CN104487565A - 一种通过非流失共价结合将酶结合于电极的无介体电化学葡萄糖检测过程及其产品 - Google Patents
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Abstract
本发明总体涉及通过在胺功能化电极上共价结合葡萄糖氧化酶以开发葡萄糖氧化酶结合电极的仪器和方法。更具体的,本发明涉及用于连续葡萄糖监测的无渗漏以及高稳定的共价结合酶包被电极。所述葡萄糖氧化酶结合电极用于开发不受生物物质和药物影响的非介体电化学葡萄糖传感程序。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年月3日提交的序列号No.61/641,886,名称为“一种通过非流失共价结合将酶结合于电极的无介体电化学葡萄糖检测过程及其产品”的美国临时专利申请的优先权并且是该申请的一个非临时转换,通过整体引用的方式将其并入本申请。
技术领域
本文总体涉及通过利用在胺功能化电极(amine-functionalizedelectrodes)上共价结合葡萄糖氧化酶以开发葡萄糖氧化酶结合电极的仪器和方法。更具体的,共价结合酶包被电极(covalently-bound enzyme-coatedelectrodes)被用于开发没有生物物质和药物干扰的无介体(mediator-less)电化学葡萄糖检测程序。
本文也涉及开发一种制造用于葡萄糖的无介体电化学检测的稳定的和非渗漏(leach-proof)的葡萄糖氧化酶结合电极的高度简化的过程。所述开发的技术可以应用于高稳定性连续葡萄糖监测(CGM)系统,葡萄糖计或用于糖尿病检测的封闭系统。在一种实施方式中,所述开发的葡萄糖检测方案采用所设计的酶结合电极可以应用于或者部分来自于一个连续葡萄糖监测系统(CGMS)。
本文进一步涉及开发一种以双酶为基础的无介体电化学(EC)葡萄糖检测技术以及检测过程。所开发的葡萄糖检测技术具有宽的动态幅度以及增加的灵敏性。所开发的葡萄糖检测技术可以用于血液葡萄糖监测仪器(BGMD's),即一个连续葡萄糖检测系统(CGMS),葡萄糖计或封闭系统。两种酶的使用,即葡萄糖氧化酶(GOx)以及辣根过氧化物酶(HRP),消除了葡萄糖测定的氧限制,从而增加了葡萄糖检测的动态幅度。
背景技术
糖尿病已经全球流行并且是所有国家的主要关切。每年用于处理糖尿病的花费占全球健康护理支出总额的11.2%,是无法承受的经济负担。该疾病正以令人担忧的速度增长。糖尿病患者血糖的监测因而是最主要的诊断测试,具有每年超过167亿次测试以及年61亿美元的市场(http://www.researchandmarkets.com/reports/338842)。市场目前主要由例如Abbott、Bayer、Roch、LifeScan、Dexcom和Minimed这样的大公司服务。一名糖尿病人不得不每天以频繁的周期监测其葡萄糖水平以将葡萄糖水平控制在生理范围内从而避免糖尿病综合症。血糖监测结果有大量问题,本发明的发明人打算进行阐述。首先是测量软片有限的耐久性,基本上购买后只是用一次。其次,如已经在某些商品化产品中观察到的,在葡萄糖测量中测量系统中特异性电子介体可以引起潜在的致命错误。随之而来是在2009年FDA的公共健康通知后厂商迅速召回这些商品化产(http://www.fda.gov/MedicalDevices/Safety/AlertsandNotices/PublicHealthNotifications/ucm 176992.htm)
然而,介体仍然被使用于葡萄糖计中,并且一些报道证实了来自于生理物质和用药的干扰(Diabetic Medicine,DOI:10.1111/j.1464-5491.2011.03362.x;Am.J.Clin.Pathol.113,75-86,2000;more ref.s)。相似的,使用阳性外加电压例如0.4V与参比电极相对在许多葡萄糖计中可以引起相似的葡萄糖估算的错误,这是由于许多生理物质和药物有300至700mV的氧化还原电位。
已经有多种技术被应用于葡萄糖的检测,包括电化学技术,电化学技术已经被几乎所有公司使用从而制造BFMD。然而许多其他葡萄糖检测概念,例如那些以非侵入性葡萄糖监测为基础的葡萄糖检测概念(Diab.Res.Clin.Prac.77,16-40,2007)已经被指出。美国Cygnus的GlucoWatchBiographer是已经被FDA批准的系统,该系统基于反向电离子透入法(reverse iontophoresis)经皮肤提取间质液,由于其准确性差、虚报、皮肤刺激、出汗、和长加热时间而被市场放弃因此被迅速被淘汰。相似的,来自BICO公司的Diasensor以及来自Pendragon医疗有限公司的Pendra也由于市场对它们的准确性的强烈担忧而被淘汰。尽管进行了显著的研究努力,仍然没有可使用的可靠的非侵入性的BGMD。
葡萄糖的非酶检测也已经被证明,许多成果只用纳米材料,这包括被多次引用的Pi团队的结果(Electrochemistry Communications 6,66-70,2004;Electroanalysis 17,89-96,2005;Nano techno logy 17,2334-2339,2006;Analytica Chimica Acta 594,175-183,2007),然而该方法也因为检测血清中葡萄糖浓度的整体病理范围的选择性、可信度以及生物分析过程的再现性而失败。
概要
根据本申请的一个方面包括电化学(EC)葡萄糖生物传感器,所述电化学生物传感器是无介体的并且应用负电位对应基准电极(referenceelectrode),这使得该仪器在葡萄糖检测中不受生理干扰、传感、测量、和/或读取,并且考虑到了患者服用的药物。更具体的,利用诸如石墨烯或多壁碳纳米管(MWCNTs)的第二底物可以避免使用介体,这是由于石墨烯和MWCNTs具有优异的导电性并且可以作为电线在酶的还原中心、葡萄糖氧化酶和电极表面之间促进直接的电子传递。由于其大的表面积例如石墨烯的第二底物或电极上的其他第二底物提供电化学信号,这提高了葡萄糖检测的敏感性。
根据本发明的相关方面,公开了一个用于制备共价偶联非渗漏葡萄糖氧化酶包被的电极的生物分析程序以及一个使用-450mV外加电势的,用于连续葡萄糖监测的非介体电化学葡萄糖传感方案。更具体的,所开发的技术能够在人的病理-生理性音域(patho-physiological range)即0.5-32mM检测葡萄糖,而没有任何暴露的电极或来自生理底物/药物的生物污垢(biofouling)。当连续的将一个相同的电极用于检测一个特定葡萄糖浓度至少4周后,没有显著的葡萄糖监测信号的减少。因此,所设计的方案可以用于开发一个连续葡萄糖检测系统(CGMS)。
根据本发明的一个更进一步的方面,本文所述的所开发的技术克服了我们在新的综合评述中提出的的现有技术的问题,即“Technology behindcommercial devices for blood glucose monitoring in diabetic management:Areview"in Analytica Chimica Acta(2011),volume 703,pp.124-136,将其通过整体引用的方式并入本文。
根据本发明的另一个方面,所述开发的技术不仅仅用于开发CGMS仪器,也应用了一个用于其它被分析物的电化学检测的制备共价偶联酶包被电极的标准方案。因此,所述开发的技术可以用于发展以酶为基础的电化学传感器。
所开发的无介体电化学葡萄糖传感技术具有用于发展CGMS的广阔的潜力,基于其更宽的动态范围,使用负外加点位以及缺少来自于生理干扰物的潜在干扰。多所开发的方案的多种变形已经被用于设计许多用于葡萄糖检测的方案。此外,如前所述的,所开发的方案实现了可以用于制备检测其他分析物的共价结合酶包被电极的标准方案。
再者,或者作为前述的实施方式的替代,本发明的实施方式可以为修改的方案,使用多种纳米材料作为第二底物,例如石墨烯纳米板(GNPs),多壁碳纳米管(MWCNTs)以及聚左旋赖氨酸(PLL)。该方案可以在多种不同形式的纳米材料中应用。因此,可以制造多种纳米复合物并用于电化学血糖传感。
本发明开发了一种高度简化的程序,该程序使得能够制备高度稳定和非渗漏(leach proof)葡萄糖氧化酶结合电极。所开发的酶结合电极具有宽的0.5-48mM的动态范围,当在环境条件下室温储存约四周后没有任何葡萄糖传感信号的降低。即使在血液样品中保存5天后也没有发现生物污垢。此外,所述应用于使用所开发的酶结合电极进行葡萄糖检测的电化学方案是非介体的并且使用-450mV作为外加电势(applied potential),因此,没有生理性物质的干扰,而这正是开发商业化血糖计的关键点。所开发的用于制备酶结合电极的程序以及开发的电化学葡萄糖传感方案的目的是开发一种CGMS、葡萄糖计或用于糖尿病监测的封闭系统,它们可以容易的转换或转换为在工业和临床设备中实践。所开发的简化的程序使用例如丝网印刷的技术适合于酶结合电极的商业化大规模生产。
另外也开发了一种基于双酶的非介体EC葡萄糖传感程序,其具有用于葡萄糖检测的宽的动态范围和增加的灵敏度。使用具有GOx的HRP消除了EC葡萄糖传感中的氧限制,由于其减少了过氧化氢,通过将葡萄糖转化为葡萄糖内酯,产生水和氧气。然而,在通过所开发的技术制备的酶包被电极中,减少的过氧化氢将显著的增强对生物污垢的抵抗。在没有介体以及使用负外加电势(-450mV)相对于Ag/AgCl基准电极使得开发的葡萄糖传感程序更不易于受生理物质和药物的影响。所开发的多种方案使用基于双酶非介体EC葡萄糖传感程序具有宽的动态范围并且覆盖糖尿病临床相关病理-生理范围,例如0.5-28mM葡萄糖。因此,所开发的双酶技术具有开发CGMS、葡萄糖计或用于葡萄糖检测的封闭系统的巨大的潜力。所开发的生物分析程序简单并且可以容易的转换或转换为使用例如丝网印刷的简单技术商业化大规模生产酶结合电极。
本发明的第一个方面提供了一种用于在检测环境中检测被分析物的非介体生物传感器,所述非介体生物传感器包括:
共价结合了功能化试剂的具有电传导化学修饰表面的基底;以及
通过共价结合于所述功能化试剂中的一种而与所述表面固定连接的第一酶,一个化学结合于功能化试剂的多聚体,以及一个化学结合于所述功能化试剂的纳米工程化材料。
其中,非介体生物传感器配制为用于在分析物和第一酶之间指导电子转移(direct electron transfer)以适于对关联于检测环境的表面施加一个负电势。
在具体实施方式中,在接近20天的周期中,上述的非介体生物传感器保持基本稳定的分析物检测能力。
在具体实施方式中,电传导化学修饰表面负载与功能化试剂共价结合的羟基。
在具体实施方式中,所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷(organofunctional alkoxysilane)化合物。在具体实施方式中,所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约4%(体积)的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在具体实施方式中,所述功能化的试剂中含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,通过将表面暴露于存在浓度低于约2%(体积)的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在具体实施方式中,所述功能化的试剂中含有有机官能烷氧基硅烷化合物,通过将表面暴露于存在浓度低于约1%(体积)的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
在具体实施方式中,所述多聚体包括胺功能化多聚体。在具体实施方式中,所述多聚体包括氨基酸多聚体(例如,聚左旋赖氨酸)和基于葡萄糖胺的多聚体中的一种(如壳聚糖)。
在具体实施方式中,纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳纳米管和纳米晶纤维素(nanocrystalline cellulose)中的至少一种。
在具体实施方式中,所述非介体生物传感器进一步包括选择性扩散膜,其在检测环境下限制第一酶在物质中的暴露。
在具体实施方式中,所述基底负载有金属(例如,铂、金)以及以碳为基础的材料。在具体实施方式中,所述基底包括玻璃化碳电极。
在具体实施方式中,除包括生物物种(biological species)和药物代谢产物的被分析物以外,第一生物分子和第一酶中的一个与被分析物之间的直接电子转移基本上没有被分子物质(molecular substances)影响。
在具体实施方式中,第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。在具体实施方式中,所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
在具体实施方式中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整个糖尿病病理浓度范围的葡萄糖。在具体实施方式中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约0.5-32mM的范围的葡萄糖。
在具体实施方式中,第一酶通过以下方式共价结合于所述表面,将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于第一酶。
在具体实施方式中,通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试剂的混合物的液体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
在具体实施方式中,通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂的悬浮液的方式将所述多聚体共价结合于所述表面。
在具体实施方式中,多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于多聚体的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质中。
在具体实施方式中,纳米工程化材料通过以下共价结合于所述表面,将表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于携带有纳米工程化材料的极化分散剂。
在具体实施方式中,通过将表面暴露于含有纳米工程化材料和功能化试剂的悬浮液的方式将纳米工程化材料共价结合于所述表面。
在具体实施方式中,纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化材料和第一酶的液体介质中。
在具体实施方式中,所述非介体生物传感器进一步包括一个第二酶,通过与功能化试剂、多聚体和纳米工程化材料中的一种共价结合的方式固定于所述表面。
在具体实施方式中,第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的副产物。在具体实施方式中,所述第二酶包括辣根过氧化物酶。在具体实施方式中,所述第二酶增加动态分析物检测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
在具体实施方式中,第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传感器能够在约0.5-48mM的浓度范围检测葡萄糖。
在具体实施方式中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
在具体实施方式中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、多聚体、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于多聚体。
在具体实施方式中,第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、纳米工程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
本发明的第二个方面提供了一种制造非介体生物传感器的方法,所述非介体生物传感器被配置用于在检测环境下检测被分析物,所述方法包括:
提供一个具有电传导化学修饰表面的基底;将功能化试剂结合于表面;以及
实施一个固定过程,所述固定过程包括以下过程中的一种:
(a)将第一酶共价结合于功能化试剂;
(b)将多聚体共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于多聚体;以及
(c)将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于纳米工程化材料,
其中所述非介体生物传感器被配置为检测响应负电势在相对于所述检测环境的表面的应用的被分析物与第一酶之间的直接电子转移。
在具体实施方式中,提供具有电传导化学修饰表面的基底包括:
提供一个具有电传导表面的基底;以及
将表面暴露于表面修饰试剂从而所述使得表面携带有羟基。
在具体实施方式中,功能化试剂包括有机官能烷氧基硅烷化合物。在具体实施方式中,功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约4%(体积)的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在具体实施方式中,所述功能化的试剂中含有有机官能烷氧基硅烷化合物,通过将表面暴露于存在浓度低于约2%(体积)的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。在具体实施方式中,所述功能化的试剂中含有有机官能烷氧基硅烷化合物,通过将表面暴露于存在浓度低于约1%(体积)的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
在具体实施方式中,所述多聚体包括胺功能化多聚体。在具体实施方式中,所述多聚体包括氨基酸多聚体、和以葡萄糖胺为基础的多聚体中的一种。
在具体实施方式中,纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳纳米管和纳米晶纤维素中的至少一种。
在具体实施方式中,制造用于在上述检测环境中检测一种被分析物的非介体生物传感器的方法进一步包括一个选择性扩散膜,所述选择性扩散膜在检测环境下限制第一酶在物质中的暴露。
在具体实施方式中,所述基底携带金属和以碳为基础的材料中的一种,在具体实施方式中,所述基底含有一个玻璃质碳电极(glassy caronelectrode)。
在具体实施方式中,除含有生物物种(biological species)和药物代谢产物的被分析物以外,被分析物和第一酶之间的直接电子转移基本上没有被分子物质影响。
在具体实施方式中,第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。在具体实施方式中,所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
在具体实施方式中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整个糖尿病病理浓度范围的葡萄糖。
在具体实施方式中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约0.5-32mM的范围的葡萄糖。
在具体实施方式中,第一酶通过以下方式共价结合于所述表面,将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于第一酶。
在具体实施方式中,通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试剂的混合物的液体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
在具体实施方式中,通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂的悬浮液的方式将所述多聚体共价结合于所述表面。
在具体实施方式中,多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于多聚体的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质中。
在具体实施方式中,纳米工程化材料通过以下共价结合于所述表面,将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于携带有纳米工程化材料的极化分散剂。
在具体实施方式中,通过将所述表面暴露于含有纳米工程化材料和功能化试剂的悬浮液的方式将纳米工程化表面共价结合于所述表面。
在具体实施方式中,纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化材料和第一酶的液体介质中。
在具体实施方式中,所述固定过程涉及第一酶以及不同于第一酶的第二酶,并且其中所述固定过程包括以下过程中的一种:
(a)将第一酶和第二酶共价结合于功能化试剂;
(b)将多聚体共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于多聚体;以及
(c)将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于纳米工程化材料。
在具体实施方式中,第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的副产物。在具体实施方式中,所述第二酶包括辣根过氧化物酶。在具体实施方式中,所述第二酶增加动态分析物检测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
在具体实施方式中,第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传感器能够在约0.5-48mM的浓度范围检测葡萄糖。
在具体实施方式中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
在具体实施方式中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、多聚体、第一酶和第二酶的方式共价结合于多聚体。
在具体实施方式中,第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、纳米工程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
本发明的第三个方面提供了一种非介体酶包被电极,包括:
a.一个一级基底;以及
b.共价结合于所述一级基底的酶。
在具体实施方式中,所述非介体酶包被电极包括一个选择性扩散膜。
本发明的第四个方面提供了一种非介体酶包被电极,包括:
a.一个一级基底;
b.一个二级基底;以及
c.共价结合于所述一级基底和二级基底的酶。
本发明的第五个方面提供了制备非介体酶包被电极的方法,包括:
a.将酶至少共价结合于一个一级基底以形成一个非介体酶包被电极。
本发明的第六个方面提供了一种在没有介体的情况下在样品中检测被分析物的方法,包括:
a.将非介体酶包被电极暴露于含有被分析物的样品;
b.在所述非介体酶包被电极施加负电势;以及
c.在所述被分析物中检测被分析物。
本发明的第七个方面提供了一种稳定酶包被电极包括:
a.一个第一基底;
b.一个附着于所述基底的酶;以及
c.一个选择性扩散膜。
其中所述电极在至少20天内保持一个稳定被分析物传感信号。
在具体实施方式中,所述稳定酶包被电极进一步包括一个二级基底。
在具体实施方式中,所述电极具有约0.5mM至约48mM的动态范围。
本发明的第八个方面提供了一种减少电化学被分析物检测反应的副产物的方法,包括:
a.提供一种含有至少两种酶的非介体酶包被电极;
b.对所述非介体酶包被电极施加一个负电势;
c.将具有负外加电势的所述非介体酶包被电极暴露于一个含有被分析物的样品以引发一个电化学被分析物检测反应;以及
d.在样品中检测所述被分析物的水平,
其中,所述至少两种酶中的至少一种催化所述电化学被分析物检测反应的副产品的还原。
本发明的第九个方面提供了一种在不存在介体的条件下增加酶包被电极灵敏度的方法,包括:
a.提供一种含有至少两种酶的酶包被电极,其中所述至少两种酶中的至少一种包括过氧化氢酶;
b.对所述酶包被电极施加一个负电势;
c.将施加有负电势的酶包被电极暴露于含有被分析物的没有介体的样品中,以引发一个电化学被分析物检测反应;以及
d.在不存在介体的情况下,用所述过氧化氢酶对所述电化学被分析物检测反应的副产物催化还原反应,进而增加所述酶包被电极对所述被分析物的灵敏度。
附图说明
1)多步骤电化学葡萄糖传感
图1A:为所开发的用于发展共价结合酶包被电极的程序的原理示意图。路径1:基于被动吸附的方案,如1.1.3中所描述以及路径2:基于共价结合的方案,如1.1.2所述。
图1B:利用Nafion/GOx/APTES/GCEl的3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)集中于葡萄糖电化学检测的作用。
图1C:显示用于检测葡萄糖的电化学葡萄糖传感分析曲线。
图ID:显示用于检测Streck人工血糖标准的葡萄糖的电化学葡萄糖传感分析曲线。
图IE:干扰物对所开发的电化学葡萄糖传感方案的影响。
图IF:显示利用开发的共价结合酶包被电极对4niM葡萄糖的连续检测。
图1G:显示生物污垢对开发的共价结合酶包被电极在电化学葡萄糖传感中的影响。
图1H:显示开发的基于直接GOx的方案的生产再现性。
图2A:开发的用于电化学葡萄糖传感的基于石墨烯纳米板(GNPs)的方案的示意图。
图2B:显示APTES浓度对利用开发的基于GNPs的方案的葡萄糖电化学检测的影响。
图2C:利用Nafion/GOx-EDC活化的/GNPs-APTES/GCE以及Nafion/GOx/APTES/GCE.的葡萄糖电化学检测的分析曲线比较。
图2D:检测Streck人工血糖的葡萄糖传感曲线。
图2E:干扰物对开发的基于GNPs的方案的影响。
图2F:显示开发的基于GNPs的方案的生产再现性。
图2G:显示开发的基于GNPs葡萄糖传感在干燥环境室温(RT)下的稳定性。
图2H:用于检测GOx结合于所开发的已用于葡萄糖检测9周时间的葡萄糖传感的BCA蛋白分析,
图2I:显示通过将传感器浸泡于1mM Sugar-Chex血糖线性标准中7天的方式检测生物污垢的影响,期间每天检测三个重复的6.8mMSugar-Chex线性标准。
图3A:为所开发的基于聚左旋赖氨酸(PLL)的电化学葡萄糖传感方案的示意图。
图3B:显示利用Nafion/GOx-EDC活化的/PLL-APTES/GCE的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
图3C:显示利用Streck人工血糖的葡萄糖电化学检测。
图3D:显示干扰物对利用Nafion/GOx-EDC活化的/PLL-APTES/GCE的葡萄糖电化学检测的影响。
图3E:显示所开发的基于PLL的方案的生产可再现性。
图4A:为所开发的用于电化学葡萄糖传感的基于多壁碳纳米管(MWCNTs)的方案的示意图。
图4B:显示多种APTES浓度对MWCNT(分散于DMF)的影响。
图4C:显示多种APTES浓度对基于MWCNT(分散于APTES)的电化学葡萄糖生物传感形式的影响。
图4D:显示基于用于特定形式的优化的APTES浓度的各种形式的叠加图。
图4E:显示用于检测多个Streck血糖线性标准的基于MWCNT(分散于DMF)的电化学葡萄糖生物传感形式的应用。
图4F:显示生理干扰物和药物对葡萄糖检测准确性的影响。
图4G:显示为基于4mM葡萄糖检测的25uLGOx-功能化GCEs开发的产品再现性。
2)电化学葡萄糖传感
图5A:为所开发的高度简化的用于发展酶结合电极的程序的示意图。
图5B:显示利用所开发的酶结合电极的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
图5C:显示利用所开发的酶结合电极在Streck人工血糖标准中的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
图5D:显示干扰物对所开发的电化学葡萄糖传感的影响。
图5E:显示已开发的简化的用于制备GOx结合玻璃化碳电极(GCE)程序的可再现性,其通过利用25个新鲜制备的GOx结合GCEs电化学检测8mM葡萄糖的方式证明。
图5F:显示当在室温干燥条件下储存时,以电化学检测8mM葡萄糖的方式显示所开发的GOx结合GCE的稳定性。
图5G:显示当在室温50mM PBS,pH 7.4中储存时,以电化学检测8mM葡萄糖的方式显示所开发的GOx结合GCE的稳定性。
图5H:显示当在4℃干燥条件下储存时,以电化学检测8mM葡萄糖的方式显示所开发的GOx结合GCE的稳定性。
图5I:显示当在4℃,50mM PBS,pH 7.4条件下储存时,以电化学检测8mM葡萄糖的方式显示所开发的GOx结合GCE的稳定性。
图5J:显示生物污垢对所开发的电极的电化学葡萄糖传感的影响,通过将所开发的GOx结合电极储存于Streck's Sugar-Chex血糖线性标准中若干天的方式证明,没有在所开发的电极上发现生物污垢。
图5K:显示当将所开发的方案用于不同底物以确定其普遍的多底物相容性质时,一个基于BCA蛋白质测定的,GOx结合的总量的测定。
图6A:为经修改的所开发的简化的用于制备GOx结合电极的程序的示意图,利用石墨烯纳米板(GNPs)作为外加的中间基底或二级基底。
图6B:显示利用所开发的高度简化的制备程序的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
图6C:显示Streck血糖线性标准的分析曲线。
图6D:显示干扰物对所开发的利用高度简化的制备程序的电化学葡萄糖传感的影响。
图6E:显示所开发的简化的用于制备GOx结合GNPs包被GCE的程序的可再现性,利用25新鲜制备的GNPs-GOx-bound GCEs对8mM葡萄糖进行电化学检测。
图7A:为经修改的所开发的简化的用于制备GOx结合电极的程序的示意图,利用据左旋赖氨酸(PLL)作为外加的中间基底或二级基底。
图7B:为利用Nafion/PLL-GOx/GCE的葡萄糖电化学检测的分析曲线。
图7C:为利用Nafion/PLL-GOx/GCE对Streck人工血糖标准中的葡萄糖的电化学检测的分析曲线。
图7D:显示干扰物对所开发的基于PLL的葡萄糖传感的影响。
图8A:为经修改的所开发的简化的用于制备GOx结合电极的程序的示意图,利用多壁碳纳米管(MWCNTs)作为外加的中间基底或二级基底。
图8B:显示利用Nafion/APTES-MWCNTs-GOx/GCE的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
图8C:显示利用Nafion/APTES-MWCNTs-GOx/GCE对Streck人工血糖标准中的葡萄糖的电化学检测的分析曲线。
图8D:显示干扰物对所开发的基于MWCNTs的葡萄糖传感方案的影响。
3)一步电化学葡萄糖传感
图9A:为所开发的基于双酶的非介体EC传感程序示意图,其中GOx和HRP被结合于胺功能化的GCE,而后用Nafion包被。
图9B:显示利用所开发的方案的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
图9C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
图10A:为所开发的利用石墨烯纳米板(GNPs)的基于双酶的非介体EC传感程序的示意图。
图10B:显示利用所开发的方案的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
图10C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
图11A:为所开发的利用聚左旋葡萄糖(PLL)的基于双酶的非介体EC传感程序的示意图。
图11B:显示利用所开发的方案的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
图11C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
图12A:为所开发的利用多壁碳纳米管的基于双酶的非介体EC传感程序示意图。
图12B:利用所开发的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
图12C:显示干扰物对利用所开发的EC葡萄糖检测的影响。
图13A:为对所开发的利用壳聚糖的(CS)基于双酶的非介体EC传感程序示意图。
图13B:显示利用所开发的电化学葡萄糖检测的分析曲线。
图13C:显示利用干扰物对利用所开发的方案的EC葡萄糖传感的影响。
具体实施方式
在以下具体实施方式中,引用了相应附图,这形成一个部分。在附图中,类似的符号通常识别类似的组件,除非上下文另有所指。以下所描述的具体的实施方式、附图以及权力要求并非用于限制作用。在没有脱离本发明精神或本文所体现的主旨范围的前提下,可以利用其他变形、以及进行其他变化。
除非特别说明,否则本文中所使用的术语“包括”和“含有”以及其在语法上的变形意在表示“开放”或“包含的”语言因此它们包括已提及的元素以及允许包含其他未提及的元素。
本文中所使用的术语“大约”在用于表示成分浓度、条件、其他测值等背景下,表示给出数值的+/-5%,或者给出数值的+/-4%,或给出数值的+/-3%或给出数值的+/-2%,或给出数值的+/-1%,或给出数值的+/-0.5%,或给出数值的+/-0%。
在本发明中,具体的实施方式可能通过一个范围形式公开,应当理解的是,范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁并且不应被解释为对已公开的范围的不可变的限制。相应地,对于范围的描述应当被理解为已经具体公开了所有的可能的亚范围以及该范围内的独立数值。例如,描述1至6的范围应当被理解为已经具体的公开了亚范围,例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等,以及该范围内的单个数字,例如,1、2、3、4、5、和6。这适用于任何宽度的数值范围。
根据本发明的多种实施方式都指向非介体(mediator-less)电化学被分析物(例如,葡萄糖)传感装置以及程序。至于特定实施方式指向固定化酶例如关联至电极构造的葡萄糖氧化酶,这种实施方式中的以下包括以下几种:
(1)通过葡萄糖氧化酶固定关联于一个胺功能化电极从而开发葡萄糖氧化酶结合电极,例如通过葡萄糖氧化酶关于或在与胺-功能化电极相一致的表面共价结合。
(2)用于制备高稳定以及非渗漏葡萄糖氧化酶结合电极的高度简化的程序。
(3)基于双酶的非介体电化学葡萄糖传感。
开发非介体电化学葡萄糖传感程序以及仪器。根据本发明的实施方式的用于开发非介体电化学葡萄糖传感程序和仪器的实施例:
实施例1:通过葡萄糖氧化酶在胺功能化电极上的共价结合所开发的葡萄糖氧化酶结合电极。
表1显示共价葡萄糖传感方案与多种主流商业化葡糖糖计的对比。
表1
表2显示共价葡萄糖传感方案与多种主流商业化连续葡糖糖监测系统的对比。
表2
准备共价结合非渗漏葡萄糖氧化酶包被电极以及非介体电化学葡萄
糖传感方案
根据本发明的实施方式的共价结合非渗漏葡萄糖氧化酶包被电极的准备以及非介体电化学葡萄糖传感方案的准备在下文中提供。
所使用的材料和仪器
表3中提供了所使用的材料和仪器。
表3
使用50mM PBS用于制造GOx和葡萄糖溶液以及用于在所开发的程序步骤后洗涤。GOx储存液通过将等体积的10mg mL-1GOx和5%戊二醛混合制备,在4℃储存并且在室温平衡30分钟后再用于实验。
1.1 用于指导(Directing)GOx结合的程序或方法
1.1.1 表面清洁以及在GCE一级基底上产生羟基1基团(hydroxy 1group)
依次使用0.3和0.05μm的氧化铝粉将玻璃化碳电极(GCE,3mm直径,CH Industruments,Austin,TX,USA)抛光,并且接着通过置于超声波浴(Model 2510,Branson)的方式清洁20min.GCEs接着浸泡于1%KOH 5min以在其表面产生羟基基团。
1.1.2 使用1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)基于交联的开发的共价方案(APTES的浓度的影响见图2)
如图1和3中路径2所描述的,将3uL的2%APTES滴加在(drop-castedon)GCE并且在室温干燥1h。APTES-功能化GCE电极用超纯水充分洗涤以形成APTES/GCE。30μL的5mg mL-1GOx溶液与2μL的0.12gmL-1EDC溶液在室温混合15min以形成EDC-GOx交联溶液。4μL的所述EDC-GOx交联溶液接下来滴加于APTES/GCE并且在室温干燥1h.此后,将这些电极在PBS中洗涤以形成GOx-APTES/GCE。电极上的非特异性结合位点的封闭通过以下方式进行:滴加4μL的3%BSA溶液于GOx-APTES/GCE并在室温干燥1h接下来用50mM PBS清洗以形成封闭的GOx-APTES/GCE。最后,滴加3μL的0.5%Nafion并且在室温干燥1h以形成Nafion/GOx-APTES/GCE接下来用50mM PBS进行广泛的清洗。Nafion作为葡萄糖限制膜,其允许葡萄糖分子的扩散,但是阻碍污染物质和干扰物的扩散。
1.1.3 阴性方案和对照电极
如图1中路径1所描述的,两个阴性方案用于与本发明所开发的共价交联方案进行对比。在第一个方案中,GOx被直接滴加于APTES/GCE并且在室温干燥1h,接下来用PBS充分清洗以形成GOx/APTES/GCE。其基本步骤与共价方案相似并且导致形成Nafion/GOx/APTES/GCE 1。第二方案使用与第一方案非常相似的程序,唯一有差别的是在各步骤之间不清洗。所形成的电极表示为Nafion/GOx/APTES/GCE 2。第一对比试验,在将GOx固定于GCE前,GCE没有用APTES修饰,导致形成Nafion/GOx/GCE。在第二对比试验,APTES/GCE为在固定GOx前用BSA封闭的,进而导致形成Nafion/GOx/BSA/APTES/GCE。
1.1.4 电化学分析
所有电化学分析都是在室温下在CHI 660A电化学工作站中利用三个电极系统完成的,即,所开发的工作电极,Pt对电极以及Ag/AgCl参比电极。在搅拌的PBS中在-450mV vs.3MAg/AgCl下记录葡萄糖的电流反应(amperometric response)。
1.1.5 葡萄糖检测
(i)用于葡萄糖和Streck Sugar-Chex血糖线性标准的分析曲线如图3所示。通过将不同体积的1M葡萄糖储液注射于搅拌的PBS获得2mL最终浓度为0.5、1、2、4、8、16和32mM的溶液,从而得到Nafion/GOx-APTES/GCE,Nafion/GOx/APTES/GCE 1和Nafion/GOx/APTES/GCE2的葡萄糖分析曲线。所有的浓度都独立检测三次。
如图4所示,通过注射具有不同葡萄糖浓度的400μL的Sugar-Chex血糖线性标准获得Nafion/GOx-APTES/GCE的streck分析曲线,即将1.3、2.8、6.6、11.8、20.3和28.2mM葡萄糖浓度的Sugar-Chex血糖线性标准注射于2.8mL搅拌的PBS。
(ii)干扰物质的影响
如图5所示,用50mM PBS制备抗坏血酸(0.28M)、多巴胺(0.33M)、(+)-麻黄碱-氢氯化物(4.96mM)以及肌酸酐(0.44M)溶液。在10mM NaOH中制备尿酸溶液(5.9mM)和胆红素(17mM)溶液。在1M HCl中制备四环素(2.25mM)溶液。在无水乙醇中制备对乙酰氨基酚(0.33M)、水杨酸(0.36M)、布洛芬(48mM)和甲苯磺丁脲(37mM)溶液。在丙酮中制备妥拉磺脲溶液(32mM)。通过在注射6.6mM葡萄糖后分析对电化学检测信号的影响测定干扰物的影响。
(iii)连续葡萄糖检测
如图6所示,所开发的Nafion/GOx-APTES/GCE被用于连续的葡萄糖检测,用同一个电极对4mM葡萄糖检测了150次。
(iv)生物污垢的影响
如图7所示,在新鲜制备的Nafion/GOx-APTES/GCE上对4mM葡萄糖进行初始检测,接下来在相同的电极上检测6.6mM Streck血糖,从而研究生物污垢的影响。该程序重复4次。
(v)生产的可再现性
如图8所示,通过采用本发明的程序制备的25μL GOx功能化的GCE检测4mM葡萄糖(重复三次)的电化学反应的可再现性来测定生产的可再现性。
1.2 使用石墨烯纳米板(GNPs)的程序和方法
1.2.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团。
与1.1.1中的实施方式相似
1.2.2 基于GNPs的多步骤方案
如图7所示,将1mg的GNPs与0.125%APTES混合并且在超声波中分散1h。4μL的GNPs-APTES悬液滴加于GCE表面并且在室温干燥1h。此后,用超纯水彻底清洗电极以形成GNPs-APTES/GCE。将4μLEDC活化的GOx(5mg mL-1)滴加于GNPs-APTES/GCE并在室温干燥1h,此后用PBS彻底清洗电极以形成GOx/GNPs-APTES/GCE。最后用与1.2所述的相同的程序包被Nafion以形成NafionGOx/GNPs-APTES/GCE.。
1.2.3 电化学分析
与1.1.4所述的相同
1.2.4 葡萄糖检测
(i)用于葡萄糖的分析曲线(如图8所示)
与1.1.5(i)所述的相同
(ii)干扰物质的影响(如图9所示)
与1.1.5(ii)所述的相同
1.3.用于使用聚左旋赖氨酸(PLL)的程序和方法
1.3.1.表面清洁和在GCE上生成羟基基团。
与1.1.1中的实施方式相似
1.3.2 所开发的基于EDC交联GOx的多步骤方案
如图10所示,将4μL的0.1%PLL和2%APTES的混合物地价与GCE并且在室温干燥1h,接下来用超纯水彻底清洗以形成PLL-APTES/GCE。将4μL EDC交联的GOx(5mg mL-1)滴加于PLL-APTES/GCE并在室温干燥1h,接下来用PBS彻底清洗以形成GOx/PLL-APTES/GCE。最后用与1.2所述相同的程序包被Nafion以形成Nafion/GOx/PLL-APTES/GCE。
1.3.3 电化学分析
与1.1.4所述相同
1.3.4 葡萄糖检测
(i)葡萄糖分析曲线(如图11所示)
与1.1.5(i)所述相同
(ii)干扰物的影响(如图12所示)
与1.1.5(ii)所述相同。
1.4 使用基于MWCNTs(在APTES中分散的)的方案的程序和方法
1.4.1 表面清洁和GCE上羟基基团的产生
与1.1.1所述相同
1.4.2 开发的基于MWCNTs的方案
如图13所示,通过在超声波浴中持续30min将1mg mL-1MWCNTs分散于0.25%APTES。接着将4μL产物MWCNTs-APTES溶液滴加于GCE表面并在室温干燥以形成MWCNTs-APTES/GCE。接下来将4μL的5mg mL-1GOx滴加于MWCNTs-APTES/GCE表面并在室温干燥1h,接着用PBS彻底清洗以形成GOx/MWCNTs-APTES/GCE。最后用与1.2所述相同的程序包被Nafion以形成Nafion/GOx/MWCNTs-APTES/GCE。
1.4.3 电化学分析
与1.1.4所述相同
1.4.4 葡萄糖检测
(i)葡萄糖分析曲线(如图14所示)
与1.1.5(i)所述相同
(ii)干扰物的影响(如图15所示)
与1.1.5(ii)所述相同。
实施例2:用于制备高稳定性和非渗漏葡萄糖氧化酶结合电极的高度简化的程序。
表4.所开发的GOx结合GCE的稳定性,在不同条件下储存,以8mM葡萄糖检测的电化学信号反应的方式检测稳定性。
表4
表5开发的高度简化的葡萄糖传感方案与多种主流商业化葡糖糖计之间的比较。
表5
表6高度简化的葡萄糖传感方案与多种主流商品化连续葡萄糖监测系统的比较。
表6
使用的材料和仪器
所使用的材料和仪器列于表7.
表7
在本发明所开发的程序中,用50mM PBS作为GOx和葡萄糖稀释物的稀释剂,并且也用于各步骤后的洗涤(如下面所详述的)。将等体积的20mg mL-1GOx和5%戊二醛混合制备GOx储液,在4℃下储存并且在使用前在室温下平衡30min。
2.1 用于指导GOx结合的程序或方法
2.1.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与1.1.1中所述相同
2.1.2 所开发的简化的方案
将2μL的10mg mL-1GOx滴加于GCE接下来迅速滴加2μL的4%(w/v)APTES以在GCE上形成APTES-GOx混合物。将APTES-GOx/GCE在室温干燥1h,用50mM PBS全面清洗,然后用3μL的0.5%Nafion形成Nafion/APTES-GOx/GCE接下来用50mM PBS彻底清洗。所开发的方案也同样使用了铂(Pt)和金(Au)电极来配制Nafion/APTES-GOx/PtE和Nafion/APTES-GOx/AuE。
所开发的方案的一个变形也用于比较,将4%APTES先滴加于GCE接下来加入10mg mL-1GOx溶液.用这个变形发难修改的电极被表示为Nafion/GOx-APTES/GCE。
2.1.3 电化学分析
所有电化学分析都是在室温下在CHI 660A电化学工作站中利用三个电极系统完成的,即,所开发的工作电极,Pt对电极以及Ag/AgCl参比电极。在搅拌的PBS中在-450mV vs.3M Ag/AgCl下记录葡萄糖的电流反应(amperometric response)。
2.1.4 葡萄糖检测
(i)用于葡萄糖和Streck Sugar-Chex血糖线性标准的分析曲线
通过将不同体积的1M葡萄糖储液注射于搅拌的PBS获得2mL最终浓度为0.5、1、2、4、8、16、32和48mM的溶液,从而得到Nafion/APTES-GOx/GCE的葡萄糖分析曲线。所有的浓度都独立检测三次。通过注射具有不同葡萄糖浓度的400μL的Sugar-Chex血糖线性标准获得Nafion/Streck分析曲线,即将1.3、2.8、6.6、11.8、20.3和28.2mM葡萄糖浓度的Sugar-Chex血糖线性标准注射于2.8mL搅拌的PBS中。
(ii)干扰物质的影响
用50mM PBS制备抗坏血酸(0.28M)、多巴胺(0.33M)以及肌酸酐(0.44M)溶液。在10mM NaOH中制备尿酸溶液(5.9mM)。在1M HCl中制备四环素(2.25mM)溶液。在无水乙醇中制备对乙酰氨基酚(0.33M)、水杨酸(0.36M)、布洛芬(48mM)和甲苯磺丁脲(37mM)溶液。在丙酮中制备妥拉磺脲溶液(32mM)。通过分析注入的多种干扰物的连续的标准浓度对6.6mM的Sugar-Chex葡萄糖电化学检测信号的影响测定干扰物的影响。
(iii)利用所开发的简化的程序制备GOx结合GCE的可再现性
本发明的简化的程序用于制备25μL GOx结合GCEs。通过在各电极上电化学检测8mM葡萄糖(重复三次)来测定制备的可再现性。
(iv)在各种条件下储存的所开发的GOx结合电极的稳定性
通过四个广泛应用于生物医学诊断的储存条件评价所开发的GOx结合电极的稳定性。
>在4℃下储存于50mM PBS:从所开发的Nafion/APTES-GOx/GCE新鲜制备好时开始(符合100%信号强度),每天将其用于检测8mM葡萄糖10次至约两个月(当信号强度降至50%)。将电极在4℃下储存于50mM PBS中。
在4℃下储存于干燥环境(无PBS):从所开发的Nafion/APTES-GOx/GCE新鲜制备好时开始(符合100%信号强度),每天将其用于检测8mM葡萄糖10次至约5周(当信号强度降至50%)。将电极在4℃下储存于干燥环境(无PBS)中。
>室温下储存于50mM PBS:从所开发的Nafion/APTES-GOx/GCE新鲜制备好时开始(符合100%信号强度),每天将其用于检测8mM葡萄糖10次至约两个月(当信号强度降至50%)。将电极在4℃下储存于50mM PBS中。
室温下储存于干燥环境(无PBS):从所开发的Nafion/APTES-GOx/GCE新鲜制备好时开始(符合100%信号强度),每天将其用于检测8mM葡萄糖10次至约2个月(当信号强度降至50%)。将电极在4℃下储存于干燥环境(无PBS)中。
(v)将所开发的GOx结合电极在Streck血糖线性标准中储存5天的影响
将Nafion/APTES-GOx/GCE在室温下浸泡于Streck's Sugar-Chex血糖线性标准中(1mM)。从GOx结合电极刚制备好开始,连续5天,在每天储存于Streck血糖后,通过Nafion/APTES-GOx/GCE检测8mM葡萄糖的电化学信号检测生物污垢。
2.1.5 证明所开发的简化的方案用于在不同底物结合GOx的多底物相容性
所开发的简化的方案用于在不同类型底物的几乎相同区域上结合GOx。进行双金鸡宁酸(Bicinchoninic acid)(BCA)蛋白分析分析以确认结合于多种基底的GOx的浓度。37℃下将APTES-GOx包被的基底在200微升BCA试剂中孵育30min(使用Thermomixer设备)。GOx通过BCA试剂结合于多种基底得到紫色BCA蛋白分析溶液,将180微升紫色BCA蛋白分析溶液转移至96-孔微孔板,其在562nm处有吸光值。
2.2 用于制备石墨烯纳米板的程序和方法
2.2.1 表面清洁以及在GCE上生成羟基基团
与1.1.1所述相同
2.2.2 开发的高度简化的方案
将分散于0.25%APTES中的2μL的2mg mL-1石墨烯纳米板(GNPs;直径5μm)在滴加于GCE接下来迅速滴加2μL的10mg mL-1GOx以在GCE上形成APTEs-GNPs-GOx混合物。将APTES-GNPs-GOx/GCE在室温干燥1h,用50mM PBS全面清洗,然后用3μL的0.5%Nafion滴加并在室温下干燥10min以形成Nafion/APTES-GNPs-GOx/GCE接下来用50mM PBS彻底清洗。
2.2.3 电化学分析
与2.1.3所述相同
2.2.4 葡萄糖分析曲线
通过将不同体积的1M葡萄糖储液注射于搅拌的PBS获得2mL最终浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、48和64mM的溶液,从而得到Nafion/APTES-GNPs-GOx/GCE的葡萄糖分析曲线。所有的浓度都独立检测三次。
利用与2.1.4(i)所述相同的程序获得Streck分析曲线。
2.2.5.干扰物的影响
与2.1.4.(ii)中所述相同。
2.2.6.用所开发的简化程序制备Nafion/APTES-GNPs-GOx/GCE的可再现性。
本发明的简化的程序用于制备25μL Nafion APTES-GNPs-GOx/GCE。通过在各电极上电化学检测8mM葡萄糖(重复三次)来测定制备的可再现性。
2.3 用于使用聚左旋赖氨酸的程序和方法
2.3.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与2.2.1所述的相同
2.3.2 开发的基于EDC交联的高度简化的方案
在100mM MES中制备0.12g mL-1的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。2μL的0.1%聚左旋赖氨酸(PLL)最先滴加于清洁的GCE接下来迅速滴加2μL的10mg mL-1GOx(在使用前用EDC活化15min)以在GCE上形成PLL-GOx混合物。将PLL-GOx/GCE在室温下干燥1h并用50mM PBS彻底洗涤。其后滴加3μL of 0.5%Nafion并在室温下干燥10min以形成Nafion/PLL-GOx/GCE接着用50mMPBS充分洗涤。
2.3.3 电化学分析
与2.1.3所述的相同。
2.3.4 葡萄糖的检测
(i)通过将不同体积的1M葡萄糖储液注射于搅拌的PBS获得2mL最终浓度为0.5、1、2、4、8、16和32mM的溶液,从而得到Nafion/PLL-GOx/GCE的葡萄糖分析曲线。所有的浓度都独立检测三次。
利用与2.1.4(i)所述相同的程序获得Streck分析曲线。
(ii)干扰物的影响
与2.1.4.(ii)中所述相同。
2.4 利用多壁碳纳米管的程序和方法
2.4.1 表面清洁和在GCE表面生成羟基基团
与2.1.1所述的相同
2.4.2 开发的高度简化的方案
将分散于1%APTES中2μL的2mg mL-1多壁碳纳米管(MWCNTs)(直径15nm并且长度为1-5μm)滴加于GCE,接下来迅速滴加2μL的10mg mL-1GOx以在GCE上形成APTES-MWCNTs-GOx混合物。将APTES-MWCNTs-GOx在室温下干燥1h并用50mM PBS彻底洗涤。其后滴加3μL of 0.5%Nafion并在室温下干燥10min以形成Nafion/APTES-MWCNTs-GOx/GCE接着用50mM PBS充分洗涤。
2.4.3 电化学分析
与2.1.3所述的相同
2.4.4 葡萄糖分析曲线
与2.3.4(i)所述的相同。
2.4.5 干扰物的影响
与2.1.4(ii)所述的相同。
实施例3:基于双酶的非集体电化学葡萄糖传感方案。
表8.将所开发的基于双酶的EC葡萄糖传感方案与主流商业化葡萄糖计的比较。
表8
表9.将所开发的基于双酶的EC葡萄糖传感方案与主流商业化连续葡萄糖监测系统的比较。
表9
所使用的材料和仪器
本实施例中所使用的材料和仪器列于表10.
表10
在本发明所开发的程序中,用50mM PBS作为GOx和葡萄糖稀释物的稀释剂,并且也用于各步骤后的洗涤(如下面所详述的)。将等体积的20mg mL-1GOx与0.2mg mL-1HRP混合制备30微升双酶溶液1,使用前将所述双酶溶液1与2微升0.12g mL-1l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC,溶解于MES中)在室温(RT)下混合15分钟。使用前通过将等体积的20mg mL-1GOx(在2.5%戊二醛中)与0.2mg mL-1HRP在室温下混合15分钟制得双酶溶液2。
3.1 用于指导GOx结合的程序或方法
3.1.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与1.1.1中所述相同
3.1.2 所开发的简化的方案
将2μL的双酶溶液2滴加于GCE接下来迅速滴加2μL的4%APTES以在GCE上形成APTES-GOx-HRP混合物。将APTES-GOx-HRP/GCE在室温干燥1h,用50mM PBS全面清洗。然后用3μL的0.5%Nafion滴加并在室温干燥10min以形成Nafion/APTES-GOx-HRP/GCE接下来用50mM PBS彻底清洗。
3.1.3 电化学分析
所有电化学分析都是在室温下在CHI 660A电化学工作站中利用三个电极系统完成的,即,所开发的工作电极,Pt对电极以及Ag/AgCl参比电极。在搅拌的PBS中在-450mV vs.3M Ag/AgCl下记录葡萄糖的电流反应(amperometric response)。
(i)葡萄糖分析曲线
通过将不同体积的1M葡萄糖储液注射于搅拌的PBS获得2mL最终浓度为0.5、1、2、4、8、16、32和48mM的溶液,从而得到Nafion/PLL-GOx-HRP/GCE的葡萄糖分析曲线。所有的浓度都独立检测三次。
(ii)干扰物质的影响
在10mM NaOH中制备胆红素(5.1mM)和尿酸(11.9mM)溶液。在0.1M PBS中制备肌酸酐(88.3mM)、醋氨酚(66mM)、抗坏血酸(0.57M)、多巴胺(62.6mM)和麻黄碱(0.5mM)溶液。在无水乙醇中制备布洛芬(48.6mM)、水杨酸(0.36M)和甲苯磺丁脲(37mM)溶液。在3M的HCl中制备四环素溶液(45Mm)。在丙酮中制备妥拉磺脲溶液(32mM)。通过分析注入的多种干扰物的连续的标准浓度对6.6mM的Sugar-Chex葡萄糖电化学检测信号的影响测定干扰物的影响。
3.2 利用石墨烯纳米板的程序和方法
3.2.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与1.1.1所述的相同
3.2.2.所开发的高度简化的基于GNPs的双酶方案
将分散于0.25%APTES中的2μL的2mg mL-1石墨烯纳米板(GNPs;直径5μm)在滴加于GCE接下来迅速滴加2μL的双酶溶液1以在GCE上形成GNPs-GOx-HRP混合物。将GNPs-GOx-HRP/GCE在室温干燥1h,用50mM PBS全面清洗.
然后用3μL的0.5%Nafion滴加并在室温下干燥10min以形成Nafion/GNPs-GOx-HRP/GCE接下来用50mM PBS彻底清洗。
3.2.3 电化学分析
与3.1.3所述的相同
3.2.4 葡萄糖的检测
(i)葡萄糖的分析曲线
与3.1.3(1)所述的相同
(ii)干扰物的影响
与3.1.3(ii)所述的相同
3.3 利用聚左旋赖氨酸的程序和方法
3.3.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与1.1.1所述的相同
3.3.2 开发的简化的基于PLL的双酶方案
将2μL的0.1%PLL滴加于GCE接下来迅速滴加2μL的双酶溶液1以在GCE上形成PLL-GOx-HRP混合物。将PLL-GOx-HRP/GCE在室温干燥1h,用50mM PBS全面清洗。然后用3μL的0.5%Nafion滴加以形成Nafion/PLL-GOx-HRP/GCE接下来用50mM PBS彻底清洗。
3.3.3 电化学分析
与3.1.3所述的相同
3.3.4 葡萄糖的检测。
(i)葡萄糖分析曲线
与3.1.3(i)所述的相同
(ii)干扰物的影响
与3.1.3(ii)所述的相同
3.4 利用MWCNTs的程序和方法
3.4.1 表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与3.1.1所述的相同。
3.4.2 开发的开度简化的基于MWCNTs的双酶方案
将分散于1%APTES中2μL的2mg mL-1MWCNTs滴加于GCE,接下来迅速滴加2μL的双酶溶液1以在GCE上形成MWCNTs-GOx-HRP混合物。MWCNTs-GOx-HRP/GCE在室温下干燥1h并用50mM PBS彻底洗涤。其后滴加3μL of 0.5%Nafion并在室温下干燥10min以形成Nafion/MWCNTs-GOx-HRP/GCE接着用50mM PBS充分洗涤。
3.4.3 电化学分析
与3.1.3所述的相同
3.4.4 葡萄糖的检测
(i)葡萄糖的分析曲线
与3.1.3(i)所述的相同。
(ii)干扰物的影响
与3.1.3.(ii)所述的相同。
3.5 利用壳聚糖的程序和方法
3.5.1.表面清洁和在GCE上生成羟基基团
与3.1.1.中所述的相同。
3.5.2.开发的高度简化的基于壳聚糖的双酶方案
将分散于5%APTES中2μL的0.1mg mL-1壳聚糖(CS)滴加于GCE,接下来迅速滴加2μL的双酶溶液1以在GCE上形成CS-GOx-HRP混合物。CS-GOx-HRP/GCE在室温下干燥1h并用50mM PBS彻底洗涤。其后滴加3μL of 0.5%Nafion并在室温下干燥10min以形成Nafion/CS-GOx-HRP/GCE接着用50mM PBS充分洗涤。
3.5.3 电化学分析
与3.1.3所述的相同
(i)葡萄糖的分析曲线
与3.1.3(i)所述的相同。
(ii)干扰物的影响
与3.1.3.(ii)所述的相同。
本文中所描述的仪器、结构和技术适用于多种电极材料例如铂、金、碳、玻璃化碳以及其他基底;并且适合与多种固定化试剂一同使用,包括纳米类物质(nano-scale species)、结构或材料,例如石墨烯、多壁碳纳米管、纳米晶纤维素、壳聚糖、聚左旋赖氨酸、纳米微粒、多聚体、纳米混合物等等。根据本文的教导,多种生物分子可以被固定或结合,例如酶、蛋白、伴刀豆球蛋白A(葡萄糖结合蛋白),和/或其他生物分子。
本文公开了多种方面和具体实施方式,可以想见的是,在阅读了上述公开的内容后,对本领域技术人员而言,在不脱离本发明的精神和范围的情况下多种对本发明的其他修改和改编是显而易见的,并且可以预期所有这种私改和改编都在附随的权利要求的范围内。本文所公开的多个方面和具体实施方式是为了说明的目的并不用于限定所用,与附随的权利要求所指出的本发明的确切范围和精神一致。
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Claims (75)
- 应当注意的是,关于下列代表性的权利要求,术语“第一酶”可以被术语“第一生物分子”取代;类似的,术语“第二酶”可以被术语“第二生物分子”取代。1.一种用于在检测环境中检测一种被分析物的非介体生物传感器,所述非介体生物传感器包括:一个共价结合了功能化试剂的具有电传导化学修饰表面的基底;以及通过共价结合于所述功能化试剂中的一种而与所述表面固定连接的第一酶,一个化学结合于功能化试剂的多聚体,以及一个化学结合于所述功能化试剂的纳米工程化材料,其中,非介体生物传感器配制为用于在分析物和第一酶之间直接电子转移(direct electron transfer)以适于对关联于检测环境的表面施加一个负电势。
- 2.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述非介体生物传感器在接近20天的周期中保持基本稳定的分析物检测能力。
- 3.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述电传导化学修饰表面负载与功能化试剂共价结合的羟基。
- 4.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物。
- 5.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,并且其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约4体积%的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
- 6.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,并且其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约2体积%的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
- 7.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,并且其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约1体积%的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
- 8.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述多聚体包括胺功能化多聚体。
- 9.根据权利要求8所述的非介体生物传感器,其中,所述多聚体包括氨基酸多聚体(例如,聚左旋赖氨酸)和葡萄糖胺基多聚体中的一种(如壳聚糖)。
- 10.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳纳米管和纳米晶纤维素中的至少一种。
- 11.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述非介体生物传感器进一步包括选择性扩散膜,其在检测环境下限制第一酶在物质中的暴露。
- 12.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述基底负载有金属(例如,铂、金)和碳基材料中的一种。
- 13.根据权利要求12所述的非介体生物传感器,其中,所述基底包括玻璃化碳电极。
- 14.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,除包括生物物种(biological species)和药物代谢产物的被分析物以外,第一生物分子和第一酶中的一个与被分析物之间的直接电子转移基本上没有被分子物质(molecular substances)影响。
- 15.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。
- 16.根据权利要求15所述的非介体生物传感器,其中,所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
- 17.根据权利要求16所述的非介体生物传感器,其中,非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整个糖尿病病理浓度范围的葡萄糖。
- 18.根据权利要求16所述的非介体生物传感器,其中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约0.5-32mM的范围的葡萄糖。
- 19.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,第一酶通过以下方式共价结合于所述表面,将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于第一酶。
- 20.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试剂的混合物的液体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
- 21.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂的悬浮液的方式将所述多聚体共价结合于所述表面。
- 22.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于多聚体的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质中。
- 23.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,纳米工程化材料通过以下方式共价结合于所述表面,将表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于携带有纳米工程化材料的极化分散剂。
- 24.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,通过将表面暴露于含有纳米工程化材料和功能化试剂的悬浮液的方式将纳米工程化材料共价结合于所述表面。
- 25.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化材料和第一酶的液体介质中。
- 26.根据权利要求1所述的非介体生物传感器,其中,所述非介体生物传感器进一步包括一个第二酶,通过与功能化试剂、多聚体和纳米工程化材料中的一种共价结合的方式固定于所述表面。
- 27.根据权利要求26所述的非介体生物传感器,其中,第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的副产物。
- 28.根据权利要求27所述的非介体生物传感器,其中,所述第二酶包括辣根过氧化物酶。
- 29.根据权利要求26所述的非介体生物传感器,其中,所述第二酶增加动态分析物检测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
- 30.根据权利要求28所述的非介体生物传感器,其中,第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传感器能够检测涵盖约0.5-48mM的浓度范围的葡萄糖。
- 31.根据权利要求26所述的非介体生物传感器,其中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
- 32.根据权利要求26所述的非介体生物传感器,其中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、多聚体、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于多聚体。
- 33.根据权利要求26所述的非介体生物传感器,其中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、纳米工程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
- 34.一种制造非介体生物传感器的方法,所述非介体生物传感器被配置用于在检测环境下检测被分析物,所述方法包括:提供一个具有电传导化学修饰表面的基底;将功能化试剂共价结合于表面;以及实施一个固定过程,所述固定过程包括以下过程中的一种:(a)将第一酶共价结合于功能化试剂;(b)将多聚体共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于多聚体;以及(c)将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂并将第一酶共价结合于纳米工程化材料,其中所述非介体生物传感器被配置为检测响应负电势在相对于所述检测环境的表面的应用的被分析物与第一酶之间的直接电子转移。
- 35.根据权利要求34所述的方法,其中,提供具有电传导化学修饰表面的基底包括:提供一个具有电传导表面的基底;以及将表面暴露于表面修饰试剂从而所述使得表面携带有羟基。
- 36.根据权利要求34所述的方法,其中,功能化试剂包括有机官能烷氧基硅烷化合物。
- 37.根据权利要求34所述的方法,其中,功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,并且其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约4体积%的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
- 38.根据权利要求34所述的方法,其中,功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,并且其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约2体积%的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
- 39.根据权利要求34所述的方法,其中,功能化试剂含有一个有机官能烷氧基硅烷化合物,并且其中,通过将表面暴露于存在浓度低于约1体积%的功能化试剂的液体介质使功能化试剂与所述表面共价结合。
- 40.根据权利要求34所述的方法,其中,所述多聚体包括胺功能化多聚体。
- 41.根据权利要求40所述的方法,其中,所述多聚体包括氨基酸多聚体、和葡萄糖胺基多聚体中的一种。
- 42.根据权利要求34所述的方法,其中,纳米工程化的材料包括石墨烯纳米板、多壁碳纳米管和纳米晶纤维素中的至少一种。
- 43.根据权利要求34所述的方法,进一步包括一个选择性扩散膜,所述选择性扩散膜在检测环境下限制第一酶在物质中的暴露。
- 44.根据权利要求34所述的方法,其中,所述基底携带金属和碳基材料中的一种。
- 45.根据权利要求44所述的方法,其中,所述基底含有一个玻璃质碳电极。
- 46.根据权利要求34所述的方法,其中,除含有生物物种和药物代谢产物的被分析物以外,被分析物和第一酶之间的直接电子转移基本上没有被分子物质影响。
- 47.根据权利要求34所述的方法,其中,第一酶适合于检测葡萄糖、胆固醇、乙醇、乳酸盐、乙酰胆碱、胆碱、次黄嘌呤和黄嘌呤中的一个。
- 48.根据权利要求47所述的方法,其中,所述第一酶包括葡萄糖氧化酶。
- 49.根据权利要求48所述的方法,其中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖几乎整个糖尿病病理浓度范围的葡萄糖。
- 50.根据权利要求48所述的方法,其中,所述非介体生物传感器能够检测涵盖浓度约0.5-32mM的范围的葡萄糖。
- 51.根据权利要求34所述的方法,其中,第一酶通过以下方式共价结合于所述表面,将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于第一酶。
- 52.根据权利要求34所述的方法,其中,通过将表面暴露于携带有第一酶和功能化试剂的混合物的液体介质的方式将第一酶共价结合于所述表面。
- 53.根据权利要求34所述的方法,其中,通过将表面暴露于含有多聚体和功能化试剂的悬浮液的方式将所述多聚体共价结合于所述表面。
- 54.根据权利要求34所述的方法,其中,多聚体共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于多聚体的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、多聚体和第一酶的液体介质中。
- 55.根据权利要求34所述的方法,其中,纳米工程化材料通过以下方式共价结合于所述表面,将所述表面暴露于功能化试剂从而形成功能化表面,接下来将所述功能化表面暴露于携带有纳米工程化材料的极化分散剂。
- 56.根据权利要求34所述的方法,其中,通过将所述表面暴露于含有纳米工程化材料和功能化试剂的悬浮液的方式将纳米工程化表面共价结合于所述表面。
- 57.根据权利要求34所述的方法,其中,纳米工程化材料共价结合于所述表面以及第一酶共价结合于纳米工程化材料的方式为将所述表面暴露于含有功能化试剂、纳米工程化材料和第一酶的液体介质中。
- 58.根据权利要求34所述的方法,其中,所述固定过程涉及第一酶以及不同于第一酶的第二酶,并且其中所述固定过程包括以下过程中的一种:(a)将第一酶和第二酶共价结合于功能化试剂;(b)将多聚体共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于多聚体;以及(c)将纳米工程化材料共价结合于功能化试剂以及将第一酶和第二酶共价结合于纳米工程化材料。
- 59.根据权利要求58所述的方法,其中,第二酶可以减少电化学被分析物检测反应的副产物。
- 60.根据权利要求59所述的方法,其中,所述第二酶包括辣根过氧化物酶。
- 61.根据权利要求58所述的方法,其中,所述第二酶增加动态分析物检测范围和分析物检测灵敏度中的至少一种。
- 62.根据权利要求61所述的方法,其中,第一酶包括葡萄糖氧化酶并且非介体生物传感器能够检测约0.5-48mM的浓度范围的葡萄糖。
- 63.根据权利要求58所述的方法,其中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于所述功能化试剂。
- 64.根据权利要求58所述的方法,其中,所述第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、多聚体、第一酶和第二酶的方式共价结合于多聚体。
- 65.根据权利要求58所述的方法,其中,第一酶和第二酶通过将表面暴露于携带功能化试剂、纳米工程化材料、第一酶和第二酶的液体介质的方式共价结合于纳米工程化材料。
- 66.一种非介体酶包被电极,包括:a.一个一级基底;以及b.共价结合于所述一级基底的酶。
- 67.根据权利要求66所述的非介体酶包被电极,进一步包括一个选择性扩散膜。
- 68.一种非介体酶包被电极,包括:a.一个一级基底;b.一个二级基底;以及c.共价结合于所述一级基底和二级基底的酶。
- 69.制备非介体酶包被电极的方法,包括:a.将酶至少共价结合于一个一级基底以形成一个非介体酶包被电极。
- 70.一种在没有介体的情况下在样品中电化学检测被分析物的方法,包括:a.将非介体酶包被电极暴露于含有被分析物的样品;b.在所述非介体酶包被电极施加负电势;以及c.在所述样品中检测被分析物。
- 71.一种稳定酶包被电极包括:a.一个第一基底;b.一个附着于所述第一基底的酶;以及c.一个选择性扩散膜,其中所述电极在至少约20天保持一个稳定被分析物传感信号。
- 72.根据权利要求71所述的稳定酶包被电极进一步包括一个第二基底。
- 73.根据权利要求71所述的稳定酶包被电极,其中,所述电极具有约0.5mM至约48mM的动态范围。
- 74.一种减少电化学被分析物检测反应的副产物的方法,包括:a.提供一种含有至少两种酶的非介体酶包被电极;b.对所述非介体酶包被电极施加一个负电势;c.将具有负外加电势的所述非介体酶包被电极暴露于一个含有被分析物的样品以引发一个电化学被分析物检测反应;以及d.在样品中检测所述被分析物的水平,其中,所述至少两种酶中的至少一种催化所述电化学被分析物检测反应的副产品的还原。
- 75.一种在不存在介体的条件下增加酶包被电极灵敏度的方法,包括:a.提供一种含有至少两种酶的酶包被电极,其中所述至少两种酶中的至少一种包括过氧化氢酶;b.对所述酶包被电极施加一个负电势;c.将施加有负电势的酶包被电极暴露于含有被分析物的没有介体的样品中,以引发一个电化学被分析物检测反应;以及d.在不存在介体的情况下,用所述过氧化氢酶对所述电化学被分析物检测反应的副产物催化还原反应,进而增加所述酶包被电极对所述被分析物的灵敏度。
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2013
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PB01 | Publication | ||
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RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |