JP3427155B2 - 精子の生存性・運動性保持剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は精子の生存性・運動性保
持剤に関する。より詳細は、ウシ精子の生存性及び運動
性を保持する活性を有する糖蛋白質性物質を有効成分と
するウシ精子の生存性・運動性保持剤及び当該糖蛋白質
性物質を含有する培地を用いることからなるウシ精子の
生存性及び運動性の保持方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】哺乳類の卵管は、精子や卵子の輸送と成
熟、受精、初期胚の発生など、多くの重要な生殖機能に
関与する器官である。これまでに卵管で合成され、卵管
液中に分泌される糖蛋白質の存在が、マウス(Kapur and
Johnson; Dev. Biol. 112, 89-93, 1985)、ハムスター
(Oikawa et al; Gamete Res. 19, 113-122, 1988)、ウ
サギ(Oliphant and Ross; Biol, Reprod. 26, 537-544,
1982)、羊(Sutton et al; J. Reprod. Fertil. 72, 41
5-422, 1984)、ヒヒ(Fazleabas and Verhage; Biol. Re
prod. 35, 455-462, 1986)、ブタ(Buhi et al; J. Exp,
Zool, 252, 79-88, 1989)、ヒト(Verhage et al; Endo
crinology, 122, 1639-1645, 1988)など、種々の哺乳類
動物で判明している。しかし、これらの糖蛋白質の主要
な生殖機能に及ぼす生理的意義について、現在なお、あ
まりわかっていない。これらの糖蛋白質を抗原として作
製した抗体を用いて調べてみると、この物質は排卵直後
や発情期の卵管に特異的にみられ、卵管内卵子や受精卵
の透明帯や囲卵腔物質に結合することがわかっている(K
apur and Johnson; Anat. Rec. 221, 720-729, 1988、
Kan et al; J. Histochem. Cytochem. 36, 1441-1447,
1988)。他方、これらの糖蛋白質は、卵巣内卵子や血清
中には存在しないことがわかっている。

【０００３】ごく最近、ウシ卵管由来糖蛋白質の生化学
的、免疫学的性状については、いくつかの報告がなされ
ている。Boiceら(Biol. Reprod. 43, 457-465, 1990)
は、発情期にウシ卵管で合成、分泌される糖蛋白質は分
子量９７，０００で、糖鎖構造の違いにより、等電点が
５．５から８．１までのいくつかのクラスのものがある
ことを見出した。この物質に対するポリクローナル抗体
を作成し、ウェスタンブロット法により分子量９７，０
００の抗原と免疫交差することもわかった。この糖蛋白
質は、発情期のウシの卵管液中に存在し、血清中や卵
巣、子宮細胞の培養上清液中には存在しなかった。ま
た、Boiceらは(J. Exp. Zool. 263, 225-229,1992)、こ
の糖蛋白質とウシ受精卵との相互作用を調べた。この糖
蛋白質は、過排卵されたウシ受精卵の透明帯に存在し、
卵巣内卵子には存在しないことを示した。WegnerとKill
ian(Mol. Reprod. Dev. 29, 77-84, 1991)は、発情期の
卵管より分泌される分子量９７，０００の糖蛋白質と卵
透明帯の相互作用について調べた。この糖蛋白質に対す
るポリクローナル抗体は、発情期の卵管液を処理した透
明帯に強く結合することがわかった。

【０００４】卵管は受精の場であり、生体内で受精前精
子が卵管内でしばらくの間留まっていることが知られて
いる(Hunter and Wilmut, Reprod. Nut. Dev. 24, 597-
608,1984)。最近、卵管と精子の生理的相互作用を体外
培養系で調べた報告がある。Pollardら(Biol. Reprod.
44, 102-107, 1991)は、卵管上皮細胞の存在下では、精
子の運動性と受精能が長時間にわたって保持されること
を報告した。しかし、精子と卵管上皮細胞との共培養で
あるため、精子の運動性や受精能を改善する作用は、精
子が直接卵管上皮細胞との接触が必要なのか、また卵管
上皮細胞の合成・分泌する生理活性物質によるものか判
定できなかった。卵管由来の糖蛋白質と精子との生理作
用については、ほとんどその詳細はわかっていない。数
少ない報告の中に、この糖蛋白質は精子と結合すること
が示されている(Suttonら; In Reproduction of Sheep,
Eds D.R. Lindsay and D.T. Pearce. Australian Acad
emy of Science, Canberra, pp140-143, 1984); Lippes
and Wagh; Fert. and Steril. 51, 89-94, 1989)。し
かし、この糖蛋白質が精子と結合することによって、精
子の生物学的役割に対していかなる影響を与えるのかわ
かっていない。

【０００５】卵管より分泌・合成される糖蛋白質の遺伝
子解析された結果が、まだ部分的なものではあるが、最
近報告されている(Donnellyら; Mol. Endo, 5, 356-36
4, 1991)。エストロジェン処理した、ヒヒ卵管より分子
量１２０，０００の糖蛋白質が分泌され、主に等電点が
８．０と４．５の２種類であることが二次元電気泳動で
判明した。等電点４．５の酸性の糖蛋白質に対するポリ
クローナル抗体を用いてヒヒ卵管ｃＤＮＡライブラリー
より約１．２Ｋｂの遺伝子をとり、塩基配列を決定した
ところ、新規の糖蛋白質であることがわかった。また、
ノーザンブロット解析により、この糖蛋白質のｍＲＮＡ
の長さは２．８Ｋｂであること、卵管のポリ（Ａ）ＲＮ
Ａの試験管内転写により、この糖蛋白質のコアータンパ
ク質部分の分子量は６６，０００であることもわかっ
た。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】このように卵管で合成
・分泌される特異的糖蛋白質が、種々の哺乳類動物で発
見された。これまでに免疫的手法により、性周期依存
性、分子量の同定、卵管内や受精卵の特定の存在様式、
精子との結合などが報告されている。また、最近遺伝子
クローニング、遺伝子塩基配列も一部ではあるが、報告
されている。しかしながら、その物質の主要な生理的役
割についてはほとんどわかっていない。かかる観点か
ら、本発明者等は、卵管で合成・分泌される蛋白質につ
いて鋭意研究を重ねたところ、(1)ウシ卵管組織抽出物
より小麦胚芽レクチン−アガロースアフィニティークロ
マトカラムとＭｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマト
カラムの２段階で、分子量約９０，０００の糖蛋白質を
分離・精製できること、(2)この糖蛋白質のコア−蛋白
質部分のＮ末端のアミノ酸配列の決定により、これまで
に報告された蛋白質のデータベースを検索の結果、この
物質は新規の糖蛋白質であると考えられること、(3)こ
の物質は、体外培養系でウシ精子の生存性と運動性を促
進する重要な生理活性物質であることを見出して本発明
を完成した。即ち、本発明は、ウシ精子の生存及び運動
性を保持する活性を有する新規な糖蛋白質性物質を有効
成分とするウシ精子の生存性・運動性保持剤及び当該糖
蛋白質性物質を含有する培地を用いるウシ精子の生存性
及び運動性の保持方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
めになされた本発明は、ウシ卵管から得られえる、下記
の理化学的性質及び生理活性を有する糖蛋白質性物質を
有効成分として含有するウシ精子の生存性・運動性保持
剤である。 (1)分子量約９０，０００（１０％ポリアクリルアミド
を支持体としたＳＤＳ−電気泳動法による）。 (2)小麦胚芽レクチン−アフィニティークロマトカラム
に親和性を有する。 (3)Ｎ末端が、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
する。 (4)ウシ精子の生存及び運動性を保持する活性を有す
る。 また、本発明の方法は、上記の糖蛋白質性物質を含有す
る培地を用いることからなるウシ精子の生存性及び運動
性の保持方法である。

【０００８】本発明の糖蛋白質性物質は、例えば次ぎの
ようにして製造することができる。原料としては、本発
明の糖蛋白質性物質を含有する材料であれば特に限定は
されないが、好適には哺乳類の卵管が用いられる。かか
る生体材料からの本発明糖蛋白質性物質の製造は、基本
的には生体物質から蛋白質類を単離・精製するための一
般的な方法、例えば、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩析、透析、遠
心分離、限外濾過、凍結乾燥、電気泳動などの方法を適
宜組み合わせて実施することができ、好適にはアフィニ
ティークロマトグラフィーと陰イオン交換クロマトグラ
フィーを用いることにより実施される。

【０００９】特に好ましい操作法の一例を具体的に説明
すると、まず原料、例えば哺乳類卵管を用意し、それに
付着している夾雑物（血管、脂肪など）を除去し、適当
な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液など）で洗浄した後、
卵管を切開する。切り開かれた卵管を、適当な大きさ
（例えば、０．５〜１ｃｍ程度）に切断し、抽出用の緩
衝液（例えば、ベンザミジン及び塩化ナトリウムを含有
するトリス−ＨＣｌ緩衝液など）に浸し、凍結−融解−
振盪などの方法により組織を破壊させた後、遠心分離し
て上清を分離することにより粗糖蛋白質液を得る。得ら
れた粗糖蛋白質液を、小麦胚芽レクチン−アガロースア
フィニティークロマトグラフィーに付し、洗浄用緩衝液
（例えば、塩化ナトリウムを含有するトリス−ＨＣｌ緩
衝液など）で洗浄して非吸着物質を溶出させた後、Ｎ−
アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有する洗浄用緩衝液を
用いてカラムに吸着している糖蛋白質を溶出させる。な
お、小麦胚芽レクチンは、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサ
ミンとシアル酸残基に対して強い親和性を有することが
知られている。目的糖蛋白質を含有する溶出画分は、Ｍ
ｏｎｏ−Ｑなどの陰イオン交換体を用いた陰イオン交換
クロマトグラフィーに付して更に精製することにより、
目的糖蛋白質が得られる。上記の方法により、本発明の
糖蛋白質性物質が得られ、当該物質は上記の特性により
特定される。

【００１０】かくして得られた本発明の糖蛋白質性物質
は、その生理活性を保持する限り、そのアミノ酸配列の
一部が欠失又は他のアミノ酸により置換されていたり、
他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、Ｎ末端及び
／又はＣ末端に１又は２以上のアミノ酸が結合していた
り、あるいは糖鎖が同様に欠失又は置換していてもよ
く、これらの物質も本発明の範囲に包含されるものとす
る。

【００１１】

【発明の効果】本発明のウシ精子の生存性・運動性保持
剤の有効成分である糖蛋白質性物質は、ウシ精子の生存
性と運動性を体外培養系において保持する作用を有す
る。従って、本発明の保持剤を精子保存液や体外受精培
地に添加することにより、また本発明の保持方法によれ
ば、精子の生存性と運動性が改善される結果、効率のよ
い正常受精の確保、ひいては胚発生率の改善に対して格
別な効果を奏する。

【００１２】

【実施例】以下、本発明を実施例及び試験例に基づいて
より詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定され
るものではない。 実施例１ウシ卵管由来糖蛋白質（以下、ＢＯＧＰという）の分離
・精製 本発明の目的糖蛋白質を下記の方法で、ウシ卵管から分
離・精製した。即ち、屠殺された牝成牛の卵管（湿重量
約３０ｇ、２５頭分）を用意した。卵管の回りについて
いる血管、脂肪、結合織をはさみで切除した。卵管をリ
ン酸緩衝液（ＰＢＳ）で洗浄した後、卵管をはさみで切
開し、開いた状態にした。開かれた卵管は０．５〜１ｃ
ｍ間隔に切り刻み、１５０ｍｌ抽出用緩衝液（２０ｍＭ
トリス−ＨＣｌ、１０ｍＭベンザミジン−ＨＣｌ、
０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に浸した。次に、凍
結（−８０℃）し、続いて室温にて融解した。凍結融解
後、卵管組織片を激しく２０〜３０回シェイクし、遠心
管に分注し、３，５００回転／分（ｒ＝１５０ｍｍ）で
１５分間遠心操作を行い、上清液を回収した。この上清
液を、１５，０００回転／分（ｒ＝８０ｍｍ）、４℃、
６０分間遠心操作を行い、この上清液（可溶性画分蛋白
質量；約２．４ｇ）を粗蛋白質サンプルとした。この粗
蛋白質サンプル（蛋白質濃度；約１６ｍｇ／ｍｌ、１５
０ｍｌ）を小麦胚芽レクチン（以下、ＷＧＡという）−
アガロースアフィニティークロマトカラム（1５×５５
ｍｍ、ＨＯＮＥＮ）にのせた。その後、２００ｍｌ洗浄
用緩衝液（２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ、ｐＨ７．４）で洗浄し、ＷＧＡ−アガロースアフ
ィニティークロマトカラムに親和性のない物質をまず溶
出させた。カラムに結合している糖蛋白質は、１００ｍ
Ｍ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含有した洗浄用
緩衝液（２０ｍｌ）で溶出させた。かくして溶出され
た、ＷＧＡ−アガロースアフィニティークロマトカラム
に親和性のある分画（蛋白質量；約２２ｍｇ）は、Ｍｏ
ｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトカラムにかけ、最
終精製を行った。即ち、このＷＧＡ−アガロースアフィ
ニティークロマトカラムに結合した分画を、０．１Ｍ
ＮａＣｌを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液で透析
後、同じ緩衝液で平衡化したＭｏｎｏ−Ｑイオン交換カ
ラムに注入し、同緩衝液でカラムを５分間洗浄後、０．
１〜０．３Ｍ ＮａＣｌの直線的濃度勾配で溶出した。
その結果を図１に示す。図１に示されるように、溶出画
分は、フラクション（Ｆｒ）１〜４の分画に分取した。
ＢＯＧＰはフラクション１〜３（主にフラクション２）
に含有されており、ＢＯＧＰは糖鎖の異なるいくつかの
分子があると考えられ、フラクション２に示すように溶
出のピークが幅広い糖蛋白質として溶出される。

【００１３】実施例２ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析 ＢＯＧＰの分子量を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動法により調べた。電気泳動は、常法に準じて、
１０％ポリアクリルアミドを支持体としたＳＤＳ−電気
泳動法により行い、電気泳動された蛋白質は、クマーシ
ーブルー染色により分子量の同定を行った。その結果を
図２−Ａに示す。図２−Ａにおいて、１は実施例１にお
ける粗蛋白質サンプル（即ち、ウシ卵管抽出液を１５，
０００回転／分（ｒ＝８０ｍｍ）遠心後の上清液）であ
り、多くの蛋白質が含まれていることが判る。総蛋白質
量：３３μｇ また、２は、実施例１におけるＷＧＡ−アガロースアフ
ィニティークロマトカラムの結合分画であり、ほとんど
が分子量約９０，０００の糖蛋白質で、他にわずかでは
あるが分子量約６６，０００及び約５５，０００の物質
も認められる。総蛋白質量：３．２μｇ 更に、３は、実施例１におけるＭｏｎｏ−Ｑイオン交換
高速液体クロマトグラフィーにより精製されたフラクシ
ョン２（図１のＦｒ．２）の分画であり、分子量約９
０，０００のほぼ単一の糖蛋白質であることが判る。総
蛋白質量：１．４μｇ

【００１４】実施例３イムノブロット法による分析 精製されたＢＯＧＰの免疫的同定法として、イムノブロ
ット実験を行った。用いた抗体は、ウシ卵管組織抽出物
をラットに免疫して作成されたポリクローナル抗体を用
いた。このポリクローナル抗体は、ウシ卵胞期卵管灌流
液や卵管上皮組織に特異的に反応し、イムノブロット法
により分子量約９０，０００の糖蛋白質に反応すること
が既に判明している。実施例１で精製した各試料をＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ニトロセ
ルロースメンブレンにブロットした。メンブレンを３％
ウシ血清アルブミン／リン酸緩衝液で１時間ブロッキン
グを行い、１，０００倍に希釈した抗血清を４℃で一晩
反応させた。その後メンブレンを０．０５％ Ｔｗｅｅ
ｎ２０／トリス−ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、ペルオキシダ
ーゼ結合抗ラットＩｇＧ抗体（1，０００倍希釈）で室
温にて１時間反応させ、コニカイムノステイニングＨＲ
Ｐキットで発色させた。その結果を図２−Ｂに示す。図
２−Ｂにおいて、１は実施例１における粗蛋白質サンプ
ル（即ち、図２−Ａの１に対応）であり、当該サンプル
の主体は分子量約９０，０００の糖蛋白質であり、他に
わずかに分子量約６０，０００の物質が免疫的交差を示
した。総蛋白質量：３３μｇ また、２は、実施例１におけるＷＧＡ−アガロースアフ
ィニティークロマトカラムの結合分画（図２−Ａの２に
対応）であり、分子量約９０，０００の糖蛋白質のみが
免疫的交差を示した。総蛋白質量：１．６μｇ 更に、３は、実施例１におけるＭｏｎｏ−Ｑイオン交換
高速液体クロマトグラフィーにより精製されたフラクシ
ョン２の分画（図２−Ａの３に対応）であり、分子量約
９０，０００の糖蛋白質のみが免疫的交差を示した。総
蛋白質量：０．７μｇ

【００１５】実施例４糖鎖分解酵素処理したＢＯＧＰのＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動による分析 ＢＯＧＰが糖蛋白質であるかどうかの証明として３種類
の糖鎖分解酵素を処理した後、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法により分子量の移動パターンを調べ
た。電気泳動は、常法に準じて、１０％ポリアクリルア
ミドを支持体としてＳＤＳ−電気泳動法により行い、電
気泳動された蛋白質は、クマーシーブルー染色により分
子量の同定を行った。その結果を図３に示す。図３の１
〜４はそれぞれ以下の試料を示す。 １：精製された未処理のＢＯＧＰ（図１のＦｒ．２と同
じサンプル；２．５μｇ）であり、分子量は約９０，０
００であった。 ２：１００μｇのＢＯＧＰは０．１％ＳＤＳと５０ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む７０μｌの２０ｍＭ
カコジル酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶かした。その後、
この糖蛋白質を変性させるため５分間煮沸した。サンプ
ルを室温まで冷却し、２５μｌの７．５％トリトンＸ−
１００、７．５μｌの１００ｍＭ酢酸カルシウム、０．
０８ユニットのノイラミニダーゼを混合し、３７℃で１
時間処理した。このノイラミニダーゼ処理でＮ−アセチ
ルノイラミン酸の糖鎖構造が、特異的に切断された。さ
らにＮ−結合型の糖鎖を特異的に切断するＮ−グリカナ
ーゼ（０．３ユニット）を３７℃で１８時間処理後、電
気泳動を行った。分子量は、約６８，０００に減少し
た。電気泳動に用いた蛋白質量：２．５μｇ ３：上記２で得られたノイラミニダーゼ処理されたサン
プルをＯ−結合型の糖鎖を特異的に切断するＯ−グリカ
ナーゼ（１ミリユニット）を３７℃で１８時間処理後電
気泳動を行った。分子量は、約５８，０００に減少し
た。電気泳動に用いた蛋白質量：２．５μｇ ４：上記２で得られたノイラミニダーゼ処理されたサン
プルをＮ−グリカナーゼとＯ−グリカナーゼを一緒に３
７℃で１８時間処理後、電気泳動を行った。分子量は約
５３，０００に減少した。電気泳動に用いた蛋白質量：
２．５μｇ 以上の結果より、ＢＯＧＰはＮ型結合及びＯ型結合して
いる糖鎖を、その分子内に含む糖蛋白質であることがわ
かった。それぞれの酵素処理による分子量の差から、少
なくとも１個のＮ結合型糖鎖と、１０個以上のＯ結合型
糖鎖を保有すると推定できた。

【００１６】実施例５精製されたＢＯＧＰのＮ末端のアミノ酸配列の構造決定 実施例１において、Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体ク
ロマトグラフィーにより精製された糖蛋白質（３００ｐ
Ｍ）を、気相プロティンシークエンサー（島津製作所、
タイプＰＳＱ−１）にかけ、Ｎ末端のアミノ酸配列を決
定した。Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーによる図１のフラクション２（Ｆｒ．２）の分画
を気相プロティンシークエンサーにかけ、Ｎ末端より２
９番目までのアミノ酸配列を決定した。その結果を配列
表の配列番号１に示す。この２９個のアミノ酸配列をEu
ropean Molecular Biology Laboratory (Swiss PROT)の
データベースで解析したところ、これまでに報告されて
いる蛋白質との相同性は確認できず、新規物質と考えら
れる。なお、配列番号１のアミノ酸配列において、Ｎ末
端から５番目のアミノ酸（Ｘａａ）は、同定できなかっ
たことを示す。即ち、気相プロティンシークエンサーで
は、システイン残基と糖の付加されたアミノ酸は解読で
きないので、システイン又は糖鎖の結合したアミノ酸の
可能性がある。

【００１７】試験例 精子の生存性及び運動性に対する本発明の糖蛋白質性物
質の効果を以下の方法で試験した。なお、精子生存率及
び運動性の確認は下記の方法により行った。精子生存率及び運動性 まず、生存精子と死滅精子の識別はトリパンブルーによ
る生体染色によって行った。精子は死ぬと細胞膜の透過
性が増し、トリパンブルー色素によって染色される。従
って色素によって染色されたものは死滅精子であり、染
色されないかほとんど染色されないのは生存精子であ
る。精子懸濁液を、同量の０．４％トリパンブルー溶液
［ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加しないmodified
Tyrode' solution(ＴＡＬＰ； Parrishら、Biol.of Re
prod. 38: 1171-1180, 1988)に溶解］と混合し、３９℃
の温水中又は炭酸ガス培養装置内で５〜１０分間保温し
た。予め３９℃に保温しておいたスライドガラス上にト
リパンブルー染色した精子懸濁液を少量滴下し、カバー
ガラスで封入後、ノマルスキー微分干渉顕微鏡で観察し
た。判定の基準は、トリパンブルーで精子の頭部が青色
に染色されたものを死滅精子、一方、頭部がほとんど染
色されない精子を生存精子とした。またトリパンブルー
で染色されず且つべん毛運動が認められる精子を運動精
子とした。精子生存率及び運動精子の比率は、数えた全
精子に対する生存精子及び運動精子の比率で表した。ス
トロー精液管１本あたり少なくとも２００個から５００
個の精子を数え、そして各ポイントの数値は、３本以上
の異なるストロー精液管における平均及び標準誤差とし
て表した。

【００１８】試験例１ウシ精子の生存性及び運動性に対するＢＯＧＰの効果 試験に用いた精子は、黒毛和種たね雄ウシから得られた
市販の人工受精用凍結精液を用いた。液体窒素中で保存
したストロー精液管（０．５ｍｌ）を、３７℃の温水に
１分間浸し解凍した。解凍後、耐凍剤等を除去するため
に、精液０．５ｍｌに２ｍｌのＢＳＡ無添加ＴＡＬＰを
加え、２，０００回転、５分間遠心分離し、精子を沈殿
させた。遠心分離後、上清を捨て新しいＴＡＬＰを加え
懸濁し、再び遠心分離し洗浄した。洗浄後、精子を実験
群と対照群に分け、実験群の精子はＷＧＡ−アガロース
アフィニティークロマトカラムにより精製したウシ卵管
糖蛋白質（ＢＯＧＰ）を添加したＴＡＬＰに懸濁した。
対照群の精子は、ＢＯＧＰを含まないＴＡＬＰに懸濁し
た。精子懸濁液は０．５ｍｌのマイクロチューブに分注
し、パラフィンオイルでおおい、炭酸ガス培養装置内
（５％ＣＯ₂、９５％空気、３９℃）で培養した。懸濁
液中の精子濃度は、約１〜３×１０⁷／ｍｌに調整し
た。上記の系における精子の生存率及び運動性を経時的
に測定した。その結果を以下に示す。

【００１９】ａ）精子の生存率に対するＢＯＧＰの効果 精子の生存率の経時的変化を図４に示す。図４に示され
るように、凍結精子は、解凍直後精子の生存率は約６０
％であった。対照群では、精子生存率は培養１時間目で
すでに２０％と激減し、その後も継時的に低下した。培
養１２時間目には、死滅精子の比率は約９６％にもなっ
た。一方、ＢＯＧＰ（５００μｇ／ｍｌ）添加した培養
では、対照群でみられた急激な生存率の低下は起こら
ず、培養１２時間目でもまだ３０％の精子の生存が確認
された。

【００２０】ｂ）精子の運動性に対するＢＯＧＰの効果 精子の運動性の経時的変化を図５に示す。図５に示され
るように、解凍直後の運動精子の比率は５０．１％であ
った。対照群では、培養１時間目ですでにほとんどの精
子は運動性を失っていた（運動精子；１．５％）。一
方、ＢＯＧＰ（５００μｇ／ｍｌ）添加した培養では、
対照群に比べて運動精子数の減少率は小さく、培養６時
間目でも、まだ２３．１％の精子が運動機能を保持して
いた。また、ＢＯＧＰ添加の培養系では、運動精子は対
照群の運動精子に比べ、活発なべん毛運動しているのが
観察された。これらの結果から、ＢＯＧＰはウシ精子の
運動能を長時間維持する効果があることがわかった。

【００２１】試験例２異なる種雄ウシ由来精子生存率に対するＢＯＧＰの効果 ３頭の異なる種雄ウシ由来の精子に対して、ＢＯＧＰの
精子生存率に対する効果を調べた。３頭の異なる種雄ウ
シ精子（それぞれＡ、Ｂ、Ｃと表す）は、ＢＯＧＰ（５
００μｇ／ｍｌ）を添加又は無添加のＴＡＬＰで６時間
培養後、精子生存率を調べた。その結果を図６に示す。
図６に示されるように、精子生存率は、ＢＯＧＰ無添加
（Ａ ６．９％；Ｂ １９．３％；Ｃ １４．０％）に
対し、ＢＯＧＰ添加では、（Ａ ４４．９％；Ｂ ４
６．６％；Ｃ ４２．８％）と３頭の雄ウシの精子のい
ずれもＢＯＧＰ添加で高い精子生存率が得られることが
わかった。

【００２２】試験例３異なる種雄ウシ由来精子の運動性に対するＢＯＧＰの効
果 試験例２と同じ３頭の異なる種雄ウシ由来の精子に対し
て、ＢＯＧＰの精子運動性に対する効果を調べた。精子
はＢＯＧＰ（５００μｇ／ｍｌ）を添加又は無添加のＴ
ＡＬＰで６時間培養後、精子の運動性を調べた。その結
果を図７に示す。図７に示されるように、運動精子の比
率は、ＢＯＧＰ無添加では（Ａ ０．３％；Ｂ ６．３
％；Ｃ １．６％）とほとんどの精子は、運動性を失っ
ていた。他方、ＢＯＧＰ添加では、（Ａ ２３．１％；
Ｂ ２５．８％；Ｃ ２４．８％）と３種類とも２０％
〜３０％と高い精子運動性を保持していた。

【００２３】試験例４ウシ精子の生存率及び運動性に対するＢＯＧＰ濃度依存
性 ＢＯＧＰをそれぞれ０μｇ、１μｇ、１０μｇ、１００
μｇ、５００μｇ／ｍｌの濃度で添加したＴＡＬＰで６
時間培養し、精子生存率と運動精子率を調べた。その結
果を表１に示す。表１に示されるように、精子生存率は
ＢＯＧＰ無添加の対照群で９．３％であるが、ＢＯＧＰ
の濃度に依存して精子生存率の増加がみられ、５００μ
ｇ／ｍｌでは４４．９％になった。また、運動精子の比
率もＢＯＧＰ濃度に依存して増加し、０μｇ／ｍｌで
１．１％であったが、５００μｇ／ｍｌ添加では２３．
１％にも上昇した。

【００２４】

【００２５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド フラグメント：Ｎ末端フラグメント 配列の特徴： 他の情報：配列中、第５番目のアミノ酸は、システイン
又は糖鎖が結合したアミノ酸を示す。 配列 His-Lys-Leu-Val-Xaa-Tyr-Phe-Thr-Asn-Trp-Ala-Phe-Ser-Arg-Pro- 1 5 10 15 Gly-Pro-Ala-Ser-Ile-Leu-Pro-Arg-Asp-Leu-Asp-Pro-Phe-Leu- 20 25

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｍｏｎｏ−Ｑイオン交換高速液体クロマトグラ
フィーによるＢＯＧＰの溶出を示す図である。

【図２】実施例１における各精製段階の生成物のＳＤＳ
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動パターン（Ａ）とラ
ット抗ＢＯＧＰ抗血清を用いたイムノブロッティング
（Ｂ）を示す写真である。

【図３】糖鎖分解酵素で処理したＢＯＧＰのＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動パターンを示す写真であ
る。

【図４】ウシ精子生存率に対するＢＯＧＰの効果を示す
図である。

【図５】ウシ精子運動性に対するＢＯＧＰの効果を示す
図である。

【図６】異なる種雄ウシ由来精子生存率に対するＢＯＧ
Ｐの効果を示す図である。

【図７】異なる種雄ウシ由来精子の運動性に対するＢＯ
ＧＰの効果を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，Ｖ ｏｌ．５，Ｎｏ．３（1991）ｐ．356− 364 Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，Ｖｏｌ. 43，Ｎｏ．３（1990）ｐ．457−465 Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔｉｌ．, Ｖｏｌ．85，Ｎｏ．３（1992．Ａｕ ｇ．）ｐ．841−854 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウシ卵管から得られえる、下記の理
   化学的性質及び生理活性を有する糖蛋白質性物質を有効
   成分として含有するウシ精子の生存性・運動性保持剤。 (1)分子量約９０，０００（１０％ポリアクリルアミド
   を支持体としたＳＤＳ−電気泳動法による）。 (2)小麦胚芽レクチン−アフィニティークロマトカラム
   に親和性を有する。 (3)Ｎ末端が、配列表の配列番号１のアミノ酸配列を有
   する。 (4)ウシ精子の生存性及び運動性を保持する活性を有す
   る。
2. 【請求項２】 請求項１記載の糖蛋白質性物質を含
   有する培地を用いることを特徴とするウシ精子の生存性
   及び運動性の保持方法。