ES2879292T3 - Fitasa mutante - Google Patents

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ES2879292T3 ES16896334T ES16896334T ES2879292T3 ES 2879292 T3 ES2879292 T3 ES 2879292T3 ES 16896334 T ES16896334 T ES 16896334T ES 16896334 T ES16896334 T ES 16896334T ES 2879292 T3 ES2879292 T3 ES 2879292T3
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Huaming Wang
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Abstract

Una fitasa mutante, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN
Fitasa mutante
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la biotecnología y, en particular, se refiere a mutantes de fitasa y a un método de producción de mutantes. La presente invención también se refiere a moléculas de ADN que codifican mutantes, vectores de expresión y células huésped.
Antecedentes de la invención
La fitasa es un tipo de enzima fosfatasa y puede hidrolizar el fitato de fósforo (hexakisfosfato de mioinositol) en mioinositol y fosfato inorgánico. Hay dos tipos de fitasa: 3-fitasa (EC 3.1.3.8) y 6-fitasa (EC 3.1.2.6). La fitasa se disemina ampliamente en la naturaleza y se encuentra en plantas, animales y microorganismos, incluidas plantas superiores como el maíz y el trigo, microbios procariotas como Bacillus subtilis, Pseudomonas, Lactobacillus y Escherichia coli y microbios eucariotas.
El fitato de fósforo es un componente principal de todas las semillas de plantas, constituye del 1 % al 3 % en peso de muchos cereales, frijoles y semillas oleaginosas y representa típicamente del 60 % al 80 % del fósforo total. Sin embargo, los animales monogástricos metabolizan solo del 0 % al 40 % del fósforo fitato, ya que carecen de enzimas digestivas para el fitato, lo que genera una serie de problemas. En primer lugar, se desperdicia la fuente de fósforo. Por un lado, la fuente de fósforo fitato en los piensos no se puede utilizar de manera eficiente; por otro lado, para asegurar el requerimiento de fósforo de los animales, es necesario agregar fósforo inorgánico en los piensos, lo que aumenta los costes de los piensos. En segundo lugar, las excretas con alto contenido de fósforo contaminan el medio ambiente. El 85 % del fósforo fitato en los piensos será excretado directamente por los animales, y las excretas que contienen un alto contenido de fósforo fitato pueden provocar una contaminación significativa del agua y el suelo. Además, el fitato de fósforo también es una especie de antinutriente, que se une a varios iones metálicos como Zn2+, Ca2+, Cu2+ y Fe2+ y otras proteínas para formar composiciones insolubles, previniendo o inhibiendo la absorción de los nutrientes en el tracto gastrointestinal, y reduce la utilización eficaz de los nutrientes.
La fitasa se puede utilizar como aditivo alimentario para animales monogástricos, y el efecto de alimentación se ha confirmado en todo el mundo. La fitasa puede mejorar la disponibilidad de fósforo de los piensos vegetales en un 60 % y disminuir la excreción de fósforo en un 40 %. La fitasa también puede contrarrestar las propiedades antinutricionales del fitato. Por lo tanto, la adición de fitasa en la alimentación animal es útil para mejorar la eficiencia de producción de la industria ganadera y avícola y para reducir la contaminación ambiental causada por el fitato.
Hay dos tipos principales de fitasa para la producción industrial, una de las cuales es la fitasa fúngica derivada de Aspergillus niger y la otra es la fitasa bacteriana derivada de E. coli. La fitasa APPA derivada de E. coli tiene una alta actividad específica y buena estabilidad gastrointestinal, y se puede utilizar en la industria de piensos añadiéndola directamente al pienso machacado o pulverizándolo sobre pienso granulado.
La fitasa bacteriana APPA tiene una estabilidad térmica más baja, cuya tasa de retención fue incluso inferior al 30 % después de mantenerse a 70 grados Celsius (°C) durante 5 minutos en un baño de agua. Por lo tanto, existe una restricción de agregar fitasa directamente en el procesamiento del pienso debido a su baja tolerancia a las altas temperaturas de 80-90 °C en el período de granulación del pienso. Sin embargo, todavía existen varias desventajas de aplicar la tecnología de pulverización de líquidos utilizando fitasa, como el alto coste del equipo, la menor estabilidad y uniformidad de las enzimas en la alimentación. Por tanto, es de gran importancia mejorar la termoestabilidad de la fitasa para piensos.
Los documentos CN 104404012 A y CN 102392002 A ya describen mutantes de fitasa.
Resumen de la invención
Esta invención proporciona una fitasa mutante y un método de producción de la misma. La termoestabilidad de la fitasa mutante se mejora significativamente, lo que favorece las amplias aplicaciones de la fitasa mutante en el campo de los piensos.
Para lograr los objetivos anteriores, la invención proporciona las siguientes soluciones técnicas:
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una fitasa mutante, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la fitasa mutante del primer aspecto. Preferiblemente, la secuencia de polinucleótidos se muestra como SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID n O: 10.
En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a un vector de expresión que comprende la molécula de ADN del segundo aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención se refiere a una célula huésped que comprende el vector de expresión del tercer aspecto.
En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a un método de producción de la fitasa mutante del primer aspecto, que incluye:
Etapa 1: obtención de una molécula de ADN del segundo aspecto;
Etapa 2: fusionar la molécula de ADN obtenida en la etapa 1 a un vector de expresión, construyendo así un vector de expresión recombinante y transformar el vector de expresión recombinante en una célula huésped; y
Etapa 3: inducir la célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante para que exprese la fitasa mutante y luego aislar y purificar la fitasa mutante.
En el presente documento, pero no incluido en la presente invención, se encuentra una fitasa mutante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como (I) o (II) o (III):
(I) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1;
(II) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un epítopo inmune de la fitasa y comprende una modificación, una sustitución, una deleción y/o una inserción de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de la fitasa;
(III) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos cuya hebra complementaria hibrida con SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético;
en el que la secuencia de aminoácidos comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 sustituciones de aminoácidos.
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 75 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1
En algunas realizaciones, las modificaciones incluyen amidación, fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, glicosilación o carbonilación.
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende sustituciones de 16 o 17 o 18 aminoácidos.
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre las posiciones 46, 62, 70, 73, 75, 80, 114, 137, 142, 146, 159, 161, 176, 187, 255 o 380.
En algunas realizaciones, la fitasa mutante comprende sustituciones de aminoácidos en las posiciones 46, 62, 70, 73, 75, 80, 114, 137, 142, 146, 159, 161, 176, 187, 255 y/o 380.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la fitasa es SEQ ID NO: 1, y la secuencia de polinucleótidos que codifica la fitasa es SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, la secuencia de aminoácidos de la fitasa mutante es SEQ ID NO: 3.
También se describe en el presente documento, pero no se incluye en la presente invención, una molécula de ADN que codifica la fitasa mutante.
En algunas realizaciones, la secuencia de polinucleótidos de la molécula de ADN que codifica la fitasa mutante es la SEQ ID NO: 4.
También se describe en el presente documento, pero no se incluye en la presente invención, un vector que comprende la molécula de ADN que codifica la fitasa mutante.
En otras realizaciones, la sustitución de aminoácidos es de Trp a Glu en la posición 46, de Gln a Trp en la posición 62, de Gly a Glu en la posición 70, de Ala a Pro en la posición 73, de Lys a Cys en la posición 75, de Ser a Pro en la posición 80, de Thr a His en la posición 114, de Asn a Val en la posición 137, de Asp a Arg en la posición 142, de Ser a Glu en la posición 146, de Arg a Tyr en la posición 159, de Thr a Pro en la posición 161, de Asn a Pro en la posición 176, de Ser a Pro en la posición 187, de Tyr a Asp en la posición 255, y de Ala a Pro en la posición 380, la posición correspondiente a la posición respectiva en SEQ ID NO: 1.
La secuencia de aminoácidos de la fitasa mutante anterior es SEQ ID NO: 3 y una secuencia de polinucleótidos que codifica la fitasa mutante es SEQ ID NO: 4.
También se describe en el presente documento, pero no incluido en la presente invención, un plásmido que comprende la secuencia polinucleotídica de SEQ ID NO: 4.
En otras realizaciones, la fitasa mutante también comprende las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 126 y/o 211.
En otras realizaciones, la fitasa mutante también comprende la sustitución de aminoácidos en la posición 126.
En otras realizaciones, la sustitución de aminoácidos es de Asn a Asp en la posición 126 de SEQ ID NO: 3.
En otras realizaciones, la fitasa mutante también comprende la sustitución de aminoácidos en la posición 211.
En otras realizaciones, la sustitución de aminoácidos es de Val a Trp en la posición 211 de SEQ ID NO: 3.
En otras realizaciones, la fitasa mutante también comprende las sustituciones de aminoácidos en las posiciones 126 y 211.
En otras realizaciones, las sustituciones de aminoácidos son de Asn a Asp en la posición 126 y de Val a Trp en la posición 211 de SEQ ID NO: 3.
También se describe en el presente documento, pero no incluido en la presente invención, un método para producir la fitasa mutante, que incluye:
Etapa 1: obtener una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada como (I) o (II) o (III):
(I) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la fitasa;
(II) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un epítopo inmune de la fitasa y comprende una modificación, una sustitución, una deleción y/o una inserción de uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la fitasa;
(III) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos cuya hebra complementaria hibrida con SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético;
en la que la secuencia de aminoácidos comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 sustituciones de aminoácidos.
Etapa 2: fusionar la molécula de ADN obtenida en la etapa 1 con un vector de expresión, construir un vector de expresión recombinante y transformar el vector de expresión recombinante en una célula huésped;
Etapa 3: inducir el vector de expresión recombinante que coexiste con la célula huésped para que exprese la proteína de fusión, y luego aislar y purificar la proteína de fusión.
En algunas realizaciones, las modificaciones incluyen amidación, fosforilación, metilación, acetilación, ubiquitinación, glicosilación o carbonilación.
En algunas realizaciones, las sustituciones en el método incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en una posición seleccionada entre las posiciones 46, 62, 70, 73, 75, 80, 114, 137, 142, 146, 159, 161, 176, 187, 255 o 380. En algunas realizaciones, las sustituciones en el método están en las posiciones 46, 62, 70, 73, 75, 80, 114, 137, 142, 146, 159, 161, 176, 187, 255 y/o 380.
En otras realizaciones, las sustituciones en el método también comprenden sustituciones de aminoácidos en las posiciones 126 y/o 211.
En algunas realizaciones, la molécula de ADN en la etapa 1 del método se obtiene mediante reacciones de amplificación de ADNc que codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3.
La célula huésped en la etapa 2 del método es Pichia.
También se describe en el presente documento, pero no se incluye en la presente invención, es: (1) un pienso para animales que comprende una cantidad eficaz de una fitasa mutante descrito en el presente documento para mejorar la digestión animal y la absorción de fósforo; y (2) un método para mejorar la digestión animal y la absorción de fósforo que comprende añadir una cantidad eficaz de la fitasa mutante descrito en el presente documento en un pienso antes de alimentar al animal.
También se describe en el presente documento, pero no se incluye en la presente invención, una célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante.
En algunas realizaciones, la célula huésped es Pichia.
La termoestabilidad de la fitasa mutante expresada en la Pichia que comprende el vector recombinante se mejora significativamente.
También se describe en el presente documento, pero no incluido en la presente invención, una fitasa mutante, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como (I) o (II) o (III):
(I) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 70 % de identidad con la secuencia de aminoácidos de la fitasa;
(II) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un epítopo inmune de la fitasa y comprende una modificación, una sustitución, una deleción y/o una inserción de uno o más aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos de la fitasa;
(III) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos cuya hebra complementaria hibrida con SEQ ID NO: 2, o una secuencia de nucleótidos que difiere de la secuencia de SEQ ID NO: 2 debido a la degeneración del código genético;
en el que la secuencia de aminoácidos comprende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 sustituciones de aminoácidos.
Breves descripciones de dibujos
La Figura 1 muestra las termoestabilidades de Phy7.1, Phy7.2 y Phy8.
Ejemplos
Para mejorar la termoestabilidad de la fitasa silvestre APPA (la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 1, y la secuencia de polinucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 2), 16 sustituciones de aminoácidos (W46E, Q62W, G70E, A73P, K75C, S80P, T114H, N137V, D142R, S146E, R159Y, T161P, N176P, S187P, Y255D y A380P) se introdujeron en APPA. La fitasa mutante obtenido se denominó PHY6, cuya secuencia de aminoácidos fue SEQ ID NO: 3 y la secuencia de polinucleótidos codificante fue SEQ ID NO: 4. En comparación con APPA, la resistencia al calor de PHY6 mejoró significativamente. (Esta parte del contenido se ha descrito en detalle en la solicitud china No: 201510532520.1, denominada “mutantes de fitasa”, presentada el 26 de agosto de 2015).
La invención divulga una fitasa mutante, un método de producción del mismo, una molécula de ADN que codifica el mutante, un vector y una célula huésped. La invención ha descrito el método y la aplicación en las realizaciones preferidas, y los técnicos en este campo pueden modificar fácilmente o modificar y combinar apropiadamente los métodos y aplicaciones para realizar y aplicar la invención sin apartarse del contenido, espíritu y alcance de la invención.
En la invención se utilizan técnicas y métodos convencionales en el campo de la ingeniería genética y la biología molecular, por ejemplo, los métodos registrados en MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001) y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003). Estas referencias generales proporcionan a un experto en la técnica un diccionario general de muchos de los términos usados en esta invención. Basándose en el esquema técnico descrito en la invención, todos los términos técnicos y científicos pueden elegir otros métodos convencionales, programas experimentales y reactivos para realizar la invención, incluyendo, pero sin limitarse a lo descrito en las realizaciones de la invención. Por ejemplo, los siguientes materiales y reactivos experimentales se pueden usar en la invención:
Cepas y vectores: E. coli DH5a, cepa GS115 de Pichia pastoris, vector pPIC9k, Amp y G418 se adquirieron de Invitrogen.
Enzimas y kits: las enzimas y ligasas de PCR se adquirieron de Takara; las endonucleasas de restricción se adquirieron de Fermentas; el mini kit de plásmido y el kit de extracción en gel se adquirieron de Omega; e l kit de mutagénesis aleatoria geneMorph II se adquirió de MBL Beijing Biotech Co., Ltd.
Recetas medianas:
Caldo Lariante (medio LB): extracto de levadura al 0,5 %, triptona al 1 %, NaCl al 1 %, pH 7,0;
Medio LB-AMP: medio LB con ampicilina 100 pg/ml;
Medio de peptona dextrosa de extracto de levadura (medio YPD): extracto de levadura al 1 %, triptona al 2 %, glucosa al 2 %;
Medio mínimo de dextrosa (medio MD): triptona al 2 %, agar al 2 %;
Medio BMGY: triptona al 2 %, extracto de levadura al 1 %, tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0), YNB al 1,34 %, biotina 4 x 10-5, glicerol al 1 %;
Medio BMMY: triptona al 2 %, extracto de levadura al 1 %, tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0), YNB al 1,34 %, biotina 4 * 10-5, metanol al 1 %.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos:
Ejemplo 1 Detección de mutantes termoestables
Para mejorar la termoestabilidad de la fitasa mutante PHY6, se analizó la estructura proteica de PHY6 (codificada por la secuencia de polinucleótidos mostrada como SEQ ID NO: 4). Había dos dominios en la proteína: el dominio I contenía 134 residuos de aminoácidos en el terminal N y 152 residuos de aminoácidos en el terminal C, mientras que el dominio II contenía los 124 residuos de aminoácidos restantes en el medio. Las secuencias conservadas y el centro de actividad estaban todos en el dominio I. Sin destruir la estructura secundaria y el centro de actividad de la proteína, se llevaron a cabo mutaciones adicionales de los residuos de aminoácidos.
1.1 Diseño de cebadores de PCR PHY6-F1 y PHY6-R1
PHY6-F1: GGCGAATTC CAGTCAGAACCAGAGTTGAAGTT (el subrayado es el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción EcoRI), que se muestra como SEQ ID NO: 11;
PHY6-R1: ATAGCGGCCGCTTACAAGGAACAAGCAGGGAT (el subrayado es el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción Not1), que se muestra como SEQ ID NO: 12;
El gen PHY6 (mostrado como SEQ ID NO: 4) se amplificó usando los cebadores anteriores mediante un kit de mutagénesis aleatoria GeneMorph II (Stratagene). Después de recuperarse, los productos de amplificación se digirieron con EcoRI y NotI y se ligaron en el plásmido pET21a digerido con EcoRI-NotI. Después de eso, el plásmido se transformó en E. coli BL21 (DE3) y luego las E coli. recombinante se extendieron sobre placas LB Amp. Después de incubarse a 37 °C, las colonias se transfirieron con un palillo de dientes una a una a placas de microtitulación de polipropileno de 96 pocillos que contenían medio LB Amp con 150 ul de IPTG 0,1 mM en cada pocillo. Las placas de microvaloración se incubaron a 37 °C durante 6 h con agitación a 220 rpm. El sobrenadante se eliminó del caldo de fermentación mediante centrifugación. Posteriormente, las células se resuspendieron con tampón y se congelarondescongelaron repetidamente para obtener lisados de células de E. coli que contenían fitasa.
Se transfirieron 40 pl de lisados de células a dos placas nuevas de 96 pocillos, una de las cuales se trató a 80 °C durante 10 min y la otra no. Se añadieron 80 ul de sustratos en cada pocillo de las placas y se incubaron durante 30 min a 37 °C. A continuación, se añadieron 80 ul de solución de parada (vanadato de amonio: molibdato de amonio: ácido nítrico =1: 1 :2) para finalizar la reacción. En cada pocilio de las placas se determinó el contenido de fosfato inorgánico, que reflejaba las actividades postratamiento térmico de los diferentes mutantes obtenidos en la invención.
En comparación con la fitasa PHY6, no se mejoran las termoestabilidades de algunos mutantes. Las termoestabilidades o actividades de algunos mutantes son aún peores. Además, existen algunos mutantes con termoestabilidades mejoradas, pero sus propiedades enzimáticas cambian significativamente, lo que también limita sus aplicaciones en piensos. Finalmente, esta invención proporciona tres mutantes de fitasa con termoestabilidad significativamente mejorada sin efectos negativos sobre sus altas actividades y propiedades enzimáticas originales: N126D, V211W y N126D/V211W.
Un mutante se denomina Phy7.1 con la mutación de un punto N126D, su secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO: 5 y la secuencia de polinucleótidos codificante se muestra como SEQ ID NO: 6.
Otro fitasa mutante se denomina Phy7.2 con una mutación de un punto V211W, su secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO: 7 y la secuencia de polinucleótidos codificante se muestra como SEQ ID NO: 8.
El otro fitasa mutante se denomina Phy8 con la mutación de dos puntos N126Dy V211W, su secuencia de aminoácidos se muestra como SEQ ID NO: 9 y la secuencia de polinucleótidos codificante se muestra como SEQ ID NO: 10.
1.2 Síntesis y amplificación de genes mutantes
Las secuencias de polinucleótidos de PHY6 y tres mutantes de fitasa se sintetizaron con referencia a SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SeQ ID NO: 8 y SEQ ID NO: 10 y se optimizaron basándose en la preferencia de codones de Pichia Postoris por Shanghai Generay Biotech Co., Ltd, a la que se añadieron un sitio de restricción EcoRI y un sitio de restricción NotI al extremo 5' y al extremo 3' respectivamente.
1.3 Construcción de vector de expresión
Las cuatro secuencias de polinucleótidos sintetizadas en 1.2 y los plásmidos pPIC-9k fueron digeridos primero por EcoRI y NotI, y luego ligados juntos a 16 °C durante la noche respectivamente. Después de eso, el plásmido recombinante se transformó en E. coli DH5a. Las células de E. coli recombinantes se extendieron luego sobre placas LB Amp. Las placas se colocaron invertidas y se incubaron a 37 °C hasta que crecieron los transformantes. Los transfromantes positivos se seleccionaron y verificaron mediante PCR de colonias y secuenciación de ADN. El sistema de reacción de PCR de colonias contenía: muestra monoclonal, rTaqDNA polimerasa 0.5ul, 10xBuffer 2.0 pl, dNTPs (2.5mM) 2.0 pl, cebador 5'AOX (10M): 0.5 pl, cebador 3'AOX: 0.5 pl, d d ^ O 14.5 pl; Las condiciones de PCR fueron: 95 °C durante 5 minutos (1 ciclo), 94 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 2 minutos (30 ciclos) y 72 °C durante 10 minutos (1 c ic lo). El vector de expresión con el gen PHY6 mostrado como SEQ ID NO: 4 se denominó pPIC9K-PHY6, y tres vectores con genes mutantes mostrados como SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10 se denominaron pPIC9K- Phy7.1, pPIC9K-Phy7.2 y pPIC9K-Phy8 respectivamente.
1.4 Construcción de la cepa de P. pastoris recombinante
1.4.1 Preparación de células de P. pastoris competentes
Se esparcieron células huésped de P. pastoris GS115 sobre placas YPD y las placas se incubaron a 30 °C durante 48 h. Las colonias GS115 se recogieron y se inocularon en 6 ml de medio líquido YPD durante aproximadamente 12 h a 30 °C con agitación a 220 rpm. Luego, el medio líquido YPD que contenía GS115 se inoculó en 30 ml de medio líquido YPD y se incubó durante 5 ha 30 °C con agitación a 220 rpm. La densidad celular de los cultivos de levadura se midió utilizando un espectrofotómetro. Cuando la densidad óptica (DO600) entre 1,1 y 1,3, se añadieron 4 ml de cultivos de levadura a tubos EP esterilizados y se centrifugaron a 9000 rpm y 4 °C durante 2 min. Los sobrenadantes se eliminaron y se aspiraron con papel de filtro estéril, mientras que las células de levadura restantes se resuspendieron en 1 ml de agua preenfriada estéril. La suspensión que contenía células de levadura se centrifugó a 9000 rpm y 4 °C durante 2 min. Se eliminaron los sobrenadantes, mientras que las células de levadura restantes se resuspendieron en 1 ml de agua estéril nuevamente. La suspensión que contenía células de levadura se centrifugó a 9000 rpm y 4 °C durante 2 min. Se eliminó el sobrenadante, mientras que las células de levadura restantes se resuspendieron en 1 ml de sorbitol preenfriado (1 mol/l). Las células de levadura que contenían sorbitol se centrifugaron a 9000 rpm y 4 °C durante 2 min. Luego se eliminó el sobrenadante, mientras que las células de levadura restantes se resuspendieron en 100-150 pl de sorbitol preenfriado estéril (1 mol/l).
1.4.2 Transformación y cribado
Los plásmidos recombinantes pPIC9K-PHY6, pPIC9K-Phy7.1, pPIC9K-Phy7.2 y pPIC9K-Phy8 fueron linealizados por Sal I y transformados en células huésped Pichia pastoris GS115 respectivamente por electroporación. El P recombinante. Pastoris cepas GS115/pPIC9K-PHY6, GS115/pPIC9K-Phy7.1, GS115/pPIC9K-Phy7.2 y GS115/pPIC9K-Phy8 se cribaron en placas MD. Y luego se seleccionaron múltiples copias de transformantes en placas YPD que contenían diferentes concentraciones de genetina (0,5 mg/ml-8 mg/ml).
Uno de los transformantes de las cepas recombinantes GS115/pPIC9K-PHY6 se denominó Pichia pastoris PHY6. Uno de los transformantes de las cepas recombinantes GS115/pPIC9K-Phy7.1 se denominó Pichia pastoris Phy7.1. Uno de los transformantes de las cepas recombinantes GS115/pPIC9K-Phy7.2 se denominó Pichia pastoris Phy7.2. Uno de los transformantes de las cepas recombinantes GS115/pPIC9K-Phy8 se denominaron Pichia pastoris Phy8. Los cuatro transformantes anteriores se inocularon primero en matraces separados con medio BMGY y se cultivaron a 30 °C durante 1 día con agitación a 250 rpm, y luego se inocularon en medio BMMY a 30 °C durante 4 días con agitación a 250 rpm. Se añadió metanol al 0,5 % al medio como inductor cada 24 h. Las células se retiraron del caldo de fermentación mediante centrifugación a 9000 rpm durante 10 min y se retuvieron los sobrenadantes de fermentación que contenían fitasa PHY6, o fitasa Phy7.1 o fitasa Phy7.2 o Phy8.
(1) Definición de unidad de actividad de fitasa
Una unidad de fitasa es la actividad de la fitasa que genera 1 micromol de fósforo inorgánico por minuto a partir de 5,0 mMol/l de fitato de sodio a pH 5,0 y 37 °C, que se indica como U.
(2) Método para detectar la actividad de la fitasa
Se añaden 1,8 ml de tampón de ácido acético (pH 5,0) y 0,2 ml de muestra en dos cubetas A y B separadas, se mezclan y se calientan a 37 °C durante 5 min. Se añaden 4 ml de solución de sustrato a la cubeta A y 4 ml de solución de parada se añaden a la cubeta B, se mezclan y se hacen reaccionar a 37 °C durante 30 min. La reacción se termina añadiendo y mezclando 4 ml de solución de parada en la cubeta A y 4 ml de solución de sustrato en la cubeta B. Después de reposar durante 10 min, se mide la absorbancia a 415 nm. Se hacen tres repeticiones para cada muestra, y el promedio de los valores de absorbancia se usa para calcular la actividad de la fitasa por regresión lineal.
Actividad enzimática:
Actividad enzimática: X = F * C/m * 30
donde: Unidad X de actividad enzimática, U/g (ml);
F-Factores de dilución total de la solución de muestra antes de la reacción;
C-la actividad enzimática calculada a partir de la ecuación de regresión lineal basada en la absorbancia de la solución de muestra real, U;
m-masa de muestra o volumen, g/ml;
30-tiempo de reacción;
Las actividades de fitasa de los sobrenadantes de fermentación de Pichia pastoris PHY6, Phy7.1, Phy7.2 y Phy 8 se detectaron mediante el método mencionado anteriormente, y los resultados se proporcionan en la Tabla 1.
Tabla 1 Actividades de fitasa
Figure imgf000008_0001
Las actividades de fitasa de los sobrenadantes de fermentación de Pichia pastoris PHY6, Pichia pastoris Phy7.1, Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris Phy8 son 241 U/ml, 223 U/ml, 205 U/ml y 237 U/ml, respectivamente.
1.5 Proceso de fermentación
Se cultivaron Pichia pastoris PHY6, Pichia pastoris Phy7.1, Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris Phy8 en cuatro fermentadores separados de 10 l con el medio de fermentación que contenía: 1,1 g/l de CaSO4, 5,5 g/l de KH2PO4, 55 g/l NH4H2PO4, 16,4 g/l de MgSO4, 20,3 g/l de K2SO4, 1,65 g/l de KOH y 0,05 % de antiespumante.
Los parámetros de fermentación: pH 5,0, 30 °C, agitación a 300 rpm, aireación a 1,0-1,5 v /vy el oxígeno disuelto se mantuvo por encima del 20 %.
Hubo tres etapas del proceso de fermentación. La primera etapa fue para cultivo celular con 7 % de semilla inoculada y cultivada a 30 °C durante 24-26 h hasta finalizar el suplemento de glucosa. La segunda etapa fue para la inanición celular sin más fuente de carbono suplementada. Esta etapa duró aproximadamente 30-60 min hasta que la concentración de oxígeno disuelto se elevó al 80 %. La tercera etapa fue para inducir la expresión de fitasa con metanol agregado como inductor en el flujo, y la concentración de oxígeno disuelto se mantuvo en más del 20 %, que duró aproximadamente 150-180 h. Después de eso, el caldo de fermentación se trató con el filtro prensa para obtener una solución de enzima cruda.
Las actividades de fitasa de las soluciones de enzima bruta se determinaron mediante el método mencionado en 1.4.2, y los resultados se proporcionan en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividades fitasa
Figure imgf000009_0001
Las actividades de fitasa de las soluciones de enzimas crudas de Pichia pastoris PHY6, Pichia pastoris Phy7.1, Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris Phy8 son 11403 U/ml, 10807 U/ml, 10713 U/ml y 11133 U/ml, respectivamente.
1.6 Análisis de propiedades enzimáticas
1.6.1 Temperatura óptima
Las actividades de fitasa de las soluciones enzimáticas brutas de Pichia pastoris PHY6, Pichia pastoris Phy7.1, Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris Phy8 se midieron a intervalos de pH de 5,5 y 5 °C entre 30 °C y 85 °C. Con la actividad de fitasa más alta calculada al 100 %, se calcularon las actividades enzimáticas relativas.
Los resultados muestran que las temperaturas óptimas de la fitasa mutante Phy7.1, Phy7.2 y Phy8 son todas de 75 °C, que es lo mismo con la fitasa mutante PHY6.
1.6.2 pH óptimo
Las soluciones de enzimas crudas de Pichia pastoris PHY6, Pichia pastoris Phy7.1, Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris Phy8 se diluyeron en tampón de ácido acético-acetato de sodio 0.1 M a pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6,0, 6.5, 7.0 respectivamente. Las actividades de fitasa se midieron a 37 °C, y las actividades enzimáticas relativas se calcularon con la actividad enzimática más alta calculada al 100 %.
Los resultados muestran que el pH óptimo de Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris PHY6 es ambos 5.0, pero el pH óptimo de Pichia pastoris Phy7.1 y Pichia pastoris Phy8 se reduce en 0.5 unidades, a 4.5.
1.6.3 Termoestabilidad
Las soluciones de enzimas brutas de Pichia pastoris PHY6, Pichia pastoris Phy7.1, Pichia pastoris Phy7.2 y Pichia pastoris Phy8 se diluyeron 10 veces con tampón acetato de sodio 0,25 M (pH 5,0) que se precalentó durante 10 min. Las soluciones de enzima diluidas se mezclaron bien y se trataron a 85 °C durante 5 min y 80 °C durante 10 min. Las actividades de fitasa se midieron cuando las soluciones enzimáticas diluidas se enfriaron a temperatura ambiente. Con la actividad de fitasa de la solución de enzima no tratada calculada al 100 %, se calcularon las actividades de fitasa residual.
Como se muestra en la Figura 1, en comparación con la fitasa PHY6, las actividades residuales de los mutantes de fitasa Phy7.1, Phy7.2 y Phy8 son 12,48 %, 15,50 % y 20,90 % mayores, respectivamente, después de ser tratados a 80 °C para 10 min, y son 13,05 %, 18,50 % y 27,56 % más altos, respectivamente, después de ser tratados a 85 °C durante 5 min. La resistencia al calor de los mutantes de fitasa Phy7.1, Phy7.2 y Phy8 es mayor que la de la fitasa PHY6 (P <0.01).
En conclusión, utilizando la fitasa PHY6 como base, la invención proporciona un Phy7.1 mutante de un punto (N126D), un Phy7.2 mutante de un punto (V211W) y un Phy8 mutante de dos puntos (N126D y V211W). En comparación con la fitasa PHY6, la temperatura óptima de los mutantes de fitasa Phy7.1, Phy7.2 y Phy8 permanece sin cambios,

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Una fitasa mutante, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 9.
2. Una molécula de ADN que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica la fitasa mutante de la reivindicación 1.
3. La molécula de ADN de la reivindicación 2, en la que la secuencia de polinucleótidos se muestra como SEQ ID NO: 6 o SEQ ID NO: 8 o SEQ ID NO: 10.
4. Un vector de expresión que comprende la molécula de ADN de las reivindicaciones 2 o 3.
5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 4.
6. Un método de producción de la fitasa mutante de la reivindicación 1, que incluye:
Etapa 1: obtención de una molécula de ADN de la reivindicación 2;
Etapa 2: fusionar la molécula de ADN obtenida en la etapa 1 a un vector de expresión, construyendo así un vector de expresión recombinante, y transformando el vector de expresión recombinante en una célula huésped; y
Etapa 3: inducir la célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante para que exprese la fitasa mutante, y luego aislar y purificar la fitasa mutante.
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