CN113484523A - 预测可用于疫苗接种的t细胞表位 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预测可用于疫苗接种的T细胞表位的方法.特别地，本发明涉及用于预测肽或多肽(例如肿瘤相关新抗原)中的修饰是否具有免疫原性并且特别地是否可用于疫苗接种或者用于预测这样的修饰中哪些最具免疫原性并且特别地最可用于疫苗接种的方法.本发明的方法特别地可用于提供对患者的肿瘤具有特异性的疫苗并且因此可用于个性化癌症疫苗的情况。

Description

预测可用于疫苗接种的T细胞表位
本申请是申请号为201680010134.9的发明名称为“预测可用于疫苗接种的T细胞表位”的中国专利申请的分案申请，原申请是2016年02月09日提交的PCT国际申请PCT/EP2016/052684于2017年08月11日进入中国国家阶段的申请.
技术领域
本发明涉及用于预测可用于疫苗接种的T细胞表位的方法.特别地，本发明涉及用于预测肽或多肽(例如肿瘤相关新抗原)中的修饰是否具有免疫原性并且特别地是否可用于疫苗接种或者用于预测这样的修饰中哪些最具免疫原性并且特别地最可用于疫苗接种的方法.本发明的方法特别地可用于提供对患者的肿瘤具有特异性的疫苗，并且因此可用于个性化癌症疫苗的情况.
背景技术
突变被认为是用于癌症免疫治疗的理想靶标。作为在任何健康组织中都严格缺乏表达的新表位，预期其是安全的并且可避开中心耐受(central tolerance)机制.然而，突变用于疫苗方案的系统性用途由于每位患者的肿瘤中突变库(“突变组(mutanome)”)的独特性而受到阻碍(Alexandrov，L.B.，等，Nature 500，415(2013)).我们最近已提出了靶向个体突变谱的个性化免疫治疗方案(Castle，J.C.，等，Cancer Res 72，1081(2012))。
然而，这需要预测表位(特别是新表位)是否诱导高效免疫并且因此可用于疫苗接种的模型。
在此，我们在三个独立的鼠肿瘤模型中显示非同义癌症突变中的相当大部分具有免疫原性，并且出乎意料地免疫原性突变组主要由CD4+T细胞(“CD4+免疫组”)识别.用这样的CD4+免疫原性突变体进行疫苗接种赋予强抗肿瘤活性.受这些发现的激励，我们建立了这样的方法，其包括通过外显子组(exome)测序进行突变检测，通过对预测表达丰富并且是良好MHC II类结合剂的突变表位进行单独生物信息学优先排序(prioritization)来选择疫苗靶标，以及迅速产生编码多种这些突变表位的合成mRNA疫苗.我们表明，用这样的多聚新表位mRNA疫苗进行疫苗接种在小鼠中诱导了强大肿瘤控制并且建立的侵袭性生长肿瘤被完全排斥。此外，我们证明，CD4+T细胞新表位疫苗接种在携带肿瘤的小鼠中诱导针对独立免疫显性抗原的CTL应答，表明抗原扩散的综合效果(orchestration).最后，通过用相同的生物信息学算法分析对应的人癌症类型，我们还示出预测与MHC II类结合的突变体在人癌症中的丰度.因此，在此介绍的定制免疫治疗方案可被视为用于综合利用癌症的巨大新表位靶标库从而能够用“准时制(just in time)”产生的疫苗靶向每位患者的肿瘤的普遍适用蓝图.
发明内容
发明概述
在一个方面，本发明涉及用于预测免疫原性氨基酸修饰的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定为经修饰蛋白质之片段的经修饰肽与一种或更多种MHC II类分子结合的评分，以及
b)确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分.
在一个实施方案中，与一种或更多种MHC II类分子结合的评分指示与一种或更多种MHC II类分子结合，以及经修饰蛋白质之表达或丰度的评分指示经修饰蛋白质表达、高水平表达或丰富，则表明所述修饰或经修饰肽具有免疫原性.
在另一个方面，本发明涉及用于选择免疫原性氨基酸修饰和/或对其进行排名的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定为经修饰蛋白质之片段的经修饰肽与一种或更多种MHC II类分子结合的评分，以及
b)确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分，
其中所述方法包括对两种或更多种不同修饰进行步骤a)和b).
在一个实施方案中，不同修饰存在于相同和/或不同蛋白质中.
在一个实施方案中，所述方法包括比较所述两种或更多种不同修饰的评分.在一个实施方案中，如下比较所述两种或更多种不同修饰的评分：通过不同修饰的MHC II类结合评分对其进行排名，并去除表达丰度小于给定阈值的修饰.
在本发明所有方面的一个实施方案中，与一种或更多种MHC II类分子结合的评分反映与一种或更多种MHC II类分子结合的可能性.在一个实施方案中，与一种或更多种MHCII类分子结合的评分通过包括与MHC II类结合甚序的数据库进行序列比较的方法来确定.
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述方法包括对两种或更多种不同经修饰肽进行步骤a)，所述两种或更多种不同经修饰肽包含相同修饰.在一个实施方案中，包含相同修饰的两种或更多种不同经修饰肽包含经修饰蛋白质的不同片段，所述不同片段包含存在于蛋白质中的相同修饰.在一个实施方案中，包含相同修饰的两种或更多种不同经修饰肽包含经修饰蛋白质的不同潜在MHC II类结合片段，所述片段包含存在于蛋白质中的相同修饰.在一个实施方案中，所述方法还包括从包含相同修饰的两种或更多种不同经修饰肽中选择具有与一种或更多种MHC II类分子结合的可能性或最高可能性的经修饰肽.在一个实施方案中，包含相同修饰的两种或更多种不同经修饰肽在长度和/或修饰位置方面不同.在一个实施方案中，将包含相同修饰的两种或更多种不同经修饰肽与一种或更多种MHC II类分子结合的最佳评分分配给该修饰.
在本发明所有方面的一个实施方案中，确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分包括确定与修饰相关之蛋白质的表达水平以及确定经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的频率.在一个实施方案中，所述确定与修饰相关之蛋白质的表达水平和/或确定经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的频率在RNA水平上进行.在一个实施方案中，经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的频率通过确定变体等位基因频率来确定.在一个实施方案中，变体等位基因频率为覆盖突变位点并且携带突变的检测序列、特别是读序之和除以覆盖该突变位点的所有检测序列、特别是读序之和。在一个实施方案中，变体等位基因频率为在突变位点的突变核苷酸之和除以在该突变位点确定的所有核苷酸之和.在一个实施方案中，为了确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分，将与修饰相关之蛋白质的表达水平的评分乘以经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的频率的评分。
在本发明所有方面的一个实施方案中，经修饰肽包含经修饰蛋白质的片段，所述片段包含存在于蛋白质中的修饰.
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述方法还包括鉴定一个或更多个蛋白质编码区中的非同义突变.
在本发明所有方面的一个实施方案中，如下鉴定氨基酸修饰：对一个或更多个细胞(例如一个或更多个癌细胞和任选地一个或更多个非癌细胞)的基因组或转录物组部分地或完全地测序，并鉴定一个或更多个蛋白质编码区中的突变.在一个实施方案中，所述突变体细胞突变.在一个实施方案中，所述突变是癌症突变.
在本发明所有方面的一个实施方案中，所述方法用于制备疫苗.在一个实施方案中，疫苗来自于通过所述方法预测为具有免疫原性或更具免疫原性的修饰或经修饰肽.
在一个实施方案中，特别地为了提供用于患者(例如癌症患者)的个性化疫苗，所述患者中存在修饰，并且对所述患者进行所述确定与一种或更多种MHC II类分子结合的评分以及所述确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分.优选地，所述患者中存在所述一种或更多种MHC II类分子(在该实施方案中，本发明可包括确定所述患者的部分或完全MHC II表达模式).优选地，对来自所述患者的样品(例如肿瘤样品)进行所述确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分.
在另一个方面，本发明涉及用于提供疫苗的方法，其包括以下步骤：通过本发明方法来鉴定预测为具有免疫原性或更具免疫原性(与还分析的其他修饰或经修饰肽相比)的修饰或经修饰肽.在一个实施方案中，所述方法还包括以下步骤：
提供疫苗，所述疫苗包含含有预测为具有免疫原性或更具免疫原性的修饰或经修饰肽的肽或多肽或者编码所述肽或多肽的核酸.
在另一个方面，本发明提供了疫苗，其能够使用根据本发明的方法获得.这样的疫苗的一些优选实施方案在本文中进行了描述.
根据本发明提供的疫苗可包含可药用载体并且可任选地包含一种或更多种佐剂、稳定剂等。疫苗可以是治疗性或预防性疫苗的形式。
另一个方面涉及用于在患者中诱导免疫应答的方法，其包括向患者施用根据本发明提供的疫苗.
另一个方面涉及治疗癌症患者的方法，其包括以下步骤：
(a)使用根据本发明的方法来提供疫苗；以及
(b)向患者施用所述疫苗。
另一个方面涉及治疗癌症患者的方法，其包括向患者施用根据本发明的疫苗.
在另一些方面，本发明提供了本文中所述的疫苗，其用于本文中所述的治疗方法，特别地用于治疗或预防癌症.
本文中所述的癌症治疗可与外科手术切除和/或放射和/或传统化学治疗组合.
本发明的其他特征和优点由以下详细描述和权利要求书将变得显而易见。
发明详述
虽然在下文对本发明进行详细描述，但是应理解，本发明不限于本文中所述的具体方法、方案和试剂，因为这些可以变化。还应理解，本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，并非旨在限制本发明的范围，本发明的范围将仅所附权利要求书限定.除非另外限定，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与由本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。
在下文，将对本发明的要素进行说明.这些要素随具体实施方案而列出，然而应理解，其可以以任何方式和以任意数量组合而产生另外的实施方案.多种描述的实例和优选实施方案不应该被解释为仅将本发明限制为明确描述的实施方案.这种描述应被理解为支持并涵盖将明确描述的实施方案与任意数量的所公开和/或优选要素组合的实施方案.此外，除非上下文另外指出，否则本申请中所有描述要素的任意排列和组合应被认为由本申请的说明书公开.
优选地，本文中使用的术语如“A multilingual glossary of biotechnologicalterms：(IUPAC Recommendations)”，H.G.W.Leuenberger，B.Nagel和H.
Figure BSA0000244595330000051
编辑，(1995)Helvetica Chimica Acta，CH-4010 Basel，Switzerland中所述进行定义.
除非另外指出，否则本发明的实施将采用生物化学、细胞生物学、免疫学和重组DNA技术中的常规方法，其在本领域的文献中进行了说明(参见，例如Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第2版，J.Sambrook等编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor 1989).
在本说明书和所附权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则词语“包括/包含”及其变化形式将被理解为意指包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，但是不排除任何其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，尽管在一些实施方案中可以排除这样的其他成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组，即主题在于包括所述成员、整数或步骤或者成员、整数或步骤的组.除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在权利要求书的上下文中)使用的没有数量词修饰的名词应被解释为涵盖一个/种或更多个/种.本文中数值范围的记载仅意在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的简写方法.除非本文中另外指出，否则每个单独的值均被并入本说明书中，如同其在本文中被单独记载一样。
除非本文中另外指出或另外与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法都可以以任何合适的顺序进行.本文中提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅旨在更好地举例说明本发明，而不对以其他方式要求保护的本发明范围构成限制。说明书中的语言都不应被解释为指示实施本发明所必需的任何未要求保护的要素。
在本说明书的正文通篇引用了数篇文件.本文中不管是在上文还是下文引用的每篇文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商的说明书、指南等)均在此通过引用整体并入本文.本文中没有内容应被解释为承认本发明无权由于在先发明而早于这些公开内容.
根据本发明，术语“肽”指这样的物质，其包含两个或更多个、优选3个或更多个、优选4个或更多个、优选6个或更多个、优选8个或更多个、优选10个或更多个、优选13个或更多个、优选16个或更多个、优选21个或更多个并且多至优选8、10、20、30、40或50个、特别是100个通过肽键共价连接的氨基酸.术语“多肽”或“蛋白质”指大的肽，优选指具有多于100个氨基酸残基的肽，但一般而言，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是同义词，并且在本文中可互换使用。
根据本发明，与肽、多肽或蛋白质相关的术语“修饰”指与亲本序列，例如野生型肽、多肽或蛋白质的序列相比的肽、多肽或蛋白质的序列变化.该术语包括氨基酸插入变体、氨基酸添加变体、氨基酸缺失变体和氨基酸替换变体，优选氨基酸替换变体。根据本发明的所有这些序列变化都可潜在地产生新表位.
氨基酸插入变体在特定氨基酸序列中包含单个或两个或更多个氨基酸的插入.
氨基酸添加变体包含一个或更多个氨基酸，例如1、2、3、4或5个或者更多个氨基酸的氨基和/或羧基末端融合。
氨基酸缺失变体以从序列中去除一个或更多个氨基酸，例如以去除1、2、3、4或5个或者更多个氨基酸为特征.
氨基酸替换变体以在序列中去除至少一个残基并且该位置插入另外残基为特征.
根据本发明，用于在本发明方法中测试的修饰或经修饰肽可来自于包含修饰的蛋白质。
根据本发明，术语“来自于”意指特定实体，特别是特定肽序列存在于其所来自于的物体。在氨基酸序列，特别是特定序列区域的情况下，“来自于”特别地意指相关氨基酸序列来自于其所在的氨基酸序列.
用于在本发明方法中测试的修饰或经修饰肽可来自于的包含修饰的蛋白质可以是新抗原.
根据本发明，术语“新抗原”指与亲本肽或蛋白质相比包含一个或更多个氨基酸修饰的肽或蛋白质.例如，新抗原可以是肿瘤相关新抗原，其中术语“肿瘤相关新抗原”包括由于肿瘤特异性突变而包含氨基酸修饰的肽或蛋白质.
根据本发明，术语“肿瘤特异性突变”或“癌症特异性突变”指存在于肿瘤细胞或癌细胞的核酸中但不存在于对应的正常细胞，即非肿瘤细胞或非癌细胞的核酸中的体细胞突变.术语“肿瘤特异性突变”和“肿瘤突变”与术语“癌症特异性突变”和“癌症突变”在本文中可互换使用.
术语“免疫应答”指针对靶标(例如抗原)的综合机体响应，并且优选地指细胞免疫应答或细胞以及体液的免疫应答。免疫应答可以是保护性的/防止性的/预防性的和/或治疗性的.
“诱导免疫应答”可意指在诱导之前不存在免疫应答，但其还可意指在诱导之前存在一定水平的免疫应答并且在诱导之后所述免疫应答被增强.因此，“诱导免疫应答”还包括“增强免疫应答”.优选地，在对象中诱导免疫应答之后，所述对象被保护免于发生疾病，例如癌症疾病，或者通过诱导免疫应答，疾病状况得以改善.例如，可在患有癌症疾病的患者中或在处于发生癌症疾病风险之中的对象中诱导针对肿瘤表达抗原的免疫应答.在这种情况下诱导免疫应答可意味着改善对象的疾病状况、对象不发生转移或者处于发生癌症疾病风险之中的对象不发生癌症疾病。
术语“细胞免疫应答”和“细胞应答”或类似术语指涉及用作“助手”或“杀手”的T细胞或T淋巴细胞以用MHC I类或II类呈递抗原为特征的针对细胞的免疫应答.辅助T细胞(也称为CD4+T细胞)通过调节免疫应答来发挥中心作用，杀伤细胞(也称为细胞毒性T细胞、细胞裂解性T细胞、CD8+T细胞或CTL)杀死患病细胞，例如癌细胞，从而防止产生更多的患病细胞.在一些优选实施方案中，本发明涉及刺激针对肿瘤细胞的抗肿瘤CTL应答，所述肿瘤细胞表达一种或多种肿瘤表达抗原并且优选地用MHC I类呈递这些肿瘤表达抗原。
根据本发明的“抗原”涵盖为抗体或T淋巴细胞(T细胞)之靶标和/或诱导与抗体或T淋巴细胞(T细胞)的免疫应答(例如特异性反应)的任何物质，优选肽或蛋白质。优选地，抗原包含至少一种表位，例如T细胞表位。优选地，在本发明的上下文中，抗原是这样的分子，其任选地在加工之后诱导优选地对该抗原(包括表达该抗原的细胞)具有特异性的免疫反应.抗原或其T细胞表位优选地在MHC分子背景下通过细胞，优选地通过抗原呈递细胞呈递，这产生针对该抗原(包括表达该抗原的细胞)的免疫应答，所述抗原呈递细胞包括患病细胞，特别是癌细胞.
在一个实施方案中，抗原是肿瘤抗原(在本文中还称为肿瘤表达抗原)，即肿瘤细胞的一部分，例如在肿瘤细胞中表达的可从细胞质、细胞表面或细胞质获得的蛋白质或肽，特别是主要在细胞内产生或作为肿瘤细胞的表面抗原产生的那些。例如，肿瘤抗原包括癌胚胎抗原、α1-胎蛋白异铁蛋白和胚胎性硫糖蛋白(fetal sulphoglycoprotein)、α2-H-铁蛋白以及γ-胎蛋白.根据本发明，肿瘤抗原优选地包含在肿瘤或癌症以及肿瘤细胞或癌细胞中表达并且任选地在肿瘤或癌症以及肿瘤细胞或癌细胞的类型和/或表达水平方面具有特征性的任何抗原，即肿瘤相关抗原。在一个实施方案中，术语“肿瘤相关抗原”指在正常条件下在有限量的组织和/或器官中或在特定发育阶段特异性表达并且在一个或更多个肿瘤或癌组织中表达或异常表达的蛋白质，例如肿瘤相关抗原可在正常条件下在胃组织(优选地在胃黏膜中)、在生殖器官中(例如在睾丸中)、在滋养层组织中(例如在胎盘中)或在种系细胞中特异性表达.在该情况下，“有限量”优选地意指不超过3，更优选不超过2。在本发明上下文中的肿瘤抗原包括例如分化抗原，优选细胞类型特异性分化抗原，即在正常条件下在特定分化阶段在特定细胞类型中特异性表达的蛋白质；癌症/睾丸抗原，即在正常条件下在睾丸中并且有时在胎盘中特异性表达蛋白质；以及种系特异性抗原.优选地，肿瘤抗原或肿瘤抗原的异常表达鉴定癌细胞.在本发明的背景下，对象，例如患有癌症疾病的患者中由癌细胞表达的肿瘤抗原优选地是所述对象中的自身蛋白.在一些优选实施方案中，在本发明上下文中的肿瘤抗原在正常条件下在非必需组织或器官，即当被免疫系统损害时不导致对象死亡的组织或器官中或者在免疫系统不可及或仅很难可及的器官或结构中特异性表达.
根据本发明，术语“肿瘤抗原”、“肿瘤表达抗原”、“癌症抗原”和“癌症表达抗原”是等同术语并且在本文中可互换使用。
术语“免疫原性”指诱导优选地与治疗性治疗，例如针对癌症的治疗相关的免疫应答的相对效果.本文中使用的术语“免疫原性的”指具有免疫原性的特性.例如，当在肽、多肽或蛋白质的背景下使用时，术语“免疫原性修饰”指所述肽、多肽或蛋白质诱导由所述修饰引起的和/或针对所述修饰的免疫应答的效果.优选地，未经修饰的肽、多肽或蛋白质不诱导免疫应答、诱导不同的免疫应答或者诱导不同的水平，优选较低水平的免疫应答.
根据本发明，术语“免疫原性”或“免疫原性的”优选地指诱导生物学相关免疫应答，特别是可用于疫苗接种的免疫应答的相对效果.因此，在一个优选实施方案中，如果氨基酸修饰或经修饰肽在对象中诱导针对靶修饰的免疫应答，则其是免疫原性的，所述免疫应答可对治疗或预防目的具有益处.
术语“主要组织相容性复合体”和缩写“MHC”包括MHC I类和MHC II类分子，并且指存在于所有脊椎动物中的基因复合体。MHC蛋白或分子在免疫反应中对淋巴细胞和抗原呈递细胞或患病细胞之间的信号传导具有重要意义，其中MHC蛋白或分子与肽结合并将其呈递于被T细胞受体识别.由MHC编码的蛋白在细胞表面上表达，并且向T细胞展现出自身抗原(来自细胞本身的肽片段)和非自身抗原(例如，入侵微生物的片段)的T细胞.
MHC区域被分成三个亚组：I类、II类和III类.MHC I类蛋白包含α链和β2微球蛋白(由15号染色体编码的非MHC部分).其将抗原片段呈递于细胞毒性T细胞。在大多数免疫系统细胞上，特别是在抗原呈递细胞上，MHC II类蛋白包含α-和β链并且将呈递抗原片段呈递于T辅助细胞-MHC III类区域编码其他免疫组分，例如补体组分，一些编码细胞因子。
MHC是多基因的(存在数个MHC I类和MHC II类基因)并且是多态性的(每个基因存在多种等位基因).
本文中使用的术语“单倍型(haplotype)”指存在于一条染色体上的HLA等位基因及由其编码的蛋白质.单倍型还可指存在于MHC内任一个基因座的等位基因.每类MHC由数个基因座表示：例如，对于I类，HLA-A(人白细胞抗原-A)、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J、HLA-K、HLA-L、HLA-P和HLA-V；以及对于II类，HLA-DRA、HLA-DRB1-9、HLA-、HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DPA1、HLA-DPB1、HLA-DMA、HLA-DMB、HLA-DOA和HLA-DOB.术语“HLA等位基因”和“MHC等位基因”在本文中可互换使用。
MHC表现出极端多态性：在人群体内，在每个遗传基因座存在大量包含不同等位基因的单倍型.I类和II类二者的不同多态性MHC等位基因具有不同的肽特异性：每种等位基因编码与表现出特定序列模式的肽结合的蛋白质.
在本发明所有方面的一个优选实施方案中，MHC分子是HLA分子.
根据本发明，MHC II类HLA包括HLA-DM、HLA-DO、HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR.
在本发明的上下文中，术语“MHC结合肽”包括MHC I类和/或II类结合肽或者可被加工产生MHC I类和/或II类结合肽的肽.在I类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为8至12、优选8至10个氨基酸，但是更长或更短的肽也可以是有效的.在II类MHC/肽复合物的情况下，结合肽的长度通常为9至30、优选10至25个氨基酸，并且特别地长度为13至18个氨基酸，而更长和更短的肽也可以是有效的.
如果肽被直接呈递，即不经加工，特别是不经切割就呈递，则其具有适于与MHC分子，特别是I类MHC分子结合的长度，并且长度优选地为7至30个氨基酸长，例如长度为7至20个氨基酸，更优选地长度为7至12个氨基酸，更优选地长度为8至11个氨基酸，特别地长度为9或10个氨基酸.
如果肽是包含另外序列的较大实体，例如疫苗序列或多肽的一部分，并且将在加工之后，特别是在切割之后被呈递，则通过加工产生的肽具有适于与MHC分子，特别是I类MHC分子结合的长度，并且优选地长度为7至30个氨基酸，例如长度为7至20个氨基酸，更优选地长度为7至12个氨基酸，更优选地长度为8至11个氨基酸，特别地长度为9或10个氨基酸.优选地，将在加工之后被呈递的肽的序列来自于用于疫苗接种的抗原或多肽的氨基酸序列，即其序列与该抗原或多肽的片段基本上对应并且优选地完全相同。
因此，在一个实施方案中，MHC结合肽包含与抗原的片段基本上对应并且优选地完全相同的序列.
术语“表位”指分子(例如抗原)中的抗原决定簇，即指特别地在MHC分子背景下被呈递时该分子中被免疫系统识别，例如被T细胞识别的部分或片段.蛋白质(例如肿瘤相关抗原)的表位优选地包含所述蛋白质的长度优选地为5至100、优选5至50、更优选8至30、最优选10至25个氨基酸的连续部分或不连续部分，例如表位的长度优选地可为9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸.特别优选的是，在本发明上下文中的表位是T细胞表位.
根据本发明，表位可与MHC分子，例如细胞表面上的MHC分子结合，并且因此可以是“MHC结合肽”.
本文中使用的术语“新表位”指在参考细胞(例如正常的非癌细胞或种系细胞)中不存在但见于癌细胞中的表位.这特别地包括以下情况，其中在正常的非癌细胞或种系细胞中发现对应的表位，然而由于癌细胞中的一种或更多种突变，该表位的序列改变而产生新表位.
如文中使用的术语“T细胞表位”指被T细胞受体识别的结构中与MHC分子结合的肽.通常来说，T细胞表位存在于抗原呈递细胞的表面上.
本文中使用的术语“预测免疫原性氨基酸修饰”指预测包含这样的氨基酸修饰的肽是否具有免疫原性并且因此可在疫苗接种中用作表位，特别是T细胞表位.
根据本发明，T细胞表位可作为包含多于一种T细胞表位的较大实体(例如疫苗序列和/或多肽)的一部分存在于疫苗中.呈递的肽或T细胞表位在适当地加工之后产生.
T细胞表位可在对TCR识别或与MHC结合非必需的一个或更多个残基处被修饰。这样的经修饰T细胞表位可被认为是免疫学等效的。
优选地，T细胞表位当被MHC呈递并且被T细胞受体识别时能够在合适共刺激信号存在下诱导携带特异性地识别肽/MHC复合物的T细胞受体的T细胞克隆扩增.
优选地，T细胞表位包含基本上对应于抗原片段的氨基酸序列的氨基酸序列。优选地，所述抗原片段是MHC I类和/或II类呈递的肽.
根据本发明的T细胞表位优选地指抗原中能够刺激针对该抗原或者针对以表达该抗原为特征并且优选地以呈递该抗原为特征的细胞(例如，患病细胞，特别是癌细胞)的免疫应答，优选细胞应答的部分或片段.优选地，T细胞表位能够刺激针对以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞的细胞应答，并且优选地能够刺激抗原响应性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
“抗原加工”或“加工”指肽、多肽或蛋白质被降解成为所述肽、多肽或蛋白质之片段的加工产物(例如，多肽被降解成肽)，并且使这些片段中一个或更多个与MHC分子相连(例如，通过结合)用于被细胞，优选抗原呈递细胞呈递于特定T细胞.
“抗原呈递细胞”(antigen presenting cell，APC)是呈递与其细胞表面上的MHC分子相连的蛋白质抗原的肽片段的细胞。一些APC可激活抗原特异性T细胞.
专职抗原呈递细胞在通过吞噬或通过受体介导的内吞内化抗原并随后在其膜上展现与II类MHC分子结合的抗原片段方面非常高效.T细胞识别抗原呈递细胞膜上的抗原-II类MHC分子复合物并与之相互作用.然后，抗原呈递细胞产生共刺激信号，导致激活T细胞.共刺激分子的表达是专职抗原呈递细胞的限定特征.
专职抗原呈递细胞的主要类型是树突细胞，其具有最宽范围的抗原呈递，并且可能是最重要的抗原呈递细胞；巨噬细胞；B细胞；以及某些活化的上皮细胞.树突细胞(DC)是通过MHC II类和I类两种抗原呈递途径将外周组织中捕获的抗原呈递于T细胞的白细胞群体.众所周知的是，树突细胞是免疫诱导的有效诱导剂，并且这些细胞的活化是诱导抗肿瘤免疫的关键步骤。树突细胞常规被分类为“未成熟细胞”和“成熟细胞”，其可用作区分两种充分表征的表型的简单方式。然而，这种命名不应解释为排除所有可能的中间分化阶段。未成熟树突细胞表征为具有高抗原摄取和加工能力的抗原呈递细胞，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达相关.成熟表型通常以这些标志物的低表达但是导致T细胞活化的细胞表面分子的高表达为特征，所述细胞表面分子例如I类和II类MHC、黏附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB).树突细胞成熟指这样的抗原呈递树突细胞导致T细胞致敏的树突细胞活化状态，而通过未成熟树突细胞的呈递导致耐受.树突细胞成熟主要由具有被先天受体检测的微生物结构的生物分子(细菌DNA、病毒RNA、内毒素等)、促炎细胞因子(TNF、IL-1、IFN)、树突细胞表面上的CD40被CD40L连接以及从正经受压迫细胞死亡的细胞中的物质引起.树突细胞可通过将骨髓细胞在体外与例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)和肿瘤坏死因子α的细胞因子一起培养来获得。
非专职抗原呈递细胞不组成型地表达与天然T细胞相互作用所需的MHC II蛋白，这些仅在非专职抗原呈递细胞被某些细胞因子(例如IFNγ)刺激之后表达.
抗原呈递细胞可通过用编码包含待呈递肽的肽或多肽的核酸(优选RNA)转导细胞而装载有MHC I类呈递肽，所述核酸例如编码用于疫苗接种的抗原或多肽的核酸.
在一些实施方案中，可向患者施用包含靶向树突细胞或其他抗原呈递细胞的核酸递送载剂的药物组合物或疫苗，实现体内发生的转染.树突细胞的体内转染例如一般可使用本领域已知的任何方法，例如WO 97/24447中所述的那些来进行，或者使用Mahvi等，Immunology and cell Biology 75：456-460，1997所述的基因枪方案来进行。
根据本发明，术语“抗原呈递细胞”还包括靶细胞.
“靶细胞”应意指为免疫应答(例如细胞免疫应答)的靶标的细胞.靶细胞包括呈递抗原，即来自于抗原的肽片段的细胞，并且包括任何不期望的细胞，例如癌细胞.在一些优选实施方案中，靶细胞是表达本文中所述的抗原的细胞，并且优选地用I类MHC呈递所述抗原.
术语“段(portion)”指片段.对于例如氨基酸序列或蛋白质的特定结构，术语其“段”可指所述结构的连续或不连续片段.优选地，氨基酸序列的段包含所述氨基酸序列的至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、优选至少40％、优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、甚至更优选至少80％并且最优选至少90％的氨基酸.优选地，如果该段是不连续片段，则所述不连续片段由结构的2、3、4、5、6、7、8份或更多份构成，每份为该结构的连续组分.例如，氨基酸序列的不连续片段可由所述氨基酸序列的2、3、4、5、6、7、8份或更多份，优选不超过4份构成，其中每份优选地包含该氨基酸序列的至少5个连续氨基酸、至少10个连续氨基酸、优选至少20个连续氨基酸、优选至少30个连续氨基酸。
术语“部分”和“片段”在本文中可互换使用，并且指连续元件。例如，例如氨基酸序列或蛋白质的结构的一部分指所述结构的连续元件.结构的段、部分或片段优选地包含所述结构的一种或更多种功能特性。例如，表位、肽或蛋白质的段、部分或片段优选地与其所来自于的表位、肽或蛋白质免疫学等效.在本发明的上下文中，例如氨基酸序列的结构的“部分”优选地包含整体结构或氨基酸序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％、至少98％、至少99％，优选地由其组成.
在本发明的上下文中，术语“免疫反应性细胞”指在免疫反应期间发挥效应功能的细胞.“免疫反应性细胞”优选地能够与抗原或者以呈递抗原或其肽片段(例如，T细胞表位)为特征的细胞结合，并且介导免疫应答.例如，这样的细胞分泌细胞因子和/或趋化因子，分泌抗体，识别癌细胞并任选地消除这些细胞.例如，免疫反应性细胞包含T细胞(细胞毒性T细胞、辅助T细胞、肿瘤浸润性T细胞)、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突细胞.优选地，在本发明的上下文中，“免疫反应性细胞”是T细胞，优选CD4+和/或CD8+T细胞。
优选地，“免疫反应性细胞”以一定程度的特异性识别抗原或其肽片段，特别是如果在MHC分子背景下在例如抗原呈递细胞或患病细胞(例如癌细胞)的表面上呈递。优选地，所述识别使识别抗原或其肽片段的细胞能够具有响应性或反应性.如果细胞是携带在MHCII类分子背景下识别抗原或其肽片段的受体的辅助T细胞(CD4+T细胞)，则这样的响应性或反应性可涉及释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞.如果细胞是CTL，则这样的响应性或反应性可涉及例如通过凋亡或穿孔素介导的细胞裂解来消除在MHC I类分子背景下呈递的细胞，即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞.根据本发明，CTL响应性可包括持续的钙通量、细胞分裂、细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)产生、活化标志物(例如CD44和CD69)上调、以及抗原表达靶细胞的特异性细胞裂解性杀伤.CTL响应性还可使用精确地指示CTL响应性的人工报道子来确定.这样的识别抗原或抗原片段并且具有响应性或反应性CTL在本文中还称为“抗原响应性CTL”.如果细胞是B细胞，则这样的响应性可涉及释放免疫球蛋白.
术语“T细胞”和“T淋巴细胞”在本文中可互换使用并且包括T辅助细胞(CD4+T细胞)和包括细胞裂解性T细胞的细胞毒性T细胞(CTL，CD8+T细胞)。
T细胞属于称为淋巴细胞的白细胞组群，并且在细胞介导的免疫中起关键作用。其与其他淋巴细胞类型(例如B细胞和自然杀伤细胞)的区别之处可在于在其细胞表面上存在称为T细胞受体(TCR)的特殊受体.胸腺是负责T细胞成熟的主要器官.已发现T细胞的数个不同亚群，其各自均具有独特的功能.
T辅助细胞在免疫过程中辅助其他白细胞，除其他功能之外还包括使B细胞成熟为浆细胞以及活化细胞毒性T细胞和巨噬细胞.这些细胞由于其在其表面上表达CD4蛋白而还被称为CD4+T细胞.辅助T细胞当抗原呈递细胞(APC)表面上表达的MHC II类分子向其呈递肽抗原时变得激活。一旦激活，其迅速分裂并分泌在活性免疫应答中起调节或辅助作用的称为细胞因子的小蛋白。
细胞毒性T细胞破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且还参与移植物排斥.这些细胞由于在其表面上表达CD8糖蛋白而还被称为CD8+T细胞.这些细胞通过结合与MHC I类相连的抗原来识别其靶标，MHC I类存在于机体的几乎每个细胞的表面上.
大多数T细胞具有作为数种蛋白质的复合体存在的T细胞受体(TCR)。实际T细胞受体由两条单独的肽链构成，两条单独的肽链由独立的T细胞受体α和β(TCRα和TCRβ)基因产生并且称为α-和β-TCR链。γδT细胞(gamma delta T细胞)代表T细胞中在表面上具有独特T细胞受体(TCR)的一个小亚群。然而，在γδT细胞，TCR由一个γ链和一个γδ链构成。与αβT细胞相比，该T细胞组群较不常见(总T细胞的2％)。
T细胞活化中的第一信号通过T细胞受体与另一细胞上由MHC呈递的段肽结合来提供.这确保仅具有对该肽特异性之TCR的T细胞被激活。配偶体细胞通常是抗原呈递细胞，例如专职抗原呈递细胞，在天然应答的情况下通常为树突细胞，但是B细胞和巨噬细胞也可以是重要的APC.
根据本发明，如果分子对所述预定靶标具有显著亲和力并且在标准测定中与所述预定靶标结合，则其能够与靶标结合。“亲和力”或“结合亲和力”通常通过平衡解离常数(KD)来测量.如果分子对靶标不具有显著亲和力并且在标准测定中不与靶标显著结合，则其(基本上)不能够与所述靶标结合。
细胞毒性T淋巴细胞可通过在体内向抗原呈递细胞中引入抗原或其肽片段来体内产生.抗原或其肽片段可作为蛋白质、作为DNA(例如在载体内)或作为RNA被呈递。抗原可被加工以产生用于MHC分子的肽配偶体，而其片段则无需进行进一步加工即可呈递.如果这些可与MHC分子结合，则特别地是后一种情况。一般来说，可通过皮内注射来向患者施用.然而，还可结内进行注射到淋巴结中(Maloy等(2001)，Proc Natl Acad Sci USA 98：3299-303)。产生的细胞呈递目的复合物并被随后增殖的自体同源细胞毒性T淋巴细胞识别.
CD4+或CD8+T细胞的特异性活化可以以多种方式来检测.用于检测特异性T细胞活化的方法包括检测T细胞的增殖、细胞因子(例如，淋巴因子)的产生或细胞裂解活性的产生.对于CD4+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测T细胞增殖。对于CD8+T细胞，用于检测特异性T细胞活化的优选方法是检测细胞裂解活性的产生.
“以呈递抗原为特征的细胞”或“呈递抗原的细胞”或者类似表述意指在MHC分子，特别是MHC I类分子背景下呈递其所表达的抗原或者例如通过加工抗原而呈递来自于所述抗原的片段的细胞，例如患病细胞，例如癌细胞，或者抗原呈递细胞.类似地，术语“以呈递抗原为特征的疾病”表示涉及以呈递抗原，特别地以I类MHC呈递抗原为特征之细胞的疾病.细胞的抗原呈递可通过用编码抗原的核酸(例如RNA)转染细胞来实现.
“所呈递抗原的片段”或类似表述意指所述片段例如当直接添加至抗原呈递细胞时可由MHC I类或II类，优选MHC I类呈递.在一个实施方案中，所述片段是由表达抗原的细胞天然呈递的片段。
术语“免疫学等效的”意指免疫学等效分子(例如免疫学等效氨基酸序列)表现出相同或基本上相同的免疫学特性和/或发挥相同或基本上相同的免疫学作用，例如对于免疫学作用的类型，例如诱导体液和/或细胞应答、所诱导免疫反应的强度和/或持续时间、或者所诱导免疫反应的特异性等.在本发明的上下文中，术语“免疫学等效的”优选地针对用于免疫接种的肽的免疫学作用或特性使用.例如，如果氨基酸序列在暴露于对象的免疫系统时诱导具有与参考氨基酸序列反应的特异性的免疫反应，则所述氨基酸序列与该参考氨基酸序列免疫学等效.
在本发明的上下文中，术语“免疫效应子功能”包括由免疫系统的组分介导的任何功能，其导致例如杀死肿瘤细胞或者抑制肿瘤生长和/或抑制肿瘤发展，包括抑制肿瘤播散和/或转移.优选地，在本发明的上下文中，免疫效应子功能是T细胞介导的效应子功能.这样的功能在辅助T细胞(CD4+T细胞)的情况下包括抗原或抗原片段在MHC II类分子背景下被T细胞受体识别、释放细胞因子和/或激活CD8+淋巴细胞(CTL)和/或B细胞，并且在CTL的情况下包括抗原或抗原片段在MHC I类分子背景下被T细胞受体识别、通过例如凋亡或穿孔素介导的细胞裂解消除在MHC I类分子背景下呈递的细胞(即以用I类MHC呈递抗原为特征的细胞)、产生细胞因子(例如IFN-γ和TNF-α)以及表达抗原的靶细胞的特异性杀死.
根据本发明，术语“评分”指测试或检测的通常用数值表示的结果。例如“评分较佳”或“评分最佳”的术语指测试或检测的较佳结果或最佳结果。
根据本发明，对经修饰肽根据其与MHC II类结合的预测能力并且根据经修饰肽所来源的经修饰蛋白质的表达或丰度进行评分.一般来说，与MHC II类结合的预测能力较低的肽相比，与MHC II类结合的预测能力较高的肽评分较佳.此外，与对应经修饰蛋白质的表达或丰度较低的肽相比，对应经修饰蛋白质的表达或丰度较高的肽评分较佳。
术语例如“预测”指可能性的确定。
根据本发明，确定肽与一种或更多种MHC II类分子结合的评分包括确定肽与一种或更多种MHC II类分子结合的可能性。
肽与一种或更多种MHC II类分子结合的评分可使用任何肽：MHC结合预测工具来确定，例如，可使用免疫表位数据库分析资源(IEDB-AR：http：//tools.iedb.org).
预测通常针对见于患者中的MHC II类分子组，例如不同MHC II类等位基因的组，例如所有可能的MHC II类等位基因或者MHC II类等位基因组或亚组来进行.优选地，患者具有这样的修饰，所述修饰的免疫原性需根据本发明确定，或者所述修饰需根据其基于本发明预测的免疫原性来进行选择和/或排名.优选地，本文中所述的疫苗是为了最终提供于所述患者.因此，本发明还包括确定患者的MHC II类表达模式.
本发明还可包括对包含相同修饰和/或不同修饰的不同肽进行本发明的方法。
术语“包含相同修饰的不同肽”在一个实施方案中指包含经修饰蛋白质的不同片段或由其组成的肽，所述不同片段包含存在于该蛋白质中的相同修饰，但是长度和/或修饰位置不同.如果蛋白质在位置x处具有修饰，则所述蛋白质中的各自包含所述蛋白质的覆盖所述位置x的不同序列窗的两个或更多个片段被认为是包含相同修饰的不同肽.
术语“包含不同修饰的不同肽”在一个实施方案中指相同和/或不同蛋白质的包含不同修饰的长度相同和/或不同的肽.如果蛋白质在位置x和y处具有修饰，则所述蛋白质各自包含所述蛋白质的覆盖位置x或位置y的序列窗的两个片段被认为是包含不同修饰的不同肽.
本发明还可包括将具有修饰的蛋白质序列断裂成合适的肽长度用于MHC结合和确定相同和/或不同蛋白质之包含相同和/或不同修饰的不同经修饰肽与一种或更多种MHCII类分子结合的评分，所述修饰的免疫原性需根据本发明确定，或者所述修饰需根据其基于本发明预测的免疫原性来进行选择和/或排名.可对输出进行排名，并且输出可由肽及其指示其结合可能性的预测评分的列表组成.
确定经修饰蛋白质之表达和丰度的评分的步骤可用所有的不同修饰、其子集，例如对与一种或更多种MHC II类分子结合评分最佳的那些修饰，或者仅用对与一种或更多种MHC II类分子结合评分最佳的那些修饰下进行。
在所述进一步的步骤之后，可对结果进行排名，并且结果可由肽以及其指示其具有免疫原性之可能性的预测评分的列表组成.
根据本发明，确定经修饰蛋白之表达或丰度的评分可对患者(例如癌症患者)(例如对患者(例如癌症患者)的肿瘤样品)进行.
根据本发明，确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分可包括确定与修饰相关之蛋白质的表达水平和/或确定编码与修饰相关之蛋白质的RNA的表达水平(其也可指示与修饰相关之蛋白质的表达水平)，以及确定经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的频率和/或确定编码经修饰蛋白质的RNA在编码与修饰相关之蛋白质的RNA中的频率.
经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的频率和/或编码经修饰蛋白质的RNA在编码与修饰相关之蛋白质的RNA中的频率可被认为是经修饰蛋白质在与修饰相关之蛋白质中的比例和/或编码经修饰蛋白质的RNA在编码与修饰相关之蛋白质的RNA中的比例。
根据本发明，术语“与修饰相关之蛋白质”涉及可包含修饰的蛋白质并且包括其未经修饰以及经修饰状态的蛋白质。
根据本发明，术语“表达水平”可指绝对量或相对量.
需根据本发明确定免疫原性的氨基酸修饰，或者需要根据其基于本发明预测的免疫原性来进行选择和/或排名的氨基酸修饰，可由细胞核酸中的突变引起。这样的突变可通过意指已知的测序技术来鉴定.
在一个实施方案中，该突变是癌症患者的肿瘤样品中的癌症特异性体细胞突变，其可通过鉴定肿瘤样品的基因组、外显子组和/或转录物组与非肿瘤发生性样品的基因组、外显子组和/或转录物组之间的序列差异来确定。
根据本发明，肿瘤样品指从包含或怀疑包含肿瘤细胞或癌细胞的患者获得的任何样品，例如机体样品.机体样品可以是任何组织样品，例如血液、从原发肿瘤或从肿瘤转移瘤获得的组织样品、或者包含肿瘤细胞或癌细胞的任何其他样品.优选地，机体样品是血液，并且在血液中包含的一个或更多个循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异。在另一个实施方案中，肿瘤样品涉及一个或更多个分离的肿瘤细胞或癌症细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))或者包含一个或更多个分离的肿瘤细胞或癌症细胞(例如循环肿瘤细胞(CTC))的样品.
非肿瘤发生性样品指从不包含或不怀疑包含肿瘤细胞或癌细胞的患者或者优选地与该患者属于同一物种的另外个体，优选健康个体获得的任何样品，例如机体样品.机体样品可以是任何组织样品，例如血液或来自非肿瘤发生性组织的样品.
本发明可涉及确定患者的癌症突变标志物。术语“癌症突变标志物”可指患者的一个或更多个癌细胞中存在的所有癌症突变，或者其可指患者的一个或更多个癌细胞中存在的仅部分癌症突变.因此，本发明可涉及鉴定患者的一个或更多个癌细胞中存在的所有癌症特异性突变，或者其可涉及鉴定患者的一个或更多个癌细胞中存在的仅部分癌症特异性突变.一般来说，本发明的方法允许鉴定大量突变，这使本发明方法中包括足够量的修饰或经修饰肽。
优选地，根据本发明鉴定的突变是非同义突变，优选肿瘤细胞或癌细胞中表达的蛋白质的非同义突变.
在一个实施方案中，在肿瘤样品的基因组，优选整个基因组中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异.因此，本发明可包括鉴定一个或更多个癌细胞的基因组，优选整个基因组的癌症突变标志物.在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤样品中癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定全基因组癌症突变谱.
在一个实施方案中，在肿瘤样品的外显子组，优选整个外显子组中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异.因此，本发明可包括鉴定一个或更多个癌细胞的外显子组，优选整个外显子组的癌症突变标志物.在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤样品中癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定全外显子组癌症突变谱.
在一个实施方案中，在肿瘤样品的转录物组，优选整个转录物组中确定癌症特异性体细胞突变或序列差异.因此，本发明可包括鉴定一个或更多个癌细胞的转录物组，优选整个转录物组的癌症突变标志物.在一个实施方案中，鉴定癌症患者的肿瘤样品中癌症特异性体细胞突变的步骤包括鉴定全转录物组癌症突变谱.
在一个实施方案中，鉴定癌症特异性体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括对一个或更多个、优选2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或甚至更多个癌细胞进行单细胞测序.因此，本发明可包括鉴定所述一个或更多个癌细胞的癌症突变标志物。在一个实施方案中，所述癌细胞是循环肿瘤细胞。例如循环肿瘤细胞的癌细胞可在单细胞测序之前分离.
在一个实施方案中，鉴定癌症特异性体细胞突变或鉴定序列差异的步骤涉及使用下一代测序(next generation sequencing，NGS).
在一个实施方案中，鉴定癌症特异性体细胞突变或鉴定序列差异的步骤包括对肿瘤样品的基因组DNA和/或RNA进行测序。
为了揭示特异性体细胞突变或序列差异，优选地将由肿瘤样品获得的序列信息与参考(例如由测序正常非癌细胞(例如种系细胞)的核酸(例如DNA或RNA)获得的序列信息)进行比较，所述正常非癌细胞可从患者或不同个体获得.在一个实施方案中，正常的基因组种系DNA从外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)获得。
术语“基因组”指生物体或细胞的染色体中遗传信息的总量.
术语“外显子组”指生物体的基因组中由外显子形成的部分，其是所表达基因的编码部分.外显子组提供用于合成蛋白质及其他功能性基因产物的遗传蓝图.其是基因组的功能最相关部分，并且因此其最有可能影响生物体的表型.人基因组的外显子组估计占总基因组的1.5％(Ng，PC等，PLoS Gen.，4(8)：1-15，2008).
术语“转录物组”指一个细胞或细胞群中产生的所有RNA分子，包括mRNA、rRNA、tRNA以及其他非编码RNA的集合.在本发明的上下文中，转录物组意指给定个体的一个细胞、细胞群(优选癌细胞群)或所有细胞在给定时间点产生所有RNA分子的集合.
“核酸”根据本发明优选地是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、更优选RNA、最优选体外转录的RNA(in vitro transcribed RNA，IVT RNA)或合成的RNA.核酸根据本发明包括基因组DNA、cDNA、mRNA、重组产生的分子和化学合成的分子。根据本发明，核酸可作为单链或双链的线性或共价环状闭合分子存在.核酸根据本发明可以是分离的.术语“分离的核酸”根据本发明意指：(i)核酸是体外扩增的，例如通过聚合酶链反应(PCR)体外扩增的；(ii)核酸是通过克隆扩增产生的；(iii)核酸是经纯化的，例如通过切割并通过凝胶电泳分离而纯化的；或者(iv)核酸是合成的，例如通过化学合成而合成的。核酸可用于引入到细胞中，即细胞转染，特别是可由DNA模板通过体外转录制备的RNA的形式。此外，可在应用之前通过稳定化序列、加帽和多聚腺苷酸化对RNA进行修饰。
术语“遗传物质”指分离的核酸(DNA或RNA)、双螺旋的部分、染色体的部分、或者生物体或细胞的整个基因组，特别是其外显子组或转录物组.
术语“突变”指与参考相比的核酸序列的变化或差异(核苷酸置换、添加或缺失)。“体细胞突变”可发生在体内除生殖细胞(精子和卵子)之外的任何细胞中并且因此不会传代给子代.这些改变可(但不总是)引起癌症或其他疾病.优选地，突变是非同义突变.术语“非同义突变”指不导致翻译产物中氨基酸改变(例如氨基酸替换)的突变，优选核苷酸突变.
根据本发明，术语“突变”包括点突变、插失(Indel)、融合、染色体碎裂(chromothripsis)和RNA编辑.
根据本发明，术语“插失”描述一种特殊的突变种类，其定义为导致共定位的插入和缺失以及核苷酸净提高或损失的突变.在基因组的编码区中，除非插失的长度为3的倍数，否则其产生移码突变.插失可与点突变形成对比，其中插失从序列中插入和缺失核苷酸，点突变是替换一个核苷酸的置换形式.
融合可产生由两个先前分离的基因形成的杂合基因.其可由于易位、中间缺失或染色体倒位而发生.通常，融合基因是癌基因.致癌性融合基因可导致具有新功能或不同于两个融合配偶体的功能的基因产物.或者，原癌基因与强启动子融合，并且由此致癌功能被设定为通过由上游融合配偶体的强启动子引起的上调而起作用.致癌性融合转录物还可通过反式剪接或通读事件产生。
根据本发明，术语“染色体碎裂”指通过单个灾难性事件基因组的特定区域被粉碎并随后拼接在一起的遗传现象。
根据本发明，术语“RNA编辑”或“RNA编辑”指其中通过碱基组成的化学改变来改变RNA分子中的信息内容的分子过程。RNA编辑包括核苷修饰，例如胞苷(C)到尿苷(U)和腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基，以及非模板的核苷酸添加和插入.mRNA中的RNA编辑有效地改变所编码蛋白质的氨基酸序列，使得其与由基因组DNA序列预测的蛋白质不同.
术语“癌症突变标志物”指与非癌性参考细胞相比时存在于癌细胞中的突变组.
根据本发明，“参考”可用于关联和比较由肿瘤样品在本发明方法中获得的结果.通常来说，“参考”可基于从患者或一个或更多个不同个体，优选健康个体，特别是相同物种的个体获得的一个或更多个正常样品，特别是未患癌症疾病的样品来获得.“参考”可凭经验通过测试足够大量的正常样品来确定.
根据本发明可使用任何合适的测序方法来确定突变，优选下一代测序(NGS)技术.第三代测序方法在未来可能替代NGS技术以加速方法的测序步骤.为了说明目的，术语“下一代测序”或“NGS”在本发明的上下文中意指全部的新高通量测序技术，其与称为Sanger化学的“常规”测序方法形成对比，通过将整个基因组断裂成小碎片来沿着整个基因组平行地随机阅读核酸模板.这样的NGS技术(也称为大规模平行测序技术)能够在非常短的时间内，例如在1至2周内，优选地在1至7天内或者最优选在不到24小时内递送整个基因组、外显子组、转录物组(基因组的所有转录序列)或甲基化组(基因组的所有甲基化序列)的核酸序列信息并且在原理上实现单细胞测序方法.在本发明的上下文中可使用可商购获得或文献中提及的多种NGS平台，例如Zhang等2011：The impact of next-generation sequencing ongenomics.J.Genet Genomics 38(3)，95-109中；或者Voelkerding等2009：Nextgeneration sequencing：From basic research to diagnostics.Clinical chemistry55，641-658中详细描述的那些.这样的NGS技术/平台的非限制性实例为：
1)在例如Roche联合公司454 Life Sciences(Branford，Connecticut)的GS-FLX454 Genome SequencerTM中实施的称为焦磷酸测序的边合成边测序技术，其首先在Ronaghi等1998：A sequencing method based on real-time pyrophosphate″.Science 281(5375)，363-365中进行了描述。这项技术使用乳剂PCR，其中通过剧烈涡旋将单链DNA结合珠包封在由油包围的包含PCR反应物的水性胶束中，以用于进行乳剂PCR扩增.在焦磷酸测序过程期间，随着聚合酶合成DNA链，记录在核苷酸并入期间从磷酸分子发射的光；
2)由Solexa(现在为Illumina Inc.，San Diego，California的一部分)开发的边测序变合成方法，其基于可逆染料-终止剂并且例如在Illumina/Solexa GenomeAnalyzerTM中和在Illumina HiSeq 2000 Genome AnalyzerTM中实施.在这项技术中，将全部四种核苷酸与DNA聚合酶一起同时添加到流式细胞通道中的寡聚物引发的簇片段中。桥接扩增用所有四种荧光标记的核苷酸延伸簇链用于进行测序；
3)在例如Applied Biosystems(现在为Life Technologies Corporation，Carlsbad，California)的SOLidTM平台中实施的边连接边测序方法.在这项技术中，根据测序位置标记固定程度的所有可能寡核苷酸的库.使寡核苷酸退火并连接；DNA连接酶对匹配序列的优先连接产生提供在该位置处核苷酸的信息的信号。在测序之前，通过溶剂PCR扩增DNA。将各自均仅包含相同DNA分子的拷贝的所得珠沉积在载玻片上.作为第一个实例，Dover Systems(Salem，New Hampshire)的PolonatorTM G.007平台还采用通过使用随机排列的珠基乳剂PCR来扩增DNA片段用于平行测序的边测序边连接方法；
4)例如，如在Pacific Biosciences(Menlo Park，California)的PacBio RS系统或在Helicos Biosciences(Cambridge，Massachusetts)的HeliScopeTM平台中实施的单分子测序技术.这项技术的独特特征是其能够不经扩增对单DNA或RNA分子进行测序的能力，定义为单分子实时(Single-Molecule Real Time，SMRT)DNA测序.例如，HeliScope使用高灵敏荧光检测系统来直接随着每个核苷酸合成对其进行检测.Visigen Biotechnology(Houston，Texas)已经开发了基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energytransfer，FRET)的类似方法。其他基于荧光的单分子技术来自U.S.Genomics(GeneEngineTM)和Genovoxx(AnyGeneTM)；
5)用于单分子测序的纳米技术，其中使用例如布置在芯片上以监测在复制期间聚合酶分子在单链上的移动的多种纳米结构.基于纳米技术的方法的非限制性实例是OxfordNanopore Technologies(Oxford，UK)的GridONTM平台、由Nabsys(Providence，RhodeIsland)开发的杂交辅助纳米孔测序(hybridization-assisted nano-pore sequencing，HANSTM)平台、以及称为组合探针-锚定连接(combinatorial probe-anchor ligation，cPALTM)的专利连接酶基DNA测序平台与DNA纳米球(DNA nanoball，DNB)技术；
6)用于单分子测序的基于电子显微术的技术，例如由LightSpeed Genomics(Sunnyvale，California)和Halcyon Molecular(Redwood City，California)开发的那些；
7)基于检测在DNA聚合期间释放的氢离子的离子半导体测序。例如，离子激流系统(Ion Torrent System)(San Francisco，California)使用微加工孔的高密度阵列以大规模并行方式进行这一生物化学过程。每个孔容纳不同的DNA模板.在孔之下是离子灵敏层并且在其之下是专有离子传感器.
优选地，DNA和RNA制备物用作NGS的起始物质。这样的核酸可容易地从例如生物材料的样品，例如从新鲜的、迅速冷冻的或福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织(FFPE)或者从新鲜分离的细胞或者从患者外周血中存在的CTC获得.可从正常的体细胞组织提取正常的未突变基因组DNA或RNA，然而在本发明的情况下，种系细胞是优选的.种系DNA或RNA可从患有非血液学恶性肿瘤的患者中的外周血单个核细胞提取.虽然从FFPE组织提取的核酸或新鲜分离的单细胞是高度片段化的，但是其适合NGS应用.
用于外显子组测序的数种靶向NGS在文献中进行了描述(有关综述，参见例如Teer和Mullikin 2010：Human Mol Genet 19(2)，R145-51)，其所有均可与本发明联合使用。这些方法(描述为例如基因组捕获、基因组分隔、基因组富集等)中有很多使用杂交技术并且包括基于阵列(例如，Hodges等2007：Nat.Genet.39，1522-1527)和基于液体的(例如，Choi等2009：Proc.Natl.Acad.Sci USA 106，19096-19101)杂交方法.用于DNA样品制备和后续外显子组捕获的市售试剂盒也是可以获得的，例如Illumina Inc.(San Diego，California)提供TruSeqTMDNA样品制备试剂盒和外显子组富集试剂盒TruSeqTM外显子组富集试剂盒。
为了在将例如肿瘤样品的序列与参考样品的序列(例如种系样品的序列)进行比较时降低检测癌症特异性体细胞突变或序列差异中假阳性发现的数量，优选地重复测定这些样品类型中一种或两种的序列。因此，优选地将参考样品的序列(例如种系样品的序列)确定两次、三次或更多次.作为替代或补充，将种系样品的序列确定两次、三次或更多次。还可如下多于一次地确定参考样品的序列(例如，种系样品的序列)和/或肿瘤样品的序列：将基因组DNA中的序列确定至少一次，并且将所述参考样品和/或所述肿瘤样品的RNA中的序列确定至少一次。例如，通过确定参考样品(例如种系样品)在重复试验之间的变化，可评估假阳性体细胞突变的预期比率(FDR)作为统计量。样品的技术重复应产生相同的结果，并且在该“相同间比较(same vs.same comparison)”中的任何检测到的突变均为假阳性。特别地，为了确定肿瘤样品相对于参考样品中体细胞突变检测的假发现率，可使用参考样品的技术重复作为参考来评估假阳性的数量.此外，可使用机器学习方法来不同的质量相关计量(例如，覆盖率或SNP质量)组合成单质量评分.对于给定的体细胞变异，可计数具有超标质量评分的所有其他变异，这使得能够对数据集中的所有变异进行排名.
在本发明的上下文中，术语“RNA”指包含至少一种核糖核苷酸残基，并且优选地整体上或基本上由核糖核苷酸残基构成的分子.“核糖核苷酸”指在β-D-呋喃核糖基的2’位具有羟基的核苷酸.术语“RNA”包含双链RNA、单链RN、分离的RNA(例如经部分或完全纯化的RNA)、基本上纯的RNA、合成的RNA以及重组产生的RNA，例如经修饰的RNA，其与天然存在RNA的不同之处在于添加、缺失、置换和/或改变一个或更多个核苷酸.这样的改变可包括添加非核苷酸材料，例如向RNA的末端或在内部，例如在RNA的一个或更多个核苷酸处添加非核苷酸材料。RNA分子中的核苷酸还可包含非标准核苷酸，例如非天然存在的核苷酸或化学合成的核苷酸或脱氧核苷酸.这些经改变的RNA可被称为类似物或天然存在RNA的类似物。
根据本发明，术语“RNA”包括并且优选涉及“mRNA”.术语“mRNA”意指“信使RNA”，并且涉及通过使用DNA模板产生且编码肽或多肽的“转录物”。通常来说，mRNA包含5”-UTR、蛋白质编码区和3’-UTR。mRNA在细胞中和在体外仅具有有限的半衰期。在本发明的上下文中，mRNA可由DNA模板通过体外转录产生.体外转录方法是技术人员已知的.例如，多种体外转录试剂盒可商购获得.
根据本发明，可根据需要改变RNA的稳定性和翻译效率。例如，可通过具有稳定化效果和/或提高RNA翻译效率的一种或更多种修饰来稳定化RNA和提高其翻译。这样的修饰例如在PCT/EP2006/009448中进行了描述，其通过引用并入本文.为了提高根据本发明使用的RNA的表达，可在编码区，即编码所表达肽或蛋白质的序列中优选地在不改变所表达肽或蛋白质的序列下对其进行修饰以提高G-C含量从而提高mRNA稳定性和进行密码子优化，并且由此增强在细胞中的翻译。
在本发明中使用的RNA的上下文中，术语“修饰”包括对RNA的非天然存在于所述RNA中的任何修饰.
在本发明的一个实施方案中，根据本发明使用的RNA不具有未加帽的5’-三磷酸.移除这样的未加帽5’-三磷酸可通过用磷酸酶处理RNA来实现.
根据本发明的RNA可具有经修饰的核糖核苷酸以提高其稳定性和/或降低细胞毒性。例如，在一个实施方案中，在根据本发明使用的RNA中，胞苷部分地或完全地，优选完全地被5-甲基胞苷置换。作为替代或补充，在一个实施方案中，RNA根据本发明使用的RNA中，尿苷部分地或完全地，优选完全地被假尿苷置换.
在一个实施方案中，术语“修饰”涉及向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物.术语“5’-帽”指见于mRNA分子的5’端的帽结构，并且一般由通过不常见的5’-5’三磷酸连接与mRNA分子连接的鸟苷核苷酸组成。在一个实施例中，该鸟苷在7-位被甲基化.术语“常规的5’-帽”指天然存在的RNA 5’-帽，优选指7-甲基鸟苷帽(M7G).在本发明的上下文中，术语“5’-帽”包括类似于RNA帽结构并且被修饰以具有稳定化RNA和/或增强RNA翻译(如果附着于RNA的话，优选在体内和/或在细胞中)能力的5’-帽类似物.
向RNA提供5’-帽或5’-帽类似物可通过在所述5’-帽或5’-帽类似物存在下体外转录DNA模板来实现，其中所述5’-帽共转录并入产生的RNA链中，或者可例如通过体外转录产生RNA并可在转录后使用加帽酶(例如痘苗病毒的加帽酶)使5’-帽与RNA连接.
RNA可包含另外的修饰。例如，本发明中使用的RNA的另外修饰可为延伸或截短天然存在的多聚(A)尾或者改变5’-或3’-非翻译区(UTR)，例如引入与所述RNA的编码区不相关的UTR，例如用来自于珠蛋白基因的3’-UTR交换现有的3’-UTR或者插入来自于珠蛋白基因的3’-UTR的一个或更多个，优选两个拷贝，所述球蛋白基因例如α2-珠蛋白、α1-珠蛋白、β-珠蛋白，优选β-珠蛋白，更优选人β-珠蛋白.
与具有经掩盖多聚-A序列的RNA相比，具有未掩盖多聚-A序列的RNA更高效地翻译.术语“多聚(A)尾”或“多聚-A序列”指通常位于RNA分子的3’端的腺嘌呤基(A)残基的序列，并且“未经掩盖多聚-A序列”意指在RNA分子3’端的多聚-A序列以多聚-A序列的A结束，并且除位于多聚-A序列3’端(即下游)的A之外，在此之后没有核苷酸.此外，约120个碱基对的长多聚-A序列产生最佳的转录物稳定性和RNA翻译效率.
因此，为了提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，可对其进行修饰以使其与多聚-A序列联合存在，所述多聚-A序列的长度优选为10至500，更优选30至300，甚至更优选为65至200，尤其是100至150个腺苷残基.在一个尤其优选的实施方案中，多聚-A序列的长度为约120个腺苷残基。为了进一步提高根据本发明使用的RNA的稳定性和/或表达，多聚-A序列可以是未经掩盖的.
此外，向RNA分子的3’-非翻译区中并入3’-非翻译区(UTR)可使得增强翻译效率。通过并入两个或更多个这样的3’-非翻译区可以实现协同效.3’-非翻译区相对于并入其的RNA可以是自体同源或异源的。在一个具体实施方案中，3’-非翻译区来自于人-β珠蛋白基因.
上述修饰的组合对RNA稳定性和翻译效率提高具有协同影响，所述修饰即并入多聚-A序列、暴露多聚-A序列以及并入一个或更多个3’-非翻译区。
术语RNA的“稳定性”涉及RNA的“半衰期”.“半衰期”涉及消除分子的活性、量或数量的一半所需的时间.在本发明的上下文中，RNA的半衰期指示所述RNA的稳定性.RNA的半衰期可影响RNA的“表达持续时间”.可以预期，具有长的半衰期的RNA将表达延长的时间段。
当然，如果根据本发明期望降低RNA的稳定性和/或翻译效率，则可以对RNA进行修饰以干扰如上所述提高RNA的稳定性和/或翻译效率的元件的功能.
根据本发明，术语“表达”以其最一般含义使用并且包括产生RNA和/或肽、多肽或蛋白质，例如，通过转录和/或翻译.关于RNA，术语“表达”或“翻译”特别涉及产生肽、多肽或蛋白质.其还包括核酸的部分表达.此外，表达可以是暂时的或稳定的.
根据本发明，术语表达还包括“异常表达”或“不正常表达”。根据本发明，“异常表达”或“不正常表达”意指与参考，例如未患有与某一蛋白质如肿瘤抗原的异常或不正常表达相关的疾病的对象的状态相比，改变，优选提高表达.表达提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％或至少100％或更多.在一个实施方案中，表达仅存在于患病组织中，同时健康组织中的表达受到抑制.
术语“特异性表达”意指蛋白质基本上仅在特定组织或器官中表达.例如，在胃黏膜中特异性表达的肿瘤抗原意指所述蛋白质主要在胃黏膜中表达，而不在其他组织中表达或者在其他组织或器官类型中不在显著程度上表达.因此，仅在胃黏膜细胞中表达和在任何其他组织如睾丸中在显著较小的程度上表达的蛋白质在胃黏膜细胞中特异性表达.在一些实施方案中，肿瘤抗原也可在正常条件下在多于一种组织类型或器官，例如2或3种组织类型或器官，但优选不超过3种不同的组织或器官类型中特异性表达.在这种情况下，肿瘤抗原然后在这些器官中特异性表达。例如，如果肿瘤抗原在正常条件下，优选在肺和胃中在大致相等的程度上表达，则所述肿瘤抗原在肺和胃中特异性表达。
在本发明的上下文中，术语“转录”涉及将DNA序列中的遗传密码转录成RNA的过程。随后，可将RNA翻译成蛋白质。根据本发明，术语“转录”包括“体外转录”，其中术语“体外转录”涉及优选使用合适的细胞提取物在无细胞体系中体外合成RNA，特别是mRNA的过程.优选地，克隆载体被应用于产生转录物.这些克隆载体通常被指定为转录载体并且根据本发明被术语“载体”所涵盖.根据本发明，本发明中使用的RNA优选为体外转录的RNA(IVT-RNA)并且可通过合适的DNA模板的体外转录获得.用于控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。RNA聚合酶的具体实例是T7、T3和SP6RNA聚合酶.优选地，根据本发明的体外转录由T7或SP6启动子控制.用于体外转录的DNA模板可通过克隆核酸，特别是cDNA，并将其引入用于体外转录的合适载体中而获得.cDNA可通过RNA的逆转录获得.
根据本发明的术语“翻译”涉及细胞核糖体中的过程，通过该过程，一条信使RNA指导氨基酸序列组装以产生肽、多肽或蛋白质.
根据本发明可与核酸功能性地连接的表达控制序列或调控序列相对于核酸可以是同源的或异源的.如果编码序列和调控序列共价结合在一起，使得编码序列的转录或翻译受到调控序列的控制或影响，则它们功能性地连接在一起.如果编码序列待被翻译成调控序列与编码序列功能连接的功能性蛋白质，则调控序列的诱导导致编码序列的转录，而不引起编码序列中的阅读框移位或使得编码序列不能翻译成期望的蛋白质或肽。
根据本发明，术语“表达控制序列”或“调控序列”包含控制核酸转录或得到的RNA翻译的启动子、核糖体结合序列和其他控制元件.在本发明的某些实施方案中，可以控制调控序列。调控序列的精确结构可以根据物种或根据细胞类型而变化，但通常包括参与启动转录或翻译的5’-未转录和5’-和3’非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等.特别地，5’-未转录的调控序列包含启动子区，所述启动子区包含用于功能结合基因的转录控制的启动子序列.调控序列还可以包含增强子序列或上游激活子序列.
优选地，根据本发明，将待在细胞中表达的RNA引入到所述细胞中.在根据本发明的方法的一个实施方案中，通过合适的DNA模板的体外转录获得待被引入到细胞中的RNA.
根据本发明，例如“能够表达的RNA”和“编码的RNA”的术语在本文中可互换使用，并且对于特定的肽或多肽意味着所述RNA(如果存在于合适的环境中，优选在细胞中)可以被表达以产生所述肽或多肽.优选地，根据本发明的RNA能够与细胞翻译机制相互作用以提供能够表达的肽或多肽.
例如“转移”、“引入”或“转染”的术语在本文中可互换使用，并且涉及将核酸特别是外源或异源核酸特别是RNA引入到细胞中.根据本发明，细胞可以形成器官、组织和/或生物体的一部分.根据本发明，核酸的施用以裸核酸实现或与施用试剂组合来实现.优选地，核酸的施用以裸核酸的形式进行。优选地，RNA与稳定物质如RNA酶抑制剂组合施用。本发明还设想将核酸重复引入到细胞中以允许持续表达的时间段延长.
可以用可与RNA有关的任何载体转染细胞，例如，通过与RNA形成复合物或形成其中包覆或包封RNA的囊泡，导致与裸RNA相比RNA的稳定性提高.根据本发明有用的载体包括例如含脂质载体如阳离子脂质、脂质体，特别是阳离子脂质体以及胶束和纳米颗粒.阳离子脂质可与带负电荷的核酸形成复合物.根据本发明可使用任何阳离子脂质.
优选地，将编码肽或多肽的RNA引入细胞，特别是在体内存在的细胞中，导致所述肽或多肽在细胞中表达.在具体实施方案中，优选将核酸靶向特定细胞.在这样的实施方案中，适用于将核酸施用于细胞的载体(例如，逆转录病毒或脂质体)显示出靶向分子.例如，可以将对靶细胞上的表面膜蛋白或靶细胞上的受体的配体具有特异性的分子如抗体并入到核酸载体中或与其结合.在通过脂质体施用核酸的情况下，可将与和内吞作用有关的表面膜蛋白结合的蛋白质并入到脂质体制剂中，以便能够靶向和/或摄取.这样的蛋白质包括其对特定细胞类型具有特异性的片段的衣壳蛋白、针对内在化蛋白质的抗体、靶向细胞内位置的蛋白质等.
术语“细胞”或“宿主细胞”优选是完整细胞，即具有完整膜的、未释放其正常细胞内组分如酶、细胞器或遗传物质的细胞.完整细胞优选是活细胞，即能够执行其正常代谢功能的活细胞.优选地，根据本发明，所述术语涉及可以用外源核酸转化或转染的任何细胞.根据本发明，术语“细胞”包括原核细胞(例如，大肠杆菌(E.coli))或真核细胞(例如，树突细胞、B细胞、CHO细胞、COS细胞、K562细胞、HEK293细胞、HELA细胞、酵母细胞和昆虫细胞)。外源核酸可存在于(i)本身自由分散、(ii)并入重组载体中或(iii)整合到宿主细胞基因组或线粒体DNA中的细胞中.特别优选哺乳动物，例如来自人、小鼠、仓鼠、猪、山羊和灵长类动物的细胞.细胞可来自于大量组织类型并且包括原代细胞和细胞系。具体实例包括角化细胞、外周血白细胞、骨髓干细胞和胚胎干细胞.在另一些实施方案中，细胞是抗原呈递细胞，特别是树突细胞、单核细胞或巨噬细胞。
包含核酸分子的细胞优选表达由所述核酸编码的肽或多肽.
术语“克隆扩增”是指使特定实体提高的过程.在本发明的上下文中，该术语优选在免疫应答的情况下使用，在所述免疫应答中通过抗原刺激淋巴细胞，增殖，并且扩增识别所述抗原的特异性淋巴细胞.优选地，克隆扩增导致淋巴细胞分化。
例如“降低”或“抑制”的术语涉及引起在水平上优选5％或更大、10％或更大、20％或更大，更优选50％或更大，最优选75％或更大的总体降低的能力。术语“抑制”或类似短语包括完全或基本上完全抑制，即降低至零或基本上为零.
例如“提高”、“增强”、“促进”或“延长”的术语优选地涉及提高、增强、促进或延长约至少10％，优选至少20％、优选至少30％、优选至少40％、优选至少50％、优选至少80％、优选至少100％、优选至少200％，特别是至少300％.这些术语还可涉及从零或不可测量或不可检测的水平提高、增强、促进或延长至大于零或可测量或可检测的水平.
本发明提供了基于通过本发明的方法预测为具有免疫原性的氨基酸修饰或经修饰肽设计的疫苗，例如癌症疫苗.
根据本发明，术语“疫苗”涉及在施用后诱导免疫应答，特别是细胞免疫应答的药物制剂(药物组合物)或产品，所述免疫应答识别和攻击病原体或患病细胞如癌症细胞。疫苗可用于预防或治疗疾病.术语“个性化癌症疫苗”或“个体化癌症疫苗”涉及特定癌症患者并且意味着癌症疫苗适应于个体癌症患者的需要或特殊情况。
在一个实施方案中，根据本发明提供的疫苗可包含肽或多肽，所述肽或多肽包含通过本发明的方法预测为具有免疫原性的一种或更多种氨基酸修饰或者一种或更多种经修饰肽或编码所述肽或多肽的核酸，优选RNA.
根据本发明提供的癌症疫苗在被施用于患者时提供一种或更多种适用于刺激、引发和/或扩增对所述患者的肿瘤具有特异性的T细胞的T细胞表位.T细胞优选针对表达T细胞表位所来自于的抗原的细胞.因此，本文中描述的疫苗优选能够诱导或促进针对以I类MHC呈递一种或更多种肿瘤相关新抗原为特征的癌症疾病的细胞应答，优选细胞毒性T细胞活性.由于根据本发明提供的疫苗将靶向癌症特异性突变，因此其对患者的肿瘤将是特异性的.
根据本发明提供的疫苗涉及包含通过本发明的方法预测为免疫原性的氨基酸修饰或经修饰的肽的疫苗，所述疫苗在施用于患者时优选提供一个或更多个T细胞表位，例如2个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个且优选至多60个、至多55个、至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个T细胞表位.这样的T细胞表位在本文中也被称为“新表位”。通过患者的细胞，特别是抗原呈递细胞呈递这些表位优选地导致在与MHC结合时靶向所述表位，因此，表达所述T细胞表位所来自于的抗原且在肿瘤细胞的表面上呈递相同表位的患者肿瘤，优选原发性肿瘤以及肿瘤转移瘤的T细胞。
本发明的方法可包括确定所鉴定的氨基酸修饰或经修饰的肽用于癌症疫苗接种的可用性的进一步步骤.因此，进一步的步骤可以包括以下中的一个或更多个：(i)评估修饰是否位于已知或预测的MHC呈递表位；(ii)体外和/或计算机模拟(in silico)测试修饰是否位于MHC呈递表位，例如，测试修饰是否是被加工成MHC呈递表位和/或呈现为MHC呈递表位的肽序列的一部分；以及(iii)体外测试所设想的经修饰的表位是否能够刺激具有期望的特异性的T细胞如患者的T细胞，特别是当存在于它们的自然序列环境中时，例如当侧接在天然存在的蛋白质中侧翼还具有所述表位的氨基酸序列时，以及当在抗原呈递细胞中表达时。这样的侧翼序列各自可包含3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且更优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列。
根据本发明确定的经修饰的肽可以按其作为用于癌症疫苗接种的表位的可用性来排名.因此，在一个方面，本发明的方法包括手动或基于计算机的分析方法，在所述分析方法中对所鉴定的经修饰的肽进行分析并对其在待提供的各种疫苗中的可用性进行选择.在一个优选的实施方案中，所述分析方法是基于计算算法的方法.优选地，所述分析方法包括根据其为免疫原性的能力的预测来确定表位和/或对其进行排名。
根据本发明鉴定并由本发明的疫苗提供的新表位优选以包含所述新表位的多肽(例如多表位多肽)或编码所述多肽的核酸，特别是RNA的形式存在。此外，新表位可以以疫苗序列的形式存在于多肽中，即存在于其天然序列环境中，例如侧接在天然存在的蛋白质中侧翼还具有所述表位的氨基酸序列.这样的侧翼序列各自可包含5个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸，并且可在N端和/或C端侧接表位序列.因此，疫苗序列可包含20个或更多个、25个或更多个、30个或更多个、35个或更多个、40个或更多个且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸.在一个实施方案中，新表位和/或疫苗序列在多肽中头至尾对齐。
在一个实施方案中，新表位和/或疫苗序列通过接头，特别是中性接头隔开.根据本发明的术语“接头”涉及在两个肽结构域(例如表位或疫苗序列)之间添加的肽以连接所述肽结构域.关于接头序列没有特别限制.然而，优选地，接头序列减小了两个肽结构域之间的空间位阻，其被很好地翻译并且支持或允许表位加工.此外，接头应当不具有或仅具有很少的免疫原性序列元件。接头优选不应当产生非内源性新表位，如由相邻新表位之间的接合缝产生的新表位，这可能产生不想要的免疫反应。因此，多表位疫苗应优选包含能够降低不想要的MHC结合接合表位数目的接头序列.Hoyt等(EMBO J.25(8)，1720-9，2006)和Zhang等(J.Biol.Chem.，279(10)，8635-41，2004)已表明，富含甘氨酸的序列损害蛋白酶体加工，因此使用富含甘氨酸的接头序列用于使可被蛋白酶体加工的包含接头的肽的数目最小化.此外，观察到甘氨酸抑制MHC结合沟位置中的强结合(Abastado等，J.Immunol.151(7)，3569-75，1993).Schlessinger等(Proteins，61(1)，115-26，2005)已发现氨基酸序列中包含的氨基酸甘氨酸和丝氨酸导致更有效地翻译和被蛋白酶体加工的更灵活的蛋白质，使得能够更好地获得编码的新表位.接头各自可包含3个或更多个、6个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、15个或更多个、20个或更多个且优选至多50个、至多45个、至多40个、至多35个或至多30个氨基酸。优选地，接头富含甘氨酸和/或丝氨酸氨基酸.优选地，接头的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、或至少95％的氨基酸是甘氨酸和/或丝氨酸.在一个优选的实施方案中，接头基本上由氨基酸甘氨酸和丝氨酸组成.在一个实施方案中，接头包含氨基酸序列(GGS)a(GSS)b(GGG)c(SSG)d(GSG)e，其中a、b、c、d和e独立地为选自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，并且其中a+b+c+d+e与0不同并且优选为2或更大、3或更大、4或更大或者5或更大。在一个实施方案中，接头包括如本文中描述的序列，包括实例中描述的接头序列，例如序列GGSGGGGSG.
在一个特别优选的实施方案中，将根据本发明的包含一个或更多个新表位的多肽(例如多表位多肽)以核酸，优选RNA如体外转录或合成RNA的形式施用于患者，所述核酸可在患者的细胞如抗原呈递细胞中表达以产生多肽.本发明还设想施用一种或更多种多表位多肽，其出于本发明的目的被术语“多表位多肽”所包括，优选以核酸，优选RNA如体外转录或合成RNA的形式，所述核酸可在患者的细胞如抗原呈递细胞中表达以产生一种或更多种多肽.在施用多于一种多表位多肽的情况下，由不同多表位多肽提供的新表位可不同或部分重叠.一旦存在于患者的细胞如抗原呈递细胞中，则对根据本发明的多肽进行加工以产生根据本发明鉴定的新表位.施用根据本发明提供的疫苗优选提供MHC II类呈递表位，所述表位能够引起针对表达MHC呈递表位所来自于的抗原的细胞的CD4+辅助T细胞应答.施用根据本发明提供的疫苗还可提供MHC I类呈递表位，所述表位能够引发针对表达MHC呈递表位所来自于的抗原的细胞的CD8+T细胞应答.此外，施用根据本发明提供的疫苗可提供一种或更多种新表位(包括已知的新表位和根据本发明鉴定的新表位)以及一种或更多种不包含癌症特异性体细胞突变，但是由癌细胞表达，优选诱导针对癌细胞的免疫应答，优选癌症特异性免疫应答的表位.在一个实施方案中，施用根据本发明提供的疫苗提供为MHC II类呈递表位和/或能够引起针对表达MHC呈递表位所来自于的抗原的细胞的CD4+辅助T细胞应答的新表位，以及不包含癌症特异性体细胞突变的为MHC I类呈递表位和/或能够引发针对表达MHC呈递表位所来自于的抗原的细胞的CD8+T细胞应答的表位.在一个实施方案中，不包含癌症特异性体细胞突变的表位来自于肿瘤抗原.在一个实施方案中，新表位和不包含癌症特异性体细胞突变的表位在癌症的治疗中具有协同作用。优选地，根据本发明提供的疫苗可用于细胞毒性和/或辅助T细胞应答的多表位刺激.
根据本发明提供的疫苗可为重组疫苗.
在本发明的上下文中的术语“重组”意指“通过基因工程制造”.优选地，在本发明的上下文中的“重组实体”(例如重组多肽)不是天然存在的，并且优选是在本质上不组合的实体(例如氨基酸或核酸序列)的组合的结果。例如，在本发明的上下文中的重组多肽可包含来自于不同蛋白质或者例如通过肽键或合适的接头融合在一起的同一蛋白质的不同部分的几个氨基酸序列如新表位或疫苗序列。
如本文中使用的术语“天然存在”是指对象可以存在于自然界中的事实.例如，存在于生物体(包括病毒)中并且可以从自然界来源中分离并且未在实验室中被人有意地修饰的肽或核酸是天然存在的.
本文中描述的药剂、组合物和方法可以被用于治疗患有疾病，例如特征在于存在表达抗原并呈递其片段的患病细胞的疾病的对象.特别优选的疾病是癌症疾病.本文中描述的药剂、组合物和方法也可用于免疫或疫苗接种以预防本文中描述的疾病.
根据本发明，术语“疾病”是指任何病理状态，包括癌症疾病，特别是本文中描述的那些癌症疾病形式.
术语“正常”是指健康状态或健康对象或组织中的状况，即非病理状况，其中“健康”优选意指非癌性的。
根据本发明，“涉及表达抗原的细胞的疾病”意指检测到患病组织或器官的细胞中的抗原的表达.与健康组织或器官中的状态相比，在患病组织或器官的细胞中的表达可提高.提高是指提高至少10％，特别是至少20％、至少50％、至少100％、至少200％、至少500％、至少1000％、至少10000％或甚至更多。在一个实施方案中，表达仅存在于患病组织中，而健康组织中的表达受到抑制.根据本发明，涉及或与表达抗原的细胞有关的疾病包括癌症疾病.
根据本发明，术语“肿瘤”或“肿瘤疾病”是指优选形成肿胀或病变的细胞(称为瘤细胞、肿瘤发生性细胞或肿瘤细胞)的异常生长.“肿瘤细胞”意指通过迅速、不受控制的细胞增殖生长并且在引发新生长停止的刺激之后继续生长的异常细胞.肿瘤表现出部分或完全缺乏结构组织和与正常组织的功能协调，并且通常形成独特的组织团块，其可为良性、恶变前或恶性的。
癌症(医学术语：恶性赘生物)是一类疾病，其中一组细胞显示出不受控制的生长(分裂超出正常限度)、入侵(侵入和破坏邻近组织)，并且有时转移(通过淋巴或血液扩散到身体中的其他位置)。癌症的这三种恶性特性将其与自限性且不入侵或转移的良性肿瘤区分开。大多数癌症形成肿瘤，但一些像白血病不形成肿瘤.恶性肿瘤(malignancy)、恶性赘生物和恶性肿瘤(malignant tumor)与癌症基本上是同义的.
赘生物是由于瘤形成而导致的组织的异常团块.瘤形成(在希腊语中新生长)是细胞的异常增殖.所述细胞的生长超过其周围的正常组织的生长并且与其周围的正常组织的生长不协调.即使在刺激停止之后仍以同样过度的方式持续生长.其通常导致肿块或肿瘤。赘生物可为良性、恶变前或恶性的.
根据本发明的“肿瘤的生长”或“肿瘤生长”涉及肿瘤提高其尺寸的倾向和/或肿瘤细胞增殖的倾向.
出于本发明的目的，术语“癌症”和“癌症疾病”与术语“肿瘤”和“肿瘤疾病”可互换使用。
癌症根据类似于肿瘤的细胞和因此被认为是肿瘤起源的组织的类型进行分类.这些分别是组织学和位置.
根据本发明的术语“癌症”包括上皮癌、腺癌、胚细胞瘤、白血病、精原细胞瘤、黑素瘤、畸胎瘤、淋巴瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、肾上腺癌、甲状腺癌、血癌、皮肤癌、脑癌、宫颈癌、肠癌、肝癌、结肠癌、胃癌、肠癌、头颈癌、胃肠癌、淋巴结癌、食管癌、结直肠癌、胰腺癌、耳鼻喉(ENT)癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌及其转移瘤.其实例是肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肾细胞癌、宫颈癌或上述癌症类型或肿瘤的转移瘤.根据本发明的术语癌症还包括癌症转移瘤和癌症复发.
“转移”意指癌细胞从其原始位置扩散到身体的另一部位.转移的形成是一个非常复杂的过程，并且取决于恶性细胞与原发性肿瘤脱离，细胞外基质的侵入，内皮基底膜穿透进入体腔和血管，然后在被血液输送后，浸润靶器官。最终，在靶位点的新肿瘤，即继发肿瘤或转移性肿瘤的生长取决于血管生成.肿瘤转移常常发生在移除原发性肿瘤后，这是因为肿瘤细胞或组分可保留并发展出转移潜能。在一个实施方案中，根据本发明的术语“转移”涉及“远端转移”，其涉及远离原发性肿瘤和区域性淋巴结系统的转移.
继发性或转移性肿瘤的细胞与原始肿瘤中的细胞类似。这意味着，例如，如果卵巢癌转移至肝脏，则继发性肿瘤由异常卵巢细胞而不是异常肝细胞组成。肝脏中的肿瘤然后被称为转移性卵巢癌，而不是肝癌。
术语“循环肿瘤细胞”或“CTC”涉及与原发性肿瘤或肿瘤转移瘤分离并在血流中循环的细胞.CTC可构成用于随后在不同组织中生长的额外的肿瘤(转移)的种子.循环肿瘤细胞以约1-10个CTC/毫升全血的频率存在于转移性疾病患者中。已开发了研究方法来分离CTC.本领域中已描述了若干种研究方法来分离CTC，例如使用上皮细胞通常表达细胞黏附蛋白EpCAM(其在正常血细胞中不存在)这一事实的技术.基于免疫磁珠的捕获涉及用已与磁性颗粒缀合的EpCAM的抗体处理血液样本，随后在磁场中分离标记的细胞。然后将分离的细胞用另一上皮标志物细胞角蛋白和常见的白细胞标志物CD45的抗体染色，以区分罕见的CTC和污染的白血细胞。这种稳健且半自动化的方法鉴定了平均产量为约1个CTC/mL且纯度为0.1％的CTC(AHard等，2004：Clin Cancer Res 10，6897-6904).用于分离CTC的第二种方法使用基于微流体的CTC捕获装置，其涉及使全血流过嵌入有80,000个微柱的室，所述微柱通过用EpCAM的抗体包被而变得具有功能.CTC然后用针对细胞角蛋白或组织特异性标志物(例如前列腺癌中的PSA或乳腺癌中的HER2)的二抗进行染色，并且通过沿着三维坐标的多个平面中的微柱的自动扫描来显现.CTC芯片能够以50个细胞/ml的中值产量和1％至80％的纯度来鉴定患者中的细胞角蛋白化阳性循环肿瘤细胞(Nagrath等，2007：Nature450，1235-1239).用于分离CTC的另一种可能性是使用来自Veridex，LLC(Raritan，NJ)的CeHSearchTM循环肿瘤细胞(CTC)测试，其对血管中的CTC进行捕获、鉴定和计数.CeHSearchTM系统是美国食品和药物管理局(FDA)批准的用于全血中的CTC的计数的方法，其是基于免疫磁性标记和自动数字显微镜的组合.存在文献中描述的用于分离CTC的其他方法，所有这些方法均可以与本发明结合使用.
当一个人再次受到过去影响他们的病症的影响时，发生复发或再发.例如，如果患者患有肿瘤疾病，已接受了所述疾病的成功治疗，并再次患上所述疾病，则所述新患上的疾病可被认为是复发或再发.然而，根据本发明，肿瘤疾病的复发或再发可以发生在原始肿瘤疾病的部位，但不必定如此.因此，例如，如果患者患有卵巢肿瘤并且已接受了成功治疗，则复发或再发可为在与卵巢不同的部位处出现卵巢肿瘤或出现肿瘤。肿瘤的复发或再发还包括其中在与原始肿瘤部位不同的部位处，以及在原始肿瘤部位处出现肿瘤的情况。优选地，患者已接受治疗的原始肿瘤是原发性肿瘤，并且与原始肿瘤部位不同的部位处的肿瘤是继发性或转移性肿瘤.
“治疗”意指向对象如本文中描述的化合物或组合物以预防或消除疾病，包括减小对象中肿瘤的尺寸或肿瘤的数量；抑制或减缓对象中的疾病；抑制或减缓对象中新疾病的发展；降低目前患有或曾经患有疾病的对象中症状和/或再发的频率或严重程度；和/或延长，即提高对象的寿命。特别地，术语“疾病的治疗”包括治愈、缩短持续时间、改善、预防、减缓或抑制发展或恶化，或预防或延迟疾病发作或其症状。
“处于风险之中”意指与一般群体相比，被鉴定为具有较正常患病(特别是癌症)几率更高的几率的对象，即患者.此外，已患有或目前患有疾病(特别是癌症)的对象是患病风险提高的对象，因为这样的对象可持续患病.目前患有或已患有癌症的对象的癌症转移瘤的风险也提高。
术语“免疫治疗”涉及包括特异性免疫反应活化的治疗。在本发明的上下文中，例如“保护”、“预防”、“预防性的”、“预防的”或“保护性的”的术语涉及对象中疾病的发生和/或传播的预防或治疗或两者，并且特别是使对象患病的几率最小化或延缓疾病的发展.例如，处于如上所述肿瘤风险中的人将是预防肿瘤治疗的候选者.
免疫治疗的预防性施用，例如本发明的疫苗的预防性施用优选保护接受者免于患病.免疫治疗的治疗性施用，例如本发明的疫苗的治疗性施用可导致抑制疾病进展/发展.这包括减缓疾病进展/发展，特别是破坏疾病进展，其优选导致消除疾病.
免疫治疗可使用多种技术中的任一种进行，其中本文中提供的药剂用于从患者中除去患病细胞.这样的除去可由于在针对抗原具有特异性的患者或表达抗原的细胞中增强或诱导免疫应答而发生。
在某些实施方案中，免疫治疗可为主动免疫治疗，其中治疗依赖于内源性宿主免疫系统的体内刺激以通过施用免疫应答调节剂(例如如本文中提供的多肽和核酸)针对患病细胞起反应。
本文中提供的药剂和组合物可单独使用或与常规治疗方案，例如外科手术、照射、化疗和/或骨髓移植(自体、同基因、同种异体或不相关)组合使用.
术语“免疫”或“疫苗接种”描述了以出于治疗或预防原因而诱导免疫应答为目的来治疗对象的过程。
术语“体内”涉及对象中的情况.
术语“对象”、“个体”、“生物体”或“患者”可互换使用并且涉及脊椎动物，优选哺乳动物.例如，在本发明的上下文中的哺乳动物是人、非人灵长类动物、驯养动物，例如狗、猫、绵羊、牛、山羊、猪、马等，实验室动物，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠等，以及圈养动物，例如动物园的动物.如本文中使用的术语“动物”还包括人.术语“对象”还可包括患者，即动物，优选患有疾病(优选如本文中描述的疾病)的人.
术语“自体”用于描述来自于同一对象的任何事物.例如，“自体移植”是指来自于同一对象的组织或器官的移植.这样的过程是有利的，因为它们克服了原本会导致排斥的免疫屏障.
术语“异源”用于描述由多个不同要素组成的事物.例如，将一个个体的骨髓转移到不同个体中构成异源移植。异源基因是来自于除所述对象之外的来源的基因.
作为用于免疫或疫苗接种的组合物的一部分，优选将一种或更多种如本文中描述的药剂与一种或更多种用于诱导免疫应答或用于提高免疫应答的佐剂一起施用.术语“佐剂”涉及延长或增强或加快免疫应答的化合物。本发明的组合物优选发挥其作用而不添加佐剂。然而，本申请的组合物可包含任何已知的佐剂.佐剂包含异种组的化合物，例如油乳剂(例如弗氏佐剂(Freund’s adjuvant))、矿物化合物(例如明矾)、细菌产物(例如百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)毒素)、脂质体和免疫刺激复合物。佐剂的实例是单磷酰脂-A(MPL SmithKline Beecham)，皂苷如QS21(SmithKline Beecham)、DQS21(SmithKline Beecham；WO 96/33739)、QS7、QS17、QS18和QS-L1(So等，1997，Mol.Cells 7：178-186)，不完全弗氏佐剂，完全弗氏佐剂，维生素E，montanid，明矾，CpG寡核苷酸(Krieg等，1995，Nature 374：546-549)和由生物可降解的油如角鲨烯和/或生育酚制备的各种油包水乳液.
也可施用刺激患者的免疫应答的其他物质.由于细胞因子对淋巴细胞的调节特性，例如可以在疫苗接种中使用细胞因子。这样的细胞因子包括例如GM-CSF、1L-18和白细胞介素-12(IL-12)，所述白细胞介素-12表现出提高疫苗的保护作用(参见Science 268：1432-1434，1995).
存在许多增强免疫应答并因此可用于疫苗接种的化合物.所述化合物包括以蛋白质或核酸如B7-1和B7-2(分别为CD80和CD86)形式提供的共刺激分子。
根据本发明，身体样品可为组织样品，包括体液和/或细胞样品.这样的身体样品可以以常规方式获得，例如通过包括穿刺活检的组织活检，以及通过取血、支气管抽吸物、痰液、尿液、粪便或其他体液。根据本发明，术语“样品”还包括处理的样品，例如生物样品的部分或分离物，例如核酸或细胞分离物。
药剂例如本文中描述的疫苗和组合物可通过任何常规途径(包括通过注射或输注)施用.施用可例如经口、静脉内、腹膜内、肌内、皮下或经皮进行.在一个实施方案中，施用节内(intranodally)，例如通过注射到淋巴结中进行.其他形式的施用设想用本文中描述的核酸体外转染抗原呈递细胞如树突细胞，然后施用抗原呈递细胞.
本文中描述的药剂以有效量施用。“有效量”是指单独或与另外的剂量一起实现期望的反应或期望的效果的量.在治疗特定疾病或特定病症的情况下，期望的反应优选涉及抑制疾病进程.这包括减缓疾病的发展，并且特别是中断或逆转疾病的发展。在治疗疾病或病症中的期望的反应也可为延迟发作或预防所述疾病或所述病症发作.
本文中描述的药剂的有效量将取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的个体参数，包括年龄、生理状况、体格和重量，治疗持续时间、伴随治疗(如果存在的话)的类型、具体施用途径和类似因素.因此，本文中描述的药剂的施用剂量可取决于各种这样的参数。在以初始剂量导致患者中的反应不足的情况下，可使用更高剂量(或者通过不同、更局部的施用途径实现的有效更高的剂量).
本文中描述的药物组合物优选是无菌的并且包含有效量的治疗活性物质以产生期望的反应或期望的效果.
本文中描述的药物组合物通常以药学上相容的量和药学上相容的制剂施用.术语“药学上相容的”是指不与药物组合物的活性成分的作用相互作用的无毒物质.这种制剂通常可包含盐、缓冲物质、防腐剂、载体、补充免疫增强物质如佐剂(例如CpG寡核苷酸)、细胞因子、趋化因子、皂角苷、GM-CSF和/或RNA，以及在合适的情况下的其他治疗活性化合物.当用于药物时，盐应当为药学上相容的.然而，不是药学上相容的盐可用于制备药学上相容的盐并且包括在本发明中。这种药理学和药学上相容的盐以非限制性方式包括由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、柠檬酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸等。药学上相容的盐也可被制备为碱金属盐或碱土金属盐，例如钠盐、钾盐或钙盐.
本文中描述的药物组合物可包含药学上相容的载体.术语“载体”是指天然或合成性质的有机或无机组分，其中活性组分被组合以便于施用.根据本发明，术语“药学上相容的载体”包括适合于施用于患者的一种或更多种相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。本发明的药物组合物的组分通常为使得不发生显著损害期望的药物效力的相互作用.
本文中描述的药物组合物可包含合适的缓冲物质，例如乙酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐和磷酸盐.
药物组合物在合适的情况下也可包含合适的防腐剂，例如苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。
药物组合物通常以均匀剂型形式提供，并且可以以本身已知的方式制备.本发明的药物组合物可为例如胶囊剂、片剂、锭剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂、酏剂的形式或乳剂形式.
适合于肠胃外施用的组合物通常包含活性化合物的无菌水性或非水性制剂，其优选与接受者的血液等渗.相容载体和溶剂的实例是林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，通常，无菌固定油用作溶液或悬浮介质。
通过附图和以下实施例对本发明进行了详细描述，这些实施例仅用于说明目的并且不旨在是限制性的.由于说明和实施例，技术人员可获得同样包括在本发明中的另外的实施方案.
附图说明
图1.非同义癌症相关突变常常是免疫原性的并且主要被CD4+T细胞识别.a，对于免疫原性测试，向小鼠(对于b和c，n＝5，对于d，n＝3)疫苗接种合成肽和作为佐剂的聚(I：C)(b)或代表突变表位(每只小鼠两个突变)的编码抗原的RNA(c，d).用突变的肽或不相关的对照肽离体再刺激脾细胞并用IFNγElispot(参见示例性的图2a)和细胞内细胞因子和CD4/CD8表面染色进行测试以评估引发的免疫应答的亚型.b-c，通过向C57BL/6小鼠疫苗接种B16F10肿瘤模型中突变的表位获得的T细胞应答.左侧，非免疫原性MHC I类或II类限制性突变表位的流行。右侧，突变特异性T细胞的检测和分型的实例(关于单个表位的数据，参见表1).d左侧，在CT26模型中发现的非免疫原性MHC I类或II类限制性突变表位的流行.右侧，基于预测的MHC I类结合优先排列和基于良好(0.1-2.1)或差(＞3.9)的结合评分选择的免疫原性突变表位的MHC限制。关于单个表位的数据，参见表2.
图2.通过用编码单个突变的CD4+T细胞表位的RNA疫苗免疫的B16F10黑素瘤中的有效肿瘤控制和存活益处。a，通过ELISpot对用B16-M30 RNA疫苗接种的小鼠(n＝5)的脾细胞进行测试以识别合成肽.左侧，突变(B16-M30)与对应的野生型(B16-WT30)序列.右侧，通过识别B16-M30的截短变体的测试(平均值±SEM)来确定最小表位。b，用B16F10肿瘤细胞皮下接种和未经处理(对照)或在有或没有施用CD4或CD8消耗性抗体的情况下用B16-M30编码RNA(B16-M30)静脉(Iv)免疫的C57BL/6小鼠(n＝10)的平均值+SEM肿瘤生长(左侧)和存活(右侧)。c，在静脉(Iv)注射萤光素酶转基因B16F10肿瘤细胞(B16F10-Luc)后，用B16-M30编码RNA(B16-M30)或不相关的对照RNA处理患肺转移瘤的B6白血病小鼠(n＝10).通过BLI确定中值肿瘤生长.d，未经处理(对照，n＝x)或B16-M30 RNA免疫的小鼠(n＝4)的B16F10肿瘤的单细胞悬液用B16-M30肽、培养基或不相关的肽(VSV-NP52-59)再刺激，并且在IFNγELISpot测定(平均值±SEM)中进行测试.e，B16-M30 RNA疫苗接种的小鼠中的肿瘤浸润性白细胞的流式细胞术表征.描述了未经处理(对照)或皮下接种B16F10肿瘤细胞的Mut30RNA疫苗接种的C57BL/6小鼠(n＝3)的CD45+细胞和Gr-1+/CD11b+细胞(MDSC)中CD4+、CD8+或FoxP3+/CD4+T细胞的频率。
图3.用RNA五链体(pentatope)免疫诱导针对单个突变表位的T细胞应答并在小鼠肿瘤模型中赋予疾病控制和显著的存活益处.a，多聚新表位RNA疫苗的工程改造。RNA五链体包含通过插入到pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120骨架中的gly/ser接头连接的五个27聚体序列。(UTR，非翻译区；sp，信号肽；MITD，MHC I类运输结构域)。b，向BALB/c小鼠(n＝5)疫苗接种五链体RNA(35μg)或对应的5种RNA单体(每种7μg)的混合物.在IFNγELISpot测定中在第19天离体测量小鼠的肽刺激的脾细胞中的T细胞应答(减去平均值±SEM的中值对照)。c，在静脉(Iv)注射CT26-Luc细胞后发展肺转移瘤的BALB/c小鼠(n＝10)同时用两种RNA五链体的混合物处理或未经处理(对照).示出了通过BLI的中值肿瘤生长(左侧)、存活数据(中间)和来自经处理的动物的肺(右侧)。d，来自五链体1+2处理的动物的肺的CD3染色的组织切片(上图)。各图的左侧示出了被分析的切片，右侧放大倍数(比例尺：扫描：1000μm，上图：100μm，下图：50μm).对对照(n＝6)或RNA五链体(CD3：n＝14；CD4、CD8、FoxP3：n＝12)处理的动物的连续免疫组织化学肺组织切片中的CD3+、CD4+、FoxP3+和CD8+(通过CD3+面积-CD4+面积计算)进行量化并计算肿瘤比例.右图描绘了对照(n＝18)和五链体1+2(n＝39)处理的动物(排除五链体1+2处理组的无肿瘤动物)的切片中的肿瘤面积的比较.描述为平均值±SEM。
图4.具有选择计算机模拟预测的有利的MHC II类结合特性和大量表达的突变的RNA五链体疫苗赋予有效的抗肿瘤控制。a，免疫原性和非免疫原性突变的MHC II结合评分的比较(示出的中值).b，考虑MHC II类结合评分，在有(‘ME’突变)或没有(‘E’突变)的情况下选择具有高表达水平的突变.还参见表4.各自由两种五链体表示的每个类别中的10个突变用于具有CT26-Luc肺肿瘤的小鼠的疫苗接种。示出了肿瘤生长曲线(左侧)、曲线下的面积(中间)和墨汁处理的肺(右侧).c，在IFNγELISpot测定中通过用RNA电穿孔的同基因BMDC再刺激来分析小鼠(每组5只)针对疫苗接种的五链体的T细胞应答.每个点表示减去不相关的RNA对照的一只小鼠的平均斑点计数(平均值±SEM).d，用CT26肿瘤细胞静脉(Iv)接种和未经处理或注射有不相关的RNA、五链体1、五链体2或CT26-M19 RNA的BALB/c小鼠(n＝10)的每个肺的肿瘤结节.e，在血液(由5只小鼠合并，肿瘤接种后第20天)和脾(n＝5)中通过IFNγELISpot测定确定针对gp70423-431(gp70-AH1)的T细胞应答.(描绘的背景(无肽对照)减去平均值±SEM)。f，来自癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas，TCGA)的单个人癌症样品(黑点)的体细胞突变和RNA-Seq数据用于鉴定基因组(上图)和表达(中图)的非同义单一核苷酸变体(non-synonymous single nucleotide variation，nsSNV).(下图)示出了预测与患者的HLA-DRB1等位基因结合的新表位(百分等级＜10％)(skin cutaneousmelanoma，SKCM，皮肤皮肤性黑素瘤；colon adenocarcinoma，COAD，结肠腺癌；breastinvasive carcinoma，BRCA，乳腺浸润性癌)。
图5：变体等位基因频率(variant allele frequency，VAF)的计算.该图示出了作为一段基因组DNA(上部)上的外显子和与该基因座比对的实例读序序列(下部，以更高的缩放水平)的组合的理想化基因.突变事件的位点(“突变位点”)由虚线(上部)或框(下部)示出.突变的核苷酸被涂成红色，野生型核苷酸被涂成绿色.此外，VAF公式中的这些核苷酸之和也被相应地涂色.
图6：突变等位基因的表达对MHCII评分的预测性能的影响.测试来自鼠肿瘤模型4T1、CT26和B16F10的185个选定的突变体的抗原性。从接受者操作特征曲线下的面积(areaunder the receiver operating characteristic curve，AUC，空心圆)推导计算的MHC II评分的预测性能。在对于总mRNA表达(左图)和突变等位基因表达(右图，mRNA表达＊突变等位基因频率，实心圆)应用不同的阈值后，随后重新计算该值.显示出了最大AUC值.突变等位基因的表达更有助于改善预测性能.
图7：在表达有和没有阈值的情况下接受者操作特征曲线(receiver operatingcharacteristic，ROC)曲线的比较.ROC曲线表示来自鼠肿瘤模型4T1、CT26和B16F10(虚曲线)的所有185个选定突变以及mRNA表达≥6 RPKM(左图，实曲线)或突变等位基因的表达≥4 RPKM(右图，实曲线)的那些突变的抗原性预测表现.所选择的阈值达到了最大AUC值(参见图6).
具体实施方式
实施例
本文中使用的技术和方法在本文中进行了描述或者以本身已知的方式实施，并且如例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y中所述.除非特别指出，否则包括使用试剂盒和试剂的所有方法均按照制造商的信息进行.
实施例1：材料和方法
样品.根据联邦动物研究政策，将雌性8-12周龄的C57BL/6、BALB/c小鼠(JanvierLabs)和C57BL/6BrdCrHsd-Tyrc小鼠(B6albino，Harlan)保存在University of Mainz.分别于2010、2011和2011年购买了B16F10黑素瘤细胞系、CT26结肠癌细胞系和4T1-luc2-tdtomato(4T1-Luc)细胞(ATCC CRL-6475批次#58078645、ATCC CRL-2638批次#58494154、Caliper 125669批次#101648)并按照供应商的建议进行保持.对表达萤火虫萤光素酶的CT26-Luc和B16F10-Luc细胞经慢病毒转导.产生了主细胞库和工作细胞库，其中第三和第四代用于肿瘤实验.
先前描述了下一代测序和数据处理(Castle，J.C.，等，Cancer Res 72，1081(2012)；Castle，J.C.，等，BMC Genomics 15，190(2014))。简言之，将来自小鼠肿瘤细胞和BALB/c或C57BL/6小鼠的尾部组织样品的外显子组捕获一式三份地进行测序(4T1-Luc一式两份)。一式三份地制备用于基因表达谱分析的基于Oligo(dT)的RNA测序文库。在IlluminaHiSeq2000上对文库进行测序，以分别产生50个核苷酸的单末端(B16F10)或100个核苷酸的双末端(CT26，4T1-Luc)读序。通过对读序重叠转录物外显子和接点进行计数并标准化为RPKM表达单位(Reads which map per kilobase of transcript length per millionmapped reads，每百万次映射读序映射每千碱基的转录物长度的读序)来确定基因表达值.通过将突变RNA读序标准化为总映射读序计数乘以1亿(normalized variant read count，NVRC，标准化的变体读序计数)以确定突变表达。
先前描述了突变选择、验证和优先排序(Castle，J.C.，等，Cancer Res 72，1081(2012)；Castle，J.C.，等，BMC Genomics 15，190(2014)；Lower，M.，等PLoS Comput Biol8，e1002714(2012)).基于以下标准选择待进行的突变：(i)存在于一式三份的各自肿瘤细胞系测序中，并且不存在于一式三份的对应健康组织样品中；(ii)在RefSeq转录物中出现；和(iii)引起非同义变化.另外的标准是在肿瘤细胞系的表达基因(重复的中值RPKM)中出现.为了验证，从B16F10、CT26或4T1-Luc细胞和C57BL/6或BALB/c尾部组织的DNA扩增突变并进行Sanger测序.如果通过Sanger测序或RNASeq读序确认，则将DNA衍生的突变分类为有效的.对于图4所示的实验未通过Sanger测序和免疫原性测试进行确认。对于图1所示的实验，基于免疫表位数据库的一致性检测法(2.5版本)(Vita，R.，等，Nucleic Acids Res 38，D854-D862(2010))，将突变表位根据其预测的MHC I类结合优先排列。基于其单独的表达(NVRC)或与其预测的MHCII类肽结合能力(IEDB一致性检测法2.5版本)一起选择图4b-e所示实验中靶向的突变.用IEDB一致性检测法2.12版本确定了图4a所示的MHC II结合预测的回顾性分析.为了分析人肿瘤中的突变，将从癌症基因组图谱(TCGA)(2014年8月)检索的皮肤皮肤性黑素瘤(SKCM，n＝308)、结肠腺癌(COAD，n＝192)或乳腺浸润性癌(BRCA，n＝872)的DNA测序数据TCGA)过滤以获得基因组非同义点突变(nsSNV).使用具有鉴定的基因组突变的肿瘤样品的RNA-Seq数据(TCGA)来定义表达的nsSNV.为了预测MHC II结合，使用表达的新表位seq2HLA来鉴定患者的4位HLA II类(HLA-DQA1、HLA-DQB1、HLA-DRB1)类型。使用IEDB一致性结合预测(2.12版本)来预测来自27聚体肽和患者HLA-DRB1等位基因的MHC II类结合。根据IEDB的建议，具有低于10％的百分等级的新表位被认为是结合剂。
合成RNA和合成肽.在于中心(14位)处具有突变的氨基酸的各个27聚体氨基酸表位的情况下研究了鉴定的非同义突变。这些突变肽中的任一种与对照肽(JPT PeptideTechnologies GmbH的水泡性口炎病毒核蛋白(VSV-NP52-59)、gp70-AH1(gp70423-431)和酪氨酸酶相关蛋白2(Trp2180-188))一起合成。或者，将编码突变的27聚体肽的序列克隆到pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120骨架(Holtkamp，S.，等，Blood 108，4009(2006))中，所述骨架的特征在于在翻译效率和作为单胞体(monotope)或通过其间编码10个氨基酸长的甘氨酸-丝氨酸接头的序列彼此融合的五链体的表位的MHC I/II类加工方面具有药理学优化的合成RNA的序列元件.在其他地方(Holtkamp，S.，等，Blood 108，4009(2006))详细描述了这些质粒构建体的线性化、这些模板的体外翻译(in vitro translation，IVT)和纯化.
小鼠模型
对于研究突变表位的免疫原性的实验，在第0、3、7和14天(用RNA免疫)或第0天和第7天(用肽免疫)对年龄匹配的雌性C57BL/6或BALB/c小鼠进行疫苗接种，在最后一次免疫后五至六天内进行读出.通过眼眶后注射200μl(对于B16F10每个突变20μg，对于CT26每个突变40μg)的与阳离子脂质(制备中的手稿)复合的RNA或者将在PBS(总体积200μL)中配制的100μg合成肽和50μg聚(I：C)皮下注射到侧胁腹中来进行疫苗接种.对每只小鼠(对于B16F10，n＝5，对于CT26，n＝3)的两个突变进行了测试.为了证实免疫原性突变和亚分型，针对单一突变对小鼠(n＝5)进行疫苗接种.
对于治疗性肿瘤实验，向C57BL/6小鼠皮下接种1×105个B16F10黑素瘤细胞至右胁腹中并将其随机分配到处理组中。用卡尺非盲测量肿瘤体积并使用公式(A×B2)/2(A为肿瘤的最大直径，B为肿瘤的最小直径)计算。在肺转移实验中，将5×105个CT26-Luc或2×105个CT26细胞注射到BALB/c小鼠的尾静脉中或者将1.5×105个B16F10-Luc肿瘤细胞注射到B6白化小鼠中以获得肺肿瘤.在腹膜内(i.p.)注射D-萤光素(250μl，1.6mg，BDBioscience)的水溶液后通过IVIS Lumina(Caliper Life Sciences)上的生物发光成像非盲追踪萤光素酶转基因细胞的肿瘤生长。注射后5分钟，将发射的光子量化.使用IVISLiving Image 4.0软件将目的区域(regions of interest，ROI)中的体内生物发光量化为总通量(光子/秒)。小鼠根据其总通量值(ANOVA-P方法，Daniel’s XL Toolbox V6.53)被随机化。在气管墨汁(在PBS中以1∶10稀释)注射和用Fekete溶液(5mL 70％EtOH，0.5mL福尔马林和0.25mL冰醋酸)固定后，将CT26肺肿瘤负荷非盲量化.在治疗性实验中，向小鼠施用重复剂量的单胞体(40μg)、五链体RNA(总计40μg)或等摩尔量的不相关RNA.
对于机械学研究，如图所示，腹膜内施用重复剂量的CD8消耗性(克隆YTS191，BioXcell)、CD4消耗性(克隆YTS169.1，BioXcell)或CD40L封闭性(克隆MR1，Prof.StephenSchoenberger惠赠)抗体(在200μL PBS中200μg/小鼠).
先前已描述了酶联免疫斑点(Enzyme-linked immunospot，ELISpot)(Kreiter，S.，等，Cancer Res 70，9031(2010))。简言之，在37℃下将5×105个脾细胞在抗INF-γ(10μg/mL，克隆AN18，Mabtech)包被的Multiscreen 96孔板(Millipore)中培养过夜，并用抗IFN-γ抗体(1μg/mL，克隆R4-6A2，Mabtech)检测细胞因子分泌.为了刺激，添加2μg/mL肽或者将脾细胞与5×104个用RNA转染的同基因骨髓来源的树突细胞(bone marrow-deriveddendritic cell，BMDC)共孵育.为了分析肿瘤浸润性淋巴细胞，使肺转移的单个细胞悬浮液静置过夜以通过塑性黏附除去活的肿瘤细胞.通过密度梯度离心分离活细胞。将所有获取的细胞添加到ELISpot平板中.为了分析外周血中的T细胞应答，通过密度梯度离心分离PBMC，计数并通过添加肽和同源BMDC再刺激.通过添加MHC II类封闭性抗体(20μg/ml，克隆M5/114，BioXcell)进行T细胞应答的亚分型.所有样品一式两份或一式三份进行测试.
流式细胞分析用于确定突变反应性T细胞的亚型.在存在Brefeldin A(Sigma-Aldrich)的情况下，用2×105个RNA转染的BMDC或2μg/mL肽刺激2×106个脾细胞.作为阳性对照，用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA，0.5μg/ml，Sigma-Aldrich)和离子霉素(1μg/ml，Sigma-Aldrich)处理脾细胞.将细胞在37℃下孵育5小时并随后对CD4+和CD8+细胞表面标记物进行染色.使用BD Cytofix/Cytoperm根据制造商的方案将细胞透化并固定，此后对INF-γ、TNF-α和IL-2细胞因子(BD Biosciences)进行染色。将受刺激样品中CD4+或CD8+T细胞中的细胞因子分泌与对照样品(培养基，不相关RNA或不相关肽)进行比较以确定响应T细胞亚型(n＝5).如前所述(PMID：2071934)，由皮下B16F10肿瘤制备肿瘤浸润性白细胞。将所得细胞悬浮液的CD4、CD8、Gr-1和CD11b表面标记物进行染色.根据制造商的方案(MouseFoxp3 Buffer Set，BD)进行细胞内FoxP3染色.在BD FACSCanto II上获得样品。
免疫组织化学。将具有CT26肿瘤的小鼠的肺在4％磷酸盐缓冲甲醛溶液(CarlRoth)中固定过夜并包埋在石蜡中.对50μm连续切片(每只小鼠3个)的CD3(克隆SP7，Abeam)、CD4(克隆1，目录号#50134-M08H，Sino Biologinal)和FoxP3(多克隆，目录号#NB100-39002，Novus Biologicals)进行染色，随后通过HRP-缀合的抗体(多HRP-抗兔IgG，ImmunoLogic)和对应的过氧化物酶底物(Vector Nova Red，Vector Laboratories)检测并用苏木精复染.在Axio Scan.Z1(Zeiss)上捕获CD3+、CD4+、FoxP3+和肿瘤区域，并通过计算机化图像分析软件(Tissue Studio 3.6.1，Definiens)将手动预定义的肿瘤和肺部区域量化。
免疫荧光染色.将低温保存的器官切割成8μm切片并附着在Superfrost载玻片上.将切片在室温(RT)下干燥过夜并在黑暗中于室温下在4％多聚甲醛(PFA)中固定10分钟.将切片用PBS洗涤3次并在黑暗中于室温下使用补充有1％BSA、5％小鼠血清、5％大鼠血清和0.02％Nonident的PBS封闭.将荧光标记的抗体(FoxP3，克隆FJK-16s，eBioscience；CD8，克隆53-6.7，BD；CD4，克隆RM4-5，BD)在染色缓冲液(补充有1％BSA、5％小鼠血清和0.02％Nonident)中稀释，并将切片在4℃下染色过夜.在用洗涤缓冲液(补充有1％BSA和0.02％Nonident的PBS)洗涤两次和用PBS洗涤一次后，将载玻片用Hoechst(Sigma)染色3分钟，用PBS洗涤3次，用蒸馏水洗涤一次，并使用安装Mounting Medium Flouromount G(eBioscience)进行安装.使用落射荧光显微镜(ApoTome，Zeiss)获得免疫荧光图像。通过计算机化图像分析软件(Tissue Studio 3.6.1，Definiens)在手动预定义的肿瘤区域内将肿瘤、CD4、CD8和FoxP3染色区域量化。
统计学.通过使用Student’s t检验(Student’s t-test)将两个组的平均值进行比较。为了比较两个以上组的平均值，应用具有Tukey检验的单因素方差分析.对于每组的单个小鼠确定用于比较肿瘤生长动力学的曲线下面积(AUC)并显示为中值.用非参数Mann-Whitney U检验计算两组之间的中值的统计学差异.用对数秩检验(log-rank test)确定存活益处。所有分析都是双尾的并使用GraphPad Prism 5.03进行。ns：P＞0.05，＊：P≤0.05，＊＊：P≤0.01，＊＊＊：P≤0.001。Grubb检验用于鉴定离群值(α＝0.05).
实施例2：新表位疫苗中的MHC II类限制性T细胞表位
A.针对突变表位具有反应性的T细胞亚型的表征
近来，描述了通过NGS对B16F10肿瘤的非同义突变进行全面绘图的工作流程(图1a)(Castle，J.C.，等，Cancer Res 72，1081(2012)).携带肿瘤的C57BL/6小鼠用编码突变表位(14位中的突变)的合成的27聚体肽免疫，产生赋予体内肿瘤控制的T细胞应答.在此项工作的继续进行中，我们从那些具有高MHC I结合可能性的突变表位开始，表征了针对突变表位的T细胞应答。向小鼠疫苗接种合成的27聚体突变表位肽(图1b右上方).在IFN-γELISpot中测试其脾细胞以鉴定用于进一步分析亚型和细胞因子表达的免疫原性突变(图1a)。发现约30％的突变表位在小鼠中诱导分泌T细胞的突变反应性细胞因子(图1b).出人意料地，针对几乎所有突变表位(16/17，95％)的应答是CD4+T细胞类型的(图1b，表1).
表1免疫原性B16F10突变.确定为在肽或RNA免疫后具有免疫原性的B16F10突变(如图1所述).(WT，野生型；AA#，突变氨基酸的编号；Mut，突变)
Figure BSA0000244595330000491
为了排除任何与基于肽的疫苗形式有关的偏差，使用编码突变表位的体外转录(IVT)mRNA重复该实验(图1c右手侧上图)。用这些RNA单胞体确定的T细胞反应性与用合成肽获得的数据大致相当(图1c，表1)，但具有略微更低数目的免疫原性表位(约25％).重要的是，同样在这种情况下，大多数突变特异性免疫应答(10/12，约80％)由CD4+T细胞赋予.
将研究扩展到BALB/c小鼠中的化学诱导的结肠癌模型CT26(Griswold，D.P.和Corbett，T.H.，Cancer 36，2441(1975))，最近在结肠癌模型CT26中鉴定了超过1680个非同义突变(Castle，J.C.，等，BMC Genomics 15，190(2014)).基于其预测的MHC I类结合特性选择了96个突变.类似于B16F10研究，一半的候选者是良好的结合剂(“低评分”0.1-2.1).另一半被有意选择为差的MHC I结合(“高评分”＞3.9).总计，在用各个RNA单胞体免疫的小鼠中，约20％的突变表位是免疫原性的(图1d饼形图，表2).值得注意的是，在“低”MHC I评分亚组中，鉴定了几个诱导表位的CD8+T细胞，而在“高”评分亚组中不是这样(图1d右侧).这显然没有偏向MHC II类限制性表位，因为这些在构成大多数CT26免疫原性突变的两个亚组中以类似的频率表示(16/21，80％).
表2免疫原性CT26突变.确定为在RNA免疫后具有免疫原性的CT26突变(如图1所述).(WT，野生型；AA#，突变氨基酸的数目；Mut，突变)
Figure BSA0000244595330000501
在类似的说明中，当分析代表我们在4T1乳腺癌模型中鉴定的所有38种突变的RNA单胞体的所有免疫应答时，近似70％的识别的表位被CD4+T细胞识别(数据未示出；表3).
表3免疫原性4T1突变.确定为在RNA免疫后具有免疫原性的4T1突变(如图1所述).(WT，野生型；AA#，突变氨基酸的数目；Mut，突变)
Figure BSA0000244595330000521
因此，在不同MHC背景的三个独立的小鼠肿瘤模型中发现，相当大部分的非同义癌症突变是免疫原性的，并且非常出乎意料地，免疫原性突变组主要被CD4+T细胞识别.
B.作为疫苗靶标的MHC II类限制性癌症突变
为了研究MHC II类限制性癌症突变在体内是否是良好的疫苗靶标，继续使用合成RNA作为疫苗形式.由于抗原编码合成RNA的优势，包括其递送多于一个表位的能力、其被抗原呈递细胞(APC)选择性摄取及其固有的佐剂性，其正在成为有前景的疫苗技术(Diken，M.，等，Gene Ther 18，702(2011)；Kreiter，S.，等，Curr Opin Immunol 23，399(2011)；Pascolo，S.，Handb Exp Pharmacol，221(2008)；Sahin，U.，等，Nat Rev Drug Discov 13，759(2014)；Van，L.S.，等，Hum Vaccin Immunother 9(2013)).我们组已开发了药理学优化的RNA(RNA序列和脂质体制剂中的稳定元件)，同时已达到临床测试阶段(NCT01684241)(Holtkamp，S.，等，Blood 108，4009(2006)；Kreiter，S.，等，J Immunol 180，309(2008)；Kuhn，A.N.，等Gene Ther 17，961(2010)).我们设计了编码B16-M30的RNA，其是在B16F10肿瘤模型中鉴定的表位之一.B16-M30引起强烈的CD4+T细胞应答，其不识别野生型肽(图2a左侧)，因为突变的氨基酸被证明对于T细胞识别是必需的(图2a右侧).当向具有B16F10肿瘤的C57BL/6小鼠反复疫苗接种B16-Mt30 RNA单胞体时，肿瘤生长被大大延缓(图2b)。一半的B16-M30 RNA处理的小鼠在肿瘤疫苗接种后120天仍然存活，而所有对照RNA处理的小鼠在65天内死亡.
类似地，如生物发光成像(BLI)所示(图2c)，用萤光素酶转导的B16F10细胞的肺转移模型中的反复疫苗接种揭示了在绝大多数小鼠中用B16-M30 RNA有效根除转移瘤，而用对照合成RNA不能有效根除转移瘤(图2c)。与此一致，从B16-M30 RNA免疫小鼠的B16F10肿瘤纯化的肿瘤浸润性白细胞显示出对B16-M30的强反应性(图2d).
一并考虑，这些数据建立了作为B16F10肿瘤中的新型主要排斥抗原的B16-M30.它们还例证了用编码单个免疫原性突变表位的RNA免疫可产生功能性T细胞.这些细胞似乎能够靶向癌症病变，触发控制并且甚至能够在鼠肿瘤模型中治愈。我们的研究结果与最近支持CD4+T细胞免疫在癌症控制中的关键作用的报道一致(Schumacher，T.，等，Nature 512，324(2014)；Tran，E.，等，Science 344，641(2014)).
由于绝大多数突变是单个患者所独有的，因此开发突变组作为疫苗抗原的来源需要积极个体化的方法(Britten，C.M.，等，Nat Biotechnol 31，880(2013)).在这方面，主要挑战之一是立即生产定制的按需疫苗.这可以通过RNA疫苗技术来可行地解决.基于体外转录的RNA制备通常需要数天(图3a)。目前，GMP级材料可以在三周内准备好释放，并且该过程不断被优化以降低该时间。另一方面，尽管我们已证明具有单一突变的小鼠模型中的肿瘤根除，但是人们理想上优选在多个新表位疫苗中组合若干突变.这将使我们能够解决阻碍人疫苗的临床成功的若干因素，如肿瘤异质性和免疫编辑(Gerlinger，M.，等，N Engl JMed 366，883(2012)；Koebel，C.M.，等，Nature 450，903(2007)).
鉴于这些考虑，我们探究了如何使用我们对免疫原性表位的见解来开发癌症疫苗概念，我们称之为“突变组设计的RNA免疫治疗”(mutanome engineered RNAimmunotherapy，MERIT)(图3a)。为了测试该概念，我们选择了来自于CT26模型的4种MHC II类(CT26-M03、CT26-M20、CT26-M27、CT26-M68)和一种MHC I类(CT26-M19)限制性突变(见表2)和编码它们中的每一个的工程化RNA单胞体。此外，合成RNA胞体被设计为编码由10聚体非免疫原性甘氨酸/丝氨酸接头连接的所有五个突变表位以避免产生连接表位(图3a).通过使原初BALB/c小鼠免疫，发现由五链体引起的产生IFN的T细胞的量与由这些突变中的三种的各自单胞体诱发的量相当(图3b).然而，对于这些突变中的两种，五链体RNA在稳健扩增突变特异性T细胞方面显著更优.
在CT26萤光素酶转染(CT26-Luc)肿瘤的肺转移模型中评估了由RNA五链体疫苗引起的免疫应答的抗肿瘤功效。向携带肿瘤的BALB/c小鼠反复疫苗接种包括在先前实验中测试的突变的两种RNA五链体(3个MHC I类和7个II类限制性表位)的混合物.如通过肺的BLI测量，疫苗接种的小鼠的肿瘤生长受到显著抑制(图3c左侧).在第32天，RNA五链体组中的所有小鼠均存活，而80％的对照小鼠已死亡(图3c中间).与未经处理的对照相比，组织切片的事后肉眼(图3c右侧)、组织学(图3d右侧)和计算机化图像分析(数据未示出)在疫苗接种的小鼠中显示显著更低的肿瘤负荷.五链体RNA疫苗接种的小鼠的肿瘤病变被CD3+T细胞迅速浸润，而CD3+T细胞的数量在其周围的肺组织中显著较低.未经处理的对照的肿瘤显示出CD3+细胞染色，其在量方面与周围肺组织无太大差异并且主要在肿瘤边界处而不在肿瘤中(图3d)。
总之，这些研究结果表明，用使用编码RNA疫苗的多聚新表位的MERIT方法引发针对每个单一表位的T细胞。这些T细胞靶向肿瘤病变，识别其突变的靶标并在体内产生有效的肿瘤控制.
C.具有抗肿瘤免疫的突变的选择
关键问题之一是如何选择具有诱导有效抗肿瘤免疫的最高可能性的突变。我们(图1d)和其他人(Matsushita，H.，等，Nature 482，400(2012)；Robbins，P.F.，等，Nat Med19，747(2013)；van，R.N.，等，J Clin Oncol 31，e439-e442(2013))已证明，MHC I类结合评分使得能够富集引起CD8+应答和肿瘤排斥的突变表位候选物(Duan，F.，等，J Exp Med211，2231(2014)).我们的上述研究结果表明，MHC II类呈递的突变表位可甚至对MERIT方法具有更高的兴趣.事实上，相关分析显示，与非免疫原性突变相比，免疫原性突变具有显著更好的MHC II类结合评分(图4a).大多数癌症缺乏MHC II类表达。MHC II类阴性肿瘤中CD4+T细胞对新表位的有效识别应当取决于待被抗原呈递细胞(APC)摄取和呈递的肿瘤抗原的释放。这对于高度大量表达的抗原应当是最有效的。为了测试该假设，实施了结合良好的MHC II类结合与编码突变表位的mRNA的大量表达的算法.对于后者，我们使用对总体读序计数标准化的确认的突变RNA测序读序(normalized variant read count，NVRC：标准化的变体读序计数).我们用该算法对CT26突变组数据进行了排序并在最丰富的候选表位(NVRC≥60)中选出了预测为良好的MHC II类结合剂的前十种突变(表4中的“ME”突变).作为对照，选择仅基于大量表达的10个突变(表4中的‘E’突变).最重要的是，使用这些表位而无需任何进一步的预验证或免疫原性测试来为每个组改造两个RNA五链体.当向具有建立的CT26-Luc肺肿瘤的小鼠疫苗接种这些表位时，与PE五链体相比，PME诱导强得多的T细胞应答(图4c).在几乎所有的小鼠中，建立的肺转移瘤完全被排斥，而PE五链体不能赋予肿瘤生长控制(图4b).
表4具有大量表达和良好的MHCII类结合特性的CT26突变的计算机模拟(insilico)预测.考虑(ME)或不考虑(E)MHC II百分等级(IEDB一致性检测版本2.5)，选择高表达的CT26突变(WT，野生型；AA#，突变氨基酸的数目；Mut，突变)
Figure BSA0000244595330000551
抗原特异性TH细胞通过树突细胞的CD40配体介导的许可来促进肿瘤特异性CTL应答的交叉致敏.如果TH细胞识别其在交叉呈递不相关的CTL表位的同一APC上的抗原，则这可导致抗原扩散(Bennett，S.R.，等，Nature 393，478(1998)；Schoenberger，S.P.，等，Nature 393，480(1998)).一致地，在用PME而不是PE五链体免疫的小鼠的血液和脾中，检测到针对gp70-AH1的强烈的CD8+T细胞应答(图4d)，所述gp70-AH1是来自于内源性鼠白血病病毒相关细胞表面抗原的良好表征的免疫显性CTL表位.这表明，类似于病毒新抗原特异性T细胞(Croxford，J.L.，等，Autoimmun Rev 1，251(2002))，癌症新表位特异性TH细胞可通过抗原扩散和提高CTL应答来发挥其抗肿瘤功能。
D.概述
总之，我们的数据表明，MHC II类限制性T细胞表位在癌症突变组中是丰富的并且可用于定制在小鼠肿瘤模型中具有显著的治疗效果的基于RNA的多聚新表位疫苗。
负责突变的高速率CD4+T细胞识别的机制尚不清楚.简单的解释可能是与MHC I类表位相比，呈现在MHC II类分子上的更长和可变大小的肽提高了突变被各个肽覆盖的可能性.由MHC I类分子呈递的T细胞表位通常是长度为8至11个氨基酸且具有明确定义的N和C端的肽.MHC II类分子呈递长度为13至17个氨基酸的更长的肽，所述肽具有9个氨基酸的MHC II核心结合区和可变数量的均有助于被CD4+T细胞识别的另外的侧翼氨基酸(Arnold，P.Y.，等，J Immunol 169，739(2002)).
虽然在20世纪90年代产生了针对癌症患者中的突变基因产物的自发性CD8+和CD4+T细胞应答的第一证据(Dubey，P.，等，J Exp Med 185，695(1997)；Lennerz，V.，et al.，Proc Natl Acad Sci U S A 102，16013(2005)；Wolfel，T.，et al.，Science 269，1281(1995))，但是仅最近的高水平出版物已广泛接受了突变特异性T细胞在癌症患者中赋予抗肿瘤活性的巨大潜力(Lu，Y.C.，等，J Immunol 190，6034(2013)；Schumacher，T.，等，Nature 512，324(2014)；Tran，E.，等，Science 344，641(2014)).为了评估我们在黑素瘤、结肠癌和乳腺癌的小鼠模型中揭示的原理在人环境中是否正确，我们分析了由癌症基因组图谱(TCGA)提供的相同的三种人癌症类型中的突变和RNA-Seq数据.对于所有三种人癌症类型，我们证实了我们在小鼠模型中揭示的预测与MHC II类结合的突变的丰度(图4e).
我们在此提出的MERIT方法结合了新一代测序、计算免疫学和合成基因组学领域中的进步，从而提供了全面开发新表位目标库的综合技术。同时靶向多个突变可至少在理论上为解决当前癌症药物开发中的关键问题铺平道路，例如克隆异质性和抗原逃逸(Kroemer，G.和Zitvogel，L.，Oncoimmunology 1，579(2012)；Mittal，D.，等，Curr OpinImmunol 27，16(2014)).
同时，基于这项研究和我们先前的工作，已开始临床翻译，正在积极招募(NCT02035956)黑素瘤患者的第一概念试验(Castle，J.C.，等，Cancer Res 72，1081(2012)；Castle，J.C.，等，Sci Rep 4，4743(2014)；Lower，M.，等，PLoS Comput Biol 8，e1002714(2012))，并且证实了多聚新表位mRNA癌症疫苗的“准时制”生产实际上是可行的.
实施例3：具有抗肿瘤免疫的突变的选择
为了选择/排名氨基酸序列修饰，可如下进行：
1.在给定的非同义点突变列表中，计算中间具有突变氨基酸且分别在N和C端侧接至多13个氨基酸的肽序列；这在下文中将被称为27聚体(当突变接近整个蛋白质的N或C端时，每个侧翼序列的长度可小于13个氨基酸)
2.计算每个27聚体的每个重叠的15nt长的子序列的MHC II类结合预测一致评分(例如使用IEDB T细胞预测工具[Wang P，等(2010)BMC Bioinformatics.11：568.PMID：21092157.http：//tools.immuneepitope.org/mhcii/])；最佳(＝最低)评分被分配给整个27聚体
3.计算与27聚体相关的基因的表达(优选以RPKM单位表示[Ali Mortazavi，等(2008)Nature Methods 5，621-628])
4.计算RNA中每个突变的变体等位基因频率(VAF)：
ο输入用与用于突变检测的相同的肿瘤样品进行的RNA-Seq实验的短读序比对
ο查找与突变位点重叠的比对和读序
ο使用聚合之前的步骤的读序来计算映射到突变位点的核苷酸
ο计算突变等位基因核苷酸之和除以映射到基因组突变位点的所有核苷酸之和(图5)
5.将各基因表达与VAF相乘以获得突变表达(优选以RPKM单位表示)
6.根据MHC结合评分排列所有27聚体(如步骤2中计算的，最低评分最佳)，并且除去具有小于给定阈值的相关突变表达的27聚体.
应用于小鼠数据集：
为了测试该算法，从小鼠肿瘤模型中选择了185个突变，测试4T1、CT26和B16F10的抗原性.然后我们首先尝试测试基因和突变表达水平对该算法预测性能的影响(图6).在此我们可以观察到，当突变表达被过滤而基因表达未被过滤(图6左侧(基因表达)与右侧(突变表达)图)时，接受者操作特征曲线下的最大面积(ROC AUC[Fawcett T.，Pattern RecognLett.2006；27：861-874.doi：10.1016/j.patrec.2005.10.010])更大.
图7示出了对于最佳阈值的ROC曲线，表明突变表达对仅具有中等相对结合亲和力的结合剂的显著影响(图7，右图，假阳性率为约0.3至0.6的值)。
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Claims (28)

1.用于预测免疫原性氨基酸修饰的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定作为经修饰蛋白质之片段的经修饰肽与一种或更多种MHC II类分子结合的评分，以及
b)确定所述经修饰蛋白质之表达或丰度的评分。
2.权利要求1所述的方法，其中与一种或更多种MHC II类分子结合的评分指示与一种或更多种MHC II类分子结合，以及所述经修饰蛋白质之表达或丰度的评分指示所述经修饰蛋白质表达、高水平表达或丰富，则表明所述修饰或经修饰肽具有免疫原性。
3.用于选择免疫原性氨基酸修饰和/或对其进行排名的方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定作为经修饰蛋白质之片段的经修饰肽与一种或更多种MHC II类分子结合的评分，以及
b)确定所述经修饰蛋白质之表达或丰度的评分，
其中所述方法包括对两种或更多种不同修饰进行步骤a)和b)。
4.权利要求3所述的方法，其中所述不同修饰存在于相同和/或不同蛋白质中。
5.权利要求3或4所述的方法，其包括比较所述两种或更多种不同修饰的评分。
6.权利要求3至5中任一项所述的方法，其中如下比较所述两种或更多种不同修饰的评分：通过所述不同修饰的MHC II类结合评分对其进行排名，并去除表达或丰度小于给定阈值的修饰。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中与一种或更多种MHC II类分子结合的评分反映与一种或更多种MHC II类分子结合的可能性。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其包括对两种或更多种不同经修饰肽进行步骤a)，所述两种或更多种不同经修饰肽包含相同修饰。
9.权利要求8所述的方法，其中包含相同修饰的所述两种或更多种不同经修饰肽包含经修饰蛋白质的不同片段，所述不同片段包含存在于所述蛋白质中的相同修饰。
10.权利要求8或9所述的方法，其中包含相同修饰的所述两种或更多种不同经修饰肽包含经修饰蛋白质的不同潜在MHC II类结合片段，所述片段包含存在于所述蛋白质中的相同修饰。
11.权利要求8至10中任一项所述的方法，其还包括从包含相同修饰的所述两种或更多种不同经修饰肽中选择具有与一种或更多种MHC II类分子结合的可能性或最高可能性的经修饰肽。
12.权利要求8至11中任一项所述的方法，其中包含相同修饰的所述两种或更多种不同经修饰肽在长度和/或所述修饰的位置方面不同。
13.权利要求8至12中任一项所述的方法，其中将包含相同修饰的所述两种或更多种不同经修饰肽与一种或更多种MHC II类分子结合的最佳评分分配给所述修饰。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分包括确定与所述修饰相关之蛋白质的表达水平以及确定所述经修饰蛋白质在与所述修饰相关之蛋白质中的频率。
15.权利要求14所述的方法，其中所述确定与修饰相关之蛋白质的表达水平和/或确定所述经修饰蛋白质在与所述修饰相关之蛋白质中的频率在RNA水平上进行。
16.权利要求14或15所述的方法，其中所述经修饰蛋白质在与所述修饰相关之蛋白质中的频率通过确定变体等位基因频率来确定。
17.权利要求16所述的方法，其中所述变体等位基因频率为覆盖突变位点并且携带突变的检测序列、特别是读序之和除以覆盖所述突变位点的所有检测序列、特别是读序之和。
18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中为了确定经修饰蛋白质之表达或丰度的评分，将与所述修饰相关之蛋白质的表达水平的评分乘以所述经修饰蛋白质在与所述修饰相关之蛋白质中的频率的评分。
19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述经修饰肽包含所述经修饰蛋白质的片段，所述片段包含存在于所述蛋白质中的修饰。
20.权利要求1至19中任一项所述的方法，其还包括鉴定一个或更多个蛋白质编码区中的非同义突变。
21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中如下鉴定氨基酸修饰：对例如一个或更多个癌细胞和任选地一个或更多个非癌细胞的一个或更多个细胞的基因组或转录物组部分地或完全地测序，并鉴定一个或更多个蛋白质编码区中的突变。
22.权利要求20或21所述的方法，其中所述突变是体细胞突变。
23.权利要求20至22所述的方法，其中所述突变是癌症突变。
24.权利要求1至23中任一项所述的方法，其用于制备疫苗。
25.权利要求24所述的方法，其中所述疫苗来自于通过所述方法预测为具有免疫原性或更具免疫原性的修饰或经修饰肽。
26.用于提供疫苗的方法，其包括以下步骤：
通过权利要求1至25中任一项所述的方法来鉴定预测为具有免疫原性或更具免疫原性的修饰或经修饰肽。
27.权利要求26所述的方法，其还包括以下步骤：
提供疫苗，所述疫苗包含含有预测为具有免疫原性或更具免疫原性的修饰或经修饰肽的肽或多肽或者编码所述肽或多肽的核酸。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法产生的疫苗。
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