】
本发明涉及呈现生物活性的La-1-样肽试剂。具体地，本发明涉及的La-1-样肽试剂可以激活哺乳动物精子。因此，该试剂可用作治疗男性或雄性不育症、特别是用于治疗“弱精子症”或“少精子症”的治疗剂。其还可以用于出于动物生产目的增加动物的生育力。
本发明还提供了包含治疗有效量的La-1-样肽试剂的组合物，其可用于治疗男性或雄性不育症。
本发明人鉴定的肽已经从蝎子的毒液中分离，并具有73个氨基酸(SEQ ID NO：1)和约7850kDa的分子量。本申请人已经鉴定所述肽也作为在氨基酸24和氨基酸25之间具有切割位点的前肽(SEQ ID NO：3)存在。因此，切掉24个氨基酸的N-末端肽MEHALKSLLLICLVVFSFTS LCMG(SEQ ID NO：2)，以得到肽SEQ ID NO：1。
预期前肽SEQ ID NO：3具有与SEQ ID NO：1相似水平的生物活性。
本申请人已经发现，所述肽含有四个二硫桥。第一个Cys位于SEQ ID NO：3的位置29/98，且最后一个Cys位于SEQ ID NO：3的位置96/98。因此，SEQ ID NO：3的某些N-末端截短物(其优选不破坏所述二硫桥并保留生物活性，如通过激活哺乳动物精子的能力所测量)被认为是本发明的实施方案。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂包含具有生物活性的肽SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的C末端截短物，如通过其激活哺乳动物精子的能力所测量。
根据本发明的优选实施方案，所述La-1-样肽试剂包含根据SEQ ID NO：1的肽。
根据另一个实施方案，所述La-1-样肽试剂包含根据SEQ ID NO：1和/或SEQ IDNO：3的肽。
根据SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的肽可以例如用组氨酸标签或用于标记蛋白质的其它标记标签来标记。根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂包含标记的根据SEQID NO：1的肽。类似地，SEQ ID NO：3的截短物，包括SEQ ID NO：1，可以标记并且所述La-1-样肽试剂可以包含此类标记的截短物。
图1显示鉴定的肽、来自蝎子(S.Maurus palmatus)的La-1-样蛋白质与来自五种其它五种(S.Urodacus yaschenkoi、八重山蝎(H.Liocheles australasiae)、红爪蝎(S.Pandinus cavimanus)、H.Opisthacanthus cayaporum和东亚钳蝎(B.Mesobuthusmartensii))的La-1-样蛋白质的序列比对。在最下面一行以没有颜色的字母指示共有序列，并且对于每个氨基酸指示％同一性。
预期与SEQ ID NO：1具有至少60％或70％或80％或90％或95％氨基酸序列同一性的肽具有对于肽SEQ ID NO：1所鉴定的生物活性。这些肽也被认为能够激活哺乳动物精子的活动性，且因此被认为是本发明的La-1-样肽试剂的实施方案。预期来自例如以下的La-1-样肽也激活哺乳动物精子的活动性：S.Urodacus yaschenkoi(Luna-Ramirez,K.,Quintero-Hernandez,V.,Vargas-Jaimes,L.,Batista,C.V.,Winkel,K.D.,and Possani,L.D.(2013).Characterization of the venom from the Australian scorpionUrodacus yaschenkoi:Molecular mass analysis of components,cDNA sequences andpeptides with antimicrobial activity.Toxicon.63:44-54.doi:10.1016/j.toxicon.2012.11.017.Epub@2012Nov 23.,44-54)、八重山蝎(Miyashita,M.,Otsuki,J.,Hanai,Y.,Nakagawa,Y.,and Miyagawa,H.(2007).Characterization of peptidecomponents in the venom of the scorpion Liocheles australasiae(Hemiscorpiidae).Toxicon.50,428-437.)、红爪蝎(Diego-Garcia,E.,Peigneur,S.,Clynen,E.,Marien,T.,Czech,L.,Schoofs,L.,and Tytgat,J.(2012).Moleculardiversity of the telson and venom components from Pandinus cavimanus(Scorpionidae Latreille 1802):transcriptome,venomics andfunction.Proteomics.12,313-328),H.Opisthacanthus cayaporum(Silva,E.C,Camargos,T.S.,Maranhao,A.Q.,Silva-Pereira,I.,Silva,L.P.,Possani,L.D.,andSchwartz,E.F.(2009).Cloning and characterization of cDNA sequences encodingfor new venom peptides of the Brazilian scorpion Opisthacanthuscayaporum.Toxicon.54,252-261)和东亚钳蝎(Ma,Y.,He,Y.,Zhao,R.,Wu,Y.,Li,W.,andCao,Z.(2012).Extreme diversity of scorpion venom peptides and proteinsrevealed by transcriptomic analysis:implication for proteome evolution ofscorpion venom arsenal.J.Proteomics.75,1563-1576)。包含来自后者物种的这些肽中的任何一种或多种的La-1-样肽试剂也被认为是本发明的实施方案。
根据本发明的实施方案，所述活动性激活剂包含至少一种与SEQ ID NO：1具有至少60％或70％或80％或90％或95％氨基酸序列同一性的肽。所述La-1-样肽试剂可以是SEQID NO：1或与SEQ ID NO 1具有至少60％或70％或80％或90％或95％氨基酸序列同一性的肽的生物活性的N-和C末端截短物或突变体。所述试剂可以包含任何所述肽的混合物。可以突变所述肽以调节它们的生物活性，例如通过进一步增加它，或增加生物作用的持续时间或通过改变另一种药理学参数。此类肽被认为是本发明的一部分。
根据本发明的实施方案，激活剂中所包括的肽从它们的天然来源分离。例如，根据SEQ ID NO：1的肽可以从蝎子分离。例如，来自其它物种(包括例如U.yaschenkoi、八重山蝎(L.australasiae)、红爪蝎(P.cavimanus)和东亚钳蝎(M.martensii))的La-1样肽可以从它们的天然来源分离。
根据本发明的实施方案，La-1-样肽试剂中所包含的肽是在合适的表达系统中、例如在酵母、大肠杆菌或其它合适的表达系统中产生的重组肽。
根据本发明的优选实施方案，所述La-1-样肽试剂是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3，或在合适的表达系统(例如大肠杆菌或Sf9细胞)中产生的同源肽。
在本发明的实施方案中，所述La-1-样肽试剂可以包含与另一肽序列融合的SEQID NO：1或同源肽的杂合或融合肽。另一肽序列可以具有帮助受精过程或稳定La-1-样肽试剂的功能。
本发明人已经使用天然化学连接策略(Native Chemical Ligation Strategy)合成了根据SEQ ID NO：1的肽并证实其保留了与从蝎子的毒液中分离的肽相关的生物活性。
根据本发明的实施方案，La-1-样肽试剂是通过技术人员已知的合适合成方法产生的合成肽。例如，技术人员可以引用天然化学连接策略。
根据本发明的优选实施方案，所述La-1-样肽试剂可以包含根据SEQ ID NO：1或同源肽的合成肽。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以包含作为SEQ ID NO：1或如上所述的同源肽的合成衍生物的肽。这些衍生物可以包括可用于增加稳定性或改善其它物理化学或药代动力学或药效动力学参数的衍生物，例如PEG化、高糖基化或甘露糖基化。根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以包含已经合成产生的肽和/或已经通过重组表达系统产生的肽和/或已经从天然来源分离的肽。
在优选实施方案中，所述La-1-样肽试剂包含从至少一种天然来源(例如从蝎子的毒液)分离的SEQ ID NO：1或同源肽。在另一个实施方案中，所述La-1-样肽试剂包含已经在合适的表达系统中表达的重组SEQ ID NO：1或同源肽。在优选实施方案中，所述La-1-样肽试剂包含已经化学合成的SEQ ID NO：1或同源肽。在另一个实施方案中，所述La-1-样肽试剂包含前述肽的混合物。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以包含呈二聚体或三聚体或多聚体形式的肽，只要它们保留其生物活性。
所述La-1-样肽试剂可以储存在合适的缓冲液中用于立即使用或用于在约4℃储存。根据一个实施方案，可以冷冻La-1-样肽试剂。在该情况下，所述La-1-样肽试剂可以储存在合适的低温缓冲液中。如果冷冻，则所述La-1-样肽试剂可以在-20℃储存最多达约6个月或在-80℃储存更长时段。
所述La-1-样肽试剂，当呈溶液或乳状物或悬浮液或凝胶的形式时，可以使用适合于将肽灭菌的任何方法灭菌，例如通过用0.22μm过滤器过滤。
根据本发明的实施方案，可以将所述La-1-样肽试剂冻干并在室温或4℃或-20℃或-80℃储存，这取决于使用者的需要。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以以粉末、纤维、薄片、悬浮液、溶液或任何其它合适的形式储存。
根据本发明的另一个方面，所述活动性激活剂可以与至少一种可用于ART程序(包括体外受精程序或体内辅助生殖程序)的其它试剂组合。该其它试剂可以是可用于增加精子活动性、稳定精子样品或任何其它可用于ART技术中的功能的试剂。
La-1-样肽试剂具有生物活性
由于其新发现的生物活性，本发明的La-1-样肽试剂具有治疗用途。在本发明的一个实施方案中，所述La-1-样肽试剂可用作药物。
因此，本发明还提供了药物组合物，其包含作为活性成分的La-1-样肽试剂以及药物载体或稀释剂。根据本发明的实施方案的La-1-样肽试剂可以通过允许所述试剂与精子接触的途径施用。例如，根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂通过阴道途径施用于女性或雌性。在该情况下，可以将所述La-1-样肽试剂配制成适合于每种施用途径的剂型。
用于阴道施用的含有La-1-样肽试剂的组合物可以呈任何合适的形式，包括乳膏或凝胶，优选呈栓剂的形式。除了活性肽以外，这些形式可以含有技术人员已知的合适赋形剂。
组合物可以施用于人或动物。所述组合物可以呈溶液、悬浮液、凝胶、乳膏、乳状物、胶囊、片剂的形式和/或用于施用于人或动物的其它合适形式。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可用于治疗哺乳动物中的雄性不育症、特别是人中的男性不育症。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可用于治疗弱精子症和/或少精子症。
本申请人已经证明根据SEQ ID NO：1的肽的生物活性(参见实施例2、3和4)。
在实施例2中，将人精子的样品与根据SEQ ID NO：1的肽溶液一起孵育。图2B中显示的结果表明孵育后精子活动性的增加。此外，最初精子越慢，肽在增加其速率方面越有效。左上小图显示，具有较低初始跟踪速度(PV单位)的精子与具有较高初始跟踪速度(CL)的精子相比具有较高的活动性的激活。类似地，在右上小图中，具有低初始路径速率(VAP)的精子经历最高达80％的增加，而具有60μm/s的初始VAP的精子具有约20％的活动性增加。
图2B的左下小图显示测试的结果，其中测量与根据SEQ ID NO：1的肽一起孵育对人精子侧向幅度的影响(ALH，参见图2A)。在Y轴上记录百分比增加。具有小于3.5μm的初始侧向幅度的精子比具有较高初始ALH值的精子具有更大的增加。在右下小图中，测量所述肽对前向运动速率(VSL)的影响。具有小于30μm/s的初始前向运动的那些精子显示20％至接近120％的增加，仅有一个异常值。由于与所述肽孵育，具有约40μm/s的初始VSL的那些显示20至55％的增加，而具有超过60μm/s的初始VSL的那些显示5至20％增加。
根据本发明的一个实施方案，所述La-1-样肽试剂增加哺乳动物精子活动性，如使用以下参数中的至少一种所测量：跟踪速度、路径速率、自然幅度、非前向运动速率和前向运动速率。
根据本发明的一个实施方案，所述La-1-样肽试剂对于弱精子症的治疗特别有效。根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂增加哺乳动物精子的前向运动活动性(初始速率超过30μm/s)。在优选实施方案中，所述试剂增加哺乳动物精子的非前向运动活动性(初始速率在1和30μm/s之间)。
在某些人工繁殖技术(诸如体外受精(IVF)、特别是胞质内精子注射(ICSI))中，理想的是用治疗剂处理精子以激活精子的活动性。该程序也可用于人工授精技术(包括IUI)中。该处理可以包括将待使用的精子样品与激活剂一起孵育的步骤。
根据本发明的一个实施方案，所述La-1-样肽试剂可以与待用于人工繁殖技术(包括IVF，特别是ICSI)中的精子样品一起孵育。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂可以与待用于人工授精方法(例如IUI)中的精子样品一起孵育。在本发明的实施方案中，可以在人和/或动物中实施人工授精以用于治疗目的。
在本发明的一个实施方案中，可以在动物中实施人工授精以用于非治疗目的。在该情况下，使用La-1-样肽试剂可用于增加动物的生育力和/或增加在人工程序中获得的受精率。
根据本发明的实施方案，La-1-样肽试剂与精子样品的孵育可以根据技术人员已知的方法实施。
待使用的肽可以存在于合适的溶液中，例如在支持精子存活或获能的介质中。肽的终浓度(在其与精子混合之后)可以在0.01微摩尔至1微摩尔(μM)的范围内。根据本发明的优选实施方案，对于牛精子，优选0.1μM的浓度。
通常，可以将一定量的精子溶液/悬浮液添加至含有待处理的精子的合适容器中。例如，为了在1毫升精子介质中处理一百万个细胞，可以添加0.1至0.2纳摩尔范围内的一定量的La-1-样肽试剂。精子细胞可以存在于合适的缓冲液中，例如已知允许精子存活的介质中。技术人员可以引用，例如用于牛精子的talp介质、用于小鼠精子的M2介质、用于人精子的合成人体液(HTF)或允许精子存活的任何精子介质，例如如Fraser LR(1993)In vitrocapacitation and fertilization.Methods in enzymology 225,p.239-253中所述。
根据本发明的一个实施方案，对于在例如IUI方法中处理牛精子，优选0.1μm的La-1-样肽试剂的终浓度。孵育时间可以在1分钟至20分钟、优选5分钟至15分钟、更优选8分钟至10分钟变化。当然，孵育时间可以根据所用的温度和所用的La-1-样肽试剂的浓度和其它因素而变化，但技术人员可以容易地确定待使用的合适的孵育条件。
根据本发明的一个实施方案，孵育温度可以在35℃至39℃变化，例如38℃。
在用活动性激活剂孵育期间和/或之后，可以通过在显微镜下或其它观察手段观察精子样品，或通过使用细胞分选机器或允许测量细胞活动性的其它装置来测量精子活动性的增加。这允许选择样品中的精子以进一步用于ART程序中。
根据本发明的实施方案，测量精子活动性，作为以下参数中的任何一种或多种：跟踪速度、路径速率、自然幅度、非前向运动速率和前向运动速率。优选的参数是非前向运动速率和前向运动速率。
根据本发明的实施方案，可以选择精子样品中活动性最高的精子用于给定程序中。例如，可以选择10％或20％或30％或40％或50％活动性最高的精子。优选地，选择50％活动性最高的精子。
选择的精子数量取决于所使用的受精技术。
例如，对于ICSI，单个活动性最高的精子细胞用于引入卵子中。
在其中哺乳动物卵子与许多精子一起孵育的IVF技术中，选择合适数量的精子。
在人工授精技术中，例如，在IUI中，可以使用基本上所有的精子细胞，或者可以使用至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％的精子细胞。
或者，不进行选择，并且在该程序中使用所有或基本上所有的精子样品。例如，在使用工业人工授精技术用于动物中可能就是这种情况。在该情况下，所述La-1-样肽试剂用于增加雄性动物的生育力。这导致在该程序中获得的受精率增加。
根据本发明的各个实施方案的La-1-样肽试剂可用于激活哺乳动物精子的活动性。优选的物种包括人、牛、猪、山羊、绵羊、狗和猫。
根据本发明的另一个实施方案，所述La-1-样肽试剂用于增加动物中的人工繁殖技术中的受精率。优选的动物是牛、绵羊和猪。
对于所提及的所有技术(其中精子在体外与La-1-样肽试剂一起孵育)，可以在将精子样品引入雌性哺乳动物之前任选地除去后者试剂。
实施例3证明，根据本发明的一个实施方案的La-1-样肽试剂(其包含根据SEQ IDNO：1的肽)，增加小鼠体外受精实验中的受精率。根据两个细胞阶段的小鼠胚胎的数量测量受精率。结果表明，在La-1-样肽试剂存在的情况下，受精率与对照相比增加约20％。这些数据还表明La-1-样肽试剂是无毒的并且不会阻止胚胎发育。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂增加体外受精程序(特别是ICSI)中的受精率。具体而言，ICSI在人中实施。
根据本发明的实施方案，所述La-1-样肽试剂增加人工授精程序(特别是IUI)中的受精率。出于治疗原因，IUI可以在人或动物中实施以治疗男性或雄性不育症。
在一些不育男性或雄性中，在附睾中发生的精子成熟过程是功能失调的，并且期望在对已经取自睾丸的精子的体外处理中刺激成熟过程。一旦精子已经经历成熟，它们就然后可以用于体外受精程序。
实施例4描述了根据SEQ ID NO：1的肽与非人灵长类睾丸精子的孵育如何导致样品中精子细胞的非前向运动速率和前向运动速率的增加。结果显示于图3和4中。这些睾丸精子细胞中活动性的增加与通常在附睾中发生的成熟过程中发生的相似。
根据本发明的实施方案，然后可以选择在用La-1-样肽试剂处理后已表现出增加的活动性的睾丸精子用于IVF程序、例如ICSI程序中。根据本发明的实施方案，可以将La-1-样肽试剂的样品与睾丸精子样品一起孵育。所述试剂以合适的浓度(例如0.01微摩尔浓度至1微摩尔浓度)使用。精子样品以合适的浓度(例如，每毫升一百万)使用。例如，为了在一毫升精子介质中处理一百万个细胞，可以添加0.1至0.2纳摩尔范围内的量。
睾丸精子样品可以存在于合适的缓冲液中。通常，激活剂储存于合适的缓冲液中。孵育时期可以是1分钟至20分钟，并且通过显微镜在视觉上或其它观察手段或通过包括使用细胞分选机的其它手段监测。
在本发明的另一个实施方案中，所述激活剂用于增加来自附睾的精子样品中的精子的活动性。在该情况下，可以使用与上述那些相同或类似的方案。
可以在与La-1-样肽试剂孵育期间和/或之后监测精子细胞的活动性的增加。可以通过使用以下参数中的一种或多种来测量活动性的增加：跟踪速度、路径速率、自然幅度、非前向运动速率和前向运动速率。
在本发明的一个实施方案中，所述La-1-样肽试剂用于增加射精精子样品中精子的活动性。
在本发明的一个实施方案中，所述La-1-样肽试剂用于增加先前已经冷冻的精子样品的活动性。该精子样品可以是射精样品，或已经取自附睾或取自睾丸的样品。
这在人工繁殖技术(其中精子样品经常被冷冻并保存用于后来使用)中尤其相关。已知冷冻精子样品常常降低其活动性。在实施例5中，将人新鲜和冷冻的精子样品与根据SEQ ID NO：1的肽一起孵育。测量样品的前向运动和非前向运动活动性。显示于图5中的结果表明，与La-1-样肽试剂的孵育增加新鲜精子样品(左侧小图)和冷冻样品(右侧小图)两者的前向运动活动性和非前向运动活动性。数据还表明冷冻样品的效果大于新鲜样品的效果。
激活剂也可以在体内与精子接触。在该情况下，可以在授精发生之前在女性或雌性的阴道或宫颈中局部施用激活剂。
在本发明的一个实施方案中，所述活动性激活剂呈凝胶、胶囊、乳状物或乳膏的形式或适合于局部施用于女性或雌性的阴道和/或宫颈区域的其它形式。因此，可以在阴道或宫颈区域向女性或雌性局部施用活动性激活剂。因此，当向女性或雌性授精时，精子才与激活剂接触。
在本发明的实施方案中，所述La-1-样肽试剂可以与其它试剂一起存在，所述其它试剂可以是通常存在于用于分别稳定细胞和肽试剂的介质或缓冲液中的那些。
根据本发明的一个实施方案，所述La-1-样肽试剂可以与可以促进受精的其它已知试剂(诸如例如罂粟碱或其它试剂)一起存在。当La-1-样肽试剂用于人工授精程序或当其用于天然授精时，可以存在这些额外的试剂。
在本发明的实施方案中，所述La-1-样肽试剂用于人工授精方法，例如IUI。这些方法也是本发明的主题。IUI可以出于工业目的在动物中实施。在该情况下，所述La-1-样肽试剂用于增加动物的生育力。人工授精程序可以通过技术人员已知的方法实施。
例如，在授精发生之前，可以将待用于授精中的精子在体外与La-1-样肽试剂接触。在该情况下，将La-1-样肽试剂和精子两者都在合适的容器或注射器中孵育。精子可以作为精液存在或存在于合适的介质缓冲液中。精子活动性激活剂可以存在于合适的缓冲液中。
在冷冻之前，可以将La-1-样肽试剂引入精子吸管内。根据本发明的另一个实施方案，在人工授精程序期间，将La-1-样肽与精子共注射。
根据本发明的另一个实施方案，在人工授精程序期间，在注射至雌性哺乳动物中之前，精子和La-1-样肽试剂可以一起孵育特定时间段，例如1至20分钟，优选5至15分钟。
在临授精之前，精子和La-1-样肽试剂也可以在没有特定孵育步骤的情况下混合在一起。
对于授精，可以将精子和La-1-样肽试剂注射至女性或雌性的阴道或宫颈区域。可用于这些方法中的动物包括牛、绵羊、马、猫和狗、禽类，例如鸡、火鸡和工业生产的其它禽类。
所述La-1-样肽试剂增加该程序的受精率。这为用户带来了巨大的时间和成本益处，允许他减少获得的每个后代进行的干预次数。
在一个方面，本发明是用于在动物中的人工授精程序中增加受精率的方法。所述方法包括以下步骤：
(a)使来自动物的精子样品与治疗有效量的包含SEQ ID NO：1的La-1-样肽试剂接触；
(b)任选地除去La-1-样肽试剂；
(c)将雌性动物用所述精子样品和(如果存在的话)La-1-样肽试剂人工授精；
(d)测量生育率。
以下是举例说明精子活动性剂的生物影响的实施例，但决不是限制性的。
【实施例1：毒液分离和La-1样肽分离】
【毒液起源】
来自蝎子(Maurus palmatus)的粗毒液获得自Alphabiotoxine Laboratory(Montroeul-au-bois,BELGIUM)或Venomtech(Sandwich,Kent,UK)。将10mg冻干的粗毒液溶解于500μL的100mM乙酸铵(pH 6.8)中，并以10,000g离心10分钟。将250微升上清液用于进一步纯化。
【通过大小排阻色谱(SEC)的纯化】
在Superdex_peptide 10/300GL凝胶过滤柱上进行分离，在100mM乙酸铵(pH 6.8)中以0.5mL/min洗脱。每分钟收集级分，并在225nm处监测吸光度。将级分保持在-20℃，直至实施生物活性筛选和质谱分析。
【从蝎子(M.palmatus)的粗毒液纯化La-1-样肽】
【通过固相萃取(SPE)预纯化】
将来自蝎子的粗冻干毒液(2mg)溶解于200uL的0.1％三氟乙酸(0.1％TFA)中，并遵循制造商的说明预纯化至两个系列连接的SepPak C18 Light(Waters Corporation,Milford,MA)上，并用3mL 80％乙腈(ACN)/0.1％TFA洗脱。将80％洗脱的级分在真空下使用速度-真空系统(Labconco,Freezone 2.5plus,Kansas City,MO)干燥，并悬浮于0.1％TFA中。
【通过与电喷雾电离串联质谱偶联的在线液相色谱(LC-ESI-MS/MS)的分析】
注射等量的200μg粗毒液的等分试样级分用于在Agilent HPLC HP-1290系统(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上的在线LC-ESI-MS/MS分析。在维持在35℃且在线偶联至Thermo Q-Exactive Orbitrap的Accucore C18柱(2.1mm×150mm，来自ThermoScientific,Bremen,Germany)上进行分离。溶剂A为0.1％甲酸，且溶剂B为0.1％甲酸中的乙腈。施加线性梯度(以350μL/min的流速从4％B开始至60％B，持续120分钟)，以分级分离毒液组分。高分辨率质谱仪以正极性和数据依赖性模式操作。Q-Exactive Orbitrap获取380至2000Th(70,000分辨率，AGC目标3.106，最大IT 200ms)的全范围扫描，且然后在每个循环中将前10个肽离子片段化(17,500分辨率，AGC目标105，最大IT 100ms，强度阈值2×104，不包括电荷未指定的离子，在27处选择的归一化碰撞能量。然后在接下来15秒内从MS/MS中排除母体离子。使用软件Chemstation B.04.03和XcaliburTM2.2分别控制HPLC和质谱仪。
【通过反相HPLC分离天然La-1-样肽】
为了分离生物活性级分，使用Agilent HPLC HP-1290系统在与上述相同的洗脱条件下注射1.7mg等量的粗毒液。在225nm处监测吸光度后手工收集级分，在真空下干燥，并保持干燥直至使用。
【实施例2：对用肽SEQ ID NO：1处理的人精子进行的速率测试】
遵循伦理委员会批准和来自患者的知情同意，人精子获得自在格勒诺布尔生育部门咨询的患者。根据关于人实验的1975年的赫尔辛基宣言，所有患者都对Germetheque生物库中残余精子的保护及其在关于人生育力的研究中的使用给予了知情同意。Germetheque科学委员会批准了本研究设计。将射精物在37℃液化30分钟，并将精子在精子制备介质(Origio,Denmark)中以500g洗涤两次，每次5分钟。然后调整浓度用于CASA分析。还用SpermFreeze(Fertipro NV,Beernem,Belgium)冷冻精子，用于作为冷冻精子的进一步分析。
【计算机辅助的活动性分析(CASA)】
与根据SEQ ID NO：1的肽(天然的或合成的)孵育10分钟之后，将精子悬浮液立即置于100μm深度(对于小鼠精子)和20μm深度(对于人、NHP和牛精子)的分析室(LejaProducts B.V.,Netherlands)，并保持在37℃用于精子运动的微观定量研究。使用精子分析仪(Hamilton Thorn Research,Beverley)在37℃测量精子活动性参数。对于人、NHP、牛和小鼠的用于分析的设置分别如下：采集速率(60；60；60；60)Hz；帧数：(30；20；30；45)；最小对比度：(80；80；80；50)；最小细胞尺寸：(3；4；5；5)；低静态尺寸门控：(0,85；0,79；0,1；0,3)；高静态尺寸门控：(4,24；2,52；3,4；1,95)；低静态强度门控：(0,39；0,62；0,3；0,5)；高静态强度门控：(1,4；1,4；1,7；1,3)；最小伸长门控：(0；2；8；0)；最大伸长门控：(85；50；97；87)；放大系数：(1,89；1,89；1,89；0,7)。测量的活动性参数是曲线速率(VCL)和侧向头部位移的幅度(ALH)。对于每次测定分析最少100个活动精子。通过VAP>(1；1；1；1)定义，且前向运动精子通过VAP>(25；25；50；30)和STR>(80；80；70；70)定义活动精子。
【精子活力的测量】
将40μL精子与20μL稀释于NaCl 9/1000中的伊红1％和20μL稀释于NaCl9/1000中的苯胺黑10％混合。然后将精子铺层在载玻片上并干燥。对于每次测定最少分析100个精子。
数据显示于图2中。
【实施例3：小鼠中的受精研究】
卵收集自成熟的OF1雌性，其用5个单位的怀孕母马血清促性腺激素(PMSG)和5个单位的人绒毛膜促性腺激素(hCG)同步。将精子在M16 2％BSA(37℃,5％CO2)中获能55分钟并引入含有卵母细胞的液滴中。同时将活性肽引入液滴中。将卵母细胞与M16培养基中的1.5×105至5×105个获能的精子/ml(37℃，5％CO2)一起孵育，并在孵育4小时后洗去未结合的精子。受精后24小时，将不同阶段，即未受精的卵母细胞(包括流产的胚胎且对应于碎片化的卵母细胞或在挤压第二极体之后阻塞的卵母细胞)和2-细胞胚胎(作为成功受精的指示)进行评分。
【实施例4：来自猕猴的睾丸精子中的活动性激活】
安乐死之后收集猕猴睾丸。通过在具有高葡萄糖浓度的DMEM中手动研磨来撕裂输精小管。在37℃进行向上游泳(swim-up)30分钟，并将上部级分用DMEM高葡萄糖洗涤两次。调整精子浓度用于计算机辅助的精子分析(CASA)。用根据SEQ ID NO：1的La-1-样肽孵育10分钟之后，使用与实施例2中的那些相同的条件测量精子活动性。
【序列表】
SEQ ID NO：1
蝎子
SEQ ID NO：2
蝎子
SEQ ID NO：3
蝎子
SEQ ID NO：4
S Urodacus yaschenkoi
SEQ ID NO：5
八重山蝎
SEQ ID NO：7H Opisthacanthus cayaporum
SEQ ID NO：8
东亚钳蝎
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Claims (14)

1.包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂，其用作药物。
2.包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂，其用于治疗男性或雄性不育症。
3.包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂，其用于激活哺乳动物精子的活动性。
4.根据权利要求3所述的La-1-样肽试剂，其中所述哺乳动物精子选自人、牛、猪、绵羊、马、山羊和家畜、特别是猫和狗。
5.根据权利要求3或4所述的La-1-样肽试剂，其中所述待激活的精子已经预先冷冻，或已经新鲜射精，或从附睾或从睾丸回收。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的La-1-样肽试剂，其中其在体外与精子接触，所述精子待用于人工授精程序中或体外受精程序、特别是胞质内精子注射(ICSI)中。
7.根据权利要求3至5中任一项所述的La-1-样肽试剂，其中其在体内与精子接触，所述精子待用于天然授精程序中。
8.根据权利要求7所述的La-1-样肽试剂，其中其呈在授精之前用于阴道和/或宫颈施用于雌性的药物组合物的形式。
9.根据权利要求7中任一项所述的La-1-样肽试剂，其中其呈用于优选通过注射至附睾或睾丸中来局部施用于男性或雄性的药物组合物的形式。
10.权利要求3至6中任一项的La-1-样肽试剂，其用于选择合适的精子用于人体外受精程序、特别是胞质内精子注射(ICSI)。
11.根据权利要求3至10中任一项所述的La-1-样肽试剂，其中待处理的精子具有1至30μm/s的初始活动性。
12.根据权利要求3至10中任一项所述的La-1-样肽试剂，其中待处理的精子具有至少30μm/s的初始活动性。
13.选择用于人体外受精程序的精子的方法，其包括以下步骤：
(a)使精子样品与治疗有效量的包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂接触；
(b)使用至少一种选自跟踪速度、路径速率、自然幅度、非前向运动速率和前向运动速率的参数来观察和测量精子活动性；
(c)根据用于待使用的特定IVF程序中的标准选择活动性最高的精子。
14.用于增加动物的生育力的方法，其包括：
(a)将来自动物的精子样品与一定量的包含SEQ ID NO：1或与SEQ ID NO：1具有至少60％、70％、80％、90％或95％氨基酸序列同一性的肽的La-1-样肽试剂孵育；
(b)任选地除去La-1-样肽试剂；
(c)将雌性动物用所述精子样品和活动性激活剂人工授精；
(d)测量生育率。
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