ES2870698T3

ES2870698T3 - Uso de un agente de captura de fibrinógeno para detectar una variante b de Ciz1

Info

Publication number: ES2870698T3
Application number: ES16784956T
Authority: ES
Inventors: Dawn Alison Coverley
Original assignee: Cizzle Biotechnology Ltd
Current assignee: Cizzle Biotechnology Ltd
Priority date: 2015-10-19
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2021-10-27
Anticipated expiration: 2036-10-14
Also published as: GB201518466D0; WO2017068330A1; US20230266327A1; EP3362473B1; CA3002320A1; JP6880046B2; CN108431032B; CN108431032A; JP2019500618A; US20180306795A1; AU2016342546B2; EP3362473A1; AU2016342546A1

Abstract

Uso de un agente de captura de fibrinógeno o un agente de detección de fibrinógeno en un ensayo para detectar la variante b de Ciz1.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de un agente de captura de fibrinógeno para detectar una variante b de Ciz1

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ensayos y métodos útiles para la detección de la proteína con dedos de zinc que interactúa con Cip1 (Ciz1) en una muestra. En particular, la presente invención se refiere al uso de tales ensayos y métodos para el diagnóstico del cáncer.

Antecedentes de la invención

La proteína con dedos de zinc que interactúa con Cip1 1 (Ciz1) (como se ejemplifica en la secuencia de referencia del NCBI: NM_NM_001131016.1) es necesaria para la proliferación celular. Ciz1 se localiza en focos unidos a la matriz nuclear que forman sitios de replicación de ADN durante la fase S temprana y estimula el inicio de la replicación del ADN en asociación con reguladores del ciclo celular, que incluyen a ciclina A / cinasa dependiente de ciclina (CDK)2, ciclina E/CDK2 y p21cip1. En el contexto de la transcripción, CIZ1 es un gen que responde al estrógeno que es en sí mismo un cofactor positivo del receptor de estrógeno (RE), capaz de potenciar el reclutamiento de RE para dirigirse a la cromatina. Ciz1, alternativamente, experimenta corte y empalme para producir isoformas conservadas en el ratón y el hombre. La proteína Ciz1 normal comprende al menos dos dominios funcionales definidos, un dominio de "replicación" y un dominio de "inmovilización".

El corte y empalme alternativo del exón 14 de Ciz1 para generar una variante b de Ciz1 se ha determinado en diversos cánceres, incluyendo cáncer de pulmón microcítico (CPM), cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), linfomas, de glándula tiroidea, cáncer de riñón e hígado. El exceso de expresión del dominio de replicación o inmovilización de Ciz1 también se ha demostrado en cánceres, por ejemplo, en CPNM, en cánceres de mama, colon, riñón, hígado, vejiga y glándula tiroidea. Además, se ha determinado una correlación de la expresión de dominios con el estadio del cáncer (véase el documento WO 2012/078208).

Higgins, G., et al., 2012. Proceedings of the National Academy of Sciences, 109 (45), pág. E3128-E3135 divulga que la Ciz1 variante es una candidata sólida para un marcador único específico de cáncer capaz de identificar el cáncer de pulmón en estadio temprano dentro de grupos de riesgo, sin recurrir a procedimientos invasivos.

La presente invención aborda la necesidad continua de desarrollar pruebas diagnósticas y tratamientos que mejoren las tasas de supervivencia de los pacientes que padecen cánceres tales como cáncer de pulmón, a través de biomarcadores y dianas novedosos.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han determinado que la variante b de Ciz1 existe en un complejo con fibrinógeno. Esto ha permitido a los inventores desarrollar un ensayo novedoso para la detección de la presencia de la variante b de Ciz1 en un sujeto.

Adicionalmente, los presentes inventores han determinado que la variante b de Ciz1 puede existir como fragmentos peptídicos. Adicionalmente, los presentes inventores han determinado que la variante b de Ciz1 y/o los complejos de fibrinógeno/variante b de Ciz1 pueden existir en el compartimento exosómico de una muestra de sangre.

Estos hallazgos instruyen el diseño de ensayos para la detección de péptidos de variante b de Ciz1, ya sea solos o formando un complejo con fibrinógeno.

En particular, el hallazgo de que la variante b de Ciz1 forma un complejo con fibrinógeno ha permitido la provisión de un ensayo de detección, en particular un ensayo diagnóstico, que utiliza la captura de fibrinógeno o de variante b de Ciz1 como etapa inicial para aislar el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1. El ensayo puede implicar el uso de un agente de captura de fibrinógeno para aislar el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 seguido del uso de un agente de detección de variante b de Ciz1 para detectar la variante b de Ciz1 que pueda estar dentro de dicho complejo aislado. Como alternativa, el ensayo puede implicar el uso de un agente de captura de la variante b de Ciz1 para aislar el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 seguido del uso de un agente de detección de fibrinógeno para detectar el fibrinógeno que pueda estar dentro de dicho complejo aislado.

Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere al uso de un agente de captura de fibrinógeno o un agente de detección de fibrinógeno en un ensayo para detectar una variante b de Ciz1.

Como se usa en el presente documento, agente de captura se refiere a un agente que se utiliza para aislar (es decir, enriquecer) el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de una muestra. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra que se ha aislado de un sujeto. En particular, la muestra puede ser una muestra de sangre (por ejemplo, una muestra de plasma) que se ha aislado de un sujeto.

Como se usa en el presente documento, agente de detección se refiere a un agente que se utiliza para unirse al complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 después de que haberlo aislado (es decir, enriquecido) a partir de una muestra utilizando un agente de captura. Así pues, el agente de detección se utiliza normalmente después de una etapa de captura para determinar la presencia del complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 aislado (es decir, enriquecido).

Convenientemente, el ensayo puede ser un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

El agente de captura de fibrinógeno o el agente de detección de fibrinógeno puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un péptido de variante b de Ciz1 que se une específicamente al fibrinógeno.

En una realización preferente, el agente de captura de fibrinógeno o el agente de detección de fibrinógeno es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente al fibrinógeno. En otra realización preferida, el agente de captura de fibrinógeno es un péptido de variante b de Ciz1 que se une específicamente al fibrinógeno. El fibrinógeno puede ser la cadena alfa de fibrinógeno.

La variante b de Ciz1 puede detectarse en una muestra de un sujeto, por ejemplo, una muestra de sangre, orina, saliva o lavado broncoalveolar.

En una realización preferida, la muestra es una muestra de sangre de un sujeto. En una realización particularmente preferida, la muestra es una muestra de plasma.

La variante b de Ciz1 puede detectarse mediante un método que comprende las siguientes etapas: a) la captura de un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de fibrinógeno; y b) la detección de la variante b de Ciz1 utilizando un agente de detección de la variante b de Ciz1; o a) la captura de un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de la variante b de Ciz1; y b) la detección de fibrinógeno utilizando un agente de detección de fibrinógeno.

El agente de captura de la variante b de Ciz1 puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a la variante b de Ciz1.

El agente de captura de la variante b de Ciz1 puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a la variante b de Ciz1.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico del cáncer en un sujeto, que comprende la detección de un péptido de variante b de Ciz1 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de péptido de variante b de Ciz1 en la muestra indica que el sujeto tiene cáncer y en donde el método comprende la etapa de capturar un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 a partir de la muestra.

El método puede comprender las etapas de capturar un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de fibrinógeno; y la detección de la variante b de Ciz1 utilizando un agente de detección de la variante b de Ciz1; o la captura de un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de la variante b de Ciz1; y la detección de fibrinógeno utilizando un agente de detección de fibrinógeno.

Convenientemente, la etapa de detección del péptido de variante b de Ciz1 o fibrinógeno puede emplear matrices basadas en anticuerpos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), transferencia de western o espectrometría de masas.

El método puede comprender además la etapa de liberar un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 a partir de un componente exosómico de la muestra.

El complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 puede liberarse del componente exosómico mediante tratamiento con detergente, tal como el tratamiento con SDS.

El método puede comprender además la etapa de enriquecimiento de la fracción exosómica a partir de la muestra. Por ejemplo, la etapa de enriquecimiento de la fracción exosómica puede comprender ultracentrifugación, ultrafiltración, electroforesis de flujo continuo, cromatografía o ultrafiltración de flujo cruzado.

El cáncer puede seleccionarse de cáncer de pulmón, linfoma, de riñón, mama, hígado, vejiga, ovario o glándula tiroidea. En particular, el cáncer puede ser cáncer de pulmón.

En el presente documento se describe un método para el tratamiento de un sujeto con cáncer, que comprende administrar al sujeto una opción terapéutica contra el cáncer; en donde se ha identificado que el sujeto tiene cáncer mediante el método de la invención.

En el presente documento se describe un fármaco antineoplásico contra el cáncer de pulmón para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, en donde se ha identificado que el sujeto tiene cáncer de pulmón mediante el método de la invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de un detergente para liberar un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico de una muestra.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la detección de una variante b de Ciz1 en una muestra, que comprende la etapa de liberar un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico de la muestra tratando la muestra con detergente y detectar si la variante b de Ciz1 está presente en la muestra. El método puede comprender además la etapa de enriquecimiento de la fracción exosómica a partir de la muestra antes de la liberación de la variante b de Ciz1.

La etapa de enriquecimiento de la fracción exosómica puede comprender ultracentrifugación, ultrafiltración, electroforesis de flujo continuo, cromatografía o ultrafiltración de flujo cruzado.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit que comprende un agente que se une específicamente a fibrinógeno y un agente que se une específicamente a una variante b de Ciz1.

El fibrinógeno, puede ser la cadena alfa de fibrinógeno.

El agente que se une específicamente a fibrinógeno y/o el agente que se une específicamente a un péptido de variante b de Ciz1 puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo.

El agente que se une específicamente a fibrinógeno puede ser un péptido de variante b de Ciz1.

De acuerdo con cualquiera de los aspectos anteriores de la presente invención, la variante b de Ciz1 puede ser un péptido de variante b de Ciz1 mostrado como la SEQ ID NO: 11 o un fragmento del mismo que comprende EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11,

Descripción de los dibujos

Figura 1 - a) Especies que contienen epítopos de la variante b de Ciz1, detectadas con anticuerpo policlonal de conejo 043 anti-Ciz1 selectivo de la unión del corte y empalme. 043 se generó y validó como se describe para el anticuerpo 2B (Higgins et al.; (2012); PNAS; 6 de noviembre; 109(45): E3128-35) y es capaz de detectar la variante b de Ciz1 mediante transferencia de western en plasma de pacientes con cáncer de pulmón. Se realizaron transferencias de Western y muestran la variante b de Ciz1 en 0,5 ul de muestras representativas de 5 pacientes con carcinomas de pulmón (diversos estadios) y cinco de individuos sin enfermedad. b) Separación de plasma de pacientes con cáncer de pulmón en el compartimento exosómico y el compartimento soluble, que se ilustra en este caso utilizando el kit Total Exosome Isolation de Invitrogen (número de catálogo 4484450) utilizado según las recomendaciones del fabricante. Las fracciones se separaron mediante SDS-PAGE y se exploraron con 043 para revelar la variante b de Ciz1, o con anticuerpos para Ciz1 'genéricos' que reconocen un epítopo en otra parte de la proteína (los datos que se muestran en este caso se generan con NB100-74624 (Nov4), de Novus Biologicals, que detecta el extremo C de Ciz1). Carril 1, plasma sin tratar (0,5 ul), carril 2, después de centrifugación a baja velocidad de clarificación (0,5 ul), carril 3, después de centrifugación a alta velocidad de clarificación (0,5 ul), carril 4, después de la adición de reactivo de exosomas (equivalente a 0,5 ul), carril 5, sobrenadante de centrifugación a alta velocidad (SN, equivalente a 0,5 ul), carril 6, sedimento de centrifugación a alta velocidad (equivalente a 0,5 ul), carril 7, sedimento de centrifugación a alta velocidad (S, equivalente a 1 ul), carril 8, sedimento de centrifugación a alta velocidad (equivalente a 2 ul). Las flechas rojas indican carriles clave, que muestran distintas separaciones de epítopos de Ciz1. M, marcador de peso molecular. c) Comparación de muestras de plasma de tipo 1 en que la variante b de Ciz1 se encuentra exclusivamente en la fracción exosomas, y pacientes infrecuentes que presentan un patrón de tipo 2 en que una fracción de la variante b de Ciz1 está en la fracción soluble. d) Inmunoanálisis cuantitativo generado utilizando un ELISA de tipo sándwich prototipo (sin tratar las muestras con detergente) que muestra una señal aumentada en la muestra de plasma tipo 2 ilustrada en c. e) Separación de la variante b de Ciz1 en plasma tipo 1 sin tratamiento previo y después del tratamiento con SDS al 3 % (analizado en presencia de inhibidor de proteasa, PI o EDTA 10 mM), que revela un desplazamiento del epítopo en la fracción soluble. Las flechas azules indican la fracción soluble después de la aplicación del protocolo de aislamiento de exosomas. Los marcadores de PM se muestran a la derecha. SN = sobrenadante, S = sedimento (exosoma). f) Señal específica de cáncer potenciada en plasma de tipo 1 tratado con SDS en un inmunoensayo de ELISA.

Figura 2 - Secuencias de Ciz1

Figura 3 - La especie de -65-70 kDa de la variante b de Ciz1 es un péptido de variante b de Ciz1 unido de forma estable a una proteína transportadora, que puede aumentar la antigenicidad del péptido de variante b de Ciz1. a) Transferencia de Western que ilustra el epítopo selectivo de cáncer reconocido por el anticuerpo 2B para la variante b anti-Ciz1, como se describió anteriormente (Higgins et al; como anteriormente). b) Reconstitución de un epítopo de la variante b de Ciz1 a partir de péptido de variante b sintético (50 nmoles de EIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETYSPNTAYGV DFLV - SEQ ID NO: 12) mezclado con 0,5 ul de plasma sin cáncer. El péptido libre migra con una movilidad indicativa de un PM 3-4x mayor que el previsto (~ 30 kDa en lugar de 7,6 kDa), indicado por la flecha azul. Cuando se incuba en plasma, la movilidad disminuye, aumenta la antigenicidad y se crea una nueva especie a ~80 kDa, indicado por la flecha roja. c) Se generaron resultados similares con un anticuerpo monoclonal de variante b anti-Ciz1 distinto. d) Como referencia, se explora una transferencia duplicada con un anticuerpo monoclonal que es selectivo para la versión del exón 14a del péptido (EIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQRSRDISREEWKGSETYS PNTAYGVDFLV -SEQ ID NO: 13), que muestra la detección del péptido en los carriles 1 y 3. Leyenda: Carril 1, Solo péptido de TS. Carril 2, Péptido de var. B solamente. Carril 3, Péptido de TS plasma normal. Carril 4, Péptido de var. B plasma normal. Carril 5, solo plasma normal. Los resultados muestran que el plasma normal adquiere la señal de la variante b de Ciz1 a ~80 kDa tras la adición del péptido de var. b, pero no péptido de var. a. e) Se obtuvieron resultados similares utilizando péptido de variante b corto (DEEEIEVRSRDIS - SEQ ID NO: 2), cuando se combinó con plasma con cáncer o sin cáncer. La transferencia de Western muestra resultados con anticuerpo monoclonal anti-variante b de Ciz1 (izquierda) o anticuerpo policlonal 043 anti-variante b de Ciz1 (derecha). Leyenda: Carril 1, Péptido de var. B solamente. Carril 2, Péptido de var. B plasma normal. Carril 3, Péptido de var. B plasma de cáncer de pulmón. Carril 4, Plasma normal solo. Carril 5, Plasma de cáncer de pulmón solo. Cabe señalar que la movilidad de la nueva señal es similar a la señal endógena en el plasma de pacientes con cáncer. F) Transferencia de Western que muestra la titulación del péptido corto (DEEEIEVRSRDIS - SEQ ID NO: 2) en plasma de pacientes con cáncer, detectado con anticuerpo monoclonal anti-variante b de Ciz1 (parte superior) o anticuerpo policlonal 043 anti-variante b de Ciz1 (parte inferior). El gráfico muestra la cuantificación de los resultados por densitometría, con la señal en plasma normal (N) establecida en 1. Los resultados muestran que la proteína transportadora no limita hasta 4 nmol de péptido/0,5 ul de plasma. En conjunto, los resultados muestran que la especie endógena bvar65, detectada mediante anticuerpos anti-variante b de Ciz1, probablemente no sea la única especie de variante b de Ciz1 de 65 kDa, sino un combinado estable de fragmento de variante b de Ciz1 y proteína transportadora con un PM cercano a 65 kDa.

Figura 4 - El aislamiento utilizando una estrategia de gel bidimensional muestra que la proteína transportadora es fibrinógeno. a) Transferencia de Western de muestras de plasma de cáncer (C) y sin cáncer (S) después de la incubación en tampón de muestra de SDS al 2 % con y sin b-mercaptoetanol 200 mM. En presencia de un agente reductor, con anticuerpos anti-variante b se produce una señal específica de cáncer a ~65 kDa, mientras que, en ausencia de agente reductor, la señal específica de cáncer se retrasa a ~ 340 kDa. b) Se utiliza un gel de primera dimensión (sin agente reductor) para aislar la banda de ~340 kDa que contiene el epítopo de variante b de Ciz1. c) La banda se resuelve aún más después de la incubación en un agente reductor para revelar polipéptidos constitutivos y la migración del epítopo de variante b de Ciz1 con un componente de ~70 kDa. La banda se cortó para espectrometría de masas. d) MASCOT asignó una identidad significativa basada en dos masas peptídicas separadas después de la digestión con tripsina. Identidad: Cadena alfa de fibrinógeno.

Figura 5 - Reconstitución del epítopo de la variante b de Ciz1 a partir de fibrinógeno purificado y de péptidos sintéticos. a) Gel teñido con plata (izquierda) que muestra 6 nmoles de complejo de fibrinógeno purificado (Sigma Cat. F3879), después de electroforesis en ausencia de agente reductor (en tampón de carga de SDS al 2 %). Los péptidos se incluyen en el experimento (100 pmol/carril) pero no se tiñen bien con plata debido a su contenido de aminoácidos. Las transferencias de Western de geles en paralelo se muestran a la derecha, exploradas con dos anticuerpos anti-variante b. L, Péptido de variante b de Ciz1 larga EIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETYSPNTAYGV DFLV (SEQ ID NO: 12). C, Péptido de variante b de Ciz1 corto DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 2). b) Experimento similar que compara una serie de péptidos de variante b y variante a de Ciz1 por su capacidad para formar un epítopo que es reactivo con los mismos anticuerpos, cuando están formando un complejo con fibrinógeno. Leyenda: 1, sin adiciones. 2, Péptido de variante b de Ciz1 larga EIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETYSPNTAYGV DFLV (SEQ ID NO: 12). 3, péptido de TS largo EIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQRSRDISREEWKGSETYS PNTAYGVDFLV

(SEQ ID NO: 13). 4, sin adiciones. 5, Variante b corta de Ciz1 DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 2). 6, C-DEEy IEVRSRDIS-coNH2 (SEQ ID NO: 14). 7, C-DEyEIEVRSRDIS-coNH2 (SEQ ID NO: 23). 8, C-DyyylyVRSRDIS-coNH2 (SEQ ID NO: 15).

Figura 6 - Tabla 1: Péptidos de variante b de Ciz1 que comprenden una unión de exón 14b/exón 15 (especificada por la exclusión de VEEELCKQ - SEQ ID NO: 10) de la secuencia de referencia del NCBI: NM_001131016.1.

Figura 7 - Los anticuerpos específicos de la unión de exones detectan CIZ1b en el plasma de un paciente con cáncer de pulmón. A) Mapa de exones traducidos de CIZ1 que muestra el corte y empalme alternativo del exón 14 para producir 14b (CIZ1b) por exclusión de los 8 aminoácidos indicados (las posiciones se refieren a la secuencia de referencia del NCBI: NM_012127.2). Además, se muestra la ubicación de los epítopos detectados con los anticuerpos utilizados en B. B) Transferencia de Western de muestras de plasma representativas de un paciente con CPNM (CP) y control normal (N) después de la desnaturalización para un SDS-PAGE, que muestra la banda de CIZ1b en 65-70 kDa en CP (flecha roja, marcado con "*") detectada por los anticuerpos para CIZ1b 2B y 043, y una banda 'genérica' reactiva con anticuerpos para CIZ1 en 55 kDa, tanto en N como en CP, detectado a través de epítopos en el exón 8 y el exón 17. Además, se indica la cadena alfa de fibrinógeno. C) Comparación de los niveles de CIZ1b en muestras emparejadas de plasma (P) y suero (S) de cuatro individuos analizados con el anticuerpo para CIZ1b 2B. El histograma muestra intensidades de banda cuantificadas para las entidades de 65 70 kDa y 55 kDa, obtenidas de muestras por triplicado, con la desviación típica. Cabe señalar que el suero carece de la banda de CIZ1b de 65-70 kDa. D) Modelo que muestra la interpretación más simple de los datos de B, aunque el corte y empalme alternativo extenso y la posible modificación secundaria significan que la identidad exacta de la entidad de 55 kDa en plasma no está verificada. E) Curvas de eficacia diagnóstica (ROC, forma siglada de receiver operating characteristics) que muestran los valores del área bajo la curva (ABC) para los resultados de las transferencias de Western con 2B y 043 en el conjunto de prueba de cáncer de pulmón A. El gráfico de puntos muestra la correlación entre los dos conjuntos de datos (las muestras de CP son de color naranja). Los umbrales (líneas de puntos negros) se establecen en la media de las muestras sin cáncer en el conjunto, más una DT. Estos producen estimaciones de sensibilidad/especificidad para este conjunto de 20 muestras de cáncer de pulmón y 20 sin cáncer de: 2B, 85/67,5; 043, 90/77,5. Utilizando un umbral arbitrario especificado por ambos anticuerpos, estos son de 90/87,5.

Figura 8 - Efecto de la desnaturalización sobre el epítopo de CIZ1b. A) Izquierda, Gel teñido con azul de Coomassie de una muestra de plasma (2 ul) representativa de cáncer de pulmón (C) y normal (N), separadas en condiciones completamente nativas (en ausencia de SDS o agente reductor). m indica los carriles con marcadores. Parte media, gel en paralelo después de la transferencia a nitrocelulosa teñida con Ponceau S. Derecha, la misma membrana explorada con anticuerpo para CIZ1b 043. El panel inferior muestra las mismas dos muestras (flechas rojas) separadas por SDS-PAGE desnaturalizante, también explorado con 043. B) La primera dimensión del gel nativo se empapó en tampón de carga de SDS-PAGE 4x durante 30 minutos sin calentar, y se separó adicionalmente por tamaño (segunda dimensión). La transferencia de Western revela una banda a 55 kDa que es reactiva con el anticuerpo 2B en la muestra sin cáncer y dos bandas (55 y 70 kDa) en la muestra con cáncer. A continuación, se muestran dos muestras de plasma con cáncer adicionales, tratadas de la misma manera. C) Migración de bandas reactivas con 043 en una muestra representativa de plasma con cáncer (C) y sin cáncer (S) a través de un gel no desnaturalizante, después de una incubación previa a las temperaturas indicadas, en presencia de SDS al 2 %, con y sin agente reductor (p-mercaptoetanol 200 mM, pME) como se indica. Cabe señalar que el desplazamiento de la banda específica de cáncer (recuadro rojo) desde la movilidad relativa de aproximadamente 340 kDa en ausencia de agente reductor, hasta ~ 70 kDa en presencia de agente reductor (acompañado de la pérdida completa de la banda 'genérica' que se detectó en todas las muestras en ausencia de agente reductor). D) Plasma de un paciente con cáncer de pulmón que muestra una banda reactiva con 043 después de la incubación con SDS al 1 % a 37 °C durante 30 minutos, con las concentraciones indicadas de DTT, o un exceso de 10 veces de pME. Se indica que la banda reactiva se desplaza de 340 kDa a 70 kDa, y luego se pierde en condiciones de máxima reducción. El comportamiento del fibrinógeno en las mismas muestras se muestra a modo de comparación, detectándolo con el anticuerpo F8512. E) El epítopo sintético de CIZ1b, generado al combinar el péptido de CIZ1b (b66, Tabla 2) con plasma normal (sin cáncer) (véase la Fig. 10), se comporta de manera similar al epítopo endógeno, disociándose de un complejo de alto peso molecular, a una especie de ~70 kDa, y luego desapareciendo en condiciones de máxima reducción. El fibrinógeno se detecta con el anticuerpo AF4786. Las concentraciones de pME se refieren a múltiplos de la concentración convencional de 200 mM utilizada en SDS-PAGE.

Figura 9 - Deconstrucción del biomarcador CIZ1b y diseño de un inmunoensayo A) Esquema de los resultados que se muestran en la Fig.8, ilustrando la complejidad del complejo nativo en que el epítopo de CIZ1b (barra roja, marcada con "*") reside en plasma, y el efecto de alteración de los detergentes y agentes reductores. En condiciones nativas, CIZ1b es parte de un complejo de más de 720 kDa, muy probablemente abarcado dentro de vesículas lipídicas. El SDS desplaza el epítopo a 340 kDa y los agentes reductores lo desplazan adicionalmente, a la movilidad que se observa normalmente en los geles SDS-PAGE convencionales (65-70 kDa). En presencia de un exceso de agente reductor, el epítopo de la transferencia de Western se pierde para los anticuerpos para CIZ1b 2B y 043. B) Esquema del formato de ELISA tipo sándwich basado en la información resumida en A.

Figura 10 - Reconstitución del biomarcador CIZ1b a partir de componentes purificados A) Se separaron dos plasmas independientes de pacientes con cáncer de pulmón después de la incubación con SDS al 1 % (sin agente reductor), para aislar la banda de 340 kDa de los geles teñidos (izquierda). La identidad de la banda se verificó mediante tinción con ponceau S seguida de transferencia de Western con anticuerpo anti-CIZ1b 043 de un gel en paralelo (derecha). B) Se empaparon los cortes de gel en tampón de carga de SDS-PAGE al 2 % (con pME 200 mM) y se separaron a través de un gel desnaturalizante para recuperar las especies reactivas con 043 en 70 kDa. Cabe señalar que la muestra cargada como un corte de gel tiene un ligero retraso en comparación con los marcadores que se cargan en solución. La tinción con azul de Coomassie reveló 5 bandas dominantes, incluida una en 70 kDa, que se aisló y digirió con tripsina (plasma con cáncer 1, C1) o AspN (plasma con cáncer 2, C2). C) Transferencia de Western de plasma humano normal (sin cáncer, N) que muestra la reconstitución del epítopo de CIZ1 b mediante la formación de un complejo entre una proteína transportadora en plasma y péptidos de CIZ1b sintéticos de las longitudes indicadas, pero no péptido de CIZ1a equivalente (Tabla 2). Cabe destacar que los péptidos libres migran en SDS-PAGE reductor con una movilidad relativa de 3 veces la esperada (-21 kDa en lugar de 7,6 kDa para b66, ~5k Da en lugar de 1,6 para b13). Ninguno es reconocido por anticuerpos para CIZ1b en transferencia de western, a menos que estén formando complejo con la proteína transportadora. Para el péptido CIZ1b66, se crea una nueva especie reactiva a ~80 kDa, mientras que el péptido CIZ1b13 aumenta la antigenicidad en la misma movilidad que el epítopo endógeno en plasmas de cáncer de pulmón (C, carril 1). D) Transferencia de Western de un gel SDS-PAGe no reductor que muestra fibrinógeno purificado (6 nmoles) en todos los carriles (parte superior), con y sin incubación previa con 100 pmoles de los péptidos indicados (Tabla 2), explorado con anticuerpos para CIZ1b como se indica. En condiciones no reductoras, el fibrinógeno migra con un peso molecular aparente de ~340 kDa y este comigra con la señal de CIZ1b. E) ELISA directo que muestra la media de la A450 nm (análisis por triplicado con ETM), generada por los anticuerpos para CIZ1b 2B o 043 como se indica, utilizando equivalentes molares de complejo de péptido/fibrinógeno preformado como analito. ** prueba de t p <0,05.

Figura 11 - Validación del inmunoensayo utilizando plasma con cáncer de pulmón y controles (n=39 sin cáncer, 13 con cáncer de pulmón). A) Transferencia de Western de CIZ1b con anticuerpo 043. B) Formato de ELISA de tipo sándwich para el antígeno CIZ1b en plasma, utilizando anticuerpo de captura 043 y anticuerpo detector antifibrinógeno. C) Detección cuantitativa de fibrinógeno en las mismas muestras utilizando anticuerpos para fibrinógeno emparejados D) Sustitución de anti-fibrinógeno por anti-IgG humana en un formato de tipo sándwich similar al mostrado en B. E) Detección de IgG en plasma mediante ELISA directo. F) Normalización de los datos de C frente a los datos en G. En todos los casos, las curvas de eficacia diagnóstica (ROC) indican la relación entre la fracción de positivos verdaderos y positivos falsos (puntos negros) y el intervalo de confianza del 95 % de la curva ROC ajustada (puntos grises), y los valores del área bajo la curva (ABC) en negrita. Los gráficos de cajas y bigotes muestran el mínimo y el máximo, el cuartil inferior, la mediana y el superior, así como los valores atípicos.

Descripción detallada de la invención

CIZ1

La proteína con dedos de zinc que interactúa con Cip1 (Ciz1) es una proteína que en los seres humanos está codificada por el gen CIZ1.

Ciz1 estimula el inicio de la replicación del ADN en mamíferos, donde ayuda a coordinar las funciones secuenciales de las proteínas cinasas dependientes de ciclina E y A (Coverley et al; J Cell Sci. 2005; 118(Pt 1):101-112). Interactúa directamente con las ciclinas E y A, CDK2 y el inhibidor de cinasa dependiente de ciclina p21, y también desempeña un papel indirecto en la replicación del ADN al modular la expresión de genes, incluida la ciclina D, que influyen en la proliferación celular (den Hollander et al; Cancer Res. 2006;66(22):11021-11029). Ciz1 a menudo se encuentra unida al componente proteico resistente a sales y nucleasas del núcleo denominado "matriz nuclear" y reside dentro de focos que se colocalizan parcialmente con sitios de replicación del ADN (Ainscough; J Cell Sci. 2007;120(Pt 1):115-124), lo que implica a Ciz1 en la organización espacial de la replicación del ADN.

Se conocen en la técnica diversas variantes de corte y empalme de Ciz1. Por ejemplo, como se describe en el documento WO 2004/051269 y Rahman et al. (BMC Cancer; 2010; 10:482).

El corte y empalme alternativo del exón 14 de Ciz1 para generar una isoforma variante b de Ciz1 se ha demostrado previamente en diversos cánceres ((documento WO 2012/017208) y (Higgins et al.; PNAS; 6 de nov.; 109(45): E3128-35)).

Como se describe en el presente documento, una isoforma variante b de Ciz1 procede de un transcrito de ARNm de Ciz1 que comprende una variante del exón 14 denominada en el presente documento como exón 14b (SEQ ID NO: 3). El exón 14b de Ciz1 carece de 24 nucleótidos en el extremo 3' en comparación con el exón 14 de longitud completa, denominado exón 14a (SEQ ID NO: 4). Los transcritos de Ciz1 que expresan el exón 14b en lugar del exón 14a (variante a) se denominan en el presente documento variante b de Ciz1, CIZ1b o simplemente variante b. Las correspondientes secuencias de aminoácidos del exón 14b y 14a de Ciz1 se muestran respectivamente como la SEQ ID NO: 5 (LKSLEKEIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIE) y la SEQ ID NO: 6 (LKSLEKEIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVEEELCKQ) (véase la Figura 2).

La secuencia que abarca una unión de corte y empalme del exón 14b y el exón 15 es, por lo tanto, distinta de la secuencia que atraviesa una unión de corte y empalme del exón 14a y el exón 15. En particular, la unión del exón 14b y el exón 15 carece de la secuencia VEEELCKQ (SEQ ID NO: 10) que está presente en la unión entre el exón 14a y el exón 15 en las proteínas variantes a de Ciz1.

Los presentes inventores han determinado que los péptidos de variante b de Ciz1 existen en un complejo con fibrinógeno. En particular, se ha demostrado que los péptidos de variante b de Ciz1 que abarcan una unión del exón 14b/exón 15 pueden unirse a fibrinógeno. Por el contrario, los péptidos de variante a de Ciz1 no pueden unirse a fibrinógeno.

Por consiguiente, como se describe en el presente documento, péptido de variante b de Ciz1 se refiere a un péptido que puede proceder de una proteína variante b de Ciz1, pero no de una proteína variante a de Ciz1. En otras palabras, péptido de variante b de Ciz1 se refiere a una porción de una proteína variante b de Ciz1 que procede de los exones 14b y el exón 15 de una proteína variante b de Ciz1 y, por lo tanto, carece de la secuencia VEEELCKQ (SEQ ID NO: 10) en la unión de corte y empalme.

En particular, un péptido de variante b de Ciz1 comprende una unión de corte y empalme de exón 14b/exón 15. En otras palabras, un péptido de variante b de ciz1 comprende secuencias de aminoácidos procedentes del exón 14b de Ciz1 (SEQ ID NO: 5) y el exón 15 de Ciz1 (SEQ ID NO: 7), y comprende la secuencia EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

SEQ ID NO: 11 EIAGQDEDHFITVDAVGCFEGDEEEEEDDEDEEEIEVRSRDISREEWKGSETYSPNTAYGVDFLVP Notablemente, los péptidos de variante b de Ciz1 no contienen aminoácidos que sean específicos de las proteínas variante a de Ciz1 y, por lo tanto, no comprenden la secuencia VEEELCKQ (SEQ ID NO: 10).

Así pues, un péptido de variante b de Ciz1 puede ser el péptido de variante b de Ciz1 mostrado como la SEQ ID NO: 11 o un fragmento del mismo que comprende EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11. Convenientemente, el péptido de variante b de Ciz1 puede comprender al menos 3, al menos 5, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50 o al menos 60 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 11 y comprender EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

Convenientemente, el péptido de variante b de Ciz1 puede comprender o consistir en 3 a 60, 5 a 60, 5 a 50, 10 a 50, 10 a 40, 10 a 30, 15 a 30 o 10 a 20 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 11 y comprende EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

Convenientemente, el péptido de variante b de Ciz1 puede comprender o consistir en 10 a 20 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 11 y comprender EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

Convenientemente, un péptido de variante b de Ciz1 puede ser un péptido que se muestra en la Tabla 1 (véase la Figura 6).

FIBRINÓGENO

En un aspecto, la presente invención se refiere al uso de un agente de captura de fibrinógeno o un agente de detección de fibrinógeno en un ensayo para detectar la variante b de Ciz1.

En el presente documento se describe el uso de un agente de unión a fibrinógeno en un ensayo para detectar la variante b de Ciz1.

El agente de unión a fibrinógeno puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente al fibrinógeno.

En particular, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une al fibrinógeno en un ensayo para detectar la variante b de Ciz1.

El fibrinógeno está implicado en la coagulación de la sangre, la fibrinólisis, interacciones celulares y de la matriz, la respuesta inflamatoria, la cicatrización de heridas y la neoplasia.

Las moléculas de fibrinógeno son estructuras alargadas de 45 nm que consisten en dos dominios D externos, cada uno conectado por un segmento de superhélice a un dominio E central. La molécula se compone de dos conjuntos de tres cadenas polipeptídicas denominadas a, p y y, que están unidos en el dominio E N-terminal por cinco puentes disulfuro simétricos. Puentes disulfuro asimétricos forman un 'anillo de disulfuro' en esta región (Mosesson; 2005; Journal of Thrombosis and Haemostasis; 3(8); 1894-1940).

La polimerización de las moléculas de fibrinógeno da como resultado la formación de una matriz de fibrina insoluble. La conversión de fibrinógeno en fibrina es desencadenada por la trombina, que escinde los fibrinopéptidos A y B de las cadenas a y p y, así, expone los sitios de polimerización N-terminales responsables de la formación del coágulo blando. El coágulo blando se convierte en el coágulo duro por el factor XIIIA, que cataliza la reticulación de la épsilon-(gamma-glutamil)lisina entre las cadenas y (más fuertes) y entre las cadenas a (más débiles) de distintos monómeros. La cadena a consiste en 610, la cadena p en 461 y la forma principal de la cadena y, yA, en 411 restos. Cada cadena a de fibrinógeno contiene una secuencia de fibrinopéptido A (FPA) N-terminal, la escisión de la cual por trombina inicia el ensamblaje de fibrina al exponer un sitio de polimerización denominado EA. Una porción de EA está en el extremo N de la cadena a de fibrina que comprende los restos 17-20, gly-pro-arg-val (GPRV), y otra porción está ubicada en la cadena p de fibrina entre los restos 15 y 42. Cada sitio EA se combina con un bolsillo de unión (Da) complementario constitutivo en el dominio D de moléculas vecinas que se ubica entre y337 y y379. Las asociaciones iniciales de EA:Da provocan que las moléculas de fibrina se alineen en una disposición de dominios solapantes escalonados de extremo a medio para formar fibrillas retorcidas de doble hebra. Las fibrillas también experimentan asociaciones laterales para crear fibras de múltiples hebras (Mosesson; como anteriormente).

Un ejemplo de proteína fibrinógeno a es la proteína fibrinógeno a humano que tiene el número de referencia de UniProtKB P02671. Esta secuencia ejemplificada tiene una longitud de 866 aminoácidos, de los cuales los aminoácidos 1 a 19 forman un péptido señal.

Un ejemplo de proteína fibrinógeno p es la proteína fibrinógeno p humano que tiene el número de referencia de UniProtKB P02675. Esta secuencia ejemplificada tiene una longitud de 491 aminoácidos, de los cuales los aminoácidos 1 a 30 forman un péptido señal.

Un ejemplo de proteína fibrinógeno y es la proteína fibrinógeno y humano que tiene el número de referencia de UniProtKB P02679. Esta secuencia ejemplificada tiene una longitud de 453 aminoácidos, de los cuales los aminoácidos 1 a 26 forman un péptido señal.

El término 'fibrinógeno' puede referirse a un complejo que comprende dos cadenas a, dos cadenas p y dos cadenas Y, o un subcomplejo del mismo (por ejemplo, que no incluye todas las cadenas del complejo de fibrinógeno completo). Los presentes inventores han determinado que los péptidos variantes b de Ciz1 tienen la capacidad de unirse a la cadena a de fibrinógeno. Así pues, en realizaciones particulares, los presentes ensayos y métodos pueden implicar la captura o detección de la cadena a de fibrinógeno. Por ejemplo, los presentes ensayos y métodos pueden implicar la detección de fibrinógeno (por ejemplo, la cadena a de fibrinógeno) después de la captura de la variante b de Ciz1 en el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1.

Un 'complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1' como se denomina en el presente documento puede comprender otros péptidos y/o proteínas además del fibrinógeno y/o el péptido de variante b de Ciz1.

Un 'agente de captura de fibrinógeno' se refiere a una entidad que es capaz de unirse a un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1. Preferentemente, un 'agente de captura de fibrinógeno' es una entidad que es capaz de unirse específicamente al fibrinógeno y se utiliza para aislar (es decir, enriquecer) el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de una muestra. Dicha unión específica puede permitir el aislamiento/enriquecimiento de fibrinógeno a partir de una muestra. En realizaciones particulares, el agente de captura de fibrinógeno puede ser capaz de unirse específicamente a una cadena a de fibrinógeno.

El agente de captura de fibrinógeno puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un péptido de variante b de Ciz1 que se une específicamente al fibrinógeno.

Un 'agente de detección de fibrinógeno' se refiere a una entidad que es capaz de unirse a un fibrinógeno. Preferentemente, un 'agente de detección de fibrinógeno' es una entidad que es capaz de unirse específicamente a fibrinógeno. Dicha unión específica permite la detección de fibrinógeno después de la captura de la variante b de Ciz1 en el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1. En realizaciones particulares, el agente de captura de fibrinógeno o el agente de detección de fibrinógeno puede ser capaz de unirse específicamente a una cadena a de fibrinógeno. El agente de detección de fibrinógeno puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente al fibrinógeno.

El agente de detección de fibrinógeno puede marcarse con una entidad que permita detectarlo en un ensayo como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el agente de detección de fibrinógeno puede marcarse con una entidad fluorescente o un marcador sustrato de enzima como se describe en el presente documento.

ANTICUERPO

Anticuerpo o un fragmento del mismo, se refiere a cualquier porción de un anticuerpo que conserva la capacidad de unirse al mismo antígeno diana que el anticuerpo parental, por ejemplo, un anticuerpo de fibrinógeno o un fragmento del mismo es capaz de unirse a fibrinógeno.

Los anticuerpos de fibrinógeno son conocidos en la técnica. Por ejemplo, pAb anti-fibrinógeno de oveja (AF4786 R&D systems), ab58207 (Abcam); Anti-fibrinógeno, clon 85D4 (N.° de Cat. F9902; Sigma Aldrich); y Anticuerpo de Fibrinógeno (MFB-h B) (N.° de Cat. MA1-35371; Life Technologies).

Los anticuerpos de cadena a de fibrinógeno son conocidos en la técnica. Por ejemplo, EPR2918 (ab108616; Abcam); Anticuerpo de fibrinógeno (5C5) (LF-MA0108; Pierce); y EPR2919 (TA307697; Origene).

La presente invención también abarca métodos que comprenden la etapa de detección de la variante b de Ciz1 o de captura del complejo de variante b de Cizl/fibrinógeno poniendo en contacto la variante b de Ciz1 con un anticuerpo o fragmento del mismo que se une a la variante b de Ciz1. Se puede generar un anticuerpo que se une específicamente a un péptido de variante b de Ciz1 como se describió anteriormente para el anticuerpo 2B (Higgins et al; 2012; PNAS; 6 de nov.; 109(45): E3128-35).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico. Los anticuerpos quiméricos pueden producirse trasplantando dominios variables de anticuerpos de una especie (por ejemplo, un ratón) a dominios constantes de anticuerpos de otra especie (por ejemplo, un ser humano).

El anticuerpo puede ser un anticuerpo clásico de longitud completa. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser una molécula de IgG, IgM o IgA.

El anticuerpo puede ser un fragmento de anticuerpo funcional. Los fragmentos de anticuerpo específicos incluyen, pero sin limitación, (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo, (iv) el fragmento dAb, que consiste en un único dominio variable, (v) regiones CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv monocatenarias (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno, (viii) dímeros Fv monocatenarios biespecíficos y (ix) "diacuerpos" o "triacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica. Los fragmentos de anticuerpo pueden modificarse. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL.

El anticuerpo descrito en el presente documento puede ser un anticuerpo multiespecífico y, especialmente, un anticuerpo biespecífico, también denominados en ocasiones "diacuerpos". Estos son anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos distintos. Los diacuerpos pueden fabricarse de diversas formas conocidas en la técnica, por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos. El anticuerpo puede ser un minicuerpo. Los minicuerpos son proteínas similares a anticuerpos minimizadas que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el scFv puede unirse a la región Fc y puede incluir parte o toda la región bisagra.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo de dominio (también denominado anticuerpo de dominio único o nanocuerpo). Este es un fragmento de anticuerpo que contiene un único dominio de anticuerpo variable monomérico individual. Los ejemplos de anticuerpos de dominio único incluyen, pero sin limitación, los fragmentos VHH descubiertos originalmente en camélidos y los fragmentos VNAR descubiertos originalmente en peces cartilaginosos. Además, pueden generarse anticuerpos de dominio único dividiendo los dominios variables diméricos de moléculas de IgG comunes en monómeros.

El anticuerpo puede ser un anticuerpo sintético (también denominado mimético de anticuerpo). Los miméticos de anticuerpo incluyen, pero sin limitación, Affibodies, los DARPin, Anticalinas, Avímeros, Versacuerpos y Duocalinas. APTÁMEROS

Los aptámeros que reconocen específicamente fibrinógeno o la variante b de Ciz1 pueden sintetizarse utilizando técnicas convencionales de síntesis de ácidos nucleicos o seleccionarse de un gran conjunto de secuencias al azar, por ejemplo, utilizando la técnica de Evolución Sistemática de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial (SELEX, forma siglada de Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment).

Los aptámeros pueden ser secuencias de ADN o ARN monocatenarias que se pliegan en una estructura 3D exclusiva que tiene una combinación de tallos, bucles, cuadruplexes, seudonudos, protuberancias u horquillas. El reconocimiento molecular de aptámeros es el resultado de interacciones intermoleculares tales como el apilamiento de anillos aromáticos, interacciones electrostáticas y de van der Waals, o enlaces de hidrógeno con un compuesto diana. Además, la interacción específica entre un aptámero y su diana se complementa a través de un mecanismo de ajuste inducido, lo que precisa que el aptámero adopte una estructura plegada exclusiva para su diana. Los aptámeros pueden modificarse para que estén unidos a moléculas marcadoras tales como colorantes, o inmovilizarse en la superficie de perlas o sustratos para distintas aplicaciones.

Los aptámeros pueden combinarse con nanotecnología, tecnología de micromatrices, microfluidos, espectrometría de masas y otras tecnologías para la cuantificación en una muestra dada.

Normalmente, un agente de captura de fibrinógeno o un agente de captura de variante b de Ciz1 se inmovilizará sobre un soporte, tal como una matriz, o se capturará en un soporte sólido, tal como perlas. A continuación, se incuba una muestra que se va a analizar con el soporte que comprende el agente de captura de manera que el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 pueda aislarse/enriquecerse a partir de la muestra. Los soportes (por ejemplo, soportes sólidos) pueden fabricarse de una diversidad de materiales, tales como vidrio, sílice, plástico, nylon y nitrocelulosa. Cuando se une a un soporte sólido, es preferentemente rígido y tiene una superficie plana.

El agente de captura de fibrinógeno o el agente de captura de variante b de Ciz1 puede comprender una fracción que se puede capturar en una superficie sólida, tal como una fracción de biotina que puede capturarse mediante perlas de estreptavidina. En tales realizaciones, la captura a un soporte puede producirse después de la incubación del agente de captura con una muestra.

DETECCIÓN DE LA VARIANTE b DE CIZ1 O CAPTURA DE UNA VARIANTE b DE CIZ1

Convenientemente, la variante b de Ciz1 puede ser un péptido de variante b de Ciz1 como se describe en el presente documento.

Puede detectarse una variante b de Ciz1 utilizando una diversidad de métodos y técnicas adecuados conocidos en la técnica.

El método puede comprender las siguientes etapas: a) la captura de un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de fibrinógeno; y b) la detección de la variante b de Ciz1 utilizando un agente de detección de la variante b de Ciz1.

El método puede comprender las siguientes etapas: a) la captura de un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de la variante b de Ciz1; y b) la detección de fibrinógeno utilizando un agente de detección de fibrinógeno.

Como se usa en el presente documento, 'agente de captura de variante b de Ciz1' se refiere a una entidad que es capaz de unirse a una variante b de Ciz1 y se utiliza para aislar (es decir, enriquecer) el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de una muestra. Preferentemente, un 'agente de captura de variante b de Ciz1' es una entidad que es capaz de unirse específicamente a la variante b de Ciz1. Dicha unión específica permite el aislamiento/enriquecimiento del complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de una muestra.

El agente de captura de variante b de Ciz1 puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un péptido de variante b de Ciz1 que se une específicamente al fibrinógeno.

En realizaciones particulares, se puede capturar un complejo de variante b de Ciz1/fibrinógeno utilizando un anticuerpo o fragmento del mismo que se una al péptido de variante b de Ciz1. Se puede generar un anticuerpo que se une específicamente a un péptido de variante b de Ciz1 como se describió anteriormente para el anticuerpo 2B (Higgins et al; 2012; PNAS; 6 de nov.; 109(45): E3128-35).

'Agente de detección de variante b de Ciz1' se refiere a una entidad que es capaz de unirse a una variante b de Ciz1 y se utiliza para unirse al complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 después de haberlo aislado (es decir, enriquecido) a partir de una muestra utilizando un agente de captura. Preferentemente, un 'agente de detección de la variante b de Ciz1' es una entidad que es capaz de unirse específicamente a la variante b de Ciz1. Dicha unión específica permite la detección de una variante b de Ciz1 después de la captura del complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1.

El agente de detección de la variante b de Ciz1 puede ser un anticuerpo o un fragmento del mismo, que se une específicamente a la variante b de Ciz1.

El agente de detección de la variante b de Ciz1 puede marcarse con una entidad que permita detectarlo en un ensayo como se describe en el presente documento. Por ejemplo, el agente de detección de la variante b de Ciz1 puede marcarse con una entidad fluorescente o un marcador sustrato de enzima como se describe en el presente documento. Por ejemplo, los métodos para la detección de la variante b de Ciz1 pueden emplear matrices basadas en anticuerpos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), transferencia de western o espectrometría de masas.

Se puede realizar un ELISA de acuerdo con métodos generales que se conocen en la técnica. Por ejemplo, el ELISA puede ser un ELISA de tipo sándwich o competitivo.

Un ELISA de tipo sándwich puede comprender las siguientes etapas:

- se prepara una superficie (es decir, un pocillo de placa de microtitulación) a la que se une una cantidad conocida de agente de captura (por ejemplo, un agente de captura de variante b de Ciz1 o un agente de captura de fibrinógeno);

- se bloquean los sitios de unión inespecífica de la superficie;

- la muestra que comprende la variante b de Ciz1 se aplica a la placa;

- la placa se lava para eliminar el antígeno no unido;

- se añade un anticuerpo primario que es capaz de unirse específicamente al fibrinógeno o a la variante b de Ciz1, y se une al antígeno;

- se aplica un anticuerpo secundario ligado a enzima como anticuerpo de detección que se une específicamente a la región Fc del anticuerpo;

- la placa se lava para eliminar los conjugados de anticuerpo-enzima no unidos, antes de añadir una sustancia química para que la enzima la convierta en una señal de color o fluorescente, o electroquímica;

- se mide la absorbancia o fluorescencia, o la señal electroquímica de los pocillos de la placa para determinar la presencia y cantidad de antígeno.

En realizaciones particulares, los presentes métodos comprenden la etapa de capturar un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de fibrinógeno o un agente de captura de variante b de Ciz1 como se describe en el presente documento.

En una realización, los presentes métodos comprenden un ELISA de tipo sándwich que comprende las etapas de capturar un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de variante b de Ciz1 como se describe en el presente documento y detectar el complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 utilizando un agente de detección de fibrinógeno como se describe en el presente documento.

Un ELISA competitivo puede comprender las siguientes etapas:

- se incuba un anticuerpo marcado que se une específicamente a la variante b de Ciz1 en presencia de una muestra que comprende la variante b de Ciz1;

- los complejos de anticuerpo/antígeno unidos se añaden a continuación a un pocillo recubierto de antígeno;

- se lava la placa, por lo que se elimina el anticuerpo no unido;

- se añade un anticuerpo secundario, específico para el anticuerpo primario y acoplado a una enzima;

- se añade un sustrato para la enzima y la reacción de la enzima con su sustrato producir una señal cromogénica o fluorescente;

- la reacción se detiene para evitar una saturación final de la señal.

Hay disponibles diversos marcadores de enzima-sustrato, por ejemplo, como se divulga en el documento US 4.275.149. La enzima generalmente cataliza una modificación química del sustrato cromogénico que puede detectarse. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un sustrato o puede modificar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen peroxidasa, tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO), fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Las técnicas para conjugar enzimas con anticuerpos son muy conocidas.

La detección de un péptido de variante b de Ciz1 puede comprender poner en contacto dicho de péptido variante b de Ciz1 con un anticuerpo o fragmento del mismo que se una al péptido de variante b de Ciz1. Se puede generar un anticuerpo que se une específicamente a un péptido de variante b de Ciz1 como se describió anteriormente para el anticuerpo 2B (Higgins et al; 2012; PNAS; 6 de nov.; 109(45): E3128-35).

En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de la variante b puede unirse a un epítopo que comprende la secuencia EVR mostrada en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

En algunas realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que comprende DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 2) pero no se une específicamente a una secuencia de aminoácidos que comprende DEEEIEVEEELCKQVRSRDIS (SEQ ID NO: 9).

Sin embargo, en algunas realizaciones, la secuencia unida por un anticuerpo específico para la variante b puede estar presente tanto en el exón 14a de Ciz1 (SEQ ID NO: 6) como en el exón 14b de Ciz1 (SEQ ID NO: 5). En tales realizaciones, el anticuerpo específico para la variante b puede ser incapaz de unirse a la variante a de Ciz1 debido a la presencia de la secuencia VEEELCKq (SEQ ID NO: 10) impide la unión del anticuerpo. En otras realizaciones, los anticuerpos pueden unirse a secuencias presentes tanto en el exón 14a de Ciz1 como en el exón 14b de Ciz1, debido a que las secuencias se presentan en una estructura o conformación específica de la variante b.

En algunas realizaciones, el anticuerpo específico de la variante b puede unirse a un epítopo formado por un complejo de péptido de variante b de Ciz1//fibrinógeno.

Sin desear quedar ligados a teoría alguna, la unión de la variante b de Ciz1 al fibrinógeno puede exponer epítopos que comprenden secuencias de aminoácidos que son comunes entre el exón 14a de Ciz1 (SEQ ID NO: 6) y el exón 14b de Ciz1 (SEQ ID NO: 5) en una conformación que es exclusiva para el fibrinógeno/variante b de Ciz1. Por lo tanto, tales epítopos conformacionales no estarán presentes en la variante a de Ciz1.

MUESTRA

En determinadas realizaciones, la presente invención utiliza una muestra aislada de un sujeto. Esta muestra puede denominarse 'muestra de prueba'. Por tanto, los presentes métodos se practican normalmente fuera del cuerpo humano o animal, por ejemplo, en una muestra que se obtuvo previamente del sujeto que se va a analizar.

La muestra puede ser una muestra de sangre, orina, saliva o lavado broncoalveolar.

En una realización preferida, la muestra es una muestra de sangre. Convenientemente, la muestra de sangre puede ser una muestra de sangre entera. Convenientemente, la muestra de sangre puede ser una fracción de sangre, por ejemplo, una muestra de plasma.

Las técnicas para recolectar muestras de sangre y separar fracciones de sangre son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, pueden recolectarse muestras de sangre venosa de los pacientes utilizando una aguja y depositarse en tubos de plástico. Los tubos de recolección pueden, por ejemplo, contener anticoagulantes, sílice recubierta por pulverización o un gel polimérico para la separación. El plasma puede separarse mediante centrifugación a 1300 FCR durante 10 min a temperatura ambiente y reservarse en pequeños tubos de plástico a -80 °C.

En una realización preferida, la muestra es una muestra de sangre, en particular una muestra de plasma. En una realización preferida, la muestra de sangre se trata con anticoagulantes (por ejemplo, heparina) después de la recolección.

DETERGENTE

En una realización, los presentes métodos pueden comprender el tratamiento de la muestra con un detergente para liberar la variante b de Ciz1 y/o un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1.

Los ejemplos de detergente incluyen, pero sin limitación, dodecilsulfato de sodio (SDS) y polisorbato 20. Por ejemplo, la muestra puede tratarse con SDS aproximadamente del 1 al 5 %, preferentemente 1 al 2 %.

Convenientemente, los presentes métodos pueden comprender además el tratamiento de la muestra con un agente reductor para purificar adicionalmente la variante b de Ciz1 y/o un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1. Los ejemplos de agentes reductores de adecuados incluyen, pero sin limitación, Ditiotreitol (DTT), que puede utilizarse en una concentración de DTT de aproximadamente 10 mM, por ejemplo.

EXOSOMAS

Los presentes métodos pueden comprender la etapa de liberar la variante b de Ciz1 y/o un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 del compartimento exosómico de una muestra. Convenientemente, los presentes métodos pueden comprender la etapa de liberar péptidos de variante b de Ciz1 del compartimento exosómico de una muestra.

Los exosomas son vesículas de tamaño nanométrico (30-100 nm) que se encuentran en muchos líquidos biológicos, tales como orina, sangre (tanto en plasma como en suero), ascitis y líquido cefalorraquídeo. Se originan como vesículas internas de cuerpos multivesiculares (los CMV) en las células y se describieron por primera vez como productos de células sanguíneas circulantes, tales como eritrocitos y linfocitos.

Los exosomas están rodeados por una membrana fosfolipídica que contiene niveles relativamente altos de colesterol, esfingomielina y ceramida, y que contienen dominios de membrana resistentes a detergente (balsas lipídicas) (Mathivanan et al., 2010; J Proteomics 73:1907-1920).

Los exosomas se caracterizan por la presencia de proteínas implicadas en el transporte y fusión de membranas, tales como Rab, GTPasas, anexinas y flotilina, componentes del complejo de clasificación endosómico necesario para el complejo de transporte (ESCRT, forma siglada del inglés, Endosomal Sorting Complex Required for Transport) tales como Alix, el gen de susceptibilidad tumoral 101 (TSG101), proteínas de choque térmico (las HSP), integrinas y tetraspaninas, incluyendo c D63, CD81 y CD82 (van der Pol et al.; 2012; 64(3); 676-705).

Liberación de la variante b de Ciz1 y/o un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico se refiere a romper la integridad estructural del exosoma, de manera que los epítopos de la variante b de Ciz1 que estaban previamente ocultos dentro de la estructura interna de los exosomas están expuestos para la unión. Convenientemente, liberación de la variante b de Ciz1 y/o un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico puede referirse al tratamiento de una muestra con un detergente. Los ejemplos de detergente incluyen, pero sin limitación, dodecilsulfato de sodio (SDS) y polisorbato 20.

En una realización, la muestra puede tratarse con un detergente a una concentración que sea adecuada para liberar la variante b de Ciz1 y/o un complejo de fibrinógeno/variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico. Por ejemplo, la muestra puede tratarse con SDS aproximadamente del 1 al 5 %, preferentemente 1 al 2 %.

ENRIQUECIMIENTO DE EXOSOMAS

Los presentes métodos pueden implicar el enriquecimiento de una fracción exosómica de una muestra.

Como se usa en el presente documento, enriquecer una fracción exosómica es sinónimo de purificar o aislar una fracción exosómica.

Los exosomas pueden purificarse mediante métodos conocidos en la técnica tales como ultracentrifugación (Pisitkun et al (2004) PNAS 101:13368-13373) o ultrafiltración (Cheruvanky et al (2007) Am. J. Physiol. Renal Physiol.

292:F1657-F1661). Además, se conocen métodos que implican procedimientos de cromatografía y electroforesis de flujo continuo que pueden preceder a la centrifugación (Taylor y Gercel-Taylor (2005) Br J Cancer 92:305-311). La ultrafiltración de flujo cruzado también puede utilizarse como parte del método de purificación de exosomas (Lamparski et al (2002) J Immunol. Methods 270:211-226).

Además, se encuentran disponibles kits comerciales para el aislamiento de exosomas, por ejemplo, el kit Total Exosome Isolation proporcionado por Invitrogen.

Los exosomas pueden aislarse a partir de una multitud de líneas celulares y líquidos corporales combinando centrifugación diferencial, filtración por membrana, concentración, velocidad de centrifugación zonal e inmunocaptura, exosomas (Simpson et al.; Proteomics, 8 (2008), pág. 4083-4099).

Los exosomas pueden detectarse y/o purificarse sobre la base de su expresión de marcadores exosómicos, tales como el gen de susceptibilidad tumoral (TSG101), acua-porina-2 (AQP2), enolasa específica de neurona (NES), anexina V, podocalixina (PODXL) y CD9. Por ejemplo, los exosomas pueden capturarse en una microplaca, por ejemplo, por captura de inmunoafinidad.

La caracterización de los exosomas aislados se realiza normalmente utilizando microscopía electrónica, FACS, CL-EM/EM, transferencia de Western o ELISA (Simpson et al.; como anteriormente) y (van Niel et al; J Biochem (Tokio), 140 (2006), pág. 13-21).

CÁNCER

En un aspecto, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico del cáncer en un sujeto.

Como se usa en el presente documento, el término "cáncer" o "cancerosas" se refiere a células que tienen capacidad de crecimiento autónomo, es decir, un estado anómalo o afección caracterizado por un crecimiento celular de rápida proliferación. Se pretende que el término incluya todos los tipos de crecimientos cancerosos o procesos oncogénicos, tejidos metastásicos o células, tejidos u órganos transformados a malignos, independientemente del tipo histopatológico o del estadio de invasividad. El término "cáncer" incluyen neoplasias malignas de diversos aparatos y sistemas, tales como las que afectan, por ejemplo, al pulmón, la mama, de glándula tiroidea, el sistema linfoide, el aparato gastrointestinal, el reproductor y el genitourinario, así como adenocarcinomas que incluyen neoplasias tales como la mayor parte de los cánceres de colon, carcinoma de células renales, cáncer de próstata y/o tumores testiculares, carcinoma de pulmón no microcítico, cáncer de intestino delgado y cáncer de esófago.

Convenientemente, el cáncer puede ser cáncer de pulmón, linfoma, cáncer de riñón, cáncer de mama, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer de ovario o de glándula tiroidea.

En una realización, el cáncer es cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón puede ser cáncer de pulmón microcítico. El cáncer de pulmón puede ser cáncer de pulmón no microcítico.

SUJETO

El sujeto puede ser un sujeto humano o animal. Preferentemente, el sujeto es un ser humano.

El sujeto puede tener, o puede estar en riesgo de tener, como se describe en el presente documento. 'En riesgo de tener cáncer' se refiere a un sujeto que no muestra ningún síntoma de la enfermedad. El sujeto puede tener una predisposición o puede creerse que está en riesgo de desarrollar cáncer.

TRATAMIENTO

En el presente documento se describe un método para el tratamiento de un sujeto con cáncer, que comprende administrar al sujeto una opción terapéutica contra el cáncer; en donde se ha identificado que el sujeto tiene cáncer mediante un método de la presente invención.

En este caso se describe un fármaco antineoplásico para su uso en el tratamiento del cáncer, en donde se ha identificado que el sujeto tiene cáncer mediante un método de la presente invención. En el presente documento se describe un fármaco antineoplásico contra el cáncer de pulmón para su uso en el tratamiento del cáncer de pulmón, en donde se ha identificado que el sujeto tiene cáncer de pulmón mediante un método de la presente invención. 'Tratamiento' o 'para tratar' se refiere al uso terapéutico de un agente terapéutico o antineoplásico. En el presente documento, el agente terapéutico contra el cáncer o antineoplásico puede administrarse a un sujeto que tiene una enfermedad o afección existente con el fin de disminuir, reducir o mejorar al menos un síntoma asociado con la enfermedad y/o para ralentizar, reducir o bloquear la progresión de la enfermedad.

FÁRMACO ANTINEOPLÁSICO

'Fármaco antineoplásico' es sinónimo de opción terapéutica contra el cáncer y se refiere a una entidad que puede utilizarse para tratar el cáncer.

El fármaco contra el cáncer puede ser una citocina o un factor hematopoyético que incluye, pero no limitado a, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IL-6, CSF-1, M-CSF, GM-CSF, IFNa, IFNp, IFNy, IL-10, IL-12, VEGF, proteínas morfogenéticas óseas, los FGF, TNF y TGFp.

El fármaco antineoplásico puede ser un agente quimioterapéutico, que puede ser un fármaco citotóxico. Un agente quimioterapéutico contemplado incluye, sin limitación, agentes alquilantes, nitrosoureas, etileniminas/metilmelamina, alquil sulfonatos, antimetabolitos, análogos de pirimidina, epipodofilotoxinas, enzimas tales como L-asparaginasa; modificadores de la respuesta biológica, tales como IFNa, IL-2, G-CSF y GM-CSF; complejos de coordinación de platino tales como cisplatino y carboplatino, antracenodionas, urea sustituida tal como hidroxiurea, derivados de metilhidracina, incluyendo N-metilhidracina (MH) y procarbacina, supresores corticosuprarrenales, tales como mitotano (o,p'-DDD) y aminoglutetimida; hormonas y antagonistas, incluyendo antagonistas de adrenocorticoesteroides, tales como prednisona y equivalentes, dexametasona y aminoglutetimida; progestina tal como caproato de hidroxiprogesterona, acetato de medroxiprogesterona y acetato de megestrol; un estrógeno tal como dietilestilbestrol y equivalentes de etinilestradiol; un antiestrógeno tal como tamoxifeno; andrógenos incluyendo propionato de testosterona y fluoximesterona/equivalentes; antiandrógenos tales como flutamida, análogos de la hormona liberadora de gonadotropinas y leuprolida; y antiandrógenos no esteroideos tales como flutamida.

El fármaco antineoplásico puede ser un ARNip o un ARNhc.

Convenientemente, el fármaco antineoplásico puede ser un fármaco antineoplásico para el cáncer de pulmón. Fármaco antineoplásico contra el cáncer de pulmón se refiere a una entidad que puede utilizarse para tratar el cáncer de pulmón.

KIT

En un aspecto, la presente invención proporciona un kit que comprende un agente que se une específicamente a fibrinógeno y un agente que se une específicamente a una variante b de Ciz1.

El agente que se une específicamente a fibrinógeno puede ser un agente de captura de fibrinógeno como se describe en el presente documento.

El agente que se une específicamente a una variante b de Ciz1 puede ser un agente de detección de la variante b de Ciz1 como se describe en el presente documento.

Las expresiones "que comprende", "comprende" y "compuesto por", como se usan en el presente documento, son sinónimas de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivas o abiertas y no excluyen componentes, elementos o etapas de procedimiento adicionales no enumerados. Las expresiones "que comprende", "comprende" y "compuesto por" también incluyen la expresión "que consiste en".

La invención se describirá ahora con más detalle mediante Ejemplos, que pretenden servir para ayudar a un experto en la materia a llevar a cabo la invención y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1 - Enriquecimiento de la variante b de Ciz1 en una fracción exosómica a partir de una muestra de sangre

El anticuerpo 043 se generó y validó como se describe anteriormente para el anticuerpo 2B (Higgins et al.; PNAS 2012; 6 de nov.; 109(45): E3128-35)). El anticuerpo fue capaz de detectar el polipéptido de variante b de Ciz-1 mediante transferencia de Western en plasma de pacientes con cáncer de pulmón (véase la Figura 1a).

Se separó plasma de pacientes con cáncer de pulmón en el compartimento exosómico y el compartimento soluble utilizando el kit Total Exosome Isolation de Invitrogen (número de catálogo 4484450) utilizado según las recomendaciones del fabricante. Las fracciones se separaron mediante SDS-PAGE y se exploraron con anticuerpo 043 o con anticuerpos de CIZ1 'genéricos' que reconocen un epítopo en otra parte de la proteína (los datos mostrados en la Figura 1b se generan con NB100-74624 (Nov4), Novus Biologicals).

Las especies que contenían epítopos de la variante b de Ciz1 migraron con una movilidad relativa de ~70 kDa. Las especies conteniendo epítopos de la variante b de Ciz1 cofraccionaron con la fracción exosómica en pacientes con cáncer de pulmón (véase la Figura 1b, las flechas rojas y azules indican los carriles que muestran las distintas separaciones de isoformas de Ciz1). En pacientes infrecuentes, la especie que contiene epítopos de la variante b de Ciz1 se separa parcialmente con la fracción no exosómica (tipo 2, Fig. 1c). El plasma de estos pacientes dio una señal positiva en un ELISA de tipo sándwich de la variante b de Ciz1 sin ningún pretratamiento para disolver exosomas. Para los pacientes cuya especie que contiene epítopos de la variante b de Ciz1 está por completo en la fracción de exosomas, puede accederse al epítopo de la variante b de Ciz1 tratando el plasma (tipo 1) con detergente antes del ensayo (Fig. 1e,f).

Ejemplo 2 - Reconstitución del epítopo a partir de péptidos sintéticos de la variante b y fibrinógeno

Los anticuerpos 2B (Fig. 3a) y 043 (Fig. 1a) reconocen la variante b de Ciz1 en la región de la unión exclusiva entre el exón 14b y el 15. No reaccionan con una especie con una movilidad relativa de ~70 kDa en plasma normal (Fig. 3B, C), pero reaccionan débilmente con un péptido sintético de variante b (Fig. 3B,C). Sin embargo, cuando se combinan, los péptidos sintéticos de variante b y el plasma normal generan una nueva especie altamente reactiva de ~80 kDa. Se obtienen resultados similares con un péptido sintético de variante b de una longitud distinta (Fig. 3e), que genera cuantitativamente el epítopo (Fig. 3f).

La movilidad del epítopo de la variante b endógena en el plasma de pacientes con cáncer es sensible a un agente reductor, migrando a -340 kDa en ausencia de DTT ya ~70 kDa en presencia de DTT (Fig. 4a). La escisión del complejo de 340 kDa (Fig. 4b), seguida de una separación adicional en polipéptidos constituyentes tras la reducción, desplaza el epítopo a 70 kDa (Fig. 4c). El corte y elución de esta banda identificó la cadena alfa de fibrinógeno mediante espectrometría de masas (Fig. 4d).

La incubación del complejo de fibrinógeno purificado (Fig. 5a) con péptidos sintéticos de variante b genera un epítopo de variante b con movilidad similar al complejo de fibrinógeno (Fig. 5a). La comparación con péptidos de variante a, o derivados carboxilados de péptidos de variante b, o con distintas longitudes de péptidos de variante b, demostró que i) la reconstitución del epítopo es específica de los péptidos que contienen la variante b, ii) la carboxilación de determinados restos E cerca de la unión de corte y empalme afecta la reconstitución del epítopo, iii) péptidos que contienen la unión de la variante b de distintas longitudes puede constituir el epítopo que existe de forma natural en el plasma humano.

Ejemplo 3 - Caracterización de la variante b de Ciz-1 como biomarcador

El análisis de CIZ1b se llevó a cabo con anticuerpo policlonal de conejo anti-péptido 2B, que se generó contra un péptido exclusivo corto que abarca la unión 14b-15 con corte y empalme alternativo (Fig.7A), con la secuencia DEEEIEVRSRDIS (SEQ ID NO: 2 - unión indicada por la valina subrayada). La estrategia para la generación, validación y la purificación se describieron previamente (Higgins et al., como anteriormente). El perfil de reactividad de la transferencia de western para 2B incluye una entidad de 65-70 kDa en SDS-PAGE de plasma de pacientes con cáncer de pulmón, más una entidad de 55 kDa en el plasma de todas las personas (Fig.7B). La especie de 65-70 kDa específica de cáncer es el biomarcador CIZ1b al que se hace referencia aquí y por Higgins. et al. A diferencia del plasma, esta proteína no pudo detectarse en muestras de suero de los mismos pacientes con cáncer de pulmón (Fig.7C), lo que sugiere que el biomarcador CIZ1b está secuestrado en sangre coagulada. En particular, la banda genérica de 55 kDa comigra con la espec. 7 de CIZ1), identificando la especie de 55 kDa como una variante o fragmento proteolítico de CIZ1h de longitud completa (que tiene un PM de longitud completa predicho de 99 kDa, secuencia de referencia del NCBI: NM_012127.2). La anchura de las bandas detectadas a través del exón 8 y el exón 17 es distinta, posiblemente debido a que el epítopo del exón 8 se encuentra dentro de una región con corte y empalme alternativo, mientras que la detección a través del exón 17 revelaría especies con o sin corte y empalme alternativo en el exón 8. Por tanto, al menos una forma de la proteína CIZ1 está presente en el sistema circulatorio en muestras de plasma con cáncer y sin cáncer por igual, sugiriendo que es parte de la fisiología normal.

Los epítopos del exón 17 y el exón 8 no están presentes en la especie de 65-70 kDa reconocidas por el anticuerpo para b de CIZ1 2B en pacientes con cáncer, lo que significa que en esta proteína faltan las secuencias tanto cadena arriba como cadena abajo del epítopo CIZ1b. Los datos sugieren que la especie de 65-70 kDa es una variante de corte y empalme de CIZ1 compleja o un complejo estable en SDS entre un fragmento de CIZ1b de CIZ1 y una proteína transportadora (Fig.7D).

Se generó un conjunto adicional de anticuerpos de conejo utilizando el mismo protocolo de inmunización que para 2B (véase Higgins et al., como anteriormente). Esto produjo el anticuerpo 043, que reacciona de forma limpia y exclusiva con la banda de 65-70 kDa en pacientes con cáncer (Fig.7B). Por tanto, 043 proporciona una herramienta de detección con aplicaciones en otros formatos de ensayo, incluyendo ELISA. La falta de reconocimiento de la especie de 55 kDa sugiere una menor contribución de las secuencias que flanquean la unión a su epítopo en comparación con 2B, y sugiere que la especie de 55 kDa no contiene la unión b de CIZ1.

La comparación directa de la capacidad de estos dos anticuerpos para discriminar a los pacientes con cáncer de pulmón mediante transferencia de Western demuestra que ambos son discriminatorios, con un alto grado de correlación (Fig.7E), aunque, notablemente, no comparten exactamente el mismo perfil en todo el conjunto de plasmas de prueba. Por tanto, existe algo de variación en sus epítopos, pero hay una capacidad común para discriminar pacientes con cáncer de pulmón de los que no lo tienen. Además, hay una pequeña ventaja en la integración de su resultado para maximizar la selectividad.

Ejemplo 4 - Estabilidad del biomarcador de variante b de Ciz-1

Los datos sustentan la afirmación de que CIZ1b es un potente biomarcador circulante para cáncer de pulmón, con un potencial significativo para su aplicación en la práctica clínica. Para alcanzar este potencial, debe ser lo suficientemente robusto como para resistir las variaciones en los regímenes de recolección y procesamiento de muestras que se producen en los hospitales muy concurridos. Por lo tanto, se analizó la estabilidad de la especie CIZ1b selectiva de cáncer de 65-70 kDa en plasma y en sangre entera, y se comparó con la especie de 55 kDa, utilizando el anticuerpo 2B. Los datos muestran estabilidad en plasma aislado durante al menos 6 horas cuando se incuba a 37 °C, con descomposición gradual de ambas especies a partir de entonces. De manera similar, hubo relativamente poco cambio durante una hora a temperaturas de hasta 50 °C, y estabilidad durante al menos 3 ciclos de congelación-descongelación. Adicionalmente, cuando se dejaba sangre entera en la mesa de laboratorio durante hasta 24 horas antes del fraccionamiento, no había pérdida de señal, todo lo cual indica que es un biomarcador robusto adecuado para su aplicación en una diversidad de ámbitos clínicos.

Ejemplo 5 - Disociación del complejo de biomarcador de variante b de Ciz-1

En condiciones nativas, tanto 2B como 043 detectan un complejo de más de 720 kDa, que comigra con una proteína abundante en plasma (Fig. 8A), pero hay muy poca discriminación entre plasmas con cáncer y sin cáncer. Tras una separación adicional a través de una segunda dimensión en condiciones desnaturalizantes, se revela la especie de 65-70 kDa específica de cáncer y (para 2B) se separa de la banda genérica de 55 kDa (Fig. 8B). Por tanto, la detección específica de cáncer de CIZ1b en un formato de inmunoensayo completamente nativo es poco probable incluso con 043. Las tres principales influencias desnaturalizantes (calor, SDS, agente reductor) que revelan la señal específica de cáncer y se evaluaron por su efecto sobre la movilidad y discriminación de CIZ1b mediante 043. Esto mostró que el SDS al 1 % desplaza las principales especies reactivas de >720 kDa en un gel nativo, a aproximadamente 340 kDa (Fig. 8C, derecha), revelando una señal específica de cáncer, así como una banda inespecífica de ~ 200 kDa tanto en muestras con cáncer como sin cáncer. El aumento de la temperatura de incubación tiene un efecto perjudicial sobre las especies específicas de cáncer, con un diferencial máximo alcanzado a 37 °C. La inclusión de un agente reductor cambió adicionalmente la movilidad de la señal específica de cáncer a la posición esperada de 65-70 kDa (Fig.8C, izquierda).

Notablemente, concentraciones más altas de agente reductor dieron como resultado la pérdida de la señal de CIZ1b (Fig.8D,E). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que la entidad de 65-70 kDa es en sí misma un complejo que es resistente a las condiciones desnaturalizantes convencionales de SDSPAGE (DTT 10 mM) pero no a tratamientos más agresivos (DTT 500 mM), y que normalmente está presente dentro de un complejo de orden superior de 340 kDa, que a su vez se libera mediante SDS de un complejo aún mayor de más de 720 kDa (ilustrado en la Fig.9A). De hecho, el fraccionamiento de plasma para enriquecer el compartimento exosómico separó de forma diferencial la especies de 55 kDa (detectada a través del exón 17) y la especie de 65-70 kDa (detectada a través de 043), detectándose la especie de 65-70 kDa exclusivamente en el sedimento, que es una fracción compleja que incluye exosomas.

Ejemplo 6 - Identificación del complejo de biomarcador de variante b de Ciz-1

Estas observaciones permiten una estrategia de purificación en gel de dos etapas para la banda de CIZ1b de 65 70 kDa. En primer lugar, la especie de 340 kDa se aisló de dos plasmas independientes de pacientes con cáncer de pulmón (Fig.10A), seguido de una separación adicional en presencia de agente reductor (Fig.10B). La banda de 65 70 kDa correspondiente a la señal de transferencia de western específica de cáncer se cortó y digirió con tripsina o endoproteasa Asp-N, para la identificación por espectrometría de masas (EM). Para ambas digestiones enzimáticas y los dos pacientes, la búsqueda en bases de datos por Mascot arrojó una única identificación significativa (P<0,05), correspondiente a Uniprot P02671; cadena alfa de fibrinógeno humano. La molécula de fibrinógeno endógeno es una glucoproteína hexamérica con una masa molecular pre-escisión de 326 kDa y una movilidad relativa de ~340 kDa, compuesta por dos conjuntos de tres cadenas distintas (a, p, e y) de 67, 51 y 45 kDa, respectivamente.

Notablemente, CIZ1b no se identificó en la banda de 65-70 kDa después de la digestión con cualquiera de las enzimas. Para determinar si podría observarse un fragmento diagnóstico C lZ lb por EM, si está presente, un péptido de CIZ1b sintético corto (b13) y un péptido de CIZ1b largo (b66, Tabla 2) se digirieron con Asp-N, lo que genera el fragmento diagnóstico DEEEIEVr s R (SEQ ID NO: 16) al cortar cualquier lado de la unión de exones de CIZ1b. El péptido se identificó positivamente después de la digestión de b13 y b66 por MALDI-EM/EM, aunque a baja intensidad con respecto a otros péptidos de la digestión. Se realizó un análisis adicional por CL-EM/EM utilizando tanto adquisición dependiente de datos (DDA, forma siglada de data dependent acquisition) como control de reacción de selección (SRM, forma siglada de selection reaction monitoring) dirigida, que centró el análisis en el ciclo a través de la fragmentación de los iones 2+ y 3+ esperados de DEEEIEVRSR (SEQ ID NO: 16), excluyendo todos los demás precursores, para maximizar la especificidad y sensibilidad de este analito. DEEEIEVRSR (SEQ ID NO: 16) se identificó tanto en los análisis de d Da como de SRM, lo que indica que el péptido diagnóstico es observable por EM cuando se corta a partir del péptido sintetizado químicamente (cromatograma de SRM).

Sin embargo, cuando se añadió el mismo péptido al plasma humano normal para reconstituir CIZ1b, el péptido DEEEIEVRSR diagnóstico (SEQ ID NO: 16) no se detectó en la banda de 65-70 kDa cortada. La falta de identificación podría reflejar: i) modificaciones secundarias que modifican la masa esperada del péptido diagnóstico b de CIZ1 o perjudican la digestión enzimática, ii) proteínas más abundantes en la muestra, principalmente cadena alfa de fibrinógeno, lo que provoca la supresión de iones o iii) abundancia absoluta que cae por debajo del límite de detección para la instrumentación después de las pérdidas sufridas en las etapas de PAGE y digestión. Cabe señalar que el péptido es altamente ácido, lo que probablemente reduzca la eficacia de ionización en la EM en modo positivo, de modo que incluso con SRM una pequeña caída de la abundancia podría caer por debajo del límite de detección. Se llegó a la conclusión de que, si el péptido añadido no podía detectarse de forma fiable a niveles fisiológicamente importantes, era improbable que fuera posible detectar el CIZ1b endógeno, por lo que se siguieron estrategias alternativas.

T l 2

Los 8 aminoácidos con corte y empalme de CIZ1b están subrayados en secuencias sin corte y empalme alternativo, y la unión creada por su ausencia se indica en las secuencias de CIZ1b por una V. Donde se indica los péptidos contienen un resto de cisteína N-terminal adicional y amidación del extremo C. Los restos de ácido glutámico carboxilado se indican mediante y.

Ejemplo 7 - Epítopo de reconstitución del complejo de biomarcador de variante b de Ciz-1

Para confirmar que el epítopo específico de cáncer de 65-70 kDa contiene en efecto secuencias de CIZ1b, se adoptó una estrategia de reconstitución de epítopos. Para conseguir esto, una pareja de péptidos sintéticos que abarcan la unión de exón 14/15 (CIZ1b13, y CIZ1a22 que incluye la secuencia intermedia con corte y empalme alternativo, Tabla 2) se incubaron con plasma humano normal (Fig.10C), y el resultado se comparó con el plasma de pacientes con cáncer de pulmón. El péptido CIZ1b, pero no CIZ1a, generó el epítopo reactivo con 043 y con 2B, de movilidad comparable al epítopo endógeno (6570 kDa), que está muy por encima de la masa molecular relativa del péptido libre y no está presente en ninguno de los componentes individuales de la reacción (carriles de péptidos 6, 7, o carril de plasma 3). Esto sugiere que el péptido de CIZ1b forma un complejo resistente a SDS/DTT con una proteína transportadora en el plasma humano, recreando el biomarcador CiZ1b reconocido por 2B y 043. Dado que no se detectó ninguna diferencia de movilidad entre el epítopo endógeno (carril 1 de plasma con cáncer) y el reconstituido, los datos también implican que el fragmento de CIZ1b que contribuye a la especie específica de cáncer de 65-70 kDa es muy corto, del orden de 10-20 aminoácidos de longitud. Adicionalmente, las moléculas individuales pueden no tener necesariamente límites moleculares uniformes, lo que posiblemente explica la naturaleza a menudo difusa de la banda.

Un equivalente molar del péptido de CIZ1b mucho más largo (b66, Tabla 2) reconstituyó el epítopo reactivo de manera menos eficaz y fue detectable solo mediante 2B (Fig.10C carril 2, y a mayor concentración). Con este péptido la señal reconstituida migró con mayor masa molecular relativa, a ~80 kDa, concordante con el tamaño aumentado del péptido contribuyente. Sobre todo, el epítopo de CIZ1b reconstituido, como epítopo endógeno, resiste las condiciones de SDS-PAGE desnaturalizantes convencionales (DTT 10 mM, SDS al 2 %, 90 °C), pero se disocia en un entorno reductor más agresivo. Tomados en conjunto, los datos sugieren que, in vivo, el epítopo específico de cáncer está compuesto por un fragmento relativamente corto de CIZ1 que abarca la unión de exón 14b/15, montado sobre la cadena alfa de fibrinógeno, que a su vez constituye la mayor parte de la masa de la especie de 65- 70 kDa. Para confirmarlo aún más, los experimentos de reconstitución de epítopos se realizaron con fibrinógeno humano purificado (Fig.10D). Para ambos anticuerpos, el epítopo reactivo se generó a la movilidad del complejo de fibrinógeno (340 kDa en geles no reductores) y la especificidad de la señal se confirmó por la falta de reactividad con el péptido de CIZ1a equivalente. El ELISA directo utilizando fibrinógeno humano formando complejo con equivalentes molares de péptidos de CIZ1a y CIZ1b (Fig.10E), confirmó i) la especificidad de la reconstitución del epítopo con péptido b13 con respecto a a22, ii) señal insignificante con fibrinógeno solo, y iii) mayor reactividad cuando el péptido está montado sobre fibrinógeno. Además, la inclusión del péptido de CIZ1b muy corto b7 (Tabla 2) reveló diferencias entre 2B y 043; 2B reconoce b7 mientras que 043 no lo hace de una manera que no esté relacionada con la presencia de fibrinógeno. La existencia del epítopo de CIZ1b en un complejo con fibrinógeno es concordante con las observaciones anteriores de que el biomarcador está empobrecido en las muestras de suero aisladas de sangre coagulada (Fig.7C).

Ejemplo 8 - Inmunoensayo para CIZ1b

Basándose en el conocimiento de la composición del biomarcador CIZ1b, se diseñó un formato de inmunoensayo de tipo sándwich capaz de detección cuantitativa en plasma parcialmente desnaturalizado. La captura de antígeno con anticuerpo para CIZ1b 043 a partir de 5 ul de plasma y la detección mediante cadena alfa de fibrinógeno, generó una señal específica de cáncer. Específicamente, los resultados por transferencia de western con 043 generaron un ABC de ROC de 0,823 (P=0,0002) y por ELISA con 043 /anti-fibrinógeno de 0,830 (P=0,0007, Fig.11A,B). Por tanto, los dos métodos generan resultados muy similares y los datos están correlacionados de forma significativa.

Este conjunto de datos, que representa a pacientes con una amplia gama de afecciones que se presentan en las clínicas de medicina respiratoria del York Hospital, también se utilizó para evaluar la contribución del componente CIZ1b del ensayo, dado que se ha informado que el fibrinógeno solo tiene cierto potencial como biomarcador para el cáncer de pulmón (Allin et al.; 2016; Int J Cancer 139(7):1493-1500). La detección cuantitativa de fibrinógeno en el intervalo lineal arrojó cierta capacidad discriminatoria en este conjunto, aunque un ABC de ROC relativamente baja de 0,628 (p=0,225). Esto concuerda con la evaluación por inmunotransferencia de western del fibrinógeno, lo que indicó poca diferencia entre los pacientes con cáncer de pulmón y aquellos sin enfermedad maligna. Por tanto, la captura de CIZ1 b es el elemento que aporta la mayor parte de la selectividad de cáncer a este ensayo. La especificidad de la configuración se analizó adicionalmente mediante el análisis del conjunto de muestras después de la captura con 043, pero sustituyendo el anticuerpo detector anti-fibrinógeno por anti-IgG humana (Fig. 11D). Los resultados indican que no hay discriminación entre los pacientes y los plasmas de control, confirmando que el anti-fibrinógeno es un reactivo detector informativo que detecta específicamente un complejo selectivo de cáncer recuperado a través de CIZ1b. Por último, la medición de los niveles totales de IgG en el conjunto B mediante ELISA directo (Fig. 11E) se utilizó para normalizar el resultado generado por 043/fibrinógeno, conduciendo a una mejora marginal en la discriminación y un ABC de ROC de 0,845 (p=0,0002, Fig.11 F).

El ELISA de complejo de CIZ1b-cadena alfa de fibrinógeno se realizó como un ELISA de tipo sándwich, después de la desnaturalización parcial de 5 ul de plasma en 100 ul de Tween20 al 0,5 %, SDS al 1 % en PBS, complementado con PMSF 0,5 mM (inhibidores de proteasa) e incubación a 20 °C durante 30 minutos con agitación vorticial repetida. Las placas (Nunc Maxisorb 442404) se recubrieron con 1 ug de fracción de proteína A de pAb para CIZ1b 043, durante una noche a 4 °C en 100 ul de carbonato 50 mM pH 9,6, a continuación, se bloqueó durante dos horas a temperatura ambiente con 300 ul de BSA al 1 % en PBS filtrada. Después de tres lavados en 300 ul de Tween20 al 0,05 % en PBS, se añadió analito durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación suave. Después de cinco lavados, el complejo capturado se detectó con pAb de oveja anti-fibrinógeno (AF4786 R&D systems) seguido de anti-oveja HRP (Jackson ImmunoResearch 213-032-177), y los resultados se desarrollaron utilizando 100 ul de Sure Blue (KPL 520001), con detección a A450 nm utilizando un lector de placas FLUOstar OPTIMA (BMG Labtech).

Para la medición de fibrinógeno el anticuerpo de captura fue IgY de pollo (1 ug/pocillo, Genway 15-288-22856), y la concentración de analito se redujo cinco órdenes de magnitud mediante dilución en serie. Para la medición de IgG humana en ELISA directo, se recubrieron directamente placas con 0,5 ul de plasma en 100 ul de tampón carbonato 50 mM pH 9,6, se bloqueó, se lavó y se detectado con anti-IgG (Jackson Immuno Research 709-035-149). Para el ELISA directo de analito sintético, se recubrieron placas con 0,5 ug de fibrinógeno purificado (Sigma F3879) formando complejo con 100 pmoles de péptido con 100 ul de carbonato 50 mM pH 9,6 como anteriormente, se explora con 043 o 2B y se detecta con anti-conejo HRP (Jackson ImmunoResearch).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un agente de captura de fibrinógeno o un agente de detección de fibrinógeno en un ensayo para detectar la variante b de Ciz1.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ensayo es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el agente de captura de fibrinógeno o el agente de detección de fibrinógeno es un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un péptido de variante b de Ciz1 que se une específicamente a fibrinógeno, en donde el péptido de variante b de Ciz1 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que comprende el motivo EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el agente de captura de fibrinógeno o un agente de detección de fibrinógeno es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a fibrinógeno o en donde el agente de captura de fibrinógeno es un péptido de variante b de Ciz1 que se une específicamente a fibrinógeno, en donde el péptido de variante b de Ciz1 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que comprende el motivo EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

5. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el fibrinógeno es la cadena alfa de fibrinógeno.

6. El uso de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde la variante b de Ciz1 se detecta mediante un método que comprende las siguientes etapas:

a) la captura de un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de fibrinógeno; y

b) la detección de péptido de variante b de Ciz1 utilizando un agente de detección de péptido de variante b de Ciz1; o

a) la captura de un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 utilizando un agente de captura de péptido de variante b de Ciz1; y

b) la detección de fibrinógeno utilizando un agente de detección de fibrinógeno.

7. Un método de diagnóstico del cáncer en un sujeto, que comprende la detección de un péptido de variante b de Ciz1 en una muestra del sujeto, en donde la presencia de péptido de variante b de Ciz1 en la muestra indica que el sujeto tiene cáncer y en donde el método comprende la etapa de capturar un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 a partir de la muestra, en donde el péptido de variante b de Ciz1 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que comprende el motivo EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende las siguientes etapas:

9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el agente de captura de péptido de variante b de Ciz1 es un anticuerpo o un fragmento del mismo que se une específicamente a péptido de variante b de Ciz1.

10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde la etapa de detección del péptido de variante b de Ciz1 o de fibrinógeno emplea matrices basadas en anticuerpos, ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), transferencia de western o espectrometría de masas.

11. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende además la etapa de liberación de un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico de la muestra, opcionalmente en donde el complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 se libera a partir del componente exosómico mediante tratamiento con detergente.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, que comprende además la etapa de enriquecimiento de la fracción exosómica a partir de la muestra, opcionalmente en donde la etapa de enriquecimiento de la fracción exosómica comprende ultracentrifugación, ultrafiltración, electroforesis de flujo continuo, cromatografía, precipitación o ultrafiltración de flujo cruzado.

13. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 16, en donde el cáncer se selecciona de cáncer de pulmón, linfoma, de riñón, mama, hígado, vejiga, ovario o glándula tiroidea, preferentemente, en donde el cáncer es cáncer de pulmón.

14. Uso de un detergente para liberar un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico de una muestra, en donde el péptido de variante b de Ciz1 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que comprende el motivo EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

15. Un método para la detección de un péptido de variante b de Ciz1 en una muestra, que comprende la etapa de liberar un complejo de fibrinógeno/péptido de variante b de Ciz1 a partir de un compartimento exosómico de la muestra tratando la muestra con detergente y detectar si el péptido de variante b de Ciz1 está presente en la muestra, en donde el péptido de variante b de Ciz1 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que comprende el motivo EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

16. Un kit que comprende un agente que se une específicamente a fibrinógeno y un agente que se une específicamente a péptido de variante b de Ciz1, en donde el péptido de variante b de Ciz1 comprende la secuencia mostrada en la SEQ ID NO: 11 o un fragmento de la misma que comprende el motivo EVR como se muestra en las posiciones 36 a 38 de la SEQ ID NO: 11.

17. Un kit de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el fibrinógeno es la cadena alfa de fibrinógeno.

18. Un kit de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, en donde el agente que se une específicamente a fibrinógeno y/o el agente que se une específicamente a péptido de variante b de Ciz1 es un anticuerpo o un fragmento del mismo.