ES2888430T3

ES2888430T3 - Predicción de epítopos de células T útiles para la vacunación

Info

Publication number: ES2888430T3
Application number: ES16704567T
Authority: ES
Inventors: Ugur Sahin; Martin Löwer; Arbel Tadmor; Sebastian Boegel; Barbara Schrörs; Mathias Vormehr; Sebastian Kreiter
Original assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Current assignee: TRON Translationale Onkologie an der Universitaetsmedizin der Johannes Gutenberg Universitaet Mainz gGmbH; Biontech SE
Priority date: 2015-02-12
Filing date: 2016-02-09
Publication date: 2022-01-04
Anticipated expiration: 2036-02-09
Also published as: KR102359213B1; WO2016128376A1; US20190250166A1; AU2022215196A1; HUE056658T2; WO2016128060A1; US20220074948A1; DK3256853T3; BR112017017293A2; JP2018507686A; AU2016217965B2; HK1246852A1; AU2016217965A1; MX2022000012A; CN107430132A; CN107430132B; HRP20211419T1; JP2021129569A; KR20170117514A; CY1124558T1

Abstract

Un método para predecir una o más modificaciones de aminoácidos inmunogénicos que son útiles para la vacunación, en donde las modificaciones se encuentran en una proteína que comprende un neoantígeno asociado a tumor de un paciente, el método comprende las etapas: a) determinar una puntuación para la unión de un péptido modificado que es un fragmento de una proteína modificada a una o más moléculas MHC clase II de dicho paciente, b) determinar una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada, en donde determinar la puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada comprende determinar el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y determinar la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación, en donde la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se determina por determinación de la frecuencia de la variante alélica, y c) predecir una o más modificaciones de aminoácidos inmunogénicos, en donde la puntuación para la unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II refleja una probabilidad de unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II, en donde la frecuencia de la variante alélica es la suma de secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación y portan la mutación dividida por la suma de todas las secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación, en donde para determinar una puntuación para la expresión o abundancia de una proteína modificada, una puntuación para el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación se multiplica por una puntuación para la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación, en donde la predicción de modificaciones de aminoácidos inmunogénicos se refiere a una predicción de si un péptido que comprende dichas modificaciones de aminoácidos será inmunogénico y, por tanto, útil como epítopo en la vacunación.

Description

DESCRIPCIÓN

Predicción de epítopos de células T útiles para la vacunación

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere a métodos para la predicción de epítopos de células T útiles para la vacunación. En particular, la presente invención se refiere a métodos para predecir si las modificaciones en péptidos o polipéptidos tales como neoantígenos asociados a tumor son inmunogénicos y, en particular, útiles para la vacunación, o para predecir cuáles de dichas modificaciones son más inmunogénicas y, en particular, más útil para la vacunación. Los métodos de la invención pueden usarse, en particular, para la provisión de vacunas que son específicas para el tumor de un paciente y, por tanto, en el contexto de vacunas personalizadas contra el cáncer.

Antecedentes de la invención

Las mutaciones se consideran dianas ideales para la inmunoterapia del cáncer. Como neo-epítopos con estricta falta de expresión en cualquier tejido sano, se espera que sean seguros y puedan eludir los mecanismos centrales de tolerancia. Sin embargo, el uso sistemático de las mutaciones para los enfoques de las vacunas se ve obstaculizado por la singularidad del repertorio de mutaciones ("el mutanoma") en el tumor de cada paciente (Alexandrov, L. B. y otros, Nature 500, 415 (2013)). Recientemente hemos propuesto un enfoque de inmunoterapia personalizado dirigido al espectro de mutaciones individuales (Castle, J. C., y otros, Cancer Res 72, 1081 (2012)). W o 2012/159754 describe un método para proporcionar una vacuna contra el cáncer individualizada que comprende las etapas: (a) identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer para proporcionar una firma de mutación del cáncer del paciente; y (b) proporcionar una vacuna que presenta la firma de mutación del cáncer obtenida en la etapa (a).

Sin embargo, existe la necesidad de un modelo para predecir si un epítopo, en particular un neo-epítopo, inducirá una inmunidad eficiente y, por tanto, será útil en la vacunación.

Aquí mostramos en tres modelos de tumores murinos independientes, que una fracción considerable de las mutaciones de cáncer no sinónimas es inmunogénica y que inesperadamente el mutanoma inmunogénico es reconocido predominantemente por CD4+ Células T ("el inmunoma CD4 "). Vacunación con las CD4+ Las mutaciones inmunogénicas confieren una fuerte actividad antitumoral. Alentados por estos hallazgos, establecimos un proceso que comprende la detección de mutaciones mediante la secuenciación del exoma, la selección de dianas de la vacuna mediante la priorización únicamente bioinformática de epítopos mutados que se predice que se expresan abundantemente y buenos quelantes del MHC de clase II y la producción rápida de vacunas de ARNm sintético que codifican múltiples de estos epítopos mutados. Demostramos que la vacunación con este tipo de vacunas de ARNm polinepitópico induce un potente control tumoral y un rechazo completo de los tumores establecidos de crecimiento agresivo en ratones. Además, demostramos que la vacunación con neoepítopos de células T como las CD4+ inducen respuestas de CTL contra un antígeno inmunodominante independiente en ratones portadores de tumores, lo que indica la orquestación de la propagación del antígeno. Finalmente, demostramos mediante análisis de los correspondientes tipos de cáncer humano con los mismos algoritmos bioinformáticos la abundancia de mutaciones que se predice que se unen al MHC clase II también en los cánceres humanos. Por lo tanto, el enfoque de inmunoterapia adaptado introducido aquí puede considerarse como un modelo universalmente aplicable para la explotación integral del enorme repertorio de neoepítopos diana de los cánceres que permite apuntar al tumor de cada paciente con vacunas producidas "justo a tiempo".

Descripción de la invención

Resumen de la invención

La presente invención consta de los siguientes aspectos:

1. Un método para predecir una o más modificaciones de aminoácidos inmunogénicos que son útiles para la vacunación, en donde las modificaciones se encuentran en una proteína que comprende un neoantígeno asociado a tumor de un paciente, el método comprende las etapas:

a) determinar una puntuación para la unión de un péptido modificado que es un fragmento de una proteína modificada a una o más moléculas MHC clase II de dicho paciente,

a) determinar una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada, en donde determinar la puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada comprende determinar el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y determinar la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación, en donde la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se determina por determinación de la frecuencia de la variante alélica, y

c) prediciendo una o más modificaciones de aminoácidos inmunogénicos, en donde la puntuación para la unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II refleja una probabilidad de unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II,

en donde la frecuencia de la variante alélica es la suma de secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación y portan la mutación dividida por la suma de todas las secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación,

en donde para determinar una puntuación para la expresión o abundancia de una proteína modificada, una puntuación para el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación se multiplica por una puntuación para la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación,

en donde la predicción de modificaciones de aminoácidos inmunogénicos se refiere a una predicción de si un péptido que comprende dichas modificaciones de aminoácidos será inmunogénico y, por tanto, útil como epítopo en la vacunación.

2. Un método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos inmunogénicos que son útiles para la vacunación, en donde las modificaciones se encuentran en una proteína que comprende un neoantígeno asociado a tumor de un paciente, el método comprende las etapas:

a) determinar una puntuación para la unión de un péptido modificado que es un fragmento de una proteína modificada a una o más moléculas del MHC clase II de dicho paciente, y

b) determinar una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada, en donde determinar la puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada comprende determinar el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y determinar la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación, en donde la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se determina por determinación de la frecuencia de la variante alélica, en donde el método comprende realizar las etapas a) y b) en dos o más modificaciones diferentes, y en donde el método comprende además la etapa:

c) seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos inmunogénicos útiles para la vacunación, en donde la puntuación para la unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II refleja una probabilidad de unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II,

en donde para determinar una puntuación para la expresión o abundancia de una proteína modificada, una puntuación para el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación se multiplica por una puntuación para la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación.

3. El método del aspecto 2, que comprende comparar las puntuaciones de dichas dos o más modificaciones diferentes, en donde, preferentemente, las puntuaciones de dichas dos o más modificaciones diferentes se comparan mediante la clasificación de las modificaciones diferentes por sus puntuaciones de unión al MHC clase II.

4. El método de uno cualquiera de los aspectos 1 a 3, que comprende realizar las etapas a) en dos o más péptidos modificados diferentes, estos dos o más péptidos modificados diferentes comprenden la(s) misma(s) modificación(ones).

5. El método del aspecto 4, en donde los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) comprenden fragmentos diferentes de una proteína modificada, dichos fragmentos diferentes comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) presente(s) en la proteína, y/o los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) comprenden diferentes fragmentos potenciales de unión al MHC clase II de una proteína modificada, dichos fragmentos comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) presente(s) en la proteína, y/o los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) que difieren en longitud y/o posición de la(s) modificación(ones).

6. El método de los aspectos 4 o 5 que comprende además seleccionar (el) péptido (s) modificado (s) de los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) que tienen una probabilidad o que tienen la probabilidad más alta de unirse a uno o más moléculas de MHC clase II.

7. El método de uno cualquiera de los aspectos 4 a 6, en donde la mejor puntuación para la unión a una o más moléculas de MHC clase II de los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) se asigna a la(s) modificación(ones).

8. El método de cualquiera de los aspectos 1 a 7, en donde dicha determinación del nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y/o la determinación de la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se realiza a nivel de ARN.

9. El método de uno cualquiera de los aspectos 1 a 8, en donde el péptido modificado comprende un fragmento de la proteína modificada, dicho fragmento comprende la modificación presente en la proteína.

10. El método de cualquiera de los aspectos 1 a 9 que comprende además identificar mutaciones no sinónimas en una o más regiones codificadoras de proteínas.

11. El método de cualquiera de los aspectos 1 a 10, en donde las modificaciones de aminoácidos se identifican mediante la secuenciación parcial o completa del genoma o transcriptoma de una o más células tal como una o más células cancerosas y opcionalmente una o más células no cancerosas e identificando mutaciones. en una o más regiones codificantes de proteínas.

12. El método de los aspectos 10 u 11, en donde dichas mutaciones son mutaciones somáticas y/o mutaciones cancerosas.

Descripción detallada de la invención

Aunque la presente invención se describe en detalle más abajo, debe entenderse que esta invención no se limita a las metodologías, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente descripción, ya que estos pueden variar. Debe entenderse, también, que la terminología utilizada en la presente descripción es para el propósito de describir modalidades particulares solamente, y no pretende limitar el alcance de la presente invención la cual se limitará solamente por las reivindicaciones anexas. A menos que se defina de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente descripción tienen el mismo significado que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica.

Preferentemente, los términos que se usan en la presente descripción se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, y H. Kolbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma, métodos convencionales de bioquímica, biología celular, inmunología y técnicas de ADN recombinante que se explican en la literatura del campo (cf., por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, J. Sambrook y otros eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta descripción y de las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto lo requiera de cualquier otra manera, la palabra “comprender”, y variaciones tales como “comprende” y “que comprende”, se entenderá que implican la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pero no la exclusión de ningún otro miembro, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas aunque en algunas modalidades dicho otro miembro entero, o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas pueden excluirse, es decir, el tema consiste en la inclusión de un miembro declarado, entero o etapa o grupo de miembros, enteros o etapas. Los términos "un" y "una" y "el/la" y referentes similares usados en el contexto para describir la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) se deben interpretar para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de cualquier otra forma en la presente descripción o claramente se contradiga por el contexto. La enumeración de los intervalos de valores en la presente descripción pretende servir simplemente como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que se encuentra dentro del intervalo. A menos que se indique de otra forma en la presente descripción, cada valor individual se incorpora en la descripción como si se enumerara individualmente en la presente descripción.

Todos los métodos que se describen en la presente descripción pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente descripción o que el contexto lo contradiga claramente de otra manera. El uso de cualquiera y de todos los ejemplos, o lenguaje ilustrativo (por ejemplo, “tal como”) que se proporciona en la presente descripción simplemente tiene el propósito de ilustrar mejor la invención y no representa una limitación en el alcance de la invención que se reivindica de otra manera. El lenguaje en la descripción no deberá interpretarse como indicación de cualquier elemento no reivindicado esencial para la práctica de la invención.

De acuerdo con la presente invención, el término "péptido" se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferentemente 3 o más, preferentemente 4 o más, preferentemente 6 o más, preferentemente 8 o más, preferentemente 10 o más, preferentemente 13 o más, preferentemente 16 más, preferentemente 21 o más y hasta preferentemente 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "polipéptido" o "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferentemente a péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" son sinónimos y se ha usado indistintamente en la presente descripción.

De acuerdo con la invención, el término "modificación" con respecto a péptidos, polipéptidos o proteínas se refiere a un cambio de secuencia en un péptido, polipéptido o proteína en comparación con una secuencia parental tal como la secuencia de un péptido, polipéptido o proteína de tipo salvaje. El término incluye variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de deleción de aminoácidos y variantes de sustitución de aminoácidos, preferentemente variantes de sustitución de aminoácidos. Todos estos cambios de secuencia de acuerdo con la invención pueden potencialmente crear nuevos epítopos.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino- y/o carboxi-terminales de uno o más aminoácidos, tales como 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.

Las variantes de deleción de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como por la eliminación de 1, 2, 3, 4 o 5, o más aminoácidos.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por al menos la remoción de un residuo en la secuencia y la inserción de otro residuo en su lugar.

De acuerdo con la invención, una modificación o un péptido modificado usado para ensayar en los métodos de la invención puede derivarse de una proteína que comprende una modificación.

El término "derivado" significa de acuerdo con la invención que una entidad particular, en particular una secuencia peptídica particular, está presente en el objeto del que se deriva. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente regiones de secuencia particulares, "derivado" significa en particular que la secuencia de aminoácidos relevante se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

Una proteína que comprende una modificación a partir de la cual se puede derivar una modificación o un péptido modificado usado para ensayar en el método de la invención puede ser un neoantígeno.

De acuerdo con la invención, el término "neoantígeno" refiere a un péptido o proteína que incluye una o más modificaciones de aminoácidos en comparación con el péptido o proteína parental. Por ejemplo, el neoantígeno puede ser un neoantígeno asociado a tumor, en donde el término "neoantígeno asociado a tumor" incluye un péptido o proteína que incluyendo modificaciones de aminoácidos debido a mutaciones específicas de tumor.

De acuerdo con la invención, el término "mutación específica de tumor" o "mutación específica de cáncer" refiere a una mutación somática que está presente en el ácido nucleico de un tumor o célula cancerosa pero ausente en el ácido nucleico de un normal correspondiente, es decir célula no tumoral o no cancerosa. Los términos "mutación específica de tumor" y "mutación tumoral" y los términos "mutación específica de cáncer" y "mutación de cáncer" son usado de forma intercambiable en la presente descripción.

El término "respuesta inmunitaria" refiere a una respuesta corporal integrada a una diana tal como un antígeno y preferentemente refiere a una respuesta inmunitaria celular o una respuesta inmunitaria celular así como también humoral. La respuesta inmunitaria puede ser protectora/preventiva/profiláctica y/o terapéutica.

"Inducir una respuesta inmunitaria" puede significar que no hubo una respuesta inmunitaria antes de la inducción, pero también puede significar que hubo un cierto nivel de respuesta inmunitaria antes de la inducción y después de la inducción dicha respuesta inmunitaria mejora. Por tanto, "inducir una respuesta inmunitaria" también incluye "potenciar una respuesta inmunitaria". Preferentemente, después de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto, dicho sujeto está protegido contra el desarrollo de una enfermedad tal como una enfermedad cancerosa o la afección patológica se mejora mediante la inducción de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede inducir una respuesta inmunitaria contra un antígeno expresado en un tumor en un paciente que padece una enfermedad cancerosa o en un sujeto que tiene riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa. Inducir una respuesta inmunitaria en este caso puede significar que la afección patológica del sujeto mejora, que el sujeto no desarrolla metástasis o que el sujeto que está en riesgo de desarrollar una enfermedad cancerosa no desarrolla una enfermedad cancerosa.

Los términos "respuesta inmunitaria celular" y "respuesta celular" o términos de manera similares refieren a una respuesta inmunitaria dirigida a células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC clase I o clase II que involucra células T o linfocitos T que actúan como "auxiliares" o "asesinos". Las células T cooperadoras (también denominadas células T CD4+) desempeñan un papel central mediante la regulación de la respuesta inmunitaria y las células asesinas (también denominadas células T citotóxicas, células T citolíticas, células T CD8+ o CTL) destruyen las células enfermas, tales como las células cancerosas, lo que evita la producción de más células enfermas. En modalidades preferidas, la presente invención implica la estimulación de una respuesta CTL antitumoral contra células tumorales que expresan uno o más antígenos expresados en tumores y que presentan preferentemente tales antígenos expresados en tumores con MHC clase 1.

Un "antígeno" de acuerdo con la invención recubre cualquier sustancia, preferentemente un péptido o proteína, que es un objetivo de y/o induce una respuesta inmunitaria tal como una reacción específica con anticuerpos o linfocitos T (células T). Preferentemente, un antígeno comprende al menos un epítopo tal como un epítopo de células T. Preferentemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente después del procesamiento, induce una reacción inmunitaria, que es preferentemente específica para el antígeno (incluyendo las células que expresan el antígeno). El antígeno o un epítopo de células T de esta manera se presenta preferentemente por una célula, preferentemente por una célula presentadora de antígeno que incluye una célula enferma, en particular una célula cancerosa, en el contexto de moléculas MHC, lo que da como resultado una respuesta inmunitaria contra el antígeno (incluyendo las células que expresan el antígeno).

En una modalidad, un antígeno es un antígeno tumoral (también denominado antígeno expresado por tumor en la presente descripción), es decir, una parte de una célula tumoral tal como una proteína o péptido expresado en una célula tumoral que puede derivarse del citoplasma, la superficie celular o el núcleo de la célula, en particular los que se encuentran principalmente de forma intracelular o como antígenos de superficie de las células tumorales. Por ejemplo, los antígenos tumorales incluye el antígeno carcinoembrionario, a1-fetoproteína, isoferritina y sulfoglicoproteína fetal, a2-H-ferroproteína y Y-fetoproteína. De acuerdo con la presente invención, un antígeno tumoral comprende preferentemente cualquier antígeno que se exprese y, opcionalmente, sea característico con respecto al tipo y/o nivel de expresión para tumores o cánceres así como también para células tumorales o cancerosas, es decir, un antígeno asociado a tumor. En una modalidad, el término "antígeno asociado a tumores" refiere a proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en un número limitado de tejidos y/o órganos o en etapas específicas de desarrollo, por ejemplo, los antígenos asociados a tumores pueden estar por debajo de la normalidad afecciones expresadas específicamente en el tejido del estómago, preferentemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductores, por ejemplo, en los testículos, en el tejido trofoblástico, por ejemplo, en la placenta, o en las células de la línea germinal, y se expresan o expresan de manera aberrante en uno o más tumores o cáncer tejidos. En este contexto, "un número limitado" significa, preferentemente, no más de 3, más preferentemente no más de 2. Los antígenos tumorales en el contexto de la presente invención incluye, por ejemplo, antígenos de diferenciación, preferentemente antígenos de diferenciación específicos del tipo celular, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en un determinado tipo celular en una determinada etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículo, es decir, proteínas que están en condiciones normales expresadas específicamente en los testículos y, a veces, en la placenta, y antígenos específicos de la línea germinal. Preferentemente, el antígeno tumoral o la expresión aberrante del antígeno tumoral identifica células cancerosas. En el contexto de la presente invención, el antígeno tumoral que expresa una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad cancerosa, es preferentemente una autoproteína en dicho sujeto. En modalidades preferidas, el antígeno tumoral en el contexto de la presente invención se expresa en condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando son dañados por el sistema inmunológico no conducen a la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o sólo difícilmente accesibles por el sistema inmunológico.

De acuerdo con la invención, los términos "antígeno tumoral", "antígeno expresado por tumor", "antígeno canceroso" y "antígeno expresado por cáncer" son equivalentes y son usado indistintamente en la presente descripción.

El término "inmunogenicidad" refiere a la efectividad relativa para inducir una respuesta inmunitaria que se asocia preferentemente con tratamientos terapéuticos, tal como tratamientos contra cánceres. Como se usa en la presente, el término "inmunogénico" refiere a la propiedad de tener inmunogenicidad. Por ejemplo, el término "modificación inmunogénica" cuando son usado en el contexto de un péptido, polipéptido o proteína refiere a la efectividad de dicho péptido, polipéptido o proteína para inducir una respuesta inmunitaria causada por y/o dirigida contra dicha modificación. Preferentemente, el péptido, polipéptido o proteína no modificados no induce una respuesta inmunitaria, induce una respuesta inmunitaria diferente o induce un nivel diferente, preferentemente un nivel más bajo, de respuesta inmunitaria.

De acuerdo con la invención, el término "inmunogenicidad" o "inmunogénico" refiere preferentemente a la efectividad relativa para inducir una respuesta inmunitaria biológicamente relevante, en particular una respuesta inmunitaria que es útil para la vacunación. Por tanto, en una modalidad preferida, una modificación de aminoácidos o un péptido modificado es inmunogénico si induce una respuesta inmunitaria contra la modificación diana en un sujeto, respuesta inmunitaria que puede ser beneficiosa para fines terapéuticos o profilácticos.

Los términos "complejo principal de histocompatibilidad" y la abreviatura "MHC" incluye moléculas de MHC clase I y MHC clase II y con relación a un complejo de genes que se encuentra en todos los vertebrados. Las proteínas o moléculas de MHC son importantes para la señalización entre linfocitos y células presentadoras de antígenos o células enfermas en reacciones inmunitarias, en donde las proteínas o moléculas de MHC se unen a péptidos y los presentan para su reconocimiento por receptores de células T. Las proteínas codificadas por el MHC se expresan en la superficie de las células y presentan tanto antígenos propios (fragmentos de péptidos de la propia célula) como antígenos no propios (por ejemplo, Fragmentos de microorganismos invasores) a una célula T.

La región MHC se divide en tres subgrupos clase I, clase II y clase III. Las proteínas del MHC de clase I contienen una cadena ayuna p2-microglobulina (que no forma parte del MHC codificado por el cromosoma 15). Presentan fragmento de antígenos a las células T citotóxicas. En la mayoría de las células del sistema inmunitario, específicamente en las células presentadoras de antígenos, las proteínas del MHC de clase II contienen cadenas a y py presentan fragmentos de antígenos a las células T cooperadoras. La región del MHC de clase III codifica otros componentes inmunitarios, tales como los componentes del complemento y algunos que codifican citocinas.

El MHC es poligénico (hay varios genes de MHC clase I y MHC clase II) y polimórfico (hay varios alelos de cada gen).

Como se usa en la presente, el término "haplotipo" refiere a los alelos HLA que se encuentran en un cromosoma y las proteínas codificadas de esta manera. El haplotipo también puede referirse al alelo presente en cualquier locus dentro del MHC. Cada clase de MHC está representada por varios loci: por ejemplo, HLA-A (antígeno leucocitario humano A), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P y HLA-V para clase I y HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA y HLA-DOB para la clase II. Los términos "alelo HLA" y "alelo MHC" son usado indistintamente en la presente descripción.

Los MHC exhiben un polimorfismo extremo: dentro de la población humana hay, en cada locus genético, un gran número de haplotipos que comprenden distintos alelos. Diferentes alelos polimórficos del MHC, tanto clase I como clase II, tienen diferentes especificidades de péptidos: cada alelo codifica proteínas que se unen a péptidos que exhiben patrones de secuencia particulares.

En una modalidad preferida de todos los aspectos de la invención, una molécula de MHC es una molécula de HLA.

De acuerdo con la invención, la clase II de MHC incluye HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ y HLA-DR.

En el contexto de la presente invención, el término "péptido de unión a MHC" incluye péptidos de unión a MHC clase ^{I y/o clase II o péptidos que pueden procesarse para producir péptidos de unión a}MhC ^{clase I y/o clase II. En el caso}de complejos de MHC/péptido clase I, los péptidos de unión tienen típicamente 8-12, preferentemente 8-10 aminoácidos de longitud, aunque los péptidos más largos o más cortos pueden ser efectivo. En el caso de complejos de MHC/péptido clase II, los péptidos de unión tienen típicamente de 9-30, preferentemente de 10-25 aminoácidos de longitud y en particular de 13-18 aminoácidos de longitud, mientras que los péptidos más largos y más cortos pueden ser efectivo.

Si un péptido se va a presentar directamente, es decir, sin procesamiento, en particular sin escisión, tiene una longitud ^{que es adecuada para unirse a una molécula de}mHc, ^{en particular una molécula de MHC de clase I, y}preferentemente es de 7-30 aminoácidos en longitud tal como 7-20 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia 7-12 aminoácidos de longitud, con mayor preferencia 8-11 aminoácidos de longitud, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud.

Si un péptido es parte de una entidad más grande que comprende secuencias adicionales, por ejemplo, de una secuencia de vacuna o polipéptido, y se presenta después del procesamiento, en particular después de la escisión, el péptido producido por procesamiento tiene una longitud que es adecuada para unirse a un MHC. molécula, en particular una molécula de MHC de clase I, y preferentemente tiene una longitud de 7-30 aminoácidos, como una longitud de 7-20 aminoácidos, con mayor preferencia una longitud de 7-12 aminoácidos, con mayor preferencia una longitud de 8-11 aminoácidos, en particular 9 o 10 aminoácidos de longitud. Preferentemente, la secuencia del péptido que se presentará después del procesamiento se deriva de la secuencia de aminoácidos de un antígeno o polipéptido usado para la vacunación, es decir, su secuencia corresponde sustancialmente y preferentemente es completamente idéntica a un fragmento del antígeno o polipéptido.

Por tanto, un péptido de unión a MHC en una modalidad comprende una secuencia que corresponde sustancialmente y es preferentemente completamente idéntica a un fragmento de un antígeno.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula tal como un antígeno, es decir, a una parte o fragmento de la molécula que es reconocida por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocida por una célula T, en particular cuando se presenta en el contexto de moléculas de MHC. Un epítopo de una proteína tal como un antígeno tumoral comprende preferentemente una porción continua o discontinua de dicha proteína y está preferentemente entre 5 y 100, preferentemente entre 5 y 50, con mayor preferencia entre 8 y 30, con la máxima preferencia entre 10 y 25 aminoácidos en de longitud, por ejemplo, el epítopo puede tener preferentemente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o 25 aminoácidos de longitud. Se prefiere particularmente que el epítopo en el contexto de la presente invención sea un epítopo de células T.

De acuerdo con la invención, un epítopo puede unirse a moléculas de MHC tal como moléculas de MHC en la superficie de una célula y, por tanto, puede ser un "péptido de unión a MHC".

Como se usa en la presente, el término "neoepítopo" refiere a un epítopo que no está presente en una referencia tal como una célula normal no cancerosa o de línea germinal pero que se encuentra en células cancerosas. Esto incluye, en particular, situaciones en donde en una célula normal no cancerosa o de la línea germinal se encuentra un epítopo correspondiente, sin embargo, debido a una o más mutaciones en una célula cancerosa, la secuencia del epítopo se cambia para dar como resultado el neocitopo-epítopo.

Como se usa en la presente, el término "epítopo de células T" se refiere a un péptido que se une a una molécula de MHC en una configuración reconocida por un receptor de células T. Típicamente, los epítopos de células T se presentan en la superficie de una célula presentadora de antígenos.

Como se usa en la presente, el término "predecir modificaciones de aminoácidos inmunogénicos" refiere a una predicción de si un péptido que comprende dicha modificación de aminoácidos será inmunogénico y, por tanto, útil como epítopo, en particular epítopo de células T, en la vacunación.

De acuerdo con la invención, un epítopo de células T puede estar presente en una vacuna como parte de una entidad más grande, como una secuencia de vacuna y/o un polipéptido que comprende más de un epítopo de células T. El péptido o epítopo de células T presentado se produce siguiendo un procesamiento adecuado.

Los epítopos de células T pueden modificarse en uno o más residuos que no son esenciales para el reconocimiento de TCR o para la unión a MHC. Dichos epítopos de células T modificados pueden considerarse inmunológicamente equivalentes.

Preferentemente, un epítopo de células T cuando se presenta por MHC y es reconocido por un receptor de células T es capaz de inducir en presencia de señales coestimuladoras apropiadas, expansión clonal de la célula T que lleva el receptor de células T reconociendo específicamente el complejo péptido/MHC.

Preferentemente, un epítopo de células T comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a sustancialmente con la secuencia de aminoácidos de un fragmento de un antígeno. Preferentemente, dicho fragmento de un antígeno es un péptido presentado por MHC clase I y/o clase II.

El epítopo de células AT de acuerdo con la invención refiere preferentemente a una porción o fragmento de un antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmunitaria, preferentemente una respuesta celular contra el antígeno o células caracterizadas por la expresión del antígeno y preferentemente por la presentación del antígeno tal como células enfermas, en particular células cancerosas. Preferentemente, un epítopo de células T es capaz de estimular una respuesta celular contra una célula caracterizada por la presentación de un antígeno con MHC clase I y preferentemente es capaz de estimular un linfocito T citotóxico sensible al antígeno (CTL).

"Procesamiento de antígenos" o "procesamiento" refiere a la degradación de un péptido, polipéptido o proteína en productos de procesado, que son fragmentos de dicho péptido, polipéptido o proteína (por ejemplo, la degradación de un polipéptido en péptidos) y la asociación de uno o más de estos fragmentos (por ejemplo, mediante unión) con moléculas de MHC para su presentación por células, preferentemente células presentadoras de antígenos, a células T específicas.

Las "células presentadoras de antígeno" (APC) son células que presentan fragmentos peptídicos de antígenos proteicos en asociación con moléculas MHC en su superficie celular. Algunas APC pueden activar células T específicas de antígeno.

Las células presentadoras de antígenos profesionales son muy eficientes para internalizar el antígeno, ya sea por fagocitosis o por endocitosis mediada por receptor, y luego exhiben un fragmento del antígeno, unido a una molécula de MHC de clase II, en su membrana. La célula T reconoce e interactúa con el complejo de moléculas de MHC de clase II de antígeno en la membrana de la célula presentadora de antígeno. Luego, la célula presentadora de antígeno produce una señal coestimuladora adicional, lo que lleva a la activación de la célula T. La expresión de moléculas coestimuladoras es una característica definitoria de las células presentadoras de antígenos profesionales.

Los principales tipos de células presentadoras de antígenos profesionales son las células dendríticas, que tienen el intervalo más amplio de presentación de antígenos, y son probablemente las células presentadoras de antígenos, los macrófagos, las células B y ciertas células epiteliales activadas más importantes. Las células dendríticas (DC) son poblaciones de leucocitos que presentan antígenos capturados en tejidos periféricos a las células T a través de las trayectorias de presentación de antígenos del MHC clase II y I. Es bien sabido que las células dendríticas son potentes inductores de respuestas inmunitarias y la activación de estas células es una etapa crítica para la inducción de inmunidad antitumoral. Las células dendríticas se clasifican convenientemente como células "inmaduras" y "maduras", que puede usarse como una forma sencilla de discriminar entre dos fenotipos bien caracterizados. Sin embargo, no debe interpretarse que esta nomenclatura excluye todas las posibles etapas intermedias de diferenciación. Las células dendríticas inmaduras se caracterizan por ser células presentadoras de antígenos con una alta capacidad de captación y procesamiento de antígenos, lo que se correlaciona con la alta expresión del receptor Fcy y del receptor manosa. El fenotipo maduro se caracteriza típicamente por una baja expresión de estos marcadores, pero una alta expresión de moléculas de superficie celular responsables de la activación de las células T tales como MHC de clase I y II, moléculas de adhesión (por ejemplo, CD54 y CD11) y moléculas coestimuladoras (por ejemplo, CD40, CD80, CD86 y 4-1 BB). La maduración de las células dendríticas se refiere como el estado de activación de las células dendríticas en el que dichas células dendríticas presentadoras de antígenos conducen al cebado de las células T, mientras que la presentación por las células dendríticas inmaduras produce tolerancia. La maduración de las células dendríticas es causada principalmente por biomoléculas con características microbianas detectadas por receptores innatos (ADN bacteriano, ARN viral, endotoxina, etc.), citocinas proinflamatorias (TNF, IL-1, IFN), ligadura de CD40 en la superficie de la célula dendrítica por CD40L y sustancias liberadas de las células que sufren una muerte celular estresante. Las células dendríticas se pueden derivar al cultivar células de la médula ósea in vitro con citocinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) y el factor de necrosis tumoral alfa.

Las células presentadoras de antígenos no profesionales no expresan constitutivamente las proteínas del MHC de clase II requeridas para la interacción con las células T vírgenes; estos se expresan solo tras la estimulación de las células presentadoras de antígenos no profesionales por ciertas citocinas tales como el IFNy.

Las células presentadoras de antígenos pueden cargarse con péptidos presentados por MHC de clase I mediante la transducción de las células con ácido nucleico, preferentemente ARN, que codifica un péptido o polipéptido que comprende el péptido que se va a presentar, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un antígeno o polipéptido usado para vacunación.

En algunas modalidades, una composición farmacéutica o vacuna que comprende un vehículo de suministro de ácido nucleico que se dirige a una célula dendrítica u otra célula presentadora de antígeno puede administrarse a un paciente, dando como resultado latransfección que se produce en vivo. En vivo Latransfección de células dendríticas, por ejemplo, generalmente se puede realizar mediante el uso cualquier método conocido en la técnica, tal como los descritos en el documento WO 97/24447, o el enfoque de pistola genética descrito por Mahvi y otros, Immunology and cell Biology 75: 456-460, 1997.

De acuerdo con la invención, el término "célula presentadora de antígeno" también incluye células diana.

"Célula diana" significará una célula que es una diana para una respuesta inmunitaria tal como una respuesta inmunitaria celular. Las células diana incluyen células que presentan un antígeno, es decir, un fragmento de péptido derivado de un antígeno, e incluyen cualquier célula indeseable, tal como una célula cancerosa. En modalidades preferidas, la célula diana es una célula que expresa un antígeno como se describió en la presente descripción y que presenta preferentemente dicho antígeno con MHC clase I.

El término "porción" se refiere a una fracción. Con respecto a una estructura particular tal como una secuencia de aminoácidos o proteína, el término "porción" de esta puede designar una fracción continua o discontinua de dicha estructura. Preferentemente, una porción de una secuencia de aminoácidos comprende al menos 1 %, al menos 5 %, al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, preferentemente al menos 50 %, con mayor preferencia al menos 60 %, con mayor preferencia al menos 70 %, aún con mayor preferencia al menos 80 %, y con la máxima preferencia al menos 90 % de los aminoácidos de dicha secuencia de aminoácidos. Preferentemente, si la porción es una fracción discontinua, dicha fracción discontinua está compuesta de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más partes de una estructura, al ser cada parte un elemento continuo de la estructura. Por ejemplo, una fracción discontinua de una secuencia de aminoácidos puede conformarse de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más, preferentemente, no más de 4 partes de dicha secuencia de aminoácidos, en donde cada parte comprende, preferentemente, al menos 5 aminoácidos continuos, al menos 10 aminoácidos continuos, preferentemente, al menos 20 aminoácidos continuos, preferentemente al menos 30 aminoácidos continuos de la secuencia de aminoácidos.

Los términos "parte" y "fragmento" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a un elemento continuo. Por ejemplo, una parte de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos o proteína se refiere a un elemento continuo de dicha estructura. Una porción, una parte o un fragmento de una estructura, preferentemente, comprende una o más propiedades funcionales de dicha estructura. Por ejemplo, una porción, una parte o un fragmento de un epítopo, péptido o proteína es, preferentemente, inmunológicamente equivalente al epítopo, péptido o proteína del que se deriva. En el contexto de la presente invención, una "parte" de una estructura tal como una secuencia de aminoácidos preferentemente comprende, preferentemente consta de al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 30 %, al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 92 %, al menos 94 %, al menos 96 %, al menos 98 %, al menos 99 % de la estructura completa o secuencia de aminoácidos.

El término "célula inmunorreactiva" en el contexto de la presente invención refiere a una célula que ejerce funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Una "célula inmunorreactiva" preferentemente es capaz de unirse a un antígeno o una célula caracterizada por la presentación de un antígeno o un fragmento peptídico del mismo (por ejemplo, un epítopo de células T) y mediar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, tales células secretan citocinas y/o quimiocinas, secretan anticuerpos, reconocen células cancerosas y, opcionalmente, eliminan tales células. Por ejemplo, las células inmunorreactivas comprenden células T (células T citotóxicas, células T cooperadoras, células T infiltrantes de tumor), células B, células asesinas naturales, neutrófilos, macrófagos y células dendríticas. Preferentemente, en el contexto de la presente invención, "células inmunorreactivas" son células T, preferentemente CD4+ y/o CD8+ Células T.

Preferentemente, una "célula inmunorreactiva" reconoce un antígeno o un fragmento de péptido del mismo con cierto grado de especificidad, en particular si se presenta en el contexto de moléculas MHC tal como en la superficie de células presentadoras de antígenos o células enfermas tal como células cancerosas. Preferentemente, dicho reconocimiento permite que la célula que reconoce un antígeno o un fragmento de péptido del mismo sea sensible o reactiva. Si la célula es una célula T colaboradora (CD4+ Células T) que portan receptores que reconocen un antígeno o un fragmento de péptido del mismo en el contexto de moléculas de MHC clase II, tal capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la liberación de citocinas y/o la activación de CD8+ linfocitos (CTL) y/o células B. Si la célula es un CTL, dicha capacidad de respuesta o reactividad puede implicar la eliminación de células presentadas en el contexto de moléculas de MHC de clase I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC de clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforinas. De acuerdo con la invención, la capacidad de respuesta de CTL puede incluir flujo de calcio sostenido, división celular, producción de citocinas como IFN-y y TNF-a, regulación positiva de marcadores de activación como CD44 y CD69 y destrucción citolítica específica de células diana que expresan antígenos. La capacidad de respuesta de c Tl también puede determinarse mediante el uso de un indicador artificial que indica con precisión la capacidad de respuesta de CTL. Tales CTL que reconocen un antígeno o un fragmento de antígeno y son sensibles o reactivos también se denominan en la presente descripción "CTL sensibles a antígenos". Si la célula es una célula B, dicha capacidad de respuesta puede implicar la liberación de inmunoglobulinas.

Los términos "célula T" y "linfocito T" se usan de forma intercambiable en la presente descripción e incluyen células T cooperadoras (células T CD4+) y células T citotóxicas (CTL, células T CD8+), que comprenden células T citolíticas.

Las células T pertenecen a un grupo de glóbulos blancos conocidos como linfocitos y desempeñan un papel central en la inmunidad mediada por células. Se pueden distinguir de otros tipos de linfocitos, tal como las células B y las células asesinas naturales por la presencia de un receptor especial en su superficie celular llamado receptor de células T (TCR). El timo es el principal órgano responsable de la maduración de las células T. Se han descubierto varios subconjuntos diferentes de células T, cada uno con una función distinta.

Las células T cooperadoras ayudan a otros glóbulos blancos en los procesos inmunológicos, que incluyen la maduración de las células B en células plasmáticas y la activación de células T citotóxicas y macrófagos, entre otras funciones. Estas células también se conocen como células T CD4+ porque expresan la proteína CD4 en su superficie. Las células T cooperadoras se activan cuando se les presentan antígenos peptídicos mediante moléculas de MHC de clase II que se expresan en la superficie de las células presentadoras de antígenos (APC). Una vez activadas, se dividen rápidamente y secretan pequeñas proteínas llamadas citocinas que regulan o ayudan en la respuesta inmunitaria activa.

Las células T citotóxicas destruyen las células infectadas por virus y las células tumorales, y también están implicadas en el rechazo de trasplantes. Estas células también se conocen como células T CD8+ ya que expresan la glicoproteína CD8 en su superficie. Estas células reconocen sus dianas al unirse al antígeno asociado con el MHC de clase I, que está presente en la superficie de casi todas las células del cuerpo.

La mayoría de las células T tienen un receptor de células T (TCR) que existe como un complejo de varias proteínas. El receptor de células T real está compuesto por dos cadenas peptídicas separadas, que se producen a partir de los genes alfa y beta del receptor de células T independientes (TCRa y TCRp) y se denominan cadenas a- y p-TCR. Las células T y6 (células T gamma delta) representan un pequeño subconjunto de células T que poseen un receptor de células T (TCR) distinto en su superficie. Sin embargo, en las células T y§, el TCR está formado por una cadena y y una cadena 8. Este grupo de células T es mucho menos común (2 % del total de células T) que las células T ap.

La primera señal en la activación de las células T se proporciona mediante la unión del receptor de las células T a un péptido corto presentado por el MHC en otra célula. Esto asegura que solo se active una célula T con un TCR específico para ese péptido. La célula asociada suele ser una célula presentadora de antígeno, como una célula presentadora de antígeno profesional, suele ser una célula dendrítica en el caso de respuestas ingenuas, aunque las células B y los macrófagos pueden ser APC importantes.

De acuerdo con la presente invención, una molécula es capaz de unirse a una diana si tiene una afinidad significativa por dicha diana predeterminada y se une a dicha diana predeterminada en ensayos estándar. La "afinidad" o "afinidad de unión" a menudo se mide por la constante de disociación en equilibrio (K^d). Una molécula no es (sustancialmente) capaz de unirse a una diana si no tiene una afinidad significativa por dicha diana y no se une significativamente a dicha diana en ensayos estándar.

Pueden generarse linfocitos T citotóxicos en vivo por incorporación de un antígeno o un fragmento de péptido del mismo en células presentadoras de antígeno en vivo. El antígeno o un fragmento de péptido del mismo puede representarse como proteína, como ADN (por ejemplo, dentro de un vector) o como ARN. El antígeno puede procesarse para producir una pareja peptídica para la molécula de MHC, mientras un fragmento del mismo puede presentarse sin la necesidad de un procesamiento adicional. Este último es el caso en particular, si estos pueden unirse a las molécula de MHC. En general, es posible la administración a un paciente mediante inyección intradérmica. Sin embargo, la inyección también se puede realizar por vía intranodal en un ganglio linfático (Maloy y otros (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98: 3299-303). Las células resultantes presentan el complejo de interés y se reconocen por los linfocitos T citotóxicos autólogos que después se propagan.

La activación específica de las células T CD4+ o CD8+ puede detectarse de diversas formas. Los métodos para detectar la activación de células T específicas incluyen detectar la proliferación de células T, la producción de citocinas (por ejemplo, linfocinas) o la generación de actividad citolítica. Para las células T CD4+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la proliferación de células T. Para las células T CD8+, un método preferido para detectar la activación de células T específicas es la detección de la generación de actividad citolítica.

Por "célula caracterizada por la presentación de un antígeno" o "célula que presenta un antígeno" o expresiones similares se entiende una célula tal como una célula enferma, por ejemplo, una célula cancerosa, o una célula presentadora de antígeno que presenta el antígeno que expresa o un fragmento derivado de dicho antígeno, por ejemplo, mediante el procesamiento del antígeno, en el contexto de moléculas MHC, en particular moléculas MHC Clase I. De manera similar, los términos "enfermedad caracterizada por la presentación de un antígeno" denotan una enfermedad que involucra células caracterizadas por la presentación de un antígeno, en particular con MHC de clase I. La presentación de un antígeno por una célula puede efectuarse al transfectar la célula con un ácido nucleico tal como el ARN que codifica el antígeno.

Por "fragmento de un antígeno que se presenta" o expresiones similares se entiende que el fragmento puede ser presentado por MHC de clase I o clase II, preferentemente MHC de clase I, por ejemplo, cuando se añade directamente a células presentadoras de antígenos. En una modalidad, el fragmento es un fragmento que se presenta naturalmente por células que expresan un antígeno.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente tal como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe las mismas o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce los mismos o esencialmente los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de efecto inmunológico tal como la inducción de una respuesta inmunitaria humoral y/o celular, la fortaleza y/o la duración de la reacción inmunitaria inducida, o la especificidad de la reacción inmunitaria inducida. En el contexto de la presente invención, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferentemente con respecto a los efectos o propiedades inmunológicos de un péptido usado para inmunización. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos, cuando se expone al sistema inmunitario de un sujeto, induce una reacción inmunitaria que tiene una especificidad de reacción con la secuencia de aminoácidos de referencia.

El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente invención incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunológico que resulten, por ejemplo, en la destrucción de células tumorales o en la inhibición del crecimiento tumoral y/o inhibición del tumor, desarrollo, incluida la inhibición de la diseminación tumoral y la metástasis. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por células T. Tales funciones comprenden en el caso de una célula T colaboradora (CD4+ Linfocito T) el reconocimiento de un antígeno o un fragmento de antígeno en el contexto de moléculas del MHC clase II por los receptores de linfocitos T, la liberación de citocinas y/o la activación de CD8+ linfocitos (CTL) y/o células B, y en el caso de CTL, el reconocimiento de un antígeno o un fragmento de antígeno en el contexto de moléculas MHC clase I por receptores de células T, la eliminación de células presentadas en el contexto de la clase MHC moléculas I, es decir, células caracterizadas por la presentación de un antígeno con MHC clase I, por ejemplo, mediante apoptosis o lisis celular mediada por perforina, producción de citocinas como IFN-y y TNF-a, y destrucción citolítica específica de la diana que expresa el antígeno células.

De acuerdo con la invención, el término "puntuación" refiere a un resultado, normalmente expresado numéricamente, de una prueba o examen. Términos como "puntuar mejor" o "mejor puntuación" con relación a un mejor resultado o el mejor resultado de una prueba o examen.

De acuerdo con la invención, los péptidos modificados se puntúan de acuerdo con su capacidad prevista para unirse al MHC clase II y de acuerdo con la expresión o abundancia de las proteínas modificadas de las que se derivan los péptidos modificados. En general, un péptido con una mayor capacidad prevista para unirse al MHC clase II se puntúa mejor que un péptido con una menor capacidad prevista para unirse al MHC clase II. Además, un péptido con mayor expresión o abundancia de la correspondiente proteína modificada se puntúa mejor que un péptido con menor expresión o abundancia de la correspondiente proteína modificada.

Términos tal como "predecir", "prediciendo" o "predicción" con relación a la determinación de una posibilidad.

De acuerdo con la invención, determinar una puntuación para la unión de un péptido a una o más moléculas de MHC clase II incluye determinar la posibilidad de unión de un péptido a una o más moléculas de MHC clase II.

Puede determinarse una puntuación para la unión de un péptido a una o más moléculas de MHC clase II mediante el uso de cualquier péptido: herramientas de predicción de la unión de MHC. Por ejemplo, el recurso de análisis de la base de datos de epítopos inmunitarios (IEDB-AR: http://tools.iedb.org) puede usarse.

Por lo general, las predicciones se hacen frente a un conjunto de moléculas del MHC clase II, tal como un conjunto de diferentes alelos del MHC clase II, como todos los alelos posibles del MHC clase II o un conjunto o subconjunto de alelos del MHC clase II que se encuentran en un paciente. Preferentemente, el paciente tiene la(s) modificación(es) cuya inmunogenicidad se va a determinar de acuerdo con la invención o que se va a seleccionar y/o clasificar de acuerdo con su inmunogenicidad predicha según la invención. Preferentemente, la vacuna descrita en la presente descripción se proporcionará en última instancia a dicho paciente. En consecuencia, la presente invención también puede incluir la determinación del patrón de expresión del MHC clase II de un paciente.

La presente invención también puede comprender realizar el método de la invención en diferentes péptidos que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) y/o modificaciones diferentes.

El término "péptidos diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones)" en una modalidad refiere a péptidos que comprenden o que consisten de fragmentos diferentes de una proteína modificada, dichos fragmentos diferentes comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) presentes en la proteína pero que difieren en longitud y/o posición de la(s) modificación(ones). Si una proteína tiene una modificación en la posición x, dos o más fragmentos de dicha proteína que comprende cada uno una ventana de secuencia diferente de dicha proteína que cubre dicha posición x se considera péptidos diferentes que comprende la(s) misma(s) modificación(ones).

El término "diferentes péptidos que comprenden modificaciones diferentes" en una modalidad refiere a péptidos de la misma y/o diferentes longitudes que comprende diferentes modificaciones de la misma y/o proteínas diferentes. Si una proteína tiene modificaciones en las posiciones x e y, dos fragmentos de dicha proteína que comprende cada uno una ventana de secuencia de dicha proteína que cubre la posición x o la posición y, se consideran péptidos diferentes que comprenden modificaciones diferentes.

La presente invención también puede comprender la ruptura de secuencias de proteínas que tienen modificaciones cuya inmunogenicidad se determinará de acuerdo con la invención o que se seleccionarán y/o clasificarán de acuerdo con su inmunogenicidad predicha de acuerdo con la invención en longitudes de péptido apropiadas para la unión del MHC y determinar puntuaciones para la unión a una o más moléculas de MHC clase II de diferentes péptidos modificados que comprenden modificaciones iguales y/o diferentes de proteínas iguales y/o diferentes. Las salidas pueden clasificarse y pueden consistir en una lista de péptidos y sus puntuaciones previstas, lo que indica su posibilidad de unión.

La etapa de determinar una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada se puede realizar con todas las modificaciones diferentes, un subconjunto del mismo, por ejemplo, aquellas modificaciones que puntúan mejor para unirse a una o más moléculas de MHC clase II, o solo con la modificación que puntúa mejor para unión a una o más moléculas de MHC clase II.

Después de dicha etapa adicional, los resultados pueden clasificarse y pueden consistir en una lista de péptidos y sus puntuaciones previstas, lo que indica su posibilidad de ser inmunogénico.

De acuerdo con la invención, la determinación de una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada se puede realizar para un paciente, como un paciente con cáncer, por ejemplo, en una muestra de tumor de un paciente, tal como un paciente con cáncer.

De acuerdo con la invención, determinar una puntuación para la expresión o abundancia de una proteína modificada puede comprender determinar el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y/o determinar el nivel de expresión del ARN que codifica la proteína a la que está asociada la modificación. asociado (que nuevamente puede ser indicativo del nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación) y determinar la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación y/o determinar la frecuencia del ARN que codifica la modificación proteína entre el ARN que codifica la proteína a la que está asociada la modificación.

La frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación y/o la frecuencia del ARN que codifica la proteína modificada entre el ARN que codifica la proteína a la que está asociada la modificación puede considerarse la proporción de la proteína modificada dentro de la proteína. al que está asociada la modificación y/o la proporción de ARN que codifica la proteína modificada dentro del ARN que codifica la proteína a la que está asociada la modificación.

De acuerdo con la invención, el término "proteína a la que está asociada la modificación" se refiere a la proteína que puede comprender la modificación e incluye la proteína en su estado no modificado, así como también modificado.

De acuerdo con la invención, el término "nivel de expresión" puede referirse a una cantidad absoluta o relativa.

Las modificaciones de aminoácidos cuya inmunogenicidad se va a determinar de acuerdo con la presente invención o que se van a seleccionar y/o clasificar de acuerdo con su inmunogenicidad predicha de acuerdo con la invención pueden resultar de mutaciones en el ácido nucleico de una célula. Tales mutaciones pueden identificarse mediante técnicas de secuenciación conocidas.

En una modalidad, las mutaciones son mutaciones somáticas específicas de cáncer en una muestra de tumor de un paciente con cáncer que pueden determinarse identificando diferencias de secuencia entre el genoma, exorna y/o transcriptoma de una muestra de tumor y el genoma, exorna y/o transcriptoma de una muestra no tumorígena.

De acuerdo con la invención, una muestra de tumor se refiere a cualquier muestra tal como una muestra corporal derivada de un paciente que contiene o se espera que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido tal como sangre, una muestra de tejido obtenida del tumor primario o de metástasis tumorales o cualquier otra muestra que contiene células tumorales o cancerosas. Preferentemente, una muestra corporal es sangre y se determinan mutaciones somáticas específicas de cáncer o diferencias de secuencia en una o más células tumorales circulantes (CTC) contenidas en la sangre. En otra modalidad, una muestra de tumor refiere a una o más células tumorales o cancerosas aisladas tal como células tumorales circulantes (CTC) o una muestra que contiene una o más células tumorales o cancerosas aisladas tales como células tumorales circulantes (CTC).

Una muestra no tumoral se refiere a cualquier muestra tal como una muestra corporal derivada de un paciente u otro individuo que preferentemente es de la misma especie que el paciente, preferentemente un individuo sano que no contiene o no se espera que contenga células tumorales o cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido tal como sangre o una muestra de un tejido no tumorígeno.

La invención puede implicar la determinación de la firma de mutación del cáncer de un paciente. El término "firma de mutación cancerosa" puede referirse a todas las mutaciones cancerosas presentes en una o más células cancerosas de un paciente o puede referirse solo a una porción de las mutaciones cancerosas presentes en una o más células cancerosas de un paciente. En consecuencia, la presente invención puede implicar la identificación de todas las mutaciones específicas de cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente o puede implicar la identificación de solo una porción de las mutaciones específicas de cáncer presentes en una o más células cancerosas de un paciente. Generalmente, los métodos de la invención proporcionan la identificación de varias mutaciones que proporcionan un número suficiente de modificaciones o péptidos modificados para ser incluirlo en los métodos de la invención.

Preferentemente, las mutaciones identificadas de acuerdo con la presente invención son mutaciones no sinónimas, preferentemente mutaciones no sinónimas de proteínas expresadas en una célula tumoral o cancerosa.

En una modalidad, las mutaciones somáticas específicas de cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el genoma, preferentemente el genoma completo, de un espécimen de tumor. Por tanto, la invención puede comprender identificar la firma de mutación del cáncer del genoma, preferentemente el genoma completo de una o más células cancerosas. En una modalidad, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en un espécimen de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación de cáncer de todo el genoma.

En una modalidad, las mutaciones somáticas específicas del cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el exoma, preferentemente el exoma completo, de un espécimen de tumor. Por tanto, la invención puede comprender identificar la firma de mutación del cáncer del exoma, preferentemente el exoma completo de una o más células cancerosas. En una modalidad, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en un espécimen de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación de cáncer en todo el exoma.

En una modalidad, las mutaciones somáticas específicas del cáncer o las diferencias de secuencia se determinan en el transcriptoma, preferentemente el transcriptoma completo, de un espécimen de tumor. Por tanto, la invención puede comprender identificar la firma de mutación del cáncer del transcriptoma, preferentemente el transcriptoma completo de una o más células cancerosas. En una modalidad, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer en un espécimen de tumor de un paciente con cáncer comprende identificar el perfil de mutación de cáncer en todo el transcriptoma.

En una modalidad, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas del cáncer o identificar diferencias de secuencia comprende la secuenciación de una sola célula de una o más, preferentemente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o incluso más células cancerosas. Portanto, la invención puede comprender identificar una firma de mutación cancerosa de dichas una o más células cancerosas. En una modalidad, las células cancerosas son células tumorales circulantes. Las células cancerosas, tal como las células tumorales circulantes, pueden aislarse antes de la secuenciación de una sola célula.

En una modalidad, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer o identificar diferencias de secuencia implica mediante el uso de secuenciación de próxima generación (NGS).

En una modalidad, la etapa de identificar mutaciones somáticas específicas de cáncer o identificar diferencias de secuencia comprende secuenciar el ADN genómico y/o ARN del espécimen de tumor.

Para revelar mutaciones somáticas específicas de cáncer o diferencias de secuencia, la información de secuencia obtenida del espécimen de tumor se compara preferentemente con una referencia, tal como la información de secuencia obtenida de la secuenciación de ácidos nucleicos, tal como ADN o ARN de células normales no cancerosas, tal como las células de la línea germinal, que pueden obtenerse del paciente o de una persona diferente. En una modalidad, el ADN de la línea germinal genómica normal se obtiene a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

El término "genoma" se refiere a la cantidad total de información genética en los cromosomas de un organismo o una célula.

El término "exoma" se refiere a parte del genoma de un organismo formado por exones, que codifican porciones de genes expresados. El exoma proporciona el modelo genético usado en la síntesis de proteínas y otros productos génicos funcionales. Es la parte más funcionalmente relevante del genoma y, por lo tanto, es más probable contribuir al fenotipo de un organismo. Se estima que el exoma del genoma humano comprende el 1,5 % del genoma total (Nlg, PC y otros, PLoS Gen., 4(8): 1-15, 2008;.

El término "transcriptoma" se refiere al conjunto de todas las moléculas de ARN, incluyendo ARNm, ARNr, ARNt y otros ARN no codificantes producidos en una célula o una población de células. En el contexto de la presente invención, el transcriptoma significa el conjunto de todas las moléculas de ARN producidas en una célula, una población de células, preferentemente una población de células cancerosas, o todas las células de un individuo dado en un momento determinado.

Un "ácido nucleico" es de acuerdo con la invención preferentemente ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), con mayor preferencia ARN, con la máxima preferencia in vitro ARN transcrito (IVT ARN) o ARN sintético. Los ácidos nucleicos incluyen de acuerdo con la invención ADN genómico, ADNc, ARNm, moléculas producidas por vía recombinante y sintetizadas químicamente. De acuerdo con la invención, un ácido nucleico puede estar presente como una molécula monocatenaria o bicatenaria y lineal o covalentemente cerrada circularmente. Se puede aislar un ácido nucleico de acuerdo con la invención. El término "ácido nucleico aislado" significa, de acuerdo con la invención, que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo por vía recombinante por clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, por escisión y separación por electroforesis en gel, o (iv) se sintetizó, por ejemplo, por síntesis química. Un ácido nucleico puede emplearse para su introducción en, es decir transfección de, células, en particular, en la forma de ARN que puede prepararse por transcripción in vitro de una plantilla de ADN. El ARN puede modificarse, además, antes de la aplicación mediante secuencias estabilizadoras, encapsulado y poliadenilación.

El término "material genético" se refiere a un ácido nucleico aislado, ya sea ADN o ARN, una sección de una doble hélice, una sección de un cromosoma o el genoma completo de un organismo o célula, en particular su exoma o transcriptoma.

El término "mutación" se refiere a un cambio o diferencia en la secuencia de ácido nucleico (sustitución, adición o deleción de nucleótidos) en comparación con una referencia. Una "mutación somática" puede ocurrir en cualquiera de las células del cuerpo, excepto en las células germinales (esperma y óvulo) y, por lo tanto, no se transmite a los niños. Estas alteraciones pueden (pero no siempre) causar cáncer u otras enfermedades. Preferentemente, una mutación es una mutación no sinónima. El término "mutación no sinónima" se refiere a una mutación, preferentemente una sustitución de nucleótidos, que da como resultado un cambio de aminoácido tal como una sustitución de aminoácido en el producto de traducción.

De acuerdo con la invención, el término "mutación" incluye mutaciones puntuales, Indels, fusiones, cromotripsis y ediciones de ARN.

De acuerdo con la invención, el término "Indel" describe una clase de mutación especial, definida como una mutación que da como resultado una inserción y deleción colocalizadas y una ganancia o pérdida neta de nucleótidos. En las regiones codificantes del genoma, a menos que la longitud de un indel sea un múltiplo de 3, producen una mutación de cambio de marco. Los indeles se pueden contrastar con una mutación puntual; donde un Indel inserta y elimina nucleótidos de una secuencia, una mutación puntual es una forma de sustitución que reemplaza uno de los nucleótidos.

Las fusiones pueden generar genes híbridos formados a partir de dos genes previamente separados. Puede ocurrir como resultado de una translocación, deleción intersticial o inversión cromosómica. A menudo, los genes de fusión son oncogenes. Los genes de fusión oncogénicos pueden conducir a un producto génico con una función nueva o diferente a la de los dos socios de fusión. Alternativamente, un protooncogén se fusiona con un promotor fuerte y, de esta manera, la función oncogénica se establece para que funcione mediante una regulación positiva causada por el promotor fuerte del socio de fusión aguas arriba. Las transcripciones de fusión oncogénicas también pueden ser causadas por eventos transempalme o lectura continua.

De acuerdo con la invención, el término "cromotripsis" se refiere a un fenómeno genético por el cual regiones específicas del genoma se rompen y luego se unen mediante un solo evento devastador.

De acuerdo con la invención, el término "edición de ARN" o "edición de ARN" se refiere a procesos moleculares en los que el contenido de información en una molécula de ARN se altera mediante un cambio químico en la composición de la base. La edición de ARN incluye modificaciones de nucleósidos tales como desaminaciones de citidina(C) a uridina(U) y de adenosina(A) a inosina(I), así como también adiciones e inserciones de nucleótidos sin plantilla. La edición de ARN en ARNm altera efectivamente la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada para que difiera de la predicha por la secuencia de ADN genómico.

El término "firma de mutación del cáncer" se refiere a un conjunto de mutaciones que están presentes en las células cancerosas en comparación con las células de referencia no cancerosas.

De acuerdo con la invención, puede usarse una "referencia" para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la invención a partir de un espécimen de tumor. Típicamente, la "referencia" puede obtenerse sobre la base de uno o más especímenes normales, en particular especímenes que no se ven afectados por una enfermedad cancerosa, obtenidas de un paciente o de uno o más individuos diferentes, preferentemente individuos sanos, en particular individuos de la misma especie. Una "referencia" puede determinarse empíricamente analizando un número suficientemente grande de especímenes normales.

Puede usarse cualquier método de secuenciación adecuado de acuerdo con la invención para determinar mutaciones, prefiriéndose las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS). Los métodos de secuenciación de tercera generación podrían sustituir a la tecnología NGS en el futuro para acelerar la etapa de secuenciación del método. Para fines de clarificación: los términos "Secuenciación de próxima generación" o "NGS" en el contexto de la presente invención significa todas las nuevas tecnologías de secuenciación de alto rendimiento que, por el contrario con la metodología de secuenciación "convencional" conocida como química de Sanger, leen plantillas de ácido nucleico al azar en paralelo a lo largo de todo el genoma rompiendo todo el genoma en pequeñas piezas. Tales tecnologías NGS (también conocidas como tecnologías de secuenciación masivamente paralela) son capaces de suministrar información de secuencia de ácido nucleico de un genoma completo, exoma, transcriptoma (todas las secuencias transcritas de un genoma) o metiloma (todas las secuencias metiladas de un genoma) en muy poco período de tiempo, por ejemplo, dentro de 1-2 semanas, preferentemente dentro de 1-7 días o con la máxima preferencia dentro de menos de 24 horas y permiten, en principio, enfoques de secuenciación de células individuales. Múltiples plataformas NGS que están disponibles comercialmente o que se mencionan en la literatura puede usarse en el contexto de la presente invención, por ejemplo, las descritas en detalle en Zhang y otros 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38(3), 95-109; o en Voelkerding y otros 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Ejemplos de no limitativos de tales tecnologías/plataformas NGS son

1) La tecnología de secuenciación por síntesis conocida como pirosecuenciación implementada, por ejemplo, en el GS-FLX 454 Genome Sequencer™ de la compañía 454 Life Sciences (Branford, Connecticut) asociada a Roche, descrita por primera vez en Ronaghi y otros 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. Esta tecnología usa un PCR en emulsión en la que las perlas de unión a ADN monocatenarias se encapsulan mediante un vórtex vigoroso en micelas acuosas que contienen reactivos de PCR rodeados de aceite para la amplificación por PCR en emulsión. Durante el proceso de pirosecuenciación, la luz emitida por las moléculas de fosfato durante la incorporación de nucleótidos se registra cuando la polimerasa sintetiza la hebra de ADN.

2) Los enfoques de secuenciación por síntesis desarrollados por Solexa (ahora parte de Illumina Inc., San Diego, California) que se basan en terminadores de colorante reversibles e implementados, por ejemplo, en Illumina/Solexa Genome Analyzer™ y en Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™. En esta tecnología, los cuatro nucleótidos se añaden simultáneamente en fragmentos de racimo conglomerado con oligo en canales de células de flujo junto con la ADN polimerasa. La amplificación de puente extiende las hebras conglomerada con los cuatro nucleótidos marcados con fluorescencia para la secuenciación.

3) Enfoques de secuenciación por ligadura, por ejemplo, implementados en la plataforma SOLid™ de Applied Biosystems (ahora Life Technologies Corporation, Carlsbad, California). En esta tecnología, se marca un conjunto de todos los posibles oligonucleótidos de una longitud fija de acuerdo con la posición secuenciada. Los oligonucleótidos se hibridan y se ligan; la ligadura preferencial por ADN ligasa para emparejar secuencias da como resultado una señal informativa del nucleótido en esa posición. Antes de la secuenciación, el ADN se amplifica mediante PCR en emulsión. La perla resultante, cada una de las cuales que contiene solo copias de la misma molécula de ADN, se deposita en un portaobjetos de vidrio. Como segundo ejemplo, la plataforma Polonator™ G.007 de Dover Systems (Salem, New Hampshire) también emplea un enfoque de secuenciación por ligación mediante el uso de un PCR de emulsión basada en perlas y ordenada al azar para amplificar fragmentos de ADN para la secuenciación paralela.

4) Tecnologías de secuenciación de una sola molécula como, por ejemplo, las implementadas en el sistema PacBio RS de Pacific Biosciences (Menlo Park, California) o en la plataforma HeliScope™ de Helicos Biosciences (Cambridge, Massachusetts). La característica distintiva de esta tecnología es su capacidad para secuenciar moléculas simples de ADN o ARN sin amplificación, definida como secuenciación de ADN de una sola molécula en tiempo real (SMRT). Por ejemplo, HeliScope usa un sistema de detección de fluorescencia de alta sensibilidad para detectar directamente cada nucleótido a medida que se sintetiza. Un enfoque similar basado en la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se ha desarrollado en Visigen Biotechnology (Houston, Texas). Otras técnicas de molécula única basadas en fluorescencia son de US Genomics (GeneEngine™) y Genovoxx (AnyGene™).

5) Nanotecnologías para la secuenciación de una sola molécula en las que son usada diversas nanoestructuras que, por ejemplo, disponer de un chip para monitorear el movimiento de una molécula de polimerasa en una sola hebra durante la replicación. Ejemplos no limitativos de enfoques basados en nanotecnologías son la plataforma GridON™ de Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido), las plataformas de secuenciación de nanoporos asistida por hibridación (HANS™) desarrolladas por Nabsys (Providence, Rhode Island), y la plataforma patentada de secuenciación de ADN basada en ligasa con tecnología de nanoesferas de ADN (DNB) llamada ligadura combinatoria de sonda-anclaje (cPAL™).

6) Tecnologías basadas en microscopía electrónica para secuenciación de una sola molécula, por ejemplo, las desarrolladas por LightSpeed Genomics (Sunnyvale, California) y Halcyon Molecular (Redwood City, California)

7) Secuenciación de semiconductores de iones que se basa en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN. Por ejemplo, Ion Torrent Systems (San Francisco, California) usando una serie de pozos micro-mecanizados de alta densidad para realizar este proceso bioquímico de una manera masivamente paralela. Cada pocillo contiene una plantilla de ADN diferente. Debajo de los pozos hay una capa sensible a los iones y debajo de ella un sensor de iones patentado.

Preferentemente, las preparaciones de ADN y ARN sirven como material de partida para NGS. Tales ácidos nucleicos pueden obtenerse fácilmente a partir de muestras tal como material biológico, por ejemplo, de tejidos tumorales frescos, congelados o fijados en parafina (FFPE) o de células aisladas de forma festiva o de CTC presentes en la sangre periférica de los pacientes. El ADN o ARN genómico normal no mutado se puede extraer de tejido somático normal, sin embargo, se prefieren las células de la línea germinal en el contexto de la presente invención. El ADN o ARN de la línea germinal se puede extraer de las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en pacientes con neoplasias malignas no hematológicas. Aunque los ácidos nucleicos extraídos de tejidos FFPE o células individuales recién aisladas están muy fragmentados, son adecuados para aplicaciones de NGS.

En la literatura se describen varios métodos de NGS dirigidos para la secuenciación del exoma (para una revisión, ver por ejemplo Teer y Mullikin 2010: Human Mol Genet 19(2), R145-51), todos los cuales puede usarse junto con la presente invención. Muchos de estos métodos (descritos, por ejemplo, como captura del genoma, partición del genoma, enriquecimiento del genoma, etc.) usan técnicas de hibridación e incluyen enfoques de hibridación en matrices (por ejemplo Hodges y otros 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) y de base líquida (por ejemplo Choi y otros 2009: Proc. Natl. Acad. Sci u Sa 106, 19096-19101). También se encuentran disponibles kits comerciales para la preparación de muestras de ADN y la posterior captura del exoma: por ejemplo, Illumina Inc. (San Diego, California) ofrece el kit de preparación de muestras de ADN TruSeq™ y el kit de enriquecimiento del exoma TruSeq™ Exome Enrichment Kit.

Para reducir el número de resultados falsos positivos en la detección de mutaciones somáticas específicas del cáncer o diferentes secuencias al comparar, por ejemplo, la secuencia de una muestra de tumor con la secuencia de una muestra de referencia, como la secuencia de una muestra de línea germinal, se prefiere determinar la secuencia en réplicas de uno o ambos de estos tipos de muestras. Por tanto, se prefiere que la secuencia de una muestra de referencia, como la secuencia de una muestra de la línea germinal, se determine dos veces, tres veces o más. Alternativamente o adicionalmente, la secuencia de una muestra de tumor se determina dos, tres veces o más. También puede ser posible determinar la secuencia de una muestra de referencia, tal como la secuencia de una muestra de línea germinal y/o la secuencia de una muestra de tumor más de una vez, por determinación de al menos una vez la secuencia en el ADN genómico y por determinación de al menos una vez el secuencia en ARN de dicha muestra de referencia y/o de dicha muestra tumoral. Por ejemplo, al determinar las variaciones entre las réplicas de una muestra de referencia, tal como una muestra de línea germinal, se puede estimar la tasa esperada de falsos positivos (FDR) de mutaciones somáticas como una cantidad estadística. Las repeticiones técnicas de una muestra deben generar resultados idénticos y cualquier mutación detectada en esta "comparación igual frente a la misma" es un falso positivo. En particular, para determinar la tasa de descubrimiento falso para la detección de mutaciones somáticas en una muestra de tumor con relación a una muestra de referencia, puede usarse una repetición técnica de la muestra de referencia como referencia para estimar el número de falsos positivos. Además, varias métricas relacionadas con la calidad (por ejemplo, cobertura o calidad de SNP) se pueden combinar en una sola puntuación de calidad mediante el uso de un enfoque de aprendizaje automático. Para una variación somática dada, se pueden contar todas las demás variaciones con una puntuación de calidad superior, lo que permite una clasificación de todas las variaciones en un conjunto de datos.

En el contexto de la presente invención, el término "ARN" se refiere a una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido y que preferentemente está compuesta total o sustancialmente por residuos de ribonucleótido. "Ribonucleótido" se refiere a un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de un grupo p-Dribofuranosilo. El término "ARN" comprende ARN bicatenario, ARN monocatenario, ARN aislado, como ARN parcial o completamente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético y ARN generado de forma recombinante, como ARN modificado, que se diferencia del ARN natural por adición, deleción, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotídico, tal como al(los) extremo(s) de un ARN o internamente, por ejemplo, a uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden comprender también nucleótidos no estándar, tales como nucleótidos que no son de origen natural o nucleótidos o desoxinucleótidos sintetizados químicamente. Estos ARN alterados pueden referirse como análogos o análogos de ARN de origen natural. De acuerdo con la presente invención, el término "ARN" incluye y preferentemente se refiere a "ARNm". El término "ARNm" significa "ARN mensajero" y se refiere a un "transcrito" que se genera mediante el uso de una plantilla de ADN y codifica un péptido o polipéptido. Típicamente, un ARNm comprende una 5'-UTR, una región codificante de proteínas y una 3'-UTR. El ARNm solo posee una vida media limitada en las células e in vitro. En el contexto de la presente invención, el ARNm puede generarse mediante transcripción in vitro de una plantilla de ADN. La metodología de transcripción in vitro es conocida por el experto. Por ejemplo, existe una variedad de kits de transcripción in vitro disponibles comercialmente.

De acuerdo con la invención, la estabilidad y la eficiencia de traducción del ARN pueden modificarse según se requiera. Por ejemplo, el ARN puede estabilizarse y su traducción aumentada mediante una o más modificaciones que tienen efectos estabilizadores y/o un aumento de la eficiencia de traducción del ARN. Tales modificaciones se describen, por ejemplo, en PCT/EP2006/009448. Para aumentar la expresión del ARN usado de acuerdo con la presente invención, se puede modificar dentro de la región codificante, es decir, la secuencia que codifica el péptido o proteína expresados, preferentemente sin alterar la secuencia del péptido o proteína expresados, para aumentar el contenido de GC para aumentar la estabilidad del ARNm y realizar una optimización de codones y, por lo tanto, mejorar la traducción en las células.

El término "modificación" en el contexto del ARN usado en la presente invención incluye cualquier modificación de un ARN que no está presente de forma natural en dicho ARN.

En una modalidad de la invención, el ARN usado de acuerdo con la invención no tiene 5'- trifosfatos sin rematar. La eliminación de tales 5'-trifosfatos sin caperuza puede lograrse al tratar el ARN con una fosfatasa.

El ARN de acuerdo con la invención puede tener ribonucleótidos modificados para aumentar su estabilidad y/o disminuir la citotoxicidad. Por ejemplo, en una modalidad, en el ARN usado de acuerdo con la invención, la 5-metilcitidina es sustituido parcialmente o completamente, preferentemente completamente, por citidina. Alternativamente o adicionalmente, en una modalidad, en el ARN usado de acuerdo con la invención, la pseudouridina es sustituida parcialmente o completamente, preferentemente completamente, por uridina.

En una modalidad, el término "modificación" se refiere a proporcionar un ARN con una caperuza 5' o un análogo de la caperuza 5'. El término "5'-cap'" se refiere a una estructura de caperuza que se encuentra en el extremo 5' de una molécula de ARNm y consiste, generalmente, en un nucleótido de guanosina que se conecta al ARNm a través de un enlace inusual 5' a 5' trifosfato. En una modalidad, esta guanosina se metila en la posición 7. El término "5'-cap convencional" se refiere a una 5'-cap ARN de origen natural, preferentemente a la tapa de 7-metilguanosina (m7G). En el contexto de la presente invención, el término "5'-cap" incluye un análogo de 5'-cap que se asemeja a la estructura de la tapa del ARN y se modifica para poseer la capacidad de estabilizar el ARN y/o mejorar la traducción del ARN si está unido al mismo. preferentemente en vivo y/o en una celda.

Proporcionar un ARN con un análogo de 5-cap' o 5'-cap se puede lograr mediante in vitro transcripción de una plantilla de ADN en presencia de dicho 5'-cap o análogo de 5'-cap, en donde dicho 5'-cap se incorpora cotranscripcionalmente en la hebra de ARN generada, o el ARN puede generarse, por ejemplo, por in vitro transcripción, y la 5'-cap puede unirse al ARN postranscripcionalmente mediante el uso de enzimas de protección, por ejemplo, enzimas de protección del virus vaccinia.

El ARN puede comprender modificaciones adicionales. Por ejemplo, una modificación adicional del ARN usado en la presente invención puede ser una extensión o truncamiento de la cola poli (A) de origen natural o una alteración de las regiones 5'o 3' no traducidas (UTR) como la introducción de una UTR que no está relacionada con la región codificante de dicho ARN, por ejemplo, el intercambio de la 3'-UTR existente con o la inserción de una o más, preferentemente dos copias de una 3'-UTR derivada de un gen de globina, tales como alfa2-globina, alfal-globina, beta-globina, preferentemente beta-globina, con mayor preferencia beta-globina humana.

El ARN que tiene una secuencia poli-A no enmascarada se traduce de manera más eficiente que el ARN que tiene una secuencia poli-A enmascarada. El término "cola poli (A)" o "secuencia poli-A" se refiere a una secuencia de residuos de adenilo (A) que típicamente se encuentra en el extremo 3' de una molécula de ARN y "secuencia poli-A desenmascarada" significa que la secuencia poli-A en el extremo 3' de una molécula de ARN termina con una A de la secuencia poli-A y no es seguida por nucleótidos distintos de A ubicado en el extremo 3', es decir, corriente abajo, de la secuencia poli-A. Además, una secuencia poli-A larga de aproximadamente 120 pares de bases da como resultado una estabilidad de transcripción y una eficiencia de traducción óptimas del ARN.

Por lo tanto, para aumentar la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con la presente invención, se puede modificar para que esté presente junto con una secuencia poli-A, preferentemente con una longitud de 10 a 500, con mayor preferencia 30 a 300, aún con mayor preferencia 65 a 200 y especialmente 100 a 150 residuos de adenosina. En una modalidad especialmente preferida la secuencia de poli Atiene una longitud de aproximadamente 120 residuos de adenosina. Para aumentar aún más la estabilidad y/o la expresión del ARN usado de acuerdo con la invención, se puede desenmascarar la secuencia poli-A.

Además, la incorporación de una región no traducida 3'(UTR) en la región no traducida 3' de una molécula de ARN puede dar como resultado una mejora en la eficiencia de la traducción. Puede lograrse un efecto sinérgico incorporando dos o más de tales regiones 3' no traducidas. Las regiones 3' no traducidas pueden ser autólogas o heterólogas al ARN en el que se introducen. En una modalidad particular, la región 3' no traducida se deriva del gen de la p-globina humana.

Una combinación de las modificaciones descritas anteriormente, es decir, la incorporación de una secuencia poli-A, el desenmascaramiento de una secuencia poli-A y la incorporación de una o más regiones 3' no traducidas, tiene una influencia sinérgica sobre la estabilidad del ARN y el aumento de la eficiencia de la traducción.

El término "estabilidad" del ARN se refiere a la "vida media" del ARN. "Vida media" se refiere al período de tiempo que se necesita para eliminar la mitad de la actividad, cantidad, o número de moléculas. En el contexto de la presente invención, la vida media de un ARN es indicativo de la estabilidad de dicho ARN. La vida media del ARN puede influenciar la "duración de la expresión" del ARN. Puede esperarse que el ARN que tiene una vida media larga se expresará por un período de tiempo prolongado.

Por supuesto, si de acuerdo con la presente invención se desea disminuir la estabilidad y/o la eficiencia de traducción del ARN, es posible modificar el ARN para interferir con la función de los elementos como se describió anteriormente aumentando la estabilidad y/o la eficiencia de la traducción de ARN.

El término "expresión" se usa de acuerdo con la invención en su significado más general y comprende la producción de ARN y/o péptidos, polipéptidos o proteínas, por ejemplo, mediante transcripción y/o traducción. Con respecto a el ARN, el término "expresión" o "traducción" se refiere en particular a la producción de péptidos, polipéptidos o proteínas. Comprende además la expresión parcial de ácidos nucleicos. Además, la expresión puede ser transitoria o estable.

De acuerdo con la invención, el término expresión también incluye una "expresión aberrante" o "expresión anormal". "Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa de acuerdo con la invención que la expresión se altera, preferentemente aumenta, en comparación con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene una enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de una determinada proteína, por ejemplo, un antígeno tumoral. Un aumento de la expresión se refiere aun aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 % o al menos 100 %, o más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime.

El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente solo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno tumoral expresado específicamente en la mucosa gástrica significa que dicha proteína se expresa primariamente en la mucosa gástrica, y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en un grado significativo en otros tipos de tejidos u órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en las células de la mucosa gástrica y en un grado significativamente menor en cualquier otro tejido, tal como el testículo, se expresa específicamente en las células de la mucosa gástrica. En algunas modalidades, un antígeno tumoral también puede expresarse específicamente bajo condiciones normales en más de un tipo de tejido u órgano, tal como en 2 o 3 tipos de tejidos u órganos, pero preferentemente en no más de 3 tipos diferentes de tejidos u órganos. En este caso, el antígeno tumoral se expresa entonces específicamente en estos órganos. Por ejemplo, si un antígeno tumoral se expresa bajo condiciones normales, preferentemente, en un grado aproximadamente igual en pulmón y estómago, dicho antígeno tumoral se expresa específicamente en pulmón y estómago.

En el contexto de la presente invención, el término "transcripción" se refiere a un proceso, en donde el código genético en una secuencia de ADN se transcribe a ARN. Subsecuentemente, el ARN puede traducirse en proteína. De acuerdo con la presente invención, el término "transcripción" comprende "transcripción in vitro", en donde el término "transcripción in vitro" se refiere a un proceso en donde el ARN, en particular el ARNm, se sintetiza in vitro en un sistema libre de células, preferentemente mediante el uso de extractos celulares apropiados. Preferentemente, los vectores de clonación se aplican para la generación de transcriptos. Estos vectores de clonación se designan generalmente como vectores de transcripción y se abarcan de acuerdo con la presente invención por el término "vector". De acuerdo con la presente invención, el ARN usado en la presente invención es preferentemente in vitro ARN transcrito (IVT-ARN) y puede obtenerse mediante in vitro transcripción de una plantilla de ADN apropiada. El promotor para controlar la transcripción puede ser cualquier promotor de cualquier ARN polimerasa. Ejemplos particulares de ARN polimerasas son las ARN polimerasas T7, T3 y SP6. Preferentemente, el in vitro la transcripción de acuerdo con la invención está controlada por un promotor T7 o SP6. Una plantilla de ADN para in vitro la transcripción se puede obtener clonando un ácido nucleico, en particular ADNc, e introduciéndolo en un vector apropiado para in vitro transcripción. El ADNc puede obtenerse mediante transcripción inversa de ARN.

El término "traducción" de acuerdo con la invención se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para fabricar un péptido, polipéptido o proteína.

Las secuencias de control de la expresión o secuencias reguladoras, que de acuerdo con la invención pueden estar unidas funcionalmente con un ácido nucleico, pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a el ácido nucleico. Una secuencia codificante y una secuencia reguladora están unidas "funcionalmente" si están unidas covalentemente, de manera que la transcripción o traducción de la secuencia codificante está bajo el control o bajo la influencia de la secuencia reguladora. Si la secuencia codificante se va a traducir en una proteína funcional, con un enlace funcional de una secuencia reguladora con la secuencia codificante, la inducción de la secuencia reguladora conduce a una transcripción de la secuencia codificante, sin provocar un cambio del marco de lectura en la secuencia codificante o incapacidad de la secuencia codificante para traducirse en la proteína o péptido deseado.

El término "secuencia de control de la expresión" o "secuencia reguladora" comprende, de acuerdo con la invención, promotores, secuencias de unión a ribosomas y otros elementos de control, que controlan la transcripción de un ácido nucleico o la traducción del ARN derivado. En determinadas formas de modalidades de la invención, se pueden controlar las secuencias reguladoras. La estructura precisa de las secuencias reguladoras puede variar en dependencia de la especie o en dependencia del tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas, que están involucradas en el inicio de la transcripción o traducción, tal como Caja TATA, secuencia de remate, secuencia CAAT y similares. En particular, las secuencias reguladoras no transcritas en 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del gen unido funcionalmente. Las secuencias reguladoras pueden también comprender además secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba.

Preferentemente, de acuerdo con la invención, el ARN que se va a expresar en una célula se introduce en dicha célula. En una modalidad de los métodos de acuerdo con la invención, el ARN que se va a introducir en una célula se obtiene mediante in vitro transcripción de una plantilla de ADN apropiada.

De acuerdo con la invención, términos como "ARN capaz de expresarse" y "ARN que codifica" son usado indistintamente en la presente descripción y con respecto a un péptido o polipéptido particular significa que el ARN, si está presente en el entorno apropiado, preferentemente dentro de una célula, puede expresarse para producir dicho péptido o polipéptido. Preferentemente, el ARN de acuerdo con la invención puede interactuar con la maquinaria de traducción celular para proporcionar el péptido o polipéptido que es capaz de expresar.

Términos tal como "transferir", "introducir" o "transfectar" se usan indistintamente en la presente descripción y con relación a la introducción de ácidos nucleicos, en particular ácidos nucleicos exógenos o heterólogos, en particular ARN en una célula. De acuerdo con la presente invención, la célula puede formar parte de un órgano, un tejido y/o un organismo. De acuerdo con la presente invención, la administración de un ácido nucleico se logra como ácido nucleico desnudo o en combinación con un reactivo de administración. Preferentemente, la administración de ácidos nucleicos tiene forma de ácidos nucleicos desnudos. Preferentemente, el ARN se administra en combinación con sustancias estabilizantes tal como inhibidores de ARNasa. La presente invención también prevé la introducción repetida de ácidos nucleicos en las células para permitir una expresión sostenida durante largos períodos de tiempo.

Las células se pueden transfectar con cualquier portador con el que se pueda asociar el ARN, por ejemplo, formando complejos con el ARN o formando vesículas en las que el ARN está encerrado o encapsulado, lo que da como resultado un aumento de estabilidad del ARN en comparación con el ARN desnudo. Los portadores útiles de acuerdo con la invención incluyen, por ejemplo, portadores que contienen lípidos tal como lípidos catiónicos, liposomas, en particular liposomas catiónicos y micelas y nanopartículas. Los lípidos catiónicos pueden formar complejos con ácidos nucleicos cargados negativamente. Puede usarse cualquier lípido catiónico de acuerdo con la invención.

Preferentemente, la introducción de ARN que codifica un péptido o polipéptido en una célula, en particular en una célula presente en vivo, resulta la expresión de dicho péptido o polipéptido en la célula. En modalidades particulares, se prefiere el direccionamiento de los ácidos nucleicos a células particulares. En tales modalidades, un portador que se aplica para la administración del ácido nucleico a una célula (por ejemplo, un retrovirus o un liposoma) exhibe una molécula diana. Por ejemplo, una molécula tal como un anticuerpo que es específico para una proteína de la membrana de la superficie en la célula diana o un ligando para un receptor en la célula diana puede incorporarse al portador de ácido nucleico o puede unirse al mismo. En caso de que el ácido nucleico se administre mediante liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie que está asociada con la endocitosis pueden incorporarse en la formulación del liposoma para permitir el direccionamiento y/o la captación. Dichas proteínas abarcan proteínas de la cápside de fragmentos de las mismas que son específicas para un tipo celular particular, anticuerpos contra proteínas que están internalizadas, proteínas que se dirigen a una ubicación intracelular, etc.

El término "célula" o "célula huésped" es preferentemente una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tal como enzimas, orgánulos o material genético.

Una célula intacta, preferentemente, es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. Preferentemente, dicho término se refiere de acuerdo con la invención a cualquier célula que puede transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. El término "célula" incluye de acuerdo con la invención células procariotas (por ejemplo, E. coli) o células eucariotas (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HELA, células de levadura, y células de insectos). El ácido nucleico exógeno se puede encontrar dentro de la célula (i) libremente disperso como tal, (ii) incorporado en un vector recombinante, o (iii) integrado en el genoma de la célula huésped o ADN mitocondrial. Se prefieren particularmente células de mamífero, tales como células de humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares. Los ejemplos específicos incluyen queratinocitos, leucocitos de sangre periférica, células madre de la médula ósea y células madre embrionarias. En modalidades adicionales, la célula es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica, un monocito o macrófago.

Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferentemente el péptido o polipéptido codificado por el ácido nucleico.

El término "expansión clonal" se refiere a un proceso en donde se multiplica una entidad específica. En el contexto de la presente invención, el término es usado preferentemente en el contexto de una respuesta inmunológica en la que los linfocitos son estimulados por un antígeno, proliferan y se amplifica el linfocito específico que reconoce dicho antígeno. Preferentemente, la expansión clonal conduce a la diferenciación de los linfocitos.

Términos tal como "reducir" o "inhibir" con relación a la capacidad de causar una disminución general, preferentemente del 5 % o más, del 10 % o más, del 20 % o más, con mayor preferencia del 50 % o más, y con la máxima preferencia del 75 % o más, en el nivel. El término "inhibir" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o esencialmente a cero.

Términos como "aumentar", "mejorar", "promover" o "prolongar" se refieren preferentemente con relación a un aumento, mejora, promoción o prolongación en aproximadamente al menos el 10 %, preferentemente al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30 %, preferentemente al menos al menos el 40 %, preferentemente al menos el 50 %, preferentemente al menos el 80 %, preferentemente al menos el 100 %, preferentemente al menos el 200 % y en particular al menos el 300 %. Estos términos también pueden con relación a un aumento, mejora, promoción o prolongación desde cero o un nivel no medible o no detectable hasta un nivel de más de cero o un nivel que es medible o detectable.

La presente descripción proporciona vacunas tal como vacunas contra el cáncer diseñadas sobre la base de modificaciones de aminoácidos o péptidos modificados que se predice que son inmunogénicos por los métodos de la presente invención.

De acuerdo con la invención, el término "vacuna" se refiere a una preparación farmacéutica (composición farmacéutica) o producto que tras su administración induce una respuesta inmunitaria, en particular una respuesta inmunitaria celular, que reconoce y ataca a un patógeno o una célula enferma tal como una célula de cáncer. Puede usarse una vacuna para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. El término "vacuna contra el cáncer personalizada" o "vacuna contra el cáncer individualizada" se refiere a un paciente de cáncer en particular y significa que una vacuna contra el cáncer se adapta a las necesidades o circunstancias especiales de un paciente de cáncer individual.

En una modalidad, una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una o más modificaciones de aminoácidos o uno o más péptidos modificados que se predice que son inmunogénicos por los métodos de la invención o un ácido nucleico, preferentemente ARN, que codifica dicha péptido o polipéptido.

Las vacunas contra el cáncer proporcionadas de acuerdo con la descripción cuando se administran a una patente proporcionan uno o más epítopos de células T adecuados para estimular, cebar y/o expandir células T específicas para el tumor del paciente. Las células T se dirigen preferentemente contra las células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos de las células T. Por tanto, las vacunas descritas en la presente descripción son preferentemente capaces de inducir o promover una respuesta celular, preferentemente actividad de células T citotóxicas, contra una enfermedad cancerosa caracterizada por la presentación de uno o más neoantígenos asociados a tumor con MHC clase I. Dado que una vacuna proporcionada de acuerdo con la presente invención se dirigirá a mutaciones específicas del cáncer, será específica para el tumor del paciente.

Una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción se refiere a una vacuna que cuando se administra a una patente proporciona preferentemente uno o más epítopos de células T, tales como 2 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más y preferentemente hasta 60, hasta 55, hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 epítopos de células T, incorporando modificaciones de aminoácidos o péptidos modificados predichos como inmunogénicos por los métodos de la invención. Tales epítopos de células T también se denominan "neoepítopos" en la presente descripción. La presentación de estos epítopos por parte de una célula de un paciente, en particular una célula presentadora de antígenos, da lugar preferentemente da como resultado que las células T se dirijan a los epítopos cuando se unen al MHC y, por lo tanto, a que el tumor del paciente, preferentemente el tumor primario, así como también las metástasis tumorales, expresen el antígenos del que se derivan los a partir de los mismos epítopos en la superficie de las células tumorales.

Los métodos de la invención pueden comprender además la etapa de determinar la usabilidad de las modificaciones de aminoácidos identificadas o péptidos modificados para la vacunación contra el cáncer. Por lo tanto, más adelante las etapas adicionales pueden involucrar uno o más de los siguientes: (i) evaluar si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por MHC conocidos o pronosticados, (ii) in vitro y/o in silico probar si las modificaciones están ubicadas en epítopos presentados por MHC, por ejemplo, probar si las modificaciones son parte de una secuencias de péptidos que se procesan y/o presentan como epítopos presentados por MHC, y (iii) in vitro probar si los epítopos modificados previstos, en particular cuando están presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, cuando están flanqueados por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en la proteína de origen natural, y cuando se expresan en células presentadoras de antígenos, son capaces de estimular células T tales como células T de paciente que tienen la especificidad deseada. Cada una de estas secuencias flanqueantes puede comprender 3 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferentemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo N-terminal y/o C-terminalmente.

Los péptidos modificados determinados de acuerdo con la invención pueden clasificarse por su utilidad como epítopos para la vacunación contra el cáncer. Por tanto, en un aspecto, el método de la invención comprende un proceso analítico manual o informático en el que los péptidos modificados identificados se analizan y seleccionan por su utilidad en la vacuna respectiva que se va a proporcionar. En una modalidad preferida, dicho proceso analítico es un proceso basado en algoritmos computacionales. Preferentemente, dicho proceso analítico comprende determinar y/o clasificar epítopos de acuerdo con una predicción de su capacidad de ser inmunogénicos.

Los neoepítopos identificados de acuerdo con la invención y proporcionados por una vacuna de la descripción están presentes preferentemente en forma de un polipéptido que comprende dichos neoepítopos tales como un polipéptido poliepitópico o un ácido nucleico, en particular ARN, que codifica dicho polipéptido. Además, los neoepítopos pueden estar presentes en el polipéptido en forma de una secuencia de vacuna, es decir, presentes en su contexto de secuencia natural, por ejemplo, flanqueados por secuencias de aminoácidos que también flanquean dichos epítopos en la proteína de origen natural. Cada una de estas secuencias flanqueantes puede comprender 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferentemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos y pueden flanquear la secuencia del epítopo N-terminal y/o C-terminal. Por tanto, una secuencia de vacuna puede comprender 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más y preferentemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 aminoácidos. En una modalidad, los neoepítopos y/o secuencias de vacuna se alinean en el polipéptido de cabeza a cola.

En una modalidad, los neoepítopos y/o secuencias de vacuna están espaciados por enlazadores, en particular enlazadores neutros. El término "enlazador" de acuerdo con la invención se refiere a un péptido añadido entre dos dominios peptídicos tales como epítopos o secuencias de vacuna para conectar dichos dominios peptídicos. No existe una limitación particular con respecto a la secuencia enlazadora. Sin embargo, se prefiere que la secuencia enlazadora reduzca el impedimento estérico entre los dos dominios peptídicos, esté bien traducida y apoye o permita el procesamiento de los epítopos. Además, el enlazador debe tener pocos elementos de secuencia inmunogénica o ninguno. Los enlazadores preferentemente no deberían crear neoepítopos no endógenos como los generados a partir de la sutura de unión entre neoepítopos adyacentes, que podrían generar reacciones inmunitarias no deseadas. Por lo tanto, la vacuna poliepitópica debería contener preferentemente secuencias enlazadoras que sean capaces de reducir el número de epítopos de unión de unión a MHC no deseados. Hoyt y otros. (EMBO J. 25 (8), 1720-9, 2006) y Zhang y otros (J. Biol. Chem., 279 (10), 8635-41,2004.) han demostrado que las secuencias ricas en glicina perjudican el procesamiento proteasómico y, por tanto, usar las secuencias enlazadoras ricas en glicina actúa para minimizar el número de péptidos que contienen enlazador que pueden ser procesados por el proteasoma. Además, se observó que la glicina inhibe una fuerte unión en las posiciones de la ranura de unión del MHC (Abastado y otros, J. Immunol.

151(7), 3569-75, 1993). Schlessinger y otros (Proteins, 61(1), 115-26, 2005) había descubierto que los aminoácidos glicina y serina incluidos en una secuencia de aminoácidos dan como resultado una proteína más flexible que el proteasoma traduce y procesa de manera más eficiente, lo que permite un mejor acceso a los neoepítopos codificados. Cada uno de los enlazadores puede comprender 3 o más, 6 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más y preferentemente hasta 50, hasta 45, hasta 40, hasta 35 o hasta 30 amino ácidos. Preferentemente, el enlazador está enriquecido en glicina y/o serina aminoácidos. Preferentemente, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % de los aminoácidos del enlazador son glicina y/o serina. En una modalidad preferida, un enlazador está compuesto sustancialmente por los aminoácidos glicina y serina. En una modalidad, el enlazador comprende la secuencia de aminoácidos (GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e en donde a, b, c, d y e es independientemente un número seleccionado entre 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 y donde a b c+ d e son diferentes de 0 y preferentemente son 2 o más, 3 o más, 4 o más o 5 o más. En una modalidad, el enlazador comprende una secuencia como se describe en la presente descripción que incluye las secuencias enlazadoras descritas en los ejemplos tales como la secuencia GGSGGGGSG.

En una modalidad preferida particularmente, un polipéptido que incorpora uno o más neoepítopos tales como un polipéptido poliepitópico de acuerdo con la presente descripción se administra a un paciente en forma de ácido nucleico, preferentemente ARN tal como in vitro ARN transcrito o sintético, que puede expresarse en células de un paciente, como células presentadoras de antígenos, para producir el polipéptido. La presente descripción también prevé la administración de uno o más polipéptidos multiepitópicos que para el propósito de la presente invención están comprendidos por el término "polipéptido poliepitópico", preferentemente en forma de un ácido nucleico, preferentemente ARN tal como in vitro ARN transcrito o sintético, que puede expresarse en células de un paciente, tal como células presentadoras de antígenos, para producir uno o más polipéptidos. En el caso de una administración de más de un polipéptido multiepitópico, los neoepítopos proporcionados por los diferentes polipéptidos multiepitópicos pueden ser diferentes o solaparse parcialmente. Una vez presente en las células de un paciente, como las células presentadoras de antígenos, el polipéptido de acuerdo con la descripción se procesa para producir los neoepítopos identificados según la invención. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción proporciona preferentemente epítopos presentados por MHC clase II que son capaces de provocar una respuesta de células T auxiliares CD4 contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por MHC. La administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción también puede proporcionar epítopos presentados por MHC clase I que son capaces de provocar un CD8+ respuesta de las células T contra las células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por el MHC. Además, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción puede proporcionar uno o más neoepítopos (incluidos neoepítopos y neoepítopos conocidos identificados según la invención) así como también uno o más epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas del cáncer pero que son expresado por células cancerosas y preferentemente induciendo una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas, preferentemente una respuesta inmunitaria específica del cáncer. En una modalidad, la administración de una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción proporciona neoepítopos que son epítopos presentados por MHC clase II y/o son capaces de provocar una respuesta de células T auxiliares CD4 contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por MHC así como también epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas de cáncer que son epítopos presentados por MHC clase I y/o son capaces de provocar una respuesta de células T CD8 contra células que expresan antígenos de los que se derivan los epítopos presentados por MHC. En una modalidad, los epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas de cáncer se derivan de un antígeno tumoral. En una modalidad, los neoepítopos y epítopos que no contienen mutaciones somáticas específicas del cáncertienen un efecto sinérgico en el tratamiento del cáncer. Preferentemente, una vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción es útil para la estimulación poliepitópica de respuestas de células T citotóxicas y/o auxiliares.

La vacuna proporcionada de acuerdo con la descripción puede ser una vacuna recombinante. El término "recombinante" en el contexto de la presente invención significa "elaborado mediante ingeniería genética". Preferentemente, una "entidad recombinante" tal como un polipéptido recombinante en el contexto de la presente invención no se produce de forma natural y preferentemente es el resultado de una combinación de entidades tales como secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos que no se combinan en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido recombinante en el contexto de la presente invención puede contener varias secuencias de aminoácidos tales como neoepítopos o secuencias de vacuna derivadas de diferentes proteínas o diferentes porciones de la misma proteína fusionadas, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos o enlazadores apropiados.

El término "de origen natural", como se usa en la presente, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, es de origen natural un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (lo que incluye los virus) y que puede aislarse a partir de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el hombre en el laboratorio.

Los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción pueden usarse para tratar a un sujeto con una enfermedad, por ejemplo, una enfermedad caracterizada por la presencia de células enfermas que expresan un antígeno y presentan un fragmento del mismo. Las enfermedades particularmente preferidas son las enfermedades cancerosas. Los agentes, composiciones y métodos descritos en la presente descripción también pueden usarse para inmunización o vacunación para prevenir una enfermedad descrita en la presente descripción.

De acuerdo con la invención, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, incluidas las enfermedades cancerosas, en particular las formas de enfermedades cancerosas descritas en la presente descripción.

El término "normal" se refiere al estado sano o las condiciones en un sujeto o tejido sano, es decir, condiciones no patológicas, en donde "saludable" significa preferentemente no canceroso.

"Enfermedad que implica células que expresan un antígeno" significa de acuerdo con la invención que se detecta la expresión del antígeno en células de un tejido u órgano enfermo. La expresión en las células de un tejido u órgano enfermo puede aumentar en comparación con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10 %, en particular al menos 20 %, al menos 50 %, al menos 100 %, al menos 200 %, al menos 500 %, al menos 1000 %, al menos 10000 % o aún más. En una modalidad, la expresión solo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano se reprime. De acuerdo con la invención, las enfermedades que involucran o están asociadas con células que expresan un antígeno incluyen enfermedades cancerosas.

De acuerdo con la invención, el término "tumor" o "enfermedad tumoral" se refiere a un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas, tumorígeno o células tumorales) que preferentemente forman una inflamación o una lesión. Por "célula tumoral" se entiende una célula anormal que crece mediante una proliferación celular rápida y descontrolada y continúa su crecimiento después de que cesa el estímulo que inició el nuevo crecimiento. Los tumores muestran una pérdida parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y generalmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser ya sea benigna, premaligna o maligna.

El cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células muestra un crecimiento descontrolado (división más allá de los límites normales), invasión (intrusión y destrucción de tejidos adyacentes) y, a veces, metástasis (diseminación a otras ubicaciones en el cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas de los cánceres los diferencian de los tumores benignos, que son autolimitados y no invaden ni hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no lo hacen. Malignidad, neoplasia maligna y tumor maligno son esencialmente sinónimos de cáncer.

La neoplasia es una masa anormal de tejido como resultado de una neoplasia. La neoplasia (nuevo crecimiento en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células excede y no está coordinado con el de los tejidos normales que lo rodean. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después de la cesación de los estímulos. Por lo general, causa un nódulo o un tumor. Las neoplasias pueden ser benignas, premalignas o malignas.

"Crecimiento de un tumor" o "crecimiento de un tumor" de acuerdo con la invención se refiere a la tendencia de un tumor de aumentar su tamaño y/o a la tendencia de las células tumorales a proliferar.

Para los propósitos de la presente invención, los términos "cáncer" y "enfermedad cancerosa" se usan de manera intercambiable con los términos "tumor" y "enfermedad tumoral".

Los cánceres se clasifican por el tipo de célula que se asemeja al tumor y, por lo tanto, el tejido que se presume es el origen del tumor. Estos son la histología y la ubicación, respectivamente.

El término "cáncer" de acuerdo con la invención comprende carcinomas, adenocarcinomas, blastomas, leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, cáncer de recto, cáncer de endometrio, cáncer de riñón, cáncer suprarrenal, cáncer de tiroides, cáncer de sangre, cáncer de piel, cáncer de cerebro, cáncer de cuello uterino, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglio linfático, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, oído, nariz y garganta (ENT) cáncer, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y sus metástasis en los mismos. Los ejemplos de estos son carcinomas de pulmón, carcinomas de mama, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales, o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la invención comprende además metástasis de cáncer y recidiva de cáncer.

Por "metástasis" se entiende la propagación de las células cancerosas desde su sitio original a otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende del desprendimiento de las células malignas del tumor primario, la invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas basales del endotelio para entrar en la cavidad y en los vasos del cuerpo, y después, tras haberse transportado por la sangre, la infiltración en los órganos diana. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o un tumor metastásico, en el sitio diana depende de la angiogénesis. A menudo la metástasis del tumor ocurre incluso después de la remoción del tumor primario porque las células o componentes tumorales pueden permanecer y desarrollar un potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a la "metástasis a distancia" que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y del sistema de ganglios linfáticos regionales.

Las células de un tumor secundario o metastásico son como las del tumor original. Esto significa, por ejemplo, que si el cáncer de ovario hace metástasis en el hígado, el tumor secundario se forma por células ováricas anormales, no por células hepáticas anormales. El tumor en el hígado entonces se denomina cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.

El término "células tumorales circulantes" o "CTC" se refiere a células que se han desprendido de un tumor primario o metástasis tumorales y circulan en el torrente sanguíneo. Los CTC pueden constituir semillas para el crecimiento posterior de tumores adicionales (metástasis) en diferentes tejidos. Las células tumorales circulantes se encuentran en frecuencias del orden de 1-10 CTC por ml de sangre total en pacientes con enfermedad metastásica. Se han desarrollado métodos de investigación para aislar CTC. Se han descrito en la técnica varios métodos de investigación para aislar CTC, por ejemplo, técnicas que utilizan el hecho de que las células epiteliales expresan comúnmente la proteína de adhesión celular EpCAM, que está ausente en las células sanguíneas normales. La captura basada en perlas inmunomagnéticas implica el tratamiento de muestras de sangre con anticuerpos contra EpCAM que se han conjugado con partículas magnéticas, seguido de la separación de las células marcadas en un campo magnético. A continuación, las células aisladas se tiñen con anticuerpo contra otro marcador epitelial, citoqueratina, así como también un marcador leucocitario común CD45, para distinguir las CTC raras de los glóbulos blancos contaminantes. Este enfoque robusto y semiautomático identifica CTC con un rendimiento promedio de aproximadamente 1 CTC/mL y una pureza del 0,1 % (Allard y otros, 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904,). Un segundo método para aislar CTC utiliza un dispositivo de captura de CTC basado en microfluidos que implica hacer fluir sangre completa a través de una cámara incrustada con 80 000 micropostes que se han vuelto funcionales al recubrir con anticuerpos contra EpCAM. Luego, las CTC se tiñen con anticuerpos secundarios contra citoqueratina o marcadores específicos de tejido, como PSA en el cáncer de próstata o HER2 en el cáncer de mama, y se visualizan mediante escaneo automático de micropostes en múltiples planos a lo largo de coordenadas tridimensionales. Los chips CTC son capaces de identificar células tumorales circulantes positivas para citoqueración en pacientes con un rendimiento medio de 50 células/ml y una pureza que oscila entre el 1-80 % (Nagrath y otros, 2007: Nature 450, 1235-1239). Otra posibilidad para aislar las CTC es mediante el uso de la prueba de células tumorales circulantes (CTC) CellSearch™ de Veridex, LLC (Raritan, NJ) que captura, identifica y cuenta las CTC en un tubo de sangre. El sistema CellSearch™ es una metodología aprobada por la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA) para el recuento de CTC en sangre completa que se basa en una combinación de etiquetado inmunomagnético y microscopía digital automatizada. Existen otros métodos para aislar CTC descritos en la bibliografía, todos los cuales pueden usarse junto con la presente invención.

Una recaída o recurrencia se produce cuando una persona se ve afectada nuevamente por una afección que la afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido una enfermedad tumoral, ha recibido un tratamiento exitoso de dicha enfermedad y desarrolla nuevamente dicha enfermedad, dicha enfermedad recientemente desarrollada puede considerarse una recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la invención, una recaída o recurrencia de una enfermedad tumoral puede ocurrir, pero no necesariamente, en el sitio de la enfermedad tumoral original. Así, por ejemplo, si una paciente ha sufrido un tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia puede ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor incluye, además, situaciones en donde un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original, así como también en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición como se describe en la presente descripción a un sujeto para prevenir o eliminar una enfermedad, incluida la reducción del tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retrasar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retardar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o la gravedad de los síntomas y/o las recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que ha tenido una enfermedad anteriormente; y/o prolongar, es decir, aumentar la vida útil del sujeto. En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye curar, acortar la duración, mejorar, prevenir, retrasar o inhibir la progresión o el empeoramiento, o prevenir o demorar la aparición de una enfermedad o los síntomas de esta.

Por "que está en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica que tiene una posibilidad mayor de la normal de desarrollar una enfermedad, en particular cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido, o que actualmente tiene, una enfermedad, en particular cáncer, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, ya que tal sujeto puede continuar el desarrollo de una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen o han tenido un cáncertienen, además, un riesgo aumentado de metástasis de cáncer.

El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que implica la activación de una reacción inmunitaria específica. En el contexto de la presente descripción, términos como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" con relación a la prevención o el tratamiento, o ambos, de la aparición y/o propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, para minimizar la posibilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o para retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor.

Una administración profiláctica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración profiláctica de una vacuna de la invención, protege preferentemente al receptor del desarrollo de una enfermedad. Una administración terapéutica de una inmunoterapia, por ejemplo, una administración terapéutica de una vacuna de la descripción, puede conducir a la inhibición del progreso/crecimiento de la enfermedad. Esto comprende la desaceleración del progreso/crecimiento de la enfermedad, en particular una interrupción de la progresión de la enfermedad, que conduce, preferentemente, a la eliminación de la enfermedad.

La inmunoterapia se puede realizar mediante el uso de cualquiera de una variedad de técnicas, en las que los agentes proporcionados en la presente descripción funcionan para eliminar las células enfermas de un paciente. Tal eliminación puede tener lugar como resultado de potenciar o inducir una respuesta inmunitaria en un paciente específico para un antígeno o una célula que expresa un antígeno.

Dentro de determinadas modalidades, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la en vivo estimulación del sistema inmunitario endógeno del huésped para que reaccione contra células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (tales como polipéptidos y ácidos nucleicos como se proporciona en la presente descripción).

Los agentes y composiciones proporcionados en la presente descripción pueden usarse solos o en combinación con regímenes terapéuticos convencionales tales como cirugía, irradiación, quimioterapia y/o trasplante de médula ósea (autólogo, singénico, alogénico o no relacionado).

El término "inmunización" o "vacunación" describe el proceso para tratar a un sujeto con el propósito de inducir una respuesta inmunitaria por razones terapéuticas o profilácticas.

El término "in vivo" se refiere a la situación en un sujeto.

Los términos "sujeto", "individuo", "organismo" o "paciente" se usan indistintamente y se refieren a vertebrados, preferentemente, mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son seres humanos, primates no humanos, animales domesticados tales como perros, gatos, ovejas, vacuno, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como animales en cautiverio, tal como animales de los zoológicos. El término "animal" como se usa en la presente descripción incluye, además, a los seres humanos. El término "sujeto" también puede incluir un paciente, es decir, un animal, preferentemente un ser humano que tiene una enfermedad, preferentemente una enfermedad como se describe en la presente descripción.

El término "autólogo" se usa para describir cualquier cosa que se derive del mismo sujeto. Por ejemplo, "trasplante autólogo" se refiere a un trasplante de tejido u órganos derivados del mismo sujeto. Tales procedimientos son ventajosos porque superan la barrera inmunológica que de cualquier otra manera resulta en el rechazo.

El término "heterólogo" se usa para describir algo que consiste de múltiples elementos diferentes. Como ejemplo, la transferencia de la médula ósea de un individuo a un individuo diferente constituye un trasplante heterólogo. Un gen heterólogo es un gen derivado de una fuente distinta al sujeto.

Como parte de la composición para una inmunización o vacunación, preferentemente se administran uno o más agentes como se describen en la presente descripción junto con uno o más adyuvantes para inducir una respuesta inmunitaria o para aumentar una respuesta inmunitaria. El término "adyuvante" se refiere a los compuestos que prolongan o potencian o aceleran una respuesta inmunitaria. La composición de la presente descripción ejerce preferentemente su efecto sin adición de adyuvantes. Aun así, la composición de la presente descripción puede contener cualquier adyuvante conocido. Los adyuvantes comprenden un grupo heterogéneo de compuestos tal como emulsiones oleosas (por ejemplo, adyuvantes de Freund), compuestos minerales (tal como alumbre), productos bacterianos (tal como toxina de Bordetella pertussis), liposomas y complejos inmunoestimulantes. Los ejemplos de adyuvantes son monofosforil lípido A (MPL SmithKline Beecham). Saponinas tal como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18 y QS-L1 (So y otros, 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adyuvantes de Freund incompletos, adyuvantes de Freund completos, vitamina E, montanide, alumbre, oligonucleótidos CpG (Krieg y otros, 1995, Nature 374: 546-549) y diversas emulsiones de agua en aceite que se preparan a partir de aceites biológicamente degradables como escualeno y/o tocoferol.

Pueden administrarse, además, otras sustancias que estimulan una respuesta inmunitaria del paciente. Es posible, por ejemplo, usar citocinas en una vacunación, debido a sus propiedades reguladoras sobre los linfocitos. Dichas citocinas comprenden, por ejemplo, interleucina-12 (IL-12) que ha demostrado que aumenta las acciones protectoras de las vacunas (cf. Science 268:1432-1434, 1995), GM-CSF e IL-18.

Existe una cantidad de compuestos que aumentan la respuesta inmunitaria y que, por consiguiente, pueden usarse en una vacunación. Dichos compuestos comprenden moléculas coestimulantes proporcionadas en forma de proteínas o ácidos nucleicos tal como B7-1 y B7-2 (CD80 y CD86, respectivamente).

De acuerdo con la invención, una muestra corporal puede ser una muestra de tejido, que incluye fluidos corporales y/o una muestra celular. Tales muestras corporales pueden obtenerse de manera convencional, como por biopsia de tejido, incluida la biopsia por perforar, y extrayendo sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces fecales u otros fluidos corporales. De acuerdo con la invención, el término "muestra" también incluye muestras procesadas tal como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, ácido nucleico o aislados de células.

Los agentes tal como vacunas y composiciones descritas en la presente descripción pueden administrarse mediante cualquier ruta convencional, incluso mediante inyección o infusión. La administración puede llevarse a cabo, por ejemplo, por vía oral, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea o transdérmica. En una modalidad, la administración se lleva a cabo por vía intranodal, por ejemplo mediante inyección en un ganglio linfático. Otras formas de administración prevén la in vitro transfección de células presentadoras de antígenos tal como células dendríticas con los ácidos nucleicos descritos en la presente descripción seguida de la administración de las células presentadoras de antígenos.

Los agentes descritos en la presente descripción se administran en cantidades efectiva. Una "cantidad efectiva" se refiere a la cantidad que logra una reacción deseada o un efecto deseado solo o junto con dosis adicionales. En el caso del tratamiento de una enfermedad particular o de una afección particular, la reacción deseada se relaciona, preferentemente, con la inhibición del curso de la enfermedad. Esto comprende ralentizar el progreso de la enfermedad y, en particular, interrumpir o revertir el progreso de la enfermedad. La reacción deseada en un tratamiento de una enfermedad o de una afección puede ser también un retraso en la aparición o una prevención de la aparición de dicha enfermedad o de dicha afección.

Una cantidad efectiva de un agente descrito en la presente descripción dependerá de la afección a tratar, la gravedad de la enfermedad, los parámetros individuales del paciente, incluida la edad, la afección fisiológica, el tamaño y el peso, la duración del tratamiento, el tipo de acompañante, terapia (si está presente), la vía específica de administración y factores similares. En consecuencia, las dosis administradas de los agentes descritos en la presente descripción pueden depender de varios de tales parámetros. En el caso que una reacción en un paciente sea insuficiente con una dosis inicial pueden usarse dosis más altas (o dosis efectivamente más altas alcanzadas por una vía de administración diferente, más localizada).

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción son preferentemente estériles y contienen una cantidad eficaz de la sustancia terapéuticamente activa para generar la reacción deseada o el efecto deseado.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción se administran generalmente en cantidades farmacéuticamente compatibles y en preparaciones farmacéuticamente compatibles. El término "compatible farmacéuticamente" se refiere a un material no tóxico que no interactúa con la acción del componente activo de la composición farmacéutica. Las preparaciones de este tipo pueden contener habitualmente sales, sustancias tampón, conservantes, portadores, sustancias complementarias que mejoran la inmunidad como adyuvantes, por ejemplo, oligonucleótidos CpG, citocinas, quimiocinas, saponina, GM-CSF y/o ARN y, en su caso, otras terapias compuestos. Cuando se usan en medicina, las sales deberían ser compatibles farmacéuticamente. Sin embargo, las sales que no son farmacéuticamente compatibles pueden ser usada para preparar sales farmacéuticamente compatibles y están incluidas en la invención. Las sales farmacológica y farmacéuticamente compatibles de este tipo comprenden de forma no limitativa las preparadas a partir de los siguientes ácidos: ácido clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético, salicílico, cítrico, fórmico, malónico, succínico y similares. Las sales compatibles farmacéuticamente pueden prepararse, además, como sales de metales alcalinos o sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de sodio, sales de potasio o sales de calcio.

Una composición farmacéutica descrita en la presente descripción puede comprender un portador farmacéuticamente compatible. El término "portador'' se refiere a un componente orgánico o inorgánico, de naturaleza natural o sintética, en el que el componente activo se combina con el fin de facilitar la aplicación. De acuerdo con la invención, el término "portador farmacéuticamente compatible" incluye una o más cargas, diluyentes o sustancias encapsulantes sólidos o líquidos compatibles, que son adecuados para la administración a un paciente. Los componentes de la composición farmacéutica de la invención son normalmente de manera que no se produce interacción que altere sustancialmente la eficacia farmacéutica deseada.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente descripción pueden contener sustancias tampón adecuadas tal como ácido acético en una sal, ácido cítrico en una sal, ácido bórico en una sal y ácido fosfórico en una sal.

Las composiciones farmacéuticas pueden contener, además, cuando sea apropiado, conservantes adecuados tales como cloruro de benzalconio, clorobutanol, parabeno y tiomersal.

Las composiciones farmacéuticas se proporcionan usualmente en una forma de dosificación uniforme y pueden prepararse de una forma conocida per se. Las composiciones farmacéuticas de la descripción pueden estar en forma de cápsulas, comprimidos, grageas, soluciones, suspensiones, jarabes, elixires o en forma de emulsión, por ejemplo.

Las composiciones adecuadas para la administración parenteral comprenden usualmente una preparación acuosa o no acuosa estéril del componente activo, que es, preferentemente, isotónica para la sangre del receptor. Ejemplos de portadores y disolventes compatibles son la solución de Ringer y la solución de cloruro de sodio isotónica. Adicionalmente, se usan aceites fijados, usualmente estériles, como solución o medio de suspensión.

La presente invención se describe en detalle mediante las figuras y los ejemplos más abajo, que se usan sólo para propósitos ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Debido a la descripción y los ejemplos, el experto en la materia puede acceder a otras formas de modalidades.

Figuras

Figura 1. Las mutaciones no sinónimas asociadas al cáncer son con frecuencia inmunogénicas y predominantemente reconocidas por CD4+ Células c. a, Para las pruebas de inmunogenicidad, los ratones (n = 5 para b y c, n = 3 para d) se vacunaron con péptidos sintéticos y poli (I: C) como adyuvante (b) o ARN que codifica antígenos (c, d) que representan los epítopos mutados (dos mutaciones por ratón). Se reestimularon los esplenocitos ex vivo con el péptido mutado o un péptido de control irrelevante y probado por IFNy Elispot (ver ilustrativo de la Figura 2a) y tinción de superficie de citocina intracelular y CD4/CD8 para evaluar el subtipo de respuestas inmunitarias provocadas. b-c, Respuestas de células T obtenidas vacunando ratones C57BL/6 con epítopos mutados en el modelo de tumor B16F10. A la izquierda, prevalencia de epítopos mutados restringidos de MHC clase I o clase II no inmunogénicos. Derecha, ejemplos para la detección y tipificación de células T específicas de mutación (vea la Tabla 1 para obtener datos sobre epítopos individuales). d A la izquierda, prevalencia de epítopos mutados restringidos de MHC clase I o clase II no inmunogénicos descubiertos en el modelo CT26. Derecha, la restricción de MHC de epítopos mutados inmunogénicos se priorizó en función de la unión prevista de MHC clase I y se seleccionó en función de puntuaciones de unión buenas (0,1-2,1) o malas (> 3,9). Vea la Tabla 2 para obtener datos sobre epítopos individuales.

Figura 2. Control eficiente del tumor y beneficio de supervivencia en el melanoma B16F10 mediante la inmunización con una vacuna de ARN que codifica un solo CD4 mutado+ Epítopo de células T. a, Los esplenocitos de ratones (n = 5) vacunados con ARN B16-M30 fueron probados por ELISpot para el reconocimiento de péptidos sintéticos. A la izquierda, la secuencia mutada (B16-M30) frente a la correspondiente secuencia de tipo salvaje (B16-WT30). Derecha, definición del epítopo mínimo probando el reconocimiento de variantes truncadas de B16-M30 (media SEM). b, El crecimiento del tumor medio SEM (izquierda) y la supervivencia (derecha) de ratones C57BL/6 (n = 10) inoculados por vía subcutánea con células tumorales B16F10 y no tratados (control) o inmunizados por vía intravenosa con ARN que codifica B16-M30 (B16-M30 ) con o sin administración de anticuerpos reductores de CD4 o CD8, c, ratones albinos B6 (n = 10) que desarrollaron metástasis pulmonares tras la inyección intravenosa de células tumorales B16F10 transgénicas de luciferasa (B16F10-Luc) se trataron con ARN que codifica B16-M30 (B16- M30) o ARN de control irrelevante. La mediana del crecimiento del tumor se determinó mediante BLI. d, Las suspensiones de células individuales de tumores B16F10 de ratones no tratados (control, n = x) o inmunizados con ARN B16-M30 (n = 4) se reestimularon con péptido B16-M30, péptido medio o irrelevante (VSV-NP52-59) y probado en un ensayo ELISpot de IFNy (media SEM). e, Caracterización citométrica de flujo de leucocitos infiltrantes de tumores en ratones vacunados con ARN B16-M30. Representada es la frecuencia de CD4+, CD8+ o FoxP3+/CD4+ Células T entre CD45+ células y Gr-1+/CD11b+ células (MDSC) de ratones C57BL/6 no tratados (control) o vacunados con ARN Mut30 (n = 3) inoculados por vía subcutánea con células tumorales B16F10.

Figura 3. La inmunización con pentatopos de ARN induce respuestas de células T contra los epítopos mutados individuales y confiere control de la enfermedad y un beneficio de supervivencia significativo en modelos de tumores de ratón. a, Ingeniería de una vacuna de ARN poli-neo-epítopo. El pentatopo de ARN contiene cinco secuencias de 27 mer conectadas por enlazadores gly/ser insertados en la cadena principal pSTI-Sp-MITD-2hBgUTR-A120. (UTR, región no traducida; sp, péptido señal; MITD, dominio de tráfico de MHC clase I), b, Se vacunaron ratones BALB/c (n = 5) con ARN pentatopo (35 |jg) o con la mezcla correspondiente de cinco monotopos de ARN (7 |jg cada uno). Se midieron las respuestas de células T en esplenocitos estimulados con péptidos de ratones ex vivo el día 19 en un ensayo ELISpot de IFNy (promedio sustraído del medio control s Em ). C, Los ratones BALB/c (n = 10) que desarrollaron metástasis pulmonares tras la inyección intravenosa de células CT26-Luc se trataron simultáneamente con una mezcla de dos pentatopos de ARN o se dejaron sin tratar (control). Se muestran la mediana del crecimiento tumoral por BLI (izquierda), los datos de supervivencia (centro) y los pulmones de los animales tratados (derecha). d, Secciones de tejido teñidas con CD3 de los pulmones de animales tratados con pentatopo1 2 (panel superior). El lado izquierdo de cada panel muestra las secciones analizadas, el lado derecho los aumentos (barra de escala: escaneo: 1000 jm , imágenes superiores: 100 jm , imágenes inferiores: 50 jim). CD3+, CD4+, FoxP3+yCD8+ (calculado por CD3+ área - CD4+ área) en secciones consecutivas de tejido pulmonar inmunohistoquímico de control (n=6) o pentatopo de ARN (CD3: n=14; CD4, CD8, FoxP3: n=12) animales tratados se cuantificaron y se calcularon las proporciones de tumor. La figura de la derecha representa una comparación del área tumoral en secciones de control (n=18) y animales tratados con pentatopo1 2 (n=39) (se excluyeron los animales sin tumor del grupo de tratamiento con pentatopo1 2). Se representan la media ± SEM.

Figura 4. Vacunas de pentatopo de ARN con mutaciones seleccionadas para propiedades de unión al MHC clase II favorables expresión abundante predichas in silico confieren un potente control antitumoral. a, Comparación de las puntuaciones de unión al MHC II de mutaciones inmunogénicas y no inmunogénicas (se muestran las medianas), b, Mutaciones con altos niveles de expresión se seleccionaron con (mutaciones 'ME') o sin (mutaciones 'E') considerando la puntuación de unión al MHC clase II. Ver también la Tabla 4. Fueron usado diez mutaciones de cada categoría representada por dos pentatopos cada una para la vacunación de ratones portadores de tumores de pulmón CT26-Luc. Se muestran las curvas de crecimiento tumoral (izquierda), el área bajo la curva (centro) y los pulmones tratados con tinta (derecha). c, Los ratones (5 por grupo) se analizaron para las respuestas de las células T contra los pentatopos vacunados mediante reestimulación con BMDC singénica electroporada de ARN en un ensayo ELISpot de IFNy. Cada punto representa el recuento medio de puntos de un ratón sustraído por un control de ARN irrelevante (media ± SEM). d, Nódulos tumorales por pulmón de ratones BALB/c (n = 10) inoculados IV con células tumorales CT26 y no tratados o inyectados con ARN irrelevante, pentatopo1, pentatopo2 o ARN CT26-M19. e, Respuestas de células T contra gp70423-431 (gp70-AH1) se determinaron mediante el ensayo ELISpot de IFNy en sangre (agrupada de 5 ratones, día 20 después de la inoculación del tumor) y bazo (n = 5). (Fondo (sin control de péptido) sustrato media ± SEM representado), f, Se emplearon datos de mutación somática y RNA-Seq para muestras individuales de cáncer humano (puntos negros) de The Cancer Genome Atlas (TCGA) para identificar variaciones genómicas (panel superior) y expresadas (panel medio) no sinónimos de un solo nucleótido (nsSNV). (panel inferior) Se muestran los neoepítopos que se predice que se unirán a los alelos HLA-DRB1 de los pacientes (orden percentil < 10 %) (SKCM, melanoma cutáneo de la piel; COAD, adenocarcinoma de colon; BRCA, carcinoma invasivo de mama).

Figura 5: Cálculo de la frecuencia alélica de la variante (VAF). La figura muestra un gen idealizado como una combinación de exones en una pieza de ADN genómico (parte superior) y secuencias leídas de ejemplo alineadas con este locus (parte inferior, en un nivel de zoom superior). El sitio del evento de mutación ("sitio de mutación") se muestra con una línea discontinua (parte superior) o un recuadro (parte inferior). Los nucleótidos mutantes son de color rojo, los nucleótidos de tipo salvaje son de color verde. Además, las sumas de esos nucleótidos en la fórmula VAF están coloreadas en consecuencia.

Figura 6: Influencia de la expresión del alelo mutado en el rendimiento de predicción de las puntuaciones de MHC II. Se ensayaron 185 mutaciones seleccionadas de los modelos de tumores murinos 4T1, CT26 y B16F10 para determinar su antigenicidad. El rendimiento predictivo de las puntuaciones calculadas del MHC II se dedujo del área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC, círculo abierto). Este valor se volvió a calcular subsecuentemente después de aplicar diferentes umbrales para la expresión de ARNm total (panel izquierdo) y la expresión del alelo mutado (panel derecho, expresión de ARNm * frecuencia del alelo mutado, círculos cerrados). Se indican los valores máximos de AUC. La expresión del alelo mutado contribuye más a la mejora del rendimiento de la predicción.

Figura 7: Comparación de las curvas de característica operativa del receptor (ROC) con y sin umbral en la expresión. Las curvas r Oc indican el desempeño de la predicción de antigenicidad para las 185 mutaciones seleccionadas de los modelos de tumores murinos 4T1, CT26 y B16F10 (curvas de puntos) y para aquellas mutaciones, para las cuales la expresión de ARNm fue > 6 RPKM (panel izquierdo, curva sólida) o la expresión del alelo mutado era > 4 RPKM (panel derecho, curva continua). Los umbrales seleccionados alcanzaron los valores máximos de AUC (ver Figura 6).

EJEMPLOS

Las técnicas y métodos usados en la presente descripción se llevan a cabo de la forma conocida per se y como se describen, por ejemplo, en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Todos los métodos, incluido el uso de estuches y reactivos, se llevan a cabo de acuerdo con la información del fabricante a menos que se indique específicamente.

Ejemplo 1: Materiales y métodos

Muestras. Hembras de 8-12 semanas de edad, ratones C57BL/6, BALB/c (Janvier Labs) y C57BL/6BrdCrHsd-TyrC Los ratones (B6 albino, Harlan) se mantuvieron de acuerdo con las políticas federales sobre investigación con animales en la Universidad de Mainz. La línea celular de melanoma B16F10, la línea celular de carcinoma de colon CT26 y las células 4T1-luc2-tdtomato (4T1-Luc) se compraron en 2010, 2011 y 2011 respectivamente (ATCC CRL-6475, lote #58078645, ATCC CRL-2638, lote #58494154, Caliper 125669 lote #101648) y se mantienen según lo sugerido por el proveedor. Se transdujeron con lentivirus células que expresan luciferasa de luciérnaga CT26-Luc y B16F10-Luc. Se generaron bancos de células maestras y de trabajo, de los cuales el tercer y cuarto pasajes se utilizaron para experimentos con tumores.

Secuenciación y procesamiento de datos de próxima generación fue descrito previamente (Castle, J. C. y otros, Cancer Res 72, 1081 (2012); Castle, J. C., y otros, Bm C Genomics 15, 190 (2014)). En resumen, la captura del exoma de las células tumorales de ratón y las muestras de tejido de la cola de los ratones BALB/c o C57BL/6 se secuenciaron por triplicado (4T1-Luc por duplicado). Se prepararon por triplicado bibliotecas de secuenciación de ARN basadas en oligo (dT) para el perfil de expresión génica. Las bibliotecas se secuenciaron en un Illumina HiSeq2000 para generar lecturas de 50 nucleótidos de extremo único (B16F10) o de 100 nucleótidos de extremo emparejado (CT26, 4T1-Luc), respectivamente. Los valores de expresión génica se determinaron mediante el recuento de las lecturas solapadas de exones y uniones de los transcritos, y su normalización respecto a las unidades de expresión RPKM (lecturas que se mapean por kilobase de longitud del transcrito por millón de lecturas mapeadas). La expresión de la mutación se determinó mediante la normalización de las lecturas de ARN mutado al total de recuentos de lecturas mapeadas multiplicado por 100 millones (recuentos de lectura de variantes normalizados; NVRC).

La selección, validación y priorización de mutaciones se describió previamente (Castle, J. C. y otros, Cancer Res 72, 1081 (2012); Castle, J. C., y otros, BMC Genomics 15, 190 (2014); Lower, M., y otros, PLoS Comput Biol 8, e1002714 (2012)). Las mutaciones a seguir se seleccionaron según los siguientes criterios: (i) presente en los triplicados de secuenciación de la línea de células tumorales respectivas y ausente en los triplicados de muestra de tejido sano correspondientes, (ii) se presente en una transcripción de RefSeq, y (iii) provoque cambios no sinónimos. Otros criterios fueron la aparición en genes expresados de líneas de células tumorales (mediana RPKM a través de réplicas). Para la validación, las mutaciones se amplificaron a partir de ADN de células B16F10, CT26 o 4T1-Luc y tejido de cola C57BL/6 o BALB/c y se sometieron a secuenciación Sanger. Las mutaciones derivadas del ADN se clasificaron como validadas si se confirmaban mediante la secuenciación de Sanger o las lecturas de RNASeq. No se realizó ninguna confirmación a través de secuenciación de Sanger y pruebas de inmunogenicidad para los experimentos que se muestran en la Figura 4. Para los experimentos que se muestran en la Figura 1, los epítopos mutados se priorizaron de acuerdo con su unión prevista de MHC clase I según el método de consenso (versión 2,5) de la base de datos de epítopos inmunitarios (Vita, R., y otros, Nucleic Acids Res 38, D854-D862 (2010)). Las mutaciones dirigidas en el experimento que se muestra en la Figura 4b-e se seleccionaron basándose en su expresión (NVRC) sola o junto con su capacidad de unión de péptidos MHC clase II predicha (método de consenso IEDB versión 2,5). El análisis retrospectivo de la predicción de la unión de MHC II que se muestra en la Figura 4a se determinó con el método de consenso IEDB versión 2,12. Para el análisis de mutaciones en tumores humanos, datos de secuenciación de ADN de melanoma cutáneo de piel (SKCM, n=308), adenocarcinoma de colon (COAD, n=192) o carcinoma invasivo de mama (BRCA, n=872) recuperados de The Cancer Genome Atlas ( TCGA) (agosto de 2014) se filtró para obtener mutaciones puntuales no sinónimas genómicas (nsSNV). Se utilizaron datos de RNA-Seq (TCGA) de muestras tumorales con mutaciones genómicas identificadas para definir nsSNV expresados. Con el fin de predecir los neoepítopos expresados en la unión de MHC II, se empleó seq2HLA para identificar el tipo de HLA clase II de 4 dígitos (HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRB1) de los pacientes. Se usó la predicción de unión por consenso de IEDB (versión 2,12) para predecir la unión al MHC clase II de un péptido 27 mer y los alelos HLA-DRB1 de los pacientes. Según lo recomendado por la IEDB, se consideraron aglutinantes los neoepítopos con un orden percentil por debajo del 10 %.

Sintético ARN y péptidos sintéticos. Las mutaciones no sinónimas identificadas se estudiaron en el contexto del epítopo de aminoácido 27mer respectivo con el aminoácido mutado en el centro (posición 14). Cualquiera de estos péptidos mutados se sintetizó junto con péptidos de control (nucleoproteína del virus de la vesiculoestomatitis (VSV- NP52-59), gp70-AH1 (gp70423-431) y la proteína 2 relacionada con la tirosinasa (Trp2-i80-188) de JPT Peptide Technologies GmbH. Alternativamente, las secuencias que codifican péptidos 27mer mutados se clonaron en la cadena principal pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120 (Holtkamp, S. y otros, Blood 108, 4009 (2006)) con elementos de secuencia para a Rn sintético optimizado farmacológicamente en términos de eficiencia de traducción y procesamiento de epítopos de clase I/II de MHC, ya sea como monotopos o como pentatopos fusionados entre sí mediante secuencias que codifican un enlazador de glicina-serina de 10 aminoácidos de longitud en el medio. Linealización de estas construcciones de plásmidos, in vitro la traducción (IVT) de estas plantillas y la purificación se describen en detalle en otra parte (Holtkamp, S. y otros, Blood 108, 4009 (2006)).

Modelos de ratón.

Para los experimentos que investigan la inmunogenicidad de los epítopos mutados, se vacunaron ratones hembra C57BL/6 o BALB/c de la misma edad los días 0, 3, 7 y 14 (inmunización con ARN) o los días 0 y 7 (inmunización con péptido), la lectura se realizó de cinco a seis días después de la última inmunización. La vacunación se realizó mediante inyección retroorbital de 200 |j 1 (20 |jg por mutación para B16F10, 40 |jg por mutación para CT26) ARN en complejo con lípidos catiónicos (manuscrito en preparación) o inyección subcutánea de 100 jg de péptido sintético y 50 jg de poli (I: C) formulado en PBS (200 j l de volumen total) en el flanco lateral. Se probaron dos mutaciones por ratón (n=5 para B16F10, n=3 para CT26). Para la confirmación de mutaciones inmunogénicas y subtipificación, los ratones se vacunaron contra una sola mutación (n=5).

Para experimentos terapéuticos con tumores, se inocularon ratones C57BL/6 por vía subcutánea con 1x105 células de melanoma B16F10 en el flanco derecho y distribuidas al azar en grupos de tratamiento. El volumen del tumor se midió sin cegar con un calibre y se calculó usando la fórmula (AxB2) /2 (A como el diámetro más grande y B el más pequeño del tumor). En experimentos de metástasis pulmonar 5x105 CT26-Luc o 2x105 se inyectaron células CT26 en la vena de la cola de ratones BALB/c o 1,5 x 105 células tumorales B16F10-Luc en ratones albinos B6 para obtener tumores pulmonares. Se trazó el crecimiento tumoral de células transgénicas de luciferasa sin cegamiento mediante formación de imágenes de bioluminiscencia después de la inyección i.p. de una solución acuosa de D-luciferina (250 jl, 1,6 mg, BD Bioscience) en un IVIS Lumina (Caliper Life Sciences). Cinco minutos después de la inyección se cuantificaron los fotones emitidos. En vivo la bioluminiscencia en las regiones de interés (ROI) se cuantificó como flujo total (fotones/s) mediante el uso del software IVIS Living Image 4,0. Los ratones se asignaron al azar en función de sus valores de flujo total (método ANOVA-P, caja de herramientas XL de Daniel V6,53). La carga tumoral pulmonar CT26 se cuantificó sin cegamiento después de la inyección de tinta traqueal (1:10 diluida en PBS) y la fijación con solución de Fekete (5 ml de EtOH al 70 %, 0,5 ml de formalina y 0,25 ml de ácido acético glacial). En experimentos terapéuticos, a los ratones se les administraron dosis repetidas de ARN monotópico (40 jg), pentatopo (en total 40 jg ) o cantidades equimolares de ARN irrelevante.

Para estudios mecanicistas, se administraron intraperitonealmente dosis repetidas de anticuerpos reductores de CD8 (clon YTS191, BioXcell), reductores de CD4 (clon YTS169.1, BioXcell) o bloqueo de CD40L (clon MR1, amable obsequio del profesor Stephen Schoenberger) por vía intraperitoneal como se indica en la figura (200 jg/ratón en 200 jL de PBS).

Inmunospot ligado a enzimas (ELISpot) se ha descrito previamente (Kreiter, S., y otros, Cancer Res 70, 9031 (2010)). En resumen, 5 x 105 Los esplenocitos se cultivaron durante la noche a 37 °C en placas de 96 pocillos multiscreen recubiertas con anti-INF-y (10 jg/ml, clon AN18, Mabtech) (Millipore) y se detectó la secreción de citocinas con un anticuerpo anti-IFN-y (1 jg/mL, clon R4-6A2, Mabtech). Para la estimulación, se agregaron 2 jg/m l de péptido o se cubrieron simultáneamente las células del bazo con 5 x 104 células dendríticas singénicas derivadas de la médula ósea (BMDC) transfectadas con ARN. Para el análisis de los linfocitos que se infiltran en el tumor, se dejaron reposar suspensiones de células individuales de metástasis pulmonar durante la noche para eliminar las células tumorales vivas mediante adherencia plástica. Las células viables se separaron mediante centrifugación en gradiente de densidad. Todas las células recuperadas se añadieron a la placa ELISpot. Para el análisis de las respuestas de las células T en sangre periférica, se aislaron PBMC mediante centrifugación en gradiente de densidad, se contaron y se reestimularon mediante la adición de péptido y BMDC singénicas. La subtipificación de las respuestas de las células T se realizó mediante la adición de un anticuerpo bloqueante del MHC clase II (20 |jg/ml, clon M5/114, BioXcell). Todas las muestras se analizaron por duplicado o triplicado.

Análisis de citometría de flujo se utilizó para determinar el subtipo de células T reactivas a la mutación. En presencia de Brefeldin A (Sigma-Aldrich) 2x106 los esplenocitos se estimularon con 2x105 BMDC transfectada con ARN o péptido 2 jg/ml. Como control positivo, los esplenocitos se trataron con 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA, 0,5 jg/ml, Sigma-Aldrich) y lonomicina (1 jg/ml, Sigma-Aldrich). Las células se incubaron 5 ha 37 °C y subsecuentemente se tiñeron para CD4+ y CD8+ marcador de superficie celular. Las células se permeabilizaron y se fijaron mediante el uso de BD Cytofi Cytoperm de acuerdo con el protocolo del fabricante y posteriormente se tiñeron para las citocinas INF-Y, TNF-a e IL-2 (BD Biosciences). Secreción de citocinas entre CD4+ o CD8+ las células T en las muestras estimuladas se compararon con las muestras de control (medio, ARN irrelevante o péptido irrelevante) para determinar el subtipo de células T que respondieron (n=5). Se prepararon leucocitos infiltrantes de tumores a partir de tumores B16F10 subcutáneos como se describió previamente (PMID: 2071934). La suspensión celular resultante se tiño para ^{marcadores de superficie CD4,}cD8, ^{Gr-1 y CD11b. La tinción intracelular de FoxP3 se realizó de acuerdo con el}protocolo del fabricante (Mouse Foxp3 Buffer Set, BD). Las muestras se adquirieron en un BD FACSCanto II.

Inmunohistoquímica. Los pulmones de los ratones portadores de tumor CT26 se fijaron durante la noche en una solución de formaldehído tamponada con fosfato al 4 % (Carl Roth) y se embebieron en parafina. Se tiñeron secciones consecutivas de 50 jm (3 por ratón) para CD3 (clon SP7, Abcam), CD4 (clon 1, cat# 50l34-M08H, Sino Biologinal) y FoxP3 (policlonal, cat# NB100-39002, Novus Biologicals) después de la detección por un anticuerpo conjugado con HRP (Poli-HRP-anti-IgG de conejo, ImmunoLogic) y el sustrato de peroxidasa correspondiente (Vector Nova Red, Vector Laboratories) y contrateñido con hematoxilina. CD3+, CD4+, FoxP3+ y las áreas tumorales se capturaron en un Axio Scan.ZI (Zeiss) y las regiones tumorales y pulmonares predefinidas manualmente se cuantificaron mediante un software de análisis de imágenes computarizado (Tissue Studio 3,6,1, Definiens).

Tinción por inmunofluorescencia. Los órganos crioconservados se cortaron en secciones de 8 jm y se unieron a portaobjetos Superfrost. Las secciones se secaron durante la noche a temperatura ambiente (TA) y se fijaron en paraformaldehído (PFA) al 4 % durante 10 min a TA en la oscuridad. Las secciones se lavaron 3 veces con PBS y se bloquearon mediante el uso de PBS suplementado con 1 % de BSA, 5 % de suero de ratón, 5% de suero de rata y 0,02 % de Nonident durante 1 hora a TA en la oscuridad. Los anticuerpos marcados con fluorescencia (FoxP3, clon ^{FJK-16s, eBioscience; CD8, clon 53-6.7, BD; CD4, clon RM4-5,}bD) ^{se diluyeron en tampón de tinción (PBS}suplementado con BSA al 1 %, suero de ratón al 5 % y 0,02 % No identificados) y las secciones se tiñeron durante la noche a 4 °C. Después de lavar dos veces con tampón de lavado (PBS suplementado con 1 % de BSA y 0,02 % de no identificados) y una vez con PBS, los portaobjetos se tiñeron durante 3 min con Hoechst (Sigma), se lavaron 3 veces con PBS, una vez con agua destilada y se montaron mediante el uso medio de montaje Flouromount G (eBioscience). Las imágenes de inmunofluorescencia se adquirieron mediante el uso de un microscopio de epifluorescencia (ApoTome, Zeiss). Las áreas manchadas de tumores, CD4, CD8 y FoxP3 se cuantificaron dentro de regiones tumorales predefinidas manualmente mediante un software de análisis de imágenes computarizado (Tissue Studio 3.6.1., Definiens)

Estadística. Las medias se compararon mediante el uso de la prueba t de Student para dos grupos. Para la comparación de medias en más de dos grupos se aplicó ANOVA de una vía con la prueba de Tukey. El área bajo la curva (AUC) para la comparación de la dinámica de crecimiento del tumor se determinó para ratones individuales por grupo y se mostró como mediana. Las diferencias estadísticas en las medianas entre dos grupos se calcularon con una prueba U de Mann-Whitney no paramétrica. El beneficio de supervivencia se determinó con la prueba del orden logarítmico. Todos los análisis fueron de dos colas y se llevaron a cabo mediante el uso de GraphPad Prism 5.03. ns: P>0,05, *: P < 0,05, **: P < 0,01, ***: P <0.001. Se usó la prueba de Grubb para la identificación de valores atípicos (alfa = 0,05).

Ejemplo 2: Epítopos de células T restringidos por MHC clase II en vacunas de neoepítopo

A. Caracterización de subtipos de células T reactivas frente a epítopos mutados

Recientemente, describimos un flujo de trabajo para el mapeo completo de mutaciones no sinónimas del tumor B16F10 por NGS (Figura 1a) (Castle, J. C., y otros, Cancer Res 72, 1081 (2012)). Se inmunizaron ratones C57BL/6 portadores de tumores con péptidos sintéticos 27mer que codifican el epítopo mutado (mutación en la posición 14), dando como resultado respuestas de células T que confieren en vivo control de tumores. Como continuación de ese trabajo, ahora caracterizamos las respuestas de las células T contra los epítopos mutados, comenzando con aquellos con una alta posibilidad de unión al MHC I. Los ratones se vacunaron con péptidos epítopos sintéticos mutados de 27 mer (Figura ^{1b, arriba a la derecha). Sus esplenocitos se probaron en}IFN-y ^{ELISpot para identificar mutaciones inmunogénicas}para un análisis adicional del subtipo y la expresión de citocinas (Figura 1a). Se encontró que aproximadamente el 30 % de los epítopos mutados inducen células T secretoras de citocinas reactivas a la mutación en ratones (Figura 1b). Sorprendentemente, las respuestas contra casi todos los epítopos mutados (16/17, 95 %) fueron de CD4+ Tipo de células T (Figura 1b, Tabla 1).

Tabla 1 Mutaciones inmunogénicas de B16F10. Mutaciones de B16F10 determinadas como inmunogénicas tras la inmunización con péptidos o ARN (como se describe en la Figura 1). (WT, tipo salvaje; AA#, número de aminoácidos mutados; Mut, Mutación)

Para excluir cualquier sesgo asociado con un formato de vacuna basada en péptidos, este experimento se repitió mediante el uso in vitro ARNm transcrito (IVT) que codifica los epítopos mutados (gráfico superior derecho de la figura 1c). Las reactividades de las células T determinadas con estos monotopos de ARN fueron en gran medida comparables a los datos obtenidos con péptidos sintéticos (Figura 1c, Tabla 1), con un número algo menor de epítopos inmunogénicos (aproximadamente un 25 %). Es importante destacar que también en este contexto la mayoría de las respuestas inmunitarias específicas de mutación (10/12, ~80 %) fueron conferidos por CD4+ células T.

Ampliamos nuestro estudio al modelo CT26 de carcinoma de colon inducido químicamente (Griswold, D.P. y Corbett, T.H., Cancer 36, 2441 (1975)) en ratones BALB/c, en los que recientemente identificamos más de 1680 mutaciones no sinónimos (Castle, J. C., y otros, BMC Genomics 15, 190 (2014)). Seleccionamos 96 mutaciones en función de sus propiedades de unión al MHC clase I predichas. En analogía con el estudio B16F10, la mitad de los candidatos eran buenos aglutinantes ("puntuación baja" 0,1 -2,1). La otra mitad se eligió deliberadamente por su escasa unión al MHC I ("puntuación alta" > 3,9). En total, aproximadamente el 20 % de los epítopos mutados fueron inmunogénicos en ratones inmunizados con los respectivos monotopos de ARN (gráfico circular de la figura 1d, tabla 2). Es de destacar que en el subgrupo de MHC "bajo" califico un par de CDS+ se identificaron epítopos inductores de células T, lo que no fue el caso en el subgrupo de puntuación "alta" (Figura 1d a la derecha). Aparentemente, esto no sesgó contra los epítopos restringidos del MHC clase II, ya que estos estaban representados con una frecuencia similar en ambos subgrupos que constituyen la mayoría de las mutaciones inmunogénicas de CT26 (16/21, 80 %).

Tabla 2 Mutaciones inmunogénicas de CT26. Mutaciones de CT26 determinadas como inmunogénicas tras la inmunización con ARN (como se describe en la Figura 1). (WT, tipo salvaje; AA#, número de aminoácidos mutados; Mut, Mutación)

En una nota similar, al analizar todas las respuestas inmunitarias a los monotopos de ARN que representan las 38 mutaciones que identificamos en el modelo de carcinoma mamario 4T1, casi el 70 % de los epítopos reconocidos fueron reconocidos por CD4+ células T (datos no mostrados; Tabla 3).

Tabla 3 Mutaciones inmunogénicas de 4T1. Mutaciones de 4T1 determinadas como inmunogénicas tras la inmunización con ARN (como se describe en la Figura 1). (WT, tipo salvaje; AA#, número de aminoácidos mutados; Mut, Mutación)

Por lo tanto, hemos encontrado en tres modelos de tumores de ratón independientes en diferentes antecedentes de MHC que una fracción considerable de mutaciones de cáncer no sinónimas son inmunogénicas y que, de manera bastante inesperada, el mutanoma inmunogénico es reconocido predominantemente por CD4+ células T.

B. Mutaciones cancerosas restringidas del MHC clase II como dianas de la vacuna

Para investigar si las mutaciones de cáncer restringidas por MHC clase II son buenos objetivos de vacuna in vivo, se procedió a usar ARN sintético como formato de vacuna. El ARN sintético que codifica antígenos está emergiendo como una tecnología de vacunas prometedora debido a sus ventajas, incluyendo su capacidad para suministrar más de un epítopo, su captación selectiva por las células presentadoras de antígenos (APC) y su adyuvancia intrínseca (Diken, M. y otros, Gene Ther 18, 702 (2011); Kreiter, S., y otros, Curr Opin Immunol 23, 399 (2011); Pascolo, S., Handb Exp Pharmacol, 221 (2008)); Sahin, U., y otros, Nat Rev Drug Discov 13, 759 (2014); Van, L. S., y otros, Hum Vaccin Immunother 9 (2013)). Nuestro grupo ha desarrollado ARN farmacológicamente optimizado (elementos estabilizadores en secuencia de ARN y formulación liposomal), que mientras tanto ha alcanzado la etapa de prueba clínica (NCT01684241) (Holtkamp, S. y otros, Blood 108, 4009 (2006); Kreiter, S., y otros, J Immunol 180, 309 (2008); Kuhn, A. N., y otros, Gene Ther 17 de 961 (2010)). Diseñamos ARN que codifica B16-M30, uno de los epítopos identificados en el modelo de tumor B16F10. B16-M30 provocó CD4 fuerte+ se demostró que las respuestas de las células T, que no reconocieron el péptido de tipo salvaje (Figura 2a a la izquierda) como el aminoácido mutado, eran esenciales para el reconocimiento de las células T (Figura 2a a la derecha). Cuando se vacunaron repetidamente ratones C57BL/6 que portaban el tumor B16F10 con el monotopo de ARN B16-Mt30, el crecimiento del tumor se retrasó profundamente (Figura 2b). La mitad de los ratones tratados con ARN B16-M30 seguían vivos 120 días después de la vacunación contra el tumor, mientras que todos los ratones tratados con ARN de control murieron dentro de 65 días.

De manera similar, la vacunación repetida en un modelo de metástasis pulmonar con células B16F10 transducidas con luciferasa reveló una erradicación eficiente de las metástasis con a Rn B16-M30, pero no con ARN sintético de control en la gran mayoría de ratones, como se muestra mediante imágenes de bioluminiscencia (BLI) (Figura 2c). De manera consistente, los leucocitos infiltrantes de tumores purificados de tumores B16F10 de ratones inmunizados con ARN B16-M30 mostraron una fuerte reactividad contra B16-M30 (Figura 2d).

En conjunto, estos datos establecen a B16-M30 como un nuevo antígeno de rechazo principal en los tumores B16F10. También ejemplifican que la inmunización con ARN que codifica un único epítopo mutado inmunogénico puede dar lugar a células T funcionales. Estas células parecen ser capaces de dirigirse al control de activación de la lesión cancerosa e incluso curar en modelos de tumores murinos. Nuestros hallazgos están de acuerdo con informes recientes que apoyan el papel fundamental de inmunidad de células T CD4+en el control del cáncer (Schumacher, T., y otros, Nature 512, 324 (2014); Tran, E., y otros, Science 344, 641 (2014)).

Dado que la gran mayoría de las mutaciones son exclusivas del paciente individual, aprovechar el mutanoma como fuente de antígenos de la vacuna requiere un enfoque activamente individualizado (Britten, C. M., y otros, Nat Biotechnol 31, 880 (2013)). En este sentido, uno de los principales desafíos es fabricar instantáneamente una vacuna personalizada a pedido. Esto se puede abordar de manera viable mediante la tecnología de vacunas de ARN. Fabricar el ARN basado en in vitro la transcripción suele tardar unos días (Figura 3a). En la actualidad, el material de grado GMP podría estar listo para su lanzamiento dentro de tres semanas y este proceso se optimiza continuamente para reducir la duración. En otra nota, aunque hemos demostrado la erradicación del tumor en modelos de ratón con una sola mutación, lo ideal sería combinar varias mutaciones en una vacuna polineoepitópica. Esto nos permitiría abordar varios factores que contrarrestan el éxito clínico de las vacunas en humanos, como la heterogeneidad del tumor y la inmunoedición (Gerlinger, M. y otros, N Engl J Med 366, 883 (2012); Koebel, C. M. y otros, Nature 450, 903 (2007)).

A la luz de estas consideraciones, exploramos cómo usar nuestros conocimientos sobre epítopos inmunogénicos para desarrollar un concepto de vacuna contra el cáncer que llamamos "inmunoterapia de ARN modificada por ingeniería genética" (MERIT) (Figura 3a). Para probar este concepto, seleccionamos cuatro mutaciones restringidas de MHC clase II (CT26-M03, CT26-M20, CT26-M27, CT26-M68) y una de MHC clase I (CT26-M19) derivadas del modelo CT26 (ver Tabla 2) y diseñamos monotopos de ARN que codifican cada una de ellas. Además, se diseñó un pentatopo de ARN sintético que codifica los cinco epítopos mutados conectados por enlazadores glicina/serina no inmunogénicos 10 mer para evitar la generación de epítopos de unión (Figura 3a). Al inmunizar ratones BALB/c vírgenes, encontramos que la cantidad de células T productoras de IFN provocadas por el pentatopo era comparable a la evocada por el monotopo respectivo para tres de estas mutaciones (figura 3b). Sin embargo, para dos de estas mutaciones, el ARN del pentatopo fue significativamente superior en células T específicas de mutaciones en expansión robusta.

Evaluamos la eficacia antitumoral de las respuestas inmunitarias provocadas por las vacunas de ARN pentatópico en un modelo de metástasis de tumores transfectados con luciferasa CT26 (CT26-Luc). Se vacunaron repetidamente ratones BALB/c portadores de tumores con una mezcla de dos pentatopos de ARN (3 epítopos restringidos de MHC clase I y 7 clase II) que incluían las mutaciones ensayadas en el experimento anterior. El crecimiento tumoral en ratones vacunados se inhibió significativamente según lo medido por BLI del pulmón (Figura 3c a la izquierda). En el día 32, todos los ratones del grupo del pentatopo de ARN estaban vivos, mientras que el 80 % de los ratones de control ya habían muerto (figura 3c a la mitad). El análisis de imágenes macroscópico post mortem (figura 3c derecha), histológico (figura 3d derecha) y computarizado (datos no mostrados) de secciones de tejido reveló una carga tumoral significativamente menor en los ratones vacunados en comparación con los controles no tratados. Las lesiones tumorales de ratones vacunados con ARN pentatopo se infiltraron enérgicamente con CD3+ Células T, mientras que el número de células T CD3 fue significativamente menor en los tejidos pulmonares circundantes. Los tumores de los controles no tratados mostraron tinción de células CD3+ que no era muy diferente a la del tejido pulmonar circundante en términos de cantidad y principalmente en el borde del tumor, pero no dentro del tumor. (Figura 3d).

En conjunto, estos hallazgos indican que las células T contra cada epítopo individual se provocan con un enfoque MERIT que emplea vacunas de ARN que codifican poli-neo-epítopos. Estas células T se dirigen a las lesiones tumorales, reconocen sus dianas mutadas y dan como resultado un control tumoral eficiente en vivo.

C. Selección de mutaciones que tienen inmunidad antitumoral

Una de las cuestiones clave es cómo seleccionar las mutaciones con mayor probabilidad de inducir una inmunidad antitumoral eficiente. Nosotros (Figura 1d derecha) y otros (Matsushita, H., y otros, Nature 482, 400 (2012); Robbins, P. F., y otros, Nat Med 19, 747 (2013); van, R. N., y otros, J Clin Oncol 31, e439-e442 (2013)) han demostrado que las puntuaciones de unión del MHC clase I permiten el enriquecimiento de candidatos a epítopos mutados que provocan respuestasCD8+ y rechazo de tumores (Duan, F., y otros, J Exp Med 211, 2231 (2014)). Nuestros hallazgos descritos anteriormente indican que el MHC clase II presentó epítopos mutados incluso puede ser de mayor interés para un enfoque MERIT. De hecho, un análisis de correlación reveló que las mutaciones inmunogénicas tienen una puntuación de unión al MHC clase II significativamente mejor en comparación con las no inmunogénicas (Figura 4a). La mayoría de los cánceres carecen de expresión de MHC clase II. Reconocimiento efectivo de neoepítopos por CD4+ las células T en tumores negativos para MHC clase II deben depender de la liberación de antígenos tumorales para ser captadas y presentadas por las células presentadoras de antígeno (APC). Esto debería ser más eficiente para antígenos con una expresión muy abundante. Para probar esta hipótesis, implementamos un algoritmo que combina una buena unión al MHC clase II con una expresión abundante del ARNm que codifica el epítopo mutado. Para el último, usamos lecturas confirmadas de secuenciación de ARN mutado normalizadas al recuento de lecturas general (NVRC: recuentos de lectura de variantes normalizadas). Clasificamos los datos del mutanoma CT26 con este algoritmo y seleccionamos las diez mutaciones principales (mutaciones 'ME' en la Tabla 4) que se predice que son buenos aglutinantes del MHC clase II entre los epítopos candidatos más abundantes (NVRc >60). Como control elegimos diez mutaciones basadas únicamente en la expresión abundante (mutaciones 'E' en la Tabla 4). Lo más importante es que estos epítopos fueron usado sin más pruebas de prevalidación o inmunogenicidad para diseñar dos pentatopos de ARN para cada grupo (P^mey P^epentatopos). Cuando se vacunaron ratones con tumores pulmonares CT26-Luc establecidos con estos epítopos, P^meen comparación con P^elos pentatopos indujeron una respuesta de células T mucho más fuerte (Figura 4c). Las metástasis pulmonares establecidas fueron completamente rechazadas en casi todos los ratones, mientras que P^elos pentatopos no pudieron conferir control del crecimiento tumoral (Figura 4b).

Tabla 4 Predicción in silico de mutaciones de CT26 con expresión abundante y propiedades de unión al MHC clase II favorables. Mutaciones de CT26 seleccionadas por su alta expresión con consideración (ME) o sin (E) del rango percentil del MHC II (IEDB consenso versión 2,5). (WT, tipo salvaje; AA#, número de aminoácidos mutados; Mut, Mutación)

Las células Th específicas de antígeno promueven el cebado cruzado de respuestas CTL específicas de tumores mediante la concesión de licencias de células dendríticas mediada por ligando CD40. Esto puede resultar en la propagación del antígeno si Th las células reconocen su antígeno en la misma APC que presenta de forma cruzada un epítopo CTL no relacionado (Bennett, S. R., y otros, Nature 393, 478 (1998); Schoenberger, S. P., y otros, Nature 393, 480 (1998)). Congruentemente, en la sangre y el bazo de ratones inmunizados con Pme pero no Pe pentatopos detectamos CD8 fuerte+ respuestas de células T contra gp70-AHl, un epítopo CTL inmunodominante bien caracterizado derivado del antígeno de superficie celular endógeno relacionado con el virus de la leucemia murina (Figura 4d). Esto indica que las células Th específicas de neoepítopos de cáncer, en analogía con las células T específicas de neoantígeno viral (Croxford, J. L., y otros, Autoimmun Rev 1, 251 (2002)), pueden ejercer su función antitumoral mediante la propagación de antígenos y el aumento de las respuestas de CTL

D. Resumen

En resumen, nuestros datos indican que los epítopos de células T restringidos por MHC clase II son abundantes en el mutanoma del cáncer y pueden usarse para personalizar vacunas de poli-neo-epítopo basadas en ARN con un efecto terapéutico sustancial en modelos de tumores de ratón.

El mecanismo responsable de la alta tasa de CD4+ el reconocimiento de mutaciones por parte de las células T aún no está claro. Una explicación simple puede ser el tamaño más largo y variable de los péptidos presentados en las moléculas de MHC de clase II en comparación con los epítopos de MHC de clase I, lo que aumenta la posibilidad de que una mutación esté cubierta por el péptido respectivo. Los epítopos de células T presentados por moléculas de MHC clase I son típicamente péptidos de entre 8 y 11 aminoácidos de longitud con N y C-termino bien definidos. Las moléculas de MHC clase II presentan péptidos más largos de 13-17 aminoácidos de longitud con una región de unión al núcleo de MHC II de 9 aminoácidos y un número variable de aminoácidos flanqueantes adicionales, ambos contribuyendo al reconocimiento por células T CD4+ (Arnold, P. Y., y otros, J Immunol 169, 739 (2002)).

Mientras que la primera evidencia del CD8 espontáneo+ y CD4+ Las respuestas de células T dirigidas contra productos génicos mutados en pacientes con cáncer se generaron en la década de 1990 (Dubey, P. y otros, J Exp Med 185, 695 (1997); Lennerz, V., y otros, Proc Natl Acad Sci USA 102, 16013 (2005); Wolfel, T., y otros, Science 269, 1281 (1995)), solo las publicaciones recientes de alto nivel han creado una amplia aceptación del enorme potencial de las células T específicas de mutación para conferir actividad antitumoral en pacientes con cáncer (Lu, Y. C., y otros, J Immunol 190, 6034 (2013); Schumacher, T., y otros, Nature 512, 324 (2014); Tran, E., y otros, Science 344, 641 (2014)). Para evaluar si los principios que desentrañamos en los modelos de ratón para el melanoma, el colon y el cáncer de mama son ciertos en el entorno humano, analizamos los datos de mutación y RNA-Seq en los mismos tres tipos de cáncer humano proporcionados por The Cancer Genome Atlas (TCGA). Para los tres tipos de cáncer humano, confirmamos la abundancia de mutaciones que se predice que se unirán al MHC clase II que revelamos en modelos de ratón (Figura 4.e).

El enfoque MERIT que presentamos aquí integra avances en el campo de secuenciación de próxima generación, inmunología computacional y genómica sintética y, de esta manera, proporciona la tecnología integrada para la explotación integral del repertorio de objetivos de neoepítopos. Dirigirse a múltiples mutaciones a la vez puede, al menos en teoría, allanar el camino para resolver problemas críticos en el desarrollo actual de fármacos contra el cáncer, tal como la heterogeneidad clonal y el escape de antígenos (Kroemer, G. y Zitvogel, L., Oncoinmunology 1, 579 (2012); Mittal, D., y otros, Curr Opin Immunol 27, 16 (2014)).

Mientras tanto, sobre la base de este estudio y nuestro trabajo previo, se ha iniciado la traducción clínica y se ha realizado un primer ensayo conceptual en pacientes con melanoma (Castle, J. C. y otros, Cancer Res 72, 1081 (2012); Castle, J. C. y otros, Sci Rep 4, 4743 (2014); Lower, M., y otros, PLoS Comput Biol 8, el002714 (2012)) está reclutando activamente (NCT02035956) y confirma que la producción "justo a tiempo" de una vacuna contra el cáncer de ARNm poli-neo-epítopo es de hecho factible.

Ejemplo 3: Selección de mutaciones que tienen inmunidad antitumoral

Para seleccionar/clasificar las modificaciones de la secuencia de aminoácidos, se puede proceder de la siguiente manera:

1. Dentro de una lista dada de mutaciones puntuales no sinónimos, calcule una secuencia peptídica que tenga el aminoácido mutado en el medio y esté flanqueada por hasta 13 aminoácidos en el extremo N y C-terminal, respectivamente; esto se llamará 27mer en el siguiente texto (la longitud de cada secuencia flanqueante puede ser menor que 13 aminoácidos cuando la mutación está cerca del extremo N o C de la proteína completa)

2. Calcular puntuaciones de consenso de predicción de unión al MHC clase II (por ejemplo, mediante el uso de las herramientas de predicción de células T de IEDB [Wang P y otros (2010) BMC Bioinformatics. 11: 568. PMID: 21092157. http://tools.immuneepitope.org/mhcii/]) para cada subsecuencia con solapamiento de 15 nt de largo de cada 27 mer; la mejor puntuación (= la más baja) se asigna a la totalidad de los 27mer

Claims

REIVINDICACIONES

Un método para predecir una o más modificaciones de aminoácidos inmunogénicos que son útiles para la vacunación, en donde las modificaciones se encuentran en una proteína que comprende un neoantígeno asociado a tumor de un paciente, el método comprende las etapas:

a) determinar una puntuación para la unión de un péptido modificado que es un fragmento de una proteína modificada a una o más moléculas MHC clase II de dicho paciente,

b) determinar una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada, en donde determinar la puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada comprende determinar el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y determinar la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación, en donde la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se determina por determinación de la frecuencia de la variante alélica, y

c) predecir una o más modificaciones de aminoácidos inmunogénicos,

en donde la puntuación para la unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II refleja una probabilidad de unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II,

en donde la frecuencia de la variante alélica es la suma de secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación y portan la mutación dividida por la suma de todas las secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación,

en donde para determinar una puntuación para la expresión o abundancia de una proteína modificada, una puntuación para el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación se multiplica por una puntuación para la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación,

en donde la predicción de modificaciones de aminoácidos inmunogénicos se refiere a una predicción de si un péptido que comprende dichas modificaciones de aminoácidos será inmunogénico y, por tanto, útil como epítopo en la vacunación.

Un método para seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos inmunogénicos que son útiles para la vacunación, en donde las modificaciones se encuentran en una proteína que comprende un neoantígeno asociado a tumor de un paciente, el método comprende las etapas:

a) determinar una puntuación para la unión de un péptido modificado que es un fragmento de una proteína modificada a una o más moléculas MHC clase II de dicho paciente,

b) determinar una puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada, en donde determinar la puntuación para la expresión o abundancia de la proteína modificada comprende determinar el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y determinar la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación, en donde la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se determina por determinación de la frecuencia de la variante alélica,

en donde el método comprende realizar las etapas a) y b) en dos o más modificaciones diferentes, y en donde el método comprende además la etapa:

c) seleccionar y/o clasificar modificaciones de aminoácidos inmunogénicos útiles para la vacunación, en donde la puntuación para la unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II refleja una probabilidad de unión de dicho péptido a dicha molécula de MHC clase II,

en donde la frecuencia de la variante alélica es la suma de secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación y portan la mutación dividida por la suma de todas las secuencias detectadas, en lecturas particulares, que cubren el sitio de mutación,

en donde para determinar una puntuación para la expresión o abundancia de una proteína modificada, una puntuación para el nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación se multiplica por una puntuación para la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación.

El método de la reivindicación 2, que comprende comparar las puntuaciones de dichas dos o más modificaciones diferentes, en donde, preferentemente, las puntuaciones de dichas dos o más modificaciones diferentes se comparan mediante la clasificación de las modificaciones diferentes por sus puntuaciones de unión al MHC clase II.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende realizar la etapa a) en dos o más péptidos modificados diferentes, dichos dos o más péptidos modificados diferentes comprenden la(s) misma(s) modificación(ones).

5. El método de la reivindicación 4, en donde

los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) comprenden fragmentos diferentes de una proteína modificada, dichos fragmentos diferentes comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) presente(s) en la proteína, y/o

los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) comprenden fragmentos diferentes potenciales de unión al MHC clase II de una proteína modificada, dichos fragmentos comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) presente(s) en la proteína, y/o

los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) difieren en la longitud y/o la posición de la(s) modificación(ones).

6. El método de la reivindicación 4 o 5 que comprende además seleccionar (el) péptido(s) modificado(s) de los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) que tienen una probabilidad o tienen la probabilidad más alta de unirse a una o más moléculas de MHC clase II.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde la mejor puntuación para la unión a una o más moléculas de MHC clase II de los dos o más péptidos modificados diferentes que comprenden la(s) misma(s) modificación(ones) se asigna a la(s) modificación(ones).

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha determinación del nivel de expresión de la proteína a la que está asociada la modificación y/o la determinación de la frecuencia de la proteína modificada entre la proteína a la que está asociada la modificación se realiza en el nivel de ARN.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el péptido modificado comprende un fragmento de la proteína modificada, dicho fragmento comprende la modificación presente en la proteína.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además identificar mutaciones no sinónimas en una o más regiones codificantes de proteínas.

11. El método de cualquiera de acuerdo con la reivindicación de 1 a 10, en donde las modificaciones de aminoácidos se identifican por secuenciación parcial o completa del genoma o transcriptoma de una o más células tal como una o más células cancerosas y opcionalmente una o más células no cancerosas e identificación de mutaciones en una o más regiones codificantes de proteínas.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde dichas mutaciones son mutaciones somáticas y/o mutaciones cancerosas.