ES2888002B2

ES2888002B2 - Produccion de nanocelulosa bacteriana

Info

Publication number: ES2888002B2
Application number: ES202030505A
Authority: ES
Inventors: Martin Silvia Marques; Quero Patricia Marin; Von Abercron Sophie Marie Martirani; Sanchez Daniel Pacheco
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Priority date: 2020-06-01
Filing date: 2020-06-01
Publication date: 2022-05-26
Anticipated expiration: 2040-06-01
Also published as: EP4159869A1; WO2021245306A1; ES2888002A1

Description

DESCRIPCIÓN

PRODUCCIÓN DE NANOCELULOSA BACTERIANA

La presente invención se refiere al empleo de bacterias del género Starkeya para producir nanocelulosa y su uso en la fabricación de biocombustibles, biomedicina, alimentación y embalaje. Por lo tanto, la invención pertenece al campo de los biomateriales, más concretamente al campo técnico de la producción de nanocelulosa bacteriana.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La celulosa es un biopolímero orgánico compuesto de moléculas de glucosa, siendo uno de los polímeros más abundantes y que forma la mayor parte de la biomasa terrestre. La celulosa y sus posibles derivados pueden ser utilizados como materia prima para una gran variedad de aplicaciones como producción de biodiesel, en alimentación (ej., aditivos alimentarios hidrocoloides), en cosmética (ej., gelificantes), en biomedicina (apósitos para heridas, implantes, catéteres, liberación de fármacos, etc.), o como parte de materiales para distintas aplicaciones (electrónica, ingeniería, etc.), entre otros.

Actualmente la producción mundial de celulosa proviene mayoritariamente de las plantas, siendo la madera y el algodón las fuentes primordiales de celulosa para la mayoría de aplicaciones. Este material vegetal tiene que sufrir un procesamiento intensivo para la eliminación de lignina, hemicelulosa y otros componentes de la matriz vegetal, con altos costes económicos y ambientales, hasta ser purificada. Tanto los compuestos químicos utilizados durante el proceso de extracción, como los residuos generados en el proceso, implican riesgos medioambientales y problemas serios de eliminación y/o recuperación de desechos.

Además, la obtención de material vegetal requiere de cultivos extensivos de especies de plantas productoras (como el algodón), con el correspondiente uso de grandes áreas agrarias, fertilizantes, pesticidas y agua dulce para el riego. Por otra parte, el uso de maderas duras como material de partida requiere la tala de árboles, con los consiguientes problemas de deforestación.

La celulosa bacteriana o nanocelulosa se ha establecido como una alternativa importante al uso de celulosa vegetal. La celulosa producida a partir de material vegetal requiere un procesamiento químico intenso para su purificación, sin embargo, en el caso de la celulosa bacteriana, se recupera el material celulósico de forma pura con la eliminación de las células bacterianas mediante un tratamiento alcalino sencillo.

La nanocelulosa bacteriana se convierte en un nanomaterial emergente con propiedades fisicoquímicas y mecánicas que han ampliado su uso a diferentes campos. Especialmente su pureza (ya que carece de lignina y resto de materiales derivados de la madera), alto grado de polimerización y capacidad de retención de agua, así como su buena biocompatibilidad y baja toxicidad, la convierten en un material atractivo con perspectivas prometedoras en biotecnología.

Por otra parte, reducir el coste de la producción del polímero podría permitir su utilización en aplicaciones más generales, como producción de papeles especiales, o embalajes específicos para mantener la humedad de frutas y verduras para la exportación tras una modificación apropiada de las fibras. Por todos estos motivos, la producción de celulosa por bacterias se plantea como una alternativa limpia de obtención de este polímero.

Aunque la síntesis de nanocelulosa es una capacidad presente en un buen número de bacterias, la producción de este polímero de forma extracelular formando largos filamentos entrelazados creando una malla o biopelícula, es una capacidad exclusiva de algunos grupos bacterianos. Actualmente las cepas bacterianas productoras de nanocelulosa descritas y utilizadas en el mercado son heterótrofas, requiriendo una fuente orgánica de carbono para su crecimiento y para la producción del polímero.

Existe un buen número de bacterias cuyo genoma incluye genes para la síntesis de nanocelulosa. Sin embargo, sólo unos pocos grupos pueden producir celulosa nanofibrilar de calidad en grandes cantidades. Las bacterias productoras de celulosa por excelencia son las Acetobacteraceae, y entre ellas especialmente Gluconacetobacter xylinus (renombrada Komagataeibacter xylinus) y Gluconacetobacter hansenii están entre las productoras más eficientes y mejor caracterizadas (Charreau, H, et al 2013, Recent Pat Nanotchenol 7, 56-80).

El proceso básico de producción consiste en cultivar bacterias productoras de nanocelulosa en el medio adecuado con diversas fuentes orgánicas de carbono suministradas exógenamente. La producción de nanocelulosa por estas bacterias requiere de medios de cultivo ricos en fuentes de carbono orgánicas, y los esfuerzos para la optimización de los medios de cultivo con el fin de reducir los costes de producción y aumentar las tasas de síntesis son constantes.

La producción de celulosa por bacterias heterótrofas a partir de sustratos orgánicos está ampliamente descrita y su optimización ha sido objeto de numerosos estudios y patentes. Por ejemplo, en el documento US2018/0142274 A1 se describe una cepa de Komagataeibacter con una producción de nanocelulosa mejorada. En el documento CN101475973 se describe un medio de cultivo bacteriano que comprende un licor alcohólico residual, agua y azúcar para la obtención de nanocelulosa. En el documento JPH11181001 A se describe la producción de celulosa bacteriana en un medio de cultivo con polisacáridos como carboximetil celulosa y aireación y agitación mediante, por ejemplo, Acetobacter xylinum subsp. sucrofermentans.

En el estado de la técnica también se ha descrito la producción de nanocelulosa bacteriana a partir de compuestos orgánicos tóxicos, como por ejemplo mediante el cultivo celular de cepas pertenecientes a las Xanthobacteraceae, capaces de sintetizar nanocelulosa a partir de cristales de naftaleno (Marín, P., Martirani-von Abercron, S.M., et al 2019, Microb Biotechnol 12(4), 662-676).

Debido a la necesidad de una fuente orgánica de carbono para el crecimiento de dichas bacterias productoras de nanocelulosa, se requieren costes excesivos para la producción de nanocelulosa bacteriana para aplicaciones comunes.

Por otro lado, el uso excesivo de los combustibles en las actividades industriales y el transporte, se han incrementado las concentraciones de CO2 emitidas a la atmósfera en los últimos años, agravando la capacidad regenerativa de la atmosfera para eliminar el CO2, principal responsable del efecto invernadero, afectando al cambio climático mundial y al calentamiento global. Por esto, se hace necesario reducir tanto las emisiones como el CO2 existente en la atmosfera.

Por ello se hace necesario el desarrollo de métodos de producción de nanocelulosa a partir de microorganismos preferiblemente autótrofos, es decir, que utilicen fuentes de carbono inorgánico, como por ejemplo el CO2, y que excreten nanocelulosa al espacio extracelular durante su crecimiento en forma prácticamente pura sin requerir métodos complejos para su purificación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han observado que bacterias del género Starkeya son capaces de sintetizar una biopelícula de nanocelulosa a partir de fuentes de carbono como dióxido de carbono (CO2), glucosa o glicerol. Así, en la presente descripción se describe, por primera vez, la producción de nanocelulosa bacteriana mediante un proceso autótrofo, en donde dichas bacterias producen extracelularmente nanocelulosa durante su crecimiento con CO2. Además, la nanocelulosa así obtenida es nanocelulosa pura, es decir, tras la producción no hay necesidad de aplicar métodos complejos para su purificación.

La obtención de dicha biopelícula de nanocelulosa se llevó a cabo mediante el cultivo de cepas bacterianas del género Starkeya, en concreto las cepas Starkeya sp. STN1B (número de depósito CECT 30087), Starkeya sp. STN1A (número de depósito CECT 30088) y Starkeya novela DSM 506 (número de depósito DSM 506), en presencia de glucosa, glicerol crudo o CO2 como fuentes de carbono, dando lugar a la síntesis de nanocelulosa extracelular.

Además, los inventores observaron que la cepa Starkeya sp. STN1A no solo era capaz de producir una biopelícula de nanocelulosa a partir de CO2, glucosa, glicerol o naftaleno como fuentes de carbono, sino que en todos los casos la cantidad de nanocelulosa producida por Starkeya sp. STN1A fue significativamente mayor en comparación con la cantidad de nanocelulosa producida por Starkeya sp. STN1B y Starkeya novela DSM 506, en las mismas condiciones.

Mediante microscopía electrónica de barrido, los inventores comprobaron que la nanocelulosa producida por las bacterias del género Starkeya presentaba una estructura reticular tridimensional de nanofibras de aproximadamente 70 nm de diámetro y varias micras de longitud. Esta estructura es característica de la nanocelulosa bacteriana. Los inventores observaron también que la nanocelulosa obtenida estaba constituida por glucosa en un 98,2 %.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un método, de aquí en adelante el “método de la invención”, para producir nanocelulosa que comprende:

(a) cultivar al menos un microorganismo que pertenece al género Starkeya, o una población que comprende al menos un microorganismo que pertenece al género Starkeya en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono, en donde la fuente de carbono no es naftaleno, y

(b) purificar la biopelícula de nanocelulosa obtenida durante la etapa (a).

El término “nanocelulosa” o “celulosa bacteriana” o “celulosa nanofibrilar”, utilizados indistintamente en el presente documento, se refiere a un polímero nanofibrilar obtenido por el crecimiento bacteriano y que se compone de unidades de glucosa unidas por enlaces p (1^4), formando fibras de entre 10 y 100 nm de diámetro y una longitud superior a una micra, capaz de formar una estructura reticular tridimensional formando una biopelícula de celulosa.

Dicha biopelícula de nanocelulosa se obtiene durante la etapa (a) del método de la invención mediante el crecimiento o cultivo microbiológico de bacterias que pertenecen al género Starkeya.

Como entiende el experto en la materia, el crecimiento o cultivo de un microorganismo se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende los componentes necesarios para que dicho microorganismo prolifere. Así, en el presente documento, el término “medio de cultivo” se refiere a una sustancia, un compuesto, una mezcla, una disolución que comprende la fuente de carbono necesaria para el crecimiento y metabolismo del microorganismo, en donde dicho medio de cultivo puede ser sólido, semisólido, semilíquido o líquido.

En el presente documento, el término “fuente de carbono” se refiere a moléculas, compuestos químicos, materia orgánica, que comprenden átomos de carbono (C) y que son metabolizadas por los microorganismos para llevar a cabo su crecimiento y desarrollo, en donde dicha fuente de carbono puede tener origen inorgánico u orgánico.

Fuentes de carbono orgánicas e inorgánicas que pueden emplearse en el método de la invención son ampliamente conocidas en el estado de la técnica. La principal fuente de carbono inorgánica en el crecimiento microbiano es el dióxido de carbono (CO2). En el crecimiento microbiano, las fuentes de carbono orgánicas o compuestos orgánicos son moléculas que comprenden átomos de carbono formando enlaces covalentes con carbono y/o hidrógeno, que además pueden presentar en su estructura oxígeno, nitrógeno, azufre, fósforo o halógenos, entre otros elementos. Ejemplos de compuestos orgánicos incluyen, sin limitarse a, hidrocarburos, carbohidratos y lípidos, que pueden ser naturales, sintéticos o sintetizados in vivo o ex vivo por los seres vivos.

En el presente documento, el término “hidrocarburo” se refiere a moléculas o compuestos químicos formados por átomos de carbono (C) y de hidrogeno (H), que pueden tener estructura lineal, ramificada o cíclica y/o enlaces saturados (por ejemplo, los alcanos) o insaturados (por ejemplo, los alquenos o alquinos) en su estructura, y a compuestos derivados de hidrocarburos que además pueden comprender un grupo funcional como por ejemplo un grupo éster, éter, aldehído, cetona, carboxilo, hidroxilo, amina, amida, azo, nitro y sulfóxido, entre otros. Ejemplos de hidrocarburos lineales incluyen, sin limitarse a, metano, etano, propano, butano, pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, propeno, propino, buteno y butino. Ejemplos de derivados de hidrocarburos incluyen, sin limitarse a, glicerol, etanol, metanol, isopropanol, propanol, formamida y acido metanoico. Ejemplos de un hidrocarburo cíclico o aromático (y sus derivados) incluyen, sin limitarse a, benceno, tolueno, antraceno y fenantreno, entre otros.

En el presente documento, el término “carbohidrato” se refiere a moléculas o compuestos químicos formados por átomos de carbono (C), de hidrogeno (H), y de oxígeno (O). Los carbohidratos principales en el estado de la técnica son los glúcidos o azúcares, formados por 3 o más átomos de carbono en su estructura, que pueden tener dos conformaciones formando dos isómeros, “isómero D” o “isómero L”, y que se clasifican según su grado de polimerización en: monosacáridos, disacáridos, trisacáridos y polisacáridos.

Ejemplos de monosacáridos, o un derivado obtenido a partir de un monosacárido, incluyen, sin limitarse a, gliceraldehido, eritrosa, treosa, arabinosa, arabitol, xilosa, xilitol, lixosa, ribosa, alosa, altrosa, glucosa, manosa, manitol, galactosa, talosa, ribulosa, fructosa, sorbosa, sorbitol, tagatosa, gluconato y piruvato, entre otros.

Ejemplos de disacáridos incluyen, sin limitarse a, sacarosa, lactosa, maltosa, isolmaltosa, trehalosa, nigerosa y celobiosa, entre otros.

Ejemplos de trisacáridos incluyen, sin limitarse a, maltotriosa, rafinosa, nigerotriosa, panosa, melecitosa, maltotriulosa y kestosa, entre otros. Ejemplos de polisacáridos incluyen, sin limitarse a, almidón, glucógeno, celulosa, quitina, alginato, dextrano y ácido algínico, entre otros.

En el presente documento, el término “lípido” se refiere a moléculas o compuestos químicos que comprenden carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, que además pueden comprender fosforo, azufre y nitrógeno, que son hidrófobas. La principal fuente de carbono lipídica son los ácidos grasos. Ejemplos de ácidos grasos incluyen, sin limitarse a, fosfolípido, glucolípidos, triglicéridos, ácido propiónico, ácido butírico, ácido palmítico, ácido linoleico y ácido oleico, entre otros.

Por otro lado, la fuente de carbono orgánica del método de la invención también puede ser extractos de materiales vegetales o animales, o subproductos en la síntesis o fabricación de materiales o compuestos como, por ejemplo, polímeros, fibras, plásticos, detergentes, jabones, biodiesel o colorantes, entre otros. Ejemplos de extractos o subproductos incluyen, sin limitarse a, glicerina cruda, extracto de levadura, extracto de hidrolizado de soja, extracto de hidrolizado de fruta y melaza.

Cualquiera de estas fuentes de carbono puede usarse en el contexto de la presente invención. No obstante, en una realización particular del método de la invención, la fuente de carbono comprende CO2, glicerol o glucosa, así como cualquier combinación de los mismos.

Tal como se describe en los ejemplos del presente documento, las bacterias del género Starkeya son capaces de usar el glicerol presente en muestras de glicerol crudo o glicerina cruda, permitiendo así la utilización de subproductos residuales para la síntesis de nanocelulosa bacteriana.

En otra realización más particular, la fuente de carbono es CO2. El CO2 puede proporcionarse directamente en forma de aire, preferiblemente CO2 atmosférico, o en forma de bicarbonato de sodio disuelto en el medio de cultivo, o burbujeando el medio con CO2 mediante una bombona de gas.

Además, cuando la fuente de carbono es CO2, el medio de cultivo tiene que comprender otros componentes, tales como un compuesto reductor que proporcione la energía y el poder reductor necesarios para la fijación de CO2. El término "compuesto reductor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un compuesto o molécula química donador de electrones que es oxidado por las bacterias del género Starkeya en el método de la invención para la obtención de energía para la fijación del carbono y producir así nanocelulosa.

Por lo tanto, en una realización particular, el medio de cultivo empleado en el método de la invención comprende, además, un compuesto reductor. Cualquier compuesto reductor puede usarse en la presente invención. Ejemplos de compuestos reductores incluyen, sin limitarse a, tiosulfato (S2O32"), sulfuro de hidrógeno (H2S), azufre inorgánico (So), tetrationato (S4O62"), sulfito (SO32"), metanotiol (CH3SH), dimetilsulfuro (C2H6S, DMS) y dimetilsulfoniopropionato ((CHs^S+CHzCHzCOO-, DMSP). No obstante, en una realización particular del método de la invención, el compuesto reductor es un compuesto reducido de azufre y/o gas hidrógeno (H2).

Asimismo, el medio de cultivo del método de la invención puede comprender compuestos suplementarios para ayudar al crecimiento bacteriano. Ejemplos de compuestos suplementarios incluyen, sin limitar a, sales minerales, vitaminas, oligoelementos, tampón fosfato, tampón MOPS (ácido 3-morfolino propano-1-sulfonico), tampón Hepes (ácido 2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperacinil]-etanosulfónico), antibióticos, extracto de levadura, casaminoácidos, peptona, ácido cítrico y hierro quelado con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).

Como entiende el experto en la materia, el medio de cultivo empleado en el método de la invención para cultivar las bacterias del género Starkeya puede estar en estado sólido, semisólido, semilíquido o líquido. No obstante, en una realización particular, el medio de cultivo empleado en el método de la invención está en estado líquido.

Medios de cultivo líquidos para cultivar las bacterias del género Starkeya son conocidos en el estado de la técnica. Ejemplos de medios que pueden emplearse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitarse a, medio mineral de Widdel modificado (WMM, Martirani von Abercron et al., 2017), medio LB, medio PBT, medio mineral tamponado a pH 7 con vitaminas y/o oligoelementos.

La etapa (a) del método de la invención comprende cultivar una bacteria del género Starkeya, o una población que comprende una bacteria perteneciente a dicho género, en un medio de cultivo que comprende una fuente de carbono, en donde dicha fuente de carbono no es naftaleno.

El cultivo de la bacteria del género Starkeya tiene que llevarse a cabo en las condiciones adecuadas para que la bacteria pueda crecer y sintetizar nanocelulosa a partir de la fuente de carbono. Las condiciones adecuadas de pH, temperatura, humedad, etc., necesarias para cultivar bacterias del género Starkeya son ampliamente conocidas en el estado de la técnica. En general, el crecimiento de bacterias del género Starkeya requiere de una temperatura por encima de aproximadamente 10°C y por debajo de aproximadamente 40°C. Así, en una realización particular del método de la invención, la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 16°C y 40°C, preferiblemente de entre 20°C y 36°C, más preferiblemente de entre 24°C y 32°C. En otra realización todavía más particular, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo a una temperatura de 28°C.

Como entiende el experto en la materia, el tiempo que las bacterias del género Starkeya tienen que ser cultivadas para generar nanocelulosa depende de la densidad del inóculo, la producción de nanocelulosa requerida, el volumen del medio de cultivo o la superficie de soporte del cultivo. En otra realización particular, la etapa (a) del método de la invención comprende un tiempo de cultivo o incubación de entre 5 y 15 semanas.

El desarrollo y crecimiento de las bacterias que pertenecen al género Starkeya no sólo depende de la fuente de carbono, de la temperatura o del tiempo de cultivo, sino que también depende de otros factores como los niveles de oxígeno en el medio de cultivo.

Los niveles de oxígeno en el medio de cultivo durante el crecimiento de una bacteria del género Starkeya (etapa (a) del método de la invención) pueden variar en un amplio intervalo, desde bajas tensiones de oxígeno o en condiciones de microaerofilia hasta altas tensiones de oxígeno o saturantes, ambas con o sin agitación.

Por lo tanto, en otra realización particular, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo en condiciones microaerófilas sin agitación. El término “condiciones microaerófilas” o de “microaerofilia”, tal como se emplea en la presente descripción, se refiere a la entrada controlada de aire para mantener los niveles de oxígeno reducidos, alrededor de un 5% (particularmente por debajo de 5 ppm) y en una concentración elevada de dióxido de carbono entre 5 y 10%.

En otra realización particular, y alternativamente a la realización anterior, la etapa (a) del método de la invención se lleva a cabo en condiciones de agitación entre 25 y 150 rpm sin control de entrada de aire, preferiblemente de entre 50 y 100 rpm, más preferiblemente a 75 rpm.

No obstante, como entiende en experto en la materia, si se quiere optimizar el método de la invención y aumentar o acelerar la producción de nanocelulosa por parte de las bacterias del género Starkeya, la etapa (a) puede llevarse a cabo en condiciones de baja concentraciones de oxígeno en favor de altas concentraciones de CO2 pues, como se ha explicado al inicio de la presente descripción, la presente invención se basa en el descubrimiento de que las bacterias del género Starkeya pueden producir nanocelulosa a partir de CO2 como fuente de carbono.

Taxonómicamente, el género Starkeya pertenece a la familia de las Xanthobacteraceae. Dicho género comprende actualmente las especies S. koreensis y S. novella. Las bacterias del género Starkeya son bacterias quimiolitoautótrofas, heterótrofas facultativas, es decir, bacterias capaces de crecer en un medio de cultivo utilizando como fuente de carbono compuestos inorgánicos y/o compuestos orgánicos.

En la puesta en práctica del método de la invención, los inventores utilizaron las cepas bacterianas del género Starkeya denominadas en el presente documento como Starkeya sp. STN1B y Starkeya sp. STN1A. Las cepas STN1B y STN1A comprenden un genoma con una identidad de secuencia media de nucleótidos inferior a 95% comparado con el genoma de una cepa tipo S. novella DSM 506.

Esto es indicativo de que las cepas STN1B y STN1A no pertenecen a la especie S. novella, así como tampoco a S. koreensis, y por tanto serían una nueva especie del género Starkeya. Por lo que cualquier bacteria del género Starkeya puede usarse en el método de la invención, tales como Starkeya novella DSM 506, Starkeya sp. STN1B (número de depósito CECT 30087) o la cepa Starkeya sp. STN1A (número de depósito CECT 30088).

La cepa Starkeya sp. STN1B fue aislada a partir de un cultivo de enriquecimiento de una muestra de acuífero contaminado con hidrocarburos, cultivada en medio mineral de Widdel modificado (WMM) con cristales de naftaleno como única fuente carbono, como se describe en Martirani von Abercron et al., 2017, Microb. Biotechnol. 10(6), 1781-1796. La cepa Starkeya sp. STN1B fue depositada el 25 de febrero de 2020 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA). El número de depósito asignado fue el CECT 30087. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

La cepa Starkeya sp. STN1A fue aislada por tener diferente morfología de colonia a partir de cultivos puros de la cepa STN1B en medio WMM con naftaleno como única fuente de carbono y siembras por dilución en medio WMM sólido con LB diluido 1/10 como fuente de carbono. La cepa Starkeya sp. STN1A fue depositada el 25 de febrero de 2020 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA). El número de depósito asignado fue el CECT 30088. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

La cepa con número de depósito CECT 30088 (Starkeya sp. STN1A) es una cepa mutante espontánea de la cepa con número de depósito CECT 30087 (Starkeya sp. STN1B) que comprende una deleción estable de un fragmento de 62-65 kb del genoma, además de una serie de mutaciones puntuales. Esta cepa presenta un aumento significativo de la capacidad de síntesis de nanocelulosa con cualquier fuente de carbono en el medio de cultivo.

No obstante, en una realización particular, la bacteria del género Starkeya es la cepa de Starkeya sp. STN1B (número de depósito CECT 30087) o la cepa Starkeya sp. STN1A (número de depósito CECT 30088).

Finalmente, el método de la invención comprende una etapa b) que comprende la purificación de la biopelícula de nanocelulosa del medio extracelular. Es práctica de rutina para un experto en la materia determinar los métodos de purificación de nanocelulosa del medio extracelular. Ejemplos de métodos de purificación de nanocelulosa incluyen, sin limitarse a, decantación, lavados con agua bidestilada, hidrólisis celular mediante tratamientos alcalinos, filtración, precipitación, centrifugación, sedimentación, tratamiento con hipoclorito sódico, tratamiento con agentes surfactantes, tratamiento con hidróxido de potasio, tratamiento con hidróxido de sodio, extracción con solventes orgánicos y calentamiento.

Mediante el método de la invención, se producen polímeros de nanocelulosa a partir de cualquier fuente de carbono, preferiblemente, a partir de CO2. Por tanto, otro aspecto de la presente invención es un polímero de nanocelulosa, de aquí en adelante "polímero de la invención”, obtenido u obtenible por el método de la invención.

El término "nanocelulosa” ha sido definido en párrafos anteriores del presente documento y se aplica de igual forma a este aspecto de la invención.

Mediante microscopía electrónica de barrido, los inventores comprobaron que el polímero de la invención presentaba una estructura reticular tridimensional de nanofibras de aproximadamente 70 nm de diámetro y varias micras de longitud. Los inventores observaron también que la nanocelulosa obtenida estaba constituida por glucosa en un 98,2 %.

Como entiende un experto en la materia, el polímero de la invención puede estar contenido dentro de una composición. Así, otro aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende el polímero de la invención, de aquí en adelante "primera composición de la invención”.

Debido a la capacidad para la producción de nanocelulosa de las bacterias que pertenecen al género Starkeya, otro aspecto de la presente invención es el uso de un microorganismo que pertenece al género Starkeya, o una población que comprende dicho microorganismo, de aquí en adelante el "uso de la invención”, para la producción de nanocelulosa, en donde la producción de nanocelulosa se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono, en donde la fuente de carbono no es naftaleno.

Los términos "nanocelulosa”, "género Starkeya”, “medio de cultivo” y "fuente de carbono” han sido definidos en párrafos anteriores del presente documento, y se aplican de igual forma a este aspecto de la invención, así como a todas sus realizaciones particulares (solas o en combinación).

Así, en otra realización particular del uso de la invención, la fuente de carbono se selecciona de la lista que consiste en CO2, glicerol, glucosa y cualquier combinación de los mismos.

En otra realización más particular del uso de la invención, la fuente de carbono comprende CO2. El CO2, puede proporcionarse directamente en forma de aire, preferiblemente CO2 atmosférico, o en forma de bicarbonato de sodio disuelto en el medio de cultivo, o burbujeando el medio con CO2 mediante una bombona de gas.

Además de la fuente de carbono, el medio de cultivo para el uso de la invención puede comprender un compuesto o molécula química donador de electrones para proporcionar energía, denominado compuesto reductor. Así, en otra realización particular del uso de la invención, el medio de cultivo para la producción de nanocelulosa además comprende un compuesto reductor. Particularmente, cuando la fuente de carbono es CO2, el medio de cultivo tiene que comprender al menos un compuesto reductor que proporcione la energía y el poder reductor necesarios para la fijación de CO2.

El término "compuesto reductor” ya se ha descrito en otros aspectos de la invención anteriores, y se aplica de igual modo al presente aspecto. En otra realización particular del uso de la invención, el compuesto reductor es un compuesto reducido de azufre y/o gas hidrógeno (H2). Ejemplos de compuestos reducidos del azufre incluyen, sin limitarse a, tiosulfato (S2O32"), sulfuro de hidrógeno (H2S), azufre inorgánico (S0), tetrationato (S4O62"), sulfito (SO32"), metanotiol (CH3SH), dimetilsulfuro (C2H6S, DMS) y dimetilsulfoniopropionato ((CH3)2S+CH2CH2COO“, DMSP).

Además, el medio de cultivo empleado en el uso de la invención puede comprender compuestos químicos suplementarios para ayudar al crecimiento bacteriano durante la producción de nanocelulosa. Ejemplos de compuestos químicos suplementarios incluye, sin limitarse a, sales minerales, vitaminas, oligoelementos, compuestos tamponadores como tampón fosfato, tampón MOPS (ácido 3-morfolino propano-1-sulfonico), tampón Hepes (ácido 2-[4-(2-Hidroxietil)-1-piperacinil]-etanosulfónico), antibióticos, extracto de levadura, casaminoácidos, peptona, ácido cítrico y, hierro quelado con EDTA (ácido etilendiaminotetraacético).

Al igual que en el método de la invención, cualquier microorganismo del género Starkeya puede usarse en la producción de nanocelulosa. No obstante, en una realización particular del uso de la invención, el microorganismo del género Starkeya se selecciona de la lista que consiste en la cepa Starkeya sp. STN1B con número de depósito CECT 30087 y la cepa Starkeya sp. STN1A con número de depósito CECT 30088.

Las cepas STN1B y/o STN1A que pertenecen al género Starkeya, ya se han descrito en otros aspectos de la invención anteriores, y se aplica de igual modo a este aspecto de la invención.

La cepa con número de depósito CECT 30088 (Starkeya sp. STN1A) presenta un aumento significativo de la capacidad de síntesis de nanocelulosa, por ello en otra realización más particular del uso de la invención, el microorganismo que pertenece al género Starkeya para la producción de nanocelulosa es Starkeya sp. STN1A.

Tal y como se ha descrito anteriormente en el presente documento, la producción de nanocelulosa se desarrolla durante el crecimiento de bacterias del género Starkeya, que requieren un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono y de una temperatura por encima de aproximadamente 10°C y por debajo de aproximadamente 40°C. Así, en una realización particular del uso de la invención, el crecimiento/cultivo de la bacteria del género Starkeya se lleva a cabo a una temperatura de entre 16°C y 40°C, preferiblemente de entre 20°C y 36°C, más preferiblemente de entre 24°C y 32°C. En otra realización todavía más particular del uso de la invención, el crecimiento/cultivo se lleva a cabo a una temperatura de 28°C.

En otra realización particular del uso de la invención, el medio de cultivo es líquido. Medios de cultivo líquidos para cultivar las bacterias del género Starkeya han sido descritos previamente en la presente descripción y son aplicables al uso de la invención.

También es práctica de rutina para un experto en la materia determinar el tiempo de cultivo que se requiere para que la bacteria del género Starkeya, o una población bacteriana que comprende dicha bacteria, produzca nanocelulosa. Como ya se ha explicado, dicho tiempo de cultivo depende de la densidad del inóculo, el volumen del medio de cultivo o la superficie de soporte de cultivo. En otra realización particular del uso de la invención, la producción de nanocelulosa se lleva a cabo en un tiempo de cultivo o incubación de entre 5 y 15 semanas.

En el uso de la invención, la producción de nanocelulosa no sólo depende de la fuente de carbono y del medio de cultivo, la temperatura o el tiempo de cultivo, sino también de los niveles de oxígeno durante el crecimiento microbiano.

Así, en otra realización particular, la producción de nanocelulosa del uso de la invención se lleva a cabo en condiciones microaerófilas y sin agitación. El termino “condiciones microaerófilas” ha sido definido en párrafos anteriores y es aplicable a la presente realización.

En otra realización particular, y alternativamente al párrafo anterior, la producción de nanocelulosa se lleva a cabo en condiciones de agitación entre 25 y 150 rpm sin control de entrada de aire, preferiblemente de entre 50 y 100 rpm, más preferiblemente a 75 rpm.

El cultivo de la cepa Starkeya sp. STN1A aislada por los inventores dio lugar a un aumento significativo de la capacidad de síntesis de nanocelulosa, independientemente de la fuente de carbono utilizada para su crecimiento. Por lo tanto, la cepa Starkeya sp. STN1A presenta unas propiedades mejoradas en la producción de nanocelulosa en comparación con otras bacterias del género Starkeya.

En consecuencia, otro aspecto de la invención se relaciona con una cepa del género Starkeya, con número de depósito CECT 30088 (Starkeya sp. STN1A), de aquí en adelante la “cepa de la invención”.

Tal como se usa en el presente documento, el término "cepa" se refiere a una variante genética o subtipo de un organismo del género Starkeya.

En la presente invención también se contempla una cepa derivada de la cepa de la invención con número de depósito CECT 30088 (STN1A).

Tal como se usa en el presente documento, los términos "mutante" o "cepa mutante" o “derivada” o “cepa derivada” son equivalentes y se refieren a cualquier microorganismo que resulta de la mutación o cambio en el ADN de uno o varios genes de la cepa Starkeya sp. con número de depósito CECT 30088 (Starkeya sp. STN1A) y que mantiene en esencia las propiedades de síntesis de nanocelulosa, tal y como se describe en la presente invención. La cepa derivada puede producirse de forma natural o bien de forma intencionada, por métodos de mutagénesis conocidos en el estado de la técnica como, a modo de ejemplo, el crecimiento del microorganismo original en presencia de agentes mutagénicos o causantes de estrés, o mediante ingeniería genética dirigida a la modificación de genes específicos.

Como sabe un experto en la materia, la cepa de la invención o la cepa derivada o mutante puede estar comprendida en una población bacteriana. Por tanto, otro aspecto de la presente invención se refiere a una población bacteriana que comprende la cepa de la invención o la cepa derivada o mutante de la misma, denominada de aquí en adelante "población bacteriana de la invención”.

Los términos "cepa”, "cepa derivada o mutante”, han sido definidos en párrafos anteriores del presente documento, y se aplica de igual forma a este aspecto de la invención.

Como entiende el experto en la materia, tanto la cepa de la invención, la cepa derivada o mutante o la población de la invención, pueden estar contenidos dentro de una composición.

Así, en otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende la cepa de la invención, la cepa derivada o mutante de la misma, o la población de la invención, así como cualquier combinación de los mismos, de aquí en adelante "segunda composición de la invención”, incluyendo todas las realizaciones particulares definidas en los párrafos anteriores.

Debido a la capacidad mejorada de la cepa con número de depósito CECT 30088 (Starkeya sp. STN1A) para la síntesis de nanocelulosa, independientemente de la fuente de carbono utilizada para su crecimiento, otro aspecto de la presente invención es el uso de la cepa de la invención, o de la población bacteriana de la invención, o de la segunda composición de la invención, para la producción de nanocelulosa, de aquí en adelante el "segundo uso de la invención”.

La producción de nanocelulosa del segundo uso de la invención se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono, en donde la fuente de carbono puede tener origen inorgánico u orgánico. Los términos "nanocelulosa”, "medio de cultivo” y "fuente de carbono” ya han sido descritos en aspectos anteriores en el presente documento y son aplicados, así como sus realizaciones particulares, de igual modo a este aspecto inventivo.

En otra realización particular, la fuente de carbono del segundo uso de la invención es CO2, naftaleno, glicerol o glucosa, así como cualquier combinación de los mismos, preferiblemente la fuente de carbono es CO2.

En otra realización particular el medio de cultivo del segundo uso de la invención además comprende un compuesto reductor. El término "compuesto reductor” ya ha sido descrito en aspectos anteriores en el presente documento y son aplicados, así como sus realizaciones particulares, de igual modo a esta realización particular.

El crecimiento microbiano de la cepa con número de depósito CECT 30088 (Starkeya sp. STN1A) requiere las condiciones de temperatura, estado del medio de cultivo, tiempo de cultivo, niveles de oxígeno del medio de cultivo de igual modo que en aspectos inventivos anteriormente descritos, así como sus realizaciones particulares, y que aplican de igual modo para este aspecto inventivo.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Imágenes de microscopía electrónica de barrido de la biopelícula producida por un cultivo de la cepa STN1B creciendo en el medio PBT. Izquierda, vista de la biopelícula a 20,00 KX. Derecha, detalle a 50,00 KX para estimar el diámetro de las fibras, aproximadamente 70 nm.

Figura 2. Espectro de espectroscopía infrarroja con transformadas de Fourierreflectancia total atenuada (ATR-FTIR) de una membrana de celulosa producida por la cepa STN1B en cultivo con bicarbonato (CO2) como única fuente de carbono.

Figura 3. A y B) Imágenes de microscopía electrónica de barrido de biopelículas producidas por la cepa STN1A creciendo en el medio PBT. A) vista de la biopelícula a 10,00 KX. B) detalle a 30,00 KX. C) Imágenes de microscopía electrónica de barrido de biopelículas producidas por la cepa STN1A creciendo con glucosa como fuente de carbono (10,00 KX).

Figura 4. Espectro de ATR-FTIR de una membrana de celulosa producida por la cepa STN1A en cultivo con bicarbonato (CO2) (A), o glucosa (B), como única fuente de carbono.

Figura 5. Imagen de la nanocelulosa sintetizada por las cepas STN1B, STN1A y DSM 506 creciendo con glucosa como fuente de carbono.

Figura 6. Imagen de microscopía electrónica de barrido de una biopelícula producida por la cepa S. novella DSM 506 en medio de cultivo PBT con bicarbonato (CO2) como única fuente de carbono.

EJEMPLOS

A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad de la invención.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cepas bacterianas

La cepa Starkeya sp. STN1B fue depositada el 25 de febrero de 2020 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA). El número de depósito asignado fue el CECT 30087. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

La cepa Starkeya sp. STN1A fue depositada el 25 de febrero de 2020 bajo el Tratado de Budapest en la Colección Española de Cultivos Tipo como Autoridad Internacional de Depósito (con sede en el Edificio 3 CUE, Parc Científic Universitat de Valencia, C/ Catedrático Agustín Escardino, 9, 46980 Paterna (Valencia) ESPAÑA). El número de depósito asignado fue el CECT 30088. El depositante de la cepa fue el Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC).

La cepa Starkeya novella DSM 506 (Kelly et al., 2000, Int J Syst Evol Microbiol 50, 1797-1802), aislada por R. L. Starkey en 1934, fue depositada bajo el Tratado de Budapest en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ) como Autoridad Internacional de Depósito, localizada en Leibniz Institute DSMZ, Inhoffenstra&e 7B, 38124, Braunschweig (Alemania). El número de depósito asignado fue DSM 506.

Aislamiento de cepas bacterianas

La cepa Starkeya sp. STN1B fue aislada a partir de un cultivo de enriquecimiento de una muestra de acuífero contaminado con hidrocarburos, cultivado en medio mineral de Widdel modificado (WMM) con cristales de naftaleno como única fuente carbono, como se describe en Martirani von Abercron et al., 2017, Microb. Biotechnol. 10(6), 1781-1796. Los cultivos los mantuvieron en botellas de 120 ml rellenas con 75 ml del medio y tapadas con un tapón de butilo envuelto en una capa de cinta de teflón para permitir el paso controlado de aire. Las botellas se sellaron con cierre de aluminio con orificio central. Tras varios pases de enriquecimiento (cada 1 ó 2 meses se transferían 10 % (v/v) del cultivo a medio fresco), la comunidad bacteriana estaba dominada por dos cepas, una de las cuales era Starkeya sp. STN1B, que fue aislada por los inventores en medio WMM sólido (1,8% de agar) con naftaleno como única fuente de carbono.

El medio WMM contiene: 30 mM de tampón MOPS (ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico) a pH 7,2; 8 mM KNO3; 17,1 mM NaCl; 6,7 mM KCl; 0,6 mM CaCL; 4,7 mM NH4Cl; 2 mM MgCh; 1,44 mM KH2PO4; 1 mM Na ² SO ⁴ . Por cada 50 ml, la solución se suplementa con 15 pl de una solución de vitaminas, 50 pl de la solución de elementos traza SL10, 50 pl de una solución de selenio-wolframio y biotina hasta una concentración de 1 pM.

La cepa Starkeya sp. STN1A fue aislada a partir de cultivos puros de la cepa STN1B en medio WMM con naftaleno como única fuente de carbono y siembras por dilución en medio WMM sólido con LB diluido 1/10 como fuente de carbono, por tener diferente morfología de colonia que las colonias de la cepa STN1B. El medio LB sin diluir contenía, en 1 litro de agua, 10 g de bactotriptona, 5 g de extracto de levadura y 10 g de cloruro sódico. Con cierta frecuencia las colonias resultantes aparecieron con una morfología diferente (pálidas y transparentes). El análisis de estas colonias mostró que se trataba de una cepa de Starkeya spp. que había perdido un fragmento del cromosoma y tenía una capacidad mayor de sintetizar celulosa, resultando en una nueva cepa del género Starkeya, la cual ha sido depositada con el número de depósito CECT 30088.

La cepa mutada Starkeya sp. STN1B bcsA fue obtenida por los inventores mediante la eliminación de una parte del gen bcsA, cuya secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 1, correspondiente a la celulosa sintasa, y por tanto deficiente en la síntesis de celulosa. La secuencia de la agrupación génica para la síntesis de celulosa en Starkeya sp. STN1B y STN1A, que incluye el gen bcsA, está depositada en la base de datos GenBank con el número de acceso MK350252. Los inventores la construyeron por doble recombinación homóloga como se describe en Marin et al., Microb. Biotechnol. 2019 12(4),662-676. La parte del gen delecionado bcsA (SEQ ID NO: 1) sintetiza una proteína inactiva con una deleción que abarca entre los residuos Ser285 y Pro689. La cepa Starkeya sp. con numero de depósito CECT 30088 (STN1A) mutada en el gen bcsA (SEQ ID NO: 1) para la celulosa sintasa, y por tanto deficiente en la síntesis de celulosa, fue construida por los inventores por doble recombinación homóloga, siguiendo el mismo protocolo utilizado para el mutante de la cepa STN1B.

Medios y condiciones de cultivo para producción de nanocelulosa

Los inventores cultivaron las cepas en condiciones microaerófilas a 28°C y sin agitación, en botellas de 50 ó 100 ml, llenadas hasta en un 80% de su capacidad con el medio PBT, o en matraces de distinto volumen (entre 100 y 500 ml) y llenos hasta un 40% de su capacidad con el medio PBT.

Un cultivo de 40 ml de medio PBT debe contener: 50 mM de tampón fosfato a pH 7,2; 8 mM KNO3; 17,1 mM NaCl; 6,7 mM KCl; 0,6 mM CaCh ; 4,7 mM NH4C 2 mM MgCh ; 1,44 mM KH2PO4; 1 mM Na2SO4. Por cada 40 ml, la solución se suplementa con 12 pl de una solución de vitaminas, 40 pl de la solución de elementos traza SL10, 40 pl de una solución de selenio-wolframio y biotina hasta una concentración de 1 pM. El tampón fosfato se obtiene de diluir 5 veces de una solución stock 0,5 M preparada, mezclando, en 1 litro de agua, 21,8 g de NaH ² PO ⁴ -2H ² O y 64,07 g de NaH ² PO ⁴ -2H ² O, y ajustando el pH final a 7,2.

La solución de vitaminas se prepara en tampón fosfato 10 mM a pH 7,1 y contiene en 100 ml: 4 mg de ácido 4-aminobenzóico, 1 mg de D(+)-biotina, 10 mg de ácido nicotínico, 5 mg de D(+) pantotenato de calcio, 15 mg de piridoxina dihidroclururo. La solución de elementos traza se prepara añadiendo en un litro de agua: 13 ml de HCl 25%; 10 mg de H3BO3; 5 mg de MnCh ^ ^ O; 2,1 g FeSO ⁴ -7H ² O; 190 mg de CoCh -6H2O; 24 mg NiCh ^ ^ O; 2 mg CuCh ^ ^ O; 144 mg ZnSO ⁴ -7H ² O. La solución de selenio-wolframio se prepara añadiendo en 1 litro de agua: 400 mg de NaOH, 6 mg de Na ² SeO ³ -5H ² O, 36 mg de Na ² MoO ⁴ -2H ² O, 8 mg de Na ² WO ⁴ -2H ² O. El tiosulfato sódico se añade a partir de una solución stock 200 mM, obtenida disolviendo 50 g de Na ² S ² O ³ -5 H2O en 1 litro de agua.

Finalmente, el medio se suplementa, en su caso, con 20 mM de bicarbonato sódico como fuente de carbono y 40 mM de tiosulfato sódico (concentraciones finales). Opcionalmente, en el medio se pueden añadir los antibióticos kanamicina a 5 pg/ml y ácido nalidíxico a 10 pg/ml.

Los inventores inocularon dichos medios de cultivo con las cepas DSM 506, STN1B o STN1A, descritas anteriormente, a partir de un cultivo saturado, con la cantidad necesaria para obtener un cultivo con una turbidez inicial, medida como absorbancia A660, de entre 0,01 y 0,005. Una vez inoculadas las cepas, los inventores taparon las botellas con los cultivos con un tapón de butilo, y los sellaron con un cierre de aluminio con orificio central, permitiendo perforar el tapón con una aguja hipodérmica de calibre 30 rellena con fibra de algodón para permitir el paso controlado de aire estéril. En el caso de los cultivos en matraces, estos se taparon con un tapón de algodón hidrófilo. Dicho proceso lo llevaron a cabo con material previamente esterilizado y en condiciones de esterilidad.

Para volúmenes mayores, los inventores utilizaron recipientes de distinto material de vidrio y plástico, como placas de Petri de vidrio de 18 cm de diámetro o bandejas tapadas de borosilicato o polipropileno de 5-10 cm de profundidad y 160-1400 cm ² de superficie, llenas hasta la mitad de su volumen con medio PBT. Inocularon los cultivos en bandeja con la cantidad proporcional de cultivo, mantenidos estáticos a 28°C.

Cuando la fuente de carbono es glucosa o glicerol, las condiciones y medio de cultivo son los mismos, a excepción del bicarbonato y tiosulfato que fueron eliminados del medio, y los inventores añadieron glicerol o glucosa a una concentración final de 50 y 25 mM, respectivamente.

Preparación de las muestras para la caracterización de la celulosa

Una vez sintetizada la biopelícula de nanocelulosa en el medio de cultivo, los inventores la recogieron por decantación, la traspasaron a matraces de vidrio, donde la lavaron por incubación en agua bi-destilada durante 24-48 horas con cambios frecuentes de agua. Para eliminar las células bacterianas, los inventores trataron la biopelícula con una solución acuosa de KOH al 1% con agitación suave (50 rpm) durante 24-48 horas.

Posteriormente, eliminaron esta solución y sometieron la biopelícula a lavados continuados con agua bi-destilada durante 24-48 horas, con varios cambios de agua hasta obtener un pH neutro. Tras la hidrólisis celular y lavado, y previo a la caracterización del polímero, escurrieron este y lo congelaron a -80°C durante 24 horas para su liofilización posterior, llevada a cabo con un liofilizador VirTis modelo Benchtop a -100°C con una presión de vacío de 7 mT durante 5-12 horas.

Para la determinación del peso seco de la nanocelulosa producida por las tres cepas, una vez eliminadas las bacterias con KOH y lavadas con agua destilada, las muestras húmedas se secaron durante varios días a 50°C, controlando la disminución del peso del material hasta que este se mantuviera estable tras varias medidas. Se tomaron esos valores finales como peso seco.

Caracterización de la nanocelulosa

Los inventores confirmaron la composición química de la celulosa tras su hidrólisis química mediante: i) deconstrucción de la celulosa por disolución completa de 10 mg del polímero liofilizado en 190 mg del líquido iónico cloruro de 1-etil-3-metilimidazolio [EMIM][Cl] a 140°C durante 1,5-2 horas de incubación, ii) reconstrucción posterior de la estructura por precipitación con 1 ml de agua MilliQ fría y lavado del precipitado con agua MilliQ y iii) hidrólisis del precipitado resultante, resuspendido en 0,8 ml de agua MilliQ, por adición de ácido sulfúrico para alcanzar 0,2 M final, e incubación a 140°C durante 5 horas.

Los inventores filtraron la solución resultante para cuantificar el material sólido no hidrolizado, y analizaron el líquido resultante mediante GC-MS en los Servicios de Instrumentación Científica de la Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada. Para ello, secaron las muestras con nitrógeno gaseoso, y derivatizaron con 150 pl de reactivo de oximación y posteriormente con 100 pl de reactivo de sililación (ambas reacciones a 75°C durante 30 minutos). De esta forma, los inventores obtuvieron los derivados trimetilsililoxima de los azúcares presentes, que analizaron en un equipo Varian 450GC 240MS inyectando 1 pl a 230°C en modo splitless, con un flujo de He a 1 ml/min y una rampa de temperatura desde 150°C durante 5 min a 5°C/min hasta 250°C, seguido de una rampa a 30 °C/min hasta 310°C durante 3 min.

Posteriormente, los inventores llevaron a cabo la detección mediante espectrómetro de masas de trampa de iones trabajando con ionización en impacto electrónico y rango de masas entre 50 y 600 u.m.a en modo TIC Full Scan y SIM. La identificación de compuestos la realizaron por coincidencia con tiempo de retención y espectro de masas de un patrón de glucosa inyectado en las mismas condiciones. Esta detección se llevó a cabo en los servicios técnicos de la Estación Experimental del Zaidín.

Los inventores analizaron los grupos funcionales característicos de la celulosa mediante espectroscopía infrarroja con transformadas de Fourier - reflectancia total atenuada (ATR/FTIR). Registraron los espectros con un espectrofotómetro JASCO FT/IR 6200 TypeA equipado con el accesorio de reflectancia total atenuada ATR PRO ONE, y con el software SPECTRA MANAGER v2. Registraron las medidas tras una media de 100 barridos con una resolución de 2 cm-1 en el rango de 400 a 4000 cm-1. Antes de los análisis, secaron las muestras liofilizadas durante 24 h en un horno a 60°C. Estas determinaciones se llevaron a cabo con los equipos disponibles en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada.

Microscopía electrónica de barrido (SEM)

Los inventores realizaron la preparación de especímenes y el análisis SEM en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada. Recuperaron las muestras de celulosa de los distintos cultivos con cuidado desde las botellas después de drenar el medio, tras lo cual las fijaron durante 2 h a 4°C en 2,5% de glutaraldehído preparado en tampón cacodilato a pH 7,4. Una vez fijadas, lavaron las muestras tres veces (15 minutos cada vez) con el mismo tampón a 4°C y las incubaron durante 1 h en 1% de tetróxido de osmio a temperatura ambiente, tras lo cual las lavaron tres veces durante 5 min con agua.

Posteriormente, los inventores deshidrataron las muestras en un gradiente creciente de etanol desde el 50% hasta el 100%. Disecaron las muestras adicionalmente con dióxido de carbono en un Leica EM CPD300 según el protocolo descrito en Anderson et al. 1951, Trans NY Acad Sci 13, 130-134. Los inventores cubrieron las muestras con carbón en un evaporador EMTECH K975X y las observaron en un microscopio de barrido Zeiss SUPRA40VP equipado con un cañón de emisión de tipo Schottky.

RESULTADOS

STN1B produce una biopelícula creciendo con CO2 como única fuente de carbono

Los inventores analizaron la capacidad de la cepa STN1B para producir celulosa a partir de CO2, en forma de bicarbonato sódico, utilizando tiosulfato sódico como fuente de azufre reducida. Durante su crecimiento, la cepa desarrolló una biopelícula de aspecto esponjoso en el fondo de la botella, y analizaron su estructura mediante microscopia electrónica de barrido cuyos resultados se pueden ver en la figura 1. Los inventores observaron que la cepa Starkeya sp. STN1B producía nanocelulosa extracelular con CO2, capacidad nunca descrita anteriormente en otras bacterias del estado de la técnica.

Características de la biopelícula producida por STN1B

Para visualizar la estructura de la matriz de la biopelícula que se forma cuando la cepa crece con bicarbonato como única fuente de carbono, los inventores mediante microscopía electrónica de barrido (SEM), demostraron la presencia de una estructura reticular tridimensional hecha de nanofibras de aproximadamente 70 nm de diámetro y varias micras de longitud (Figura 1). La red de fibras forma poros amplios entre ellas, y se observa la presencia de algunos bacilos de aproximadamente 1 pm de longitud, sumergidos en la red de nanofibras, en contacto con una o varias de estas fibras, demostrando que la cepa produce una estructura extracelular de nanocelulosa bacteriana.

Los inventores utilizaron espectroscopia de infrarrojos por transformadas de Fourier con reflectancia total atenuada (ATR-FTIR) para confirmar la naturaleza del polímero. Los resultados confirmaron que el material obtenido a partir de los cultivos con bicarbonato como única fuente de carbono mostraba el perfil característico de la celulosa bacteriana (Figura 2): un pico ancho a 3279 cm-1, correspondiente a las vibraciones de estiramiento de los grupos OH; picos a 2914 y 2850 cm-1, correspondientes a las vibraciones de estiramiento de los grupos CH; picos a 1161 y 1105 cm-1, correspondientes a la vibración de los enlaces C-O-C de los puentes glicosidicos. Este espectro es compatible con la celulosa de tipo I, aunque no se puede descartar la presencia de algo de celulosa de tipo II. Los picos a 1630 y 1532 cm-1 son inesperados, y podrían reflejar la presencia de moléculas de agua, o bien la presencia de restos celulares tras el tratamiento con KOH para eliminar las células, que suelen aparecer como picos en el rango 1750-1400 cm-1.

STN1A produce una biopelícula creciendo con CO ² como única fuente de carbono

La cepa STN1A, cepa mutante con deleción de un fragmento significativo del genoma de STN1B además de una serie de mutaciones puntuales a lo largo de toda su secuencia, muestra una capacidad aumentada significativa de sintesis de celulosa. Esta cepa creciendo en un recipiente de 160 cm2 de superficie lleno con 300 ml de medio PBT (es decir, con CO2 y tiosulfato como únicas fuentes de carbono y energía, respectivamente) es capaz de formar una película de celulosa consistente.

Al igual que la biopelícula formada por la cepa STN1B, los inventores demostraron que la biopelícula sintetizada a partir de CO2 por la cepa STN1A tenía las características típicas de nanocelulosa bacteriana, y estaba formada por fibras de varias micras de longitud y entre 60 y 70 nm de diámetro (Figura 3A y 3B), dejando grandes huecos en el entramado. Dentro del entramado y en contactos con las fibras se observaban bacilos de aproximadamente 1 pm de longitud.

La estructura formada por la cepa STN1A creciendo en glucosa como fuente de carbono mostraba una estructura semejante, típica de nanocelulosa bacteriana (Figura 3C).

Los cromatogramas en GC-MS del producto de hidrólisis derivatizado de dicha biopelícula mostraron que la glucosa era el único componente del polímero. Los inventores lo confirmaron mediante espectroscopía ATR-FTIR. La figura 4A muestra un espectro de la biopelícula formada por STN1A creciendo con CO2 como única fuente de carbono, presentando un perfil semejante al de la cepa STN1B, característico de celulosa bacteriana.

La cepa STN1A presenta una capacidad de producir celulosa con otras fuentes de carbono

Utilizando glucosa o glicerina cruda como fuente de carbono, la cepa STN1A es capaz de sintetizar nanocelulosa. La producción de la cepa STN1B fue de 106 mg de nanocelulosa por g de glucosa consumida, la de la cepa DSM506 fue de 170 mg de nanocelulosa por g de glucosa consumido, y la de la cepa STN1A fue muy superior, de 609 mg de nanocelulosa por g de glucosa consumido (Figura 5). La figura 4B muestra el espectro de la biopelícula obtenida a parir de la cepa STN1A creciendo con glucosa como fuente de carbono. La producción se puede comparar con las descritas en el estado de la técnica, como el arquetipo Komagataeibacter xylinus. La producción de nanocelulosa por distintas cepas de Komagataeibacter xylinus descrita en la literatura, y determinada en las mismas condiciones de secado, oscila entre 190 y 210 mg de nanocelulosa por g de glucosa consumida (Zhong C, et al., 2013. Appl Microbiol Biotechnol. 2013;97(14):6189-6199; Vazquez, A., et al., 2013. J Polym Environ, 21, 545-554), por lo que la cepa STN1A tiene unos niveles de producción superiores.

Además, STN1A en medio con glicerina cruda como única fuente de carbono produce 289 mg de nanocelulosa por g de glicerol consumido.

La biopelícula está compuesta exclusivamente de celulosa

Los cromatogramas mostraron que el material extraído de las biopelículas obtenidas estaba constituido exclusivamente por glucosa, que constituía el 98,2 % de los carbohidratos presentes. La composición del material extraído de un cultivo de la cepa creciendo en glucosa en vez de bicarbonato como única fuente de carbono fue la misma: exclusivamente glucosa.

Para confirmar la naturaleza celulósica de la matriz de la biopelícula, los inventores utilizaron mutantes de las cepas STN1B y STN1A con una deleción en el gen bcsA (SEQ ID NO: 1) que codifica la subunidad principal de la celulosa sintasa, que genera una proteína truncada inactiva. Observaron que la inactivación del gen bcsA era suficiente para que las dos cepas mutantes perdieran la capacidad de formar una biopelícula creciendo en bicarbonato como fuente de carbono, así como cuando la fuente era glucosa o glicerol.

La cepa tipo S. novella DSM 506 reproduce la capacidad de síntesis de celulosa de STN1B

Los cultivos de la cepa DSM 506 tanto en PBT con CO2 como fuente carbono como en medio PBT con glucosa o glicerol, fueron capaces de formar una película de celulosa semejante a la cepa STN1B. La figura 6 muestra la red de polímero formada por DSM 506 creciendo con CO2 como fuente de carbono en presencia de tiosulfato.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir nanocelulosa que comprende:

(a) cultivar al menos un microorganismo que pertenece al género Starkeya, o una población que comprende un microorganismo que pertenece al género Starkeya, en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono, y

(b) purificar la biopelícula de nanocelulosa obtenida durante la etapa (a), en donde el microorganismo del género Starkeya es la cepa STN1A con número de depósito CECT 30088.

2. El método según la reivindicación 1, en donde la fuente de carbono comprende CO2 en forma de bicarbonato de sodio, naftaleno, glicerol, glucosa o cualquier combinación de los mismos.

3. El método según la reivindicación 2, en donde la fuente de carbono es CO2 en forma de bicarbonato de sodio.

4. El método según la reivindicación 3, en donde el medio de cultivo además comprende al menos un compuesto reductor, preferiblemente, el compuesto reductor es un compuesto reducido de azufre y/o gas hidrógeno.

5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en donde el cultivo de la etapa (a) se lleva a cabo a una temperatura de entre 16°C y 40°C, preferiblemente de entre 20°C y 36°C, más preferiblemente, de entre 24°C y 32°C.

6. El método según la reivindicación 5 en donde la temperatura es 28°C.

7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde el medio de cultivo es líquido.

8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde el cultivo se lleva a cabo en condiciones microaerófilas y sin agitación.

9. El método según una cualquiera reivindicación 1 a 7 en donde el cultivo se lleva a cabo en condiciones de agitación entre 25 y 150 rpm sin control de entrada de aire, preferiblemente de entre 50 y 100 rpm, más preferiblemente a 75 rpm.

10. Uso de un microorganismo que pertenece al género Starkeya o una población que comprende un microorganismo que pertenece al género Starkeya para la producción de nanocelulosa, en donde la producción de nanocelulosa se lleva a cabo en un medio de cultivo que comprende al menos una fuente de carbono, donde el microorganismo del género Starkeya es la cepa STN1A con número de depósito CECT 30088.

11. Uso según la reivindicación 10, donde la fuente de carbono se selecciona de la lista que consiste en: CO2 en forma de bicarbonato de sodio, naftaleno, glicerol, glucosa y cualquier combinación de los mismos.

12. Uso según la reivindicación 10 o 11, en donde, cuando la fuente de carbono es CO2 en forma de bicarbonato de sodio, el medio de cultivo además comprende al menos un compuesto reductor, preferiblemente, el compuesto reductor es un compuesto reducido de azufre y/o gas hidrógeno.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, en donde la producción de nanocelulosa se lleva a cabo a una temperatura de entre 16°C y 40°C, preferiblemente de entre 20°C y 36°C, más preferiblemente de entre 24°C y 32°C, todavía más preferiblemente a 28°C.

14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en donde el medio de cultivo es líquido.

15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14 en donde la producción de nanocelulosa se lleva a cabo en condiciones microaerófilas y sin agitación.

16. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde la producción de nanocelulosa se lleva a cabo en condiciones de agitación entre 25 y 150 rpm sin control de entrada de aire, preferiblemente de entre 50 y 100 rpm, más preferiblemente a 75 rpm.

17. Una cepa del género Starkeya sp. (STN1A) con número de depósito CECT 30088 o una cepa derivada de la misma, donde la cepa derivada de la misma es una cepa que resulta de una mutación o cambio en el ADN de uno o varios genes de la cepa CECT 30088 y que mantiene las propiedades de síntesis de nanocelulosa de la cepa CECT 30088.

18. Una población bacteriana que comprende al menos una cepa del género Starkeya según la reivindicación 17.

19. Una composición que comprende la cepa según la reivindicación 17 o la población bacteriana según la reivindicación 18.

20.

Uso de la cepa según la reivindicación 17, o una población bacteriana según la reivindicación 18, o una composición según la reivindicación 19, para la producción de nanocelulosa.