ES2882631T3 - Enzimas sensibles a lactato estabilizadas, electrodos y sensores y procedimientos para fabricar y utilizar las mismas - Google Patents

Enzimas sensibles a lactato estabilizadas, electrodos y sensores y procedimientos para fabricar y utilizar las mismas Download PDF

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Tianmei Ouyang
Benjamin J Feldman
Kuan-Chou Chen
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Abbott Diabetes Care Inc
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Abstract

Sensor de lactato que comprende una composición enzimática que comprende: una enzima sensible a lactato; y un agente estabilizante que estabiliza la enzima sensible a lactato de manera suficiente para: proporcionar una señal de sensor que se cambia en 10 % o menos durante 60 horas continuas o más, y aumentar la sensibilidad del sensor al lactato; en el que el agente estabilizante es catalasa y la enzima sensible a lactato es lactato oxidasa.

Description

DESCRIPCIÓN
Enzimas sensibles a lactato estabilizadas, electrodos y sensores y procedimientos para fabricar y utilizar las mismas
INTRODUCCIÓN
[0001] El lactato es un metabolito clave y su monitorización es importante para evaluar la salud, incluyendo enfermos críticos y/o de cuidados intensivos y/o pacientes de cirugías, por ejemplo. Sin embargo, hasta la fecha no existe un procedimiento eficiente y eficaz para monitorizar el lactato, especialmente a lo largo del tiempo, tal como se requiere para pacientes en la UCI o el área quirúrgica. Se puede utilizar la monitorización del lactato para detectar sepsis, hipoxia y presencia de tejidos cancerosos (Clinical use of lactate monitoring in critically ill patients Jan Bakker, Maarten WN Nijsten and Tim C Jansen.).
[0002] Aunque la monitorización de lactato es deseable, existen varios desafíos asociados con la monitorización de lactato, tal como, la estabilidad enzimática. Es recomendable el desarrollo de sensores mejorados de lactato que tengan un alto nivel de estabilidad y sensibilidad.
[0003] Los documentos US-A-20120138484 y US-A-5476776 dan a conocer sensores basados en enzimas. El documento JP-A-2011120500 da a conocer una composición de lactato oxidasa.
CARACTERÍSTICAS
[0004] De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sensor de lactato o una composición enzimática, tal como se reivindica en las reivindicaciones independientes. Las realizaciones de la presente divulgación se refieren a enzimas de lactato estabilizadas, electrodos, sensores y procedimientos. En el presente documento se dan a conocer composiciones enzimáticas sensibles a lactato, agente estabilizador de enzima sensible a lactato y polímero. Algunos o todos estos componentes pueden estar no unidos o no conectados o dos o más de estos componentes pueden estar unidos o conectados entre sí. Por ejemplo, la enzima y/o el estabilizador pueden estar unidos al polímero, por ejemplo, unidos de manera covalente. En determinadas realizaciones, se puede incluir un mediador, y el mediador puede estar unido al polímero, con o sin una enzima sensible a lactato y/o un agente estabilizador de enzima sensible a lactato unido al polímero. La enzima sensible a lactato puede ser lactato oxidasa y el estabilizador de enzima sensible a lactato puede ser catalasa. También, se proporcionan procedimientos de fabricación de las composiciones enzimáticas de lactato oxidasa estables, los electrodos de lactato, los sensores de lactato y los procedimientos para usar los mismos, por ejemplo, para monitorizar lactato.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
[0005] En el presente documento se proporciona una descripción detallada de varias realizaciones de la presente divulgación con referencia a los dibujos que las acompañan, que se describen brevemente a continuación. Los dibujos son ilustrativos y no necesariamente están dibujados a escala. Los dibujos ilustran varias realizaciones de la presente divulgación y pueden ilustrar una o más realizaciónes o ejemplos de la presente divulgación en su totalidad o en parte. Se puede utilizar una referencia numérica, con letra y/o símbolo, que se utiliza en un dibujo con referencia a un elemento particular, en otro dibujo con referencia a un elemento similar.
La FIGURA 1 muestra un gráfico de salida de señal de un sensor como una función del tiempo para tres sensores de lactato, que no incluyen un agente estabilizador como parte de la composición enzimática de sensor.
La FIGURA 2 muestra un gráfico de salida de señal de un sensor con el tiempo como respuesta a cambios graduales en concentración de lactato para sensores de lactato con falta de un agente estabilizador y sensores de lactato que tienen un agente estabilizador como parte de la composición enzimática.
La FIGURA 3 muestra un gráfico de salida de señal de un sensor como una función de concentración de lactato para sensores de lactato con falta de un agente estabilizador y sensores de lactato que tienen un agente estabilizador como parte de la composición enzimática.
La FIGURA 4 muestra un gráfico de estabilidad de salida de señal de un sensor como una función del tiempo para sensores de lactato con falta de un agente estabilizador y sensores de lactato que tienen un agente estabilizador como parte de la composición enzimática.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
[0006] Antes de describir las realizaciones de la presente divulgación, se debe entender que esta invención no se limita a realizaciones particulares descritas, debido a que tales realizaciones, por supuesto, pueden variar. También se debe entender que la terminología utilizada en el presente documento se utiliza solamente con el fin de describir realizaciones particulares y no pretende limitar, dado que el alcance de las realizaciones de la invención se incorporará en las reivindicaciones adjuntas.
[0007] Cuando se proporciona un rango de valores, se entiende que cada valor intermedio, hasta el décimo de la unidad del límite inferior, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario, entre los límites superior e inferior de aquel rango está descrito, también, de manera específica. Cada rango menor entre cualquier valor indicado o valor intermedio y cualquier otro valor indicado o intermedio en aquel rango indicado está comprendido dentro de la invención. Los límites superior e inferior de estos rangos más pequeños pueden estar incluidos o excluidos independientemente en el rango, y cada rango, donde cualquiera de los dos, ninguno o ambos límites se incluyen en los rangos menores está comprendido, también, dentro de la invención, sujeto a cualquier límite excluido específicamente en el rango indicado. Cuando el rango indicado incluye uno o ambos límites, los rangos, que excluyen cualquiera de los dos o ambos de aquellos límites incluidos, se incluyen, también, en la invención.
[0008] En la descripción de la invención del presente documento, se entenderá que una palabra, que aparece en singular, incluye su homólogo en plural, y una palabra, que aparece en plural, incluye su homólogo en singular, a menos que se entienda de manera implícita o explícita o se especifique lo contrario. Simplemente a modo de ejemplo, una referencia a «una(s)» o «la(s)» «enzimas» incluye una enzima única, así como una combinación y/o una mezcla de dos o más enzimas diferentes, en lo que se refiere a «un» o «el» «valor de concentración» incluye un valor único de concentración, así como dos o más valores de concentración y similares, a menos que se entienda de manera implícita o explícita o se especifique lo contrario. Además, se entenderá que para cualquier componente proporcionado descrito en el presente documento, cualquiera de los candidatos posibles o alternativas enumeradas, se pueden utilizar de manera general individualmente o en combinación uno con el otro, a menos que se entienda de manera implícita o explícita o se especifique lo contrario. Adicionalmente, se entenderá que cualquier lista de tales candidatos o alternativas es simplemente ilustrativa, no limitativa, a menos que se entienda de manera implícita o explícita o se especifique lo contrario.
[0009] A continuación se describen varios términos para facilitar un entendimiento de la invención. Se entenderá que una descripción correspondiente de estos diversos términos se aplica a variaciones o formas lingüísticas o gramaticales correspondientes de estos diversos términos. Se entenderá también que la invención no se limita a la terminología utilizada en el presente documento o la descripción de la misma para la descripción de realizaciones particulares. Simplemente a modo de ejemplo, la invención no se limita a lactatos particulares, fluidos o tejidos corporales, sangre o sangre capilar o construcción de sensores o su uso, a menos que se entienda de manera implícita o explícita o se especifique lo contrario.
[0010] Las publicaciones divulgadas en el presente documento se proporcionan solamente para su divulgación anterior a la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en el presente documento se debe interpretar como una admisión de que las realizaciones de la invención no permitan preceder a tal publicación debido a una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes a las fechas de publicación actual, que probablemente sea necesario confirmar de manera independiente.
[0011] La presente divulgación da a conocer composiciones enzimáticas de lactato que incluyen enzimas sensibles a lactato, agente estabilizador de enzima sensible a lactato y polímero, que puede incluir sitios de unión de la enzima y/o el estabilizador. Se puede incluir, también, un reticulante y/o un agente de transferencia de electrones. Las composiciones enzimáticas de lactato estabilizadas no cambian (o al menos tienen actividad y/o sensibilidad y/o especificidad, que no cambia) durante un periodo de tiempo en condiciones de uso de la composición, que incluyen las condiciones de uso, tales como, temperatura, ambientes fisiológicos, duración, etc., cuando se aplica a un electrodo y/o un sensor de lactato in vivo. Una composición enzimática de lactato estable y/o no cambiada es una que tiene menos de 10 % de disminución, incluyendo menos de 8 %, menos de 7 %, menos de 5 % y menos de 1 %, en una señal a una concentración constante de solución de lactato durante un periodo de tiempo predeterminado, tal como, 60 horas, 40 horas, 20 horas o 10 horas. Los cambios, si se producen, no tienen importancia clínica para la monitorización de lactato, por ejemplo, no tienen importancia estadística y/o no afectan clínicamente el resultado del análisis de gradilla de error de Clark y/o MARD y/o MAD. Los cambios son al menos menores que los cambios en una composición de control de una enzima sensible a lactato no estabilizada. Por ejemplo, un cambio en la composición enzimática estabilizada de lactato, que se da a conocer en el presente documento, no provocará un cambio de una zona a otra zona de la gradilla de error de Clark, o al menos no provocará un cambio en una zona menos precisa, tal como, de zona B a zona C, etc. La enzima sensible a lactato estabilizada al menos permanece estabilizada hasta y a lo largo del periodo de tiempo de uso in vivo (es decir, vida de funcionamiento), por ejemplo, de unas cuantas semanas hasta unos cuantos meses o más, hasta un año o más en un entorno in vivo o en un entorno ex vivo, que simula un entorno in vivo. En determinadas realizaciones, la enzima sensible a lactato es lactato oxidasa y el estabilizador es catalasa o sus derivados y mimetizadores (en general «catalasa»).
[0012] En determinados ejemplos, la catalasa reduce o elimina la degradación de la lactato oxidasa (por ejemplo, desnaturalización o pérdida de actividad catalítica) reduciendo o eliminando degradación de la lactato oxidasa causada por especies oxidativas (por ejemplo, especies de peróxido, especies de oxígeno reactivo, etc.), inhibidores o desnaturalizantes. En algunas realizaciones, la catalasa reduce la degradación de la lactato oxidasa hasta 2 veces o más, incluyendo 5 veces, 8 veces, 10 veces y hasta 12 veces en comparación con la degradación de un control de lactato oxidasa, que se producirá en ausencia de la catalasa. En algunas realizaciones, la catalasa reduce la cantidad de degradación de la lactato oxidasa en 20 %-80 % más en comparación con la degradación que se produciría en ausencia de la catalasa. Por lo tanto, la catalasa conserva la actividad enzimática a lo largo de tiempo y en una variedad de condiciones de uso.
[0013] La lactato oxidasa puede estar presente en las composiciones enzimáticas en una cantidad, que oscila entre 0,05 |jg y 5 |jg, tal como, desde 0,1 |jg hasta 4 |jg, tal como, desde 0,2 |jg hasta 3 |jg e incluyendo desde 0,5 |jg hasta 2 jig. La catalasa puede estar presente en las composiciones enzimáticas en una cantidad, que oscila entre 0,05 jig y 5 jig, tal como, desde 0,1 jig hasta 1 jig, tal como, desde 0,2 jig hasta 0,9 jig e incluyendo desde 0,5 jig hasta 2 jig. En determinadas realizaciones, la proporción en peso (p/p) de lactato oxidasa con respecto a catalasa puede oscilar entre 10 y 1, 8 y 1, 5 y 1 y 2 y 1.
[0014] En algunas realizaciones, se degrada menos de 10 % de la enzima, en algunas realizaciones, menos de 5 % o incluso menos de 1 % o 0,5 % o incluso 0,1 %. Se degradan 5 jig o menos de la enzima sensible a lactato durante el tiempo que el sensor está en contacto con la fuente de lactato hasta que no lo esté, tal como, 3 jig o menos, tal como 2 jig o menos e incluyendo 1 jig o menos de la enzima sensible a lactato. Por ejemplo, cuando está presente el agente estabilizante de catalasa en las composiciones en cuestión, se degradan 5 jig o menos de la lactato oxidasa después de 3 horas continuas o más, tal como, 5 horas continuas o más, tal como, 6 horas continuas o más, tal como, 12 horas continuas o más, tal como, 24 horas continuas o más, tal como, 48 horas continuas o más, tal como, 72 horas continuas o más e incluyendo 168 horas continuas o más.
[0015] La lactato oxidasa no estabilizada puede provocar una disminución de señal no relacionada con el nivel de lactato evaluado (es decir, debido a la inestabilidad enzimática), cuando se utiliza la enzima para monitorizar lactato, por ejemplo, cuando se utiliza con un electrodo en un sensor electroquímico de lactato in vivo (descrito con más detalle a continuación). En un ejemplo, la catalasa estabiliza la actividad de la lactato oxidasa y proporciona un sensor de lactato in vivo, que mantiene una salida de señal estable (es decir, señal estable de sensor, tal como, corriente o voltaje) a lo largo de la duración del periodo de desgaste del sensor in vivo y bajo condiciones de desgaste, tal como se señala anteriormente. La catalasa puede estabilizar la lactato oxidasa y proporcionar un sensor de lactato in vivo, que muestra sensibilidad y/o especificidad aumentada de lactato en comparación con el mismo sensor de lactato sin la catalasa. En estas realizaciones, la catalasa estabiliza la lactato oxidasa de tal modo que el sensor de monitorización de lactato estabilizado muestra una disminución en la salida de sensor de 10 % o menos de la salida total de sensor mientras el sensor está en contacto con la fuente de lactato, tal como, de 8 % o menos, tal como, de 5 % o menos, tal como, 3 % o menos, tal como, de 2 % o menos, tal como de 1 % o menos, tal como de 0,1 % o menos e incluyendo 0,01 % o menos. En determinadas realizaciones, la catalasa estabiliza la lactato oxidasa de tal modo que el sensor muestra una disminución en la salida de sensor de 2 nA o menos mientras el sensor está en contacto con la fuente de lactato, tal como, de 1,5 nA o menos, tal como, de 1 nA o menos, tal como, de 0,5 nA o menos, tal como, de 0,1 nA o menos e incluyendo 0,01 nA o menos. En los sensores de lactato, donde no está presente el agente estabilizante, el sensor muestra una disminución en la salida de señal que es mayor de 10 % durante el tiempo que el sensor de lactato está en contacto con la fuente del lactato. Por ejemplo, en ausencia del agente estabilizante, los sensores de lactato pueden mostrar una disminución en la salida de sensor que es 15 % o más, tal como, de 25 % o más, tal como, de 50 % o más e incluyendo de 75 % o más, que no se relaciona con la concentración de lactato.
[0016] En algunas realizaciones, las composiciones de lactato oxidasa/catalasa aumentan la sensibilidad de lactato en comparación con sensores sin la catalasa, por ejemplo, mediante un aumento de 5 % o más, tal como, de 10 % o más, tal como, de 15 % o más, tal como, de 20 % o más, tal como, de 25 % o más e incluyendo de 50 % o más. Las composiciones de lactato oxidasa/catalasa aumentan la sensibilidad de sensor de lactato en 1 nA/mg/dL o más, tal como, en 2 nA/mg/dL o más, tal como en 5 nA/mg/dL o más, tal como, en 7 nA/mg/dL o más, tal como, en 10 nA/mg/dL e incluyendo en 15 nA/mg/dL o más. En los sensores de lactato, donde no está presente el agente estabilizante, el sensor no muestra aumento de sensibilidad y, en algunos casos, muestra una pérdida de sensibilidad de sensor mientras el sensor de lactato está en contacto con la fuente de lactato, tal como, una disminución de sensibilidad de sensor de 3 % o más, tal como, de 5 % o más, tal como, de 7 % o más e incluyendo una disminución de sensibilidad de sensor de 10 % o más. Por ejemplo, en ausencia de agente estabilizante, los sensores de lactato pueden mostrar una disminución de sensibilidad de sensor de 1 nA/mg/dL o más, tal como, de 2 nA/mg/dL, tal como, de 5 nA/mg/dL, tal como, de 7 nA/mg/dL, tal como, de 10 nA/mg/dL e incluyendo de 15 nA/mg/dL o más mientras el sensor está en contacto con la fuente de lactato.
[0017] Las composiciones de lactato oxidasa/catalasa pueden ser heterogéneas u homogéneas. En algunas realizaciones, ambas se distribuyen a través de la composición, por ejemplo, cuando se aplica a un electrodo. Por ejemplo, la lactato oxidasa y la catalasa se pueden distribuir de manera uniforme por toda la composición, de tal modo que la concentración de cada una de la lactato oxidasa y la catalasa sea la misma por toda la misma. En algunos casos, la composición tiene una distribución homogénea de la lactato oxidasa y la catalasa. En determinados ejemplos, la composición de lactato oxidasa/catalasa incluye, además, un agente de transferencia de electrones que se distribuye también a través de la composición. En determinadas realizaciones, los tres de la enzima sensible a lactato, el agente estabilizante y el agente de transferencia de electrones se distribuyen uniformemente por toda la composición.
[0018] Los sensores de lactato estabilizados in vivo descritos detectan y/o monitorizan lactato en un fluido biológico in vivo. En algunas realizaciones, estos sensores de lactato in vivo pueden detectar y/o monitorizar lactato en uno o más fluidos intersticiales, sangre y sus constituyentes, fluido dérmico, mucosidad, fluido linfático, fluido sinovial, fluido cerebroespinal, saliva, lavado broncoalveolar, fluido amniótico y sangre amniótica de cordón umbilical.
[0019] En algunas realizaciones, el sujeto es un ser humano. Los sensores descritos en el presente documento se pueden aplicar a sujetos de cualquier género y a cualquier edad de desarrollo (es decir, fetos, recién nacidos, infantes, jóvenes, adolescentes y adultos), mientras que en determinadas realizaciones el sujeto es un joven, adolescente o adulto. Mientras que la presente divulgación se describe en el contexto de sujetos humanos, se debe entender que los sensores se pueden configurar para analizar muestras de otros sujetos animales (es decir, en «sujetos» «no humanos»), tales como, pero no se limitan a, perros, gatos, pájaros, ratones, ratas, cobayas, chimpancés, monos y otros primates, ganado y caballos. En algunas realizaciones, los sensores de lactato de interés son sensores in vivo configurados de tal modo que al menos una parte se coloca en el sujeto. Por ejemplo, todo o una parte del sensor estabilizado de lactato oxidasa se puede colocar debajo de la superficie de la piel del usuario para tener contacto directo con fluido corporal para detectar y/o monitorizar lactato durante un periodo de tiempo.
[0020] Las composiciones de lactato oxidasa/catalasa pueden incluir un agente de transferencia de electrones. Estos pueden ser iones o moléculas electroreducibles y electrooxidables, que tienen potenciales redox, que están unos cuantos cientos milivoltios por encima o por debajo del potencial redox del electrodo de calomelanos estándar (SCE). El agente de transferencia de electrones puede ser orgánico, organometálico o inorgánico. Los ejemplos de especies redox orgánicas son quinonas y especies que en su estado de oxidación tienen estructuras quinoides, tales como, azul de Nilo e indofenol. Los ejemplos de especies redox organometálicas son metalocenos, que incluyen ferroceno. Los ejemplos de especies redox inorgánicas son hexacianoferrato (III), rutenio hexamina, etc. Los ejemplos adicionales incluyen aquellos descritos en las Patentes de EE. UU. Números 6.736.957, 7.501.053 y 7.754.093. Aunque cualquier especie orgánica, organometálica o inorgánica puede unirse con el polímero y utilizarse como un agente de transferencia de electrones, en determinadas realizaciones, el agente de transferencia de electrones es un compuesto o complejo de metales de transición, por ejemplo, compuestos o complejos de osmio, rutenio, hierro y cobalto.
[0021] En determinadas realizaciones, los agentes de transferencia de electrones tienen estructuras o cargas que previenen o reducen sustancialmente la pérdida difusional del agente de transferencia de electrones durante el periodo de tiempo de análisis de la muestra. Por ejemplo, los agentes de transferencia de electrones incluyen, pero no se limitan a especies redox, por ejemplo, unidas a un polímero, que a su vez puede estar dispuesto sobre o cerca del electrodo de trabajo. La unión entre las especies redox y el polímero puede ser covalente, de coordinación o iónica. Aunque cualquier especie orgánica, organometálica o inorgánica puede unirse con el polímero y utilizarse como un agente de transferencia de electrones, en determinadas realizaciones, el agente de transferencia de electrones es un compuesto o complejo de metales de transición, por ejemplo, compuestos o complejos de osmio, rutenio, hierro y cobalto. Los ejemplos de agentes de transferencia de electrones y agentes de transferencia de electrones unidos a polímero de interés incluyen, pero no se limitan a, los complejos de metales de transición descritos en las Patentes de EE. UU. Números 8.444.834, 8.268.143 y 6.605.201.
[0022] Las composiciones de lactato oxidasa/catalasa descritas en el presente documento son poliméricas. Los polímeros que se pueden utilizar pueden ser ramificados o no ramificados y pueden ser homopolímeros formados a partir de la polimerización de un tipo único de monómero o heteropolímeros, que incluyen dos o más tipos diferentes de monómeros. Los heteropolímeros pueden ser copolímeros, donde el copolímero tiene subunidades alternadas de monómero, o en algunos casos, pueden ser copolímeros de bloque, que incluyen dos o más subunidades de homopolímero unidas mediante uniones covalentes (por ejemplo, copolímeros dibloque o tribloque).
[0023] En algunas realizaciones, las composiciones de lactato oxidasa/catalasa en cuestión incluyen un polímero que contiene heterociclo. El término heterociclo (al que también se refiere como «heterociclilo») se utiliza en el presente documento en su sentido convencional para hacer referencia a cualquier resto cíclico, que incluye uno o más heteroátomos (es decir, átomos distintos a carbono) y puede incluir, pero no se limita a, N, P, O, S, Si, etc. Los polímeros que contienen heterociclo pueden ser heteroalquilo, heteroalcanilo, heteroalquenilo y heteroalquinilo, así como heteroarilo o heteroarilalquilo.
[0024] «Heteroalquilo, Heteroalcanilo, Heteroalquenilo y Heteroalquinilo» por sí mismos o como una parte de otro sustituyente hacen referencia a grupos de alquilo, alcanilo, alquenilo y alquinilo, respectivamente, donde uno o más de los átomos de carbono (y cualquier átomo de hidrógeno asociado) se sustituyen independientemente por los mismos o diferentes grupos heteroatómicos. Los grupos heteroatómicos típicos, que se pueden incluir en estos grupos, incluyen, pero no se limitan a, -O-, -S-, -S-S-, -O-S-,-NR37R38-, .=N- N=, -N=N-, -N=N-NR39R40, -PR41-, -P(O)2-, -POR42-, -O-P(O)2-, -S-O-, -S-(O)-, -SO2-, - SnR43R44- y similares, donde R37, R38, R39, R40, R41, R42 R43 y R44 son independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo, arilalquilo sustituido, cicloalquilo, cicloalquilo sustituido, cicloheteroalquilo, cicloheteroalquilo sustituido, heteroalquilo, heteroalquilo sustituido, heteroarilo, heteroarilo sustituido, heteroarilalquilo o heteroarilalquilo sustituido.
[0025] "Heteroarilo" por si mismo o como una parte de otro sustituyente se refiere a un radical heteroaromático monovalente derivado mediante la eliminación de un átomo de hidrógeno de un átomo único de un sistema de anillos heteroaromáticos. Los grupos típicos heteroarilo incluyen, pero no se limitan a, grupos derivados de acridina, arsindol, carbazol, p-carbolino, cromano, cromeno, cinnolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno, benzodioxol y similares. En determinadas realizaciones, el grupo heteroarilo es de 5-20 miembros de heteroarilo. En determinadas realizaciones, el grupo heteroarilo es de 5-10 miembros de heteroarilo. En determinadas realizaciones, los grupos heteroarilo son aquellos derivados de tiofeno, pirrol, benzotiofeno, benzofurano, indol, piridina, quinolina, imidazol, oxazol y pirazina.
[0026] "Heteroarilalquilo" por sí mismo o como una parte de otro sustituyente, se refiere a un radical de alquilo acíclico, donde uno de los átomos de hidrógeno unido a un átomo de carbono, típicamente un átomo de carbono terminal o sp3 se reemplaza por un grupo heteroarilo. Cuando se prevén grupos de alquilo específicos, se utiliza la nomenclatura de heteroarilalcanilo, heteroarilalquenilo y/o heteroarilalquinilo. En determinadas realizaciones, el grupo heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-30 miembros, por ejemplo, el grupo de alcanilo, alquenilo o alquinilo del heteroarilalquilo tiene 1-10 miembros y el grupo de heteroarilo es un heteroarilo de 5-20 miembros. En determinadas realizaciones, el grupo heteroarilalquilo es un heteroarilalquilo de 6-20 miembros, por ejemplo, el grupo de alcanilo, alquenilo o alquinilo del heteroarilalquilo tiene 1-8 miembros y la fracción de heteroarilo es un heteroarilo de 5-12 miembros.
[0027] En algunas realizaciones, el componente que contiene heterociclo es un sistema de anillos aromáticos. El "Sistema de Anillos Aromáticos" por sí mismo o como una parte de otro sustituyente, se refiere a un sistema de anillos cíclicos o policíclicos no saturados que contiene un sistema de electrones %. Se incluyen de manera específica dentro de la definición de «sistema de anillos aromáticos» sistemas de anillos fusionados, donde uno o más anillos son aromáticos y uno o más anillos están saturados o no saturados, tales como, por ejemplo, fluoreno, indano, indeno, fenaleno, etc. Los sistemas típicos de anillos aromáticos incluyen, pero no se limitan a, aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benceno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno y similares.
[0028] «Sistema de Anillos Heteroaromáticos» por sí mismo o como una parte de otro sustituyente hace referencia a un sistema de anillos aromáticos, donde uno o más de los átomos de carbono (y cualquier átomo de hidrógeno asociado) se sustituyen independientemente con el mismo o diferente heteroátomo. Los heteroátomos típicos que sustituyen los átomos de carbono, incluyen, pero no se limitan a, N, P, O, S, Si, etc. En la definición de "sistemas de anillos heteroaromáticos" se incluyen de manera específica sistemas de anillos fusionados, donde uno o más de los anillos son aromáticos, y uno o más de los anillos están saturados o no saturados, tales como, por ejemplo, arsindol, benzodioxano, benzofurano, cromano, cromeno, indol, indolina, xanteno, etc. Los sistemas típicos de anillos heteroaromáticos incluyen, pero no se limitan a, arsindol, carbazol, p-carbolina, cromano, cromeno, cinnolina, furano, imidazol, indazol, indol, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindol, isoindolina, isoquinolina, isotiazol, isoxazol, naftiridina, oxadiazol, oxazol, perimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazol, piridazina, piridina, pirimidina, pirrol, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazol, tiadiazol, tiazol, tiofeno, triazol, xanteno y similares.
[0029] En determinadas realizaciones, las composiciones de lactato oxidasa/catalasa incluyen un componente, que contiene nitrógeno heterocíclico, tal como, polímeros de polivinilpiridina (PVP) y polivinilimidazol.
[0030] Las composiciones poliméricas de lactato oxidasa/catalasa pueden incluir también uno o más reticulantes (agente reticulante) de tal modo que la composición enzimática de estructura polimérica está reticulada. Tal como se describe en el presente documento, la referencia para unir dos o más polímeros diferentes es reticulación intermolecular, mientras que la unión de dos o más fracciones del mismo polímero es reticulamiento intramolecular. En las realizaciones de la presente divulgación, los reticulantes pueden ser capaces de reticularse tanto de manera intermolecular como intramolecular al mismo tiempo.
[0031] Los reticulantes adecuados pueden ser bifuncionales, trifuncionales o tetrafucnionales, cada uno con cadena lineal o estructuras ramificadas. Los reticulantes, que tienen estructuras ramificadas incluyen un componente ramificado con múltiples brazos, tal como, un componente ramificado con 3 brazos, un componente ramificado con 4 brazos, un componente ramificado con 5 brazos, un componente ramificado con 6 brazos o un componente ramificado con un número más alto de brazos, tal como uno que tiene 7 brazos o más, tal como uno que tiene 8 brazos o más, tal como uno que tiene 9 brazos o más, tal como uno que tiene 10 brazos o más e incluyendo 15 brazos o más. En determinados ejemplos, el componente ramificado con múltiples brazos es un epóxido con múltiples brazos, tal como, un epóxido con 3 brazos o un epóxido con 4 brazos. Cuando el componente con múltiples brazos es un epóxido con múltiples brazos, el componente ramificado con múltiples brazos puede ser un epóxido con múltiples brazos con polietilenglicol (PEG) o un epóxido con múltiples brazos sin polietilenglicol (sin PEG). En algunas realizaciones, el componente ramificado con múltiples brazos es un epóxido con múltiples brazos sin PEG. En otras realizaciones, el componente ramificado con múltiples brazos es un epóxido con múltiples brazos con PEG. En determinadas realizaciones, el componente ramificado con múltiples brazos es un epóxido con 3 brazos con PEG o un epóxido con 4 brazos con PEG.
[0032] Los ejemplos de reticulantes incluyen, pero no se limitan a, polietilenglicol diglicidil éter, W,W-diglicidil-4-glicidiloxianilina, así como también, reticulantes multifuncionales con nitrógeno, que tienen las siguientes estructuras:
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[0033] En algunos ejemplos, pueden formarse uno o más enlaces con una o más enzimas sensibles a lactato, el agente estabilizante y el agente de transferencia de electrones. Por enlaces se entiende cualquier tipo de interacción entre átomos o moléculas, que permite a compuestos químicos formar asociaciones entre sí, tales como, pero no se limita a, enlaces covalentes, enlaces iónicos, interacciones dipolo-dipolo, enlaces de hidrógeno, fuerzas de dispersión de London y similares. Por ejemplo, la polimerización in situ de las composiciones de lactato oxidasa/catalasa puede formar reticulaciones entre los polímeros de la composición y la enzima sensible a lactato, el agente estabilizante y el agente de transferencia de electrones. En determinadas realizaciones, la reticulación del polímero con uno o más de las enzimas sensibles a lactato, el agente estabilizante y el agente de transferencia de electrones facilita una disminución en la aparición de deslaminación de las composiciones enzimáticas de un electrodo.
[0034] Tal como se describe en el presente documento, las composiciones de lactato oxidasa/catalasa se pueden utilizar con un sensor de lactato. Un sensor de lactato puede tener uno o más electrodos con la composición enzimática sensible a lactato estabilizada. En las realizaciones, el sensor de lactato incluye: un electrodo de trabajo que tiene un material conductor de la composición enzimática en cuestión próxima a (por ejemplo, dispuesta sobre) y en contacto con el material conductor. Se pueden incluir uno o más de otros electrodos, tales como, uno o más de contraelectrodos, uno o más de electrodos de referencia y/o uno o más de contraelectrodos/electrodos de referencia.
[0035] La configuración particular de sensores electroquímicos puede depender del uso para el que está previsto el sensor de lactato y las condiciones bajo las cuales operará el sensor de lactato. En determinadas realizaciones de la presente divulgación, los sensores de lactato son sensores de lactato posicionados completamente in vivo o sensores de lactato posicionados de manera transcutánea configurados para el posicionamiento in vivo en un sujeto. En un ejemplo, al menos una parte del sensor de lactato se puede colocar en el tejido subcutáneo para analizar las concentraciones de lactato en un fluido intersticial. En otro ejemplo, al menos una parte del sensor de lactato se puede colocar en el tejido dérmico para analizar la concentración de lactato en un fluido dérmico.
[0036] En las realizaciones, una o más de las composiciones enzimáticas en cuestión se colocan próximas a (por ejemplo, se disponen sobre) la superficie de un electrodo de trabajo. En algunos ejemplos, una pluralidad de composiciones enzimáticas se colocan próximas a la superficie del electrodo de trabajo (por ejemplo, en forma de manchas). En determinados ejemplos, se forma un perímetro discontinuo o continuo alrededor de cada pluralidad de composiciones enzimáticas colocadas próximas a la superficie del electrodo de trabajo. Los ejemplos de deposición de una pluralidad de composiciones de reactivo sobre la superficie de un electrodo, así como también, formación de un perímetro discontinuo o continuo alrededor de cada composición de reactivo se describen en la publicación de la Patente de Estados Unidos Número 2012/0150005 y en la solicitud de Patente de Estados Unidos en trámite Número 62/067.813.
[0037] La composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa se puede depositar sobre la superficie del electrodo de trabajo como una aplicación larga, que cubre la parte deseada del electrodo de trabajo o en forma de una matriz de una pluralidad de composiciones estabilizadas de lactato oxidasa/catalasa, por ejemplo, separadas una de la otra. Dependiendo del uso, cualquiera o todas las composiciones enzimáticas en la matriz pueden ser las mismas o diferentes una de la otra. Por ejemplo, una matriz puede incluir dos o más, 5 o más, 10 o más, 25 o más, 50 o más, 100 o más características de matriz de composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa, o incluso 1000 o más, en una área de 100 mm2 o menos, tal como 75 mm2 o menos, o 50 mm2 o menos, por ejemplo, 25 mm2 o menos, o 10 mm2 o menos, o 5 mm2 o menos, tal como, 2 mm2 o menos, o 1 mm2 o menos, 0,5 mm2 o menos, o 0,1 mm2 o menos.
[0038] La forma de la composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa depositada puede variar dentro o entre los sensores. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, la membrana depositada es circular. En otras realizaciones, la forma será un triangulo, cuadrado, círculo, elipse u otra forma poligonal regular o irregular (por ejemplo, cuando se observa desde arriba), así como también otras formas bidimensionales, tal como, un círculo, semicírculo o forma de medialuna. Se puede cubrir todo o una parte del electrodo mediante la composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa, tal como, 5 % o más, tal como, 25 % o más, tal como, 50 % o más, tal como, 75 % o más e incluyendo 90 % o más. En determinados ejemplos, la superficie entera de electrodo se cubre con la composición enzimática (es decir, 100%).
[0039] La fabricación de un electrodo y/o un sensor según las realizaciones de la presente divulgación produce una composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa reproducible depositada sobre la superficie del electrodo. Por ejemplo, las composiciones enzimáticas proporcionadas en el presente documento pueden variar la una de la otra en 5 % o menos, tal como, en 4 % o menos, tal como, en 3 % o menos, tal como, en 2 % o menos, tal como en 1 % o menos e incluyendo en 0,5 % o menos. En determinadas realizaciones, la composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa depositada no muestra ninguna diferencia una de la otra y son idénticas.
[0040] En determinadas realizaciones, los procedimientos incluyen, además, secar la composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa depositada sobre el electrodo. El secado se puede llevar a cabo a temperatura ambiente, a temperatura elevada, según se desee, tal como a una temperatura que oscila entre 25 °C y 100 °C, tal como, entre 30 °C y 80 °C e incluyendo entre 40 °C y 60 °C.
[0041] Los ejemplos de configuraciones para los sensores de lactato en cuestión y los procedimientos para fabricarlos pueden incluir, pero no se limitan a, aquellos descritos en las Patentes de Estados Unidos Números 6.175.752, 6.134.461, 6.579.690, 6.605.200, 6.605.201, 6.654.625, 6.746.582, 6.932.894, 7.090.756, 5.356.786, 6.560.471, 5.262.035, 6.881.551, 6.121.009, 6.071.391, 6.377.894, 6.600.997, 6.514.460, 5.820.551, 6.736.957, 6.503.381, 6.676.816, 6.514.718, 5.593.852, 6.284.478, 7.299.082, 7.811.231, 7.822.557, 8.106.780 y 8.435.682; las Publicaciones de Solicitud de Patente Números 2010/0198034, 2010/0324392, 2010/0326842, 2007/0095661, 2010/0213057, 2011/0120865, 2011/0124994, 2011/0124993, 2010/0213057, 2011/0213225, 2011/0126188, 2011/0256024, 2011/0257495, 2012/0157801, 2012/0245447,2012/0157801,2012/0323098 y 20130116524.
[0042] En algunas realizaciones, los sensores in vivo pueden incluir una punta de inserción colocada por debajo de la superficie de la piel, por ejemplo, penetrando a través de la piel y dentro, por ejemplo, del espacio subcutáneo, entrando en contacto con el fluido biológico del usuario, tal como fluido intersticial. Las partes de contacto del electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contraelectrodo se colocan sobre la primera parte del sensor situada por encima de la superficie de la piel. Un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un contraelectrodo se colocan en la parte insertada del sensor. Se pueden producir señales desde los electrodos en la punta hasta un contacto configurado para la conexión con la electrónica de los sensores.
[0043] En determinadas realizaciones, el electrodo de trabajo y el contraelectrodo del sensor, así como también, el material del mismo están en capas. Por ejemplo, el sensor puede incluir una capa de material no conductor y una primera capa conductora, tal como, polímero conductor, carbono, platino-carbono, oro, etc., dispuestos sobre al menos una sección de la capa de material no conductor. La composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa se coloca sobre una o más superficies del electrodo de trabajo, o puede, de otro modo, entrar en contacto directamente o indirectamente con el electrodo de trabajo. Se puede disponer o poner en capas una primera capa de aislamiento, tal como, una primera capa dieléctrica sobre al menos una parte de una primera capa conductora y se puede colocar o apilar una segunda capa conductora encima de al menos una parte de una primera capa de aislamiento (o capa dieléctrica). La segunda capa conductora puede ser un electrodo de referencia. Se puede colocar o poner en capas una segunda capa de aislamiento, tal como una segunda capa dieléctrica, sobre al menos una parte de la segunda capa conductora. Además, se puede colocar una tercera capa conductora sobre al menos una parte de la segunda capa de aislamiento y puede ser un contraelectrodo. Finalmente, se puede colocar o poner en capas una tercera capa de aislamiento sobre al menos una parte de la tercera capa conductora. De este modo, se puede poner en capas el sensor de tal modo que al menos una parte de cada una de las capas conductoras esté separada por una capa respectiva de aislamiento (por ejemplo, una capa dieléctrica).
[0044] En otras realizaciones, se pueden proporcionar algunos o todos los electrodos de una manera coplanaria, de tal modo, que dos o más electrodos se pueden colocar sobre el mismo plano (por ejemplo, uno al lado del otro (por ejemplo, en paralelo) o en ángulo en relación uno con el otro) sobre el material. Por ejemplo, los electrodos coplanarios pueden incluir un espacio adecuado entre los mismos y/o incluir un material dieléctrico o un material de aislamiento colocado entre capas/electrodos conductores. Además, en determinadas realizaciones, se pueden colocar uno o más de los electrodos en caras contrarias del material no conductor. En tales realizaciones, el contacto eléctrico puede estar en la misma o diferente cara del material no conductor. Por ejemplo, un electrodo puede estar en una primera cara y su contacto respectivo puede estar en una segunda cara, por ejemplo, una señal que conecta el electrodo y el contacto puede atravesar el material. Una vía proporciona una ruta a través de la cual una señal eléctrica se lleva hasta una cara opuesta de un sensor.
[0045] Los sensores de lactato in vivo en cuestión se pueden configurar para la monitorización del nivel del lactato durante un periodo de tiempo que puede variar desde segundos, minutos, horas, días, semanas hasta meses o más.
Las membranas adecuadas independientes de temperatura pueden incluir, pero no se limitan a, aquellas descritas en la Publicación de Patente de Estados Unidos Número 2012/0296186 y la Solicitud en tramitación de la Patente de Estados Unidos Número 62/067.813.
[0046] Los sensores de lactato in vivo según las determinadas realizaciones se pueden configurar para operar en concentraciones de oxígeno bajo. Por la concentración de oxígeno bajo se entiende que la concentración de oxígeno es de 1,5 mg/L o menos, tal como, 1,0 mg/L o menos, tal como, 0,75 mg/L o menos, tal como, 0,6 mg/L o menos, tal como, 0,3 mg/L o menos, tal como, 0,25 mg/L o menos, tal como, 0,15 mg/L o menos, tal como, 0,1 mg/L o menos e incluyendo 0,05 mg/L o menos.
[0047] Los aspectos de la presente divulgación incluyen, también, procedimientos de monitorización in vivo de niveles de lactato con el tiempo con lactato oxidasa estabilizada. Generalmente, la monitorización de la concentración de lactato en un fluido del cuerpo de un sujeto incluye insertar al menos parcialmente bajo la superficie de la piel un sensor de lactato in vivo de lactato oxidasa/catalasa, tal como se da a conocer en el presente documento, poner en contacto el fluido monitorizado (intersticial, sangre, dérmico y similares) con el sensor de lactato oxidasa/catalasa insertado y generar una señal de sensor en el electrodo de trabajo. La presencia y/o la concentración de lactato detectada mediante el sensor de lactato se puede exponer, almacenar, remitir y/o procesar de otro modo.
[0048] Se puede utilizar una variedad de procedimientos para determinar la concentración de lactato con los sensores en cuestión.
[0049] En determinados aspectos, se utiliza un procedimiento de monitorización electroquímica de concentración de lactato. Por ejemplo, la monitorización de la concentración de lactato utilizando la señal del sensor se puede realizar mediante técnicas de detección coulométrica, amperométrica, voltamétrica, potenciométrica o cualquier otra técncai de detección electroquímica conveniente.
[0050] En determinadas realizaciones, el procedimiento incluye, además, adherir una unidad electrónica a la piel del paciente, acoplar contactos conductores de la unidad electrónica con contactos del sensor de lactato, recopilar datos utilizando la unidad electrónica con respecto a un nivel de lactato a partir de las señales generadas por el sensor y remitir los datos recopilados de la unidad electrónica a una unidad receptora, por ejemplo, utilizando RF. La unidad receptora puede ser un teléfono móvil. El teléfono móvil puede incluir una aplicación de lactato. En determinadas realizaciones, la información del lactato se remite utilizando protocolo RFID, Bluetooth y similares.
[0051] El sensor de lactato se puede colocar en un usuario para detección automática de lactato, tanto continuamente como periódicamente. Las realizaciones pueden incluir la monitorización del nivel del lactato durante un periodo de tiempo que puede variar desde segundos, minutos, horas, días, semanas hasta meses o más. Se pueden predecir los futuros niveles de lactato basándose en la información obtenida, por ejemplo, el nivel actual de lactato a tiempo cero, así como también, la tasa de cambio de lactato.
[0052] La unidad electrónica del sensor puede remitir automáticamente los datos desde el sensor de lactato/ unidad electrónica a una o más unidades receptoras. Los datos del sensor se pueden comunicar automáticamente y periódicamente, tal como, con una frecuencia determinada cuando se obtienen los datos o después de un periodo de tiempo determinado de almacenamiento de datos del sensor en la memoria. Por ejemplo, la electrónica del sensor acoplada a un sensor colocado in vivo puede recopilar los datos del sensor durante un periodo de tiempo predeterminado y transmitir los datos recopilados periódicamente (por ejemplo, cada minuto, cinco minutos u otro tiempo predeterminado) a un aparato de monitorización, que se coloca al alcance de la electrónica del sensor.
[0053] En otras realizaciones, la electrónica del sensor acoplado al sensor colocado in vivo puede comunicarse con el aparato receptor de una manera no automática y no fijarse con ningún horario específico. Por ejemplo, se pueden transmitir los datos del sensor desde la electrónica del sensor al equipo receptor utilizando tecnología RFID y transmitir cada vez que la electrónica del sensor está dentro del rango de comunicación del dispositivo de monitorización de lactato. Por ejemplo, el sensor colocado in vivo puede recopilar datos del sensor en la memoria hasta que el dispositivo de monitorización (por ejemplo, unidad receptora) este dentro del rango de comunicación de la unidad de electrónica del sensor, por ejemplo, por el paciente o el usuario. Cuando se detecta el sensor colocado in vivo por el dispositivo de monitorización, el dispositivo establece comunicación con la electrónica del sensor de lactato y cargan datos del sensor, que se recogieron desde el momento de la última transmisión de los datos del sensor, por ejemplo. De este modo, el paciente no tiene que mantener proximidad cercana con el dispositivo receptor en todo momento, y en cambio, puede cargar datos del sensor cuando se desee colocando el dispositivo receptor al alcance del sensor de lactato. En otras realizaciones adicionales, se puede implementar una combinación de transferencias automáticas y no automáticas de los datos del sensor en determinadas realizaciones. Por ejemplo, las transferencias de los datos del sensor se pueden iniciar cuando se esté en el rango de comunicación y, a continuación, de manera automática, si se permanece en el rango de comunicación.
[0054] Los aspectos de la presente divulgación incluyen procedimientos de fabricación de un electrodo que tiene una composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa para su uso en un sensor de lactato. Las realizaciones incluyen la formación de un electrodo y el posicionamiento de la composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa próxima al electrodo. Algunas realizaciones incluyen aplicar una capa conductora sobre la superficie de un material no conductor, eliminar una parte de la capa conductora para definir un electrodo sobre la superficie del material, eliminar al menos una parte en la capa conductora dentro de los límites del electrodo para formar un área sobre el electrodo que tiene un perímetro incompleto, y depositar la composición estabilizada de lactato oxidasa/catalasa dentro de los límites de la composición enzimática del electrodo.
EXPERIMENTAL
[0055] Se proponen los siguientes ejemplos para proporcionar a aquellos expertos en la técnica una divulgación y descripción completa de cómo preparar y utilizar las realizaciones de la invención, y no se intenta limitar ni el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni se intenta mostrar que los experimentos a continuación son todos y los únicos experimentos que se realizan. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud en lo que se refiere a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.), pero se deberían tener en cuenta errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, partes son partes en peso, peso molecular es peso molecular promedio en peso, la temperatura está en grados centígrados y la presión es o cercana a la atmosférica.
EJEMPLO 1
[0056] Los experimentos se llevaron a cabo para demostrar el funcionamiento de los sensores de lactato oxidasa en presencia y ausencia de catalasa. Los sensores de lactato se prepararon depositándolos sobre la superficie de un electrodo con una composición de reactivo que contiene lactato oxidasa, y un polímero unido con catalizador de metal de transición de osmio y un reticulante difuncional, tal como se muestra en el esquema a continuación:
[0057] Los sensores de lactato se pusieron a prueba en un tampón de fosfato que contenía 5 mM de lactato a 33 °C
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con oxígeno al 1%. La temperatura se controló utilizando un sistema circulatorio de agua con un controlador de temperatura digital.
[0058] La Figura 1 muestra la estabilidad de salida de señal del sensor a lo largo de 60 horas continuas para tres sensores de lactato diferentes, que incluyen composiciones enzimáticas, que contienen lactato oxidasa, un polímero unido con un complejo de metal de transición y un reticulante. Tal como se muestra en la Figura 1, los sensores de lactato empezaron a mostrar una caída en la salida del sensor después de 3 horas de uso y mostraron una disminución significativa y continua en la salida de señal hasta alcanzar 60 horas, es decir, son inestables. Los sensores de lactato mostraron una disminución de más de 70% de la salida de señal en el transcurso de las 60 horas cuando los sensores de lactato estaban en contacto con lactato.
EJEMPLO 2
[0059] Los experimentos se llevaron a cabo para comparar el funcionamiento de sensores de lactato con y sin catalasa con la composición de lactato oxidasa. Se prepararon los sensores que carecen de agente estabilizante como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Los sensores con composiciones enzimáticas que incluyen catalasa se prepararon depositando sobre la superficie de un electrodo una composición de reactivo que contiene lactato oxidasa, el agente estabilizante catalasa y un polímero unido a catalizador de metal de transición de osmio y un reticulante bifuncional, tal como se muestra en el esquema a continuación:
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[0060] Cada sensor de lactato se analizó en un tampón de fosfato que contenía lactato a 33 °C con oxígeno al 1 %. La temperatura se controló utilizando un sistema circulatorio de agua con un controlador de temperatura digital.
[0061] La Figura 2 muestra la salida de señal de cada sensor durante los estudios de calibración, que ilustran la respuesta del sensor a cambios graduales en la concentración de lactato de 1 mM a 5 mM. Los sensores de lactato que carecen de catalasa mostraron una respuesta a señal más pequeña a cada incremento en la concentración de lactato y una salida de señal más baja general en el transcurso del tiempo que los sensores que contienen catalasa. Los sensores que contienen catalasa como una parte de la composición enzimática mostraron grandes cambios en la respuesta a la señal a cada aumento en la concentración de lactato y una salida de señal más alta en general en el transcurso del tiempo en comparación con los sensores de lactato con ausencia de catalasa.
[0062] La Figura 3 muestra la linealidad de salida de señal del sensor como una función de concentración de lactato. Los sensores de lactato que carecen de catalasa mostraron una pendiente más baja, demostrando una sensibilidad más baja de estos sensores de lactato que la de los sensores que incluían las composiciones de lactato oxidasa/catalasa. Los sensores de lactato que contienen catalasa como una parte de la composición enzimática mostraron una pendiente casi tres veces más grande que los sensores de lactato que carecen de catalasa.
[0063] La Figura 4 muestra la estabilidad de salida de señal del sensor a lo largo de 60 horas continuas para tres sensores de lactato que carecían de catalasa y tres sensores de lactato que tenían catalasa como una parte de la composición enzimática. Tal como se muestra en la Figura 4, los sensores de lactato que carecían de catalasa empezaron a mostrar una caída en la salida del sensor 3 horas después del uso y mostraron una disminución significativa y continua en la salida de señal hasta alcanzar 60 horas. Los sensores de lactato que carecían de lactato mostraron una disminución de más de 70% de la salida de señal en el transcurso de las 60 horas cuando los sensores de lactato estaban en contacto con lactato. Por el contrario, los sensores de lactato que tenían catalasa como una parte de la composición enzimática de lactato oxidasa mostraron una disminución significativamente más baja en la salida de señal (8%) en el transcurso de las 60 horas de prueba.
[0064] Un resumen de la comparación entre los sensores de lactato con deficiencia de catalasa y los sensores de lactato que contienen catalasa como parte de la composición enzimática se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 1
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Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Sensor de lactato que comprende una composición enzimática que comprende:
una enzima sensible a lactato; y
un agente estabilizante que estabiliza la enzima sensible a lactato de manera suficiente para: proporcionar una señal de sensor que se cambia en 10 % o menos durante 60 horas continuas o más, y aumentar la sensibilidad del sensor al lactato;
en el que el agente estabilizante es catalasa y la enzima sensible a lactato es lactato oxidasa.
2. Sensor de lactato, según la reivindicación 1, en el que el agente estabilizante estabiliza la enzima sensible al lactato de una manera suficiente para proporcionar una señal del sensor que cambia en 10 % o menos durante 168 horas continuas o más, opcionalmente, que cambia en 5 % o menos durante 168 horas continuas o más.
3. Sensor de lactato, según la reivindicación 1 o 2, en el que el agente estabilizante aumenta la sensibilidad del sensor, preferiblemente, al lactato en 10 % o más en comparación con un sensor de lactato, que no incluye el agente estabilizante.
4. Sensor de lactato, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente estabilizante mantiene la sensibilidad aumentada del sensor al lactato durante 60 horas continuas o más.
5. Sensor de lactato, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la composición enzimática comprende un polímero que contiene un heterociclo, y un reticulante.
6. Sensor de lactato, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el sensor de lactato comprende un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, opcionalmente, en el que la composición enzimática se coloca próxima a un electrodo de trabajo, opcionalmente, en el que la composición enzimática se fija al electrodo de trabajo.
7. Composición enzimática, que comprende:
una enzima sensible a lactato; y
un agente estabilizante que estabiliza la enzima sensible a lactato de manera suficiente para proporcionar una señal del sensor que cambia en un 10 % o menos durante 60 horas continuas o más; y
un polímero que comprende un componente, que contiene heterociclo, y un reticulante,
en la que el agente estabilizante es catalasa y la enzima sensible a lactato es lactato oxidasa.
8. Composición enzimática, según la reivindicación 7, en la que el agente estabilizante reduce cambios en la actividad catalítica de la enzima sensible a lactato durante 60 horas continuas o más, opcionalmente, en la que el agente estabilizante evita cambios en la actividad catalítica de la enzima sensible a lactato durante 60 horas continuas o más.
9. Sensor de lactato o la composición enzimática, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima sensible a lactato y el agente estabilizante están reticulados dentro del polímero.
10. Sensor de lactato o la composición enzimática, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la enzima sensible a lactato y el agente estabilizante están unidos de manera covalente con el polímero.
11. Sensor de lactato o la composición enzimática, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un agente de transferencia de electrones.
12. Sensor de lactato o la composición enzimática, según la reivindicación 11, en el que el agente de transferencia de electrones es un complejo que contiene osmio, opcionalmente, en el que el agente de transferencia de electrones está unidos de manera covalente con el polímero.
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