ES2886236T3 - Procedimiento para producir una azafilona en Talaromyces atroroseus - Google Patents
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Abstract
Método para producir un pigmento de atrorosina mediante fermentación, que comprende las etapas de: a. proporcionar esporas o micelios de una especie del género Talaromyces, b. cultivar las esporas o micelios de (a) en un medio de crecimiento líquido, c. recuperar el pigmento de atrorosina producido durante dicho cultivo en la etapa b), y d. opcionalmente aislar dicho pigmento de atrorosina, en el que el pH del medio de crecimiento en la etapa (b) se mantiene entre 4 y 6; en el que la única fuente de nitrógeno en dicho medio de crecimiento líquido en la etapa (b) es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido individual, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y en el que el pigmento de atrorosina tiene la estructura de la fórmula I **(Ver fórmula)** en la que N-R se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis.
Description
DESCRIPCIÓN
Procedimiento para producir una azafilona en Talaromyces atroroseus
Campo de la invención
La invención proporciona una clase novedosa de pigmentos de azafilona naturales, denominados atrorosinas, y métodos para su producción. Los métodos para la producción de atrorosinas incluyen la producción mediante fermentación usando una especie fúngica que pertenece al género Talaromyces, preferiblemente la especie Talaromyces atroroseus. El uso de los pigmentos de atrorosina novedosos, y un kit que comprende los mismos, como agente colorante para productos alimenticios y/o productos no alimenticios, y para cosméticos.
Antecedentes de la invención
Cada vez se desean más los colorantes alimentarios naturales debido a la creciente concienciación de los consumidores sobre los posibles efectos perjudiciales de los colorantes sintéticos12. A la vista del creciente reconocimiento de un vínculo entre la dieta y la salud, la industria de los aditivos alimentarios se enfrenta a nuevos desafíos para proporcionar alternativas de color naturales. Hasta ahora, los colorantes naturales más usados en la industria se extraen directamente a partir de fuentes naturales, por ejemplo antocianinas (extracto de raíz de remolacha Beta vulgaris), licopeno (extracto de tomate Solanum lycopersicum) o ácido carmínico (extraído a partir del insecto hembra Dactylopius coccus3). Su producción depende altamente del suministro de componentes de partida, que están sujetos a variación estacional tanto con respecto a la cantidad como con respecto a la calidad4. Estas limitaciones pueden superarse explorando nuevas fuentes de pigmentos naturales tales como microorganismos5. Se conocen hongos que biosintetizan de manera natural y excretan diversas clases de metabolitos secundarios incluyendo pigmentos dentro de una amplia gama de colores6.
Monascus es un género fúngico productor de pigmento que se ha usado desde hace mucho tiempo para la fabricación de alimentos tradicionales en países asiáticos7. Los pigmentos procedentes de Monascus se denominan “pigmentos de Monascus", que son una mezcla de azafilonas que incluyen constituyentes amarillos, naranjas y rojos. Kim et al 2006 dan a conocer un método para producir pigmentos de Monascus mediante fermentación.
El uso de especies de Monascus para la producción de pigmentos de Monascus da como resultado un cóctel de pigmentos de Monascus diferentes8, que tienen una gama de tonalidades, cuya composición es difícil de controlar y pueden variar de un lote a otro. Además, se sabe que especies de Monascus producen micotoxinas, tales como citrinina9, que provoca diversos efectos tóxicos, incluyendo efectos nefrotóxicos, hepatotóxicos y citotóxicos y que excluye su uso para fines industriales en países occidentales. Desde un punto de vista industrial, sería altamente preferible producir estos pigmentos componentes de manera individual mediante fermentación, en los que las especies individuales de pigmento producidas estuvieran libres de micotoxinas, de tal manera que el pigmento pueda extraerse fácilmente y recuperarse sin necesidad de múltiples etapas de purificación posiblemente complejas. Entre los usos importantes de los pigmentos naturales se encuentran como aditivos alimentarios; en los que pigmentos solubles en agua son altamente deseables.
Se ha examinado Talaromyces atroroseus por Rasmussen et al., 2015, como organismo productor de pigmento, y se realizó una secuenciación genómica completa y análisis filogenético del organismo y sus pigmentos.
Sumario de la invención
La invención es tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Según una primera realización, la invención proporciona un método para producir un pigmento de atrorosina (preferiblemente una especie individual de pigmento de atrorosina) mediante fermentación, que comprende las etapas de:
a) proporcionar esporas o micelios de una especie del género Talaromyces,
b) cultivar las esporas o micelios de (a) en un medio de crecimiento líquido,
c) recuperar el pigmento de atrorosina producido durante dicha etapa de cultivo b), y
d) opcionalmente aislar dicho pigmento de atrorosina,
en el que el pH del medio de crecimiento en la etapa (b) se mantiene entre 4 y 6; en el que la única fuente de nitrógeno en dicho medio de crecimiento líquido en la etapa (b) es un compuesto individual seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria; y en el que el pigmento de atrorosina tiene la estructura de la fórmula I:
en la que N-R se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis.
El método según la primera realización puede comprender además la etapa adicional de:
a’) cultivar las esporas o micelios de (a) en un medio de crecimiento líquido preliminar, en el que la única fuente de nitrógeno es una fuente de nitrógeno inorgánico y la concentración de NO3- es de no más de 20 mM, continuando el cultivo hasta que la concentración de NO3- se agota hasta menos de 5 mM; y
en el que dicha etapa
va seguida por la etapa (b).
Según una segunda realización la invención proporciona un pigmento de atrorosina que tiene la estructura de la fórmula I:
en la que N-R se selecciona de un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis, en el que dicho aminoácido se selecciona de uno del grupo que consiste en: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamato, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-tirosina, L-valina y L-ornitina.
Además se da a conocer un pigmento de atrorosina que tiene la estructura de la fórmula I tal como se definió anteriormente que se produce mediante el método de la invención.
Además se da a conocer el uso del pigmento de atrorosina, que tiene la estructura de la fórmula I tal como se definió anteriormente, como agente colorante para uno cualquiera de un alimento, un producto no alimenticio y un cosmético.
Además se da a conocer un producto que comprende el pigmento de atrorosina que tiene la estructura de la fórmula I tal como se definió anteriormente, en el que el producto se selecciona de un alimento, un producto no alimenticio y un cosmético.
Además se da a conocer un kit para colorar un producto, en el que el kit comprende al menos un pigmento de atrorosina que tiene la estructura de la fórmula I tal como se definió anteriormente, en el que el pigmento se suministra en un recipiente, y en el que el producto se selecciona de un alimento, un producto no alimenticio y un cosmético.
Descripción de la invención
Figuras
Figura 1. Estructura química de un pigmento de atrorosina, en la que R se selecciona de un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis. In vivo, se sintetiza mediante derivatización de los precursores de azafilona que contienen isocromeno, cis-PP-O y trans-PP-O, con una molécula que contiene nitrógeno.
Figura 2. Presentación gráfica de los espectros de absorbancia de pigmentos de atrorosina purificados y sus curvas patrón correspondientes:
Espectro de absorbancia de PP-O puro y curva patrón correspondiente a 450 nm con la ecuación: y=54,869x. Espectro de absorbancia de atrorosinas puras (atrorosina-S a modo de ejemplo) y curva patrón correspondiente a 500 nm con la ecuación: y=95,244x
Figura 3. Presentación gráfica de acumulación de biomasa (diagrama de barras) y pigmentos en g/l (■) producidos mediante fermentación en una etapa de T. atroroseus después de 96 h, cuando se cultiva en matraces de agitación en un medio de fermentación definido (véase el ejemplo 1.2) cuando se suplementa con los aminoácidos individuales indicados (0,1 M) o KNO3 (0,1 M) como única fuente de nitrógeno. Se tomaron muestras después de 96 h. El conjunto de datos se basa en fermentaciones en matraz de agitación llevadas a cabo por triplicado.
Figura 4. Diagrama que muestra cromatogramas de UV (medidos a 520±20 nm) de compuestos extraídos a partir de caldo de fermentación derivado a partir de la fermentación en una etapa de T. atroroseus (tal como se define en el ejemplo 1.2) en el que al medio de crecimiento (100 ml) se le suministró una única fuente de nitrógeno en forma de nitrato de potasio (KNO3), ácido aspártico, ácido glutámico, histidina o serina como única fuente de nitrógeno a una concentración de 0,1 M. Se ajustó el pH del medio a pH 5 con NaOH y HCI acuosos. Se llevó a cabo el cultivo en matraces de agitación sin deflector a 30°C y 150 rpm en incubadoras de agitación rotatorias. Se tomaron muestras después de 96 h. Se llevaron a cabo experimentos en matraces de agitación por triplicado. Figura 5. Presentación gráfica de acumulación de biomasa (DW) y niveles de pigmento (PP-O y atrorosina-S), CO2 y sacarosa detectados a lo largo del tiempo durante la fermentación en una etapa o en dos etapas de T. atroroseus al que se suministraron serina o nitrato de potasio (KNO3) y serina como única fuente de nitrógeno. A) transcurso de tiempo de la fermentación en una etapa con KNO3 10 g/l; B) transcurso de tiempo de la fermentación en una etapa con serina 10 g/l; C) transcurso de tiempo de la fermentación en dos etapas; D) perfil de color del sobrenadante de medio de fermentación de la fermentación en una etapa con KNO3 10 g/l; E) perfil de color del sobrenadante de medio de fermentación de la fermentación en una etapa con serina 10 g/l; F) perfil de color del sobrenadante de medio de fermentación de la fermentación en dos etapas; G) cromatograma de UV (520±10 nm) de sobrenadante de medio de fermentación en el cultivo en una etapa con KNO3 10 g/l que muestra una mezcla de pigmentos; H) cromatograma de UV (520±10 nm) de sobrenadante de medio de fermentación en el cultivo en una etapa con serina 10 g/l que muestra atrorosina-S; y I) cromatograma de UV (520±10 nm) a partir de sobrenadante de medio de fermentación en el cultivo en dos etapas que muestra en primer lugar la formación tanto de cis como de trans-PP-O y, después de la adición de serina, esencialmente cis-atrorosina-S pura.
Figura 6. Diagrama que muestra un cromatograma de iones de un patrón autentificado de citrinina (m/z = 251,0290) en comparación con cromatogramas de muestras de caldo de fermentación derivado a partir de la fermentación en una etapa frente a en dos etapas de T. atroroseus cuando se le suministra serina como única fuente de nitrógeno de amino, en comparación con nitrato de potasio (KNO3) como única fuente de nitrógeno. Figura 7. Diagrama que muestra la estructura química de cis-atrorosina-S.
Figura 8. Diagrama que muestra los valores de logD para A) atrorosina-S y monascorubramina-S y B) atrorosina-E y monascorubramina-E.
Figura 9. Medidas colorimétricas de nitrato usando tiras reactivas de nitrato. Parte superior izquierda: muestras tomadas a partir de cultivos en 2 etapas. Parte inferior izquierda: tiras reactivas de nitrato usadas para cada muestra después de una dilución de 40x para ajustarse al intervalo de 5-100 mg. Los puntos de tiempo de muestra se indican en las tiras reactivas de nitrato
Figura 10. Talaromyces atroroseus cultivado en biorreactor a diferentes pH, fuente de nitrógeno KNO3. A) Tasa de crecimiento (|jmax (Ir1)) en función del pH; B) producción de biomasa (Ysx ■) y pigmento total (Ysp □) en función del pH.
Abreviaturas y términos:
PP-O: es un pigmento que tiene la fórmula química C23H24O7 y puede estar en forma o bien cis, o bien trans. Atrorosina: es un pigmento que tiene la fórmula química C23H24O6NR, en la que NR es un compuesto que contiene una amina primaria, tal como un aminoácido, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis.
Medio de crecimiento esencialmente desprovisto de nitrógeno inorgánico disponible: es un medio de crecimiento que limita el crecimiento exponencial y provoca que el crecimiento microbiano (fúngico) entre en una fase de latencia o muerte celular, debido a la falta de nitrógeno disponible. La fuente de nitrógeno se agota y no queda nada de nitrógeno disponible cuando el medio de crecimiento contiene menos de 0,5 g/l de la fuente de nitrógeno (por ejemplo KNO3 o NaNO3 < 0,5 g/l, tal como NO3- < 5 mM).
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un método para la producción de especies individuales de pigmentos de azafilona mediante fermentación, usando una especie fúngica que pertenece al género Talaromyces, preferiblemente la especie Talaromyces atroroseus. Inicialmente se seleccionaron especies de Talaromyces como posiblemente adecuadas para su uso como organismo de producción dado que, de manera común con especies de Monascus, se encontró que excretan un color rojo brillante cuando se cultivan en medios sólidos. Según una primera realización, la invención proporciona un método para producir una especie individual de pigmento de azafilona usando un procedimiento de fermentación en una etapa que comprende:
a) proporcionar esporas o micelios de una especie del género Talaromyces,
b) cultivar dichas esporas o micelios en un medio de crecimiento líquido,
c) recuperar el pigmento de azafilona producido durante el cultivo en la etapa b), y
opcionalmente aislar uno o más de dichos pigmentos de azafilona,
en el que la única fuente de nitrógeno en dicho medio de crecimiento líquido en la etapa (b) es un compuesto individual seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y cualquier otra amina primaria; y en el que el pigmento de atrorosina tiene la estructura de la fórmula I:
en la que N-R se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis.
Una única fuente de nitrógeno adecuada incluye un aminoazúcar tal como glucosamina o galactosamina; e incluye una amina primaria tal como ácido antranílico, anilina o p-fenilendiamina.
Preferiblemente, la única fuente de nitrógeno es un aminoácido individual, seleccionado de uno del grupo que consiste en: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-tirosina, L-valina y L-ornitina.
El medio de crecimiento líquido, que comprende una fuente de nitrógeno, es un medio sintético que comprende sales, metales traza y una fuente de carbono. Una fuente de carbono adecuada incluye glucosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melazas de remolacha o de caña, malta y cualquier combinación de al menos dos de los mismos.
El medio de crecimiento comprende o consiste preferiblemente en las siguientes sales y metales traza: KH2PO4 (por ejemplo 1 g/l), NaCl (por ejemplo 1 g/l), MgSO4.7 H2O (por ejemplo 2 g/l), kCi (por ejemplo 0,5 g/l), CaCl2.H2O (por ejemplo 0,1 g/l) y una disolución de metales traza (por ejemplo 2 ml/l). La disolución de metales traza puede comprender, o consistir en: CuSO4.5 H2O (por ejemplo 0,4 g/l), Na2B4O7.10 H2O (por ejemplo 0,04 g/l), FeSO4.7 H2O (por ejemplo 0,8 g/l), MnSO4.H2O (por ejemplo 0,8 g/l), Na2MoO4.2 H2O (por ejemplo 0,8 g/l), ZnSO4.7 H2O (por ejemplo 8 g/l). La concentración del compuesto que proporciona la única fuente de nitrógeno en el medio de crecimiento puede ser de desde 0,05 M hasta 1 M, por ejemplo de al menos 0,05, 0,075, 0,10, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 y 0,8 M.
El pH del medio de crecimiento proporcionado y mantenido durante la etapa (b) es preferiblemente de entre 4 y 6; más preferiblemente entre 4,5 y 5,5; en el que el pH puede ajustarse mediante la adición de NaOH o HCI acuosos.
El cultivo en la etapa (b) puede realizarse suspendiendo esporas o micelios de la especie del género Talaromyces en el medio de crecimiento líquido; o más preferiblemente sumergiendo esporas o micelios de la especie del género Talaromyces en el medio de crecimiento líquido.
Las esporas en la etapa (a) pueden comprender una suspensión acuosa de esporas de la especie del género Talaromyces. Preferiblemente, la especie del género Talaromyces es la especie Talaromyces atroroseus (por ejemplo, la cepa Talaromyces atroroseus IBT 11181).
Según una segunda realización, la invención proporciona un método para producir una especie individual de pigmento de azafilona usando una modificación del procedimiento de fermentación en una etapa, denominado procedimiento de fermentación en dos etapas. Según esta modificación, se realiza una etapa adicional (a') después de la etapa (a). En la etapa (a'), las esporas o micelios proporcionados en la etapa (a) se cultivan en un medio de crecimiento líquido preliminar, en el que la única fuente de nitrógeno es una fuente de nitrógeno inorgánico y la concentración de NO3- es de no más de 20 mM. La fuente de nitrógeno inorgánico puede seleccionarse del grupo que consiste en: KNO3 y NaNO3.
El medio de crecimiento líquido preliminar, que comprende el nitrógeno inorgánico como única fuente de nitrógeno, es un medio sintético que comprende sales, metales traza y una fuente de carbono. La composición de este medio sintético con respecto a sales y metales traza es: KH2PO4 (por ejemplo 1 g/l), NaCl (por ejemplo 1 g/l), MgSO4.7 H2O (por ejemplo 2 g/l), kCi (por ejemplo 0,5 g/l), CaCl2.H2O (por ejemplo 0,1 g/l) y una disolución de metales traza (por ejemplo 2 ml/l). La disolución de metales traza puede comprender, o consistir en: CuSO4.5 H2O (por ejemplo 0,4 g/l), Na2B4O7 .10 H2O (por ejemplo 0,04 g/l), FeSO4.7 H2O (por ejemplo 0,8 g/l), MnSO4.H2O (por ejemplo 0,8 g/l), Na2MoO4.2 H2O (por ejemplo 0,8 g/l), ZnSO4.7 H2O (por ejemplo 8 g/l). Una fuente de carbono adecuada incluye glucosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melazas de remolacha o de caña, malta y cualquier combinación de al menos dos de los mismos.
Según el método de fermentación en dos etapas, el cultivo del cultivo de Talaromyces producido en la etapa (a') se continúa entonces con una etapa de cultivo adicional (b) en un medio de crecimiento líquido. El medio de crecimiento líquido en la etapa (b) es un medio sintético que tiene la misma composición con respecto a sales y metales traza que el medio de crecimiento líquido preliminar. Sin embargo, el medio de crecimiento líquido en la etapa (b) comprende un compuesto seleccionado de uno de un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, como única fuente de nitrógeno orgánico. Las fuentes de nitrógeno orgánico adecuadas se seleccionan del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y cualquier otra amina primaria; y corresponden a fuentes adecuadas usadas en el medio de crecimiento líquido en el procedimiento de fermentación en una etapa. Aunque una fuente de nitrógeno inorgánico es un componente del medio de crecimiento líquido preliminar en la etapa (a'); no se incluye ninguna fuente de nitrógeno inorgánico adicional en el medio de crecimiento líquido en la etapa (b), sino que en vez de eso se sustituye el nitrógeno inorgánico por las fuentes dadas de nitrógeno orgánico.
La fermentación en dos etapas, según la segunda realización, puede realizarse cultivando las esporas o el micelio en el medio de crecimiento líquido preliminar en la etapa (a') y después añadiendo en la etapa (b) la única fuente de nitrógeno orgánico al cultivo producido mediante la etapa (a'). El contenido en nitrógeno inorgánico del medio de crecimiento líquido preliminar se agota durante el cultivo de las esporas o el micelio fúngicos en la etapa (a'), de tal manera que el medio de crecimiento está esencialmente desprovisto de nitrógeno inorgánico disponible al final de la etapa (a'). El contenido en nitrógeno inorgánico del medio de crecimiento líquido preliminar puede ajustarse para garantizar un agotamiento completo para el final de la etapa (a'); por ejemplo proporcionando no más de 2 g/l, 1,75 g/l, 1,5 g/l, 1,25 g/l, 1 g/l de KNO3 o NaNO3 , tal como proporcionando no más de 20 mM, 17,5 mM, 15 mM, 12,5 mM, 10 mM de NO3-. Una vez que el nivel de nitrógeno inorgánico presente en el medio de crecimiento líquido preliminar se agota hasta una cantidad de menos de 0,5 g/l, 0,4 g/l, 0,3 g/l, 0,2 g/l, 0,1 g/l o 0,05 g/l de o bien KNO3, o bien NaNO3, tal como agotado hasta una cantidad de menos de 5 mM, 4 mM, 3 mM, 2 mM, 1 mM, 0,5 mM de NO3-, entonces ya no puede soportar el crecimiento del cultivo de Talaromyces.
Alternativamente, el medio de crecimiento líquido preliminar en la etapa (a’) se sustituye por el medio de crecimiento líquido que comprende el compuesto de nitrógeno orgánico anteriormente identificado como única fuente de nitrógeno, al principio de la etapa de cultivo adicional (b).
El pH del medio de crecimiento proporcionado en la etapa 
y mantenido durante la etapa (b) es preferiblemente de entre 4 y 6; preferiblemente entre 4,5 y 5,5; en el que el pH puede ajustarse mediante la adición de NaOH o HCI acuosos.
Las condiciones de cultivo durante la fermentación en una etapa y en dos etapas soporta el metabolismo aerobio en el cultivo de Talaromyces. El metabolismo aerobio se basa en una aireación suficiente, lo cual puede lograrse agitando el cultivo líquido o suministrando una fuente de aire (por ejemplo oxígeno).
El procedimiento de fermentación en una etapa y en dos etapas puede realizarse en un biorreactor. Los medios de crecimiento líquidos (descritos anteriormente) usados en el procedimiento de fermentación tanto en una etapa como en dos etapas pueden suministrarse al biorreactor para facilitar el cultivo ya sea discontinuo, semicontinuo o continuo del cultivo fúngico.
La duración de las etapas de cultivo (a’) y (b) en el procedimiento de fermentación en dos etapas se selecciona para optimizar el crecimiento del cultivo de Talaromyces (tal como se mide mediante la biomasa) y el rendimiento de pigmento de azafilona producido mediante el cultivo de Talaromyces. La etapa de cultivo (a’) es preferiblemente de al menos 28 h; por ejemplo entre 30 h y 40 h. La etapa de cultivo (a’) puede tener una duración de aproximadamente 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52 y 54 h. La duración de la etapa de cultivo (b), que sigue a la etapa (a’), es preferiblemente de al menos 50 h; por ejemplo entre 50 h y 80 h. La etapa de cultivo (b) puede tener una duración de aproximadamente, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 75, 80 h.
El pigmento de azafilona producido mediante el cultivo del cultivo de Talaromyces, según las realizaciones primera o segunda, es extracelular y, por tanto, puede recuperarse a partir del medio líquido. Sorprendentemente, el inicio de la síntesis de pigmento de azafilona tiene lugar después de significativamente menos horas de cultivo cuando se usa el procedimiento de fermentación en dos etapas en comparación con el procedimiento de fermentación en una etapa (véase el ejemplo 3.2; figura 5). Adicionalmente, la economía de carbono del procedimiento de fermentación en dos etapas, tal como se evalúa mediante el rendimiento de pigmento de azafilona, es superior (véase el ejemplo 3.4 - 3.5; tablas 3 y 4).
Se notifica que las cepas de Talaromyces atroroseus pueden producir una mezcla de pigmentos de Monascus, incluyendo una azafilona amarilla (PP-Y) y los isómeros cis y trans de una azafilona naranja (PP-O) y una azafilona violeta (PP-V). Sorprendentemente, el pigmento de azafilona producido mediante el método según las realizaciones primera y segunda de la invención es una especie individual de pigmento de atrorosina y no una mezcla de pigmentos (véase el ejemplo 2). Cuando se proporciona KNO3 o NaNO3 (en cantidades bajas, por ejemplo de 2 g/l (NO3- 0,02 M)) como única fuente de nitrógeno durante la etapa (a’) del procedimiento de fermentación en dos etapas, esto fomenta selectivamente la síntesis de bajas cantidades de formas tanto cis como trans del pigmento de azafilona naranja (PP-O) durante la etapa (a’). En la etapa (b) posterior, el grupo amino presente en la fuente de nitrógeno orgánico se incorpora en las estructuras isoméricas principales de azafilona PP-O (cis y trans-PP-O) para formar el derivado de cis-atrorosina específico esencialmente en forma pura (figura 1). Por tanto, la especie individual de pigmento de atrorosina producido mediante el método puede extraerse y recuperarse sin necesidad de múltiples etapas de purificación posiblemente complejas. Además, los productos de la fermentación usando el método están libres de cualquier micotoxina (véase el ejemplo 4) y, por tanto, son seguros para su uso por seres humanos.
Además se da a conocer un pigmento de atrorosina novedoso que tiene la fórmula I:
en la que N-R se selecciona de un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar (por ejemplo glucosamina o
galactosamina) y una amina primaria (por ejemplo ácido antranílico, anilina o p-fenilendiamina), y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis.
El pigmento de atrorosina tiene la fórmula I, en la que N-R es un aminoácido seleccionado de uno del grupo que consiste en: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamato, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-tirosina, L-valina y L-ornitina. Esta atrorosina novedosa que tiene la fórmula I, tal como se definió anteriormente, es el pigmento de azafilona que se recupera a partir del cultivo fúngico producido mediante el procedimiento de fermentación según las realizaciones primera o segunda de la invención. El rendimiento de esta atrorosina novedosa usando este procedimiento de fermentación es al menos 4 veces superior a la suma combinada de diferentes atrorosinas producidas, cuando la cepa fúngica se cultiva en las mismas condiciones, pero se le suministra un medio sintético con nitrógeno inorgánico como única fuente de nitrógeno (véase el ejemplo 3.4). Una propiedad importante de la atrorosina novedosa que tiene la fórmula I es su solubilidad en agua aumentada en comparación con los pigmentos de Monascus conocidos. Esto se debe al ácido carboxílico en la estructura principal en las atrorosinas y a la polaridad conferida por los restos que contienen amino incorporados (véase el ejemplo 6.1). En los ejemplos 2.1 y 2.2 se detallan métodos para extraer y detectar una atrorosina que tiene la fórmula I. La estructura química de una atrorosina que tiene la fórmula I puede determinarse por medio de cromatografía de líquidos de ultraalto rendimiento acoplada a detección por red de diodos y espectrometría de masas de alta resolución y espectroscopía de resonancia magnética nuclear, tal como se describe en los ejemplos 5.1 y 5.2. Una atrorosina que tiene la fórmula I puede usarse como agente colorante en un producto alimenticio, un producto no alimenticio y un cosmético. El producto alimenticio puede seleccionarse de los siguientes alimentos: producto horneado, mezcla para hornear, bebida y base de bebida, cereales para el desayuno, queso, condimento y conserva, confección y glaseado, grasa y aceite, mezcla y postre lácteo congelado, gelatina, pudin y relleno, salsa espesa y salsa, producto lácteo, producto de proteína vegetal, fruta procesada y zumo de fruta y tentempié.
El producto no alimenticio puede seleccionarse de los siguientes productos no alimenticios: material textil, algodón, lana, seda, cuero, papel, pintura, polímero, plástico, tintas, tableta. El producto cosmético puede estar en forma de un polvo libre, vertido o compactado, un producto graso anhidro fluido, un aceite para el cuerpo y/o la cara, una loción para el cuerpo y/o la cara o un producto para el cabello.
Además se da a conocer un producto en el que el kit comprende al menos un pigmento de atrorosina que tiene la fórmula I según la invención; en el que el pigmento se suministra en un recipiente (opcionalmente combinado con un agente de dispensación, por ejemplo coloide o agente espesante), en el que el producto se selecciona de un alimento, un producto no alimenticio y un cosmético.
Ejemplos
Ejemplo 1. Producción de atrorosinas, una clase novedosa de pigmentos de azafilona, mediante fermentación 1.1 Mantenimiento de cepa y producción de esporas: se usó la cepa fúngica, Talaromyces atroroseus IBT 11181 (colección de cepas IBT DTU), para la producción de atrorosinas. Se propagaron esporas de T. atroroseus sobre placas en agar de Czapek-Dox (CYA) (suministrado por 70185 Sigma-Aldrich) y se incubaron a 30°C durante 7 días. Se recogieron las esporas con disolución de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9%. Se filtró la suspensión a través de Miracloth para separar esporas de micelios. Se centrifugó la disolución de esporas durante 10 min a 10.000 rpm a 4°C. Se retiró el sobrenadante y volvió a suspenderse el sedimento de esporas en disolución de NaCl al 0,9%. Se determinó la concentración de esporas usando una cámara de recuento de Burker-Turk. Se inocularon todos los cultivos para dar una concentración de esporas inicial de 106 esporas/ml.
1.2 Procedimiento de fermentación en una etapa para la producción de atrorosinas. Producción a pequeña escala: se produjeron atrorosinas mediante una fermentación en una etapa usando un medio de fermentación que comprendía los siguientes componentes: sacarosa (7,5 g/l), glucosa (0,375 g/l), KH2PO4 (1 g/l), NaCl (1 g/l), MgSO4.7 H2O (2 g/l), KCI (0,5 g/l), CaCl2.H2O (0,1 g/l) y disolución de metales traza (2 ml/l). La disolución de metales traza consistía en CuSO4.5 H2O (0,4 g/l), Na2B4O7.10 H2O (0,04 g/l), FeSO4.7 H2O (0,8 g/l), MnSO4.H2O (0,8 g/l), Na2MoO4.2 H2O (0,8 g/l), ZnSO4.7 H2O (8 g/l). Se suministraron diversas fuentes de nitrógeno, proporcionando: 0,1 M de un L-aminoácido seleccionado de L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptófano, L-tirosina, L-valina y L-ornitina. Se ajustó el pH del medio a pH 5 con NaOH y HCI acuosos. Se llevó a cabo la fermentación, en un volumen de 100 ml, en matraces de agitación sin deflector a 30°C y 150 rpm en incubadoras de agitación rotatorias. Se tomaron muestras después de 96 h. Se llevaron a cabo experimentos en matraces de agitación por triplicado. Como control/referencia, se sometió a prueba KNO3 (0,1 M) como fuente de nitrógeno en vez de los aminoácidos.
Producción a gran escala: también se produjeron atrorosinas mediante fermentación en una etapa en un biorreactor de 1 l, usando el mismo medio, con la modificación de que el medio comprendía sacarosa 20 g/l y serina como única fuente de nitrógeno y a pH de 4,5. Se realizó la fermentación a 30°C, 800 rpm y 1 vvm. Los experimentos en biorreactor se llevaron a cabo por duplicado.
1.3 Análisis de biomasa de T. atroroseus obtenida mediante fermentación. Se midió la biomasa de T. atroroseus acumulada durante la fermentación como peso en seco (DW) usando filtros previamente pesados. Se secaron previamente los filtros en un microondas durante 20 min, se mantuvieron en un desecador durante un mínimo de 10 min y se pesaron. Para la medición de DW, se colocaron los filtros en una bomba de filtración a vacío y se añadieron aproximadamente 10 ml del cultivo fermentado. Posteriormente, se secaron los filtros con la biomasa en un microondas durante 20 min y se mantuvieron en un desecador durante un mínimo de 10 min antes de volver a pesarse. Se determinó el peso de la biomasa como la diferencia del peso del filtro antes y después de la aplicación de la muestra y suponiendo una densidad de caldo de cultivo de 1 g/l.
1.4 Análisis cuantitativo de atrorosinas producidas mediante fermentación. Se determinaron los valores de absorbancia de los pigmentos usando un fotoespectro Synergy 2 y una placa de microtitulación de 96. Se exploraron muestras de 150 |jl de caldo de fermentación filtrado, derivado a partir de la fermentación con medio que comprendía cada uno de los aminoácidos como fuente de nitrógeno, en el intervalo de 200-700 nm y se determinaron los valores de absorbancia máxima. La absorbancia a 490 nm indicó la presencia de pigmentos rojos. Se usó una curva patrón de un pigmento naranja y rojo para calcular la concentración en el medio (véase la figura 2).
1.5 Pigmentos de atrorosina y biomasa producidos mediante fermentación de T. atroroseus con medio de fermentación definido
Se evaluó la función esencial de la fuente de nitrógeno de amino sobre la producción de pigmentos mediante T. atroroseus y la acumulación de biomasa durante la fermentación en una etapa para cada uno de los 20 aminoácidos naturales y el aminoácido no proteinogénico ornitina en un medio definido tal como se definió en el ejemplo 1.2 en matraces de agitación a pequeña escala. Como control, se realizó la fermentación con medio definido usando KNO3 como única fuente de nitrógeno.
Se determinó la concentración de pigmento producido en cada fermentación midiendo la absorbancia a 500 nm de todo el caldo de fermentación a partir de lo cual se calculó la concentración de pigmento usando la curva patrón mostrada en la figura 2.
Tal como se observa en la figura 3, aunque cada aminoácido natural soportó el crecimiento cuando se suministró como única fuente de nitrógeno, algunos aminoácidos favorecieron la acumulación de biomasa más que otros. La acumulación de biomasa fue la más alta con prolina (6,05+0,3 g/l), seguido por alanina (5,48+0,01 g/l) y ornitina (4,83+0,07 g/l). Arginina (4,45+0,02 g/l), asparagina (4,4+0,03 g/l), ácido aspártico (4,26+0,5 g/l) y ácido glutámico (4,49+0,24 g/l) también condujeron a altos valores de biomasa. El control al que se le suministró KNO3 como fuente de nitrógeno produjo 2,77±0,06 g/l. Histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, serina, treonina, triptófano y tirosina soportaron bajos valores de biomasa por debajo de 2 g/l. En cuanto a la producción de pigmento, la fuente de nitrógeno de amino que dio los rendimientos más altos fue ácido glutámico, con un rendimiento de 0,39 g/l. Otras fuentes de nitrógeno de amino de alto rendimiento fueron ácido aspártico (0,25 g/l), histidina (0,19 g/l) y leucina (0,11 g/l), seguidas por serina (0,08 g/l) e isoleucina (0,07 g/l) (véase la figura 3).
No se observó ninguna producción de pigmento detectable cuando se proporcionó prolina como única fuente de nitrógeno de amino. Se cree que esto se debe a la amina secundaria en prolina, que impide su incorporación en la estructura principal del pigmento. Los otros 17 aminoácidos naturales se incorporan mediante su amina primaria. En ausencia de formación de pigmento, se observa que T. atroroseus usa prolina como fuente de carbono para el crecimiento, conduciendo a la alta acumulación observada de biomasa.
La producción de pigmento relativamente inferior en medio que comprende glutamina y asparagina se atribuye a no lograr mantener un pH estable en matraces de agitación. El pH del caldo de fermentación después de 72 h, en medio que comprendía glutamina disminuyó hasta pH 3,8, mientras que medio que comprendía ácido glutámico tenía un pH final de 6,1 (véase la tabla 1).
TABLA 1: pH de caldo de fermentación después de 72 h de fermentación en matraces de agitación
Los experimentos en biorreactor para el método en 1 etapa demostraron que el pH del líquido de fermentación afectaba en gran medida a la producción de pigmento y biomasa. La figura 10A muestra que la tasa de
crecimiento de Talaromyces atroroseus IBT 11181 era significativamente superior cuando se cultivaba a un pH bajo (tal como pH 3-4,5) en comparación con un pH superior (tal como pH 5-7). Sin embargo, tal como se muestra en la tabla 2 y la figura 10B, cuando el pH del líquido de fermentación se mantenía a pH 3, esto impedía completamente la producción de pigmento. También a pH alto (tal como pH>6), no se observó esencialmente ninguna producción de pigmento. Tal como ya se observó a partir de cultivos en matraces de agitación que carecían de control del pH, los experimentos en biorreactor confirmaron la importancia del control del pH para mantener condiciones favorables para la producción de pigmento.
Tabla 2: efecto del pH sobre el rendimiento de pigmento en biorreactor
Pigmento total, sacarosa rendimiento g/g de
Fuente de N* KNOa 0,1 M (NH4)2SO40,1 M
pH 3 No color secreción
pH 4 0,009 ±0,001 0,003 ±0,001
pH 4,5 0,010 ±0,001 n.a.
pH 5 0,006±0,001 0,009 ±0,013
*Medio de crecimiento tal como se define en el ejemplo 1.2; en el que la única fuente de
nitrógeno es tal como se indica.
Ejemplo 2. Se obtienen pigmentos de atrorosina individuales de alta pureza mediante fermentación de T. atroroseus con medio de fermentación definido
En primer lugar, se filtraron muestras recogidas a partir de cultivos de fermentación a través de un filtro Statorius Stedim estéril con un tamaño de poro de 0,45 |jm con el fin de separar biomasa a partir del filtrado antes de su análisis mediante HPLC, absorbancia y CL-EM. Se usaron dos métodos para la purificación de atrorosinas producidas mediante fermentación de T. atroroseus con medio de fermentación definido.
2.1 Extracción y purificación de atrorosinas producidas mediante fermentación. Método I: se filtró caldo de fermentación derivado a partir del cultivo de Taleromyces atroroseus (IBT 11181), se centrifugó y se extrajo el sobrenadante dos veces 1:1 con acetato de etilo (EtOAc) a pH 3, ajustado con ácido fórmico (FA). Se concentraron los extractos orgánicos a vacío. Se enriqueció el compuesto objetivo para dar una fracción en bruto mediante cromatografía ultrarrápida del extracto de EtOAc, en un sistema ultrarrápido automatizado Isolera One (Biotage), usando una elución en gradiente de agua/metanol en un material de columna C18. El aislamiento final se realizó en una HPLC semipreparativa, un controlador Waters 600 con un detector de red de fotodiodos 996, equipado con una columna LUNA II C18 (250 mm x 10 mm, 5 jm, Phenomenex) usando un gradiente de agua/acetonitrilo con 50 ppm de ácido triflouroacético (TFA).
Método II: se filtró caldo de fermentación derivado a partir del cultivo de Taleromyces atroroseus (IBT 11181), se centrifugó y se extrajo el filtrado tres veces, con un volumen de 1/3 de EtOAc, a pH 3 (ajustado con FA). Se evaporaron las fases de EtOAc combinadas hasta 100 ml y se extrajeron dos veces con agua milli-Q (1:1) a pH 8 (ajustado con hidróxido de amonio). Volvió a ajustarse la fase acuosa a pH 3 con FA y se extrajo dos veces con EtOAc, seguido por evaporación, para proporcionar una fracción de pigmento altamente enriquecida >95% (una mezcla de varias atrorosinas y N-aminoácido monascorubramina, razón>10:1). Se separaron los pigmentos en un sistema de HPLC semipreparativa Gilson 332 equipado con un detector de red de diodos Gilson 172, usando una columna LUNA II C18 (250 mm x 10 mm, 5 jm, Phenomenex), con un gradiente de agua/acetonitrilo.
2.2 Análisis cuantitativo de atrorosinas producidas mediante fermentación
Se determinaron los valores de absorbancia de las disoluciones de pigmentos individuales usando un fotoespectro Synergy 2 y una placa de microtitulación de 96 pocillos. Se exploraron 150 j l de caldo de muestra de cada disolución de aminoácido-pigmento en el intervalo de 200-700 nm y se determinaron los valores de absorbancia máxima. La absorbancia a 490 nm indica la presencia de pigmentos rojos. Puede usarse una curva patrón de un pigmento naranja y rojo para calcular la concentración en el medio (véase la figura 2).
2.3 Pigmentos de atrorosina individuales detectados en caldo de fermentación de T. atroroseus fermentado con medio definido
El enriquecimiento de una azafilona dada producida mediante fermentación de T. atroroseus se aumenta en gran medida proporcionando un aminoácido individual como única fuente de nitrógeno (figura 4). Cuando se cultivó T. atroroseus con nitrato de potasio 0,1 M como fuente de nitrógeno, se detectó una plétora de pigmentos de azafilona diferentes, mientras que, cuando solo se suministró un aminoácido individual como única fuente de nitrógeno, solo se observó un pico principal detectable por UV correspondiente a la atrorosina que incorpora ese aminoácido particular en su estructura (figura 4).
Ejemplo 3. Producción a gran escala de pigmentos de atrorosina individuales de alta pureza mediante fermentación de T. atroroseus con medio de fermentación definido
3.1 Un procedimiento de fermentación en dos etapas para la producción de atrorosinas
Cultivo en dos etapas: se llevó a cabo la fermentación en dos etapas en biorreactores de 1 l. El medio de fermentación contenía sacarosa (20 g/l), glucosa (1 g/l), KH2 PO4 (10 g/l), NaCl (1 g/l), MgSO4.7 H2O (2 g/l), KCI (0,5 g/l), CaCl2.H2O (0,1 g/l) y disolución de metales traza (2 ml/l). En la primera etapa, el medio comprendía 2 g/l (0,02 M) de KNO3 como única fuente de nitrógeno. Después de 53 h de cultivo, se añadió serina hasta una concentración final de 1 g/l (0,01 M) para inducir la formación del derivado de aminoácido. Se mantuvieron las condiciones de fermentación a 30°C, 800 rpm, 1 vvm y un pH de 4,5.
3.2 Producción de atrorosina más rápida usando el procedimiento de fermentación en dos etapas en vez de la fermentación en una etapa
Se compararon tanto el rendimiento de biomasa como la producción de pigmento mediante T. atroroseus usando los procedimientos de fermentación en una etapa y en dos etapas. En la fermentación en una etapa, se usó serina 0,1 M como única fuente de nitrógeno y se usó KNO3 0,1 M como control. En la fermentación en dos etapas, inicialmente se indujo la producción de cis y trans-PP-O mediante KNO30,02 M que después se convirtió en cis-atrorosina-S mediante la adición de L-serina (en una concentración final de 0,01 M), después de agotarse KNO3 a partir del medio de crecimiento.
Durante la fermentación en una etapa, la fermentación se volvió limitante de carbono para el control (KNO3 como única fuente de nitrógeno) después de 75 h y, al final de la fermentación, produjo 0,35 g/l de pigmentos mixtos y 5 g/l de biomasa (véase la figura 5A). Durante el cultivo, la producción de pigmento cambió de color de naranja (PP-O) a rojo (mezcla de atrorosinas y pigmentos de Monascus) a medida que se agotó el carbono (figuras 5A y D).
Durante la fermentación en una etapa con L-serina como única fuente de nitrógeno, la fermentación se volvió limitante de carbono después de 180 h y, al final de la fermentación, produjo 0,9 g/l de cis-atrorosina-S y 6,5 g/l de biomasa (véase la figura 5B). Se obtuvieron resultados similares para otros aminoácidos naturales (véase la figura 4). La producción de cis-atrorosina-S aumentó con el crecimiento fúngico durante todo el transcurso de tiempo de la fermentación y no se observaron isómeros de PP-O (figuras 5B y E).
En el procedimiento de fermentación en dos etapas, inicialmente se suministró una baja cantidad de KNO3 (20 mM) como fuente de nitrógeno, dando como resultado la biosíntesis del pigmento naranja, PP-O (figuras 5C y F). En primer lugar, se añadió un aminoácido (en este caso serina), a una concentración de 0,01 M, después de 53 h de fermentación, que posteriormente se incorporó en las estructuras principales de azafilona cis y trans-PP-O, dando como resultado la síntesis del pigmento rojo, cis-atrorosina S (figura 1). Mientras que el cultivo en dos etapas también produjo 0,9 g/l de atrorosina S, pero una biomasa superior de 7,4 g/l de biomasa, en comparación con 6,5 g/l, esto se obtuvo después de tan solo 100 h al inicio de la limitación de carbono.
3.3 Identificación de los pigmentos de atrorosina producidos mediante fermentación de T. atroroseus
Los perfiles de cromatograma de UV (520±20 nm) de los pigmentos de atrorosina producidos mediante fermentación en una etapa de T. atroroseus con medio de fermentación definido que comprendía o bien KNO3, o bien serina como única fuente de nitrógeno se muestran en las figuras 5 G y H, respectivamente, mientras que el perfil de pigmento de la fermentación en dos etapas justo antes y después de la adición de aminoácido se muestra en la figura 5I.
La fermentación que comprendía KNO30,1 M como única fuente de nitrógeno produjo una mezcla de pigmentos (figura 5G), mientras que la fermentación que comprendía L-serina 0,1 M como única fuente de nitrógeno produjo cis-atrorosina-S con impurezas mínimas (figura 5H).
Para la fermentación en dos etapas, durante la primera fase (bajas cantidades de KNO3) se produjeron dos isómeros de PP-O: en la segunda fase (tras la adición de serina), ambos isómeros de PP-O se convirtieron en cis-atrorosina-S.
El pico de UV principal detectado a los 8 minutos en ambos cromatogramas H y I corresponde a atrorosina-S (tal como se confirma mediante espectrometría de masas) y los dos picos detectados entre 10 y 11 minutos en el cromatograma I corresponden a los isómeros cis y trans de PP-O.
3.4 Agotamiento de nitrato durante la fermentación en dos etapas
Después de 54 horas, se estimó que se había agotado KNO3 debido a la meseta en la salida de CO2 y biomasa (figura 5C). Esto se confirmó mediante estimación semicuantitativa usando tiras de nitrato Quanto-fix tal como se muestra en la figura 9. Ya después de 42 horas los niveles de nitrato comenzaron a disminuir en comparación con un momento anterior en la fermentación; esto corresponde a cuando comenzaron a producirse las dos
formas isoméricas del precursor PP-O (figura 5C). Lo que era más evidente era que, después del cambio a serina como fuente de nitrógeno, los pigmentos en el sobrenadante se volvieron de color rojo brillante y, tal como se demuestra mediante las tiras de nitrato Quanto, se agotó el nitrato.
Para la producción de un pigmento de atrorosina individual mediante T. atroroseus según el método de fermentación en 2 etapas, es esencial que se agoten los niveles de nitrato en el medio de cultivo (hasta menos de 5 mM) antes de la adición de un aminoácido.
Cultivando T. atroroseus en un medio de fermentación que comprende altas concentraciones de nitrato (tal como >0,02 M), se produce una mezcla de pigmentos (tal como se observa en las figuras 5A y G) antes del agotamiento de nitrato y, como consecuencia, cuando se añade un aminoácido al medio de cultivo, no es posible obtener un producto de atrorosina puro individual.
Cultivando T. atroroseus en un medio de fermentación que comprende bajos niveles de nitrato (tal como <0,02 M) y añadiendo un aminoácido al medio de cultivo “demasiado pronto”, es decir, antes de agotarse el nitrato y antes del inicio de la acumulación de PP-O, no se obtiene un producto de atrorosina individual sino más bien una mezcla de pigmentos. Cuando se añade antes del inicio de la producción de PP-O, el aminoácido se usa para funciones celulares y no estará presente en exceso (en comparación con nitrato), dando como resultado una mezcla de atrorosinas.
3.5 La economía de carbono de la producción de atrorosina se potencia usando la fermentación en dos etapas (cálculo referido a la tabla 3)
En el procedimiento de fermentación en una etapa en el que se suministra serina, T. atroroseus usa 20 g/l de sacarosa y 10 g/l de serina para producir 0,9 g/l de atrorosina-S.
En el procedimiento de fermentación en dos etapas T. atroroseus usa 20 g/l de sacarosa y 2 g/l de serina para producir 0,9 g/l de atrorosina-S.
El peso molecular de la sacarosa es de 324,3 g/mol. Cuando solo se tiene en cuenta el uso de carbono del procedimiento, se usa la unidad c-mol. La sacarosa tiene la fórmula química C12H22O11 , por consiguiente:
324,3 g/mol 342,3 g/mol corresponden a 28,53 g/c-mol (28,53 c-mol = 12 moléculas de carbono/
20 g de sacarosa es igual a (n = m/c-mol = 20 g / 28,53 g/c-mol) = 0,7 c-mol.
Puede llevarse a cabo el mismo cálculo para atrorosina-S y serina.
Atrorosina-S: C26H29NO9 y 499,18 g/mol.
Serina: C3H7 NO3 y 105,09 g/mol.
Tabla 3: economía de carbono en la producción de atrorosina-S
El método de cultivo en una etapa convierte el 4,8% del carbono en atrorosina-S, mientras que en el cultivo en dos etapas correspondiente la conversión de carbono en atrorosina-S se aumentó hasta el 6,4% (véase la tabla 4). Cuando se suministra KNO3 como fuente de nitrógeno, la conversión de carbono en una mezcla de pigmentos fue de tan solo el 1% (tabla 4)). Por consiguiente, la economía de carbono del método de fermentación en una etapa y en dos etapas para la producción de un pigmento de azafilona alcanza un rendimiento al menos 4 veces superior a los métodos de fermentación tradicionales basados en nitrógeno inorgánico.
3.6 Se producen rendimientos potenciados de cis-atrorosina-S pura mediante T. atroroseus usando el procedimiento de fermentación en una y en dos etapas
Usando métodos de fermentación tradicionales basados un medio de crecimiento que comprende nitrógeno inorgánico (véase la tabla 4), T. atroroseus convierte carbono en una mezcla de pigmentos con una economía de carbono de tan solo el 1% o menos. En cambio, la economía de carbono del método de fermentación en una etapa y en dos etapas para la producción de un pigmento de azafilona individual con un rendimiento al menos 4 veces superior.
Tabla 4: efecto de las condiciones de fermentación sobre el perfil y rendimiento de pigmento
Ejemplo 4. Los productos de T. atroroseus producidos mediante el método de fermentación en una etapa o en dos etapas están libres de micotoxinas
El análisis de caldo de fermentación derivado a partir de la fermentación en una etapa o en dos etapas de T. atroroseus (al que se suministra KNO3 , serina, o KNO3 y serina), muestra que la micotoxina citrinina (m/z = 251,0920) no se produce (ni mevinolina; no mostrado) en ninguna de las tres condiciones de cultivo (figura 6). Ejemplo 5. Estructura de pigmentos de atrorosina novedosos producidos mediante fermentación de T. atroroseus Se extrajeron pigmentos de atrorosina en el caldo de fermentación de T. atroroseus derivado a partir de la fermentación en una etapa o en dos etapas y se separaron tal como se describió en el ejemplo 2.1; y posteriormente se analizaron usando los siguientes métodos:
5.1 Cromatografía de líquidos de ultraalto rendimiento - Espectrometría de masas de alta resolución (UHPLC-EMAR)
Se realizó UHPLC-EMAR en un sistema de UHPLC Agilent Infinity 1290 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.) equipado con un detector de red de diodos. Se obtuvo la separación en una columna de fenil-hexilo Agilent Poroshell 120 (2,1 * 250 mm, 2,7 |jm) con un gradiente lineal que consistía en agua (A) y acetonitrilo (B), ambos tamponados con ácido fórmico 20 mM, empezando al 10% de B y aumentado hasta el 100% en 15 min, a lo que se mantuvo durante 2 min, volvió hasta el 10% en 0,1 min y permaneció durante 3 min (0,35 ml/min, 60°C). Se usó un volumen de inyección de 1 jl. Se realizó detección mediante EM en modo de detección positivo en un dispositivo Agilent 6545 QTOF MS equipado con fuente de iones de electropulverización Agilent Dual Jet Stream con una temperatura de gas de secado de 250°C, flujo de gas de 8 l/min, temperatura de gas de protección de 300°C y flujo de 12 l/min. Se ajustó la tensión capilar a 4000 V y la tensión de boquilla a 500 V. Se registraron espectros de masas a 10, 20 y 40 eV como datos de centroide para m/z 85-1700 en modo de EM y m/z 30-1700 en modo de EM/EM, con una tasa de adquisición de 10 espectros/s. Se introdujo por infusión una disolución de masa conocida en metanol:agua 70:30 en el segundo pulverizador usando una bomba de CL adicional a un flujo de 15 jl/min usando un divisor 1:100. La disolución contenía tributilamina 1 jM (Sigma-Aldrich) y hexakis(2,2,3,3-tetrafluoropropoxi)fosfazeno 10 jM (Apollo Scientific Ltd., Cheshire, R.U.) como masas conocidas. Se usaron los iones [M H]+ (m/z 186,2216 y 922,0098, respectivamente) de ambos compuestos. 5.2 Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN)
Se registraron espectros de 1D y 2D-RMN (1H, DQF-COSY, edHSQC, HMBC y NOESY) o bien en un dispositivo Bruker Ascend 400 MHz (Bruker, Billerica, MA, EE. UU., o bien en un dispositivo Bruker Avance 800 MHz ubicados en el departamento de química en la universidad técnica de Dinamarca. Se adquirieron espectros de RMN usando secuencias de pulsos convencionales. El disolvente usado fue o bien DMSO-d6, que también se usó como referencia con las señales a 5H = 2,50 ppm y 5C = 39,5 ppm, o bien CD3OD (referencia a 5H = 3,31 ppm y 5C = 49,0 ppm). El procesamiento y análisis de datos se realizó usando TopSpin 3.5 (Bruker), MestReNova v.6.2.1-7569 (Mestrelab Research, Santiago de Compostela, España) y ACD NMR Workbook (Advanced Chemical Development, Inc., Toronto, Ontario, Canadá). Los acoplamientos J se notifican en hercios (Hz) y los desplazamientos químicos en ppm (5).
5.3 Elucidación estructural de c/s-atrorosina-S
La atrorosina-S purificada era un sólido amorfo de color rojo oscuro, casi negro. HR-ESI-EM dio una razón de
masa con respecto a carga de [M+H]+ = 500,1915 Da, correspondiente a una fórmula molecular de C26H30NO9 (DBE=13).
TABLA 5: desplazamientos de protones y carbono y constantes de acoplamiento para atrorosina-S.
N.° 1H 13C mult.
1-OH - - -
1 - 166,8 -
2 6 43 130,9 d (J=11,8)
3 6 94 133,8 d (J=11,8)
4 - 149,7 -
5 6 81 119,6 S
6 - 151,8 -
7 6 72 117,7 S
8 - 168,0 -
9 - 86,8 -
9-CH3 167 30,1 S
10 - 195,4 -
11 - 98,6 -
12 8 57 142,8 S
13 - 174,6 -
14 - 125,4 -
15 - 198,5 -
16 2 82 40,9 M
17 159 25,8 quint (J=7,0 Hz)
18 131 233/30,0/325
19 131 233/30,0/325 M
20 131 233/30,0/325
21 131 233/30,0/325
22 0 89 13,9 t (J=7,3)
1'-OH - - -
1' - 169,1 -
2' 512 67,3 dd (J=5,4/2,9)
3'a 428 62,5 dd (J=12,2/5,4)
3'b 409 62,5 dd (J=12,2/2,9)
La c/s-atrorosina-S tenía un espectro de absorción UV similar al de monascorubraminas conocidas, con UVmáx a 520 nm. Se usaron 1D y 2D-RMN (desplazamientos indicados en la tabla 5) para determinar su estructura.
1H-RMN y HSQC revelaron cinco protones olefínicos en el intervalo de desde 6,43 hasta 8,57 ppm (2, 3, 5, 7 y 12), y dos grupos metilo a 1,67 (9-CH3) y 0,89 ppm (22). Además, pudieron identificarse un total de siete grupos CH2, seis de ellos unidos entre sí en una cadena de ácido graso (16-21) y uno (3') unido a un CH a 5,12 ppm (2').
13C-RMN y HMBC revelaron 11 carbonos cuaternarios: cinco carbonilos (1, 10, 13, 15 y 1'), cinco carbonos de alqueno (4, 6, 8, 11 y 14) y un alcano cuaternario (9).
HMBC proporcionó acoplamientos de H-C de largo alcance dentro de la estructura principal de azafilona, que unen 3' al carbonilo 1'. 3' también mostró acoplamiento con 4. 16 y 17 tenían correlaciones con 15, y 5 y 12 tenían correlaciones con 6, 10 y 10, mientras que 7 y 9-CH3 mostraron acoplamientos con 8 y 9. Además, se observaron acoplamientos con 1 y 4 a partir de 2 y 3. Finalmente, las constantes de acoplamiento entre 2 y 3 respaldaban una configuración c/s del doble enlace. Basándose en los espectros obtenidos, se determinó que la atrorosina-S tenía la estructura expuesta en la figura 7.
5.4 Elucidación estructural de derivados de aminoácidos de atrorosina
Se elucidó la estructura de los 18 derivados de aminoácido de atrorosina restantes para confirmar que el aminoácido respectivo se incorporaba en la estructura principal de azafilona al igual que para c/s-atrorosina-S (datos no mostrados). Los datos de RMN solo mostraron diferencias con respecto a c/s-atrorosina-S en el resto de aminoácido unido a la parte de isoquinolina de la molécula. Los 18 derivados de aminoácido de atrorosina tenían todos ellos un color rojo brillante.
Ejemplo 6. Propiedades físicas de pigmentos de atrorosina
6.1 Hidrofilia de pigmentos de atrorosina en comparación con monascorubramina respectiva (sin ácido carboxílico en la posición 1 como en todas las atrorosinas)
Los valores de logP y logD son una medida de la solubilidad de un analito en un sistema bifásico de agua/octanol. Cuanto menor es el valor más hidrófilo es el analito, correspondiendo un valor de logP/D de 0 a una distribución 50:50. logP se refiere únicamente a especies no ionizadas, mientras que logD se refiere tanto a especies ionizadas como a no ionizadas y, por tanto, varía con el pH.
Tabla 5: valores de logP para pigmentos de atrorosina y monascorubramina
Los valores de logP y logD, que se presentan para atrorosina-S y atrorosina-E en la figura 8, demuestran que son más solubles.
6.2 Valores colorimétricos de pigmentos de atrorosina
Se determinaron las características de color de los pigmentos de atrorosina usando el sistema de color de CIELAB (15). Se midieron los valores de L*, a* y b* mediante un colorímetro CR-300 con el sistema de color de CIELAB (Minolta Camera Co., Ltd., Osaka, Japón). Después se usaron estos valores para calcular los valores de croma (C*) y de ángulo de tonalidad (hab). L* indica la claridad desde 0 (negro) hasta 100 (blanco). Los positivos y negativos en a* representan rojo y verde, respectivamente, mientras que los positivos y negativos en b* representan amarillo y azul, respectivamente. Los valores de croma designan la saturación o pureza del color. Los valores próximos al centro al mismo valor de L* indican colores mate o grises, mientras que los valores cerca de la circunferencia representan colores vívidos o brillantes. Los valores de ángulo de tonalidad representan 0 para rojo, 90 para amarillo, 180 para verde y 270 para azul. Se obtuvieron los valores de L*, a* y b* de los pigmentos puros después de ajustarse su concentración en dilución hasta 4.
Bibliografía
Rasmussen et al 2015: tesis de PhD “Talaromyces atroroseus - Genome sequencing, Monascus pigments and azaphilone gene cluster evolution”. Biblioteca de DTU disponible en orbit.dtu.dk
Kim et al 2006. FEMS Microbiology Letters, vol. 264, n.° 1, págs. 117-124.
Claims (9)
1. Método para producir un pigmento de atrorosina mediante fermentación, que comprende las etapas de:
a. proporcionar esporas o micelios de una especie del género Talaromyces,
b. cultivar las esporas o micelios de (a) en un medio de crecimiento líquido,
c. recuperar el pigmento de atrorosina producido durante dicho cultivo en la etapa b), y
d. opcionalmente aislar dicho pigmento de atrorosina,
en el que el pH del medio de crecimiento en la etapa (b) se mantiene entre 4 y 6;
en el que la única fuente de nitrógeno en dicho medio de crecimiento líquido en la etapa (b) es un compuesto seleccionado del grupo que consiste en un aminoácido individual, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y
en el que el pigmento de atrorosina tiene la estructura de la fórmula I
en la que N-R se selecciona del grupo que consiste en un aminoácido, un péptido, un aminoazúcar y una amina primaria, y la configuración del doble enlace entre el carbono 2 y 3 es cis.
2. Método para producir un pigmento de atrorosina mediante fermentación según la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de:
a’) cultivar las esporas o micelios de (a) en un medio de crecimiento líquido preliminar, en el que la única fuente de nitrógeno es una fuente de nitrógeno inorgánico y la concentración de NO3- es de no más de 20 mM, continuando el cultivo hasta que la concentración de NO3" se agota hasta menos de 5 mM; y en el que dicha etapa
va seguida por la etapa (b).
3. Método según la reivindicación 2, en el que la única fuente de nitrógeno en la etapa
es una fuente de nitrógeno inorgánico seleccionada del grupo que consiste en KNO3 y NaNO3.
4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la única fuente de nitrógeno en la etapa (b) es un aminoácido individual, seleccionado del grupo que consiste en: L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-aspartato, L-cisteína, L-glutamina, L-glutamato, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-serina, L-treonina, L-tirosina, L-valina y L-ornitina.
5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la especie es Talaromyces atroroseus.
6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medio de crecimiento líquido preliminar y el medio de crecimiento líquido son sintéticos y comprenden sales, metales traza y una fuente de carbono,
en el que las sales son KH2PO4 , NaCl, MgSO4.7 H2O, KCI y CaCl2.H2O y los metales traza son CuSO4.5 H2O, Na2B4O7.10 H2O, FeSO4.7 H2O, MnSO4.H2O, Na2MoO4.2 H2O y ZnSO4.7 H2O.
7. Método según la reivindicación 6, en el que la fuente de carbono se selecciona de glucosa, sacarosa, maltosa, almidón soluble, melazas de remolacha o de caña, malta y cualquier combinación de al menos
dos de los mismos.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la fermentación se realiza usando fermentación discontinua o semicontinua en condiciones aerobias.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el medio de crecimiento líquido en la etapa (b) se mantiene dentro de un pH de 4,0 a 5,5.
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