JP2019520346A - 哺乳動物における精子運動能の活性化剤としての、Ｍａｕｒｕｓ ｐａｌｍａｔｕｓの毒液から単離されたＬａ−１様ペプチドの使用 - Google Patents

哺乳動物における精子運動能の活性化剤としての、Ｍａｕｒｕｓ ｐａｌｍａｔｕｓの毒液から単離されたＬａ−１様ペプチドの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は、精子の運動能を高めるＬａ−１様ペプチド剤に関する。このペプチド剤は、無毒であり、ヒトにおける男性不妊症の治療に使用することができるとともに、動物の生殖能力を高めるためにも使用することができる。また、卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を含む体外受精（ＩＶＦ）などの人工繁殖技術において使用することもできる。このＬａ−１様ペプチド剤は、子宮内受精（ＩＵＩ）などの人工授精技術にも使用することができる。

Description

本発明は、in vitroまたはin vivoのいずれかの生殖補助技術で精子の運動能を改善することによるオスの不妊症の治療に関する。また、本発明は、人工授精を含む動物生産方法において、動物のオスの生殖能力を高めることに関する。
６組に１組のつがいで不妊が発生し、２例のうち１例はオスの側に問題がある。
オスの不妊は多種多様な表現型を呈する。最も一般的な表現型の１つは、精子の運動能の低下または欠如を特徴とする精子無力症である［Publicover SJ, Barratt CL. Sperm motility: things are moving in the lab! Mol Hum Reprod. 2011 Aug; 17(8):453-6を参照のこと］。
生殖補助技術（ＡＲＴ）とは、つがいを助けるために使用される方法を説明するのに用いられる用語で、この用語には、オスの不妊の重症度に応じて、オスの精子機能不全が軽度である場合の子宮内受精（ＩＵＩ）、中程度である場合の体外受精（ＩＶＦ）、重度である場合の卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）が含まれる。
無精子症または乏精子症では、精巣または精巣上体からの精子の直接採取が必要とされる場合がある。
ＡＲＴでは、精子サンプルの凍結が必要なことが多い。しかし、サンプルを凍結することの主な欠点に、一度融解すると、過去に凍結された運動精子の運動能が新鮮な精子サンプルよりも低下し、直進する精子の量が少なくなることがある。
さらに、人工授精ＡＩが多用される農場動物では、凍結精子の運動能の低下はストロー内の精子の濃度を高めなければならないことを意味し、これによってこの方法の全体としての成功率が低下する。
このため、医学的に生殖を補助する状況では、精子の運動能を高めることができる無毒の薬剤を使用することに高い治療的価値がある。
運動精子は均等に成熟するわけではないため、医学的に生殖を補助する用途では、無精子症または乏精子症の患者から採取した個々の精巣運動精子の選択が、精子の運動能を活性化する分子に対する応答性を基準になされることが多い。国によっては、これらの分子のうち、今日の臨床用途で入手できるものが極めて少ないか全くないため、臨床医にはこの選択をするための手段が残されていない。
体外受精（ＩＶＦ）技術の場合と同様に、これらの薬剤は、たとえば精子がメスの膣管または子宮に注入される（ＩＵＩ）人工授精（ＡＩ）でも注目されている。これらの薬剤が、メスの生殖管における運動精子の運動能を高め、受精が起こる可能性を高めるためである。
したがって、そのような薬剤は、ヒトにおける治療用としてだけでなく、ウマ、ブタ、ウシ、さらにはシチメンチョウなどの鳥類といった多くの種の産業における生殖用の体外受精技術の成功率にも影響を及ぼす。
過去には、ヒトで精子の運動能を高めるために、ペントキシフィリン（ＰＴＦ）などの非選択的ホスホジエステラーゼ阻害剤が使用されていた。しかしながら、これらの分子はたしかに動きのある運動精子を加速させるものの、先体反応（ＡＲ）への刺激が早すぎるという重大な欠点があった。これは、精子が卵母細胞に達したときに、卵母細胞を貫通することができなくなることにつながる。
最近、他のＰＤＥ阻害薬が、小規模の臨床試験で検討されている［Tardif S, Madamidola OA, Brown SG, Frame L, Lefievre L, Wyatt PG, Barratt CL, Martins Da Silva SJ. Clinically relevant enhancement of human sperm motility using compounds with reported phosphodiesterase inhibitor activity. Hum Reprod. 2014, Oct 10;29(10):2123-35］。ＰＤＥ阻害活性を有する４３種の市販の分子のうち、６種が第Ｉ相で運動能の乏しさに対して強い効果を示し、第ＩＩ相ではこれらの化合物のうち３種が「さらに研究するための有望な候補」とされた。
別のＰＤＥ阻害剤であるパパベリンも、ペントキシフィリンに代わる物質として検討されている（たとえば、Terriou et al. 2015, Gynecologie Obstetrique et Fertilite 43, p. 786-790を参照のこと）。
したがって、ヒトにおける治療用途での卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を含む、ＡＩ、ＩＵＩ、ＩＶＦなどのＡＲＴにおいて用いられる精子細胞の運動能を高める、無毒の薬剤が依然として強く求められている。
運動精子の運動能を活性化する無毒の薬剤が必要とされている。
卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）を含む、ＩＶＦなどのＡＲＴで用いられる個々の運動精子を選択できるようにする薬剤が必要とされている。
また、動物における産業規模での人工授精でオスの生殖能力を高めるのに使用できる薬剤に対する強い需要も存在する。特に、凍結ストロー（サンプル）からの直進する精子の数を増やすことができる分子が必要とされている。
動物における産業規模での人工授精に使用するための、サンプルに含まれる精子集団の受精能力を高めることができる薬剤が必要とされている。
新鮮な運動精子ならびに過去に凍結された運動精子の運動能を活性化する／高めることができる薬剤が必要とされている。
ウシ、ブタ、ヒツジ、たとえばニワトリやシチメンチョウなどの鳥類、ウマ、ヤギならびに家畜、特にネコおよびイヌの精巣の精子、精巣上体の精子および／または射精された精子の運動能を活性化することができる薬剤が必要とされている。
ヒトにおいて精巣の精子、精巣上体の精子および／または射精された精子の運動能を活性化することができる薬剤が必要とされている。
本発明者らは、哺乳動物の精子の運動能を高めるために使用することができるＬａ−１様ペプチド化合物を発見した。出願人らは、過去にＬａ１様タンパク質として同定された［Abdel-Rahman, M.A, et al Toxicon 74 (2013) Venom proteomic and venomous glands transcriptomic analysis of the Egyptian scorpion Scorpio Maurus palmatus(Arachnida: Scorpionidae) pp. 193-207］が生物学的機能については知られていない、Maurus palmatusサソリの毒液から単離されたペプチドが、重要な生物学的活性を示すことを示した。ペプチド配列は、配列番号１である。
本発明は、配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、医薬として使用するためのＬａ−１様ペプチド剤に関する。
本発明の一実施形態によれば、前記Ｌａ−１様ペプチド剤は、哺乳動物におけるオスの不妊症の治療に使用することができる。特に、原因の一部または全部が精子の運動能の低さにあるオスの不妊症を、本発明のＬａ−１様ペプチド剤を用いて治療することができる。
本発明の一実施の形態によれば、前記Ｌａ−１様ペプチド剤を使用して、哺乳動物の精子の運動能を活性化することができる。この薬剤と哺乳類の精子とが接触すると、その速度が増す場合がある。さらに、運動していない精子が運動するようになることもある。
本発明の一実施形態によれば、前記精子は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギならびに家畜、特にネコおよびイヌの精子から選択される。
本発明の一実施形態によれば、前記精子は過去に凍結されたものであってもよく、射精されたばかりのものでもよく、または精巣上体もしくは精巣から採取したものであってもよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を、人工授精法で使用される精子または体外受精法、特に卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）で使用される精子と、in vitroで接触させることができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を、自然受精または人工授精法で使用される精子とin vivoで接触させることができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、受精（人工授精または自然受精のいずれか）前にメスの膣管および／または子宮頸部に投与するための医薬組成物の形態であってもよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、ヒトの体外受精、特に卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に適した精子の選択に使用することができる。
本発明の一実施形態によれば、処理対象となる精子は、初期の運動能が１〜３０μｍ／ｓであってもよい。
本発明の一実施形態によれば、処理対象となる精子は、初期の運動能が少なくとも３０μｍ／ｓであってもよい。
また、本発明は、ヒトの体外受精法において使用するための精子の選択方法であって、
ａ．配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、治療有効量のＬａ−１様ペプチド剤と精子サンプルとを接触させる工程と、
ｂ．曲線地点移動速度、進行方向性速度、自然な振幅、非直線地点移動速度、直線地点移動速度から選択される少なくとも１つのパラメータを使用して、精子の運動能を観察および測定する工程と、
ｃ．使用される特定の体外受精で用いられ基準に従って、最も運動している精子を選択する工程と、を含む方法に関する。
また、本発明は、動物の生殖能力を高めるための方法であって、
ａ．動物由来の精子サンプルを、配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、治療有効量のＬａ−１様ペプチド剤とともにインキュベートし、
ｂ．前記精子サンプルおよびＬａ−１様ペプチド剤をメスの動物に人工授精し、
ｃ．出生率を測定することを含む、方法に関する。
出願人が実施した試験では、パパベリンと比較したＬａ−１様ペプチドの優位性が観察された。また、出願人は、このペプチドが、精子に対して毒性を示さず、精子の運動能に対して長期にわたって作用することを示した。
図１Ａは、ソフトウェアＣＬＣ配列ビューアーを使用した、異種のサソリ由来のＬａ−１様ペプチドのシーケンスアライメントである。 図１Ｂは、ソフトウェアＣＬＣ配列ビューアーを使用した、異種のサソリ由来のＬａ−１様ペプチドのシーケンスアライメントである。 図２Ａは、精子の運動に関する定義を示す図である。 ＶＣＬ：曲線速度とは、実軌跡を通る精子頭部の平均速度である。
ＶＡＰ：平均進行方向性速度とは、平均軌跡を通る精子頭部の平均速度である。
ＡＬＨ：精子頭部振幅（ＡＬＨ）は、ＶＡＰに対する精子頭部の現軌跡の変動幅として定義される。
ＶＳＬ：直線速度とは、最初の位置と最後の位置を結ぶ直線を通る精子頭部の平均速度である。
図２Ｂは、ペプチド配列番号１で処理したヒト運動精子で実施した速度試験の結果である。 Ａ：初期ＶＣＬに対する活性化率（％）。
Ｂ：初期ＶＡＰに対する活性化率（％）。
Ｃ：初期ＡＬＨに対する活性化率（％）。
Ｄ：初期ＶＳＬに対する活性化率（％）。
図３は、マカカ（非ヒト霊長類）由来の精巣精子を、配列番号１のペプチドとともに（７．８Ｋｄａのペプチド）またはペプチドを使用せずに（対照）インキュベートした後に、運動している細胞と直進する細胞を測定した結果である。ＶＡＰ＞１μｍ／ｓおよびＶＡＰ＞３０μｍ／ｓおよびＳＴＲ＞７０％として、運動している精子と直進する精子の特徴を解析した。ＳＴＲ＝ＶＳＬ／ＶＡＰ。統計分析はシグマプロットを用いて行った。ｔ検定を使用して、精子の運動パラメータに対するＬａ１様ペプチドの効果を比較した。データは平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値＜０．０５の両側検定を有意であるとした。 図４は、非ヒト霊長類由来の精巣精子を、配列番号１のペプチドとともに（７．８Ｋｄａのペプチド）またはペプチドを使用せずに（対照）インキュベートした後に、速度ＶＣＬ（μｍ／ｓ）を測定した結果である。ＶＡＰ＞１μｍ／ｓおよびＶＡＰ＞３０μｍ／ｓおよびＳＴＲ＞７０％として、運動している精子と直進する精子の特徴を解析した。ＳＴＲ＝ＶＳＬ／ＶＡＰ。統計分析はシグマプロットを用いて行った。ｔ検定を使用して、精子の運動パラメータに対するＬａ１様ペプチドの効果を比較した。データは平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値＜０．０５の両側検定を有意であるとした。 図５は、ヒトの新鮮な（左側）射精精子と凍結した（右側）射精精子を、配列番号１のペプチドとともに（７．８Ｋｄａのペプチド）またはペプチドを使用せずに（対照）インキュベートした後に、運動している細胞と直進する細胞の割合（％）を測定した結果である。ＶＡＰ＞１μｍ／ｓおよびＶＡＰ＞３０μｍ／ｓおよびＳＴＲ＞７０％として、運動している精子と直進する精子の特徴を解析した。ＳＴＲ＝ＶＳＬ／ＶＡＰ。統計分析はシグマプロットを用いて行った。ｔ検定を使用して、精子の運動パラメータに対するＬａ１様ペプチドの効果を比較した。データは平均±ＳＥＭを表す。Ｐ値＜０．０５の両側検定を有意であるとした。
本発明において、「運動能の活性化」または「精子運動能の活性化」という用語は、精子の速度を高めることを意味すると理解されるべきである。これは、精子の非直線地点移動速度を高め、任意に、直線地点移動運動能を高めることを意味する。また、この用語は、運動していない精子（すなわち、初期速度が０μｍ／ｓである精子）の速度を増すことも含む。
本発明において、「精子運動能活性化剤」という用語は、精子の速度を高める薬剤として理解されるべきである。これは、非直線地点移動速度、任意に、直線地点移動速度を高めることを含む。また、この薬剤は、運動していない精子（すなわち、初期速度が０μｍ／ｓである精子）の速度を増すこともできる。
本発明において、「直線地点移動速度」という用語は、少なくとも３０μｍ／ｓの速度を意味すると理解されるべきである。
本発明において、「非直線地点移動速度」という用語は、１〜３０μｍ／ｓの速度を意味すると理解されるべきである。
本発明において、「精子無力症」という用語は、精子の運動能の低下を意味すると理解されるべきである。完全な精子無力症では、運動精子が１００％不動であることを意味する。
本発明において、「直進する精子」という用語は、速度が少なくとも３０μｍ／ｓである精子を意味すると理解されるべきである。本発明において、「生物学的に活性」という用語は、精子運動能活性化活性を有することを意味すると理解されるべきである。
本発明において、「治療有効量」という用語は、所望の生物学的結果を誘導するのに十分な量を指す。その結果は、生体系の他の何かを所望の状態にするための、疾患の徴候、症状または原因の低減である場合もある。特に、結果は精子の運動能の活性化であり得る。
本発明において、「相同な」という用語は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のアミノ酸配列同一性を有することを意味する。
本明細書において、「Scorpio Maurus palmatus」と「Maurus palmatus」は同義語である。
Ｌａ−１様ペプチド剤
本発明は、生物学的活性を示すＬａ−１様ペプチド剤に関する。具体的には、本発明によるＬａ−１様ペプチド剤は、哺乳動物の精子を活性化することができる。したがって、この薬剤は、オスの不妊症、特に「精子無力症」または「乏精子症」を治療するための治療薬として使用することができる。また、この薬剤を動物生産の目的で使用して、動物の生殖能力を高めることもできる。
さらに、本発明は、オスの不妊症を治療するのに有用なＬａ−１様ペプチド剤を治療有効量で含む組成物を提供する。
本発明者らによって同定されたペプチドは、サソリであるMaurus palmatusの毒液から単離され、７３個のアミノ酸（配列番号１）を有し、分子量が約７８５０ｋＤａである。出願人は、このペプチドがアミノ酸２４とアミノ酸２５との間に切断部位を有するプロペプチド（配列番号３）としても存在することを確認した。したがって、２４個のアミノ酸ＭＥＨＡＬＫＳＬＬＬＩＣＬＶＶＦＳＦＴＳＬＣＭＧ（配列番号２）のＮ末端ペプチドが切断され、配列番号１のペプチドが得られる。
プロペプチドである配列番号３は、配列番号１と同等の生物学的活性を有すると思われる。
出願人は、このペプチドが４つのジスルフィド架橋を含むことを発見した。第１のＣｙｓは、配列番号３の位置２９／９８と最後の９６／９８に位置する。したがって、配列番号３の特定のＮ末端トランケーション、好ましくは前記ジスルフィド架橋を破壊せず、哺乳動物の精子を活性化する能力で測定した場合の生物学的活性を保持するトランケーションが、本発明の実施形態であるとみなされる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、哺乳動物の精子を活性化する能力で測定した場合に生物学的に活性なペプチドである配列番号１または配列番号３のＣ末端トランケーションを含む。
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、配列番号１のペプチドを含む。
別の実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、配列番号１および／または配列番号３によるペプチドを含む。
配列番号１または配列番号３のペプチドを、タンパク質を標識するのに使用されるヒスチジンタグまたは他の標識タグで標識してもよい。本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、標識された配列番号１によるペプチドを含む。同様に、配列番号１を含む、配列番号３のトランケーションを標識してもよく、Ｌａ−１様ペプチド剤は、そのような標識されたトランケーションを含み得る。
図１は、S. Maurus palmatusおよび他の５種すなわちS. Urodacus yaschenkoi、H. Liocheles australasiae、S. Pandinus cavimanus、H. Opisthacanthus cayaporum、B. Mesobuthus martensiiから同定されたペプチドであるＬａ−１様タンパク質のシーケンスアライメントを示す。コンセンサス配列を色のない文字で一番下の行に示し、同一性（％）をアミノ酸ごとに示してある。
配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％であるペプチドは、配列番号１のペプチドで同定された生物学的活性を有すると思われる。これらのペプチドも哺乳動物の精子の運動能を活性化することができると考えられ、したがって本発明のＬａ−１様ペプチド剤の実施形態として考えられる。たとえばS. Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez, K. , Quintero-Hernandez, V., Vargas-Jaimes, L., Batista, C.V., Winkel, K.D., and Possani, L.D. (2013). Characterization of the venom from the Australian scorpion Urodacus yaschenkoi: Molecular mass analysis of components, cDNA sequences and peptides with antimicrobial activity. Toxicon. 63:44-54. doi: 10.1016/j.toxicon.2012.11.017. Epub@2012 Nov 23., 44-54)、H. Liocheles australasiae (Miyashita, M., Otsuki, J., Hanai, Y., Nakagawa, Y., and Miyagawa, H. (2007). Characterization of peptide components in the venom of the scorpion Liocheles australasiae (Hemiscorpiidae). Toxicon. 50, 428-437.)、S. Pandinus cavimanus (Diego-Garcia, E., Peigneur, S., Clynen, E., Marien, T., Czech, L., Schoofs, L., and Tytgat, J. (2012). Molecular diversity of the telson and venom components from Pandinus cavimanus (Scorpionidae Latreille 1802): transcriptome, venomics and function. Proteomics. 12, 313-328)、H. Opisthacanthus cayaporum (Silva,E.C, Camargos,T.S., Maranhao, A.Q., Silva-Pereira, I., Silva, L.P., Possani, L.D., and Schwartz, E.F. (2009). Cloning and characterization of cDNA sequences encoding for new venom peptides of the Brazilian scorpion Opisthacanthus cayaporum. Toxicon. 54, 252-261 )、B. Mesobuthus martensii (Ma, Y., He, Y., Zhao, R., Wu,Y., Li, W., and Cao, Z. (2012). Extreme diversity of scorpion venom peptides and proteins revealed by transcriptomic analysis: implication for proteome evolution of scorpion venom arsenal. J. Proteomics. 75, 1563-1576)由来のＬａ−１様ペプチドも、哺乳動物の精子の運動能を活性化すると思われる。後者の種からのこれらのペプチドのいずれか１つ以上を含むＬａ−１様ペプチド剤も本発明の実施形態として考えられる。
本発明の一実施形態によれば、運動能活性化剤は、配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％または７０％または８０％または９０％または９５％であるペプチドを少なくとも１つ含む。Ｌａ−１様ペプチド剤は、生物学的に活性なＮ末端トランケーションおよびＣ末端トランケーション、または配列番号１または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドの変異体であってもよい。この薬剤は、前記ペプチドのいずれかの混合物を含み得る。これらのペプチドを、たとえばそれをさらに増加させることによって、または生物学的作用の持続時間を増加させることによって、または別の薬理学的パラメータを変更することによって、これらのペプチドの生物学的活性を調節するように変異させてもよい。そのようなペプチドも本発明の一部とみなされる。
本発明の一実施形態によれば、活性化剤に含まれるペプチドは、それらの天然のソースから単離される。たとえば、配列番号１によるペプチドはScorpion Maurus palmatusから単離することができる。
たとえば、U. yaschenkoi、L. australasiae、P.cavimanus、M.martensiiをはじめとする他の種に由来するＬａ−１様ペプチドも、それぞれの天然のソースから単離することができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤に含まれるペプチドは、適切な発現系、たとえば酵母、大腸菌または他の適切な発現系で産生された組換えペプチドである。
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、配列番号１、配列番号３、または、大腸菌もしくはＳｆ９細胞などの適切な発現系で産生された相同ペプチドである。
本発明の一実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、別のペプチド配列に融合した、配列番号１または相同のペプチドのハイブリッドペプチドまたは融合ペプチドを含んでもよい。他のペプチド配列は、受精プロセスを補助するか、またはＬａ−１様ペプチド剤を安定させる機能を有することもある。
本発明者らは、Native Chemical Ligation Strategyを用いて配列番号１のペプチドを合成し、それがScorpion Maurus palmatusの毒液から単離されたペプチドに関連する生物学的活性を保持していることを確認した。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、当業者に知られている適切な合成方法によって製造された合成ペプチドである。たとえば、Native Chemical Ligation Strategyを引用することができる。
本発明の好ましい実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、配列番号１の合成ペプチド、または相同ペプチドを含んでもよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、配列番号１または上述したような相同ペプチドの合成誘導体であるペプチドを含んでもよい。これらの誘導体は、安定性を増加させるか、または他の物理化学的もしくは薬物動態学的もしくは薬力学的パラメータ、たとえば、ＰＥＧ化、過グリコシル化もしくはマンノシル化を改善するために有用な誘導体を含んでもよい。本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、合成されたペプチドおよび／または組換え発現系によって生産されたペプチドおよび／または組換え発現系によって産生されたペプチドおよび／または天然のソースから単離されたペプチドを含んでもよい。
好ましい実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、少なくとも１つの天然のソース、たとえばMaurus palmatusの毒液から単離された、配列番号１または相同ペプチドを含む。別の実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、適切な発現系で発現された、組換え配列番号１または相同ペプチドを含む。好ましい実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、化学合成された、配列番号１または相同ペプチドを含む。別の実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、前述のペプチドの混合物を含む。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、生物学的活性が保持される限り、二量体、三量体または多量体の形態であるペプチドを含んでもよい。
Ｌａ−１様ペプチド剤を、即時使用または約４℃での保存のために適切な緩衝液中で保存してもよい。一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を凍結することができる。その場合、Ｌａ−１様ペプチド剤を、適切な極低温緩衝液中で保存することができる。凍結する場合、Ｌａ−１様ペプチド剤を、−２０℃で最大約６ヶ月まで、または−８０℃でさらに長期間保存することができる。
Ｌａ−１様ペプチド剤が溶液、ミルク、懸濁液またはゲルの形態である場合、ペプチドを滅菌するのに適した任意の方法を用いて、たとえば０．２２μｍのフィルターでの濾過によって、このペプチド剤を滅菌することができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を凍結乾燥し、使用者の必要に応じて、室温または４℃、または−２０℃、または−８０℃で保存してもよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を、粉末、繊維、フレーク、懸濁液、溶液または任意の他の適切な形態で保存することができる。
本発明の他の態様によれば、この運動能活性化剤を、体外受精またはin vivoでの生殖補助を含むＡＲＴ法において有用な少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせてもよい。この他の薬剤は、精子の運動能の増加、精子サンプルの安定化またはＡＲＴ技術において有用な他の任意の機能に役立つ薬剤であってもよい。
Ｌａ−１様ペプチド剤は生物活性を有する
本発明のＬａ−１様ペプチド剤は、その新たに同定された生物学的活性がゆえに治療的に有用である。本発明の一実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、医薬品として使用することができる。
したがって、本発明は、活性成分としてＬａ−１様ペプチド剤を医薬用担体または希釈剤とともに含む医薬組成物も提供する。本発明の一実施形態によるＬａ−１様ペプチド剤は、薬剤が精子と接触することを可能にする経路によって投与することができる。たとえば、本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は膣を経路としてメスに投与される。この場合、Ｌａ−１様ペプチド剤を、それぞれの投与経路に適した剤形に製剤化することができる。
膣内投与用のＬａ−１様ペプチド剤を含有する組成物は、クリームまたはゲルを含む任意の適切な形態であればよく、好ましくは坐剤の形態であってもよい。これらの形態は、活性ペプチドに加えて、当業者に知られた適切な賦形剤を含むことができる。
組成物は、ヒトまたは動物に投与することができる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、ゲル、クリーム、ミルク、カプセル、錠剤および／またはヒトもしくは動物への投与に適した他の形態の形態であればよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、哺乳動物、特にヒトにおけるオスの不妊症の治療に使用することができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、精子無力症および／または乏精子症の治療に使用することができる。
出願人は、配列番号１のペプチドの生物学的活性を示した（実施例２、３、４を参照のこと）。
実施例２では、ヒト精子のサンプルを配列番号１のペプチドの溶液とともにインキュベートした。図２Ｂに示す結果は、インキュベーション後の精子の運動能が増したことを示している。さらに、運動精子が最初にゆっくりであればあるほど、ペプチドが速度を高めるのに効果的であった。左上の図は、初期の曲線地点移動速度（ＰＶ単位）が低い精子が、曲線地点移動速度の高い精子（ＣＬ）よりも運動能が活性化されたことを示している。同様に、右上の図において、進行方向性速度（ＶＡＰ）が低い精子では運動能が最大８０％増加したが、初期ＶＡＰが６０μｍ／ｓの精子では運動能の増加が約２０％であった。
図２Ｂの左下の図は試験の結果を示す。ここでは、配列番号１のペプチドを用いたインキュベーションがヒト精子頭部の平均振幅値（ＡＬＨ、図２Ａを参照のこと）に対して及ぼす影響を測定した。増加率がＹ軸に示されている。頭部の平均振幅値が最初に３．５μｍ未満であった精子は、ＡＬＨの初期値がこれよりも高い精子よりも大きく増加した。右下の図では、ペプチドが直線地点移動速度（ＶＳＬ）に対して及ぼす影響を測定した。初期の直線地点移動速度が３０μｍ／ｓ未満である精子では２０〜約１２０％増加し、この範囲から外れたのは１例だけであった。初期ＶＳＬが約４０μｍ／ｓの精子では２０〜５５％増加したのに対し、初期ＶＳＬが６０μｍ／ｓを超えた精子では、このペプチドを用いたインキュベーションで５〜２０％増加した。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、パラメータとしての曲線地点移動速度、進行方向性速度、自然な振幅、非直線地点移動速度、直線地点移動速度のうちの少なくとも１つを用いて測定した場合の哺乳動物の精子の運動能を増加させる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、精子無力症の治療に特に有効である。本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、哺乳動物の運動精子の直線地点移動運動能（初期速度が３０μｍ／ｓを超える）を増加させる。好ましい実施形態において、この薬剤は、哺乳動物の運動精子の非直線地点移動運動能（初期速度が１〜３０μｍ／ｓ）を増加させる。
体外受精（ＩＶＦ）、特に卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）などのある種の人工繁殖技術においては、薬剤を用いて精子を処理し、精子の運動能を活性化することが望ましい。この手法は、ＩＵＩを含む人工授精技術にも用いることができる。この処理は、使用される精子サンプルを活性化剤とともにインキュベートする工程を含んでもよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を、ＩＶＦ、特にＩＣＳＩを含む人工繁殖技術において使用される精子サンプルとともにインキュベートしてもよい。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤を、人工授精法、たとえばＩＵＩで使用される精子サンプルとともにインキュベートしてもよい。本発明の一実施形態では、人工授精は、治療目的で、人間および／または動物で実施することができる。
本発明の一実施形態では、動物において治療以外の目的で人工授精を行ってもよい。この場合、Ｌａ−１様ペプチド剤を使用して、動物の受精能を高めるおよび／または人工的な手法で得られる受精率を高めることができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤と精子サンプルとのインキュベーションについては、当業者に知られている方法で実施することができる。
使用されるペプチドを、適切な溶液、たとえば精子の生存または受精能獲得を補助する培地に入れておいてもよい。（精子と混合した後の）ペプチドの最終濃度は、０．０１マイクロモルから１マイクロモル（μＭ）の範囲であってもよい。
本発明の好ましい実施形態によれば、ウシの精子では０．１μＭの濃度が好ましい。
一般に、ある量の精子溶液／懸濁液を、処理対象となる精子の入った適切な容器に加えることができる。たとえば、１ミリリットルの精子培地で１００万個の細胞を処理するには、０．１から０．２ナノモルの範囲の量のＬａ−１様ペプチド剤を加えればよい。精子細胞を、適切な緩衝液、たとえば精子の生存を可能にすることが知られている培地中に入れておいてもよい。たとえば、Fraser LR (1993) In vitro capacitation and fertilization. Methods in enzymology 225, p. 239-253に記載されているように、ウシ精子用のtalp培地、マウス精子用のＭ２培地、ヒト精子用のヒト合成液（ＨＴＦ）または精子の生存を可能にする任意の精子培地をあげることができる。
本発明の一実施形態によれば、たとえば、ＩＵＩ法でウシの精子を処理するためには、Ｌａ−１様ペプチド剤の最終濃度が０．１μｍであると好ましい。インキュベーション時間は、１分間から２０分間、好ましくは５分間から１５分間、より好ましくは８分間から１０分間の間で変えることができる。もちろん、インキュベーション時間は、使用する温度と使用するＬａ−１様ペプチド剤の濃度ならびに他の要因に応じて変えることができるが、当業者であれば、使用すべき適切なインキュベーション条件を容易に決定することができる。
本発明の一実施形態によれば、インキュベーション温度は、３５℃から３９℃、たとえば３８℃まで変えることができる。
運動能活性化剤を用いたインキュベーション中および／またはインキュベーション後における精子の運動能の増加は、精子サンプルを顕微鏡もしくは他の観察手段の下で観察することによって、または細胞の運動能を測定することができる細胞選別機もしくは他の装置を使用することによって、測定することができる。これにより、ＡＲＴ法でさらに使用するためにサンプル中の運動精子を選択することが可能になる。
本発明の一実施形態によれば、精子の運動能は、パラメータとしての曲線地点移動速度、進行方向性速度、自然な振幅、非直線地点移動速度、直線地点移動速度のうちのいずれか１つ以上で測定される。好ましいパラメータは、非直線地点移動速度および直線地点移動速度である。
本発明の一実施形態によれば、所与の手順で使用するために、運動精子サンプル中の最も運動している精子を選択することができる。たとえば、１０％または２０％または３０％または４０％または５０％の最も運動している運動精子を選択することができる。好ましくは、運動精子のうち、５０％の最も運動している精子を選択する。
選択される運動精子の数は、使用している受精技術によって異なる。
たとえば、ＩＣＳＩでは、最も運動性の高い運動精子細胞を卵子への導入用に使用する。
哺乳動物の卵子をいくつかの精子とともにインキュベートするＩＶＦ技術では、適切な数の運動精子を選択する。
人工授精技術では、たとえば、ＩＵＩにおいて、実質的に全ての精子細胞または少なくとも５０％もしくは少なくとも６０％もしくは少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の精子細胞を使用することができる。
あるいは、選択をせずに、すべての精子サンプルまたは実質的にすべての精子サンプルを使用する方法もある。これは、たとえば、動物に用いる産業用の人工授精技術で使用する場合に有り得る形である。この場合、Ｌａ１様ペプチド剤を使用して、動物のオスの生殖能力を高める。これにより、その方法で得られる受精率が上がる。
本発明の様々な実施形態によるＬａ−１様ペプチド剤は、哺乳動物の精子の運動能を活性化するために使用することができる。好ましい種として、ヒト、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコがあげられる。
本発明の別の実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、動物の人工繁殖技術における受精率を高めるために使用される。好ましい動物は、ウシ、ヒツジ、ブタである。
精子をＬａ−１様ペプチド剤とともにin vitroでインキュベートする、上述したすべての技術について、精子サンプルをメスの哺乳動物に導入する前に、任意に後者の薬剤を除去してもよい。
実施例３は、配列番号１のペプチドを含む、本発明の一実施形態によるＬａ−１様ペプチド剤が、マウスの体外受精実験で受精率を高めることを示している。受精率については、２細胞期のマウス胚の数に基づいて測定した。これらの結果は、Ｌａ−１様ペプチド剤の存在下で、受精率が対照と比較して約２０％増加したことを示している。また、これらのデータは、Ｌａ−１様ペプチド剤には毒性がなく、胚の発達を妨げないことも示している。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、体外受精法、特にＩＣＳＩにおいて受精率を高める。特に、ＩＣＳＩはヒトで実施されている。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、人工授精法、特にＩＵＩにおいて受精率を高める。
ＩＵＩは、オスの不妊症を治療するための治療上の理由から、人間または動物において実施することができる。
不妊のオスには、精巣上体で起こる精子の成熟過程が機能不全を起こしている場合もあり、精巣から採取した精子をin vitroで処理して成熟過程を刺激することが望ましい。運動精子が成熟したら、体外受精に使用することができる。
実施例４では、配列番号１のペプチドと非ヒト霊長類の精巣精子をともにインキュベートすることにより、サンプル中の精子細胞の非直線地点移動速度および直線地点移動速度の両方の増加がどのように生じるかについて説明する。結果を図３および図４に示す。これらの精巣精子細胞の運動能の増加は、精巣上体で通常生じる成熟過程において起こるものに匹敵する。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤での処理後に運動能の増加を示した精巣運動精子を、その後、ＩＣＳＩ法などのＩＶＦで使用するために選択してもよい。本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤のサンプルを精巣精子サンプルとともにインキュベートすることができる。この薬剤は、適切な濃度、たとえば０．０１マイクロモルから１マイクロモルで使用される。精子サンプルは、適切な濃度、たとえば１００万個／ｍｌで使用される。たとえば、１ミリリットルの精子培地で１００万個の細胞を処理するには、０．１から０．２ナノモルの範囲の量を加えればよい。
精巣精子サンプルを、適切な緩衝液に入れておいてもよい。この活性化剤は一般に、適切な緩衝液に入れて保存される。インキュベーション時間は１分間から２０分間であればよく、可視的に顕微鏡もしくは他の観察手段によってモニターされるか、または細胞選別機の使用を含む他の手段によってモニターされる。
本発明の別の実施形態では、活性化剤は、精巣上体から得た精子サンプル中の精子の運動能を高めるために使用される。この場合、上述したものと同一または類似のプロトコルを使用することができる。
精子細胞の運動能の増加については、Ｌａ−１様ペプチド剤とのインキュベーション中および／またはインキュベーション後にモニターすることができる。運動能の増加は、曲線地点移動速度、進行方向性速度、自然な振幅、非直線地点移動速度、直線地点移動速度のうちの１つまたは複数のパラメータを使用して測定することができる。
本発明の一実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤を使用して、射精された精子サンプル中の精子の運動能を高める。
本発明の一実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤を使用して、過去に凍結された精子サンプルの運動能を高める。精子サンプルは、射精されたサンプルであってもよいし、精巣上体または精巣から採取されたものであってもよい。
これは、後から使用するために精子サンプルが凍結保存されることが多い人繁殖殖技術に特に関係する。精子サンプルを凍結すると、精子の運動能が低下する場合が多いことが知られている。実施例５では、ヒトの新鮮な精子サンプルと凍結させた精子サンプルを、配列番号１のペプチドとともにインキュベートした。サンプルの直線地点移動運動能と非直線地点移動運動能を測定した。図５に示す結果は、Ｌａ−１様ペプチド剤とのインキュベーションによって、新鮮な精子サンプル（左図）と凍結サンプル（右図）の両方で、直線地点移動運動能と非直線地点移動運動能が高まることを示している。また、このデータは、凍結サンプルを用いる場合の方が新鮮なサンプルを用いる場合よりも効果が大きいことを示唆している。
活性化剤を、in vivoで精子と接触させることもできる。この場合、受精が行われる前に、活性化剤をメスの膣または子宮頸部に局所投与すればよい。
本発明の一実施形態では、運動能活性化剤は、ゲル、カプセル、ミルクもしくはクリーム、またはメスの膣管および／もしくは頸部の領域への局所投与に適した他の形態である。このため、運動能活性化剤を、膣または頸部の領域でメスに局所投与することができ、メスに精液が注入されると精子が活性化剤と接触する。
本発明の一実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、細胞およびペプチド剤をそれぞれ安定化するために使用される培地または緩衝液中に通常存在することがある他の薬剤と共存することができる。
本発明の一実施形態によれば、Ｌａ−１様ペプチド剤は、たとえばパパベリンまたは他の薬剤など、受精を促進し得る他の既知の薬剤と共存することができる。これらの追加の薬剤は、Ｌａ−１様ペプチド剤が人工授精法に使用されているときや、自然受精に使用されているときに存在してもよい。
本発明の一実施形態では、Ｌａ−１様ペプチド剤は、人工授精法、たとえばＩＵＩに使用される。これらの方法も、本発明の主題である。ＩＵＩは、産業目的で、動物において実施することができる。この場合、Ｌａ−１様ペプチド剤は、動物の生殖能力を高めるために使用される。人工授精法は、当業者に知られた方法で実施することができる。
たとえば、受精に使用される精子を、受精前にin vitroでＬａ−１様ペプチド剤と接触させることができる。この場合、Ｌａ−１様ペプチド剤と精子の両方を適切な容器または注射器でインキュベートする。精子は、精液として存在してもよいし、適切な培地緩衝液中に精子を入れておいてもよい。精子運動能活性化剤を適切な緩衝液中に入れておいてもよい。
凍結前に、Ｌａ−１様ペプチド剤を精子ストローに導入してもよい。本発明の別の実施形態によれば、人工授精時に、Ｌａ−１様ペプチドを精子と同時に注射する。
本発明の別の実施形態によれば、人工授精時に、精子とＬａ−１様ペプチド剤を、哺乳動物のメスへの注射前に、たとえば１分間から２０分間、好ましくは５分間から１５分間の一定の時間、一緒にインキュベートすることができる。
また、特定のインキュベーション工程なしで、受精の直前に精子とＬａ−１様ペプチド剤とを混合してもよい。
受精のために、精子とＬａ−１様ペプチド剤をメスの膣管または頸部の領域に注射することができる。これらの方法で使用することができる動物として、ウシ、ヒツジ、ウマ、ネコおよびイヌ、ニワトリやシチメンチョウ、産業的に生産される他のトリを含む鳥類があげられる。
Ｌａ−１様ペプチド剤は、処置での受精率を高める。これは、利用者にとって時間と費用の面で大きな利点があり、得られた子孫１人あたりの介入の回数を減らすことができる。
一態様において、本発明は、動物における人工授精法における受精率を高めるための方法である。この方法は、
ａ）動物由来の精子サンプルと、治療有効量の、配列番号１を含むＬａ−１様ペプチド剤とを接触させる工程と、
ｂ）任意に、Ｌａ−１様ペプチド剤を除去する工程と、
ｃ）前記精子サンプルと、Ｌａ−１様ペプチド剤が存在する場合にはこのＬａ−１様ペプチド剤を、動物のメスに人工授精する工程と、
ｄ）出生率を測定する工程と、を含む。
以下は、精子運動能剤の生物学的効果を説明する例であり、何ら限定的なものではない。
実施例１
毒液の分離とＬａ−１様ペプチドの単離
毒の取得源
Maurus palmatus由来の粗毒液を、Alphabiotoxine Laboratory（ベルギー、モンルエル＝オー＝ボワ）またはVenomtech（英国ケント、サンドウィッチ）から入手した。１０ｍｇの凍結乾燥粗毒液をｐＨ６．８の１００ｍＭ酢酸アンモニウム５００μｌに溶解し、１０，０００ｇで１０分間遠心処理した。２５０マイクロリットルの上清をさらに精製した。
サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）による精製
Superdex_peptide 10/300 GLゲル濾過カラムで、ｐＨ６．８の１００ｍＭ酢酸アンモニウム中、０．５ｍＬ／分で溶出して分離を行った。１分ごとに画分を集め、２２５ｎｍで吸光度をモニターした。生物活性スクリーニングおよび質量分析による分析が行われるまで、画分を−２０℃に保った。
M. palmatusの粗毒液からのＬａ−１様ペプチドの精製
固相抽出（ＳＰＥ）による精製
M. palmatus由来の凍結乾燥粗毒液（２ｍｇ）を０．１％トリフルオロ酢酸（０．１％ＴＦＡ）２００μＬに溶解し、直列接続した２つのSepPak C18 Light（Waters Corporation、マサチューセッツ州ミルフォード）にて製造者の指示に従って予備精製し、０．１％ＴＦＡ中８０％アセトニトリル（ＡＣＮ）３ｍＬで溶出した。８０％溶出画分をスピードバキュームシステム（Labconco、Freezone 2.5plus、ミズーリ州カンザスシティ）を用いて真空乾燥し、０．１％ＴＦＡに懸濁させた。
エレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析と組み合わせたオンライン液体クロマトグラフィ（ＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）による分析
Agilent HPLC HP-1290システム（Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ）でのオンラインＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析用に、２００μｇの当量の粗毒液の分画アリコートを注入した。分離は、Thermo Q-Exactive Orbitrapに接続して３５℃に保ったAccucore C18カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、ドイツ、ブレーメンのThermo Scientificから入手）で行った。溶媒Ａには０．１％ギ酸、Ｂにはアセトニトリルの０．１％ギ酸溶液を用いた。３５０μＬの流速で１２０分間、４％Ｂから６０％Ｂまでの直線勾配を適用して毒成分を分画した。高分解能質量分析計を、正極性およびデータ依存モードで動作させた。Q-Exactive Orbitrapで３８０から２０００Ｔｈのフルレンジスキャン（分解能７０，０００、ＡＧＣターゲット３．１０６、最大ＩＴ ２００ｍｓ）を行った後、各サイクルで上位１０のペプチドイオンをフラグメント化した（分解能１７，５００、ＡＧＣターゲット１０５、最大ＩＴ １００ｍｓ）、強度閾値２×１０４、電荷なしのイオンを排除、正規化衝突エネルギーを２７で選択。その後、次の１５秒間のＭＳ／ＭＳから親イオンを除外した。Chemstation B.04.03およびXcalibur（商標）2.2ソフトウェアを使用して、ＨＰＬＣおよび質量分析計を制御した。
逆相ＨＰＬＣによるネイティブなＬａ−１様ペプチドの単離
生物活性画分を単離するために、上記と同じ溶出条件で、Agilent HPLC HP-1290システムを使用して、１．７ｍｇ当量の粗毒液を注射した。２２５ｎｍでモニターした吸光度に従って画分を手で集め、真空乾燥し、使用するまで乾燥状態に保った。
実施例２
配列番号１のペプチドで処理したヒトの運動精子について速度試験を実施
倫理委員会による承認後、患者のインフォームドコンセントを経て、Grenobleの生殖部門で相談をしている患者からヒト精子を得た。患者には全員、残存精子をGermethequeバイオバンクにて保存し、ヒトでの実験に関する１９７５年のヘルシンキ宣言に従ってヒトの生殖能力の研究で使用することについて、インフォームドコンセントを与えた。Germetheque Scientific Committeeでは本研究の設計を承認した。射精液を３７℃で３０分間液化し、精子をSperm Preparation Medium（Origio、デンマーク、モーレル）５００ｇで５分間洗浄した。次に、ＣＡＳＡ分析用に濃度を調整する。凍結精子としてさらに分析するために、精子をSpermFreeze（Fertipro NV、ベルギー、ベールネム）でも凍結した。
コンピュータ支援運動解析（ＣＡＳＡ）
配列番号１のペプチド（天然または合成）とともに１０分間インキュベートした後、精子懸濁液を、マウスの精子については深さ１００μｍ、ヒト、ＮＨＰ、ウシの精子については深さ２０μｍの分析チャンバ（Leja Products B.V.、オランダ）に直ちに入れ、精子の動きを顕微鏡で定量的に研究するために３７℃に保った。精子分析器（Hamilton Thorn Research、ベバリー）を用いて３７℃で精子運動性パラメータを測定した。分析用の設定設定は、ヒト、ＮＨＰ、ウシ、マウスについて、それぞれ以下の通りとした。取得速度（６０；６０；６０；６０）Ｈｚ、フレーム数（３０；２０；３０；４５）、最小コントラスト（８０；８０；８０；５０）、最小セルサイズ（３；４；５；５）、低静的サイズゲート（０．８５；０．７９；０．１；０，３）；高静的サイズゲート（４．２４；２．５２；３．４；１．９５）；低静的強度ゲート：（０．３９；０．６２；０．３；０．５）、高静的強度ゲート（１．４；１．４；１．７；１．３）。最小伸びゲート（０；２；８；０）、最大伸びゲート（８５；５０；９７；８７）、倍率（１．８９；１．８９；１．８９；０．７）。測定した運動パラメータは、曲線速度（ＶＣＬ）および精子頭部の振幅値（ＡＬＨ）であった。アッセイごとに最低１００個の運動している運動精子を分析した。運動している精子をＶＡＰ＞（１；１；１；１）で定義し、直進する精子をＶＡＰ＞（２５；２５；５０；３０）およびＳＴＲ＞（８０；８０；７０；７０）で定義した。
精子の活力の測定
４０μＬの精子を、ＮａＣｌ９／１０００で希釈した２０μＬのエオシン１％およびＮａＣｌ９／１０００で希釈した２０μＬのニグロシン１０％と混合した。次に、精子をスライドガラスに重層して乾燥させた。アッセイごとに最低１００個の運動精子を分析した。
データを図２に示す。
実施例３
マウスにおける受精試験
５ユニットの妊馬血清性性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ）および５ユニットのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）とシンクロナイズさせて、成熟したＯＦ１のメスから卵を採取した。Ｍ１６ ２％ＢＳＡ（３７℃、５％ＣＯ２）中で５５分間かけて精子に生殖能を獲得させ、卵母細胞を含有する液滴中に導入した。この液滴に活性ペプチドも同時に導入した。卵母細胞を１．５×１０５から５×１０５の生殖能獲得精子／ｍｌとともにＭ１６培地中にてインキュベート（３７℃、５％ＣＯ２）し、４時間のインキュベーション後に未結合精子を洗い流した。受精後２４時間で、異なる段階すなわち未受精卵母細胞（中絶胚を含み、断片化された卵母細胞または第二極体の押し出し後にブロックされた卵母細胞に対応）および２細胞胚（受精成功の指標として）をスコアリングした。
実施例４
マカカ由来の精巣精子における運動能活性化
マカカを安楽死させた後、精巣を採取した。グルコース濃度の高いＤＭＥＭ中での手動粉砕により、精細管を細断した。３７℃で３０分間スイムアップし、上側の画分をＤＭＥＭ高グルコースで２回洗浄した。精子濃度をコンピュータ支援精子分析（ＣＡＳＡ）用に調整した。配列番号１のＬａ−１様ペプチドとの１０分間のインキュベーション後、実施例２と同様の条件で精子の運動能を測定した。

Claims (14)

  1. 配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、医薬として使用するためのＬａ−１様ペプチド剤。
  2. 配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、オスの不妊症を治療するためのＬａ−１様ペプチド剤。
  3. 配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、哺乳動物の精子の運動能を活性化するためのＬａ−１様ペプチド剤。
  4. 前記哺乳動物の精子は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、ヤギ、家畜、特にネコおよびイヌから選択される、請求項３に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  5. 活性化される前記精子は、過去に凍結された精子であるか、射精されたばかりの精子であるか、または精巣上体もしくは精巣から採取された精子である、請求項３または４に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  6. 人工授精法で使用される精子または体外受精法、特に卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）で使用される精子と、in vitroで接触させる、請求項３から５のいずれか１項に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  7. 自然受精法で使用される精子とin vivoで接触させる、請求項３から５のいずれか１項に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  8. 受精前にメスの膣管および／または子宮頸部に投与するための医薬組成物の形態である、請求項７に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  9. 好ましくは精巣上体または精巣への注射によってオスに局所投与するための医薬組成物の形態である、請求項７に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  10. ヒトの体外受精法、特に卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）に適した精子の選択に使用される、請求項３から６のいずれか１項に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  11. 処理対象となる前記精子は、初期の運動能が１〜３０μｍ／ｓである、請求項３から１０のいずれか１項に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  12. 処理対象となる前記精子は、初期の運動能が少なくとも３０μｍ／ｓである、請求項３から１０のいずれか１項に記載のＬａ−１様ペプチド剤。
  13. ヒトの体外受精法において使用するための精子の選択方法であって、
    ａ．配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、治療有効量のＬａ−１様ペプチド剤と精子サンプルとを接触させる工程と、
    ｂ．曲線地点移動速度、進行方向性速度、自然な振幅、非直線地点移動速度、直線地点移動速度から選択される少なくとも１つのパラメータを使用して、精子の運動能を観察および測定する工程と、
    ｃ．使用される特定のＩＶＦ法で用いられ基準に従って、最も運動している精子を選択する工程と、を含む方法。
  14. 動物の生殖能力を高めるための方法であって、
    ａ．動物由来の精子サンプルを、配列番号１、または配列番号１とのアミノ酸配列同一性が少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％もしくは９５％であるペプチドを含む、ある量のＬａ−１様ペプチド剤とともにインキュベートし、
    ｂ．任意に、前記Ｌａ−１様ペプチド剤を除去し、
    ｃ．運動能活性化剤を用いて前記精子サンプルで動物のメスの人工授精を行い、
    ｄ．出生率を測定することを含む、方法。
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