CN113311152A - 一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，该方法在金纳米粒子介导下，通过富集引发链DNA并进行杂交链(HCR)反应，HCR产物上的生物素与链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶结合并快速催化多巴胺转化为聚多巴胺，从而吸附溶液中具有磁信号的Fe3+导致上清液的横向磁弛豫时间发生变化。该传感器通过金纳米颗粒、HCR反应以及聚多巴胺的三重信号放大，实现了pg级的分析检测，解决了传统磁弛豫时间传感器灵敏度低，稳定性差等问题。

Description

一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法
技术领域
本发明属于检测分析领域，涉及一种磁弛豫传感免疫分析方法，尤其是一种三重信号放大的磁弛豫传感免疫分析方法。
背景技术
基于磁性纳米粒子的磁弛豫(magnetic relaxation switching,MRS)传感器因其信噪比高、背景干扰少、操作方便、预处理过程简单的优点在生化分析中得到了广泛的应用，其原理是基于生物分子之间的相互作用来改变磁性纳米颗粒(magneticnanoparticles,MNPs)的状态(通常是分散状态变为聚集状态或MNPs的数量减少)，从而改变周围环境中水分子质子的横向弛豫时间(T2)。将T2的变化值作为信号输出，以达到检测复杂样品中目标物的目的。但是，由于缺乏有效的信号放大系统，传统的MRS传感器灵敏度低，无法有效检测痕量物质。而且，传统MRS传感器基于生物分子之间的相互作用导致MNPs状态的改变，MNPs的状态变化是可逆的，所以会导致MRS的稳定性较差。因此，有效的信号放大系统和稳定的信号读出方式是提高MRS传感器分析性能的两个关键因素。最近，研究发现通过使用氧化还原反应改变顺磁离子的价态，可以使纵向弛豫时间(T1)或T2信号产生变化，由此开发了一系列用于生化分析的顺磁离子介导的MRS传感器。顺磁离子产生的磁信号比MNPs产生的磁信号更稳定，因此检测结果更准确。但是，顺磁离子介导的MRS传感器的灵敏度仍比较低，还是无法检测痕量物质。
盐酸多巴胺(DA)是一种具有邻苯二酚和胺的生物分子，可在空气中发生自聚形成聚多巴胺。聚多巴胺(PDA)具有良好的稳定性和生物相容性，很适合作为表面改性剂附着在有机和无机材料的表面上。PDA上的邻苯二酚配体还显示出与某些金属离子产生强相互作用的配位键。例如在纤维素纳米晶体上修饰PDA(PDA@CNC)，该探针遇到Fe3+后，将通过PDA和Fe3+的配位键作用使Fe3+快速聚结，因此对Fe3+具有很好的吸附能力。此外，辣根过氧化物酶(HRP)可以显著促进DA的自聚合(提高约100倍)。因此，我们使用HRP催化DA转化为PDA以吸附Fe3+，从而导致上清液中Fe3+数量发生极大的变化，而磁信号(T2)与Fe3+数量成正相关，进而进行信号读出及放大。
近年来，各种核酸信号扩增策略层出不穷，并被应用到分析和检测领域。其中，支点介导的链置换反应，包括催化发夹自组装(CHA)、杂交链反应(HCR)和无酶信号放大的熵驱动策略最引人注目。因为其具备反应条件温和，来源广泛，价格便宜且易于获得的优势。引发链DNA(iDNA)可以触发HCR反应，形成长DNA双链产物。因此本发明使用金纳米颗粒(AuNPs)富集iDNA，再通过HCR产物富集HRP，最后利用HRP催化DA转变为PDA对Fe3+进行吸附，以实现三重信号放大，显著提高MRS传感器的灵敏度。
在本发明中，开发了一种基于金纳米颗粒(AuNPs)介导的三重自组装级联信号放大(TC-MRS)的MRS传感器。在此，AuNPs通过偶联抗体和iDNA形成Ab-AuNPs-iDNA检测探针，该过程富集了iDNA，形成第一重信号放大。在存在目标物的情况下，目标物与固定在酶标板底部的完全抗原竞争结合Ab-AuNPs-iDNA，Ab-AuNPs-iDNA可以打开由生物素修饰的两个稳定的DNA发夹(bio-H1和bio-H2)，以触发HCR反应产生长HCR产物，实现第二重信号放大。较长的HCR产物能与更多的辣根过氧化物酶-链霉亲和素(HRP-SA)结合，以快速催化DA转化为PDA，实现第三重信号放大。本项目将顺磁离子Fe3+作为磁信号探针，相较于磁性纳米颗粒，Fe3+不仅在水溶液中保持稳定且均匀，而且由于电子结构(半填充的d轨道和长的电子自旋弛豫)可以对周围的水分子质子产生强烈的影响。Fe3+通过PDA被吸附到酶标板底部，从而导致上清液中Fe3+的数量发生变化，T2信号随之发生显著变化，通过低场核磁共振分析仪快速测量。TC-MRS由于具有三重信号放大策略而具有很高的检测灵敏度，并且由于特异性的抗体-抗原相互作用而具有很高的特异性。与通过生物分子相互作用的传统MRS信号读取相比，该方法稳定性、灵敏度显著提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，该方法在金纳米粒子介导下，通过富集iDNA并进行HCR反应，HCR产物上的生物素与HRP-链霉亲和素上的链霉亲和素(SA)结合并快速催化DA转化为PDA，从而吸附Fe3+导致上清液的T2信号变化。该传感器通过金纳米颗粒、HCR反应以及PDA的三重信号放大，实现了pg级的分析检测，解决了传统磁弛豫时间传感器灵敏度低，稳定性差等问题。
为达到上述目的，本发明使用了以下技术手段：
一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，包括以下步骤：
1)在酶标板上包被待测物完全抗原并进行封闭；
2)洗涤酶标板后加入待测物溶液和金纳米颗粒(AuNPs)，室温下进行免疫反应，所述金纳米颗粒上偶联有待测物单克隆抗体(Ab)和用于进行杂交链反应的引发链DNA(iDNA)；
3)洗涤酶标板后加入生物素(bio)修饰的两个寡聚核苷酸DNA发夹(bio-H1和bio-H2)，室温下进行杂交链反应(HCR)；
4)洗涤酶标板后加入链霉亲和素(SA)标记的辣根过氧化物酶(HRP)，室温下进行生物识别反应；
5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺(DA)，DA在辣根过氧化物酶(HRP)催化下生成聚多巴胺(PDA)；
6)洗涤酶标板后加入Fe3+溶液，室温下进行吸附反应；
7)取上清液，用低场核磁共振分析仪测定横向弛豫时间T2并对目标物进行定性和定量分析。
本发明的检测原理如下：首先，通过构建Ab-AuNPs-iDNA探针，iDNA被AuNPs富集，实现了第一次信号倍增。竞争免疫后，不同数量的与酶标板结合的Ab-ANPs-iDNA引发HCR反应，HCR产物中的许多生物素可以通过生物素-链霉亲和素相互作用来富集更多的HRP-SA，以实现第二次信号倍增。HRP-SA的富集可将DA快速转换为PDA，以进行第三次信号增强。Fe3+通过与PDA形成配位键被吸附到酶标板底部时，上清液中的Fe3+数量大大减少，从而导致显著的T2信号变化值(ΔT2＝T2样品-T2空白)。ΔT2与目标物含量成正比，目标物越多，ΔT2值越大；反之，ΔT2值越小。
优选地，所述引发链DNA的核苷酸序列为H2N-AAAAAAAAAAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA，所述两个生物素修饰的寡聚核苷酸DNA发夹的序列为bio-H1：biotin-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAA；bio-H2：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-biotin。
所述金纳米颗粒上偶联的待测物单克隆抗体量为10-50μg，优选为30μg。
所述金纳米颗粒上偶联的引发链DNA量为0.1-1nmol，优选为0.5nmol。
所述生物素修饰的两个DNA发夹的浓度为0.1-1μM，优选为0.5μM。
所述盐酸多巴胺溶液的浓度为5-50mM，优选为25mM。
所述Fe3+溶液的浓度为0.1-1mM，优选为0.2mM。
优选地，链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶的稀释倍数为1：1000-10000。
所述待测物为毒死蜱，当然，根据本发明的检测原理，本发明适用的检测对象不局限于毒死蜱，还可以为其它小分子物质如抗生素等，以及大分子物质如炎症标志物降钙素原等。当进行其它物质检测时，仅需对检测条件进行适当调整即可。
本发明的有益效果是：
(1)灵敏度高。本发明利用金纳米颗粒作为介导，结合了HCR反应和生物素-链霉亲和素体系，以及聚多巴胺对Fe3+的较强的吸附作用，实现了信号的三重放大和读出。与传统的磁弛豫免疫传感器相比，本发明的检测限降低了一个数量级，达到了pg/mL，因此具有很高的检测灵敏度和更宽的检测范围。
(2)稳定性强。本发明的检测信号不依赖于磁性纳米颗粒(MNPs)的状态改变，Fe3+数量变化导致的T2信号改变更加稳定，从而使检测结果更准确。
(3)本发明不仅能够针对痕量小分子物质如毒死蜱进行检测，还可以对大分子物质如降钙素原进行检测，能够用于多种目标物检测，具有应用范围广的特点。
(4)本发明与常规的仪器检测法相比，操作更加简单，所用材料容易获得，检测中仅需使用一台低场核磁共振分析仪，不依赖精密、昂贵的大型仪器，为现场即时检测提供了可能。
附图说明
图1示出了AuNPs的TEM图谱。
图2示出了AuNPs与Ab及iDNA发生反应后的粒径分布图。
图3示出了AuNPs与Ab及iDNA发生反应后的电位变化图。
图4示出了不同浓度HRP-SA与盐酸多巴胺转变速率之间的关系。
图5示出了HRP-SA催化盐酸多巴胺的特异性。
图6示出了iDNA的量与HCR反应之间的关系。
图7示出了三重信号放大磁弛豫传感器T2值的改变量与Ab-AuNPs-iDNA用量之间的响应关系。
图8示出了三重信号放大磁弛豫传感器的Ab浓度优化结果。
图9示出了三重信号放大磁弛豫传感器的iDNA用量优化结果。
图10示出了三重信号放大磁弛豫传感器的bio-H1和bio-H2浓度优化结果。
图11示出了三重信号放大磁弛豫传感器的盐酸多巴胺浓度优化结果。
图12示出了三重信号放大磁弛豫传感器的Fe3+浓度优化结果。
图13示出了三重信号放大磁弛豫传感器检测毒死蜱的标准曲线和线性范围。
图14示出了三重信号放大磁弛豫传感器检测不同农药的T2值改变量。
图15示出了传统磁弛豫传感器检测毒死蜱的标准曲线和线性范围。
图16示出了ELISA方法检测毒死蜱的标准曲线和线性范围。
图17示出了基于聚多巴胺信号放大的磁弛豫免疫传感器检测毒死蜱的标准曲线和线性范围。
具体实施方式
下面以毒死蜱为例进一步说明本发明，但是本领域技术人员应当理解，这些实施例仅仅是用于解释本发明，而不应用于以任何形式限制本发明的保护范围。
实施例中使用的试剂、材料、溶液和仪器如下：
试剂和材料：毒死蜱标准品，毒死蜱单克隆抗体(5.2mg/mL)，毒死蜱完全抗原(3.7mg/mL)均购自山东绿都科技有限公司(中国，山东)；链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP-SA)购自Sigma-Aldrich公司(USA)；金纳米颗粒(AuNPs)、牛血清蛋白(BSA)均购自Sigma-Aldrich公司(中国，上海)；氯化铁购自西龙化工公司(中国，广州)；试验所用水均为超纯水；所有DNA寡聚核苷酸均购自Sangon Biological Engineering Technology&Services Co.Ltd(中国，上海)并由其纯化。序列如下(序列5′-3′)：
iDNA：H2N-AAAAAAAAAAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA；
bio-H1：biotin-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTG；
bio-H2：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-biotin；
溶液配制：
碳酸盐缓冲液(CBS)：取1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，溶于1000mL水中，摇匀。
磷酸盐缓冲液(PBS)：取8.00g NaCl，0.20g KCl，0.20g KH2PO4和2.90gNa2HPO4·12H2O溶于1000mL水中，摇匀；
Tris-HCl缓冲液：先配置同样浓度的三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液和HCl溶液，将两者混匀后加水稀释；
洗涤液：在配制好的1000mL PBS缓冲液中加入0.5mL吐温-20，摇匀，配成PBST洗涤液；
毒死蜱标准品使用甲醇溶解，毒死蜱单克隆抗体溶液、毒死蜱完全抗原溶液、均使用PBS缓冲液配置，然后于4℃保存。
盐酸多巴胺溶液：用含有2％过氧化氢(1M)的Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝8.5)配置不同浓度的盐酸多巴胺溶液，使用前配置，不可久放。
仪器：场发射透射电子显微镜(JEM-2100F，日本)用于表征金纳米颗粒；激光粒度分析仪(马尔文仪器有限公司，英国)用于测量金纳米颗粒的粒度分布和电位变化；0.47T小型低场核磁共振仪购自苏州纽迈分析仪器股份有限公司，用于测量横向弛豫时间(T2)。
实施例1金纳米粒子偶联前后的表征结果
取pH为8.0的AuNPs溶液2mL(浓度0.5mg/mL)，加入毒死蜱单克隆抗体(200μL，0.15mg/mL)在37℃条件下反应60min；之后加入iDNA(1μM，500μL)在4℃条件下反应16h；然后在上述混合液中加入3mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.2)在4℃条件下继续反应24h；最后将上述混合溶液离心(9500r/min，40min，4℃)，用PBST洗涤3次。对金纳米粒子进行TEM、粒径及电位表征，结果如图1至图3所示，偶联后金纳米颗粒吸收光谱及粒径发生了变化，表明Ab-AuNPs-iDNA制备成功。
该条件下金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg、iDNA量为0.5nmol，通过加入不同量的单克隆抗体和iDNA，即可得到不同偶联量的金纳米颗粒。
实施例2三重信号放大磁弛豫传感器对Fe3+状态的改变
取制备好的Ab-AuNPs-iDNA 200μL(浓度0.5mg/mL)与bio-H1、bio-H2(50μL，0.5μM)混匀，在37℃条件下反应90min；之后加入100μL不同稀释比的HRP-SA(稀释比1:1000，1：10000)继续在37℃下反应不同时间(0、2、5、10、20、30min)；再在上述混合液中添加100μL25mM的盐酸多巴胺溶液，37℃下反应10min。结果如图4所示，HRP-SA越多，盐酸多巴胺转化为聚多巴胺的速率越快。而且当用链霉亲和素标记的碱性磷酸酶(ALP-SA)代替HRP-SA时，其无法促进盐酸多巴胺转变为聚多巴胺的速率，故Fe3+状态未发生改变，表明了它具有很高的特异性(图5)。通过凝胶电泳也证明了iDNA触发了HCR反应，前3个泳道分别为iDNA、bio-H1和bio-H2；第4泳道出现滞后带说明触发HCR反应；减少iDNA浓度，第5泳道的滞后带变浅，说明iDNA的量与HCR产物的量有直接关系(图6)。
取不同体积的Ab-AuNPs-iDNA溶液，加入bio-H1、bio-H2(50μL，0.5μM)，37℃条件下反应90min；混合液中再加入100μL稀释比为1：1000的HRP-SA，37℃条件下反应10min；再加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液，37℃下反应10min。反应完成后，向其中加入Fe3+溶液(0.2mM，200μL)，37℃下反应10min。反应结束后，取上清液测量T2值。结果如图7所示，T2值的变化量随着Ab-AuNPs-iDNA的增加而减小，说明Ab-AuNPs-iDNA会使Fe3+状态发生改变。
实施例3检测条件的优化
在酶标板上包被毒死蜱完全抗原并进行封闭，然后加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液和同体积的Ab-AuNPs-iDNA溶液(金纳米颗粒上偶联的Ab量分别为10、20、30、40μg、iDNA的量为0.5nmol)，37℃条件下反应20min；洗涤三次后，加入50μL0.5μM的bio-H1和bio-H2继续在37℃条件下反应90min；洗涤三次后，再加入稀释倍数为1：1000的HRP-SA 100μL继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入200μL0.2mM的Fe3+溶液继续在37℃条件下反应10min；取上清液进行T2值检测以优化Ab用量。结果如图8所示，当金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg时，该三重信号放大磁弛豫传感器具有最优的响应效果。
在酶标板上包被毒死蜱完全抗原并进行封闭，然后加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液和同体积的Ab-AuNPs-iDNA溶液(金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg、iDNA的量分别为0.1、0.2、0.5、0.8nmol)，37℃条件下反应20min；洗涤三次后，加入50μL 0.5μM的bio-H1和bio-H2继续在37℃条件下反应90min；洗涤三次后，再加入稀释倍数为1：1000的HRP-SA100μL继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入200μL 0.2mM的Fe3+溶液继续在37℃条件下反应10min；取上清液进行T2值检测以优化iDNA用量。结果如图9所示，当金纳米颗粒上的iDNA量为0.5nmol时，该三重信号放大磁弛豫传感器具有最优的响应效果。
在酶标板上包被毒死蜱完全抗原并进行封闭，然后加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液和同体积的Ab-AuNPs-iDNA溶液(金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg、iDNA的量为0.5nmol)，37℃条件下反应20min；洗涤三次后，加入50μL不同浓度的bio-H1和bio-H2(0.1、0.2、0.5、1μM)继续在37℃条件下反应90min；洗涤三次后，再加入稀释倍数为1：1000的HRP-SA 100μL继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入200μL 0.2mM的Fe3+溶液继续在37℃条件下反应10min；取上清液进行T2值检测以优化bio-H1和bio-H2浓度。结果如图10所示，当bio-H1和bio-H2的浓度为0.5μM时，该三重信号放大磁弛豫传感器具有最优的响应效果。
在酶标板上包被毒死蜱完全抗原并进行封闭，然后加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液和同体积的Ab-AuNPs-iDNA溶液(金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg、iDNA的量为0.5nmol)，37℃条件下反应20min；洗涤三次后，加入50μL 0.5μM的bio-H1和bio-H2继续在37℃条件下反应90min；洗涤三次后，再加入稀释倍数为1：1000的HRP-SA 100μL继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入100μL不同浓度的盐酸多巴胺溶液(5、10、25、50mM)继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入200μL 0.2mM的Fe3+溶液继续在37℃条件下反应10min；取上清液进行T2值检测以优化盐酸多巴胺浓度。结果如图11所示，当盐酸多巴胺溶液的浓度为25mM时，该三重信号放大磁弛豫传感器具有最优的响应效果。
在酶标板上包被毒死蜱完全抗原并进行封闭，然后加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液和同体积的Ab-AuNPs-iDNA溶液(金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg、iDNA的量为0.5nmol)，37℃条件下反应20min；洗涤三次后，加入50μL 0.5μM的bio-H1和bio-H2继续在37℃条件下反应90min；洗涤三次后，再加入稀释倍数为1：1000的HRP-SA 100μL继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入100μL 25mM的盐酸多巴胺溶液继续在37℃条件下反应10min；洗涤五次后，加入200μL不同浓度的Fe3+溶液(0.1、0.2、0.5、1mM)继续在37℃条件下反应10min；取上清液进行T2值检测以优化Fe3+溶液的浓度。结果如图12所示，当Fe3+溶液的浓度为0.2mM时，该三重信号放大磁弛豫传感器具有最优的响应效果。
从以上结果可以得出，金纳米颗粒上偶联的Ab量为30μg、iDNA量为0.5nmol；反应体系中bio-H1和bio-H2的浓度为0.5μM，盐酸多巴胺浓度为25μM，Fe3+溶液浓度为0.2mM时该三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法效果最优。
实施例4三重信号放大磁弛豫传感器对毒死蜱检测
(1)包被：96孔酶标板中包被100μL 1μg/mL的毒死蜱完全抗原，4℃过夜，采用PBST洗涤。
(2)封闭：用260μL 5％牛血清白蛋白(BSA)进行封闭(37℃，1小时)，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩去，用吸水纸拍干后加入洗涤液250μL/孔，洗涤三次，每次3min(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破)。
(3)竞争免疫反应：洗涤孔板后，于对应的孔中加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液，然后加入100μL Ab-AuNPs-iDNA溶液(含毒死蜱单克隆抗体30μg、iDNA 0.5nmol)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后37℃条件下反应20min。
(4)加寡聚核苷酸：洗涤孔板后，于对应的孔中加入50μL 0.5μM的bio-H1和bio-H2，在37℃条件下反应90min。
(5)加链霉亲和素标记的HRP：洗涤孔板后，于对应的孔中加入稀释倍数为1：1000的HRP-SA 100μL，继续在37℃条件下反应10min。
(6)催化反应：洗涤5次后，向孔板中加入100μL盐酸多巴胺溶液(25mM)，37℃反应15min。
(7)磁弛豫时间检测：洗涤5次后，向孔板中加入200μL 0.2mM的Fe3+溶液在37℃条件下反应10min后，取上清液进行T2值检测。
实验结果如图13所示，以不含毒死蜱时的T2值为参照，T2值的改变量随着毒死蜱溶液的浓度增加而逐渐增大，结果表示该方法在对毒死蜱的检测中具有很好的灵敏度及宽的线性范围。
实施例5三重信号放大磁弛豫传感器检测毒死蜱的特异性
步骤(3)中，洗涤孔板后，于对应的空中加入100μL克百威(50pg/mL)、100μL杀螟丹(50pg/mL)、100μL涕灭威(50pg/mL)、100μL毒死蜱(50pg/mL)，然后加入100μL Ab-AuNPs-iDNA溶液，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后37℃条件下反应20min。
其它检测步骤均与实施例4相同。
实验结果如图14所示，毒死蜱对应的T2值的改变量差异显著，其余农药对应的T2值的改变量很小，表明该方法对毒死蜱的检测具有良好的特异性。
实施例6三重信号放大磁弛豫传感器检测毒死蜱的加标回收率
步骤(3)中，洗涤孔板后，于对应的孔板中加入100μL加标水果样品提取液，然后加入100μL Ab-AuNPs-iDNA溶液，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后37℃条件下反应20min。
其它检测步骤均与实施例3相同。
试验结果如表1所示，水果样品中不同毒死蜱平均回收率和相对标准偏差表明该方法对毒死蜱检测具有良好的准确性和精密度。
表1水果中不同毒死蜱加标水平的平均回收率和相对标准偏差
Figure BDA0003053855530000101
实施例7本发明与常规检测方法的灵敏度比较
(一)三重信号放大磁弛豫传感器检测毒死蜱
方法与实施例4相同。实验结果如图13所示。
(二)传统磁弛豫传感器检测毒死蜱
(1)将30nm羧基磁颗粒表面偶联上毒死蜱完全抗原。
(2)在酶标板中包被毒死蜱捕获抗体，并进行封闭。在孔中分别加入100μL不同浓度的(0、0.01、0.1、1、5、10、50、100、500、1000、5000、10000ng/mL)毒死蜱标准溶液，37℃反应20min。
(3)反应结束后测定上清液的T2值。实验结果如图15所示。
(三)ELISA方法检测毒死蜱
步骤(1)、(2)与实施例4相同。
(3)免疫反应：洗涤孔板后，于对应的孔中加入100μL不同浓度的毒死蜱标准溶液，然后加入100μL毒死蜱酶标抗体溶液(1μg/mL)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)下反应20min。
(5)显色：加入TMB显色液100μL/孔，置室温(25±2℃)避光环境中反应15min。
(6)测定：加入终止液50μL/孔，轻轻震荡混匀，设定酶标仪于450nm处检测，在5min内读完数据，测定每孔OD值。试验结果如图16所示。
(四)基于聚多巴胺信号放大的磁弛豫免疫传感器检测毒死蜱
步骤(1)、(2)与实施例4相同。
(3)免疫反应：洗涤孔板后，于对应的孔中加入100μL不同浓度梯度的毒死蜱溶液，然后加入100μL毒死蜱单克隆抗体溶液(1μg/mL)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)下反应20min。
(4)加酶标二抗：反应之后洗涤3次，向孔板中加入100μL HRP标记的羊抗鼠IgG(1:1000)，轻轻震荡混匀，用盖板膜盖板后置室温(25±2℃)避光环境中反应20min，取出重复洗板5次。
(5)催化反应：洗涤5次后，继续向孔板中加入100μL盐酸多巴胺溶液(25mM)，37℃反应15分钟。
(6)加入传感器并进行磁弛豫时间检测：在200μL FeCl3(0.5mM)溶液中加入100μL反应后的盐酸多巴胺溶液，37℃反应10分钟。反应结束后，取混合溶液测定T2值。试验结果如图17所示。
对比实验结果可以得出本发明的检测方法具有更高的灵敏度和更宽的线性范围。
<110> 华中农业大学
<120> 一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa aagtctagga ttcggcgtgg gttaa 35
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaa 28
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttg 48

Claims (9)

1.一种三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：
1)在酶标板上包被待测物完全抗原并进行封闭；
2)洗涤酶标板后加入待测物溶液和金纳米颗粒，室温下进行免疫反应，所述金纳米颗粒上偶联有待测物单克隆抗体和用于进行杂交链反应的引发链DNA，
3)洗涤酶标板后加入生物素修饰的两个寡聚核苷酸DNA发夹，室温下进行杂交链反应；
4)洗涤酶标板后加入链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶，室温下进行生物识别反应；
5)洗涤酶标板后加入盐酸多巴胺溶液，盐酸多巴胺在辣根过氧化物酶催化下生成聚多巴胺；
6)洗涤酶标板后加入Fe3+溶液，室温下进行吸附反应；
7)取上清液，用低场核磁共振分析仪测定横向弛豫时间T2并对目标物进行定性和定量分析。
2.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述引发链DNA的核苷酸序列为H2N-AAAAAAAAAAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA，所述两个生物素修饰的寡聚核苷酸DNA发夹的序列为bio-H1：biotin-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAA；bio-H2：AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-biotin。
3.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述金纳米颗粒上偶联的待测物单克隆抗体量为10-50μg。
4.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述金纳米颗粒上偶联的引发链DNA量为0.1-1nmol。
5.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述生物素修饰的两个DNA发夹的浓度为0.1-1μM。
6.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述盐酸多巴胺溶液的浓度为5-50mM。
7.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述Fe3+溶液的浓度为0.1-1mM。
8.如权利要求1所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶的稀释倍数为1：1000-10000。
9.如权利要求1-8任一项所述的三重信号放大磁弛豫传感免疫分析方法，其特征在于：所述待测物为毒死蜱。
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