CN106103468A - 稳定水溶液中的谷氨酸脱氢酶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种在水溶液中稳定来自梭菌属细菌的谷氨酸脱氢酶以保持其抗原特性的方法,包括将所述谷氨酸脱氢酶与稳定化合物混合的步骤,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链且包含至少两个–COOH基团的羧酸或者其盐。本发明还涉及由此稳定的GDH组合物及其用于检测梭菌属细菌的存在的应用。
Description
本发明涉及在体外检测可能含有细菌蛋白质的生物学样品中这些细菌蛋白质的领域。本发明特别涉及稳定来自梭菌(Clostridium)属细菌的谷氨酸脱氢酶,以便所述蛋白质在水溶液中时保留其抗原特性。
梭菌属细菌是革兰氏阳性的、形成芽孢的厌氧菌,其不能将硫酸盐还原成亚硫酸盐。一些菌种是非常致病的,如艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens),这些菌种是最熟知的。
艰难梭菌是导致施用抗生素后腹泻的主要因素。由于其极高的传染潜力而令人恐惧。尽管大约5%人群是该细菌的无症状携带者,但是其病理学表现与住院时间密切相关。这种细菌存在于由于用抗生素治疗而变弱的肠道菌群中且可以分泌两种毒素:A和B。只有产生毒素的菌株是病原性的。毒素A是一种肠毒素,导致肠上皮通透性改变;毒素B是一种细胞毒素,直接攻击上皮细胞。这两种毒素的组合效应是肠道传送时间和肠吸收时间的降低,从而导致腹泻。较罕见地,艰难梭菌可导致结肠的严重炎症(伪膜性结肠炎)。
肉毒杆菌一部分造成肉毒中毒。其产生呈现细菌抗性形式的芽孢。这些芽孢可抵抗较弱的热处理如巴氏杀菌,这可造成食品安全性问题,接着可产生能增殖的代谢活性细菌细胞。这种细菌分泌生物世界上最强毒素之一,肉毒毒素。通过主动摄取,这种毒素在生物体中扩散并通过阻断神经肌肉传导而起作用:抑制肌肉收缩的运动神经元。如果未及时治疗,这种感染通过呼吸肌麻痹而可以导致死亡。
产气荚膜梭菌是存在于子宫的一种细菌,有时位置非常深。这种细菌产生坏死毒素,因此导致坏死性肠炎。最常见的主要毒素是α毒素,尤其是由A型产气荚膜梭菌产生的毒素。这种毒素在人体和动物中导致大量的坏疽。单独或者与其它毒素组合,其在猪和反刍动物中也可以导致直线上升的死亡率。
这些细菌及其毒素分泌存在的检测因此成为主要的公众健康问题,要求实验室具有在灵敏性/特异性及使用这些测试获得的结果的再现性方面均可靠的测试检验。为此,实验室特别需要包括不随时间而降解及因此保持稳定的试剂的测试。
样品中细菌存在的检测可以通过各种技术进行,如使用培养基或者免疫测定技术,这些为本领域技术人员熟知。免疫测定技术是一种主要包括使用这些蛋白质的结合配体检测蛋白质存在的技术。在检测梭菌属细菌的情况中,代表这种细菌存在的可检测蛋白质之一是谷氨酸脱氢酶(GDH)。其它可检测蛋白质是当细菌是产毒性时分泌的毒素。通过免疫测定检测或量化GDH与通过免疫测定检测或量化毒素相比可具有更高的诊断灵敏性。其用作风险人群的筛选方式。在阳性结果的情况中,然后推荐查找毒素,因为这种技术部分具有较高的特异性。
一些诊断公司提议用试剂盒检测艰难梭菌中的GDH。例如可提及的是来自本申请人的GDH试剂盒。
除了结合配体之外,免疫测定技术也需要使用校准和/或对照试验的试剂。因此,在GDH免疫测定中,这种试剂包含这样的GDH,其必须在包含其的诊断试剂盒的保存期限内尽可能长的保持其抗原特性。
从化学观点及从物理观点而言,蛋白质的性质可以通过任何结构修饰而被破坏。蛋白质的化学修饰基于在共价键水平的改变,例如由于氧化、水解反应等,而物理修饰也称作变性,导致蛋白质的三级结构或三维构象的解体,而不破坏共价键。蛋白质变性可以通过许多化学或物理因素诱导,例如温度、pH改变或者化学药剂。这种修饰的结果是蛋白质的实际活性被破坏。因此,在酶如GDH的情况中,这种修饰可改变其酶活性,这是各研究人员已经试图去克服的事情。
因此,例如专利申请WO 2007/003936的申请人描述了使用一或多种稳定化合物稳定各种蛋白质的酶活性,所述化合物具有如下特征:
-其具有可离子化基团,能与被稳定的蛋白质及与水溶液的离子化产物进行质子交换,
-所述可离子化基团包括第一个基团,当其质子化时是正电荷的,当其去质子化时是无电荷的,及第二个基团,当其质子化时是无电荷的及当去质子化时是负电荷的,及
-组合物的pH维持在所述pH的+/-0.5个pH单位范围内,在此pH所述组合物具有相对于pH的最大稳定性。
这篇文献指出牛GDH的酶活性通过加入赖氨酸作为稳定化合物而被保持,而加入柠檬酸盐不能使得GDH保持这种酶活性。
Garcia-Galan C.et al.,2013指出可以通过用聚乙烯亚胺在存在Li+离子条件下包被GDH表面而稳定大肠杆菌GDH以便维持其酶活性。
然而,尚无研究人员示出对怎样稳定GDH以便保留其抗原特性感兴趣,尽管这是当这种蛋白质用于水溶液、特别是以极稀释的方式如以大约几个ng/ml的浓度使用中会遇到的问题。
事实上,GDH通常以冻干形式贮存,因为已知其置于水溶液中时不保持其抗原特性。因此,当GDH必须置于水溶液中时,例如在GDH免疫测定的情况中,实验助手将冻干的GDH置于水相溶剂中,并制备等份,其随后必须在-20℃冷冻。水溶液的有效期限非常短,在2-8℃之间贮存为平均两个月。进一步地,GDH置于水相缓冲液中的缺点是不仅导致额外的操作,而且也导致当其放置时额外失误风险。最终,这也需要冰箱的存在。
本申请人已经发现,出乎意料地,可以稳定水溶液中的GDH以便其三维结构至少部分被保护,由此其保持抗原特性。这种稳定是通过加入作为稳定化合物的羧酸或其盐进行的,所述羧酸具有至少三个碳原子的碳基链并且包含至少两个–COOH基团。通过加入这种化合物,包含GDH的水溶液可以在2-8℃温度贮存几个月。
因此,本发明的第一个主题涉及稳定来自梭菌属细菌的谷氨酸脱氢酶以维持其抗原活性的方法,包括将在水溶液中的所述谷氨酸脱氢酶与稳定化合物混合的步骤,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链和至少两个-COOH基团的羧酸或其盐。
本发明的另一主题涉及因此获得的稳定的水性组合物,还涉及包含这些组合物的诊断试剂盒。
本发明的再一主题涉及所述组合物在GDH免疫学测定中建立标准范围的应用。
本发明的再一主题涉及所述组合物在GDH免疫学测定中作为校准物和/或对照物的应用。
最后,本发明最后一方面的主题涉及使用本发明的组合物检测梭菌属细菌存在的方法,所述细菌视情况而定是产毒性的。
本发明人因此出人意料地证实,使用特定的化合物可以稳定来自梭菌属细菌的GDH,从而当GDH在水溶液中,特别是GDH在以大约几个ng/ml的浓度例如0.75-10ng/ml、2-10ng/ml或者3-6ng/ml应用时时维持其抗原特性,这在通过免疫测定检测这些细菌的测试中特别重要。
“维持GDH的抗原特性”是指GDH由于其结构被保护,至少参与与结合配体的结合的抗原性决定簇被保护,从而在免疫测定中保持与其结合配体结合的性质。
当然,在术语“免疫测定”中的前缀词“免疫”在本申请中不认为是严格指示结合配体必须是免疫来源的配体,如抗体或抗体片段。事实上,正如本领域技术人员熟知,这个术语更广泛用于表明其中结合配体不是免疫来源/性质的配体的试验和方法中,而是例如包括希望检测和/或量化的被分析物的受体。要求是结合配体能结合被分析物,优选特异性结合。因此,已知ELISA测定是使用在严格意义上不是免疫学的结合配体的测定,更广泛地称作“配体结合测定”,而标题中包含的术语“免疫”完全相应于首字母缩写ELISA。为了澄清及统一起见,在本申请中使用的术语“免疫”是指任何使用适于结合、优选特异性结合被分析物及检测和/或量化其的至少一种结合配体的生物学分析,甚至当所述结合配体在严格意义上不是免疫学性质或来源的情况。
术语“GDH结合配体”是指能结合GDH的任何分子。例如,可以提及的GDH结合配体是抗体、抗体片段、nanofitins、GDH受体、适体、DARPins或者已知与GDH相互作用的任何其它分子。
结合配体抗体是例如多克隆抗体或者单克隆抗体。
多克隆抗体可以通过用靶GDH作为免疫原免疫动物,随后回收纯化形式的希望的抗体而获得,通过获取所述动物的血清及将所述抗体与其它血清成分分离,例如通过在附着由该抗体特异性识别的抗原、特别是免疫原柱上进行亲和性层析或者利用蛋白质A或G进行分离。
单克隆抗体可以通过本领域技术人员熟知的杂交瘤技术获得。单克隆抗体也可以是通过遗传工程获得的重组抗体,使用本领域技术人员熟知的技术进行。
抗体片段例如可提及的是Fab、Fab'和F(ab')2片段,也可以是scFvs(单链可变片段)和dsFvs(双链可变片段)。这些功能片段可特别通过遗传工程获得。
Nanofitins(商品名)是如抗体的小蛋白质,能结合生物靶标,因此使得可以检测、捕获或者非常简便地靶向生物体内的生物靶标。
适体是在含有直至1015个不同序列的文库中鉴别的寡核苷酸,通常是RNA或DNA,利用已知为“指数富集的配体系统进化法”(SELEX)(Ellington AD and Szostak JW.,1990)的体外组合选择方法进行。大多数适体是由RNA组成,由于RNA采用的不同及复杂结构的能力,从而使得可以在其表面产生不同几何形式的腔,使得可以结合不同的配体。这些是感兴趣的生物化学工具,可用于生物技术、诊断或治疗性应用中。其灵敏性和配体结合性质与抗体的那些性质相当。
“DARPins”是指设计的锚定重复序列蛋白(Boersma YL and Plütckthun A,2011),是使得可以模拟抗体及能以高亲和性和高选择性结合靶蛋白质的另一类蛋白质。其衍生自锚蛋白家族,是使得完整的膜蛋白与组成细胞浆膜“支架”的血影蛋白/肌动蛋白网附着的适体蛋白。锚蛋白的结构基于一个大约33个氨基酸的单位的重复,DARPins也如此。每个单位具有螺旋-转角-螺旋类型的二级结构。DARPins含有至少3个、优选4-5个重复单位,通过筛选组合文库获得。
使用的结合配体可以是GDH特异性的或者非特异性的。当其能排他地或者几乎排他地结合GDH时称其是特异性的。当其GDH结合选择性较低及其随后能结合其它配体如其它蛋白质或抗体时,称其为非特异性的。根据一个优选的实施方案,优选特异性结合配体。
需要被稳定的谷氨酸脱氢酶是来自梭菌属的任何谷氨酸脱氢酶,希望其用于检测例如艰难梭菌、肉毒杆菌或者产气荚膜梭菌的存在情况。包括所有可能的变体。这种蛋白质是已知的,其序列在例如Uniprot数据库(www.uniprot.org)中描述。
因此,来自艰难梭菌的GDH(Uniprot登记号no.P27346)是具有421个氨基酸的蛋白质,其参考氨基酸序列如下SEQ ID NO:1所示:
其变体是:
表1
变体的Uniprot登记号No. | 菌株 |
Q18CS0 | 艰难梭菌(菌株630) |
C9XIV3 | 艰难梭菌(菌株CD196) |
C9YHY9 | 艰难梭菌(菌株R20291) |
G6B2V9 | 艰难梭菌002-P50-2011 |
G6BHV4 | 艰难梭菌050-P50-2011 |
D5S4M2 | 艰难梭菌NAP07 |
G6BQY2 | 艰难梭菌70-100-2010 |
D5Q9B1 | 艰难梭菌NAP08 |
来自产气荚膜梭菌的GDH是在Uniprot数据库中还没有参考序列的一种蛋白质。在Uniprot数据库中给出的第一种蛋白质(Uniprot登记号No.Q8XK85)是菌株13/A型的蛋白质,具有448个氨基酸,氨基酸序列如下SEQ ID NO:2所示:
其变体是:
表2
变体的Uniprot登记号No. | 菌株 |
Q8XK85 | 产气荚膜梭菌(菌株13/A型) |
Q0SST9 | 产气荚膜梭菌(菌株SM101/A型) |
Q0TQ84 | 产气荚膜梭菌(菌株ATCC 13124/NCTC 8237/A型) |
B1R556 | 产气荚膜梭菌B str.ATCC 3626 |
B1BJJ0 | 产气荚膜梭菌C str.JGS1495 |
B1BWI0 | 产气荚膜梭菌E str.JGS1987 |
B1RGN1 | 产气荚膜梭菌CPE str.F4969 |
B1V119 | 产气荚膜梭菌D str.JGS1721 |
B1RPY4 | 产气荚膜梭菌NCTC 8239 |
H7CWP7 | 产气荚膜梭菌F262 |
H1CRA8 | 产气荚膜梭菌WAL-14572 |
来自肉毒杆菌的GDH是在Uniprot数据库中还没有参考序列的一种蛋白质。在Uniprot数据库中给出的第一种蛋白质(Uniprot登记号No.A5I2T3)是菌株Hall/A型蛋白质(ATCC 3502,NCTC 13319),具有421个氨基酸,其氨基酸序列如下SEQ ID NO:3所示:
该菌株的421、447或450个氨基酸的变体是:
表3
变体的Uniprot登记号No. | 菌株 |
B1IM79 | 肉毒杆菌(菌株Okra/B1型)421 |
B1KSB4 | 肉毒杆菌(菌株Loch Maree/A3型) |
A7FUM1 | 肉毒杆菌(菌株ATCC 19397/A型) |
E8ZRR3 | 肉毒杆菌(菌株H04402 065/A5型) |
B2TLD1 | 肉毒杆菌(菌株Eklund 17B/B型) |
C1FNV0 | 肉毒杆菌(菌株Kyoto/A2型) |
B2V1W6 | 肉毒杆菌(菌株Alaska E43/E3型) |
C3KX46 | 肉毒杆菌(菌株657/Ba4型) |
D5VZM8 | 肉毒杆菌(菌株230613/F型) |
F4A4K5 | 肉毒杆菌BKT015925 |
A7GE56 | 肉毒杆菌(菌株Langeland/NCTC 10281/F型) |
B1B9U1 | 肉毒杆菌C str.Eklund |
C5VRL1 | 肉毒杆菌D str.1873 |
B1QDG7 | 肉毒杆菌NCTC 2916 |
B1QQR1 | 肉毒杆菌Bf |
M1ZQM8 | 肉毒杆菌CFSAN001627 |
L1LK36 | 肉毒杆菌CFSAN001628 |
C5UPY2 | 肉毒杆菌E1str.'BoNT E Beluga' |
根据一个特定的实施方案,谷氨酸脱氢酶是来自艰难梭菌细菌的酶。
置于水溶液中的谷氨酸脱氢酶是天然来源的或者是重组来源的。天然 的或者另外称作自然的谷氨酸脱氢酶可以在培养梭菌属细菌及从细菌裂解物中纯化该蛋白质之后而获得。重组谷氨酸脱氢酶可以使用本领域技术人员熟知的技术通过遗传工程获得。这种获得在例如Anderson BM et al.,1993中描述。重组谷氨酸脱氢酶可以得自如HolzelDiagnostika GmbH(Germany)等公司。
术语“水性组合物或水溶液”是指通过一或多种化合物的完全溶解获得的澄清的液体溶液,主要溶剂是水,相对于溶液的总体积水的体积为至少50%,通常为至少60%、70%、80%或90%。
在本发明中,水性组合物或水溶液是通过将GDH在主要包含水和如后文定义的稳定化合物的溶剂中稀释获得的。加入含有被稳定的GDH的水溶液中的所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链及包含至少两个–COOH基团的羧酸或其盐。
“具有至少三个碳原子的碳基链及包含至少两个–COOH基团的羧酸”是指如下组成的分子:
-线性或支链的碳基链,其是连续的(即在碳基链中无中断)或者由除碳原子之外的至少一个其它原子中断,例如氮原子或氧原子,
-在链末端的至少两个–COOH基团,及
-至少一个“CX”基团,位于链末端(写作-CX),或者在链中间(写作-CX-),X是除C之外的原子。
例如,–CX–基团单独地选自-CH2、=CH–、–C(H)OH–、–C(H)NH2–和–C(O)–。–CX基团其部分单独地选自–CH3、–COOH(如果分子中有超过两个–COOH基团)及–C(O)NH2。
因此,例如稳定化合物可以是琥珀酸,其化学式为OH(O)C-(CH2)2-C(O)OH,其是具有四个碳原子的连续线性碳基链的分子,在链的末端具有两个–COOH基团,并且具有两个–CH2–基团。
另一实例是由反丁烯二酸组成,化学式为OH(O)C-(CH=CH)-C(O)OH,这是具有四个碳原子的连续的线性碳基链的分子,在链的末端具有两个–COOH基团及两个–CH–基团。
另一实例是由N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸组成,化学式为H2NC(O)-CH2-N(CH2-COOH)2,这是具有六个碳原子的支链碳基链的分子,链由氮原子中断,在链末端具有两个–COOH基团,及三个–CH2–基团和一 个–C(O)NH2基团。
根据一个特定的实施方案,稳定化合物选自:反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸、谷氨酸、己二酸、天冬氨酸、庚二酸、丙二酸,及其盐,它们的化学式在图1中示出。
术语“羧酸盐”是指一价阳离子盐。一价阳离子可以提及的是铵(NH4+)、银(Ag+)、二胺银(Ag(NH3)2 +)、铯(Cs+)、一价铜(I)(Cu+)、汞(Hg+)、甲烷鎓(methanium)(CH5 +)、甲基(methylium)(CH3 +)和亚硝基(nitrosium)(NO2 +)离子以及碱金属离子钠(Na+)、钾(K+)和锂(Li+)。
当稳定化合物是盐形式时,-COOH基团的至少一个质子H+用上述一价阳离子置换。
根据一个优选的实施方案,稳定化合物选自琥珀酸、反丁烯二酸,及其盐,特别是碱金属盐,如上文定义。
碳基链可包含一或多个如下特性:
-其可包含至少三个碳原子至至多十个原子,优选至多八个、优选至多七个、优选至多六个原子,
-其插入氮原子或者其是连续的且仅由碳原子组成,
-“CX”基团单独地选自–CH2–、=CH–、–CH3、–COOH、–C(H)OH–、–C(O)NH2、–C(H)NH2–和–C(O)–,及
-其可以包含或不包含一或多个双键,及随后所述酸可以是E或Z异构体形式。
特别地,所述羧酸可具有一或多个如下特性:
-具有4、5或6个碳原子的碳基链,
-具有四个碳原子的碳基链,具有至少两个-COOH基团及单独地选自=CH–、-CH2–和–C(H)OH–的–CX–基团,
-具有五个碳原子的碳基链,具有至少两个–COOH基团和选自–CH2–和–C(H)NH2的–CX–基团,
-具有六个碳原子的碳基链,具有至少两个–COOH基团和选自–CH2–、–C(H)OH–(-CX-)和-C(O)NH2(-CX)的–CX–基团,
-一个双键,并且是E异构体,
-两个–COOH基团。
水溶液中存在的GDH的量依赖于含有其的水性组合物的最终使用。在常规的免疫测定中,GDH以0.75-10ng/ml或者2-10ng/ml、优选3-6ng/ml的比例存在。在“超灵敏”免疫测定中,GDH以更低量存在,例如低于1pg/ml,或者甚至为大约1fg/ml。
加入到含有GDH的水溶液中的稳定化合物的量极大地超过GDH的量。其依赖于所述稳定化合物是否仅用作稳定化合物,然后加入另一分子作为缓冲剂,或者其是否既用作稳定化合物又用作缓冲剂。因此,例如当稳定化合物仅用作稳定化合物时,每个GDH单体加入20-100个稳定化合物分子,优选30-80个稳定化合物分子/GDH单体,更优选40-60个稳定化合物分子/GDH单体。在这种情况中,加入作为缓冲剂的化合物是本领域技术人员已知的pH在4.5-7之间的任何化合物,优选pH在5.5-6.5之间,优选5.8。加入作为缓冲剂的化合物例如可提及的是磷酸盐和乙酸盐。当稳定化合物用作稳定化合物也用作缓冲剂时,每个GDH单体加入108-1010个分子,优选1×109-5×109个稳定化合物分子/GDH单体,更优选1×109-2×109个稳定化合物分子/GDH单体。
在本发明的方法中,其它化合物也可以加入到水性组合物中。因此,例如可以加入多元醇。多元醇的加入使得可以促进蛋白质的热稳定性(对加热变性的抗性),及也防止聚集。通常地,多元醇具有共-溶剂作用,且有助于维持蛋白质在水溶液中的天然构象。
多元醇例如可以提及的是单糖醇如三元醇,例如甘油;四元醇,例如赤藻糖醇;五元醇,如木糖醇、阿糖醇和核糖醇;六元醇,如山梨糖醇、半乳糖醇及甘露醇;七元醇(heptols),如庚七醇;以及二糖醇,如麦芽糖醇、异麦芽糖醇和乳糖醇。
根据本发明的一个实施方案,加入本发明方法中的水性组合物中的多元醇是山梨糖醇。
加入水性组合物中的多元醇的比例是至少1%,优选至少5%,更优选至少10%,至多50%。
组合物也可以包含另一种大分子,尽管除了蛋白质之外的大分子也是合适的,但是通常称作“充填蛋白质(filler protein)”,其与GDH无关联,但是相对于GDH以大量存在,进一步改良GDH的稳定。这种“充填蛋白质” 在一定意义上具有屏蔽作用(shield effect),其部分经历在水溶液中的物理化学修饰,因此使得可以保护感兴趣的蛋白质、在本例中是GDH。这种加入的大分子可例如是BSA(牛血清白蛋白)的蛋白,或者是葡聚糖或聚乙二醇类型的合成聚合物。例如加入的BSA的比例是50g/l比3mg/l的GDH。
对水性组合物进行缓冲,以使其pH在4.5-7之间,优选在5.5-6.5之间,优选pH5.8。如先前指出,本发明的稳定化合物也可以用作缓冲剂,或者可以加入另一种缓冲化合物。
包含来自梭菌属细菌的谷氨酸脱氢酶和稳定化合物的水性组合物是新的且构成本发明的另一主题,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链且包含至少两个–COOH基团的羧酸或其盐,应理解所述稳定化合物既不是谷氨酸盐,也不是α-酮戊二酸盐,这些是由谷氨酸盐被GDH酶及NAD+辅酶水解产生,也不是柠檬酸盐、琥珀酸盐、戊二酸盐。
根据另一实施方案,本发明的水性组合物还不包括谷氨酸、α-酮戊二酸、戊二酸、琥珀酸和/或柠檬酸。
当梭菌属细菌选自艰难梭菌、肉毒杆菌和产气荚膜梭菌时,包含来自这些细菌之一的谷氨酸脱氢酶和稳定化合物的水性组合物是新的且构成本发明的另一主题,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链及包含至少两个–COOH基团的羧酸或其盐,应理解所述稳定化合物既不是谷氨酸盐,也不是α-酮戊二酸、柠檬酸盐。
根据另一个实施方案,本发明的水性组合物还不包括谷氨酸、α-酮戊二酸和/或柠檬酸。
先前描述的特别是在本发明方法中关于GDH、稳定化合物、加入的混合物及其相对量的选择的相同特性和优选性,也适用于本发明的水性组合物。
本发明的水性组合物,特别是根据本发明方法获得的那些组合物,特别用于检测可能含有梭菌属细菌的生物学样品中这种细菌的存在。因此,含有这种组合物的试剂盒构成了本发明的另一主题。
可能含有梭菌属细菌的生物学样品可以是来自临床领域或来自检验工业产品的无毒害或者甚至无菌性领域的样品。在临床领域,所述样品是动物、优选人的生物学样品,如粪便或其衍生物,例如粪便蛋白质提取物,尿液,血液或衍生物,例如血清或血浆,脓液等。在工业领域,所述样品 来自食品或化妆品。
本发明的试剂盒也可以含有例如通过免疫测定检测梭菌属细菌及特别是艰难梭菌的存在的方法所需要的化合物。因此,例如试剂盒可含有如前所述的一或多种GDH结合配体,及证实结合配体与GDH之间反应所需的所有化合物。
定性或定量GDH免疫学测定优选是夹心测定,这是为本领域技术人员熟知的一种测定方法,使用两个GDH结合配体进行。两个配体之一可以与一标记结合以形成缀合物或追踪物。另一结合配体可以捕获在固体支持物上。术语“捕获配体”用于后者,检测配体用于前者。
由缀合物发射的测量信号与生物学样品中的GDH的量成比例。
术语“标记”是指含有与结合配体的基团反应的基团的任何分子,无化学修饰直接反应,或者在化学修饰之后包含这种基团之后反应,这种分子能直接或间接产生可检测信号。这些直接检测信号的非限制性列表包括:
·产生可检测信号如比色、荧光、发光信号的酶,例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或者葡萄糖-6-磷酸脱氢酶,
·生色团如荧光、发光或染色化合物,
·放射性分子,如32P、35S或125I,
·荧光分子如Alexas或者藻蓝蛋白,及
·电化学发光盐如基于吖啶或基于钌的有机金属衍生物。
间接检测系统也可以使用,例如能与抗-配体反应的配体。所述配体相应于标记,与结合配体构成缀合物。
成对的配体/抗配体为本领域技术人员熟知,例如如下配对:生物素/抗生物素蛋白,半抗原/抗体,抗原/抗体,肽/抗体,糖/凝集素,多核苷酸/与该多核苷酸互补的多核苷酸。
所述抗配体可以通过先前描述的直接检测标记直接检测,或者其自身通过另一对配体/抗配体检测等。
这些间接检测系统在一定条件下可使得信号放大。这种信号放大技术为本领域技术人员熟知,可参见本申请人先前的专利申请FR 2781802或WO 95/08000。
根据使用的标记的类型,本领域技术人员将加入试剂以使得可以通过任何合适的测量仪器可以观测标记或者可检测的信号发射,例如分光光度 计、分光荧光计、光密度计或者高分辨率相机。
在GDH测定中,根据本发明的方法获得的本发明的水性组合物可特别用于建立标准范围,这构成了本发明的另一主题。标准范围的建立,可以量化GDH必需的一个步骤,是本领域技术人员熟知的一个步骤。简而言之,其在于通过GDH分析物的已知量或浓度增加测量产生的信号,绘制信号与所述量或浓度相关的曲线图,及发现以最可靠方式表示这种关系的数学模型。为此,使用本发明的含有不同GDH浓度的一些水性组合物。使用数学模型通过推断确定检测的生物学样品中含有的未知量或浓度的GDH。
根据本发明的方法获得的本发明的水性组合物也可特别用作校准物,这构成的本发明的另一主题。在这种情况中,组合物中GDH浓度是固定且已知的。在使用免疫测定试剂盒期间由校准物产生的信号也已知。所述校准物用于核实在使用免疫测定试剂盒期间产生的测量值(信号)确实相应于预期值。如果不是这种情况,所述校准物用于测量位移,所述位移可以数学校正或者通过对测量仪器进行物理干预(调整)而校正。
根据本发明的方法获得的本发明的水性组合物也可特别用于作为对照物,这构成了本发明的另一主题。在这方面,其用于例如核实免疫测定试剂盒如预期地运行(也称作阳性对照),及在检测方法使用本发明的水性组合物适当运行的范围内所述生物学样品中GDH的检测不是假阴性的。
生物学样品中GDH的检测使得可以得出存在细菌的结论。
因此,本发明的另一主题涉及检测可能含有梭菌属细菌的生物学样品中这种细菌的存在的方法,特征在于其包括如下步骤:
(i)使用本发明的水性组合物、合适时是根据本发明的方法获得的水性组合物或者如先前定义的试剂盒,通过检测或量化所述样品中的谷氨酸脱氢酶,进行检测梭菌属细菌存在的方法,及,
(ii)如果步骤(i)的方法是阳性的,得出存在所述细菌的结论。
换句话说,对于步骤(ii),步骤(i)中的阳性结果使得可以得出存在所述细菌的结论。
另一方面,这未提供关于这种细菌是否产生至少一种毒素的信息,这个信息在患者存在如下症状时对于辅助诊断特别重要,上述症状也许由产毒性且表达至少一种毒素的细菌存在所致。
因此,本发明另一主题涉及检测可能含有产生至少一种毒素的产毒性 梭菌属细菌的生物学样品中这种细菌及至少一种这种毒素存在的方法,特征在于包括如下步骤:
(i)通过使用根据本发明的方法获得的本发明的水性组合物或者如先前定义的试剂盒检测或量化所述样品中的谷氨酸脱氢酶,进行检测梭菌属细菌存在的方法,及
(ii)如果步骤(i)的方法是阴性的,得出不存在所述细菌的结论,或者
(ii’)如果步骤(i)的结果是阳性的,进行检测或量化同一生物学样品中或者来自相同个体的新的生物学样品中由所述梭菌属细菌释放的至少一种毒素的方法,如果存在所述至少一种毒素则得出所述细菌是产毒性的并产生所述至少一种毒素的结论。
换句话说,对于步骤(ii),步骤(i)的阴性结果使得可以得出不存在该细菌的结论,步骤(i)的阳性结果使得可以得出存在该细菌的结论。
通过检测或量化生物学样品中的谷氨酸脱氢酶检测梭菌属细菌存在的上述步骤(i)已经在前文描述。通过本发明的方法获得的本发明的水性组合物可用于产生标准范围和/或作为校准物和/或作为阳性对照物。
检测或量化由所述梭菌属细菌释放的至少一种毒素的上述步骤(ii’)是为本领域技术人员熟知的一个步骤。这种检测或量化可以例如通过使用与所述毒素结合的配体的免疫测定进行。毒素免疫测定是以与先前描述的GDH免疫测定相似的方式进行。对梭菌属细菌的毒素进行免疫测定的试剂盒是可商购的,例如Clostridium difficile A&B试剂盒,其可以检测艰难梭菌毒素A和B。
质谱分析法也可用于进行检测/量化毒素的步骤。这种技术是一种分析技术,可以确定被分析的化合物的摩尔质量,及鉴别其分子结构,或者甚至对其量化。用于复杂的混合物如生物体液或粪便,需要结合可降低其复杂性的分离技术。这通常是气相层析(GC)或液相层析(LC)。串联质谱法(MS/MS)组合两种分析仪,可用于检测/量化。在第一个分析仪中选择及随后片段化的离子化合物在第二个分析仪中更精细地分析。这种双重分析可以显著增加所述方法的特异性。对于这种技术,可以特别参考Van den Broek et al.,2013所述。
毒素的检测和/或量化也可以通过在粪便中的免疫毒性检测(CTA)进行,这使得可以证实毒素在粪便中的生物作用(Eckert C.et al.,2011)。
毒素的检测或量化在与用于检测或量化GDH的样品相同的生物学样品中进行,该样品的一部分用于此方面,或者在来自相同来源的新的生物学样品中进行,即来自检测GDH存在的第一个生物学样品的相同个体(如果所述生物学样品是临床样品),或者来自相同来源(如果生物学样品是工业样品)。第二个生物学样品是相同性质的,或者是不同性质的,优选第一种情况。
根据一个特定的实施方案,想要检测其存在的产毒性细菌是艰难梭菌,至少一种毒素包括毒素A、毒素B或者这二者。
其它产毒性梭菌属细菌已经在前文描述。
通过如下以非限制性的例证给出的实施例及图1和2将得以更清晰地理解本发明,其中:
-图1例举用于本发明的水性组合物的稳定化合物及其化学式,及
-图2是一图表,显示在使用GDH试剂盒(bioMérieux)进行的免疫测定期间获得的由本发明的水性组合物或对比组合物发射的荧光信号随着时间的改变,这些组合物维持在37℃。
实施例
实施例1:来自艰难梭菌的重组GDH的制备
将具有编码附加HIS标签的序列的编码来自艰难梭菌的GDH的gluD基因(Genbank登记号No.M65250)克隆在pMR78载体(bioMérieux,France)中。将因此构建的表达质粒导入大肠杆菌BL21细菌及其衍生物中(Stratagene,Agilent Technologies)。在2×YT培养基(Difco)中在存在氨苄青霉素的条件下于37℃振荡培养。通过加入1mM的IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷)诱导蛋白质的表达。在培养结束时离心收集细菌。
将细菌沉淀物置于2×PBS缓冲液(磷酸盐缓冲盐水)中并裂解。将裂解物在3000g于4℃离心30分钟。上清含有可溶蛋白质,包括待纯化的重组GDH。
蛋白质的纯化是通过一步金属螯合亲和性层析进行的。将离心后获得的上清加样于Ni-NTA-琼脂糖树脂(Qiagen)上。在洗涤循环之后,将蛋白质在存在咪唑梯度条件下洗脱。将蛋白质在20mM磷酸盐缓冲液中透析。
实施例2:使用本发明的稳定化合物证实GDH的抗原特性的稳定化
将在实施例1中制备的重组GDH在如下配方中稀释为3ng/ml,根据在 GDH试剂(Ref 30125,bioMérieux,France)的信息资料中提供的关于校准物和对照物(S1/C1)的指示进行:
-对比组合物:100mM磷酸盐+50g/l BSA,pH 5.8(试剂盒的校准溶液配方,GDH是冻干形式,置于去矿物质水中),
-根据本发明的组合物1:100mM N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)+50g/l BSA,pH 5.8(ADA组合物),
-根据本发明的组合物2:100mM琥珀酸+50g/l BSA,pH 5.8(琥珀酸盐组合物),
-根据本发明的组合物3:100mM反丁烯二酸二钠+50g/l BSA,pH 5.8(反丁烯二酸盐组合物)。
如下提前制备每种组合物(对比组合物和ADA组合物、琥珀酸盐组合物和反丁烯二酸盐组合物):将每种稳定化合物(1.18g的琥珀酸–Merck,1.6g的反丁烯二酸二钠–Sigma,1.90g的ADA–Sigma或者0.78g的磷酸盐NaH2PO4.2H2O+1.79g的Na2HPO4.12H2O)与去矿物质水混合,获得50ml混合物。然后加入10N NaOH以调节pH为5.8。加入5g的BSA(Millipore)。最后,加入去矿物质水以获得100ml溶液。
然后将含有GDH的四种组合物等分为1ml,在37+/-1℃贮存。配方对重组GDH蛋白的抗原特性的稳定性的影响通过根据厂商(bioMérieux,France)指导使用GDH试剂盒(Ref 30125)及仪器,在91天内进行一些GDH测定评估。
实施VIDAS GDH检测根据销售的试剂盒的方案进行:
-导入200μl样品+1ml的R1预处理试剂
-通过涡旋均质,
-将300μl的1/6稀释的这种稀释液导入GDH试剂盒的圆筒(catridge)的样品孔中。
每个等份用于仅一个监测时间点,但是一式两份系统性使用。VIDAS仪器测量荧光信号,结果以“相对荧光值”或RFV表示。
一式两份两次测量获得的RFV结果(1和2)及D/D0比率(与第0天相对的天数D的RFV)在下表4中给出,也在图2的表中再现。
表4
NA=不适用
结果表明在37℃使用由具有至少三个碳原子的碳基链及包含至少两个–COOH基团的羧酸组成的稳定化合物可以非常明显地改善含有GDH的水溶液的贮存时间,因为对比组合物在第28天不再有任何信号,而本发明的组合物在这个时间的D/D0比率至少等于0.5。
实施例3:监测使用柠檬酸作为稳定化合物的水溶液中GDH的抗原特性
重复实施例2的步骤,不同的是使用柠檬酸(100mM)作为稳定化合物,将水溶液在2-8℃和37℃贮存更长时间。
一式两份两次测量获得的RFV结果(1和2)及D/D0比率在下表5中示出。
表5
NA:不适用
上述结果表明加入柠檬酸获得与保持GDH的抗原特性相关的极好的稳定性,当该水性组合物在2-8℃贮存时甚至在18个月后仍具有几乎最佳的稳定性。
实施例4:监测使用琥珀酸和山梨糖醇的水溶液中GDH的抗原特性
重复实施例2的步骤,不同的是在琥珀酸盐组合物中还加入10%山梨糖醇,将水溶液在2-8℃和37℃贮存更长时间。
一式两份两次测量获得的RFV结果(1和2)及D/D0比率在下表6中示出。
表6
NC:未计算
上述结果表明琥珀酸也使得水溶液中GDH的抗原特性的长期稳定化,加入山梨糖醇未改变这种稳定化,甚至当水溶液在2-8℃贮存时在大约30个月后稳定性仍然几乎是最佳的。
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Claims (25)
1.一种在水溶液中稳定来自梭菌(Clostridium)属细菌的谷氨酸脱氢酶以保持其抗原特性的方法,包括将所述谷氨酸脱氢酶与稳定化合物混合的步骤,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链且包含至少两个–COOH基团的羧酸或其盐。
2.权利要求1的方法,特征在于所述羧酸含有4、5或6个碳原子的碳基链。
3.权利要求1或2的方法,特征在于所述稳定化合物选自如下羧酸及其盐:
(i)含有四个碳原子的碳基链的羧酸,具有至少两个-COOH基团和独立地选自=CH–、–CH2–和–C(H)OH–的–CX–基团,及
(ii)含有五个碳原子的碳基链的羧酸,具有至少两个-COOH基团和选自–CH2–和–C(H)NH2的–CX–基团,及
(iii)含有六个碳原子的碳基链的羧酸,具有至少两个-COOH基团和选自–CH2–、–C(H)OH–和–C(O)NH2的“CX”基团。
4.前述任一项权利要求的方法,特征在于所述羧酸在其碳基链中含有双键且是E异构体。
5.前述任一项权利要求的方法,特征在于所述羧酸含有两个–COOH基团。
6.前述任一项权利要求的方法,特征在于所述稳定化合物选自反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸、谷氨酸、己二酸、天冬氨酸、庚二酸和丙二酸,及其盐。
7.权利要求6的方法,特征在于所述稳定化合物选自琥珀酸和反丁烯二酸,及其盐,特别是碱金属盐。
8.前述任一项权利要求的方法,特征在于所述谷氨酸脱氢酶是来自艰难梭菌(Clostridium difficile)种细菌的酶。
9.一种包含来自梭菌属细菌的谷氨酸脱氢酶及稳定化合物的水性组合物,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链且包含至少两个–COOH基团的羧酸或其盐,应理解所述稳定化合物既不是谷氨酸盐也不是α-酮戊二酸盐、柠檬酸盐、戊二酸盐、琥珀酸盐。
10.一种包含谷氨酸脱氢酶和稳定化合物的水性组合物,所述谷氨酸脱氢酶来自选自艰难梭菌、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)和产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)种的梭菌属细菌,所述稳定化合物是具有至少三个碳原子的碳基链且包含至少两个–COOH基团的羧酸或其盐,应理解所述稳定化合物既不是谷氨酸盐,也不是α-酮戊二酸盐、柠檬酸盐。
11.权利要求9或10的组合物,特征在于所述羧酸含有4、5或6个碳原子的碳基链。
12.权利要求9-11任一项的组合物,特征在于所述稳定化合物选自如下羧酸及其盐:
(i)含有四个碳原子的碳基链的羧酸,具有至少两个–COOH基团和独立地选自=CH–、–CH2–和–C(H)OH–的–CX–基团,及
(ii)含有五个碳原子的碳基链的羧酸,具有至少两个–COOH基团和选自–CH2–和–C(H)NH2的–CX–基团,及
(iii)含有六个碳原子的碳基链的羧酸,具有至少两个–COOH基团和选自–CH2–、–C(H)OH–和–C(O)NH2的“CX”基团。
13.权利要求9-12任一项的组合物,特征在于所述羧酸在其碳基链中含有双键且是E异构体。
14.权利要求9-13任一项的组合物,特征在于所述羧酸含有两个–COOH基团。
15.权利要求9的组合物,特征在于所述稳定化合物选自反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸、谷氨酸、己二酸、天冬氨酸、庚二酸和丙二酸,及其除柠檬酸盐、谷氨酸盐、琥珀酸盐和戊二酸盐之外的盐。
16.权利要求10的组合物,特征在于所述稳定化合物选自反丁烯二酸、琥珀酸、苹果酸、戊二酸、柠檬酸、酒石酸、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸、谷氨酸、己二酸、天冬氨酸、庚二酸和丙二酸,及其除柠檬酸盐和谷氨酸盐之外的盐。
17.权利要求16的组合物,特征在于所述稳定化合物选自琥珀酸和反丁烯二酸及其盐,特别是碱金属盐。
18.权利要求9-17任一项的组合物,特征在于所述谷氨酸脱氢酶是来自艰难梭菌种细菌的酶。
19.用于检测可能含有梭菌属细菌的生物学样品中这种细菌的存在的试剂盒,其包含根据权利要求1-8任一项定义的稳定方法稳定的或者如权利要求9-18任一项定义的水性组合物,以及进行检测梭菌属、特别是艰难梭菌细菌的存在的方法所需要的化合物。
20.根据权利要求1-8任一项定义的稳定方法稳定的或者如权利要求9-18任一项定义的水性组合物用于产生标准范围的应用。
21.根据权利要求1-8任一项定义的稳定方法稳定的或者如权利要求9-18任一项定义的水性组合物作为校准物的应用。
22.根据权利要求1-8任一项定义的稳定方法稳定的或者如权利要求9-18任一项定义的水性组合物作为对照物的应用。
23.一种检测可能含有梭菌属细菌的生物学样品中这种细菌的存在的方法,特征在于其包括如下步骤:
(i)通过使用根据权利要求1-8任一项定义的稳定方法稳定的或者如权利要求9-18任一项定义的水相化合物或者如权利要求19定义的试剂盒检测或量化所述样品中谷氨酸脱氢酶的存在,进行检测梭菌属细菌存在的方法,及
(ii)在步骤(i)中的阳性结果使得可能得出存在所述细菌的结论。
24.一种检测生物学样品中产生至少一种毒素的梭菌属产毒性细菌的存在的方法,所述生物学样品可能含有这种细菌及至少一种这种毒素,所述方法特征在于其包括如下步骤:
(i)通过使用根据权利要求1-8任一项定义的稳定方法稳定的或者如权利要求9-18定义的水性组合物或者如权利要求19定义的试剂盒检测或量化所述样品中谷氨酸脱氢酶的存在,进行检测梭菌属细菌的存在的方法,及
(ii)在步骤(i)中的阴性结果使得可能得出不存在所述细菌的结论,或者
(ii’)如果步骤(i)的方法是阳性的,则在同一生物学样品中或者在来自同一个体的新的生物学样品中进行检测或量化可能由所述梭菌属细菌释放的至少一种毒素的方法,并得出以下结论:如果所述至少一种毒素存在,则所述细菌是产毒性的且产生所述至少一种毒素。
25.权利要求24的方法,特征在于所述细菌是艰难梭菌,并且所述至少一种毒素包括毒素A、毒素B或者这二者。
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