CN107735027A - 稳定的乳酸响应酶、电极和传感器以及制备和使用它们的方法 - Google Patents

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Abstract

本公开文本的实施方案涉及稳定的乳酸氧化酶组合物和包括它们的电极、传感器和系统。还提供了用于制备所述组合物的方法和使用所述稳定的乳酸酶组合物检测和/或测定体内乳酸的方法。

Description

稳定的乳酸响应酶、电极和传感器以及制备和使用它们的 方法
相关申请的交叉引用
本申请要求基于2015年6月15日提交的美国临时申请No.62/175,910的优先权，其公开内容通过整体引用并入本文。
技术领域
乳酸是关键的代谢物，并且其监测对于健康评估是重要的，例如包括危重病和/或重症监护和/或手术患者。然而，迄今为止，没有高效和有效的方法来监测乳酸，特别是随着时间推移变化的乳酸，例如ICU或手术室中的患者所需要的。乳酸监测可用于检测脓毒症、缺氧和癌性组织的存在(Clinical use of lactate monitoring in critically illpatients Jan Bakker,Maarten WN Nijsten和Tim C Jansen.)
虽然乳酸监测是所期望的，但是存在与乳酸监测有关的几个挑战，例如酶稳定性。具有高度稳定性和敏感性的改进的乳酸传感器的研发是所期望的。
背景技术
本公开文本的实施方案涉及稳定的乳酸酶、电极、传感器和方法。本文公开了乳酸响应酶、乳酸响应酶稳定剂和聚合物的酶组合物。这些成分中的一些或全部可以是未结合或未连接的，或者这些成分中的两种或多种可以彼此结合或连接在一起。例如，酶和/或稳定剂可以键合到聚合物上，例如共价键合。在某些实施方案中也可以包括介体，并且介体可以结合到聚合物上，其中有或没有乳酸响应酶和/或乳酸响应酶稳定剂键合到聚合物上。所述乳酸响应酶可以是乳酸氧化酶，且乳酸响应酶稳定剂可以是过氧化氢酶。还提供了用于制备稳定的乳酸氧化酶组合物、乳酸电极、乳酸传感器的方法及其使用方法，例如用于乳酸监测。
附图说明
本文参照附图提供了本公开文本的各种实施方案的详细描述，附图在下面简要描述。附图是示例性的，并且不一定按比例绘制。附图示例了本公开文本的各种实施方案，并且可以全部或部分地示例本公开文本的一个或多个实施方案或实施例。在一个图中用来指代特定要素的参考数字、字母和/或符号可以用在另一个图中以指代相似的要素。
图1显示不包括作为传感器酶组合物的一部分的稳定剂的三种乳酸传感器的作为时间的函数的传感器信号输出的示意图。
图2显示随时间推移响应于缺乏稳定剂的乳酸传感器和具有作为酶组合物的一部分的稳定剂的乳酸传感器的乳酸浓度的逐步变化的传感器信号输出的示意图。
图3显示缺乏稳定剂的乳酸传感器和具有作为酶组合物的一部分的稳定剂的乳酸传感器的作为乳酸浓度的函数的传感器信号输出的示意图。
图4显示缺乏稳定剂的乳酸传感器和具有作为酶组合物一部分的稳定剂的乳酸传感器的作为时间函数的传感器信号输出稳定性的示意图。
发明内容
在描述本公开文本的实施方案之前，应该理解本发明不局限于所述的特定实施方案，就其本身而言当然可以变化。还应该理解，本文使用的术语只是为了描述特定实施方案的目的，而无意起限定作用，因为本发明实施方案的范围只由所附权利要求书限定。
在提供一个数值范围的情况下，应该理解，也具体公开了该范围的上限与下限之间的到下限的单位的十分之一(除非上下文另有明确指示)的每个中间值。所述范围中的任何所述值或中间值与该所述范围中的任何其他所述或中间值之间的每个较小范围都包含在本发明之内。在该范围内可以独立地包括或排除这些较小范围的上限和下限，并且在较小范围内包括任一个端点、无端点、或两个端点的每个范围也包含在本发明之内，受所述范围中的任何明确排除端点支配。在所述范围包括端点之一或两者的情况下，排除那些被包括的端点的任一个或两者的范围也包括在本发明之内。
在本文对本发明的描述中，应当理解，除非另外有毫无疑义地或明确地理解或陈述，否则以单数出现的单词涵盖其复数对应物，并且以复数形式出现的单词涵盖其单数对应物。仅举例而言，对“一种”或“该”“酶”的提及涵盖单一的酶，以及两种或更多种不同酶的组合和/或混合物，提及的“一种”或“该”“浓度值”涵盖单个浓度值以及两个或更多个浓度值等，除非另外毫无疑义地或明确地理解或陈述。此外，将要理解的是，除非另外毫无疑义地或明确地理解或陈述，否则这类候选者或替代者的任何列表仅仅是示例性的而不是限制性的。
下面描述各种术语以便有利于理解本发明。应当理解，这些不同术语的相应描述适用于这些不同术语的相应语言或语法变化或形式。还将要理解的是，本发明不限于在此用于描述特定实施方案使用的术语或其描述。仅作为实例，除非另外毫无疑义地或明确地理解或陈述，否则本发明不限于特定的乳酸、体液或组织液、血液或毛细血管血液、或传感器构造或应用，因为可以照此改变。
仅仅针对在本申请的申请日之前的公开内容来提供本文所讨论的公开资料。本文中的任何内容均不被解读为承认本发明的实施方案无权因在先发明而早于这样的公开资料。此外，所提供的公开资料的日期可能不同于实际公开日期，这可能需要独立地确认。
本公开内容公开了乳酸酶组合物，其包括乳酸响应酶、乳酸响应性酶稳定剂和可以包括所述酶和/或稳定剂连接位点的聚合物。还可以包括交联剂和/或电子转移剂。在组合物的使用条件下，包括使用条件如温度、生理环境、持续时间等，当应用于电极和/或体内乳酸传感器时，稳定的乳酸酶组合物随时间未改变(或至少具有不改变的活性和/或敏感性和/或特异性)。稳定的和/或不变的乳酸酶组合物是这样一种组合物，在预定的时间内，例如60小时、40小时、20小时或10小时内，在恒定浓度的乳酸溶液中的信号下降小于10％，包括小于8％、小于7％、小于5％和小于1％。如果发生变化，则改变对乳酸监测没有临床意义，例如，没有统计学显著性和/或临床上不影响Clark误差网格分析结果和/或MARD和/或MAD。变化至少小于对无稳定的乳酸响应酶的对照组合物的变化。例如，对本文公开的乳酸稳定的酶组合物的变化不会导致从Clark误差网格的一个区域到另一个区域的变化，或者至少不会导致变化到精确度较低的区域，例如从B区改变到C区等。稳定的乳酸响应酶至少在整个体内使用期间(即，功能寿命)保持稳定，例如在体内环境中或在模拟体内环境的离体环境中几周至几个月或更长-至到一年或以上。在某些实施方案中，所述乳酸响应酶是乳酸氧化酶，且所述稳定剂是过氧化氢酶或其衍生物和模拟物(统称“过氧化氢酶”)。
在某些情况下，过氧化氢酶通过减少或消除由氧化物质(例如过氧化物物质、活性氧等)、抑制剂或变性剂引起的乳酸氧化酶的降解来减少或消除乳酸氧化酶的降解(例如变性或催化活性的丧失)。在一些实施方案中，与在没有过氧化氢酶存在下出现的乳酸氧化酶对照的降解相比，过氧化氢酶将乳酸氧化酶的降解降低乃至1/2或更少，包括1/5或更少、1/8或更少、1/10或更少以及1/12或更少。在一些实施方案中，与没有过氧化氢酶存在下将发生的降解相比，过氧化氢酶使乳酸氧化酶的降解量减少了20％-80％。因此，随着时间和各种使用条件的变化，过氧化氢酶保持酶的活性。
所述酶组合物中的乳酸氧化酶可以以0.05μg-5μg的量存在，例如0.1μg-4μg，例如0.2μg-3μg，且包括0.5μg-2μg。所述酶组合物中的过氧化氢酶(catalse)可以以0.05μg-2μg的量存在，例如0.1μg-1μg，例如0.2μg-0.9μg，且包括0.3μg-0.8μg。在某些实施方案中，乳酸氧化酶与过氧化氢酶的重量(w/w)比可以为10：1、8：1、5：1和2：1。
在一些实施方案中，少于10％的酶被降解，在一些实施方案中，少于5％乃至少于1％或0.5％乃至0.1％的酶被降解。在传感器与乳酸源接触的时间期间，5μg或以下的乳酸响应酶被降解到它们不接触的时间，例如3μg或以下、例如2μg或以下，且包括1μg或以下的乳酸响应酶。例如，在本组合物中存在过氧化氢酶稳定剂时，连续3小时或以上、例如连续5小时或以上、例如连续6小时以上、例如连续12小时或以上、例如连续24小时或以上、例如连续48小时或以上、例如连续72小时或以上且包括连续168小时或以上后，5μg或以下的乳酸氧化酶被分解。
当酶用于监测乳酸时，例如当与体内电化学乳酸传感器中的电极一起使用时，未稳定的乳酸氧化酶可导致与测定的乳酸水平无关的信号下降(即，因为酶不稳定)(在下面更详细地描述)。在一个实例中，过氧化氢酶稳定乳酸氧化酶的活性并提供体内乳酸传感器，其在如上所述的整个体内传感器磨损期间和磨损条件下维持稳定的传感器输出(即，稳定的传感器信号，例如电流或电压)。与不含过氧化氢酶的相同乳酸传感器相比，过氧化氢酶可稳定乳酸氧化酶的活性并提供显示乳酸敏感性和/或特异性提高的体内乳酸传感器。在这些实施方案中，过氧化氢酶稳定乳酸氧化酶，使得在传感器与乳酸源接触的持续时间内，稳定的乳酸监测传感器显示传感器输出下降为总传感器输出的10％或以下，例如8％或以下、例如5％或以下、例如3％或以下、例如2％或以下、例如1％或以下、例如0.1％或以下且包括0.01％或以下。在某些实施方案中，过氧化氢酶稳定乳酸氧化酶，使得传感器在传感器与乳酸源接触的持续时间内表现出2nA或以下的传感器输出降低，例如1.5nA或以下、例如1nA或以下、例如0.5nA或以下、例如0.1nA或以下，且包括0.01nA或以下的降低。在不存在稳定剂的乳酸传感器中，在乳酸传感器与乳酸源接触的时间期间，所述传感器表现出大于10％的信号输出下降。例如，在不存在稳定剂的情况下，乳酸传感器可以表现出15％或更多，例如25％或以上，例如50％或以上且包括75％或以上的传感器输出下降，这与乳酸的浓度无关。
在一些实施方案中，与不含过氧化氢酶的传感器相比，乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物提高乳酸敏感性，例如提高5％或以上，例如10％或以上，例如15％或以上，例如20％或以上，例如25％或以上，且包括50％或以上。乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物使乳酸传感器灵敏度提高1nA/mg/dL或以上，例如2nA/mg/dL，例如5nA/mg/dL，例如7nA/mg/dL，例如10nA/mg/dL，且包括15nA/mg/dL或以上。在不存在稳定剂的乳酸传感器中，传感器显示灵敏度没有提高，并且在一些情况下，在乳酸传感器与乳酸源接触期间显示传感器灵敏度的损失，例如传感器灵敏度降低3％或以上，例如5％或以上，例如7％或以上，且包括传感器灵敏度降低10％或以上。例如，在不存在稳定剂的情况下，例如在传感器与乳酸源接触期间，乳酸传感器可以表现出1nA/mg/dL或以上、例如2nA/mg/dL、例如5nA/mg/dL、例如7nA/mg/dL、例如10nA/mg/dL且包括15nA/mg/dL或以上的传感器灵敏度降低。
乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物可以是不均匀的或均匀的。在一些实施方案中，两者均分布于整个组合物中，例如，当施加至电极时。例如，乳酸氧化酶和过氧化氢酶可以均匀分布在整个组合物中，使得乳酸氧化酶和过氧化氢酶各自的浓度始终相同。在一些情况下，所述组合物具有乳酸氧化酶和过氧化氢酶的均匀分布。在某些情况下，乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物进一步包括也分布在整个组合物中的电子转移剂。在某些实施方案中，乳酸响应酶、稳定剂和电子转移剂全部三种均匀地分布在整个组合物中。
所讨论的稳定的体内乳酸传感器检测和/或监测体内生物流体中的乳酸。在一些实施方案中，这些体内乳酸传感器可以检测和/或监测间隙液、血液及其成分、皮肤流体、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、支气管肺泡灌洗液、羊水和羊膜脐带血的一种或多种中的乳酸。
在一些实施方案中，受试者是人。本文所述的传感器可以应用于来自任何性别和处于任何发育阶段(即胎儿、新生儿、婴儿、少年、青少年和成人)的受试者的样品，而在某些实施方案中，受试者是少年、青少年或成人。虽然本公开是在人类受试者的背景下描述的，但是应当理解，所述传感器也可以被配置为分析来自其它动物受试者(即，在“非人”受试者)中的样品，例如但不限于狗、猫、鸟、小鼠、大鼠、豚鼠、黑猩猩、猴子和其它灵长类动物、家畜类和马。在一些实施方案中，感兴趣的乳酸传感器是配置为使得该传感器的至少一部分定位在受试者中的体内传感器。例如，乳酸氧化酶稳定的传感器的全部或一部分可以定位在使用者的皮肤表面之下以直接接触体液，从而在一段时间期间检测和/或监测乳酸。
乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物可以包括电子转移剂。它们可以是可电还原的和可电氧化的离子或分子，其具有在标准甘汞电极(SCE)的氧化还原电位以上或以下几百毫伏的氧化还原电位。所述电子转移剂可以是有机的、有机金属的或无机的。有机氧化还原物质的实例是醌和处于其氧化态的具有醌型结构的物质，例如尼罗蓝和靛酚。有机金属氧化还原物质的实例是茂金属，包括二茂铁。无机氧化还原物质的实例是六氰合铁酸盐(III)，六胺钌等。另外的实例包括在美国专利号6,736,957、7,501,053和7,754,093中描述的那些，其公开内容各自全部通过引用并入本文。尽管任何有机、有机金属或无机氧化还原物质可以与聚合物结合并用作电子转移剂，但是在某些实施方案中，所述电子转移剂是过渡金属化合物或配合物，例如锇、钌、铁和钴化合物或配合物。
在某些实施方案中，电子转移剂具有这样的结构或电荷，所述结构或电荷在样品被分析的时间期间内防止或基本上减少电子转移剂的扩散损失。例如，电子转移剂包括但不限于氧化还原物质，例如结合到聚合物上，该聚合物由此可以设置在工作电极上或附近。氧化还原物质与聚合物之间的键可以是共价键、配位键或离子键。尽管任何有机、有机金属或无机氧化还原物质可以与聚合物结合并用作电子转移剂，但是在某些实施方案中，所述电子转移剂是过渡金属化合物或配合物，例如锇、钌、铁和钴化合物或配合物。感兴趣的电子转移剂以及聚合物结合的电子转移剂的实例包括但不限于美国专利号8,444,834、8,268,143和6,605,201中所述的过渡金属配合物，其公开内容通过整体引用并入本文中。
本文所述的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物是聚合的。可以使用的聚合物可以是支链的或无支链的，并且可以是由单一类型的单体聚合形成的均聚物或包括两种或多种不同类型的单体的杂聚物。杂聚物可以是其中共聚物具有交替单体亚单元的共聚物，或者在一些情况下可以是嵌段共聚物，其包括通过共价键连接的两个或更多个均聚物亚单元(例如二嵌段或三嵌段共聚物)。
在一些实施方案中，主题乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物包括含杂环的聚合物。术语杂环(也称为“杂环基”)在本文中以其常规含义使用，是指包括一个或多个杂原子(即除碳以外的原子)的任何环状部分，并且可以包括但不限于N、P、O、S、Si等。含杂环的聚合物可以是杂烷基，杂链烷基(heteroalkanyl)，杂烯基和杂炔基以及杂芳基或杂芳基烷基。
"杂烷基、杂链烷基、杂烯基和杂炔基”本身或作为另一个取代基的组成部分分别是指烷基、链烷基、烯基和炔基，其中碳原子(和任何相关的氢原子)的一个或多个为独立地被相同或不同的杂原子基团替代。可包括在这些基团中的典型的杂原子基团包括但不限于-O-、-S-、-S-S-、-O-S-、-NR37R38-、＝N-N＝、-N＝N-、-N＝N-NR39R40、-PR41-、-P(O)2-、-POR42-、-O-P(O)2-、-S-O-、-S-(O)-、-SO2-、-SnR43R44-等，其中R37、R38、R39、R40、R41、R42、R43和R44独立地是氢、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳基烷基、取代的芳基烷基、环烷基、取代的环烷基、环杂烷基、取代的环杂烷基、杂烷基、取代的杂烷基、杂芳基、取代的杂芳基、杂芳基烷基或取代的杂芳基烷基。
"杂芳基"本身或作为另一个取代基的一部分是指通过从杂芳族环系统的单个原子上除去一个氢原子而衍生的一价杂芳族基团。典型的杂芳基包括但不限于衍生自如下结构的基团：吖啶，砷杂茚，咔唑，β-咔啉，色满，色烯，噌啉，呋喃，咪唑，吲唑，吲哚，二氢吲哚，吲嗪，异苯并呋喃，异色烯，异吲哚，异二氢吲哚，异喹啉，异噻唑，异噁唑，萘啶，噁二唑，噁唑，萘嵌间二氮杂苯，菲啶，菲咯啉，吩嗪，酞嗪，蝶啶，嘌呤，吡喃，吡嗪，吡唑，哒嗪，吡啶，嘧啶，吡咯，吡呤(pyrrol izine)，喹唑啉，喹啉，喹嗪，喹喔啉，四唑，噻二唑，噻唑，噻吩，三唑，呫吨，苯并间二氧杂环戊烯等。在某些实施方案中，杂芳基是5-20元杂芳基。在某些实施方案中，杂芳基是5-10元杂芳基。在某些实施方案中，杂芳基是衍生自噻吩、吡咯、苯并噻吩、苯并呋喃、吲哚、吡啶、喹啉、咪唑、噁唑和吡嗪的那些。
"杂芳基烷基"本身或作为另一取代基的一部分是指其中与碳原子(典型地为末端或sp3碳原子)键合的氢原子之一被杂芳基替代的无环烷基。当提及具体的烷基部分时，使用命名杂芳基链烷基、杂芳基链烯基和/或杂芳基炔基。在某些实施方案中，杂芳基烷基为6-30元杂芳基烷基，例如，杂芳基烷基的烷基、烯基或炔基部分为1-10元并且杂芳基部分为5-20元杂芳基。在某些实施方案中，杂芳基烷基为6-20元杂芳基烷基，例如，杂芳基烷基的烷基、烯基或炔基部分为1-8元并且杂芳基部分为5-12元杂芳基。
在一些实施方案中，含杂环的成分是芳族环系。“芳环体系”本身或作为另一取代基的一部分是指具有共轭π电子体系的不饱和环或多环环系。具体包括在“芳香环体系”的定义内的是其中一个或多个环为芳族并且一个或多个环为饱和或不饱和的稠合环系，例如芴、茚满、茚、非那烯等。典型的芳族环体系包括但不限于醋蒽烯、苊烯、醋菲烯(acephenanthrylene)、蒽、甘菊环、苯、草屈(chrysene)、晕苯(coronene)、荧蒽(fluoranthene)、芴(fluorene)、并六苯(hexacene)、己芬(hexaphene)、hexalene、不对称引达省(as-indacene)、对称引达省(s-indacene)、茚满、茚、萘、octacene、octaphene、octalene、卵苯(ovalene)、戊-2,4-二烯、戊省(pentacene)、并环戊二烯(pentalene)、pentaphene、二萘嵌苯(perylene)、非那烯(phenalene)、菲、苉(picene)、七曜烯(pleiadene)、芘(pyrene)、皮蒽(pyranthrene)、玉红省(rubicene)、苯并菲、联三萘(trinaphthalene)等。
“杂芳族环系”本身或作为另一个取代基的一部分是指其中一个或多个碳原子(和任何相关的氢原子)独立地被相同或不同的杂原子替代的芳族环系。用于替代碳原子的典型杂原子包括但不限于N、P、O、S、Si等。具体包括在“杂芳环系”的定义中的是稠合环系，其中一个或多个环是杂芳族环的，且一个或多个环是饱和或不饱和的，例如，砷杂茚、苯并二噁英、苯并呋喃、色满、色烯、吲哚、二氢吲哚、呫吨等。典型的杂芳族环系包括但不限于砷杂茚，咔唑，β-咔啉，色满，色烯，噌啉，呋喃，咪唑，吲唑，吲哚，二氢吲哚，吲嗪，异苯并呋喃，异色烯，异吲哚，异二氢吲哚，异喹啉，异噻唑，异噁唑，萘啶，噁二唑，噁唑，萘嵌间二氮杂苯，菲啶，菲咯啉，吩嗪，酞嗪，蝶啶，嘌呤，吡喃，吡嗪，吡唑，哒嗪，吡啶，嘧啶，吡咯，吡呤(pyrrolizine)，喹唑啉，喹啉，喹嗪，喹喔啉，四唑，噻二唑，噻唑，噻吩，三唑，呫吨等。
在某些实施方案中，乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物包括含杂环氮的成分，例如聚乙烯吡啶(PVP)和聚乙烯咪唑的聚合物。
聚合乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物还可以包括一种或多种交联剂(交联剂)，使得聚合物骨架酶组合物是交联的。如本文所述，所涉及的两种或多种不同聚合物连接在一起是分子间交联，而将相同聚合物的两个以上部分连接是分子内交联。在本公开文本的实施方案中，交联剂能够同时具有分子间和分子内交联两者。
适合的交联剂可以是双官能的、三官能的或四官能的，它们各自具有直链或支链结构。具有支链结构的交联剂包括多臂支链成分，例如3-臂支链成分，4-臂支链成分，5-臂支链成分，6-臂支链成分或大量臂支链成分，例如具有7臂或以上，例如8-臂或以上，9-臂或以上，10-臂或以上，且包括15-臂或以上。在某些情况下，多臂支链成分是多臂环氧化物，例如3-臂环氧化物或4-臂环氧化物。当多臂支链成分是多臂环氧化物时，多臂支链成分可以是聚乙二醇(PEG)多臂环氧化物或非聚乙二醇(非PEG)多臂环氧化物。在一些实施方案中，多臂支链成分是非PEG多臂环氧化物。在其它实施方案中，多臂支链成分是PEG多臂环氧化物。在某些实施方案中，多臂支链成分是3-臂PEG环氧化物或4-臂PEG环氧化物。
交联剂的实例包括但不限于聚乙二醇二缩水甘油醚，N,N-二缩水甘油基-4-缩水甘油基氧基苯胺以及具有以下结构的含氮的多官能交联剂：
在一些情况下，可以形成与一种或多种乳酸响应酶、稳定剂和电子转移剂的一个或多个键。所谓键是指允许化学化合物彼此形成缔合的原子或分子之间的任何类型的相互作用，例如但不限于共价键，离子键，偶极-偶极相互作用，氢键，伦敦分散力等。例如，乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物的原位聚合可以在组合物的聚合物和乳酸响应酶、稳定剂和电子转移剂之间形成交联。在某些实施方案中，聚合物与乳酸响应酶、稳定剂和电子转移剂中的一种或多种的交联有利于减少酶组合物从电极分层的发生。
如本文所述，稳定化的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物可以与乳酸传感器一起使用。乳酸传感器可具有一个或多个具有稳定的乳酸响应酶组合物的电极。在实施方案中，所述乳酸传感器包括：具有导电材料的工作电极，主题酶组合物与之临近(例如，设置在其上)并且与导电材料接触。可以包括一个或多个另外的电极，例如一个或多个对电极、一个或多个参比电极和/或一个或多个对电极/参比电极。
电化学传感器的具体构造可以取决于乳酸传感器所针对的用途以及乳酸传感器将操作的条件。在本公开文本的某些实施方案中，乳酸传感器是体内完全定位的乳酸传感器或经皮定位的乳酸传感器，其被配置用于在受试者体内定位。在一个实例中，乳酸传感器的至少一部分可位于皮下组织中以测试间隙液中的乳酸浓度。在另一个实例中，乳酸传感器的至少一部分可以定位于皮肤组织中以便测试皮肤流体中的乳酸浓度。
在实施方案中，一种或多种主题酶组合物位于工作电极表面附近(例如，设置于其上)。在一些情况下，将多种酶组合物置于工作电极表面附近(例如以点的形式)。在某些情况下，在靠近工作电极表面定位的多个酶组合物各自周围形成不连续或连续的周边。在美国专利公开号2012/0150005和共同悬而未决的美国专利申请号62/067,813中描述了多个试剂组合物沉积到电极表面上并且每个试剂组合物周围形成不连续或连续周边的实例，其公开内容在此引入作为参考。
稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物可作为覆盖工作电极的期望部分的一个大应用或以多个稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物的阵列的形式沉积到工作电极的表面上，例如彼此间隔开。根据用途的不同，阵列中的任何或全部酶组合物可以彼此相同或不同。例如，阵列可以在100mm2或以下、例如75mm2或以下或50mm2或以下、例如25mm2或以下或10mm2或以下或5mm2或以下、例如2mm2或以下或1mm2或以下、0.5mm2或以下或0.1mm2或以下的面积中包括2个或以上、5个或以上、10个或以上、25个或以上、50个或以上、100个或以上稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物阵列特征，乃至1000个或以上。
沉积的稳定乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物的形状可以在传感器内或传感器之间变化。例如，在某些实施方案中，沉积的膜是圆形的。在另外的实施方案中，所述形状具有三角形，正方形，矩形，圆形，椭圆形或其它规则或不规则的多边形(例如，当从上面看时)以及其它二维形状，例如圆形、半圆形或新月形状。所述电极的全部或一部分可以被稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物覆盖，例如5％或以上，例如25％或以上，例如50％或以上，例如75％或以上，且包括90％或以上。在某些情况下，整个电极表面被所述酶组合物覆盖(即100％)。
根据本公开文本的实施方案制备电极和/或传感器产生沉积在电极表面上的可再现的稳定乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物。例如，本文提供的酶组合物可以相互偏离5％或以下、例如4％或以下、例如3％或以下、例如2％或以下、例如1％或以下，且包括0.5％或以下。在某些实施方案中，沉积的稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物显示彼此没有偏差并且是相同的。
在某些实施方案中，方法还包括干燥沉积在电极上的稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物。干燥可以根据需要在室温下，在升高的温度下进行，例如在25℃至100℃，例如30℃至80℃，且包括40℃至60℃的温度下进行。
主题乳酸传感器的构造及其制备方法的实例可以包括但不限于如下专利号中所述的那些：美国专利号6,175,752、6,134,461、6,579,690、6,605,200、6,605,201、6,654,625、6,746,582、6,932,894、7,090,756、5,356,786、6,560,471、5,262,035、6,881,551、6,121,009、6,071,391、6,377,894、6,600,997、6,514,460、5,820,551、6,736,957、6,503,381、6,676,816、6,514,718、5,593,852、6,284,478、7,299,082、7,811,231、7,822,557、8,106,780和8,435,682；美国专利申请公开号2010/0198034、2010/0324392、2010/0326842、2007/0095661、2010/0213057、2011/0120865、2011/0124994、2011/0124993、2010/0213057、2011/0213225、2011/0126188、2011/0256024、2011/0257495、2012/0157801、2012/0245447、2012/0157801、2012/0323098和20130116524，其各自的公开内容作为整体引用并入本文。
在一些实施方案中，体内传感器可以包括可定位在皮肤表面下方的插入尖端，例如穿透皮肤并进入例如皮下空间，与使用者的生物流体(例如间隙液)接触。工作电极、参比电极和对电极的接触部分定位于位于皮肤表面上方的传感器的第一部分上。工作电极、参比电极和对电极位于传感器的插入部分。迹线(traces)可以从尖端处的电极提供到配置用于与传感器电子器件连接的触点。
在某些实施方案中，传感器的工作电极和对电极以及介电材料被分层。例如，传感器可以包括非导电材料层以及设置在非导电材料层的至少一部分上的第一导电层，例如导电聚合物，碳，铂-碳，金等(如上所述)。稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物位于工作电极的一个或多个表面上，或者可以直接或间接与工作电极接触。第一绝缘层，例如第一介电层可以设置或层叠在第一导电层的至少一部分上，并且第二导电层可以定位或叠加在第一绝缘层(或介电层)的至少一部分的顶部上。第二导电层可以是参比电极。第二绝缘层，例如第二介电层可以被定位或叠层在第二导电层的至少一部分上。此外，第三导电层可以位于第二绝缘层的至少一部分上，并且可以是对电极。最后，第三绝缘层可以被设置或分层在第三导电层的至少一部分上。按照这种方式，传感器可以被分层，使得每个导电层的至少一部分被相应的绝缘层(例如，介电层)分开。
在另外的实施方案中，电极中的一些或全部可以以共面方式提供，使得两个或多个电极可以位于材料上的同一平面上(例如，并排(例如，平行)或彼此相对成角度)。例如，共面电极可以包括其间的适当间隔和/或包括设置在导电层/电极之间的介电材料或绝缘材料。此外，在某些实施方案中，电极中的一个或多个可以被设置在非导电材料的相对侧上。在这样的实施方案中，电接触可以位于非导电材料的相同或不同的侧面上。例如，电极可以在第一侧上，并且其相应的触点可以在第二侧上，例如连接电极和触点的迹线可以穿过材料。通孔(via)提供了一条通道，通过该通道电迹线被传送到传感器的相对侧。
受试者体内乳酸传感器被配置用于监测在一定时间期间的乳酸水平，所述时间期间范围可以为数秒，数分钟，数小时，数天，数周至数月或更长。适合的温度独立膜可以包括但不限于在美国专利公开号2012/0296186和共同悬而未决的美国专利申请号62/067,813中描述的那些膜，其公开内容通过引用并入本文。
根据某些实施方案的体内乳酸传感器可以被配置成在低氧浓度下操作。所谓低氧浓度是指氧浓度为1.5mg/L或以下、例如1.0mg/L或以下、例如0.75mg/L或以下、例如0.6mg/L或以下、例如0.3mg/L或以下、例如0.25mg/L或以下、例如0.15mg/L或以下、例如0.1mg/L或以下，且包括0.05mg/L或以下。
本公开内容的方面还包括用稳定的乳酸氧化酶体内监测随时间推移变化的乳酸水平的方法。通常，监测受试者身体的流体中乳酸的浓度包括至少部分地在皮肤表面下插入本文公开的乳酸氧化酶/过氧化氢酶体内乳酸传感器，使监测的流体(间质，血液，皮肤等)与插入的乳酸氧化酶/过氧化氢酶传感器接触，并且在工作电极处产生传感器信号。可以显示、存储、转发和/或以其它方式处理由乳酸传感器检测到的乳酸的存在和/或浓度。
可以采用多种方法来使用主题传感器测定乳酸浓度。在某些方面，使用电化学乳酸浓度监测方法。例如，使用传感器信号监测乳酸的浓度可以通过库仑法、安培法、伏安法、电位滴定法或任何其它便利的电化学检测技术来进行。
这些方法还可以结合用于检测和/或测量其它分析物的装置使用，所述分析物包括体液中发现的葡萄糖、氧气、二氧化碳、电解质、或其它感兴趣的成分，例如或其任意的组合，所述体液包括皮下体液，例如间隙液，皮肤流体，血液或其它感兴趣的体液或其任意的组合。
在某些实施方案中，该方法进一步包括将电子单元连接至患者的皮肤，将电子单元的导电触点耦合到乳酸传感器的触点，使用电子单元采集有关来自传感器所生成的信号的乳酸水平的数据，并且将采集的数据从电子单元转发至接收单元，例如通过RF。接收单元可以是移动电话。移动电话可以包括乳酸应用程序。在某些实施方案中，乳酸信息通过RFID方案、蓝牙等来转发。
所述乳酸传感器可以连续地或周期性地定位在使用者中以便进行自动乳酸传感。实施方案可以包括监测乳酸在一定时间期间的水平，所述时间期间范围可以为数秒，数分钟，数小时，数天，数周至数月或更长。未来的乳酸水平可基于所获得的信息来预测，例如，在零时的当前乳酸水平以及乳酸变化率。
传感器电子单元可以自动地将来自乳酸传感器/电子单元的数据转发到一个或多个接收单元。传感器数据可以被自动且周期性地传送，例如在获得数据时或者在存储在存储器中的传感器数据的特定时间段之后的特定频率下。例如，耦合到体内定位的传感器的传感器电子单元可以采集传感器数据预定的时间期间，并周期性地(例如，每分钟，每五分钟或其它预定的时间期间)将所采集的数据传输到在来自传感器电子单元的范围内定位的监测装置。
在其它实施方案中，耦合到体内定位传感器的传感器电子单元可以非自动方式与接收装置通信，并且不设置为任何特定的时间表。例如，可以使用RFID技术将传感器数据从传感器电子单元传送到接收装置，并且每当传感器电子单元进入乳酸监测装置的通信范围内时传送传感器数据。例如，体内定位的传感器可以将传感器数据采集在存储器中，直到监测装置(例如，接收器单元)被置于传感器电子单元的通信范围内，例如由患者或使用者。例如，当监测装置检测到体内定位的传感器时，该装置建立与乳酸传感器电子单元的通信并且上载自最后传送传感器数据以来采集的传感器数据。按照这种方式，患者不必始终维持与接收装置的紧密接近，而是可以在需要时通过将接收装置带入乳酸传感器的范围来上传传感器数据。在其它实施方案中，在某些实施方案中可以实现传感器数据的自动和非自动传送的组合。例如，传感器数据的传送可以在进入通信范围时启动，并且如果继续保持在通信范围内则以自动为基础继续传送。
本公开文本的方面包括用于制备用于乳酸传感器的具有稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物的电极的方法。实施方案包括形成电极并将稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物置于电极附近。一些实施方案包括将导电层施加到非导电材料的表面，移除导电层的一部分以便在材料的表面上限定电极，移除电极的边界内的导电层中的至少一部分以便在具有不完全周边的电极上形成区域，并将稳定的乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物沉积在电极的酶组合物的边界内。
具体实施方式
举出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的实施方案的完整的公开内容和描述，并且发明人无意于限制其发明的范围，也无意于表示下面的实验是所进行的全部或仅有的实验。已经尝试确保所使用的数字(例如数量、温度等)的准确性，但是应当考虑到一些实验误差和偏差。除非另有指，否则份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，且压力是在大气压下或接近大气压。
实施例1
进行实验来证明在存在和不存在过氧化氢酶的情况下乳酸氧化酶传感器的性能。通过在电极表面上沉积具有乳酸氧化酶和聚合物结合的锇-过渡金属催化剂和双官能交联剂的试剂组合物来制备乳酸传感器，如以下方案所示：
在33℃下、1％氧气气氛中，在包含5mM乳酸的磷酸盐缓冲液中测试乳酸传感器。温度由带有数字温度控制器的水循环系统控制。
图1显示了对于包括具有乳酸氧化酶、聚合物结合的过渡金属配合物和交联剂的酶组合物的三种不同乳酸传感器在60个连续小时过程中传感器信号输出的稳定性。如图1中所示，乳酸传感器在使用3小时后开始表现出传感器输出下降，并且显示出信号输出显著和持续下降，直到达到60小时为止，即它们不稳定。在乳酸传感器与乳酸接触60小时的过程中，乳酸传感器表现出大于70％的信号输出下降。
实施例2
进行实验以比较具有和不具有过氧化氢酶的乳酸传感器与乳酸氧化酶组合物的性能。如上述实施例1中所述制备缺乏稳定剂的传感器。通过将具有乳酸氧化酶、稳定剂过氧化氢酶和聚合物结合的锇-过渡金属催化剂和双官能交联剂的试剂组合物沉积在电极表面上来制备具有包括过氧化氢酶的酶组合物的传感器，如以下方案中所示：
在33℃下和1％氧气气氛中测试在包含乳酸的磷酸盐缓冲液中的每种乳酸传感器。温度由带有数字温度控制器的水循环系统控制。
图2显示了在校准研究期间从每个传感器输出的信号，其示例了传感器对乳酸浓度从1mM到5mM逐步变化的响应。缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器对乳酸浓度的每次增加都表现出较小的信号响应，并且随着时间的推移总体信号输出低于包含过氧化氢酶的传感器。具有过氧化氢酶作为酶组合物的组成部分的乳酸传感器与不存在过氧化氢酶的乳酸传感器相比，在乳酸浓度的每次增加时的信号响应都显示出较大的变化，并且随着时间推移具有更高的总体信号输出。
图3显示了作为乳酸浓度的函数的传感器信号输出的直线性。缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器表现出较低的斜率，这表明这些乳酸传感器的灵敏度低于包括乳酸氧化酶/过氧化氢酶组合物的传感器。具有过氧化氢酶作为酶组合物的组成部分的乳酸传感器表现出比缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器大以至达到近3倍的斜率。
图4显示了对于三种缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器和三种具有过氧化氢酶作为酶组合物组成部分的乳酸传感器在连续60个小时的过程中传感器信号输出的稳定性。如图4中所示，缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器在使用3小时后开始表现出传感器输出下降，并且显示信号输出显著和持续下降直至达到60小时为止。缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器在乳酸传感器与乳酸接触60小时的过程中表现出大于70％的信号输出的下降。相反，具有过氧化氢酶作为乳酸氧化酶组合物的组成部分的乳酸传感器在60小时的测试中表现出显著较低的信号输出下降(8％)。
表1中提供了缺乏过氧化氢酶的乳酸传感器与具有过氧化氢酶作为酶组合物组成部分的乳酸传感器之间的比较的概括。
表1
无过氧化氢酶的传感器 具有过氧化氢酶的传感器
斜率 2.2 6.4
R2 0.9651 0.9947
60小时后的信号降低 -71％ -8％

Claims (64)

1.包含酶组合物的乳酸传感器，所述酶组合物包含：
乳酸响应酶；和
稳定剂，该稳定剂以足以提供连续60小时或以上变化10％或以下的传感器信号的方式稳定所述乳酸响应酶。
2.权利要求1的乳酸传感器，其中所述乳酸响应酶是乳酸氧化酶。
3.权利要求1-2任一项的乳酸传感器，其中所述稳定剂是酶。
4.权利要求3的乳酸传感器，其中所述酶是过氧化氢酶。
5.权利要求1-4任一项的乳酸传感器，其中所述酶组合物包含含有杂环的聚合物和交联剂。
6.权利要求5的乳酸传感器，其中所述乳酸响应酶和稳定剂在所述聚合物内交联。
7.权利要求5的乳酸传感器，其中所述乳酸响应酶和稳定剂与所述聚合物共价键合。
8.权利要求1-7任一项的乳酸传感器，其中所述稳定剂以足以提供连续168小时或以上变化10％或以下的传感器信号的方式稳定所述乳酸响应酶。
9.权利要求8的乳酸传感器，其中所述稳定剂以足以提供连续168小时或以上变化5％或以下的传感器信号的方式稳定所述乳酸响应酶。
10.权利要求1-9任一项的乳酸传感器，其中所述稳定剂提高传感器对乳酸的灵敏度。
11.权利要求10的乳酸传感器，其中所述稳定剂将提高后的传感器对乳酸的灵敏度维持连续60个小时或以上。
12.权利要求11的乳酸传感器，其中与不包括该稳定剂的乳酸传感器相比所述稳定剂将传感器的灵敏度提高10％或以上。
13.权利要求1-12任一项的乳酸传感器，其中所述酶组合物还包含电子转移剂。
14.权利要求13的乳酸传感器，其中所述电子转移剂是包含锇的配合物。
15.权利要求13的乳酸传感器，其中所述电子转移剂与所述聚合物共价键合。
16.权利要求1-15任一项的乳酸传感器，其中所述乳酸传感器包含工作电极和对电极。
17.权利要求16的乳酸传感器，其中所述酶组合物被接近于工作电极定位。
18.权利要求17的乳酸传感器，其中所述酶组合物被固定至所述工作电极。
19.包含酶组合物的乳酸传感器，所述酶组合物包含：
乳酸响应酶；和
稳定剂，该稳定剂以足以提高传感器对乳酸的灵敏度的方式稳定所述乳酸响应酶。
20.权利要求19的乳酸传感器，其中与不包括该稳定剂的乳酸传感器相比所述稳定剂将传感器对乳酸的灵敏度提高10％或以上。
21.权利要求19-20任一项的乳酸传感器，其中所述稳定剂将提高后的传感器对乳酸的灵敏度维持连续60个小时或以上。
22.权利要求19-21任一项的乳酸传感器，其中所述稳定剂提供连续60个小时或以上的变化为10％或以下的传感器信号。
23.权利要求19-22任一项的乳酸传感器，其中所述乳酸响应酶是乳酸氧化酶。
24.权利要求19-23任一项的乳酸传感器，其中所述稳定剂是酶。
25.权利要求24的乳酸传感器，其中所述酶是过氧化氢酶。
26.权利要求19-25任一项的乳酸传感器，其中所述酶组合物包含含有杂环的聚合物和交联剂。
27.权利要求26的乳酸传感器，其中所述乳酸响应酶和稳定剂在所述聚合物内交联。
28.权利要求26的乳酸传感器，其中所述乳酸响应酶和稳定剂与所述聚合物共价键合。
29.权利要求19-28任一项的乳酸传感器，其中所述酶组合物还包含电子转移剂。
30.权利要求29的乳酸传感器，其中所述电子转移剂是包含锇的配合物。
31.权利要求29的乳酸传感器，其中所述电子转移剂与所述聚合物共价键合。
32.权利要求19-31任一项的乳酸传感器，其中所述乳酸传感器包含工作电极和对电极。
33.权利要求32的乳酸传感器，其中所述酶组合物被接近于工作电极定位。
34.权利要求33的乳酸传感器，其中所述酶组合物被固定至所述工作电极。
35.用于监测受试者中乳酸水平的方法，该方法包含：
将权利要求1-34任一项的乳酸传感器的至少一部分定位入受试者皮肤；和
在一段时间期间根据由所述乳酸传感器生成的信号测定乳酸水平，
其中所述在一段时间期间的测定提供对受试者中乳酸水平的监测。
36.权利要求35的方法，其中配置所述乳酸传感器，使得来自该乳酸传感器的信号作为乳酸浓度的函数呈线性提高。
37.权利要求35的方法，其中配置所述乳酸传感器，以便在所述乳酸传感器定位于皮肤中的30秒内提供临床上精确的乳酸浓度。
38.权利要求35的方法，其中配置所述乳酸传感器，以便在所述乳酸传感器定位于皮肤中之后即刻提供临床上精确的乳酸浓度。
39.权利要求35的方法，其中配置所述乳酸传感器，以便提供乳酸浓度值的95％，该值在根据血液乳酸确定的相应乳酸浓度值的25％范围内。
40.权利要求35的方法，其中配置所述乳酸传感器，以便在0.6g/L或以下的氧浓度下提供临床上精确的乳酸浓度。
41.权利要求34的方法，其中配置所述乳酸传感器，以便在0.3g/L或以下的氧浓度下提供临床上精确的乳酸浓度。
42.酶组合物，包含：
乳酸响应酶；和
稳定所述乳酸响应酶的稳定剂；和
包含含有杂环的成分的聚合物和交联剂。
43.权利要求42的酶组合物，其中所述稳定剂降低所述乳酸响应酶的催化活性变化达连续60个小时或以上。
44.权利要求42的酶组合物，其中所述稳定剂防止所述乳酸响应酶的催化活性变化达连续60个小时或以上。
45.权利要求42-44任一项的酶组合物，其中所述稳定剂是酶。
46.权利要求45的酶组合物，其中所述酶是过氧化氢酶。
47.权利要求42-46任一项的酶组合物，其中所述乳酸响应酶是乳酸氧化酶。
48.权利要求42-47任一项的酶组合物，其中所述乳酸响应酶和稳定剂在所述聚合物内交联。
49.权利要求42-47任一项的酶组合物，其中所述乳酸响应酶和稳定剂与所述聚合物共价键合。
50.权利要求42-49任一项的酶组合物，还包含电子转移剂。
51.权利要求50的酶组合物，其中所述电子转移剂是包含锇的配合物。
52.权利要求50的酶组合物，其中所述电子转移剂与所述聚合物共价键合。
53.制备电极的方法，该方法包含：
将导电材料施加到材料的表面以形成导电层；和
沉积包含乳酸响应酶和稳定该乳酸响应酶的稳定剂的试剂。
54.权利要求53的方法，其中所述稳定剂降低所述乳酸响应酶的催化活性变化达连续60个小时或以上。
55.权利要求54的方法，其中所述稳定剂防止所述乳酸响应酶的催化活性变化达连续60个小时或以上。
56.权利要求53-55任一项的方法，其中所述稳定剂是酶。
57.权利要求56的方法，其中所述酶是过氧化氢酶。
58.权利要求53-57任一项的方法，其中所述乳酸响应酶是乳酸氧化酶。
59.权利要求53-58任一项的方法，其中所述试剂包含含有杂环的聚合物和交联剂。
60.权利要求59的方法，其中所述乳酸响应酶和稳定剂在所述聚合物内交联。
61.权利要求59的方法，其中所述乳酸响应酶和稳定剂与所述聚合物共价键合。
62.权利要求53-61任一项的方法，其中所述试剂还包含电子转移剂。
63.权利要求62的方法，其中所述电子转移剂是包含锇的配合物。
64.权利要求62的方法，其中所述电子转移剂与所述聚合物共价键合。
CN201680035003.6A 2015-06-15 2016-06-15 稳定的乳酸响应酶、电极和传感器以及制备和使用它们的方法 Pending CN107735027A (zh)

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