ES2313116T3 - Peptido que aumenta la capacidad fusogenica de un gameto. - Google Patents
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Abstract
Uso in vitro o ex vivo de un péptido cíclico que comprende el tripéptido que forma un sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito para aumentar las capacidades fusogénicas de un gameto.
Description
Péptido que aumenta la capacidad fusogénica de
un gameto.
La presente invención se refiere a unos péptidos
cíclicos que aumentan la capacidad fusogénica del ovocito y/o del
espermatozoide, a unas composiciones farmacéuticas que los
comprenden y a sus usos, en particular para suplementar unos medios
de cultivo usados para la realización de la fecundación in
vitro. Los péptidos de la invención comprenden típicamente un
campo que procede del bucle desintegrina de la fertilina beta.
La fecundación es un proceso complejo que
conduce a la fusión de los gametos (espermatozoide y ovocito) para
formar un embrión. Este proceso natural tiene lugar en la zona
ampular de la trompa de Falopio y provoca un embarazo después de la
migración del embrión a la cavidad uterina.
Cuando la pareja es estéril, se utilizan unas
técnicas de Asistencia Médica para la Procreación para obtener
in vitro unos embriones. Éstos se transfieren entonces por
vía vaginal en el útero en el que se implantan.
La fecundación in vitro consiste
simplemente en poner en presencia, en un medio de cultivo adaptado y
en unas condiciones de pH y de temperatura apropiadas, los ovocitos
y los espermatozoides para que pueda producirse la fecundación. Las
técnicas se han desarrollado ampliamente desde hace 25 años
(Bavister 2002).
Cuando, por razones a veces no elucidadas,
tienen lugar unos fracasos de fecundación, los biólogos recurren a
las técnicas de fecundación asistida que consisten en microinyectar
un espermatozoide directamente en el citoplasma del ovocito. La
evolución de los embriones microinyectados no es, sin embargo, tan
buena como la observada después de la fecundación espontánea. En
efecto, los porcentajes de embarazo obtenidos mediante la
transferencia de estos embriones son inferiores a los obtenidos
después de la fecundación in vitro simple (25,4% contra
26,5%, sobre más de 20.000 intentos) (FIVNAT, 2001). Asimismo, los
embriones que proceden de una microinyección soportan menos la
congelación que los que proceden de FIV (BLEFCO 2001, Simon et
al., 1998). Así, una lisis embrionaria más importante se
produce en el momento de la descongelación y se obtiene un índice
de implantación más bajo.
Por último, se sabe que la activación del
ovocito consecutiva a la fecundación es mediada por unas ondas
cálcicas inducidas por un factor espermático (Swan 1999). Estas
ondas tienen una amplitud y una frecuencia reguladas de las que
depende la calidad embrionaria (Swan 1999). El cortocircuito de las
etapas membranarias de la interacción de los gametos modifica el
régimen de estas ondas cálcicas por dos razones. La interacción
fisiológica entre las membranas no tiene lugar, y el traumatismo
celular debido al paso de la pipeta de microinyección en el
citoplasma provoca la salida de calcio de los pools de reserva
(Tésarik et al.; 2002). Esta salida, aunque asegura la
activación del ovocito, también puede perturbar el desarrollo
ulterior del embrión.
El estudio del proceso de fusión de las
membranas espermática y ovocitaria en el momento de la fecundación
ha permitido demostrar en parte el mecanismo de la fusión.
La formación de un complejo molecular
membranario tiene lugar en la superficie del ovocito. Este complejo
es inducido por el espermatozoide en el momento de la fecundación.
Su composición y su mecanismo de acción se conocen parcialmente,
pero se sabe que la inhibición de su formación conlleva la
inhibición de la fusión de los gametos. Por lo tanto, la
fecundación está realmente relacionada con la formación de estos
parches en la superficie del ovocito.
La hipótesis comúnmente admitida es que el
espermatozoide interactúa mediante un primer receptor con la
membrana y que después de la transducción de una señal
transmembranaria un mecanismo celular permite la constitución de
estos parches sobre los cuales se fijará el espermatozoide.
Se han realizado unos estudios para determinar
la naturaleza del ligando espermático y del receptor ovocitario
implicados. Existe una proteína de membrana espermática denominada
Fertilina (Evans 2002). Esta molécula es un dímero alfa beta cuyas
moléculas pertenecen a la familia de las proteínas ADAM (A
Disintegrine And Metalloprotease) (Evans 2001). Se ha demostrado la
presencia de integrinas sobre el ovocito. Mediante su sitio de unión
putativo, la fertilina espermática es susceptible de interactuar
con una o unas integrinas ovocitaria(s).
Las moléculas de membranas denominadas
integrinas son unas moléculas de enlace que intervienen en los
enlaces célula-matriz extracelular y
célula-célula. Sus ligandos se enlazan a su dominio
extracelular mediante un sitio de unión constituido por un
tripéptido situado en el vértice de un bucle.
Los espermatozoides poseen una molécula de
membrana que tiene un sitio desintegrina capaz de enlazarse a una
integrina. Esta molécula, descubierta en la cobaya, pero presente en
todos los mamíferos estudiados incluyendo el ser humano y el ratón
se denomina Fertilina. Se ha secuenciado la Fertilina humana, lo que
hace que se conozca su sitio putativo de unión. Se trata del
tripéptido FEE (Fenilalanina, ácido glutámico, ácido glutámico)
(Gupta et al., 1995, Vidaeus et al., 1997) Un
octapéptido lineal que contiene la secuencia FEE inhibe la
adherencia de los espermatozoides al ovocito y su penetración
(Bronson 1999). Se han observado unos efectos comparables en otras
especies con unos péptidos lineales y cíclicos (Mwethera 1999; Gupta
2000; Li 2002; Myles 1994). Evans (1995) describe una ausencia de
efecto inhibidor de los péptidos cíclicos en el ratón.
Durante investigaciones de inhibidores de la
fecundación, los inventores han sintetizado un péptido cíclico,
denominado FEEc, que reproduce el sitio de unión de la fertilina
humana beta, y han ensayado su acción sobre los ovocitos humanos.
Contrariamente a sus expectativas y de manera sorprendente, los
inventores han demostrado así que (1) el péptido cíclico FEEc se
fija sobre la membrana del ovocito humano, (2) que induce una
relocalización de las proteínas de adhesión en la superficie del
ovocito, siendo esta relocalización normalmente inducida por los
espermatozoides, (3) que aumenta la capacidad fusogénica de los
ovocitos. Estos resultados han sido corroborados por unos
experimentos en el ratón.
Así, los inventores han identificado una nueva
clase de péptidos cíclicos capaces de aumentar la capacidad
fusogénica de los ovocitos y/o de los espermatozoides. Además, esta
clase de péptidos cíclicos sería capaz de activar el ovocito.
La invención se refiere al uso de un péptido
cíclico que comprende el sitio de unión de la fertilina beta (ADAM
2) a la integrina del ovocito para aumentar la capacidad fusogénica
y/o para activar un ovocito, típicamente in vitro o ex
vivo. Este sitio de unión se conoce en el bucle desintegrina de
la fertilina beta. Este péptido cíclico comprende como mínimo el
tripéptido indispensable para esta unión. Este tripéptido varía
según las especies. Sin embargo, la organización del bucle
desintegrina está muy bien conservada entre las especies (véase la
Tabla 1). Por lo tanto, será fácil para el experto en la materia
definir el bucle desintegrina de la fertilina beta e identificar el
tripéptido.
Se puede deducir de la Tabla 1 una secuencia
consenso del bucle integrina.
- \quad
- C-X_{2}-(F/L)-(K/M/I)-X_{5}-(KJR/Q)-(G/E)-X_{8}-X_{9}-C-R-X_{12}-X_{13}-TriPépt-C-D-(L/V)-X_{20}-E-Y-C-N-(G/E)-(T/S)- S-(A/E/G)-X_{29}-C
en la que los grupos X representan,
independientemente unos de otros, un aminoácido y "TriPépt" el
tripéptido indispensable para la unión de la fertilina a la
integrina. Preferentemente, X^{8} es un aminoácido cargado. Más
particularmente, se selecciona de entre E, R y Q. Preferentemente,
X_{12} se selecciona de entre P, L, E y G. Preferentemente,
X_{13} es un aminoácido poco voluminoso y no cargado, más
particularmente seleccionado de entre S, A, P y T. Preferentemente,
X_{29} es un aminoácido poco voluminoso y no cargado, más
particularmente seleccionado de entre S, A y V.
El péptido cíclico se puede ciclizar por
cualquier medio conocido por el experto en la materia. El péptido
se puede ciclizar mediante una unión covalente entre la cadena
principal y la cadena principal, entre la cadena principal y una
cadena lateral, o entre una cadena lateral y otra cadena lateral.
Esta unión puede ser una unión disulfuro, amida o tioéter.
Por ejemplo, el péptido se puede ciclizar
mediante una unión peptídica entre el residuo
N-terminal y el residuo C-terminal,
o con unos grupos aminas o carbocílixos de cadenas laterales de
residuos.
Preferentemente, el péptido se cicliza mediante
dos residuos de cisteína, más particularmente mediante un puente
disulfuro entre estos dos residuos de cisteína. La localización de
los residuos de cisteína debe permitir la ciclización del péptido.
Los residuos de cisteína se pueden disponer de tal forma que después
de la ciclización, el péptido presente una cola polipeptídica.
Preferentemente, estos residuos de cisteína estarán dispuestos en
los extremos del
péptido.
péptido.
El péptido cíclico según la presente invención
se puede describir por lo tanto mediante la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X representa un
aminoácido, m y n están comprendidos entre 0 y 14. Tal como se ha
indicado anteriormente, en las fórmulas de la invención, los grupos
X son independientes unos de otros y pueden representar, dentro de
una misma molécula, unos aminoácidos diferentes o idénticos.
Preferentemente, cuando m o n es igual a 0, el otro es por lo menos
1. Preferentemente, m+n es inferior a 10, preferentemente inferior o
igual a 5. En un modo de realización preferido, m+n es igual a 3.
Preferentemente, el tripéptido presenta una secuencia
X-(Q/D/E)-E, preferentemente
X-(D/E)-E. Por ejemplo, el tripéptido se puede
seleccionar de entre el grupo constituido por
(Q-D-E),
(F-E-E),
(T-D-E),
(V-G-E),
(F-D-E),
(T-D-E),
(N-Q-E),
(L-D-E). En un modo de realización
preferido, el tripéptido es
(F-E-E-).
(F-E-E-).
Preferentemente, el péptido cíclico según la
presente invención se describe mediante la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
Los residuos de cisteína implicados en la
ciclización del péptido pueden encontrarse naturalmente en el bucle
desintegrina o se pueden introducir en la secuencia del péptido. Los
bucles desintegrinas son ricos en cisteínas. En efecto, se
conservan unos residuos de cisteína en las posiciones 1, 10, 17, 23
y 30 de estos bucles. Así, los péptidos se pueden ciclar por medio
de un puente disulfuro seleccionado de entre el grupo siguiente:
C1-C17, C1-C23,
C1-C30, C10-C17,
C10-C23, y C10-C30. Preferentemente,
los péptidos se ciclizan por medio de un puente disulfuro
seleccionado de entre C10-C17 y
C10-C23.
Los péptidos cíclicos según la presente
invención pueden, por lo tanto, presentar una de las siguientes
estructuras:
- \quad
- C_{1}-X2-(F/L)-(K/M/I)-X_{5}-(K/R/Q)-(G/E)-X_{8}-X_{9}C-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C_{17};
- \quad
- C_{1}-X2-(F/L)-(K/M/I)-X_{5}-(K/R/Q)-(G/E)-X_{8}-X_{9}C-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C-D-(L/V)-X_{20}-E-Y-C_{23};
- \quad
- C_{1}-X2-(F/L)-(K/M/I)-X_{5}-(K/R/Q)-(G/E)-X_{8}-X_{9}C-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C-D-(L/V)-X_{20}-E-Y-C-N-(G/E)-(T/S)-S-(A/E/G)-X_{29}-C_{30};
- \quad
- C_{10}-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C_{17};
- \quad
- C_{10}-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C-D-(L/V)-X_{20}-E-Y-C_{23};
- \quad
- C_{10}-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C-D-(L/V)-X_{20}-E-Y-C-N-(G/E)-(T/S)-S-(A/E/G)-X_{29}-C_{30};
en las que X representa un aminoácido y los
residuos de cisteína de los extremos forman unos puentes
disulfuro.
\vskip1.000000\baselineskip
Preferentemente, los péptidos según la presente
invención presentan una de las siguientes estructuras:
- \quad
- C_{10}-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C_{17}; o
- \quad
- C_{10}-R-X_{12}-X_{13}-TriPept-C-D-(L/V)-X_{20}-E-Y-C_{23}.
\vskip1.000000\baselineskip
Más particularmente, los péptidos cíclicos según
la invención se seleccionan de entre un grupo constituido por los
fragmentos 1-17, 1-23,
1-30, 10-17, 10-23,
y 10-30 de una de las secuencias SEC ID nº
1-8, preferentemente de la secuencia SEC ID nº 1.
Preferentemente, los péptidos cíclicos según la invención se
seleccionan de entre un grupo constituido por los fragmentos
10-17, 10-23 de una de las
secuencias SEC ID nº 1-8, preferentemente de la
secuencia SEC ID nº 1.
Los residuos de cisteína se pueden introducir en
el péptido a ciclizar. En un modo de realización preferido, el
péptido según la invención tiene la siguiente estructura:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un aminoácido. Se
privilegiará un aminoácido poco voluminoso y no cargado.
Preferentemente, X se selecciona de entre A, S o T. Más
particularmente, X es A o S. en un modo de realización preferido, X
es la serina y el tripéptido presenta la secuencia
(F-E-E) (SEC ID nº 9). La invención
se refiere muy particularmente a este péptido cíclico (denominado
FEEc en los ejemplos) y a su uso para aumentar la capacidad
fusogénica y/o de activar los
ovocitos.
Los aminoácidos del péptido cíclico según la
presente invención pueden ser naturales o no. Mediante la expresión
"aminoácido no natural" se entiende un análogo o un derivado de
un aminoácido natural. Por ejemplo, un aminoácido no natural puede
presentar una cadena lateral alargada, más corta, o variante que
presenta unos grupos funcionales apropiados. Evidentemente, se
prevén los estereoisómeros L y D. Además, los enlaces peptídicos se
pueden modificar para hacerlos resistentes a la proteolisis. Por
ejemplo, por lo menos un enlace peptídico (-CO-NH)-
se puede sustituir por un enlace divalente seleccionado de entre
(-CH_{2}-NH-), (-NH-CO-),
(-CH_{2}-O-), (-CH_{2}-S-),
(-CH_{2}-CH_{2}-),
(-CO-CH_{2}-), (-CHOH-CH_{2}-),
(-N=N-), y (-CH=CH-).
Los residuos de las secuencias descritas
anteriormente pueden variar de manera conservadora. Por el término
"conservadora" se entiende que el residuo variante presentará
unas características físico-químicas comparables.
Entre las características físico-químicas tenidas en
cuenta, se encuentra la voluminosidad estérica, la polaridad, la
hidrofobia o la carga.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere asimismo a las variantes y/o a los derivados de estos
péptidos cíclicos y a su uso, en particular para aumentar la
capacidad fusogénica y/o para activar los ovocitos. Estas variantes
y derivados conservan la capacidad de unión a la integrina del
ovocito, más particularmente a la integrina \alpha6\beta1.
La invención se refiere asimismo a un multímero
de péptido cíclico según la invención. Esta polimerización del
péptido cíclico se puede realizar mediante cualquier medio
disponible para el experto en la materia. Preferentemente, el
péptido cíclico está acoplado a una molécula portadora que permite
la polimerización del péptido. La unión entre el péptido cíclico y
la molécula portadora puede ser covalente o no covalente. Los
procedimientos para fijar los péptidos cíclicos a la molécula
portadora son bien conocidos por el experto en la materia y
comprenden la química de las aminas, el enlace carbodiimida de los
derivados carboxilo y amino, la activación del bromuro de
cianógeno, de N-hidroxisuccinimida, de epóxido, de
sulfhidrilo, o de hidrazida. El enlace entre la molécula portadora
y los péptidos cíclicos puede ser directo o indirecto. Cuando es
indirecto, se puede realizar a través de un vínculo. Este vínculo
puede tener una función de espaciador que evita una interacción de
la molécula portadora sobre las propiedades del péptido cíclico, en
particular las propiedades fusogénicas y/o activadoras. Este
vínculo puede ser un péptido. El péptido cíclico debe ser fijado a
la molécula portadora de manera que se mantiene la accesibilidad
del tripéptido. El número de péptidos cíclicos comprendido en el
multímero está preferentemente comprendido entre 2 y 1.000. La
forma multimérica del péptido según la presente invención permite
aumentar el efecto del péptido cíclico sobre la relocalización de
las proteínas de adhesión del ovocito.
Por ejemplo, la polimerización se puede realizar
por medio del par biotina/estreptavidina que permite preparar un
tetrámero del péptido cíclico. Así, cada péptido cíclico esta
enlazado a una biotina, y cuatro biotinas pueden enlazarse a una
molécula de estreptavidina.
Alternativamente, varios péptidos cíclicos según
la presente invención pueden ser portados por una proteína
transportadora. Preferentemente, esta proteína no tiene ningún
efecto biológico sobre el ovocito. El experto en la materia conoce
varias proteínas usadas como proteína portadora incluyendo la
albúmina sérica bovina (SAB) y la hemocianina de lapa.
Por otro lado, varios péptidos cíclicos según la
presente invención se pueden inmovilizar sobre un soporte sólido.
El soporte sólido puede ser de manera no exhaustiva agarosa, vidrio,
resinas celulósicas, resinas de sílice, poliestireno,
poliacrilamida. El soporte sólido se puede modificar con unos grupos
funcionales que permiten la fijación de los péptidos cíclicos, por
ejemplo por medio de los grupos carboxilo, amino, sulfhidrilo,
hidroxilo y/o carbohidrato contenidos en estos péptidos.
La presente invención se refiere a una
composición que comprende un péptido cíclico según la presente
invención o a un multímero de éste. Esta composición puede ser un
medio destinado al cultivo de gametos. Esta composición puede
comprender además un soporte farmacéuticamente aceptable. Esta
composición puede ser una composición farmacéutica, preferentemente
adaptada a una aplicación local. Preferentemente, esta aplicación
local se realiza a nivel del tracto genital femenino.
La presente invención se refiere al uso in
vitro o ex vivo de un péptido cíclico según la presente
invención, de un multímero de éste o de una composición según la
presente invención para aumentar la capacidad fusogénica de un
gameto, en particular del ovocito, o para activar un ovocito, así
como a un procedimiento correspondiente.
En particular, los péptidos cíclicos según la
presente invención se pueden usar para la fecundación in
vitro, para la inseminación artificial, y para la transferencia
nuclear (clonación) en los mamíferos, preferentemente
no-humanos. Preferentemente, estos péptidos se
usarán para realizar o mejorar una fecundación in vitro, más
particularmente en el ser humano. Con este fin, la invención se
refiere asimismo a un medio de cultivo de gametos suplementado con
un péptido cíclico según la presente invención o un multímero de
éste. En un modo de realización particular, el ovocito se pone en
presencia del péptido cíclico según la invención antes de ser
incubado en presencia de los espermatozoides. En otro modo de
realización, el ovocito se pone en presencia simultáneamente con el
péptido cíclico según la presente invención y el gameto
masculino.
Los péptidos de la invención se pueden usar
asimismo en un tratamiento destinado a aumentar la fecundidad. Así,
la presente invención se refiere al uso de un péptido según la
presente invención para la preparación de un medicamento destinado
al tratamiento de los problemas de fecundidad, así como a un
procedimiento correspondiente.
Los péptidos cíclicos según la presente
invención se pueden usar asimismo para potencializar los
espermatozoides.
Los diferentes procedimientos y usos de la
invención se pueden realizar in vitro o ex vivo. Se
practican ventajosamente in vitro o ex vivo con el
fin de producir unas células o unos materiales biológicos
tratados.
Los péptidos cíclicos según la presente
invención se pueden usar para cualquier especie cuya reproducción
necesita unos gametos. La invención presenta un interés particular
para las especies en vías de desaparición, las especies poco
fecundas o las especies de gran valor. Más particularmente, la
invención considera el uso de los péptidos cíclicos en los
mamíferos. Preferentemente, la presente invención puede aplicarse a
la reproducción o a la clonación de los ovinos, de los bovinos, de
los equinos, etc. Evidentemente, la presente invención se aplica
asimismo en la ayuda de la procreación humana.
Este péptido añadido a los medios de cultivo de
los gametos humanos es susceptible de potenciar su capacidad
fusogénica y llegar a la constitución de embriones respetando al
mismo tiempo las interacciones fisiológicas membranarias. Existen
dos intereses potenciales por su uso: la reducción del uso de la
microinyección intracitoplásmica como técnica de fecundación y la
mejora de la calidad de los embriones obtenidos.
Otros aspectos y ventajas de la invención se
pondrán más claramente de manifiesto a partir de la lectura de los
ejemplos siguientes, que deben ser considerados ilustrativos y no
limitativos.
Los ovocitos humanos usados para los
experimentos tenían dos orígenes: los ovocitos fracasados de
fecundación después de FIV y los ovocitos no microinyectados puesto
que son inmaduros en el momento de la ICSI y madurados in
vitro. Los pacientes habían donado estos ovocitos para la
investigación y habían firmado para ello un consentimiento previsto
por el CCPPRB del hospital de Aulnay sous Bois.
Estos ovocitos de 48 horas o madurados in
vitro no son o ya no son capaces de proporcionar ningún embrión.
Por otro lado, el mecanismo del bloqueo a la polispermia que
asegura la calidad diploide del embrión está situado a nivel de la
zona pelúcida del ovocito. Eliminando la zona pelúcida de estos
ovocitos se anula el mecanismo protector, lo que conduce en caso de
fusión gamética a unos zigotos polispérmicos no viables. Por
último, al realizarse el desarrollo embrionario en el interior de la
zona pelúcida durante los 6 primeros días, su ausencia impide que
tenga lugar dicho desarrollo.
Para mantener la membrana ovocitaria tan próxima
como sea posible de su estado natural, la eliminación de la zona
pelúcida que los inventores han realizado se ha efectuado de manera
mecánica con la ayuda de tijeras de microcirugía.
Se recolectó el esperma de donantes fecundos
después de 3 días de abstinencia, y se preparó como para los FIV.
Brevemente, el eyaculado se ha guardado a 37º hasta licuefacción y
después se seleccionó sobre un gradiente de Puresperm 2 capas (90 y
45%). El esperma se guardó entonces en unas condiciones capacitantes
hasta la inseminación de los ovocitos.
La secuencia completa del dominio desintegrina
de la Fertilina humana que constituye el bucle se representa a
continuación:
| CLFMSKERMCRP SFEECDLPEYCNGSSASC | SEC ID nº 1 |
El péptido sintético cíclico FEEc usado en este
ejemplo es el siguiente:
| CS FEEC | SEC ID nº 9 |
El péptido FEEc que los inventores han
sintetizado comprende la secuencia del tripéptido FEE. Comprende la
serina que le precede y la cisteína que le sigue. Los inventores han
añadido una cisteína suplementaria corriente arriba del sitio de
unión. Las dos cisteínas situadas en los extremos del péptido
permiten ciclizar el péptido.
La subunidad integrina alfa 6 está presente
sobre la membrana del ovocito humano. Ésta forma parte del complejo
multimolecular de fusión. Es la razón por la que los inventores la
han tomado como control de la remodelación membranaria.
Se han incubado los ovocitos sin zona pelúcida
en unas gotas de 20 \mul de medio de cultivo Ferticult con aceite
a temperatura ambiente. Se ha suplementado el medio con un
anticuerpo de ratón anti alfa 6 humano a 20 \muM (Chemicon
International, Londres, GB). Entonces, se han lavado los ovocitos y
se han fijado a continuación en PFA al 2% durante una hora. Se han
incubado a continuación durante 45 minutos con un segundo anticuerpo
anti-inmunoglobulina de ratón marcado con FITC o
con rodamina elevada en el asno (FITC-conjugated
donkey anti-mouse IgG o
Rhodamine-conjugated donkey
anti-mouse IgG 10 \mug/ml; Jackson laboratories).
Después del lavado, se han montado por último los ovocitos en
Immumount antifade (Shandon Laboratories) entre el portaobjetos y
la lámina y examinado con microscopio de fluorescencia (Zeiss
Axiophot) o bien con microscopio confocal (Leica Lasertechnik,
GmbH).
Se han realizado los ensayos funcionales de
inhibición de la fusión en unas condiciones similares a las usadas
para la FIV: es decir, en unas condiciones suficientemente próximas
a las condiciones fisiológicas puesto que permiten la obtención de
embarazos y de niños. Brevemente, se han incubado los ovocitos en
unas gotas de 20 \mul de Ferticult con aceite durante 18 horas en
una incubadora al 5% de CO2 a 37º con 4.000 espermatozoides
móviles. Los ensayos se han realizado suplementando el medio con el
péptido FEEc a una concentración de 200 \muM. Al final de la
incubación, se han lavado los ovocitos y se han incubado durante 20
minutos en Hoechst 33342 (Sigma) a 5 \mug/ml. Después de la
fijación en PFA al 4% PBS-BSA al 1% durante 30
minutos a temperatura ambiente, se han montado los ovocitos en
immumount entre el portaobjetos y la lámina antes de ser examinados
con UV. Los espermatozoides fusionados eran fluorescentes. Se han
analizado los portaobjetos en un microscopio Zeiss Axiophot
equipado con una cámara conectada a un programa de análisis de
imágenes Imaging System Package (Applied Imaging,
Newcastle-upon-Tyne, UK).
Se han incubado los ovocitos con péptido FEEc
biotinilado a 200 \muM durante 45 minutos. El examen en
microscopia confocal ha permitido demostrar una marcación
membranaria con el péptido FEEc tal como es visible sobre la
sección ecuatorial del ovocito (Figura 1A). La superposición
informática ha mostrado además que esta marcación corresponde a
unos parches membranarios (Fig. 1B).
El espermatozoide induce unos parches
multimoleculares. Incubando unos ovocitos madurados in vitro
con una suspensión de péptido FEEc a 200 \muM durante 18 horas,
los inventores han demostrado una redistribución de la subunidad
integrina \alpha6. En efecto, mientras que sobre el ovocito
intacto la distribución de la subunidad \alpha6 es homogénea
sobre la superficie del ovocito (Fig. 2A), el péptido FEEc induce su
redistribución en forma de pequeños agregados membranarios. En el
ratón, el espermatozoide induce efectivamente dichos parches
durante la fecundación. Se puede concluir entonces que el péptido
FEEc induce una redistribución membranaria de proteínas de adhesión
comparable a la inducida por el propio espermatozoide durante la
fecundación.
En unas condiciones parecidas, se han incubado
unos ovocitos sin zona pelúcida en presencia de 200 \muM de
péptido FEEc y de espermatozoides. En los ovocitos de control, se ha
observado una veintena de espermatozoides fusionados en el seno del
citoplasma ovocitario (Fig. 3A). En presencia de 200 \muM de
péptido FEEc, el número de espermatozoides citoplásmicos fue mucho
más importante (Fig. 3B). El experimento reproducido sobre un mayor
número de ovocitos hizo aparecer un aumento medio de 60%
aproximadamente del número de espermatozoides que se han fusionado
con el ovocito (26,1 \pm 8,3 contra 16,4 \pm 5,2; P < 0,001).
El aumento del número de espermatozoides es por lo tanto
estadísticamente significativo. Este efecto es específico puesto que
la incubación con el mismo péptido aleatorio no tiene ningún
efecto. La acción del péptido FEEc es reversible puesto que los
ovocitos preincubados con el péptido FEEc y después lavados e
inseminados no muestran ninguna variación de su capacidad
fusogénica. Por lo tanto, no existe tampoco ningún efecto tóxico
sobre los ovocitos sino que la co-incubación es
necesaria para que aparezca el efecto del péptido.
El péptido FEEc presenta por lo tanto la
propiedad de aumentar la capacidad fusogénica del ovocito humano.
Reproduce el mecanismo por el cual el espermatozoide presente en
contacto con la membrana ovocitaria induce los complejos
moleculares de fusión ovocitarios y permite por lo tanto un proceso
de fusión más fácil.
Puede servir para suplementar los medios de
cultivo usados para la reacción de la fecundación in vitro.
Por lo tanto, debería poder mejorar los porcentajes de fecundación
de las FIV realizadas para la esterilidad idiopática o para la
deficiencia espermática. Habría entonces una disminución del recurso
a las técnicas de microinyección y una mejora de la calidad de los
embriones obtenidos.
De manera parecida a lo que se ha observado en
la especie humana, se ha estudiado el efecto de un tripéptido
cíclico en el modelo de ratón. Por analogía, el motivo del
tripéptido reproducía esta vez el sitio de fijación de la
desintegrina de la fertilina \beta del ratón, es decir, el
tripéptido QDE. Este péptido se denominó QDEc.
Se han sobreovulado unos ratones C56b1/CBA de 6
semanas mediante 5 Ul de PMSG y 5 Ul de hCG administradas con 48
horas de intervalo. Trece horas después de la última inyección, se
han sacrificado los ratones y se han recuperado los oviductos y
después se han lacerado en un medio de M2. Los ovocitos recuperados
se han inseminado entonces en su cumulus o bien se han descoronado
mediante un rápido paso por hialuronidasa. Después, se ha eliminado
la zona pelúcida de los ovocitos descoronados mecánicamente con la
ayuda de tijeras de microdisección bajo una lupa binocular.
Se han preincubado los ovocitos sin zona
pelúcida durante 30 min. y después se han inseminado en presencia;
1) de un grupo de control de medio M16; 2) de medio suplementado con
10 \muM de QDEc; 3) de 100 \muM de QDEc y 4) de 1 mM de QDEc.
En todos los casos, se han inseminado los ovocitos durante 3 horas
con una concentración de 10^{6} espermatozoides móviles por
ml.
Se han incubado los ovocitos intactos con QDE
cíclico a 100 \muM y 10^{5} espermatozoides/ml.
Después de la incubación, se han lavado los
ovocitos cuidadosamente y se han incubado a continuación en Hoescht
a 10 \muM durante 30 min., se han aclarado y después examinado en
UV en un microscopio Zeiss. Se han analizado los datos con la ayuda
del programa Statview®.
Durante 5 experimentos, se han estudiado 170
ovocitos en 4 grupos. Mientras que la media del número de
espermatozoides fusionados por ovocito es de 2,2 \pm 0,1
(med\pmES) en el grupo de control, ésta aumenta de manera
dependiente de la dosis con la presencia del QDE en el medio de
incubación (Figura 5). Alcanza unas diferencias estadísticas para
unas concentraciones de 100 \muM (P < 0,05) y de manera
significativa para 1 mM (P < 0,004) con un aumento de 32% del
número de los espermatozoides fusionados.
En FIV habitual: los tres experimentos han dado
unos resultados coherentes con una media de fecundación de 32,1 +
7,6% para el control y 56,3 + 16,0% para el grupo ensayado (P <
0,001) (Figura 6).
El número de espermatozoides que se fusionan con
un ovocito sin zona pelúcida es de una veintena en la especie
humana mientras que no supera en general 2 espermatozoides en el
ratón. El aumento de este número, menos importante que en la
especie humana, bajo el efecto del QDE alcanza rápidamente un nivel
de significación estadística. Además, en la fecundación in
vitro de ovocitos intactos, el QDE cíclico provoca un aumento
del 75% del porcentaje de ovocitos normalmente fecundados. El
esquema de interacción del espermatozoide con la membrana
ovocitaria parece ser por lo tanto comparable en el ratón a lo que
ocurre en la especie humana. La versión ciclizada del péptido que
reproduce el sitio de fijación del dominio desintegrina de la
fertilina \beta aumenta bien las capacidades fusogénicas de los
gametos.
Figura 1. Detección del péptido FEEc
biotinilado en la superficie del ovocito humano
Se ha eliminado la zona pelúcida de unos
ovocitos mecánicamente y después se han incubado durante 45 min.
con el péptido biotinilado a 100 \muM. Se ha detectado el péptido
FEEc mediante un anticuerpo de ratón anti-biotina
reconocido por un anticuerpo biotinilado
anti-inmunoglobulina de ratón y después mediante la
estreptavidina-FITC. Entonces, se han montado los
ovocitos en immumount entre el portaobjetos y la lámina y se han
examinado con microscopio confocal. A: sección ecuatorial del
ovocito, B: superposición de las secciones que corresponden a un
hemi-ovocito.
Figura 2. Inducción de parches de fusión
mediante el péptido FEEc sobre el ovocito humano
Se han incubado unos ovocitos intactos con
péptido FEEc a 200 \muM durante 45 minutos. Después del lavado,
se han incubado con un anticuerpo anti subunidad integrina \alpha6
a 20 \muM durante 45 minutos y después se han fijado (PFA 4%
durante 30 minutos). Después del lavado, se han incubado con un
segundo anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón
marcado con rodamina. Después, se han examinado en
inmunofluorescencia. Fig. 2A: ovocito de control que muestra una
fluorescencia difusa y homogénea sobre la superficie del ovocito.
Fig. 2B: después de la incubación con el péptido FEEc, existe una
redistribución de la subunidad \alpha6 en forma de agregados
membranarios.
Figura 3. Ensayo funcional de fusión con unos
gametos humanos
Se han incubado los ovocitos sin zona pelúcida
en unas gotas de 20 \mul con aceite en un medio de cultivo con
4.000 espermatozoides móviles durante 18 horas. Después, se han
lavado e incubado a continuación en una disolución de Hoechst 33342
10 \muM durante 30 minutos antes de ser lavados de nuevo, montados
en immumount entre el portaobjetos y la lámina y examinados bajo
UV. Fig. 3A: ovocito de control que muestra la presencia de una
veintena de espermatozoides fusionados en el citoplasma ovocitario.
Fig. 3B: ovocito co-incubado con el péptido a 100
\muM que presenta una sesentena de espermatozoides fusionados.
Figura 4. Efectos del péptido FEEc sobre la
capacidad de fecundación del ovocito humano
Comparación de los índices de fecundación
obtenidos en ausencia y en presencia del péptido FEEc a 100 \muM
en el medio de incubación.
Figura 5. Efectos del péptido QDEc sobre la
fusión gamética en el ratón
Los números entre paréntesis representan el
número de ovocitos en cada grupo. Diferencia estadística con los
valores del grupo de control: * (P < 0,05); ** (P < 0,04).
Figura 6. Efecto de QDE cíclico sobre la
fecundación in vitro de ovocitos intactos de ratones
Número de acceso: Ratones Q60718; Ser
humano Q99965; Cobaya Q60411; Conejo Q28660; Macaco Q28478; Bovino
077780; Rata Q63202; Cerdo CAC84225.
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<130> B0200WO
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\vskip0.400000\baselineskip
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19-11-2003
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Patentln version 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Cavia porcellus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> oryctolagus cuniculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Macaca fascicularis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Bos taurus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Rattus norvegicus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Sus scrofa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> SITE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (14)..(16)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Tripéptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> péptido FEEc
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<221> DISULFID
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
Claims (22)
1. Uso in vitro o ex vivo de un
péptido cíclico que comprende el tripéptido que forma un sitio de
unión de la fertilina beta a la integrina del ovocito para aumentar
las capacidades fusogénicas de un gameto.
2. Uso según la reivindicación 1, en el que el
tripéptido es X-(Q/D/E)-E, siendo X un
aminoácido.
3. Uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que
el tripéptido es FEE.
4. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, en el que dicho péptido presenta la siguiente
fórmula:
en la que X representa un
aminoácido, m y n están comprendidos entre 0 y 14, y "TriPept"
designa dicho
tripéptido.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que m+n
es inferior a 10, preferentemente inferior o igual a 5.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que
dicho péptido presenta la siguiente fórmula:
en la que X es un
aminoácido.
7. Uso según la reivindicación 6, en el que X es
un aminoácido poco voluminoso y no cargado, preferentemente
seleccionado de entre A, S o T.
8. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, en el que el péptido cíclico está en forma de
multímero.
9. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, en el que el gameto es un ovocito.
10. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 8,
en el que el gameto es un espermatozoide.
11. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, destinado a mejorar la fecundación in vitro.
12. Uso según una de las reivindicaciones
anteriores, destinado a mejorar la inseminación artificial y/o la
transferencia nuclear en unos animales no humanos.
13. Uso según una de las reivindicaciones 1 a
10, destinado a mejorar la fecundación in vitro y la
inseminación artificial en el ser humano.
14. Péptido cíclico que presenta la siguiente
fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X representa un
aminoácido, m y n están comprendidos entre 0 y 14, una variante o un
derivado de
éste.
15. Péptido cíclico según la reivindicación 14,
en el que m+n es inferior a 10, preferentemente inferior o igual a
5.
16. Péptido cíclico según la reivindicación 15,
presentando dicho péptido la siguiente fórmula:
\vskip1.000000\baselineskip
en la que X es un aminoácido,
siendo X preferentemente seleccionado de entre A, S o
T.
17. Péptido cíclico según la reivindicación 16,
en el que X es S.
18. Multímero de péptidos cíclicos, presentando
dichos péptidos la siguiente fórmula:
en la que X representa un
aminoácido, m y n están comprendidos entre 0 y 14 y "TriPept"
designa el tripéptido X-(Q/D/E)-E que forma un
sitio de unión de la fertilina beta a la integrina del
ovocito.
19. Multímero según la reivindicación 18, en el
que el tripéptido es FEE.
20. Multímero según la reivindicación 18 ó 19,
presentando dicho péptido la fórmula siguiente:
en la que X es un aminoácido,
siendo X preferentemente seleccionado de entre A, S o
T.
21. Composición destinada a aumentar las
capacidades fusogénicas de gametos, que comprende un péptido según
una de las reivindicaciones 14 a 17, o un multímero según una de las
reivindicaciones 18 a 20.
22. Uso de un péptido según una de las
reivindicaciones 14 a 17, o un multímero según una de las
reivindicaciones 18 a 20, para la preparación de un medicamento
destinado al tratamiento de los problemas de fecundidad.
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