KR20220079855A - 암의 검사 방법 - Google Patents

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다츠야 오다
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고쿠리츠켄큐카이하츠호진 상교기쥬츠 소고켄큐쇼
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Abstract

본 발명은, 대상이 암인지 아닌지를 예측하기 위하여, 당해 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 특정 성분을 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 생체 샘플 중의 Serpin3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 분리하는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 본 발명에 의하면 또한, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 제2 분자를 이용하여 실시되는 어세이에 의하여, 대상으로부터 얻어진 생체 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중에 포함되는 당단백질을 검출하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.

Description

암의 검사 방법
본 발명은, 암의 검사 방법 및 그것을 위한 검사 키트에 관한 것이다.
BC2LCN은, 당결합 단백질, 즉 렉틴의 일종이며, 이전의 보고에 의하면, 당단백질 당쇄(糖鎖)인 H-type1(Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 및 H-type3(Fucα1-2Galβ1-3GalNAc)에 친화성을 갖고, H-type3 당쇄를 갖는 포도칼릭신을 발현하는 인간 ES 세포나 iPS 세포의 미분화 마커 검출용 프로브로서 이용할 수 있는 것이 밝혀져 있다(특허문헌 1). 또, 이전의 보고에 의하면, BC2LCN은, 암의 조직에 강하게 결합하여, 암 마커 검출 프로브로서 이용할 수 있는 것이 밝혀져 있다(특허문헌 2). 특허문헌 2에 의하면, BC2LCN과 케라탄 황산에 결합하는 항체의 샌드위치 어세이에 의하여, 일부의 암 환자의 혈액 성분에 있어서, BC2LCN과 케라탄 황산에 의하여 인식되는 단백질의 존재가 확인되고 있다.
SerpinA3은, α1-안티키모트립신이라고도 불리며, 몇 개의 종양 등의 질환에 관련되어 있는 것이 알려졌다. SerpinA3은, 혈액 검사 마커로서 개발되어 있다(비특허문헌 1).
Gal3BP는, LGAL3SBP 혹은 MAC-2-BP라고도 불리며, 유방암, 폐암, 직장 결장암, 난소암, 및 자궁 내막암의 환자의 혈청에 있어서 고농도로 발견된다(비특허문헌 2).
특허문헌 1: WO2014/126146 특허문헌 2: WO2017/061449
비특허문헌 1: Nie, S. et al., J. Proteome Res. 13:1873-1884, 2014 비특허문헌 2: Koths, K. et al., J. Biol. Chem. 268:14245-14249, 1993
본 발명은, 암의 검사 방법 및 그것을 위한 검사 키트에 관한 것이다.
본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공된다.
(1) 대상으로부터 얻어진 혈액 샘플 중을 분석하는 방법으로서,
BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 샌드위치 어세이 또는 이뮤노크로마토 어세이에 의하여, 혈액 샘플 중에 포함되는 혈액 성분을 분석하는 것을 포함하는, 방법.
(2) 제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체인, 상기 (1)에 기재된 방법.
(3) 제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체인, 상기 (1)에 기재된 방법.
(4) 제1 분자가 BC2LCN인, 상기 (1)에 기재된 방법.
(5) 대상이, 암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6) 대상이, 췌장암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 상기 (5)에 기재된 방법.
(7) 대상이, 스테이지 1 또는 2의 췌장암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 상기 (6)에 기재된 방법.
(8) BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 포함하고, 제1 분자와 제2 분자를 이용하여 대상의 혈액 샘플 중의 당단백질의 양을 측정할 수 있는, 샌드위치 어세이용 또는 이뮤노크로마토 어세이용의 키트.
(9) 제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체이며, 당단백질에 있어서의 단백질 부분이 SerpinA3인, 상기 (8)에 기재된 키트.
(10) 제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체이며, 당단백질에 있어서의 단백질 부분이 Gal3BP인, 상기 (8)에 기재된 키트.
(11) 고상화(固相化)된 BC2LCN인 제2 분자와, 표지된 BC2LCN, 표지된 SerpinA3에 결합하는 항체, 및 표지된 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표지된 제1 분자를 포함하는, 상기 (8)에 기재된 키트.
(12) 암을 검출하는 것에 이용되는, 상기 (8) 내지 (11) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(13) 암이, 췌장암 및 대장암으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 암인, 상기 (12)에 기재된 키트.
(14) 암이, 스테이지 1 또는 2의 췌장암인, 상기 (13)에 기재된 키트.
(15) 대상이 암인지 아닌지를 예측하는 방법으로서, 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 방법을 실시하는 것을 포함하는, 방법.
(16) 대상으로부터 얻어진 혈액 샘플 중을 분석하는 방법으로서,
혈액 샘플 중의 혈액 성분의 유무 또는 농도를 분석하는 것을 포함하고, 혈액 성분은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분인, 방법.
본 발명에 의하면 또한, 이하의 발명이 제공될 수 있다.
(1A) 대상으로부터 얻어진 생체 샘플을 분석하는 방법으로서,
BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 어세이에 의하여, 생체 샘플 중에 포함되는 성분을 분석하는 것을 포함하는, 방법.
(2A) 제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체인, 상기 (1A)에 기재된 방법.
(3A) 제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체인, 상기 (1A)에 기재된 방법.
(4A) 제1 분자가 BC2LCN인, 상기 (1A)에 기재된 방법.
(5A) 대상이, 암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 상기 (1A) 내지 (4A) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(6A) 대상이, 췌장암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 상기 (5A)에 기재된 방법.
(7A) 대상이, 스테이지 1 또는 2의 췌장암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 상기 (6A)에 기재된 방법.
(8A) BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자인 제2 분자를 포함하고, 제1 분자와 제2 분자를 이용하여 대상의 생체 샘플 중의 당단백질의 양을 측정할 수 있는, 샌드위치 어세이용의 키트, 이뮤노크로마토 어세이용의 키트, 렉틴 전기 영동(泳動)용의 키트, 질량 분석용의 키트, 렉틴 어피니티 크로마토그래피용의 키트 또는 μTAS용의 키트.
(9A) 제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체이며, 당단백질에 있어서의 단백질 부분이 SerpinA3인, 상기 (8A)에 기재된 키트.
(10A) 제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체이며, 당단백질에 있어서의 단백질 부분이 Gal3BP인, 상기 (8A)에 기재된 키트.
(11A) 고상화된 BC2LCN인 제2 분자와, 표지된 BC2LCN, 표지된 SerpinA3에 결합하는 항체, 및 표지된 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표지된 제1 분자를 포함하는, 상기 (8A)에 기재된 키트.
(12A) 암을 검출하는 것에 이용되는, 상기 (8A) 내지 (11A) 중 어느 하나에 기재된 키트.
(13A) 암이, 췌장암인, 상기 (12A)에 기재된 키트.
(14A) 암이, 스테이지 1 또는 2의 췌장암인, 상기 (13A)에 기재된 키트.
(15A) 대상이 암인지 아닌지를 예측하는 방법으로서, 상기 (1A) 내지 (7A) 중 어느 하나에 기재된 방법을 실시하는 것을 포함하는, 방법.
(16A) 대상으로부터 얻어진 생체 샘플 중에 있어서 특정 성분을 검출하는 방법으로서,
특정 성분은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분인, 방법.
(17A) 대상으로부터 얻어진 생체 샘플로부터 2개의 BC2LCN에 동시에 결합할 수 있는 성분, SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 이상의 성분을 분리하는 것을 포함하는, 방법.
(18A) 대상이, 췌장암 또는 췌장암을 가질 가능성을 갖는 대상인, 상기 (17A)에 기재된 방법.
(19A) 췌장암이, 스테이지 I 또는 II의 췌장암인, 상기 (17A)에 기재된 방법.
(20A) 분리된 성분의 양을 측정하는 것을 더 포함하는, 상기 (17A) 내지 (19A) 중 어느 하나에 기재된 방법.
(21A) 컷오프값과 상기 측정된 성분의 양을 비교하는 것을 더 포함하는, 상기 (20A)에 기재된 방법.
(22A) 컷오프값이, 정상인의 상기 측정된 성분에 대응하는 성분의 양의 평균값 이상의 값이며, 췌장암 환자의 상기 측정된 성분에 대응하는 성분의 양의 평균값 이하의 값인, 상기 (21A)에 기재된 방법.
(23A) 분리된 성분을 검출하는 것을 더 포함하는, 상기 (17A) 내지 (19A) 중 어느 하나에 기재된 방법.
도 1은, 각종 암을 갖는 환자와 정상인의 혈액 샘플 중에서, 2분자의 BC2LCN에 의하여 동시에 인식할 수 있는 혈액 인자의 농도를 측정한 샌드위치 어세이의 결과이다.
도 2는, 혈액 샘플로부터 BC2LCN을 이용하여 BC2LCN에 결합하는 혈액 성분을 침강시키고, 그 후, 젤 전기 영동을 행하여 BC2LCN을 이용하여 웨스턴 블로트한 결과(왼쪽) 및 은 염색한 결과(오른쪽)를 나타낸다.
도 3은, 혈액 샘플로부터 BC2LCN을 이용하여 BC2LCN에 결합하는 혈액 성분을 침강시키고, 그 후, 젤 전기 영동을 행하여, 각각 SeprinA3에 대한 항체(왼쪽) 및 Gal3BP에 대한 항체(오른쪽)로 웨스턴 블로트한 결과를 나타낸다.
도 4는, 각종 암을 갖는 환자와 정상인의 혈액 샘플 중에서, BC2LCN과 SerpinA3에 결합하는 항체를 이용하여 샌드위치 어세이를 행한 결과를 나타낸다.
도 5는, 각종 암을 갖는 환자와 정상인의 혈액 샘플 중에서, BC2LCN과 Gal3BP에 결합하는 항체를 이용하여 샌드위치 어세이를 행한 결과를 나타낸다.
도 6은, 췌장암 환자와 정상인의 혈액 샘플 중에서, 2분자의 BC2LCN에 의하여 동시에 인식할 수 있는 혈액 인자의 농도, BC2LCN 결합성의 SerpinA3의 농도, BC2LCN 결합성의 Gal3BP의 농도, 및 2종류의 상이한 항(抗)SerpinA3 항체를 이용하여 측정한 SerpinA3의 농도의 결과를 나타낸다.
도 7은, 췌장암 환자와 정상인의 혈액 샘플 중의, 2분자의 BC2LCN에 의하여 동시에 인식할 수 있는 혈액 인자의 농도, BC2LCN 결합성의 SerpinA3의 농도, BC2LCN 결합성의 Gal3BP의 농도, 및 2종류의 상이한 항SerpinA3 항체를 이용하여 측정한 SerpinA3의 농도를 지표로 하여 췌장암을 검출하는 평가계에 있어서의 감도(Sensitivity) 및 특이도(Specificity)의 관계를 나타내는 ROC 곡선이다.
도 8a는, 2분자의 BC2LCN에 의하여 동시에 인식할 수 있는 혈액 인자의 췌장암 환자의 혈액 샘플 중에 있어서의 농도를 UICC TMN 분류에 있어서의 스테이지별로 측정한 결과를 나타낸다.
도 8b는, BC2LCN 결합성의 SerpinA3의 췌장암 환자의 혈액 샘플 중에 있어서의 농도를 UICC TMN 분류에 있어서의 스테이지별로 측정한 결과를 나타낸다.
도 8c는, BC2LCN 결합성의 Gal3BP의 췌장암 환자의 혈액 샘플 중에 있어서의 농도를 UICC TMN 분류에 있어서의 스테이지별로 측정한 결과를 나타낸다.
도 8d는, 2종류의 상이한 항SerpinA3 항체를 이용하여 측정한 SerpinA3의 췌장암 환자의 혈액 샘플 중에 있어서의 농도를 UICC TMN 분류에 있어서의 스테이지별로 측정한 결과를 나타낸다.
도 9는, 정상(normal) 및 췌장암을 포함하는 췌장의 조직 절편의 rBC2LCN(도면 중에서는, 간단히 "rBC2"라고 기재하는 경우가 있다)을 이용한 조직학 염색, 및 SerpinA3 및 Gal3BP에 대한 면역 조직학 염색의 결과를 나타낸다.
도 10은, 2분자의 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이, 항SerpinA3 항체를 이용한 ELISA, 항Gal3BP 항체를 이용한 ELISA의 계에 있어서의, 정상인, 만성 췌장염 환자, 및 췌장암 환자의 혈액 샘플의 분석 결과를 나타낸다.
도 11은, 2분자의 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이, 항SerpinA3 항체를 이용한 ELISA, 항Gal3BP 항체를 이용한 ELISA의 계에 있어서의, 정상인 및 만성 췌장염 환자에 대하여 췌장암 환자를 검출하는 ROC 곡선을 나타낸다. 분석은, 혈액 샘플을 이용하여 행했다.
도 12는, 2분자의 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이, 항SerpinA3 항체를 이용한 ELISA, 항Gal3BP 항체를 이용한 ELISA의 계에 있어서의, 정상인에 대하여 스테이지 I의 췌장암 환자를 검출하는 ROC 곡선을 나타낸다. 분석은, 혈액 샘플을 이용하여 행했다.
도 13은, 2분자의 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이, 항SerpinA3 항체를 이용한 ELISA, 항Gal3BP 항체를 이용한 ELISA의 계에 있어서의, 정상인에 대하여 스테이지 II의 췌장암 환자를 검출하는 ROC 곡선을 나타낸다. 분석은, 혈액 샘플을 이용하여 행했다.
도 14는, 2분자의 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이의 계에 있어서의, 정상인에 대하여 스테이지 III의 췌장암 환자를 검출하는 ROC 곡선을 나타낸다. 분석은, 혈액 샘플을 이용하여 행했다.
도 15는, 2분자의 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이의 계에 있어서의, 정상인에 대하여 스테이지 IV의 췌장암 환자를 검출하는 ROC 곡선을 나타낸다. 분석은, 혈액 샘플을 이용하여 행했다.
도 16은, 췌장암 적출 수술 전, 당해 수술의 30일 후(30POD), 및 당해 수술의 3개월 후(3m)의 환자의 혈액 샘플을, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이에 의하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 17은, 췌장암 적출 수술 전, 당해 수술의 30일 후(30POD), 및 당해 수술의 3개월 후(3m)의 환자의 혈액 샘플을, BC2LCN과 항Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이에 의하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 18은, 췌장암 적출 수술 전, 당해 수술의 30일 후(30POD), 및 당해 수술의 3개월 후(3m)의 환자의 혈액 샘플을, CA19-9를 이용한 ELISAA에 의하여 분석한 결과를 나타낸다.
도 19는, 췌장암 적출술 전, 당해 수술의 1일 후(1POD), 당해 수술의 7일 후(7POD), 및 당해 수술의 30일 후(30POD), 및 재발 후의 환자(환자 A)의 혈액 샘플을, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이로 분석한 결과를 나타낸다.
본 명세서에서는, "대상"이란, 포유 동물, 특히, 인간을 포함하는 포유류를 의미한다. 본 명세서에서는, "대상"은, 정상인일 수 있고, 또는, 암을 갖는 환자일 수 있으며, 혹은 암을 가질 가능성을 갖는 환자일 수 있다.
본 명세서에서는, "종양"이란, 자립성 증식을 나타내는 세포 집단을 의미한다. 자립성 증식이란, 체내의 정상적인 세포 증식 제어를 벗어나, 자율적으로 증식을 계속하는 세포의 성질을 의미한다. 종양은, 양성 종양과 악성 종양(암)으로 크게 나뉜다. 양성 종양은, 자립성 증식을 하지만, 전이 및 침윤, 및 악액질을 일으키는 경우가 없는 종양이다. 악성 종양은, 자율 증식에 더하여, 정상 조직으로의 침윤, 전이, 및 악액질 중 어느 하나 이상을 일으킨다.
본 명세서에서는, "생체 샘플"이란, 대상으로부터 얻어지는 샘플(예를 들면, 조직, 세포, 세포 외액, 및 체액)을 의미한다. 체액으로서는, 혈액, 요(尿), 복수, 흉수, 및 분비액(예를 들면, 내분비액 및 외분비액, 예를 들면, 췌액 등의 소화액)을 들 수 있다. 본 명세서에서는, "혈액 샘플"이란, 대상으로부터 얻어지는 혈액(예를 들면, 말초혈) 또는 혈액에서 유래하는 샘플(예를 들면, 혈청 및 혈장)이다. 본 명세서에서는, "혈액 성분"이란, 혈액에 포함되는 성분이며, 특히 혈액에 포함되는 액체 성분이다. 본 명세서에서는, 후술하는 바와 같이, 생체 샘플이 혈액 샘플인 경우, 성분은 혈액 성분이다.
본 명세서에서는, "항체"는, 면역 글로불린을 의미한다. 항체는, 항원에 대하여 결합하는 특성을 갖는 생체 분자이다. 항체는, 항원에 대하여 특이성을 가질 수 있다. 항체는, 모노클로널 항체여도 되고, 폴리클로널 항체여도 된다. 항체는, 이중 특이성 항체를 포함할 수 있다. 항체는, 전체 길이의 항체와, 항원에 대한 결합성을 갖는 그 단편(斷片)일 수 있다.
본 명세서에서는, "BC2LCN"이란, Burkholderia cenocepacia 유래의 렉틴인 BC2L-C의 N 말단 도메인이다(Sulak, O., et al., Structure, 18(1):59-72, 2010). 이전의 보고에 의하면, BC2LCN은, 당단백질 당쇄인 H-type1(Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc) 및 H-type3(Fucα1-2Galβ1-3GalNAc)에 친화성을 갖는 것이 밝혀져 있고, 또한, BC2LCN은, H-type3 당쇄를 갖는 포도칼릭신을 발현하는 인간 ES 세포나 iPS 세포의 미분화 마커로서 이용할 수 있는 것이 밝혀져 있다(WO2014/1236146). 또, 이전의 보고에 의하면, BC2LCN은, 암의 조직에 특이적으로 발현하여, 암을 검출하는 것으로서 이용할 수 있는 것이 밝혀져 있다(WO2017/061449). WO2017/061449에 의하면, BC2LCN과 케라탄 황산에 결합하는 항체의 샌드위치 어세이에 의하여, 일부의 암 환자의 혈액 성분에 있어서, BC2LCN과 케라탄 황산에 의하여 인식되는 단백질의 존재가 확인되고 있다. 본 명세서에서는, 대장균 등의 B. cenocepacia 이외의 숙주를 이용하여 산생(産生)된 BC2LCN을, 재조합 BC2LCN 또는 rBC2LCN이라고 하는 경우가 있다. 본 명세서에서는, BC2LCN이 결합하는 당쇄 또는 단백질을, BC2LCN 결합성의 당쇄 또는 단백질이라고 한다. BC2LCN 결합성의 단백질은, BC2LCN 결합성의 당쇄에 의하여 수식되어 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄는, H-type1의 당쇄 및/또는 H-type3의 당쇄일 수 있다. BC2LCN으로서는, 예를 들면, 미국 국립 생물 공학 정보 센터(NCBI)에 있어서 YP_002232818로서 등록된 렉틴을 들 수 있다. BC2LCN으로서는 당쇄에 대한 결합능을 갖는 한 이용할 수 있지만, BC2LCN으로서는, JP2020-146027에 개시되는 바와 같은 당쇄에 대한 결합능을 개변(改變)(예를 들면, 향상)시킨 것을 이용할 수도 있다. BC2LCN의 개변체를 이용해도 된다. BC2LCN으로서는, YP_002232818로서 등록된 렉틴의 아미노산 배열과 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100% 동일한 아미노산 배열을 갖는 단백질(BC2LCN)을 들 수 있다. BC2LCN은, 적어도 H-type3 당쇄 및 H-type1 당쇄로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상에 결합한다.
본 명세서에서는, "SerpinA3"이란, α1 안티키모트립신(AACT)으로서도 알려진 세린 프로테아제 저해제(세르핀)이다. 인간에서는, 예를 들면, GenBank 등록 번호 K01500.1로서 등록된 염기 배열을 갖는 mRNA로부터 번역되어 얻어지는 단백질일 수 있다. 인간에서는, SerpinA3의 단백질은, 423 아미노산 길이의 전구체(예를 들면, NCBI 참조 번호: NP_001076.2)로부터 1~23번째의 아미노산 배열로 이루어지는 시그널 펩타이드가 절단되어 발생할 수 있다.
본 명세서에서는, "Gal3BP"란, 갈렉틴-3-결합 단백질이다. Gal3BP는, 미국 국립 생물 공학 정보 센터(NCBI) 참조 번호 NM_005567.4로서 등록된 염기 배열을 갖는 mRNA로부터 번역되어 얻어지는 단백질일 수 있다. 인간에서는, Gal3BP의 단백질은, 예를 들면, 585 아미노산 길이의 전구체(예를 들면, NCBI 참조 번호: NP_005558.1로서 등록된 아미노산 배열을 갖는다)로부터 1~18번째의 아미노산 배열로 이루어지는 시그널 펩타이드가 절단되어 발생할 수 있다. Gal3BP는, 혈청 중에서는 90kDa의 분자량을 갖고, 유방암, 폐암, 직장 결장암, 난소암, 및 자궁 내막암의 환자의 혈청에서 고농도로 발견된다(Koths, K. etal., J. Biol. Chem. 268:14245-14249, 1993).
본 명세서에서는, "샌드위치 어세이"란, 샘플에 포함되는 목적 성분을 검출하는 것에 이용되는 어세이이다. 샌드위치 어세이는, 당업자라면 통상의 방법에 의하여 실시할 수 있다. 샌드위치 어세이는, 통상은, 지지체(예를 들면, 기판 및 비즈)에 고상화된 목적 성분에 결합하는 포착 분자 A에 당해 목적 성분을 접촉시켜, 지지체 상에 목적 성분을 포착하고, 그 후, 미결합의 당해 목적 성분을 제거한(또는 분리한) 후에, 표지된 당해 목적 성분에 결합하는 포착 분자 B를 접촉시켜, 지지체 상에 포착된 목적 성분의 표지를 지표로 하여 검출하는 어세이이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 지지체로서는, 통상의 면역학적 측정법에서 이용되는 지지체(특히, 불용성의 지지체)이면 모두 사용 가능하지만, 예를 들면, 폴리스타이렌, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴산 메틸, 폴리아크릴아마이드, 폴리글리시딜메타크릴레이트, 폴리프로필렌, 폴리올레핀, 폴리이미드, 폴리유레테인, 폴리에스터, 폴리 염화 바이닐, 폴리에틸렌, 폴리클로로카보네이트, 실리콘 수지, 실리콘 러버, 아가로즈, 덱스트란, 에틸렌-무수 말레산 공중합물 등의 유기물; 유리, 산화 규소, 규소, 다공성 유리, 불투명 유리, 알루미나, 실리카젤, 금속 산화물 등의 무기 물질; 철, 코발트, 니켈, 마그네타이트, 크로마이트 등의 자성체 등; 및 이들 자성체의 합금을 재료로 하여 조제된 것을 들 수 있다. 고상화는, 고상(예를 들면, 비즈, 자기(磁氣) 비즈, 멤브레인, 플레이트 등의 모든 표면)에 대하여 이루어질 수 있다. 자기 비즈는, 시판 중인 다양한 것을 이용할 수 있다. 자기 비즈로서는, 예를 들면, WO2012/173002A에 개시되는 비즈를 이용해도 된다. 샌드위치 어세이에서는, 통상, 고상화되는 상기 포착 분자 A와 표지된 상기 포착 분자 B는, 목적 성분과의 결합에 관하여 서로 경합하지 않고, 동시에 목적 성분에 결합할 필요가 있다. 포착 분자 A는, 이하에 설명하는 제1 분자일 수 있고, 포착 분자 B는, 제2 분자일 수 있다. 포착 분자 A는, 이하에 설명하는 제2 분자일 수 있고, 포착 분자 B는, 제1 분자일 수 있다.
샌드위치 어세이는, 마이크로 유체 칩(micro-total analysis systems; μTAS)에 의하여 행할 수도 있다. 마이크로 유체 칩은, 유로를 구비하고, 유로는 샘플 도입구를 가지며, 예를 들면, 샘플 도입구에 있어서, 폴리 양이온 또는 폴리 음이온(예를 들면, DNA)을 결합한 포착 분자 X와 샘플을 접촉시켜 포착 분자 X와 목적 성분의 복합체를 형성시키고, 전장(電場)을 가하여 복합체를 이동시켜, 유로의 도중에 존재하는 표지된 포착 분자 Y와 복합체가 접촉하면, 목적 성분과 포착 분자 X와 포착 분자 Y의 복합체가 형성되며, 또한 전장에 의하여 복합체는, 유로를 이동하여, 유로 상의 검출부에 도달하고, 그곳에서 포착 분자 Y에 결합한 표지에 의하여 검출될 수 있다. 검출은, 예를 들면, 레이저 등에 의하여 광학적으로 실시될 수 있다. 포착 분자 X는, 이하에 설명하는 제1 분자일 수 있고, 포착 분자 Y는, 제2 분자일 수 있다. 포착 분자 X는, 이하에 설명하는 제2 분자일 수 있고, 포착 분자 Y는, 제1 분자일 수 있다. μTAS를 이용하여 복수의 바이오 마커의 존재를 병렬적으로 검출할 수도 있다.
그 외 샌드위치 어세이로서는, 포착 분자 N과 포착 분자 M이 각각 다른 비즈 A 및 B에 고상화되고, 목적 분자가 존재할 때에는, 목적 분자, 포착 분자 N 및 비즈 A 및 포착 분자 M 및 비즈 B가 복합체를 형성하며, 여기(勵起)에 의하여 일중항 산소를 방출하는 포토센시타이저를 포함하는 비즈 A에 여기광을 조사함으로써, 복합체가 형성되어 있을 때(비즈 A와 B가 근접하고 있을 때)에만 비즈 B에 일중항 산소가 도달하고, 그로써 비즈 B가 화학 발광하도록 하여, 비즈 B로부터의 광을 검출함으로써 목적 분자의 존재를 검출하는 어세이(예를 들면, AlphaLISA)를 들 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, BC2LCN이 고상화된 비즈와, SerpinA3 또는 Gal3BP에 결합하는 항체가 고상화된 비즈를 포함하는, AlphaLISA 어세이 키트가 제공될 수 있다. 본 발명에서는, 제1 형광 분자로 표지된 BC2LCN과 제2 형광 분자로 표지된 SerpinA3 또는 Gal3BP에 결합하는 항체의 사이의 형광 공명 에너지 전이(FRET) 및 생체 발광 공명 에너지 전이(BRET) 등을 이용하여 목적 분자의 존재를 검출하는 어세이 키트도 이용할 수 있다. 이 경우에는, 고상화를 위한 비즈나 지지체는 필요하지 않다. 본 발명에서는, 그와 같은 어세이용의 키트가 제공될 수 있다.
본 명세서에서는, "이뮤노크로마토 어세이"란, 샘플에 포함되는 목적 성분을 검출하는 것에 이용되는 어세이이며, 통상은, 금 콜로이드 등의 표지로 표지된 포착 분자 C와 액체 시료에 포함되는 목적 성분을 접촉시켜, 표지 포착 분자 C와 목적 성분의 복합체를 형성시키고, 그 후 크로마토 멤브레인 상을 복합체로 이동시켜, 테스트 라인 상에 고상화되어 있는 포착 분자 D에 접촉시켜, 테스트 라인 상에 표지 포착 분자 C와 목적 성분의 복합체를 포착시키고, 테스트 라인 상의 표지를 지표로 하여 검출하는 어세이이다. 이뮤노크로마토 어세이에서는, 통상, 표지된 포착 분자 C와 테스트 라인 상에 고상화되어 있는 포착 분자 D는, 목적 성분과의 결합에 관하여 서로 경합하지 않고, 동시에 목적 성분에 결합할 필요가 있다. 이뮤노크로마토 어세이에서는, 테스트 라인 외에 대조(對照) 라인이 마련되고, 대조 라인에는, 포착 분자 C에 결합하는 분자(항체 등이며, 포착 분자 C가 IgG 항체인 경우는 항IgG 항체일 수 있다)가 고상화되어, 목적 성분과 결합하지 않은 표지 포착 성분 C를 포착할 수 있다. 이뮤노크로마토 어세이에서는, 샘플을 포함시키는 샘플 패드와, 표지 포착 분자 C가 존재하는 콘주게이트 패드와, 샘플 중의 목적 성분과 포착 분자 C의 복합체가 이동하는 이동층인 멤브레인과, 샘플 중의 수분을 흡수하는 흡수 패드를 이 순서로 포함하는 스트립이 제공되고, 멤브레인 상에는, 포착 분자 D가 고상화된 테스트 라인과 포착 분자 C에 대한 항체가 고상화된 대조 라인이 존재한다. 샘플 패드에 샘플을 포함시키면, 샘플이 목적 성분을 포함하는 경우는, 스트립 상을 흡수 패드를 향하여 이동한다. 콘주게이트 패드로 이동한 부분에서, 표지 포착 분자 C와 목적 성분이 복합체를 형성하고, 복합체는 테스트 라인에 고상화된 포착 분자 D에 포착되며, 또한, 대조 라인에도 포착된다. 샘플이 목적 성분을 포함하지 않는 경우는, 샘플은 흡수 패드를 향하여 이동하고, 표지 포착 분자 C는, 복합체를 형성하지 않아, 테스트 라인에 포착되는 일은 없으며, 대조 라인에만 포착되게 된다. 결과적으로, 대조 라인이 발색되고, 테스트 라인이 발색된 경우에는, 샘플에 목적 성분이 포함되어 있는 것이 나타나며, 대조 라인이 발색되고, 테스트 라인이 발색되지 않는 경우에는, 샘플에 목적 성분이 포함되어 있지 않는 것이 나타난다. 대조 라인이 발색되지 않는 경우는, 이뮤노크로마토에 의한 평가계가 올바르게 작동하고 있지 않다고 판단할 수 있다. 포착 분자 C는, 이하에 설명하는 제1 분자일 수 있고, 포착 분자 D는, 제2 분자일 수 있다. 포착 분자 C는, 이하에 설명하는 제2 분자일 수 있고, 포착 분자 D는, 제1 분자일 수 있다.
본 명세서에서는, "렉틴 전기 영동"은, 렉틴을 포함하는 젤을 이용한 전기 영동이며, 전기 영동 중에 렉틴과 상호 작용하는 분자는, 이동 속도가, 상호 작용하지 않는 분자보다 느려지는 것을 이용한, 렉틴 결합 분자의 분리 방법이다. 렉틴은, 젤 중에 유리(遊離)되어 있거나, 또는, 젤 상에 고상화되어 있다. 렉틴은, 전기 영동에 의하여 거의 이동하지 않기 때문에, 단순히 젤의 재료와 혼합하여 젤을 제작함으로써, 당단백질의 영동 속도를 저하시킬 수 있다. 혹은, 렉틴은, 젤에 대하여 비공유 결합 또는 공유 결합으로 연결되어 있다. BC2LCN 결합성의 분자를, BC2LCN에 대하여 비결합성의 분자와 분리하는 경우에는, 렉틴으로서 BC2LCN을 이용한 렉틴 전기 영동에 의하여, 생체 샘플을 분리할 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 분자는, 영동 중에 젤 상에 고상화된 렉틴과 상호 작용을 반복하기 때문에, 영동이 지연된다. 한편, BC2LCN 비결합성의 분자는, 젤 상에 고상화된 렉틴과의 상호 작용이 없어, 영동이 빠르다. 이 원리를 이용하면, 전기 영동에 의하여, BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 분자와, BC2LCN 비결합성과의 분자를 분리할 수 있다. 렉틴 전기 영동은, 당업자라면 적절히 실시할 수 있다.
본 명세서에서는, "렉틴 어피니티 크로마토그래피"는, 렉틴이 당쇄와 특이적으로 결합하는 성질을 갖는 것을 이용한 크로마토그래피이다. 렉틴 어피니티 크로마토그래피에서는, 예를 들면, 렉틴을 고상화한 불용성의 지지체를 포함하는 칼럼을 이용하여, 시료에 대하여 어피니티 크로마토그래피를 행한다. 시료 중의 성분이 렉틴에 친화성을 갖는 경우에는, 당해 성분은, 다른 성분으로부터 분리되게 된다. 본 발명에서는, 렉틴으로서는, 예를 들면, BC2LCN을 이용할 수 있다.
본 발명에 의하면, 다양한 암을 갖는 환자의 혈청을 분석한 결과, 고상화된 BC2LCN과 표지된 BC2LCN을 이용한 샌드위치 어세이에 있어서, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 혈액 성분이 존재하는 것, 및 암을 갖는 환자에 있어서의 당해 혈액 성분의 혈청 중의 양이, 정상인보다 높은 경향이 있는 것을 발견했다.
본 발명에 의하면 또한, 다양한 암을 갖는 환자의 혈청을 분석한 결과, BC2LCN과 SerpinA3에 결합하는 항체를 이용한 샌드위치 어세이에 있어서, BC2LCN 결합성의 SerpinA3이 혈액 성분으로서 존재하는 것, 및 암을 갖는 환자에 있어서의 BC2LCN 결합성의 SerpinA3의 혈청 중의 양이, 정상인보다 높은 경향이 있는 것을 발견했다.
본 발명에 의하면 또한, 다양한 암을 갖는 환자의 혈청을 분석한 결과, BC2LCN과 Gal3BP에 결합하는 항체를 이용한 샌드위치 어세이에 있어서, BC2LCN 결합성의 Gal3BP가 혈액 성분으로서 존재하는 것, 및 암을 갖는 환자에 있어서의 BC2LCN 결합성의 Gal3BP의 혈청 중의 양이, 정상인보다 높은 경향이 있는 것을 발견했다.
본 발명에 의하면,
대상으로부터 얻어진 생체 샘플을 분석하는 방법으로서,
대상으로부터 얻어진 생체 샘플 중의 SerpinA3(예를 들면, BC2LCN 결합성의 SerpinA3) 및 Gal3BP(예를 들면, BC2LCN 결합성의 Gal3BP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분("목적 성분"이라고 하는 경우가 있다)을 검출하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
본 발명의 방법에서는, 생체 샘플을 준비하는 것을 포함해도 된다. 본 발명의 방법에서는, 상기의 성분의 양을 측정하는 것을 더 포함해도 된다.
본 발명에 의하면, SerpinA3(예를 들면, BC2LCN 결합성의 SerpinA3) 및 Gal3BP(예를 들면, BC2LCN 결합성의 Gal3BP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분은, 당해 성분에 결합하는 분자를 이용하여 검출할 수 있다.
일 양태에서는, 상기 하나 이상의 성분을 그 이외의 성분으로부터 분리하고 나서, 상기 하나 이상의 성분을 검출할 수 있다.
예를 들면, SerpinA3은, SerpinA3에 결합하는 분자를 이용하여 검출할 수 있다. SerpinA3에 동시에 결합할 수 있는 2개의 상이한 분자를 이용할 수도 있다. SerpinA3에 동시에 결합할 수 있는 2개의 상이한 분자를 이용하면, 이뮤노크로마토 어세이나 샌드위치 어세이에 의하여 SerpinA3을 검출할 수 있다. SerpinA3은 또한, 질량 분석에 의해서도 검출할 수 있다. 어느 경우도 SerpinA3의 표준 물질을 이용하여 검량선을 얻을 수 있다. 또, 얻어진 검증선에 대하여, SerpinA3에 관한 측정값을 적용시켜, SerpinA3을 정량할 수 있다.
또, BC2LCN 결합성의 SerpinA3은, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자와 SerpinA3에 결합하는 분자를 이용하여 검출할 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자가, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자를 이용하여, BC2LCN 결합성의 분자를 그 이외와 분리하는 것을 포함하고 있어도 되고, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자가, BC2LCN인 경우, 렉틴 어피니티 크로마토그래피나 렉틴 전기 영동을 이용하여, BC2LCN 결합성의 분자를 그 이외와 분리하는 것을 포함하고 있어도 된다. 또, SerpinA3을 그 이외의 성분과 분리하는 것을 포함하고 있어도 된다. SerpinA3의 분리와, BC2LCN 결합성의 성분의 분리는, 어느 쪽을 먼저 실시해도 된다.
예를 들면, Gal3BP는, Gal3BP에 결합하는 분자를 이용하여 검출할 수 있다. Gal3BP에 동시에 결합할 수 있는 2개의 상이한 분자를 이용할 수도 있다. Gal3BP에 동시에 결합할 수 있는 2개의 상이한 분자를 이용하면, 이뮤노크로마토 어세이나 샌드위치 어세이에 의하여 Gal3BP를 검출할 수 있다. Gal3BP는 또한, 질량 분석에 의해서도 검출할 수 있다. 어느 경우도 Gal3BP의 표준 물질을 이용하여 검량선을 얻을 수 있다. 또, 얻어진 검증선에 대하여, Gal3BP에 관한 측정값을 적용시켜, Gal3BP를 정량할 수 있다.
또, BC2LCN 결합성의 Gal3BP는, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자와 Gal3BP에 결합하는 분자를 이용하여 검출할 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자가, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자를 이용하여, BC2LCN 결합성의 분자를 그 이외와 분리하는 것을 포함하고 있어도 되고, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자가, BC2LCN인 경우, 렉틴 전기 영동을 이용하여, BC2LCN 결합성의 분자를 그 이외와 분리하는 것을 포함하고 있어도 된다. 또, Gal3BP를 그 이외의 성분과 분리하는 것을 포함하고 있어도 된다. Gal3BP의 분리와, BC2LCN 결합성의 성분의 분리는, 어느 쪽을 먼저 실시해도 된다.
본 발명에 의하면,
대상으로부터 얻어진 생체 샘플을 분석하는 방법으로서,
BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 어세이에 의하여, 생체 샘플 중에 포함되는 성분("목적 성분"이라고 하는 경우가 있다)을 분석하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
생체 샘플은, 상기 대상으로부터 얻어진 생체 샘플이다. 대상은, 암을 갖거나, 또는 암을 가질 가능성을 갖는 대상일 수 있다. 암은, 예를 들면, 췌장암일 수 있다. 췌장암은, 예를 들면, 스테이지 I, II, III, 및 IV로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테이지의 췌장암일 수 있고, 예를 들면, 스테이지 I의 췌장암일 수 있으며, 예를 들면, 스테이지 II의 췌장암일 수 있다. 생체 샘플로서는, 예를 들면, 조직, 세포, 및 체액을 들 수 있다. 체액으로서는, 혈액(예를 들면, 혈장 및 혈청), 땀, 타액, 요, 복수, 흉수, 및 분비액(예를 들면, 내분비액 및 외분비액, 예를 들면, 췌액 등의 소화액)을 들 수 있다. 조직 및 세포는 각각, 예를 들면, 암이거나, 또는 암이라고 의심되는 조직 및 세포로 할 수 있다. 조직 및 세포는 각각, 예를 들면, 암이거나, 또는 암이라고 의심되는 부분을 포함한다.
BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자로서는, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 들 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자로서는 또한, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 앱타머(예를 들면, DNA 및 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산(核酸) 앱타머)를 들 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자로서는 또한, 환상 펩타이드 등의 중분자(中分子)를 들 수 있다. 이들 BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자는, 당업자에게 주지의 방법에 의하여 취득할 수 있다. 예를 들면, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 항체는, BC2LCN 결합성의 당쇄를 면역한 비인간 포유 동물로부터 얻을 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 앱타머는, 핵산 풀로부터 BC2LCN 결합성의 당쇄에 대한 친화성을 이용하여 취득할 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 환상 펩타이드는, 환상 펩타이드 풀로부터 BC2LCN 결합성의 당쇄에 대한 친화성을 이용하여 취득할 수 있다. BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자는, 예를 들면, BC2LCN일 수 있다.
SerpinA3에 결합하는 분자로서는, SerpinA3에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 들 수 있다. SerpinA3에 결합하는 분자로서는 또한, SerpinA3에 결합하는 앱타머(예를 들면, DNA 및 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 앱타머)를 들 수 있다. SerpinA3에 결합하는 분자로서는 또한, 환상 펩타이드 등의 중분자를 들 수 있다. 이들 SerpinA3에 결합하는 분자는, 당업자에게 주지의 방법에 의하여 취득할 수 있다. 예를 들면, SerpinA3에 결합하는 항체는, SerpinA3을 면역한 비인간 포유 동물로부터 얻을 수 있다. SerpinA3에 결합하는 앱타머는, 핵산 풀로부터 SerpinA3에 대한 친화성을 이용하여 취득할 수 있다. SerpinA3에 결합하는 환상 펩타이드는, 환상 펩타이드 풀로부터 SerpinA3에 대한 친화성을 이용하여 취득할 수 있다. SerpinA3은, 생체 시료 중에서 다른 성분과 복합체를 형성하고 있는 경우가 있다. 본 발명에서는, 그와 같은 복합체를 검출해도 된다. 예를 들면, SerpinA3과 복합체를 형성하는 다른 성분으로서는 PSA를 들 수 있다. 따라서, PSA에 결합하는 분자와 SerpinA3에 결합하는 분자를 이용하여 SerpinA3을 검출할 수도 있다. 또는, 표지된 재조합 PSA를 이용하여, SerpinA3이 PSA에 결합하는 성질을 이용하여 SerpinA3을 검출할 수도 있다.
Gal3BP에 결합하는 분자로서는, Gal3BP에 결합하는 항체 또는 그 항원 결합성 단편을 들 수 있다. Gal3BP에 결합하는 분자로서는 또한, Gal3BP에 결합하는 앱타머(예를 들면, DNA 및 RNA로 이루어지는 군으로부터 선택되는 핵산 앱타머)를 들 수 있다. Gal3BP에 결합하는 분자로서는 또한, 환상 펩타이드 등의 중분자를 들 수 있다. 이들 Gal3BP에 결합하는 분자는, 당업자에게 주지의 방법에 의하여 취득할 수 있다. 예를 들면, Gal3BP에 결합하는 항체는, Gal3BP를 면역한 비인간 포유 동물로부터 얻을 수 있다. Gal3BP에 결합하는 앱타머는, 핵산 풀로부터 Gal3BP에 대한 친화성을 이용하여 취득할 수 있다. Gal3BP에 결합하는 환상 펩타이드는, 환상 펩타이드 풀로부터 Gal3BP에 대한 친화성을 이용하여 취득할 수 있다. Gal3BP는, 생체 시료 중에서 다른 성분과 복합체를 형성하고 있는 경우가 있다. 본 발명에서는, 그와 같은 복합체를 검출해도 된다. 예를 들면, Gal3BP와 복합체를 형성하는 다른 성분으로서는 갈렉틴(특히, 갈렉틴 3)을 들 수 있다. 따라서, 갈렉틴(특히, 갈렉틴 3)에 결합하는 분자와 Gal3BP에 결합하는 분자를 이용하여 Gal3BP를 검출할 수도 있다. 또는, 표지된 재조합 갈렉틴(특히, 갈렉틴 3)을 이용하여, Gal3BP가 갈렉틴(특히, 갈렉틴 3)에 결합하는 성질을 이용하여 Gal3BP를 검출할 수도 있다.
본 발명에 의하면, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플)을 분석하는 방법으로서,
생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 성분(특정 성분, 예를 들면, 혈액 성분)의 유무 또는 농도를 분석하는 것을 포함하고, 성분(예를 들면, 혈액 성분)은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, SerpinA3(예를 들면, BC2LCN 결합성의 SerpinA3), 및 Gal3BP(예를 들면, BC2LCN 결합성의 Gal3BP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분(목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)이라고 하는 경우가 있다)인, 방법이 제공된다. 본 발명의 분석 방법에 있어서는, 상기 성분의 1, 2 또는 전부가 검출된 경우에는, 대상이 암일 가능성이 나타난다. 본 발명의 분석 방법에 있어서는, 상기 성분 중 1개의 농도가, 컷오프값보다 큰 경우에는, 대상이 암일 가능성이 나타난다.
본 발명의 분석 방법에서는, 대상은, 인간일 수 있고, 예를 들면, 정상인, 암을 갖는 환자, 및 암을 가질 가능성을 갖는 환자일 수 있다.
일 양태에서는, 암은, 췌장암, 대장암, 직장선암, 방광암, 유방암, 비소세포 폐암, 위암, 자궁 경부암, 자궁체암, 간세포암, 갑상선암, 전립선암, 멜라노마, 식도암, 난소암, 담관암, 비호지킨 림프종, 및 만성 골수성 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암일 수 있다. 일 양태에서는, 암은, 췌장암일 수 있다. 일 양태에서는, 췌장암은, 스테이지 I 및 II로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테이지의 췌장암일 수 있다. 일 양태에서는, 췌장암은, 스테이지 I일 수 있다. 일 양태에서는, 췌장암은, 스테이지 II일 수 있다.
일 양태에서는, 목적 성분 또는 목적 혈액 성분은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분이다. 일 양태에서는, 목적 성분 또는 목적 혈액 성분은, BC2LCN 결합성의 SerpinA3이다. 일 양태에서는, 목적 성분 또는 목적 혈액 성분은, BC2LCN 결합성의 Gal3BP이다. 이들 양태에 있어서, 암은, 상기한 바와 같을 수 있지만, 예를 들면, 췌장암, 대장암, 직장선암, 방광암, 유방암, 자궁체암, 간세포암, 갑상선암, 멜라노마, 식도암, 담관암, 난소암, 비호지킨 림프종, 및 만성 골수성 백혈병으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 암일 수 있다. 일 양태에서는, 암은, 췌장암일 수 있다. 일 양태에서는, 췌장암은, 스테이지 I 및 II로 이루어지는 군으로부터 선택되는 스테이지의 췌장암일 수 있다. 일 양태에서는, 췌장암은, 스테이지 I일 수 있다. 일 양태에서는, 췌장암은, 스테이지 II일 수 있다. 일 양태에 있어서, 컷오프값은, 예를 들면, 0, 정상인군의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분) 농도의 제1사분위 값, 평균값, 제3사분위 값, 혹은 최댓값, 또는 이들 중 어느 2개의 사이의 값(예를 들면, 제3사분위 값 혹은 최댓값 또는 그 사이의 값)으로 할 수 있다. 일 양태에 있어서, 컷오프값은, 예를 들면, 0, 암 환자군의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분) 농도의 제1사분위 값, 평균값, 제3사분위 값, 혹은 최댓값, 또는 이들 중 어느 2개의 사이의 값으로 할 수 있다.
일 양태에 있어서, 컷오프값은, ROC 곡선 상의 감도 1 및 특이도 1의 점으로부터의 거리가 가장 가까운 점에 있어서의 컷오프값, 당해 컷오프값보다 큰 값, 또는 당해 컷오프값보다 작은 값일 수 있다. 일 양태에 있어서, 컷오프값은 또한, Youden Index가 최댓값이 되는 점에 있어서의 컷오프값, 당해 컷오프값보다 큰 값, 또는 당해 컷오프값보다 작은 값일 수 있다.
컷오프값은, 감도와 위양성률(僞陽性率)의 균형에 의하여 결정할 수 있다. 컷오프값은, 의양성(擬陽性)이 많아도 암 환자를 가능한 한 많이 검출하고자 하는 경우(감도를 높이고자 하는 경우)에는, 낮게 설정할 수 있고, 의양성을 줄이고자 하는 경우(그 대신에, 감도가 저하되어도 되는 경우)에는, 높게 설정할 수 있으며, 당업자라면, 검사의 목적에 따라 적절히 설정할 수 있다.
본 발명의 분석 방법에 있어서, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)의 농도가 컷오프값보다 큰 경우에는, 당해 대상은, 암을 가질 가능성이 있다는 정보를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 분석 방법은, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)의 농도가 컷오프값보다 큰 경우에, 당해 대상이, 암을 가질 가능성이 있는 것을 나타내는 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 분석 방법에 있어서, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)의 농도가 컷오프값보다 큰 경우에는, 당해 대상은, 췌장암을 가질 가능성이 있다는 정보를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 분석 방법은, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)의 농도가 컷오프값보다 큰 경우에, 당해 대상이, 췌장암을 가질 가능성이 있는 것을 나타내는 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 분석 방법에 있어서는, 조기 암(스테이지 I 및 II)을 갖는 환자의 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중에 있어서도 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)이 검출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 분석 방법은, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 목적 성분(예를 들면, 목적 혈액 성분)의 농도가 컷오프값보다 큰 경우에, 당해 대상이, 조기 암을 가질 가능성이 있는 것을 나타내는 정보를 제공하는 것을 포함할 수 있다. 조기 암은, 조기 췌장암일 수 있다. 췌장암의 스테이지 분류는, UICC TNM 분류(UICC: TNM Classification of Malignant Tumours, 8th Edn. Wiley-Blackwell; 2017. 94-95)에 근거하여 의사가 결정할 수 있다. 스테이지 I은, 스테이지 1A 및 1B를 포함하고, 스테이지 II는, 스테이지 2A와 2B를 포함한다. 스테이지 III 및 IV는, 스테이지 3 및 4와 각각 동일한 의미이다.
[표 1]
Figure pct00001
정보의 제공은, 정보의 송신 또는 출력에 의하여 행할 수 있다. 정보의 출력은, 디스플레이 또는 인쇄물 상에 이루어질 수 있다.
본 발명의 분석 방법은, 대상이 암을 가질 가능성을 갖는다고 결정하는 것을 더 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 분석 방법에 있어서 암을 가질 가능성이 있다고 결정된 대상의 적어도 일부를 암 요법에 제공하는 것을 포함하는, 암을 처치하는 방법이 제공된다. 암 요법으로서는, 방사선 요법, 화학 요법, 및 외과적 요법으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 들 수 있다. 암 요법은, 표준 요법일 수 있다. 방사선 요법은, 암에 대하여 방사선을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 화학 요법은, 대상에 항암제를 투여하는 것을 포함할 수 있다. 외과적 요법은, 암을 절제하는 것을 포함할 수 있다. 암(예를 들면, 췌장암)에 대한 화학 요법으로서는, 예를 들면, 폴피리녹스 요법, 젬시타빈·납파클리탁셀 요법(GnP 요법), 젬시타빈·S1 요법(GS 요법), 리포소말 이리노테칸·5FU/LV 요법(Nal-IRI/FL 요법), 젬시타빈 요법, 및 S1 요법 등을 들 수 있고, 이들 요법 중 어느 하나 이상에 의하여 대상을 처치할 수 있다. 항암제로서는, 예를 들면, 옥살리플라틴 등의 백금 제제, 이리노테칸, 리포솜형 이리노테칸, 레보폴리네이트, 젬시타빈, 납파클리탁셀, 5-플루오로우라실(5-FU), 및 S-1로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 들 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기의 항암제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치료상 유효량을 포함하는 의약 조성물로서, 본 발명의 분석 방법에 있어서 암을 가질 가능성이 있다고 결정된 대상에 있어서 암을 처치하는 것에 이용하기 위한 의약 조성물이 제공될 수 있다. 의약 조성물은, 의약 유효 성분에 더하여, 약학상 허용 가능한 부형제(賦形劑)를 더 포함하고 있어도 된다. 약학상 허용 가능한 부형제는, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 분석 방법의 일 양태에서는,
대상으로부터 얻어진 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중을 분석하는 방법으로서,
BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 샌드위치 어세이 또는 이뮤노크로마토 어세이에 의하여, 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중에 포함되는 성분(예를 들면, 혈액 성분)을 분석하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
일 양태에서는, 제1 분자는, 지지체(예를 들면, 기판)에 고상화되고, 제2 분자는, 표지될 수 있다. 일 양태에서는, 제1 분자는, 표지되고, 제2 분자는, 지지체에 고상화될 수 있다.
고상화는, 예를 들면, 직접법, 폴리스타이렌 태그법(WO2018/190357), 바이오틴-스트렙타비딘법, HaloTag법, 아민 커플링법 등의 화학 결합을 이용한 방법, 및 V5 태그법 등의 공지의 고상화법을 이용할 수 있다. 직접법에서는, 고상화되는 포착 분자는, 그 상태로 지지체와 접촉되고, 이로써, 지지체 상에 고상화된다. 폴리스타이렌 태그법에서는 포착 분자에 융합시킨 폴리스타이렌 태그를 통하여, 폴리스타이렌 플레이트에 고상화된다. 바이오틴-스트렙타비딘법에서는, 스트렙타비딘으로 피복한 지지체에 대하여, 바이오틴으로 수식한 포착 분자가 결합함으로써, 포착 분자가 지지체 상에 고상화된다. HaloTag법에서는, 포착 분자에 융합시킨 HaloTag 단백질을 통하여, HaloTag로 피복한 지지체 상에 포착 분자가 고상화된다. 아민 커플링법에서는, 고상 표면에 형성한 카복실기를 활성 에스터화하고, 아미노기를 통하여 단백질 등을 화학 결합에 의하여 고정화할 수 있다. V5 태그법에서는, 항V5 태그 항체로 피복한 지지체에 대하여, V5 태그를 연결시킨 포착 분자를 결합함으로써, 포착 분자가 지지체 상에 고상화된다.
표지로서는, 샌드위치 어세이에 있어서는, 기질(발색 기질, 형광 기질, 및 발광 기질), 효소 항체법에서 이용되는 효소(예를 들면, 퍼옥시다제, 글루코스옥시다제, 및 알칼리포스파타제)를 이용할 수 있다. 표지는, 당업자라면 통상의 방법을 이용하여 행할 수 있다. 표지는, 예를 들면, 공유 결합성으로 행할 수 있다. 표지는, 예를 들면, 바이오틴 연결 항체와 아비딘 연결 표지를 반응시켜 행해도 된다. 기질로서는, 예를 들면, 형광 기질을 들 수 있다. 퍼옥시다제로서는, 예를 들면, 서양 고추냉이 퍼옥시다제가 이용될 수 있다. 서양 고추냉이 퍼옥시다제는, 발색 기질, 형광 기질 또는 발광 기질을 더함으로써 발색, 형광 또는 화학 발광을 발생시킨다. 따라서, 발색, 형광 또는 화학 발광을 지표로 하여 표지된 포착 분자의 존재를 검출할 수 있다. 서양 고추냉이 퍼옥시다제의 발색 기질로서는, 예를 들면, 테트라메틸벤지다인(TMB), o-페닐렌다이아민(OPD), 2,2-아지노비스[3-에틸벤조-싸이아졸린-6-설폰산(ABTS), 및 Amplex(상표) Red를 들 수 있고, 과산화 수소 존재하에 있어서, 표지 분자의 검출에 이용할 수 있다. 알칼리포스파타제의 발광 기질로서는, p-나이트로페닐포스페이트(pNPP), 4-메틸움벨리페릴포스페이트(4-MUP), 및 AttoPhos(상표)를 들 수 있고, 포착 분자의 검출에 이용할 수 있다. 글루코스옥시다제는, 글루코스를 산화하여, 글루콘산과 과산화 수소를 발생한다. 과산화 수소는, 예를 들면, 과산화 수소 검출용의 비색(比色) 프로브(예를 들면, 퍼옥시다제)를 이용하여 용이하게 검출할 수 있다. 과산화 수소는, 예를 들면, 퍼옥시다제와 그 발색 기질 존재하에 있어서, 발색시킬 수 있다.
표지로서는, 이뮤노크로마토 어세이에 있어서는, 색소(예를 들면, 착색료, 예를 들면, 금 콜로이드)를 이용할 수 있다.
일 양태에서는, 제1 분자는, BC2LCN이다. 이 양태에서는, BC2LCN으로서는, 재조합 BC2LCN을 이용할 수 있다. BC2LCN은, 직접 고상화해도, 예를 들면, 바이오틴 표지한 다음 스트렙타비딘(또는 뉴트라비딘) 피복된 지지체에 대하여 고상화해도 된다. 그 외에, BC2LCN을 HaloTag 단백질과 융합시킨 다음 HaloTag 리간드로 피복된 지지체에 고상화해도 된다. 또, BC2LCN에 폴리스타이렌 태그를 융합시킨 다음 폴리스타이렌 플레이트에 직접 고상화해도 된다. 샌드위치 어세이에 있어서도 이뮤노크로마토 어세이에 있어서도, 제1 분자가 BC2LCN인 경우, 목적 성분은, 제1 분자인 BC2LCN과 제2 분자인 BC2LCN의 양방과 동시에 결합하는 것이다. 따라서, 제1 분자가 BC2LCN인 샌드위치 어세이 및 이뮤노크로마토 어세이에 의하여 검출되는 목적 성분은, 복수의 BC2LCN과 동시에 결합할 수 있는 성분이다. 이뮤노크로마토 어세이에 있어서는, 대조 라인에는, BC2LCN에 대한 항체나, H-type1 당쇄 항원이나 H-type3 당쇄 항원 등의 BC2LCN과 결합하는 당쇄 항원이 고상화될 수 있다.
일 양태에서는, 제1 분자는, SerpinA3에 결합하는 항체이다. 이 양태에서는, BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 SerpinA3이 검출되어 있다고 생각된다. SerpinA3에 결합하는 항체는, SerpinA3에 대한 결합성을 지표로 하여 통상의 방법에 의하여 조제할 수 있다.
SerpinA3에 결합하는 항체는, BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 SerpinA3에 대한 결합성을 갖는 것으로 더 확인해도 된다. BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 SerpinA3은, 실시예에서 이용한 것 같이, 고상화된 BC2LCN과 SerpinA3에 결합하는 항체에 반응하는 성분으로서 정제할 수 있다. SerpinA3에 결합하는 항체는, 당해 정제된 성분에 결합하는지 아닌지를 지표로 하여, 선택해도 된다.
제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체인 양태에 있어서, 제1 분자는, 지지체(예를 들면, 기판 또는 비즈)에 고상화되고, 제2 분자는, 표지될 수 있다; 또는, 제1 분자는, 표지되며, 제2 분자는, 지지체에 고상화될 수 있다.
일 양태에서는, 제1 분자는, Gal3BP에 결합하는 항체이다. 이 양태에서는, BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 Gal3BP가 검출되어 있다고 생각된다. Gal3BP에 결합하는 항체는, Gal3BP에 대한 결합성을 지표로 하여 통상의 방법에 의하여 조제할 수 있다.
Gal3BP에 결합하는 항체는, BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 Gal3BP에 대한 결합성을 갖는 것으로 더 확인해도 된다. BC2LCN 결합성의 당쇄를 갖는 Gal3BP는, 실시예에서 이용한 것 같이, 고상화된 BC2LCN과 Gal3BP에 결합하는 항체에 반응하는 성분으로서 정제할 수 있다. Gal3BP에 결합하는 항체는, 당해 정제된 성분에 결합하는지 아닌지를 지표로 하여, 선택해도 된다.
제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체인 양태에 있어서, 제1 분자는, 지지체(예를 들면, 기판 또는 비즈)에 고상화되고, 제2 분자는, 표지될 수 있으며; 또는, 제1 분자는, 표지되고, 제2 분자는, 지지체에 고상화될 수 있다.
본 발명에 의하면, 대상이 암인지 아닌지를 예측하는 방법, 대상이 암인지 아닌지의 예비적 정보를 얻는 방법, 대상이 암인지 아닌지를 판정하는 방법, 대상이 암인지 아닌지를 예측하기 위한 방법 혹은 예비적 방법, 대상에 있어서 암을 검출하는 방법, 대상에 있어서 암세포를 검출하는 방법, 대상에 있어서 암의 바이오 마커를 검출하는 방법(바이오 마커는, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분이다), 또는 대상이 암인지 아닌지를 분석하는 방법으로서,
당해 방법은,
생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 성분(예를 들면, 혈액 성분)의 유무 또는 농도를 분석하는 것을 포함하고, 성분(예를 들면, 혈액 성분)은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분이거나; 또는
BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 샌드위치 어세이 또는 이뮤노크로마토 어세이에 의하여, 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중에 포함되는 성분(예를 들면, 혈액 성분)을 분석하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
본 발명에 의하면, 대상의 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플)에 있어서 성분(예를 들면, 혈액 성분)을 검출하는 방법으로서, 성분(예를 들면, 혈액 성분)이, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분인 방법이 제공된다. 이 방법은, BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플)과 접촉시키는 것과, 그 결과, 형성된 성분(예를 들면, 혈액 성분)과 제1 분자와 제2 분자의 복합체를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 이 방법은, BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 샌드위치 어세이 또는 이뮤노크로마토 어세이에 의하여, 상기 성분(예를 들면, 혈액 성분)을 검출하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 포함하고, 제1 분자와 제2 분자를 이용하여 대상의 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플) 중의 당단백질의 양을 측정할 수 있는, 샌드위치 어세이용 또는 이뮤노크로마토 어세이용의 키트가 제공된다. 본 발명의 키트에 있어서, 일 양태에서는, 제1 분자는, 기판 또는 스트립 상에 고상화되고, 제2 분자는 표지되어 있다. 본 발명의 키트에 있어서, 일 양태에서는, 제1 분자는 표지되고, 제2 분자는 기판 또는 스트립 상에 고상화되어 있다. 일 양태에서는, 제1 분자는 표지되고, 제2 분자는 젤 중에 포함되거나, 또는 젤 상에 고상화되어 있다. 본 발명의 키트는, 표지가 효소 항체법에서 이용되는 효소인 경우에는, 발색 기질을 더 포함하고 있어도 된다. 생체 샘플이 혈액 샘플인 경우, 성분은 혈액 성분이다.
본 발명의 키트의 일 양태에서는, 제1 분자는, BC2LCN이다. 본 발명의 일 양태에서는, 제1 분자는, SerpinA3에 결합하는 항체이다. 본 발명의 일 양태에서는, 제1 분자는, Gal3BP에 결합하는 항체이다.
본 발명의 키트는, 목적 분자의 검출, 또는 암의 검출, 판정, 예측, 혹은 진단의 용도에 있어서 이용할 수 있다.
본 발명에 의하면, BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 항체, 및 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자의 조합이 제공된다. 본 발명의 조합은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분을 샘플 중(예를 들면, 생체 샘플 또는 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플))에 있어서 검출하는 것에 이용할 수 있다. 상기 조합에 있어서는, 제1 분자 및 제2 분자 중 일방은 지지체에 고상화되어 있어도 되고, 또한, 타방은 검출을 위하여 표지되어 있어도 된다. 상기 조합은, 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플)을 이용하여 암을 진단하는 것에 이용할 수 있다. 본 발명에 의하면, 상기 조합을 포함하는, 생체 샘플(예를 들면, 혈액 샘플)을 이용하여 암을 진단하는 것에 이용하는 키트가 제공된다. 상기 조합은, 샌드위치 어세이용의 키트, 이뮤노크로마토 어세이용의 키트, 렉틴 전기 영동용의 키트, 질량 분석용의 키트, 렉틴 어피니티 크로마토그래피용의 키트 또는 μTAS용의 키트일 수 있다. 렉틴 전기 영동용의 키트는, 렉틴을 포함하는 젤을 포함하고 있을 수 있다. 렉틴 어피니티 크로마토그래피용의 키트는, 렉틴이 고상화된 지지체를 포함하는 칼럼을 포함하고 있을 수 있다. 이들 키트에는, 표준 물질로서, 정제된 SerpinA3, 정제된 BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 정제된 Gal3BP, 또는 정제된 BC2LCN 결합성의 Gal3BP 등이 더 포함되어 있어도 된다. μTAS용의 키트는, 마이크로 유체 칩을 포함하고 있어도 된다. 마이크로 유체 칩은, 검출부를 갖고, 검출부에는, SerpinA3, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, Gal3BP, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP, 및 이들을 포함하는 단백질 복합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 결합하는 분자가 고상화되어 있을 수 있다.
본 발명에 있어서의
대상으로부터 얻어진 생체 샘플을 분석하는 방법으로서,
BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 어세이에 의하여, 생체 샘플 중에 포함되는 성분("목적 성분"이라고 하는 경우가 있다)을 분석하는 것을 포함하는, 방법에서는, 어세이에 의하여 얻어지는 시그널이, 체내의 암이 감소하는 것(예를 들면, 암이 적출되는 것)에 의하여 감소할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서는, 어세이 시그널은, 체내의 암의 양을 나타낼 수 있다. 또, 상기 방법에서는, 어세이에 의하여 얻어지는 시그널이, 재발함으로써 증대될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 시그널이 증대된 것은, 암의 재발을 나타낼 수 있다.
본 발명에 의하면, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플로부터, 2개의 BC2LCN에 동시에 결합할 수 있는 성분, SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 분리하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 본 발명에 의하면 또한, 대상으로부터 얻어진 생체 샘플로부터, 2개의 BC2LCN에 동시에 결합할 수 있는 성분, SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 검출하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다. 본 발명에 의하면 또한,
대상으로부터 얻어진 생체 샘플을 분석하는 방법으로서,
대상으로부터 얻어진 생체 샘플 중의, 2개의 BC2LCN에 동시에 결합할 수 있는 성분, SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 분리하는 것을 포함하는, 방법이 제공된다.
분리란, 그 이외의 성분 중 적어도 하나 이상으로부터 목적의 성분을 분리하는 것을 의미한다. 분리는, 목적의 성분의 농축, 부화(富化), 및 정제를 포함할 수 있다. 농축은, 농도를 높이는 것을 의미한다. 부화 및 정제는, 다른 성분에 대하여 목적의 성분의 존재 비율을 선택적으로 높이는 것을 의미한다. 부화 및 정제는, 목적의 성분의 농축을 수반하고 있어도 된다. 분리는 또한, 고상화된 분자에 결합시키는 것을 포함할 수 있다. 이 경우, 고상화된 분자에 결합함으로써, 결합하지 않는 다른 성분으로부터 분리되어 있다. 분리는, 목적의 성분의 고상화 표면에 대한 흡착에 더하여, 흡착되지 않은 성분을 제거하는 것을 포함하고 있어도 된다. 흡착되지 않은 성분의 제거는, 상기 표면의 세정에 의하여 행할 수 있다. 흡착되지 않은 성분의 제거는 또한, 액상(液相)의 제거에 의하여 행할 수 있다. 흡착되지 않은 성분의 제거는 또한, 고상이 비즈 표면 상에 존재하는 경우에는, 비즈를 회수함으로써 행해도 된다. 이 양태에 있어서, 본 발명은, 분리된 성분의 양을 측정하는 것을 더 포함하고 있어도 된다. 측정은, 다양한 당업자에게 주지의 어세이에 의하여 행할 수 있고, 이로써 어세이 시그널을 얻을 수 있다. 측정된 양은, 지표가 되는 다른 양(예를 들면, 컷오프값)과 비교할 수 있다. 컷오프값은, 상기에서 설명한 바와 같을 수 있다.
본 발명의 방법에서는, 측정된 양이, 지표가 되는 다른 양과 비교한 많은 경우에는, 생체 샘플이 유래하는 대상이 암일 가능성이 나타날 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은, 암을 검출하는 방법, 암세포를 검출하는 방법, 암이라고 진단하는 방법, 암이라고 진단하기 위한 비진단적인 방법, 암이라고 진단하기 위한 예비적 정보를 얻는 방법, 암이라고 예측하는 방법, 또는 암이라고 예측하기 위한 비진단적 방법일 수 있다. 본 발명의 방법에서는, 어세이에 의하여 얻어지는 시그널이, 체내의 암이 감소하는 것(예를 들면, 암이 적출되는 것)에 의하여 감소할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 어세이 시그널은, 체내의 암의 양을 나타낼 수 있다. 또, 상기 방법에서는, 어세이에 의하여 얻어지는 시그널이, 재발함으로써 증대될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서는, 시그널이 증대된 것은, 암의 재발을 나타낼 수 있다. 본 발명의 방법은, 상이한 시점에서 회수된 2개 이상의 생체 샘플에 대하여 실시할 수 있다. 따라서, 일 양태에서는, 생체 샘플은, 상이한 시점에서 회수된 2개 이상의 생체 샘플일 수 있다. 일 양태에서는, 본 발명의 방법은, 어세이에 의하여 얻어지는 시그널(측정된 양에 대응한다)은, 당해 상이한 시점에서 회수될 수 있었던 별개의 샘플에 있어서 얻어진 시그널과 비교하는 것을 더 포함하고 있어도 된다. 이와 같이 함으로써, 본 발명은, 환자의 암의 치료 과정 및/또는 재발 과정의 모니터링에 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은, 기존의 방법과 조합하여 실시되어도 된다. 예를 들면, 기존의 방법으로서, 체액 샘플 중의 CA19-9의 양을 측정하는 것을 포함하는 방법이 알려져 있다. CA19-9는, 암을 갖는 체액 샘플 중에서 농도를 높이고 있다. 또, 암의 양이 증가하면 그 농도가 높아지고, 암의 양이 감소하면 그 농도가 저하된다. 이와 같이, CA19-9와 본 발명의 방법을 조합함으로써, 체액 샘플의 분석에 의한 암의 검출의 정밀도 및/또는 특이도를 높일 수 있다. CA19-9는, 췌장암, 특히, 스테이지 III 및 IV 등의 췌장암의 지표가 될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 생체 샘플 중의 CA19-9의 농도를 측정하는 것을 더 포함하고 있어도 된다.
측정되는 SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분은, BC2LCN 결합성의 당쇄 수식을 갖는 것을 지표로 하여 더 분석되어도 된다. SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분이, BC2LCN 결합성의 당쇄 수식을 갖는지 아닌지는, 상술한 바와 같이, 당해 당수식(당쇄)에 결합하는 인자를 이용하여 결정할 수 있다. 혹은, SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분은, 당해 당수식(당쇄)에 결합하는 인자를 이용하여 분리한 후에 검출되어도 된다. SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분은, SerpinA3에 결합하는 분자 및 Gal3BP에 결합하는 분자를 이용하여 분리한 후에 검출되어도 된다.
실시예
실시예 1: 암 환자의 혈청 중의 당단백질의 rBC2LCN을 이용한 검출
각종 암을 갖는 환자의 혈청 중의 당단백질을 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이에 의하여 검출했다.
먼저, 바이오틴화 rBC2LCN을 PBS로 0.3μg/mL로 희석하고, 50μL/well로 아비딘 플레이트(블로킹리스 타입)(스미토모 베이크라이트사, BS-X7603)에 첨가하여, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. 얻어진 rBC2LCN 고상화 플레이트를 PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정 후, PBS로 100배 희석한 각종 암 환자의 희석 혈청 50μL/well(n=3)과 반응시켰다. 실온 1시간 반응 후, 플레이트를 PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정하고, HRP 표지 rBC2LCN(1μg/mL)을 50μL/well 어플라이하여, 실온 1시간 반응시켰다. PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정 후, TMB solution(후지필름 와코 준야쿠)을 50μL/well 어플라이하고, 실온 30분 발색시키며, 1N HCl을 50μL/well 반응시켜 발색 반응을 정지시키고, OD450/620을 측정했다. 얻어진 수치의 평균을 나타냈다. 본 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이에 있어서는, OD450/620의 값이 높을수록, rBC2LCN에 결합하는 당단백질이 대량으로 존재하고 있는 것을 의미한다.
결과는, 도 1에 나타나는 바와 같았다. 도 1에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이에 의하여 검출되는 당단백질은, 췌장암 환자, 결장암 환자, 방광암 환자, 유방암 환자, 비호지킨 림프종 환자, 자궁체암 환자, 난소암 환자, 및 만성 골수성 백혈병 환자에 있어서, 정상인군에 있어서 인정된 최댓값보다 높은 농도를 갖는 것이 밝혀졌다.
검출된 당단백질은, 고상화된 rBC2LCN과 검출용의 rBC2LCN의 2분자와 동시에 결합할 수 있어야 한다. 본 실시예의 결과로부터, 2분자의 rBC2LCN과 동시에 결합할 수 있는 성분(예를 들면, 혈액 성분)이, 암 환자에 있어서 광범위하고, 정상인보다 높은 농도를 가지며, 따라서, 성분(예를 들면, 혈액 성분)의 분석에 유용하다는 것이 밝혀졌다.
실시예 2: rBC2LCN에 의하여 인식되는 당단백질의 동정(同定)
본 실시예에서는, rBC2LCN 결합 비즈로 췌장암 환자 및 정상인의 혈청 중의 당단백질을 각각 침강시키고, 침강된 당단백질을 rBC2LCN으로 용출하여, 얻어진 용출액을 전기 영동하여, 췌장암 고유의 당단백질을 질량 분석에 의하여 동정했다.
DynabeadsM280 Streptavidin(Invitrogen)에 바이오틴화 rBC2LCN을 결합시켰다. 그리고, 췌장암 및 정상인 혈청과 4℃ 하룻밤 인큐베이트하고, 세정 후, 0.2M 후코스를 첨가하여, 실온 1시간 인큐베이트함으로써, rBC2LCN에 결합한 당단백질을 용출했다. 얻어진 용출액을 전기 영동하여, PVDF막에 전사 후, HRP 표지 rBC2LCN으로 블로트했다. 그 결과, 정상인 혈청에서는 rBC2LCN 블로트에서 반응성이 보이지 않았지만, 췌장암 혈청에서는 75-150kDa 부근에 반응성이 확인되었다. 따라서, 전기 영동하여 은 염색한 젤로부터, 100-150kDa의 적색으로 둘러싼 부분을 잘라냈다. 잘라낸 각 젤편(片)으로부터 트립신 가수분해를 거쳐 펩타이드 혼합물을 얻었다. 펩타이드 혼합물을 LC-MS/MS에 제공하여, MS/MS 데이터를 취득했다. MS/MS 데이터의 아미노산 배열 데이터베이스 검색의 결과를 펩타이드 동정 일람으로서 출력했다. 그 결과, SerpinA3과 Gal3BP가 rBC2LCN에 의하여 암 환자에 있어서 검출되는 후보 단백질로서 취득되었다.
따라서, 췌장암 및 정상인 혈청으로부터 rBC2LCN 고정화 비즈에 결합성을 나타낸 당단백질을 전기 영동하고, SerpinA3에 대한 항체 및 Gal3BP에 대한 항체와 HRP 표지 2차 항체를 이용하여 웨스턴 블로트했다. 그 결과, 도 3에 나타나는 바와 같이, SerpinA3, 및 Gal3BP는, 정상인과 비교하여 췌장암 환자 혈청에서 유의미하게 강하게 검출되었다. SerpinA3과 Gal3BP는, rBC2LCN으로 비즈에 흡착되는 단백질로서 얻어진 것이며, 그 때문에, 이들 당단백질은 rBC2LCN에 반응성인 것을 알 수 있었다.
정상인 췌장의 조직과 췌장암의 조직을 환자로부터 얻어, 면역 조직 화학 염색에 제공했다. 면역 조직 화학 염색은 통상의 방법에 근거하여 행했다. 1차 항체로서는, SerpinA3의 염색에 대해서는, 항SerpinA3 항체(R&D Systems사제, 제품 번호: MAB12945, 희석 배율: 200배)를 이용하고, Gal3BP의 염색에 대해서는, 항Gal3BP 항체(R&D Systems사제, 제품 번호: AF2226, 1μg/mL)를 이용했다. 또, 2차 항체로서는, 각각 바이오틴화 항마우스 IgG(니치레이 바이오사이언스사제, 제품 번호: 424021, 희석 배율: 원액), 및 바이오틴화 항염소 IgG(니치레이 바이오사이언스사제, 제품 번호: 414011, 희석 배율: 원액)를 이용했다. 결과는, 도 9에 나타나는 바와 같았다. 도 9에 나타나는 바와 같이, 정상 췌장 조직에서는, 염색상(像)이 거의 확인되지 않은 데 대하여, 췌장암 조직에서는, 췌관에 있어서 SerpinA3과 Gal3BP가 강하게 발현하고 있는 것이 밝혀졌다.
혈액 중에서 검출되는 SerpinA3 및 Gal3BP는, 췌장암 조직의 췌관에서 유래하는 것이 시사된다.
실시예 3: rBC2LCN과 SerpinA3 항체 또는 Gal3BP 항체를 이용한 샌드위치 어세이에 있어서의 암 환자의 혈청의 분석
따라서, rBC2LCN과 SerpinA3 항체의 샌드위치 어세이를 구축하여, 정상인, 및 췌장암을 포함하는 각종 암 환자의 혈청의 해석을 행했다. 바이오틴화 rBC2LCN을 PBS로 0.3μg/mL로 희석하고, 50μL/well로 아비딘 플레이트(블로킹리스 타입)(스미토모 베이크라이트사, BS-X7603)에 첨가하여, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. 얻어진 rBC2LCN 고상화 플레이트를 PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정 후, PBS로 100배 희석한 각종 암 환자의 희석 혈청 50μL/well(n=3)과 반응시켰다. 실온 1시간 반응 후, 플레이트를 PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정하고, HRP 표지 SerpinA3 항체(1μg/mL; R&D Systems, Cat#: AF1295)를 50μL/well 어플라이하여, 실온 1시간 반응시켰다. PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정 후, TMB solution(후지필름 와코 준야쿠)을 50μL/well 어플라이하고, 실온 30분 발색시키며, 1N HCL을 50μL/well 반응시켜 발색 반응을 정지시키고, OD450/620을 측정했다. 얻어진 수치의 평균을 나타냈다.
결과는, 도 4에 나타나는 바와 같았다. 도 4에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 SerpinA3 항체의 샌드위치 어세이에 의하여 검출되는 당단백질(즉, BC2LCN 렉틴과 결합하는 특정의 당쇄를 갖는 SerpinA3)은, 정상인에 있어서는 거의 검출할 수 없었던 한편, 결장암, 췌장암, 방광암, 위암, 소세포 폐암, 유방암, 비호지킨 림프종, 자궁 경부암, 직장선암, 간세포암, 갑상선암, 전립선암, 자궁체암, 멜라노마, 식도암, 난소암, 담관암, 및 만성 골수성 백혈병 전부(조사한 암 전부)에 있어서, 강하게 검출되었다.
다음으로 rBC2LCN과 Gal3BP 항체의 샌드위치 어세이를 구축하여, 정상인, 췌장암을 포함하는 각종 암 환자의 혈청의 해석을 행했다. 바이오틴화 rBC2LCN을 PBS로 0.3μg/mL로 희석하고, 50μL/well로 아비딘 플레이트(블로킹리스 타입)(스미토모 베이크라이트사, BS-X7603)에 첨가하여, 실온에서 1시간 인큐베이트했다. 얻어진 rBC2LCN 고상화 플레이트를 PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정 후, PBS로 100배 희석한 각종 암 환자의 희석 혈청 50μL/well(n=3)과 반응시켰다. 실온 1시간 반응 후, PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정하고, HRP 표지 Gal3BP 항체(1μg/mL; R&D Systems, Cat#: AF2226)를 50μL/well 어플라이하여, 실온 1시간 반응시켰다. PBS/0.1% Tween20으로 5회 세정 후, TMB solution(후지필름 와코 준야쿠)을 50μL/well 어플라이하고, 실온 30분 발색시키며, 1N HCL을 50μL/well 반응시켜 발색 반응을 정지시키고, OD450/620을 측정했다. 얻어진 수치의 평균으로 그래프를 작성했다. 얻어진 수치의 평균을 나타냈다.
결과는, 도 5에 나타나는 바와 같았다. 도 5에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 Gal3BP 항체의 샌드위치 어세이에 의하여 검출되는 당단백질(즉, BC2LCN 렉틴과 결합하는 특정의 당쇄를 갖는 Gal3BP)은, 정상인에 있어서는 거의 검출할 수 없었던 한편, 결장암, 췌장암, 방광암, 위암, 소세포 폐암, 유방암, 비호지킨 림프종, 자궁 경부암, 직장선암, 간세포암, 갑상선암, 전립선암, 자궁체암, 멜라노마, 식도암, 난소암, 담관암, 및 만성 골수성 백혈병 전부(조사한 암 전부)에 있어서, 강하게 검출되었다.
또, 도 10에서는, 정상인, 췌장염 환자, 및 췌장암 환자로 나누어, 비교를 행했다. 그 결과, rBC2LCN과 rBC2LCN의 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체의 샌드위치 어세이, rBC2LCN 및 항Gal3BP 항체의 샌드위치 어세이, 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체의 샌드위치 어세이에 있어서, 췌장암 환자에서, 정상인이나 췌장염 환자와 비교하여 강한 시그널을 검출했다. 이 점에서, 이들 어세이에 의하여, 췌장암 환자를, 정상인이나 췌장염 환자로부터 구별할 수 있는 것이 시사되었다.
이 점에서, 암 환자의 혈청에 있어서 광범위하고, BC2LCN 렉틴과 결합하는 특정의 당쇄를 갖는 SerpinA3 및 BC2LCN 렉틴과 결합하는 특정의 당쇄를 갖는 Gal3BP가 존재하는 것이 밝혀졌다.
또한, 다른 정상인의 혈청 검체 및 췌장암 환자의 혈청 검체를 이용하여, 상기에 기재된 바와 같은 방법으로, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이, 및 항SerpinA3 항체(R&D Systems, Cat#: AF1295)와 항SerpinA3 항체(R&D Systems, Cat#: AF1295)에 의한 샌드위치 어세이를 실시했다.
결과는, 도 6에 나타나는 바와 같았다. 도 6에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이, 및 rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이에 있어서는, 정상인의 혈청보다, 췌장암 환자의 혈청에 있어서 샌드위치 어세이에서 높은 측정 강도가 얻어졌다. 이에 대하여, 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이에서는, 정상인과 췌장암 환자의 혈청에서 측정 강도가 동등했다. 이것은, 정상인 혈청에 있어서도, 췌장암 환자의 혈청에 있어서도, SerpinA3은 존재하지만, 췌장암 환자에 있어서 특이적으로 SerpinA3이 rBC2LCN에 의하여 인식 가능한 당에 의한 수식을 받고 있는 것을 시사하는 결과이다.
상기에서 얻어진 결과를 해석하여, 특이도(Specificity)를 가로축으로 하고, 감도(Sensitivity)를 세로축으로 하여, ROC 곡선을 그렸다. 결과는, 도 7에 나타나는 바와 같았다.
도 7의 좌상(左上) 측 패널에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-rBC2)에서는, ROC 곡선하 면적(AUC)이 0.679이며, 당해 ROC 곡선에 있어서의 컷오프(감도 1, 특이도 1로부터의 최단 거리에 있는 ROC 곡선상의 점으로부터 구해진다)는 0.329이고, 그때의 특이도는 0.820이며, 감도는 0.575였다.
도 7의 우상(右上) 측 패널에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-SerpinA3)에서는, ROC 곡선하 면적(AUC)이 0.892이며, 당해 ROC 곡선에 있어서의 컷오프(감도 1, 특이도 1로부터의 최단 거리에 있는 ROC 곡선상의 점으로부터 구해진다)는 0.014이고, 그때의 특이도는 0.840이며, 감도는 0.825였다.
도 7의 좌하(左下) 측 패널에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-Gal3BP)에서는, ROC 곡선하 면적(AUC)이 0.743이며, 당해 ROC 곡선에 있어서의 컷오프(감도 1, 특이도 1로부터의 최단 거리에 있는 ROC 곡선상의 점으로부터 구해진다)는 0.01이고, 그때의 특이도는 0.900이며, 감도는 0.575였다.
또한, 도 7의 우하(右下) 측 패널에 나타나는 바와 같이, 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이(SerpinA3-SerpinA3)에서는, ROC 곡선하 면적(AUC)이 0.718이며, 당해 ROC 곡선에 있어서의 컷오프(감도 1, 특이도 1로부터의 최단 거리에 있는 ROC 곡선상의 점으로부터 구해진다)는 1.056이고, 그때의 특이도는 0.8이며, 감도는 0.65였다.
상기 결과로부터는, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-SerpinA3)가, 가장 우수한 정밀도를 갖고, rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-Gal3BP)가, 가장 우수한 특이도를 나타내는 것이 밝혀졌다. 또, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-rBC2)나, 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이(SerpinA3-SerpinA3)에서도, 일정한 유용성을 갖는 정밀도를 나타내는 것이 밝혀졌다.
또한, 정상인(n=49) 및 췌장염 환자(n=9)와 췌장암 환자(n=85)를 구별할 수 있는지 아닌지를 ROC 곡선을 작성하여 검토했다. 그러자, 도 11에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-SerpinA3)와 rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-Gal3BP)가, 가장 우수한 AUC를 나타내는 것이 밝혀졌다. 또, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이(rBC2-rBC2)나, 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이(SerpinA3-SerpinA3)에서도, 일정한 유용성을 갖는 것이 밝혀졌다.
실시예 5: 스테이지별 췌장암 환자의 혈청의 분석
본 실시예에서는, 스테이지 1A부터 스테이지 4까지의 다양한 췌장암을 갖는 환자의 혈청 검체를, 샌드위치 어세이에 의하여 평가했다.
암의 스테이지는, UICC TNM 분류(UICC: TNM Classification of Malignant Tumours, 8th Edn. Wiley-Blackwell; 2017. 94-95)에 근거하여 의사가 결정했다. 암 환자의 혈청을 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같이, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이, 및 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이에 각각 제공했다. 결과는, 도 8a~8d에 나타나는 바와 같았다.
도 8a~8c에 나타나는 바와 같이, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이, 및 rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이에서는, 스테이지 1부터 4까지의 모든 스테이지에 있어서, 높은 측정 강도를 나타내는 샘플이 확인되었다.
도 8d에 나타나는 바와 같이, 항SerpinA3 항체와 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이에서는, 도 6에서 나타난 것과 동일하게, 모든 샘플에 있어서 높은 측정 강도가 나타났다.
스테이지 I의 췌장암 환자(n=9)와 정상인(n=49)의 사이에서 ROC 곡선을 작성했다. 결과는, 도 12에 나타나는 바와 같았다. 도 12에 나타나는 바와 같이, 어느 샌드위치 어세이에 있어서도, 스테이지 I의 췌장암 환자를 양호하게 검출할 수 있었다. 스테이지 II의 췌장암 환자(n=51)와 정상인(n=49)의 사이에서 ROC 곡선을 작성했다. 결과는, 도 13에 나타나는 바와 같았다. 도 13에 나타나는 바와 같이, 어느 샌드위치 어세이에 있어서도, 스테이지 II의 췌장암 환자를 양호하게 검출할 수 있었다. 스테이지 III의 췌장암 환자(n=8)와 정상인의 사이(n=49)의 ROC 곡선을 작성했다. 결과는, 도 14에 나타나는 바와 같았다. 도 14에 나타나는 바와 같이, 나타나는 어느 샌드위치 어세이에 있어서도, 스테이지 III의 췌장암 환자를 양호하게 검출할 수 있었다. 스테이지 IV의 췌장암 환자(n=17)와 정상인(n=49)의 사이의 ROC 곡선을 작성했다. 결과는, 도 15에 나타나는 바와 같았다. 도 15에 나타나는 바와 같이, 나타나는 어느 샌드위치 어세이에 있어서도, 스테이지 IV의 췌장암 환자를 양호하게 검출할 수 있었다.
췌장암 환자에 대하여 췌장암의 적출 수술을 실시했다. 수술 전과 수술 후의 혈액 샘플(n=38)에 대하여 샌드위치 어세이로 분석했다. rBC2LCN과 항SerpinA3 항체의 샌드위치 어세이의 결과는 도 16에 나타나고, rBC2LCN과 항Gal3BP 항체의 샌드위치 어세이의 결과는 도 17에 나타나며, CA19-9 어세이의 결과는 도 18에 나타났다. 각각의 도면에 있어서, 30POD는 수술 후 30일을 의미하고, 3m는 수술 후 3개월을 의미한다. 도 16~18에 나타나는 바와 같이, 각 샌드위치 어세이의 시그널은, 암의 적출술에 의하여 저하되었다. 따라서, 이들 어세이에서는, 암의 적출의 결과가, 혈액 중의 성분 함량에 영향을 주는 것을 이해할 수 있다.
또한, 재발한 환자의 혈액 샘플을 경시적으로 어세이했다. 어세이는, BC2LCN과 항SerpinA3 항체를 이용한 샌드위치 어세이로 했다. 결과는 도 19에 나타나는 바와 같았다. 도 19에 나타나는 바와 같이, 환자 A에 있어서는, 수술 후, 시간 경과와 함께 어세이의 시그널이 저하되었다. 그러나, 재발한 환자 A의 혈액을 분석하면, 시그널이 현저하게 증대되어 있었다. 이 점에서, 본 발명의 어세이계는, 재발의 검출에 이용할 수 있는 것이 시사되었다.
이 점에서, rBC2LCN과 rBC2LCN에 의한 샌드위치 어세이, rBC2LCN과 항SerpinA3 항체에 의한 샌드위치 어세이, 및 rBC2LCN과 항Gal3BP 항체에 의한 샌드위치 어세이에서는, 적절히 컷오프값을 설정함으로써 스테이지 1 및 2 등의 조기 췌장암부터 스테이지 4의 췌장암까지를 폭넓게 검출할 수 있다.

Claims (23)

  1. 대상으로부터 얻어진 생체 샘플을 분석하는 방법으로서,
    BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN인 제2 분자를 이용하여 실시되는 어세이에 의하여, 생체 샘플 중에 포함되는 성분을 분석하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    제1 분자가 BC2LCN인, 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    대상이, 암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    대상이, 췌장암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    대상이, 스테이지 1 또는 2의 췌장암을 갖거나, 또는 그 가능성을 갖는, 방법.
  8. BC2LCN, SerpinA3에 결합하는 분자, 및 Gal3BP에 결합하는 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 제1 분자와, BC2LCN 결합성의 당쇄에 결합하는 분자인 제2 분자를 포함하고, 제1 분자와 제2 분자를 이용하여 대상의 생체 샘플 중의 당단백질의 양을 측정할 수 있는, 샌드위치 어세이용의 키트, 이뮤노크로마토 어세이용의 키트, 렉틴 전기 영동용의 키트, 질량 분석용의 키트, 렉틴 어피니티 크로마토그래피용의 키트 또는 μTAS용의 키트.
  9. 청구항 8에 있어서,
    제1 분자가 SerpinA3에 결합하는 항체이며, 당단백질에 있어서의 단백질 부분이 SerpinA3인, 키트.
  10. 청구항 8에 있어서,
    제1 분자가 Gal3BP에 결합하는 항체이며, 당단백질에 있어서의 단백질 부분이 Gal3BP인, 키트.
  11. 청구항 8에 있어서,
    고상화된 BC2LCN인 제2 분자와, 표지된 BC2LCN, 표지된 SerpinA3에 결합하는 항체, 및 표지된 Gal3BP에 결합하는 항체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 표지된 제1 분자를 포함하는, 키트.
  12. 청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    암을 검출하는 것에 이용되는, 키트.
  13. 청구항 12에 있어서,
    암이, 췌장암인, 키트.
  14. 청구항 13에 있어서,
    암이, 스테이지 1 또는 2의 췌장암인, 키트.
  15. 대상이 암인지 아닌지를 예측하는 방법으로서, 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 방법을 실시하는 것을 포함하는, 방법.
  16. 대상으로부터 얻어진 생체 샘플 중에 있어서 특정 성분을 검출하는 방법으로서,
    특정 성분은, 2개의 BC2LCN을 동시에 결합할 수 있는 성분, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분인, 방법.
  17. 대상으로부터 얻어진 생체 샘플로부터 2개의 BC2LCN에 동시에 결합할 수 있는 성분, SerpinA3 및 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 분리하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    대상이, 췌장암 또는 췌장암을 가질 가능성을 갖는 대상인, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서,
    췌장암이, 스테이지 I 또는 II의 췌장암인, 방법.
  20. 청구항 17 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
    분리된 성분의 양을 측정하는 것을 더 포함하는, 방법.
  21. 청구항 20에 있어서,
    컷오프값과 상기 측정된 성분의 양을 비교하는 것을 더 포함하는, 방법.
  22. 청구항 21에 있어서,
    컷오프값이, 정상인의 상기 측정된 성분에 대응하는 성분의 양의 평균값 이상의 값이며, 췌장암 환자의 상기 측정된 성분에 대응하는 성분의 양의 평균값 이하의 값인, 방법.
  23. 청구항 17 내지 청구항 22 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 성분이, BC2LCN 결합성의 SerpinA3, 및 BC2LCN 결합성의 Gal3BP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 성분인, 방법.
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