ES2888930T3

ES2888930T3 - Estabilización de la glutamato deshidrogenasa en solución acuosa

Info

Publication number: ES2888930T3
Application number: ES14821808T
Authority: ES
Inventors: Florence Bettsworth; Jérôme Martinez
Original assignee: Biomerieux SA
Current assignee: Biomerieux SA
Priority date: 2013-12-10
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2022-01-10
Anticipated expiration: 2034-12-08
Also published as: US11029312B2; US20160299140A1; US10533999B2; EP3080144B1; CN106103468A; CN106103468B; WO2015086973A1; US20200132690A1; EP3080144A1; FR3014446B1; FR3014446A1

Abstract

Procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium en una muestra biológica susceptible de contener dicha bacteria, caracterizado por que comprende las etapas de: (i) realizar un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de la presencia de glutamato deshidrogenasa en dicha muestra usando una composición acuosa que comprende glutamato deshidrogenasa de una bacteria del género Clostridium y un compuesto de estabilización que es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono, y que comprende al menos 2 grupos -COOH, o una de sus sales, y (ii) un resultado positivo en la etapa (i) permite determinar la presencia de la bacteria.

Description

DESCRIPCIÓN

Estabilización de la glutamato deshidrogenasa en solución acuosa

La presente invención se refiere al campo de la detección in vitro de proteínas de bacterias en muestras biológicas susceptibles de contener estas proteínas. En particular, la invención se refiere a la estabilización de la glutamato deshidrogenasa de una bacteria del género Clostridium con el fin de que esta proteína conserve sus propiedades antigénicas cuando se encuentra en solución acuosa.

Las bacterias del género Clostridium son bacterias anaerobias, esporuladas, Gram positivas, que son incapaces de reducir los sulfatos a sulfitos. Algunas especies son muy patógenas, tales como Clostridium difficile, Clostridium botulinum y Clostridiuum perfringens por ser las más conocidas.

La bacteria Clostridium difficile es el principal agente responsable de la diarrea tras la administración de antibióticos. Es temible debido a su gran potencial de contagio. Aunque alrededor del 5% de la población son portadores asintomáticos de la bacteria, sus manifestaciones patológicas están estrechamente relacionadas con una estancia en el hospital. Esta bacteria se desarrolla en una flora intestinal debilitada por la antibioterapia y puede secretar dos toxinas, A y B. Solamente las cepas que producen toxinas son patógenas. La toxina A, una enterotoxina, provoca la alteración de la permeabilidad del epitelio intestinal; la toxina B, una citotoxina, ataca directamente las células del epitelio. El efecto combinado de las dos toxinas es la disminución del tiempo de tránsito intestinal y de la absorción intestinal, lo que da lugar a una diarrea. Más raramente, la bacteria Clostridium difficile puede provocar una inflamación severa del colon (colitis pseudomembranosa).

La bacteria Clostridium botulinum es responsable, por su parte, del botulismo. Produce esporas que representan la forma de resistencia de la bacteria. Estas esporas pueden resistir tratamientos a baja temperatura, tales como la pasteurización, lo que puede plantear problemas de seguridad alimentaria, y después dar como resultado una célula bacteriana metabólicamente activa capaz de multiplicarse. Esta bacteria segrega una de las toxinas más potentes del mundo vivo, la toxina botulínica. Activa por ingestión, esta toxina se difunde después en el organismo y actúa bloqueando la transmisión neuromuscular: inhibe las neuronas motoras de la contracción muscular. Esta infección puede provocar la muerte por parálisis de los músculos respiratorios si no se aplica ningún tratamiento.

La bacteria Clostridium perfringens es una bacteria que se desarrolla en las heridas, a veces de manera muy profunda. Esta bacteria producirá necrotoxinas provocando así la enteritis necrosante. La toxina principal más frecuente es la toxina alfa, esencialmente producida por Clostridium perfringens de tipo A. Esta toxina está implicada en muchos casos de gangrena en humanos y en animales. Sola o en asociación con otras toxinas, causa también mortalidades brutales en cerdos y rumiantes.

La detección de la presencia de estas bacterias y de la secreción de su toxina es, por lo tanto, un problema importante de salud pública que requiere que los laboratorios tengan pruebas de detección fiables, tanto a nivel de la sensibilidad/especificidad, como a nivel de la reproducibilidad de los resultados obtenidos con estas pruebas. Para hacer esto, los laboratorios necesitan especialmente pruebas que incluyan reactivos que no se degraden con el tiempo, y, por lo tanto, que permanezcan estables.

La detección de la presencia de bacterias en las muestras se puede implementar mediante diferentes técnicas, tales como el uso de medios de cultivo o la técnica de los inmunoensayos, que son ampliamente conocidas por el experto en la materia. La técnica de los inmunoensayos es una técnica que consiste, en líneas generales, en detectar la presencia de proteínas utilizando pares de unión de estas proteínas. En el ámbito de la detección de bacterias del género Clostridium, una de las proteínas detectables, representativa de la presencia de esta bacteria, es la glutamato deshidrogenasa (GDH). Otras proteínas detectables son las toxinas secretadas cuando las bacterias son toxinogénicas. La detección o cuantificación por inmunoensayo de la GDH es una técnica que permite obtener una mayor sensibilidad de diagnóstico que la detección o cuantificación por inmunoensayo de las toxinas. Se utiliza como medio de cribado en las poblaciones de riesgo. En caso de positividad, se recomienda entonces una búsqueda de toxinas, ya que esta técnica presenta, por su parte, una mayor especificidad.

Varias compañías de diagnóstico proponen kits para la detección de GDH en Clostridium difficile. Se puede citar, por ejemplo, el kit VIDAS® GDH de la Solicitante.

Además de los pares de unión, la técnica de inmunoensayo requiere también el uso de reactivos para la calibración y/o el control de la prueba. Así, en el ámbito de un inmunoensayo de la GDH, tales reactivos incluyen la GDH como tal, la cual debe conservar sus propiedades antigénicas tanto tiempo como sea necesario con respecto a la vida útil del kit de diagnóstico en el que está contenida.

Las propiedades de una proteína pueden verse perturbadas por cualquier modificación de estructura, tanto desde un punto de vista químico como físico. Las modificaciones químicas de una proteína se basan en cambios en los enlaces covalentes, debidos, por ejemplo, a reacciones de oxidación, hidrólisis, etc., mientras que las modificaciones físicas, también denominadas desnaturalización, provocan una desorganización de la estructura terciaria o conformación tridimensional de la proteína, sin ruptura de los enlaces covalentes. La desnaturalización de las proteínas puede ser inducida por numerosos factores, químicos o físicos, tales como, entre otros, la temperatura, la modificación del pH o un agente químico. Tales modificaciones tienen como consecuencia una perturbación de la actividad propia de la proteína. Así, en el ámbito de una enzima como la GDH, tales modificaciones pueden alterar su actividad enzimática, lo que los diferentes autores han intentado paliar.

Así, por ejemplo, los autores de la solicitud de patente WO2007/003936 han descrito la estabilización de la actividad enzimática de diferentes proteínas utilizando uno o varios compuestos estabilizantes que tienen las características siguientes:

- tienen grupos ionizables capaces de intercambiar protones con la proteína a estabilizar y con los productos ionizados de la disolución acuosa,

- los grupos ionizables incluyen unos primeros grupos que están cargados positivamente cuando están protonados, y no cargados cuando están desprotonados, y unos segundos grupos que están no cargados cuando están protonados, y negativamente cargados cuando están desprotonados, y

- el pH de la composición se mantiene en un intervalo de /- 0,5 unidades pH del pH en el que la composición tiene su estabilidad máxima con respecto al pH.

Este documento describe que la actividad enzimática de la GDH bovina se conserva por adición de lisina como compuesto estabilizante, mientras que la adición de citrato no permite a la GDH conservar esta actividad enzimática.

Garcia-Galan C. et al., 2013, describieron, por su parte, que la GDH de Escherichia coli podía estabilizarse para que mantuviera su actividad enzimática revistiendo la superficie de la GDH con polietilenimina en presencia de litio+.

Sin embargo, ningún autor se ha interesado en investigar cómo estabilizar la GDH para que conserve sus propiedades antigénicas, mientras que este es un problema que se encuentra cuando esta proteína se utiliza en solución acuosa, especialmente de manera muy diluida, por ejemplo a una concentración del orden de algunos ng/ml.

En efecto, la GDH se conserva habitualmente en forma liofilizada ya que se sabe que no conserva sus propiedades antigénicas cuando se pone en solución acuosa. Asimismo, cuando la GDH debe colocarse en solución acuosa, por ejemplo en el ámbito de un inmunoensayo de la GDH, el técnico de laboratorio recoge la GDH liofilizada en un disolvente acuoso, prepara unas alícuotas que debe después congelar a -20°C. El periodo de caducidad de la solución acuosa es entonces bastante corto, de media de 2 meses conservada entre 2 y 8°C. Además, el hecho de recoger la GDH en un tampón acuoso tiene como inconvenientes provocar no sólo manipulaciones suplementarias, sino también riesgos suplementarios de error en la recogida. Finalmente, esto requiere también la presencia de un congelador.

La Solicitante ha encontrado, contra todo pronóstico, que era posible estabilizar la GDH en solución acuosa a fin de que su estructura tridimensional se conserve al menos en parte, de manera que conserve sus propiedades antigénicas. Dicha estabilización se lleva a cabo mediante la adición, como compuesto de estabilización, de un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono, y que comprende al menos 2 grupos -COOH o una de sus sales. Gracias a la adición de este compuesto, la solución acuosa que comprende la GDH se puede conservar entre 2 y 8°C, y eso durante muchos meses.

Así, un primer objeto de la invención se refiere a un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium en una muestra biológica susceptible de contener dicha bacteria, caracterizado por que comprende las etapas de:

(i) realizar un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de la presencia de glutamato deshidrogenasa en dicha muestra utilizando una composición acuosa que comprende glutamato deshidrogenasa de una bacteria del género Clostridium y un compuesto de estabilización que es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono, y que comprende al menos 2 grupos -COOH, o una de sus sales, y

(ii) un resultado positivo en la etapa (i) permite determinar la presencia de la bacteria.

Otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria toxinogénica del género Clostridium que produce al menos una toxina en una muestra biológica susceptible de contener tal bacteria y dicha al menos una toxina.

Por lo tanto, la Solicitante ha mostrado, contra todo pronóstico, que la utilización de compuestos particulares permitía estabilizar la GDH de las bacterias del género Clostridium para mantener sus propiedades antigénicas cuando la GDH se encuentra en solución acuosa, especialmente a concentraciones del orden de algunos ng/ml, por ejemplo de 0,75 a 10 ng/ml, de 2 a 10 ng/ml, o también de 3 a 6 ng/ml, lo que es particularmente importante en el ámbito de las pruebas para la detección de estas bacterias por inmunoensayo.

Por mantenimiento de las propiedades antigénicas de la GDH, se entiende que la GDH conserva su propiedad de unión a los pares de unión utilizados en el ámbito del inmunoensayo, ya que su estructura se conserva, al menos a nivel del determinante antigénico implicado en la fijación del par de unión.

Por supuesto, el prefijo “inmuno” en el término “inmunoensayo”, por ejemplo, no debe considerarse en la presente solicitud como indicando estrictamente que el par de unión es necesariamente un par de origen inmunológico, tal como un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo. En efecto, como es bien conocido por el experto en la materia, este término se utiliza más ampliamente para designar pruebas y procedimientos en los que el par de unión no es un par de origen/de naturaleza inmunológico, sino que consiste, por ejemplo, en un receptor del analito que se desea detectar y/o cuantificar. La condición es que el par de unión en cuestión sea capaz de unirse al analito deseado, preferentemente de manera específica. Así, se conoce hablar del ensayo ELISA para ensayos que utilizan pares de unión no inmunológicos stricto sensu, denominados más ampliamente en inglés “ligand binding assay”, que se podría traducir al español por “ensayo que usa la unión a un ligando”, mientras que el término “inmuno” se incluye en el título in extenso correspondiente al acrónimo ELISA. En aras de la claridad y uniformidad, el término “inmuno” se emplea en la presente solicitud para designar cualquier análisis biológico que utilice al menos un par de unión adecuado para unirse al analito deseado y para detectar y/o cuantificar este último, preferentemente de manera específica, incluso cuando dicho par de unión no sea de naturaleza o de origen inmunológico en sentido estricto.

Por par de unión a la GDH se entiende cualquier molécula capaz de unirse a la GDH. A título de ejemplo de par de unión a la GDH se pueden citar los anticuerpos, los fragmentos de anticuerpos, las nanofitinas, los receptores de GDH, los aptámeros, las DARPinas, o cualquier otra molécula conocida por tener una interacción con la GDH.

Los anticuerpos pares de unión son, por ejemplo, anticuerpos policlonales, o bien anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos policlonales se pueden obtener por inmunización de un animal con, como inmunógeno, la GDH diana, seguida de la recuperación de los anticuerpos deseados en forma purificada, por extracción del suero de dicho animal, y separación de dichos anticuerpos de los demás constituyentes del suero, por ejemplo por cromatografía de afinidad sobre una columna sobre la que se fija un antígeno específicamente reconocido por los anticuerpos, especialmente el inmunógeno, o con la ayuda de una proteína A o G.

Los anticuerpos monoclonales se pueden obtener mediante la técnica de los hibridomas ampliamente conocida por el experto en la materia. Los anticuerpos monoconales pueden también ser unos anticuerpos recombinantes obtenidos por ingeniería genética, mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia.

A título de ejemplo de fragmentos de anticuerpos, se pueden citar los fragmentos Fab, Fab’, F(ab’)2, así como los scFv (Fragmento variable monocatenario, en inglés “Single chain variable fragment”), dsFv (Fragmento variable bicatenario, en inglés “Double-stranded variable fragment”). Estos fragmentos funcionales pueden obtenerse especialmente por ingeniería genética.

Las nanofitinas (nombre comercial) son pequeñas proteínas que, como los anticuerpos, son capaces de unirse a una diana biológica que permite así detectarlas, capturarlas o simplemente determinarlas dentro de un organismo.

Los aptámeros son unos oligonucleótidos, generalmente ARN o ADN, identificados en bancos que contienen hasta 1015 secuencias diferentes, mediante un método combinatorio de selección in vitro denominado SELEX por “Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment” (Ellington AD y Szostak JW., 1990). La mayoría de los aptámeros están compuestos de ARN, debido a la capacidad del ARN para adoptar estructuras variadas y complejas, lo que permite crear en su superficie cavidades de geometrías diversas, permitiendo fijar unos ligandos diversos. Se trata de herramientas bioquímicas de interés que pueden utilizarse en aplicaciones biotecnológicas, diagnósticas o terapéuticas. Su selectividad y sus propiedades de fijación a ligandos son comparables a las de los anticuerpos.

Las DARPinas” por Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Proteínas diseñadas a partir de repeticiones de anquirinas) (Boersma YL et Plütckthun A, 2011) son otra clase de proteínas que permite mimetizar los anticuerpos y poder fijarse con una afinidad y una selectividad elevadas sobre proteínas diana. Derivan de la familia de las proteínas anquirinas, que son unas proteínas adaptadoras que permite fijar las proteínas de membrana integrales a la red espectrina/actina que constituye “la columna vertebral” de la membrana plasmática celular. La estructura de las anquirinas se basa en la repetición de un motivo de aproximadamente 33 aminoácidos, y es la misma que la de las DARPinas. Cada motivo tiene una estructura secundaria de tipo hélice-codo-hélice (hélix-turn-helix”). Las DARPinas contienen al menos tres, preferentemente de cuatro a cinco motivos repetidos, y se obtienen por cribado de bancos combinatorios.

Los pares de unión utilizados pueden ser específicos o no de la GDH. Se denominan específicos cuando son capaces de unirse de manera exclusiva o casi exclusiva a la GDH. Se denominan no específicos cuando la selectividad de unión a la GDH es menor y son entonces capaces de unirse a otros ligandos, tales como otras proteínas o anticuerpos. Según una realización preferida, se prefieren los pares de unión específicos.

La glutamato deshidrogenasa que conviene estabilizar es cualquier glutamato deshidrogenasa de Clostridium cuya presencia se desea detectar, por ejemplo la de Clostridium difficile, de Clostridium botulinum o de Clostridium perfringens. Se incluyen todas las variantes posibles. Tales proteínas son conocidas y sus secuencias se describen, por ejemplo, en la base de datos Uniprot (www.uniprot.org).

Así, la GDH de Clostridium difficile (n° de acceso Uniprot P27346) es una proteína de 421 aminoácidos cuya secuencia de referencia en aminoácidos es la SEQ ID N° 1 siguiente:

10 20 3£ 4£ 50 60

MSGKDVNVFE MAQSQVKNACDKLGMEPAVY ELLKEPMRVI EVSIPVKMDDGSIKTFKGFR

70 8£ 9£ 10£ 110 12£

SQHNDAVGPT KGGIRFHQNVSRDEVKALSIWHTFKCSVTG IPYGGGKGGIIVDPSTLSQG

130 14£ 15£ 16£ 170 180

ELERLSRGYI DGIYKLIGEKVDVPAPDVNTNGQIMSWMVD EYNKLTGQSSIGVITGKPVE

190 20£ 21£ 22£ 230 240

FGGSLGRTAA TGFGVAVTAREAAAKLGIDM KKAKIAVQGI GNVGSYTVLNCEKLGGTWA

250 26£ 27£ 28£ 290 300

MAEWCKSEGS YAIYNENGLDGQAMLDYMKEHGNLLNFPGA KRISLEEFWASDVDIVIPAA

310 32£ 33£ 34£ 350 36£

LENSITKEVA ESIKAKLVCEAANGPTTPEADEVFAERGIV LTPDILTNAGGVTVSYFEWV

370 38£ 39£ 40£ 410 42£

QNLYGYYWSE EEVEQKEEIAMVKAFESIWKIKEEYNVTMR EAAYMHSIKKVAEAMKLRGW

Y cuyas variantes son:

Tabla 1

La GDH de Clostridium perfringens es una proteína que no tiene aún secuencia de referencia en la base Uniprot. La primera proteína dada en la base Uniprot (n° de acceso Uniprot Q8XK85) es la proteína de la cepa 13 de tipo A, de 448 aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos es la SEQ ID Na 2 siguiente:

10 2£ 3£ 4£ 50 6£

MEVKKYVDNL MEDLKKNNPG ESEFLAAAEEVLYSLVPVLE KNPKYMEEGI LERIVEPERV

70 8£ 9£ 10£ 11£ 12£

IMFRVPWVDD AGNVRVNRGY RVQFNSAIGPYKGGLRFHPS VNLSIIKFLG FEQIFKNSLT

130 14£ 15£ 16£ 170 18£

TLPIGGGKGG SNFDPKGKSD REIMRFCQSFMSELYRHIGP NTDVPAGDIG VGGREIGYMF

GQYKKLKNSV DAGVLTGKGL TYGGSLARKEATGYGLVYFV DEMLRDNGQT IEGKTWISG

SGNVAIYATE KVQELGGKW ALSD33GYVYDENGIDLEW KEIKEVKRGR ISEYVNYVKT

310 32£ 33£ 34£ 350 360

AKFTEGFRGI WNVKCDIALP CATQNEIDKSSAKTLIDNGV IAVGEGANMP STLEAQKLFV

DNKILFAPAK AANAGGVATS ALEMSQNSLRMSWTFEEVDA KLKDIMKNIY YNSRNAASEY

43£ 44£

GHDGNLIVGA NIAGFKKVAD AMLDHGII

Y cuyas variantes son:

Tabla 2

La GDH de Clostridium botulinum es una proteína que no tiene aún secuencia de referencia en la base Uniprot. La primera proteína dada en la base Uniprot (N° de acceso Uniprot A5I2T3) es la proteína de la cepa Hall de tipo A (ATCC 3502, NCTC 13319), de 421 aminoácidos, cuya secuencia de aminoácidos es la SEQ ID N°3 siguiente:

10 20 30 40 50 60

MAKENLNPFE NAQKQVKTAC DKLGMEPAYY ELLKEPQRVI EVSIPVKMDD GSVKVFKGYR

70 8£ 90 1Q£ 110 120

SQHNDAVGPT KGGVRFHPNV SLDEVKALSI WMTFKCSVTG IPYGGGKGGI IVDPKTLSKG

130 140 150 160 170 180

ELERLSRGYI DGIHKLIGEK VDVPAPDVNT NGQIMAWMVD EYNKLVGRSA IGVITGKPVE

190 200 210 220 230 240

FGGSLGRNAA TGFGVAVTAR EAAAKLGIDM KKAKLAIQGI GNVGSHTVLN CEKLGGTWA

250 260 270 280 290 300

LAEWCKEEGT YAIYNENGLD GKAMIEYVKE NGN1LGYPGA KKISLDEFWA LNVDILIPAA

310 320 330 340 350 360

LENAITHENA SSINAKLVCE AANGPITPDA DAILKEKGIT VTPDILTNAG GVTVSYFEWV

370 380 390 400 410 420

QNLYGYYWTE AEVEAKEEEA MVKAFESIWA IKEEYSVTMR EAAYMHSIKK VAGAMKLRGW

Y

Y cuyas variantes, de 421,447 o 450 aminoácidos según las cepas, son:

Tabla 3

Según una realización particular, la glutamato deshidrogenasa es una enzima de la bacteria de la especie Clostridium difficile.

La glutamato deshidrogenasa puesta en solución acuosa es de origen natural, o bien de origen recombinante. La glutamato deshidrogenasa natural, o también denominada nativa, se puede obtener después del cultivo de la bacteria Clostridium y de la purificación de la proteína a partir del lisado bacteriano. La glutamato deshidrogenasa recombinante se puede obtener por ingeniería genética, mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Tal obtención se describe, por ejemplo, por Anderson BM et al., 1993. La glutamato deshidrogenasa recombinante se puede obtener de compañías tales como Holzel Diagnostika GmbH (Alemania).

Por composición o solución acuosa, se entiende una solución líquida y límpida obtenida por disolución completa de uno o varios compuestos, y cuyo disolvente principal es el agua, que representa al menos un 50% en volumen, en general al menos un 60%, un 70%, un 80%, un 90%, con respecto al volumen total de la solución.

En el ámbito de la presente invención, la composición o solución acuosa se obtiene diluyendo la GDH en un disolvente que comprende principalmente agua y un compuesto de estabilización tal como se define a continuación. El compuesto de estabilización a añadir en la solución acuosa que contiene la GDH a estabilizar es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono y que comprende al menos 2 grupos -COOH, o una de sus sales.

Por ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono y que comprende al menos 2 grupos -COOH, se entiende una molécula constituida de:

- una cadena carbonada, lineal o ramificada, contigua (es decir, sin interrupción en la cadena carbonada) o interrumpida por al menos otro átomo diferente del átomo de carbono, por ejemplo un átomo de nitrógeno o de oxígeno,

- al menos 2 grupos -COOH al final de la cadena, y

- al menos un grupo “CX”, bien al final de la cadena (se escribe entonces -CX), o bien en medo de la cadena (se escribe entonces -CX-), siendo X diferente de C.

Por ejemplo, los grupos -CX- se seleccionan independientemente entre -CH²-, =CH-, -C(H)OH-, -C(H)NH²- y -C(O)-. Los grupos -CX se seleccionan independientemente entre -CH³, -COOH (si existen, en la molécula, más de 2 grupos -COOH) y -C(O)NH².

Así, por ejemplo, el compuesto de estabilización puede ser el ácido succínico, de fórmula OH(O)C-(CH²)²-C(O)OH, que es una molécula que tiene una cadena carbonada lineal contigua de 4 átomos de carbono, 2 grupos -COOH al final de la cadena y 2 grupos -CH ²-.

Otro ejemplo consiste en el ácido fumárico de fórmula OH(O)C-(CH=CH)-C(O)OH, que es una molécula que tiene una cadena carbonada lineal contigua de 4 átomos de carbono, 2 grupos -COOH al final de la cadena y 2 grupos -CH-. Aún otro ejemplo consiste en el ácido N-(2-acetamido)iminodiacético, de fórmula H²NC(O)-CH²-N(CH²-COOH)², que es una molécula que tiene una cadena carbonada ramificada de 6 átomos de carbono, interrumpida por un átomo de nitrógeno, constituida de 2 grupos -COOH al final de la cadena, de 3 grupos -CH²- y de 1 grupo -C(O)NH².

Según una realización particular, el compuesto de estabilización se selecciona entre: el ácido fumárico, el ácido succínico, el ácido málico, el ácido glutárico, el ácido cítrico, el ácido tartárico, el ácido N-(2-acetamido)iminodiacético, el ácido glutámico, el ácido adípico, el ácido aspártico, el ácido pimélico, el ácido malónico, y sus sales, cuyas fórmulas se dan en la Figura 1.

Por sal de ácido carboxílico, se entiende una sal de un catión monovalente. A título de catión monovalente, se pueden citar los iones amonio (NH4+), plata (Ag+), diaminoplata (Ag(NH3)2+), cesio (Cs+), cobre(I) (Cu+), mercurio (Hg+), el metanio (CH⁵+), el metilio (CH3+), el nitrosio (NO²+), y los iones de los metales alcalinos sodio (Na+), potasio (K+) y litio (Li+).

Cuando el compuesto de estabilización está en forma de sal, al menos un protón H+ de los grupos -COOH está sustituido por un catión monovalente descrito anteriormente.

Según una realización preferida, el compuesto de estabilización se selecciona entre el ácido succínico, el ácido fumárico, y sus sales, en particular de metales alcalinos, tales como se han definido anteriormente.

La cadena carbonada puede comprender una o varias de las características siguientes:

- puede comprender al menos 3 átomos de carbono hasta como máximo 10 átomos, preferentemente como máximo 8, preferentemente como máximo 7, preferentemente como máximo 6 átomos,

- intercala un átomo de nitrógeno o es contigua y está constituida solamente de átomos de carbono,

- los grupos “CX” se seleccionan independientemente entre -CH²-, =CH-, -CH³, -COOH, -C(H)OH-, -C(O)NH², -C(H)NH²-, -C(O) -, y

- puede comprender o no uno o varios dobles enlaces, y el ácido puede entonces encontrarse en forma de isómero E o Z.

En particular, el ácido carboxílico puede presentar una o varias de las características siguientes:

- una cadena carbonada de 4, 5 o 6 átomos de carbono,

- una cadena carbonada de 4 átomos de carbono que tiene al menos 2 grupos -COOH y unos grupos -CX-seleccionados independientemente entre =CH-, -CH²- y -C(H)OH-,

- una cadena carbonada de 5 átomos de carbono que tiene al menos 2 grupos -COOH y unos grupos -CX-seleccionados entre -CH²- y -C(H)NH²,

- una cadena carbonada de 6 átomos de carbono que tiene al menos 2 grupos -COOH y unos grupos -CX-seleccionados entre -CH2-, -C(H)OH-(-CX-) y -C(O)NH (-CX),

- un doble enlace y es un isómero E,

- 2 grupos -COOH.

La cantidad de GDH presente en la solución acuosa depende del uso final de la composición acuosa que la contiene. En el ámbito de un inmunoensayo clásico, la GDH puede estar presente a razón de 0,75 a 10 ng/ml, o de 2 a 10 ng/ml, preferentemente de 3 a 6 ng/ml. En el ámbito de un inmunoensayo denominado ultrasensible, la GDH estará presente en una cantidad muy inferior, por ejemplo inferior al pg/ml, incluso del orden del fg/ml.

La cantidad de compuesto de estabilización a añadir en la solución acuosa que contiene la GDH está en amplio exceso con respecto a la cantidad de GDH. Depende del hecho de si el compuesto de estabilización se utiliza únicamente a título de compuesto de estabilización, añadiéndose entonces otra molécula a título de tampón, o bien si se utiliza al mismo tiempo a título de compuesto de estabilización y de tampón. Así, por ejemplo, cuando el compuesto de estabilización se utiliza únicamente a título de compuesto de estabilización, se añaden de 20 a 100 moléculas de compuesto de estabilización por monómero de GDH, preferentemente de 30 a 80 moléculas de compuesto de estabilización por monómero de GDH, más preferentemente de 40 a 60 moléculas de compuesto de estabilización por monómero de GDH. En este caso, el compuesto añadido a título de tampón es cualquier compuesto conocido por el experto en la materia que tiene un pH comprendido entre 4,5 y 7, preferentemente entre 5,5 y 6,5, prefiriéndose un pH de 5,8. A título de ejemplo de compuesto añadido a título de tampón, se puede citar el fosfato y el acetato. Cuando el compuesto de estabilización se utiliza al mismo tiempo a título de compuesto de estabilización y de tampón, se añaden de 108 a 1010 moléculas de compuesto de estabilización por monómero de GDH, preferentemente de 1X109 a 5X109 moléculas de compuesto de estabilización por monómero de GDH, más preferentemente de 1X109 a 2X109 moléculas de compuesto de estabilización por monómero de GDH.

A la composición acuosa, pueden añadirse también otros compuestos en el procedimiento de la invención. Así, por ejemplo, se puede añadir un poliol. La adición de poliol permite favorecer la estabilidad térmica de las proteínas (resistencia a la desnaturalización térmica) y también prevenir la agregación. De manera general, los polioles tienen un efecto co-disolvente, y contribuyen al mantenimiento de la configuración nativa de las proteínas en solución acuosa.

A título de ejemplos de poliol, se pueden citar los polioles monosacarídicos tales como trioles, por ejemplo glicerol, los tetraoles, por ejemplo eritritol, los pentoles, por ejemplo el xilitol, el arabitol y el ribitol, los hexoles, por ejemplo el sorbitol, el dulcitol y el manitol, los heptoles, por ejemplo el volemitol, así como los polioles disacarídicos tales como el maltitol, el isomaltitol y el lactitol.

Según una realización de la invención, el poliol añadido en la composición acuosa del procedimiento de la invención es el sorbitol.

Se añade el poliol en la composición acuosa a razón de al menos un 1%, preferentemente al menos un 5% y más preferentemente de al menos un 10%, con como máximo un 50%.

La composición puede también comprender otra macromolécula, denominada de manera genérica “proteína de carga”, incuso si son adecuadas unas macromoléculas diferentes de las proteínas, la cual no tiene nada que ver con la GDH pero está presente en gran exceso con respecto a la GDH, mejorando aún más la estabilización de la GDH. Esta “proteína de carga” tiene un efecto de escudo en el sentido el que sufrirá en parte las modificaciones fisicoquímicas en la solución acuosa, permitiendo así proteger la molécula de interés, en este caso la GDH. Esta macromolécula añadida puede, por ejemplo, ser una proteína como la BSA (Albúmina de Suero Bovino, en inglés “Bovine Serum Albumine”), o también polímeros sintéticos de tipo dextrano o polietilenglicol. La BSA, por ejemplo, se añade a razón de 50 g/l frente a 3 ml/l de GDH.

La composición acuosa se tampona para obtener un pH comprendido entre 4,5 y 7, preferentemente entre 5,5 y 6,5, prefiriéndose un pH de 5,8. Como se ha indicado anteriormente, el compuesto de estabilización de la invención puede también utilizarse a título de tampón, o bien puede añadirse otro compuesto tampón.

Según una realización, las composiciones acuosas de la invención comprenden la glutamato deshidrogenasa de una bacteria del género Clostridium y un compuesto de estabilización que es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono y que comprende al menos 2 grupos -COOH, o una de sus sales, entendiéndose que el compuesto de estabilización no es ni el glutamato, ni el alfa-cetoflutarato, producto de hidrólisis del glutamato por la enzima GDH y la coenzima NAD+, ni el citrato, ni el succinato, ni el glutarato.

Según otra realización, las composiciones acuosas de la invención excluyen también el ácido glutámico, el ácido alfacetoglutárico, el ácido glutárico, el ácido succínico y/o el ácido cítrico.

Según otra realización, cuando la bacteria del género Clostridium se selecciona entre las especies de Clostridium difficile, Clostridium botulinum y Clostridium perfrigens, entonces las composiciones acuosas que comprenden la glutamato deshidrogenasa de una de estas bacterias y un compuesto de estabilización que es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono y que comprende al menos 2 grupos -COOH o una de sus sales, entendiéndose que el compuesto de estabilización no es ni el glutamato, ni el alfa-cetoglutarato, ni el citrato.

Según otra realización, las composiciones acuosas de la invención excluyen también el ácido glutámico, el ácido alfacetoglutárico y/o el ácido cítrico.

Las mismas características y preferencias descritas anteriormente, especialmente en cuanto a la elección de la GDH, del compuesto de estabilización, de los compuestos a añadir y de sus cantidades relativas, dadas en relación con el procedimiento, se aplican también a las composiciones acuosas según la invención.

Las composiciones acuosas de la invención, especialmente las obtenidas según el procedimiento de la invención son particularmente útiles para la detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium en una muestra biológica susceptible de contener tal bacteria.

Las muestras biológicas susceptibles de contener una bacteria del género Clostridium pueden ser unas muestras procedentes del campo clínico o del campo del control de seguridad, incluso de esterilidad de los productos industriales. En el campo clínico, la muestra es una extracción biológica animal, preferentemente humana, tal como las heces o derivados, por ejemplo extracto de proteínas fecales, orina, sangre o derivados, por ejemplo suero o plasma, pus, etc. En el campo industrial, la muestra procede de un producto alimentario o cosmético.

El ensayo inmunológico cualitativo o cuantitativo de la GDH será preferentemente un ensayo en sándwich, que es un ensayo ampliamente conocido por el experto en la materia, que usa dos pares de unión a la GDH. Uno de los dos pares puede acoplarse a un marcador para formar un conjugado o un trazador. El otro par de unión puede capturarse sobre un soporte sólido. Se habla entonces de par de captura para este último y par de detección para el primero. La señal medida emitida por el conjugado es entonces proporcional a la cantidad de GDH de la muestra biológica. Por marcador, se entiende, especialmente, cualquier molécula que contiene un grupo reactivo con un grupo del par de unión, directamente sin modificación química, o después de la modificación química para incluir tal grupo, molécula que es capaz de generar directa o indirectamente una señal detectable. Una lista no limitativa de estos marcadores de detección directa consiste en:

* las enzimas que producen una señal detectable, por ejemplo por colorimetría, fluorescencia, luminiscencia, tal como la peroxidasa de rábano picante, la fosfatasa alcalina, la p-galactosidasa, la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,

* los cromóforos tales como los compuestos fluorescentes, luminiscentes, colorantes,

* las moléculas radiactivas tales como 32P, 35S o 125I,

* las moléculas fluorescentes tales como Alexa o ficocianinas, y

* las sales electroquimioluminiscentes tales como derivados organometálicos a base de acridinio o de rutenio. También pueden utilizarse sistemas indirectos de detección, como por ejemplo unos ligandos capaces de reaccionar con un anti-ligando. El ligando corresponde entonces al marcador para constituir, con el par de unión, el conjugado. Los pares ligando/anti-ligando son bien conocidos por el experto en la materia, lo que es el caso, por ejemplo, de los pares siguientes: biotina/estreptavidina, hapteno/anticuerpo, antígeno/anticuerpo, péptido/anticuerpo, azúcar/lectina, polinucleótido/complementario del polinucleótido.

El anti-ligando puede entonces ser detectable directamente por los marcadores de detección directa descritos anteriormente o ser él mismo detectable por otro par ligando/anti-ligando, y así sucesivamente.

Estos sistemas indirectos de detección pueden conducir, en ciertas condiciones, a una amplificación de la señal. Esta técnica de amplificación de la señal es bien conocida por el experto en la materia, y se podrá referir a las solicitudes de patente anteriores FR 2781802 o WO 95/08000 de la solicitante.

Según el tipo de marcado utilizado, el experto en la materia añadirá unos reactivos que permitan la visualización del marcado o la emisión de una señal detectable por cualquier tipo de aparato de medición apropiado, como por ejemplo un espectrofotómetro, un espectrofluorímetro, un densitómetro o también una cámara de alta definición.

En los procedimientos de ensayo de la GDH las composiciones acuosas de la invención, llegado el caso obtenidas según el procedimiento de la invención, son particularmente útiles para el establecimiento de un intervalo patrón, lo que constituye otro objeto de la invención. El establecimiento del intervalo patrón es una etapa necesaria para poder efectuar una cuantificación de la GDH, es una etapa ampliamente conocida por el experto en la materia. En pocas palabras, consiste en medir la señal generada por cantidades o concentraciones crecientes y conocidas del analito GDH, trazar la curva que da la señal en función de la cantidad o de la concentración y encontrar un modelo matemático que represente de la manera más fiel posible esta relación. Para hacer esto, se usan varias composiciones acuosas de la invención, conteniendo cada una una concentración diferente en GDH. El modelo matemático se usará para determinar por extrapolación las cantidades o concentraciones de GDH desconocidas contenidas en la muestra biológica a ensayar.

Las composiciones acuosas de la invención, llegado el caso obtenidas según el procedimiento de la invención, son también particularmente útiles como calibrador, lo que constituye otro objeto de la invención. En este caso, la concentración en GDH de la composición es fija y conocida. La señal generada durante el uso del kit de inmunoensayo por el calibrador es también conocido. El calibrador sirve para verificar que la medida (señal) producida durante el uso del kit de inmunoensayo corresponde claramente al valor esperado. Si este no es el caso, el calibrador sirve para medir la desviación que podrá, llegado el caso, corregirse matemáticamente o por una intervención física sobre el instrumento de medida (ajuste).

Las composiciones acuosas de la invención, llegado el caso obtenidas según el procedimiento de la invención, son también particularmente útiles como control, lo que constituye otro objeto de la invención. Para ello, se usan, por ejemplo, para verificar que el kit de inmunoensayo funciona según las previsiones (también denominado control o control positivo) y que la detección de la GDH en la muestra biológica no es falsamente negativa en la medida en la que el método de detección ha funcionado bien con la composición acuosa de la invención.

La detección de la GDH en una muestra biológica permite determinar la presencia de la bacteria.

La invención se refiere a un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium en una muestra biológica susceptible de contener tal bacteria, caracterizado por que comprende las etapas de (i) realizar un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de la glutamato deshidrogenasa en dicha muestra usando una composición acuosa de la invención, llegado el caso tal como se obtiene según el procedimiento de la invención, y (ii) si el procedimiento de la etapa (i) es positivo, determinar la presencia de la bacteria.

En otras palabras, para la etapa (ii) un resultado positivo en la etapa (i) permite determinar la presencia de la bacteria.

Por el contrario, esto no da información sobre el hecho de que esta bacteria produce o no al menos una toxina, lo que es particularmente importante como ayuda al diagnóstico cuando un paciente presenta síntomas que podrían ser provocados por la presencia de una bacteria toxinogénica y que expresa al menos una toxina.

Asimismo, otro objeto de la invención se refiere a un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria toxinogénica del género Clostridium que produce al menos una toxina en una muestra biológica susceptible de contener tal bacteria y dicha al menos una toxina, caracterizado por que comprende las etapas de:

(i) realizar un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de glutamato deshidrogenasa en dicha muestra, usando una composición acuosa de la invención, llegado el caso tal como se obtiene según el procedimiento de la invención, y

(ii) si el procedimiento de la etapa (i) es negativo, determinar la ausencia de la bacteria, o

(ii’) si el procedimiento de la etapa (i) es positivo, realizar un procedimiento de detección o cuantificación de al menos una toxina susceptible de ser liberada por dicha bacteria del género Clostridium en la misma muestra biológica, o en una nueva muestra biológica procedente del mismo individuo, y determinar el hecho de que la bacteria es toxinogénica y produce dicha al menos una toxina si dicha al menos una toxina está presente.

En otras palabras, para la etapa (ii) un resultado negativo en la etapa (i) permite determinar la ausencia de la bacteria, y un resultado positivo en la etapa (i) permite determinar la presencia de la bacteria.

La etapa (i) anterior que consiste en detectar la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de glutamato deshidrogenasa en la muestra biológica, se ha descrito anteriormente. La composición acuosa de la invención, llegado el caso obtenida mediante el procedimiento de la invención, puede entonces utilizarse para establecer el intervalo patrón y/o como calibrador y/o como control positivo.

La etapa (ii’) anterior que consiste en detectar o cuantificar al menos una toxina susceptible de ser liberada por dicha bacteria del género Clostridium es una etapa ampliamente conocida por el experto en la materia. Tal detección o cuantificación se puede realizar, por ejemplo, por inmunoensayo usando unos pares de unión a las toxinas deseadas. El inmunoensayo de las toxinas se realiza de manera similar al inmunoensayo de la GDH tal como se ha descrito anteriormente. En el mercado, hay disponibles unos kits de inmunoensayo de toxina de bacterias del género Clostridium, tal como por ejemplo el kit VIDAS® Clostridium difficile A&B que permite detectar las toxinas A y B de Clostridium difficile.

Para realizar la etapa de detección/cuantificación de la toxina se podrá utilizar también la espectrometría de masa. Esta técnica es una técnica de análisis que permite la determinación de la masa molar de los compuestos analizados, así como identificar su estructura molecular, incluso cuantificarla. Aplicada a una mezcla compleja, tal como un fluido biológico o heces, necesita acoplarse a una técnica separativa que permite reducir su complejidad. Se trata, generalmente, de la cromatografía en fase gaseosa (GC) o de la cromatografía en fase líquida (LC). La espectrometría de masa en tándem (MS/MS) combina 2 analizadores y podrá usarse con fines de detección/cuantificación. Los compuestos iónicos seleccionados en el primer analizador y después fragmentados se analizan de manera más fina en el segundo. Este doble análisis permite aumentar de manera significativa la especificidad del método. Para esta tecnología, se podrá referir, especialmente, a Van den Broek et al., 2013.

La detección y/o cuantificación de las toxinas se puede llevar a cabo también mediante un ensayo de inmunotoxicidad en las heces (CTA) que permite poner en evidencia los efectos biológicos de las toxinas en las heces (Eckert C. et al., 2011).

La detección o cuantificación de la toxina se efectúa en la misma muestra biológica que la utilizada para la detección o la cuantificación de la GDH, una parte de la cual se ha conservado a tal efecto, o bien en una nueva muestra biológica que tiene la misma procedencia, es decir del individuo del cual procede la primera muestra biológica ensayada con respecto a la presencia de GDH si la muestra biológica es una muestra clínica, o de la misma fuente si la muestra biológica es una muestra industrial. La segunda muestra biológica es o bien de la misma naturaleza, o de naturaleza diferente, prefiriéndose el primer caso.

Según una realización particular, la bacteria toxinogénica de la que se desea detectar la presencia es Clostridium difficile y dicha al menos una toxina comprende la toxina A, la toxina B, o las dos.

Anteriormente, se han descrito otras bacterias toxinogénicas del género Clostridium.

La invención se entenderá mejor con la ayuda de los ejemplos siguientes, dados a título ilustrativo y no limitativo, así como con la ayuda de las figuras 1 y 2, en las que:

- la Figura 1 da unos ejemplos de compuestos de estabilización usados en las composiciones acuosas según la invención, así como su fórmula química, y

- la Figura 2 es un gráfico que da la evolución de la señal fluorescente obtenida durante un inmunoensayo con el kit VIDAS® GDH (bioMérieux) emitida por unas composiciones acuosas según la invención o unas composiciones comparativas, en función del tiempo, cuando estas composiciones se mantienen a 37°C.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Preparación de la GDH recombinante de Clostridium difficile

El gen gluD que codifica para la GDH de Clostridium difficile (N° de acceso Genbank M65250) completado con una secuencia que codifica un tag HIS se clona en el vector pMR78 (bioMérieux, Francia). El plásmido de expresión así construido se introduce en unas bacterias E. coli BL21 y derivadas (Stratagene, Agilent Technologies). Los cultivos se realizan en medio 2x YT (Difco), en presencia de ampicilina, a 37°C bajo agitación. La inducción de la expresión de la proteína se lleva a cabo por adición de 1 mM de IPTG (isopropil beta-D-1-tiogalactopiranosido). Las bacterias se recogen por centrifugación al final del cultivo.

Los residuos bacterianos se recogen en tampón PBS 2X (Tampón Fosfato Salino, en inglés “phosphate buffered saline”) y se lisan. Los lisados se centrifugan a 3000 g durante 30 minutos a 4°C. El sobrenadante contiene las proteínas solubles, incluyendo la GDH recombinante a purificar.

La purificación de la proteína se lleva a cabo por cromatografía de afinidad de quelato metálico en una etapa. El sobrenadante obtenido después de la centrifugación se carga sobre una resina Ni-NTA-Agarosa (Qiagen). Después de un ciclo de lavado, la proteína se eluye en presencia de un gradiente de imidazol. La proteína se dializa en un tampón fosfato 20 mM.

Ejemplo 2: Puesta en evidencia de la estabilización de las propiedades antigénicas de la GDH usando unos compuestos de estabilización según la invención

La GDH recombinante, preparada en el ejemplo 1, se diluye a 3 ng/ml en las formulaciones siguientes, según las indicaciones relativas al calibrador y control (S1/C1) dadas en el prospecto del reactivo VIDAS® GDH (Ref. 30125, bioMérieux, Francia)

- Composición comparativa: fosfato 100mM BSA 50g/l, pH 5,8 (formulación de la disolución de calibración del kit Vidas®, GDH en forma liofilizada, recogida en agua desmineralizada),

- Composición 1 según la invención: ácido N-(2-acetamido)iminodiacético (ADA) 100mM BSA 50g/l pH 5,8 (composición ADA)

- Composición 2 según la invención: ácido succínico 100mM BSA 50g/l pH 5,8 (composición succinato) - Composición 3 según la invención: fumarato disódico 100mM BSA 50g/l pH 5,8 (composición fumarato).

Cada composición (comparativa y ADA, succinato y fumarato) se ha preparado previamente de la siguiente manera: se ha mezclado cada compuesto de estabilización (1,18 g de ácido succínico - Merck, 1,6 g de fumarato de sodio dibásico - Sigma, 1,90 de ADA - Sigma, o 0,78 g de fosfato NaH2PÜ4.2H2O 1,79 g de Na2HPÜ4.12H2O) con agua desmineralizada para obtener 50 ml. Después, se ha añadido NaOH 10 M N para ajustar el pH a 5,8. Se han añadido cinco g de BSA (Millipore). Finalmente, se añadió agua desmineralizada para obtener una disolución de 100 ml. Las 4 composiciones que contienen GDH se alicuotaron después en fracciones de 1 ml, después se conservaron a 37 /- 1°C. El impacto de la formulación sobre la estabilidad de las propiedades antigénicas de la proteína GDH recombinante se evalúa realizando varios ensayos de la GDH durante un periodo de 91 días con el kit VIDAS® GDH (Ref. 30125) y el instrumento VIDAS® según las instrucciones del fabricante (bioMérieux, Francia).

El uso del ensayo VIDAS GDH respeta el protocolo del kit comercializado:

- introducción de 200 pl de muestra 1 ml del reactivo de pretratamiento R1

- homogeneización por vórtice

- introducción de 300 pl de esta dilución al 1/6 en el pocillo de muestra del cartucho del kit VIDAS® GDH Cada alícuota se utiliza sólo para un único periodo de seguimiento, pero se usa en duplicado sistemáticamente. El instrumento VIDAS mide una señal de fluorescencia y los resultados se expresan en “relative fluorescence value” (valor de fluorescencia relativa) o RFV.

Los resultados de RFV obtenidos para las 2 mediciones en duplicado (1 y 2) así como la relación J/J0 (RFV en el día J sobre RFV en el día 0) se dan en la tabla 4 siguiente y se reproducen también en el gráfico de la Figura 2.

Tabla 4

Los resultados ponen en evidencia que a 37°C, el uso de compuestos de estabilización que consisten en ácidos carboxílicos que tienen una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono y que comprende al menos 2 grupos -COOH, permite mejorar muy sustancialmente la duración de conservación de una solución acuosa que contiene GDH ya que, para la composición comparativa, no existe ya señal a los 28 días, mientras que la relación J/J0 en esta fecha para las composiciones según la invención es al menos igual a 0,5.

Ejemplo 3: Seguimiento de las propiedades antigénicas de la GDH en solución acuosa usando el ácido cítrico como compuesto de estabilización

Se ha repetido el modo de realización del ejemplo 2, con la diferencia de que se ha usado el ácido cítrico (100 mM) como compuesto de estabilización y de que se han conservado las soluciones acuosas en un periodo más largo, a 2-8°C y 37°C.

Los resultados de RFV obtenidos para las 2 mediciones en duplicado (1 y 2) así como la relación J/J0 se dan en la tabla 5 siguiente.

Tabla 5

Los resultados anteriores ponen en evidencia que la adición de ácido cítrico permite una muy buena estabilidad relacionada con la conservación de las propiedades antigénicas de la GDH, con una estabilización casi óptima, incluso después de 18 meses, cuando la composición acuosa se conserva entre 2-8°C.

Ejemplo 4: Seguimiento de las propiedades antigénicas de la GDH en solución usando ácido succínico y sorbitol Se ha repetido el modo de realización del ejemplo 2, con la diferencia de que se ha añadido además un 10% de sorbitol en una composición succinato y de que se han conservado las soluciones acuosas en un periodo más largo, a 2-8°C y a 37°C.

Los resultados de RFV obtenidos para las 2 mediciones en duplicado (1 y 2) así como la relación J/J0 se dan en la tabla 6 siguiente.

Tabla 6

Los resultados anteriores ponen en evidencia que el ácido succínico permite también una estabilización larga de las propiedades antigénicas de la GDH en solución acuosa, no alterando esta estabilización la adición de sorbitol, con una estabilización casi óptima, incluso después de alrededor de 30 meses, cuando la solución acuosa se conserva entre 2-8°C.

Claims

REIVINDICACIONES

1 . Procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium en una muestra biológica susceptible de contener dicha bacteria, caracterizado por que comprende las etapas de:

(i) realizar un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de la presencia de glutamato deshidrogenasa en dicha muestra usando una composición acuosa que comprende glutamato deshidrogenasa de una bacteria del género Clostridium y un compuesto de estabilización que es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono, y que comprende al menos 2 grupos -COOH, o una de sus sales, y

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que la composición comprende también una macromolécula, también denominada “proteína de carga”, y/o un poliol.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado por que el ácido carboxílico contiene una cadena carbonada de 4, 5 o 6 átomos de carbono.

4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el compuesto de estabilización se selecciona entre los ácidos carboxílicos siguientes, y sus sales:

(i) los ácidos carboxílicos que contienen una cadena carbonada de 4 átomos de carbono que tiene al menos 2 grupos -COOH y unos grupos -CX- seleccionados independientemente entre =CH-, -CH²- y -C(H)OH-, y (ii) los ácidos carboxílicos que contienen una cadena carbonada de 5 átomos de carbono que tiene al menos 2 grupos -COOH y unos grupos -CX- seleccionados entre -CH²- y -C(H)NH², y

(iii) los ácidos carboxílicos que contienen una cadena carbonada de 6 átomos de carbono que tiene al menos 2 grupos -COOH y unos grupos «CX» seleccionados entre -CH²-, -C(H)OH- y -C(O)NH².

5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el ácido carboxílico contiene, en su cadena carbonada, un doble enlace y es un isómero E.

6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el ácido carboxílico contiene 2 grupos -COOH.

7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el compuesto de estabilización se selecciona entre el ácido fumárico, el ácido succínico, el ácido málico, el ácido glutárico, el ácido cítrico, el ácido tártrico, el ácido N-(2-acetamido)iminodiacético, el ácido glutámico, el ácido adípico, el ácido aspártico, el ácido pimélico, el ácido malónico, y sus sales.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado por que el compuesto de estabilización se selecciona entre el ácido succínico y el ácido fumárico, y sus sales, en particular de metal alcalino.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la glutamato deshidrogenasa es una enzima de la bacteria de la especie Clostridium difficile.

10. Procedimiento de detección de la presencia de una bacteria toxinogénica del género Clostridium que produce al menos una toxina, en una muestra biológica susceptible de contener dicha bacteria, y dicha al menos una toxina, caracterizado por que comprende las etapas de:

(i) realizar un procedimiento de detección de la presencia de una bacteria del género Clostridium por detección o cuantificación de glutamato deshidrogenasa en dicha muestra, usando una composición acuosa que comprende glutamato deshidrogenasa de una bacteria del género Clostridium y un compuesto de estabilización que es un ácido carboxílico que tiene una cadena carbonada de al menos 3 átomos de carbono, y que comprende al menos 2 grupos -COOH, o una de sus sales, y

(ii) un resultado negativo de la etapa (i) permite determinar la ausencia de la bacteria, o

(ii’) si el procedimiento de la etapa (i) es positivo, implementar un procedimiento de detección o cuantificación de al menos una toxina susceptible de ser liberada por dicha bacteria del género Clostridium en la misma muestra biológica, o en una nueva muestra biológica procedente del mismo individuo, y determinar el hecho de que la bacteria es toxinogénica y produce dicha al menos una toxina si dicha al menos una toxina está presente.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado por que la bacteria es Clostridium difficile y dicha al menos una toxina comprende la toxina A, la toxina B, o las dos.