ES2854400T3 - Fc-ELA--32 y su uso en el tratamiento de afecciones cardiacas - Google Patents

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Abstract

Un péptido en una forma farmacéuticamente aceptable, para usar en un método para tratar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca, estando seleccionando el péptido del grupo que consiste en: (a) una proteína de fusión Elabela de SEQ ID NO: 4 (Fc-ELA-32), y (b) un fragmento, o una variante, o un derivado de la misma que es al menos un 95 % idéntico a los péptidos de (a).

Description

DESCRIPCIÓN
Fc-ELA-32 y su uso en el tratamiento de afecciones cardiacas
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional 62/063.005, titulada "Methods for Treating Cardiovascular Disease and Improving Fluid Homeostasis with a Peptide Hormone", presentada el 13 de octubre de 2014.
Antecedentes
Cada año, las cardiopatías son uno de los problemas de salud más graves de este país. Los costes directos e indirectos de las enfermedades cardiovasculares y los accidentes cerebrovasculares son aproximadamente 315 mil millones de dólares. Esta cifra aumenta cada año. Las estadísticas muestran que las enfermedades cardiovasculares son el principal problema de salud de Estados Unidos y la principal causa de muerte. Teniendo en cuenta las estadísticas más recientes publicadas por la American Heart Association, aproximadamente 84 millones de personas en este país padecen algún tipo de enfermedad cardiovascular, lo que provoca aproximadamente 2.200 muertes al día, con un promedio de una muerte cada 40 segundos. Casi una de cada tres muertes se debe a una enfermedad cardiovascular. Se estima que 15 millones de adultos estadounidenses tienen cardiopatía coronaria. Aproximadamente 78 millones de adultos estadounidenses tienen la presión arterial alta y se estima que 20 millones tienen diabetes. Se estima que otros 8 millones de adultos tienen diabetes no diagnosticada y 87 millones tienen prediabetes. Se estima que actualmente 5,8 millones de adultos en los Estados Unidos viven con insuficiencia cardíaca y se prevé que su frecuencia aumente al 25 % para 2030. La creciente frecuencia de cardiopatías se atribuye al envejecimiento de la población, el aumento de la obesidad y la diabetes, y a la mejora de la supervivencia de la insuficiencia cardíaca y otras enfermedades y afecciones cardíacas.
Los medicamentos que funcionan en muchos niveles diferentes están disponibles para mejorar la función cardíaca e incluyen: inhibidores de la ECA, antagonistas de la aldosterona, bloqueantes de los receptores de la angiotensina, betabloqueantes, antagonistas del calcio, fármacos para reducir el colesterol, digoxina, diuréticos, fármacos para reducir la glucosa, potasio o magnesio, antagonistas de la vasopresina y warfarina. Se buscan activamente agentes terapéuticos que puedan mejorar y/o restaurar la función cardíaca con grandes márgenes de seguridad. Además, es deseable mantener al paciente a un nivel de fármaco constante durante un período de tiempo prolongado.
Existe una necesidad urgente de identificar estrategias y métodos para mejorar la salud cardiovascular, la tasa de supervivencia de la insuficiencia cardíaca y la esperanza de vida de esta creciente población de pacientes. La presente invención aborda esta necesidad.
Sumario
La invención se define en las reivindicaciones. En un primer aspecto, se proporciona un péptido en una forma farmacéuticamente aceptable, para usar en un método para tratar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca, seleccionando el péptido del grupo que consiste en:
(a) una proteína de fusión Elabela de SEQ ID NO: 4 (Fc-ELA-32),
y
(b) un fragmento, o una variante, o un derivado de la misma que es al menos un 95 % idéntico a la proteína de fusión de (a).
En determinadas realizaciones, la afección cardíaca es el resultado de una afección seleccionada del grupo que consiste en infarto de miocardio, apoptosis de cardiomiocitos inducida por infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca inducida por infarto de miocardio, fibrosis inducida por infarto de miocardio.
En otras realizaciones, la administración de las proteínas de fusión como se describe en el presente documento puede ser en una cantidad sola o en combinación con, un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de la ECA, un antagonista de aldosterona, un bloqueante de los receptores de la angiotensina, un betabloqueante, un bloqueante del calcio, un fármaco para reducir el colesterol, una digoxina, un diurético, potasio o magnesio, un antagonista de la vasopresina y warfarina.
También se proporciona la proteína de fusión para usar en un método para tratar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca de acuerdo con el primer aspecto, comprendiendo el método:
(i) identificar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca;
(ii) medir en una muestra una cantidad de un péptido de SEQ ID NO: 1, en el torrente circulatorio del sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca;
(iii) medir en una muestra una cantidad de un péptido de SEQ ID NO: 1, en el torrente circulatorio de un sujeto normal de control;
(iv) comparar las cantidades del péptido de SEQ ID NO: 1, en el sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca y en el sujeto normal de control; y
(v) tratar al sujeto con una composición que comprende una proteína de fusión Elabela de SEQ ID NO: 4 o un fragmento, o variante, o derivado de la misma que es al menos un 95% idéntico al SEQ ID NO: 4, cuando la cantidad de péptido del sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca ha disminuido significativamente con respecto a la del sujeto normal de control.
Las proteínas de fusión se proporcionan en determinadas realizaciones/enseñanzas y comprenden desde el extremo N al C, (i) un péptido señal de secreción de plasminógeno tisular humano, (ii) un dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina, (iii) una región bisagra, y (iv) un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, o un fragmento, o una variante, o un derivado del mismo que es al menos un 95 % idéntico a los péptidos de (iv). La proteína de fusión puede comprender una molécula de inmunoglobulina humana y una región bisagra. En determinadas realizaciones, la región bisagra comprende al menos 5, preferentemente 16 aminoácidos, como máximo, 20 aminoácidos. En otras realizaciones, se proporcionan métodos para producir estas proteínas de fusión.
Se enseñan composiciones farmacéuticas y comprenden (a) un péptido de SEQ ID NO: 2 (ELA-21), o fragmento, variante o derivado del mismo que es al menos un 95 % idéntico a los péptidos (b) o la proteína de fusión como se describió anteriormente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica puede comprender además un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de la ECA, un antagonista de aldosterona, un bloqueante de los receptores de la angiotensina, un betabloqueante, un bloqueante del calcio, un fármaco para reducir el colesterol, una digoxina, un diurético, un fármaco para reducir la glucosa, potasio o magnesio, un antagonista de la vasopresina y warfarina.
En otras realizaciones, se proporcionan métodos para activar selectivamente cardiomiocitos in vitro, que comprenden poner en contacto los cardiomiocitos con proteínas de fusión como se describió en ellos. La activación comprende la estimulación de la proliferación de cardiomiocitos.
Estas y otras características, aspectos y ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto a la siguiente descripción, las reivindicaciones adjuntas y las figuras adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinadas realizaciones de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento. Se proporcionan a modo de antecedentes o con fines comparativos ejemplos que describen el uso de péptidos o proteínas de fusión que no están cubiertos por las reivindicaciones. La Figura 1 es una fotografía de una transferencia Western que muestra la expresión de ELA limitada por tejidos en el ser humano.
La Figura 2A es un esquema de una proteína de fusión APJ-GFP.
Las Figuras 2B-2G son fotografías de internalización de la proteína de fusión APJ-EGFP estimulada con ELA. Las Figuras 3A-3C son gráficos que representan la señalización descendente de la activación de APJ con ELA. Las Figuras 4A-4D son fotografías y gráficos que ilustran la estimulación de una estructura tipo túbulo vascular mediante la señalización de ELA-APJ.
Las Figuras 5A-5C son gráficos que ilustran el efecto relajante de ELA y apelina-13 en los vasos sanguíneos. Las Figuras 6A-6C son fotografías y gráficos de barras que ilustran la expresión y función endocrina de ELA en el riñón.
Las Figuras 7A-7C son gráficos de barras y una fotografía que ilustran que la administración de ELA mejora las funciones cardíacas posteriores al IM, como lo indica un menor aumento de la LVDs y una menor disminución de LVEF.
Las Figuras 8A-8B son fotografías y gráficos de barras que ilustran que ELA disminuye la apoptosis de cardiomiocitos inducida por hipoxia.
La Figura 9 es un gráfico de barras que ilustra la expresión de ARNm de ELA en riñón de ratón con una dieta baja o alta en sal medida mediante RT-PCR común (panel superior) o qPCR (panel inferior).
La Figura 10 es un gráfico de barras que ilustra la expresión de ARNm de ELA de riñón y corazón en ratón sin (simulado) o con IM infundido con ELA o vehículo medido mediante qRT-PCR ajustado a niveles de beta actina. Las Figuras 11A-11B son gráficos de barras que ilustran la expresión de ARNm de apelina y APJ en riñón y corazón de ratón después de la infusión de ELA o el vehículo.
La Figura 12 es un gráfico que ilustra el aumento de la diuresis en ratones después de la administración de ELA-32.
La Figura 13 es un gráfico de barras que ilustra la supresión de ELA-32 de la expresión de aldosterona sintasa inducida por angiotensina II.
La Figura 14 es un diseño esquemático de las construcciones Fc-ELA-32 y Fc-ELA-21.
Las Figuras 15A-15C son fotografías que ilustran las proteínas de fusión Fc-ELA-32 y Fc-ELA-21 como endocitosis funcional e inductora in vitro.
Las Figuras 16A-16B son gráficos que muestran la farmacocinética de Fc-ELA-32 y Fc-Apelina-13
La Figura 17 es un gráfico de barras que muestra los niveles séricos de Fc-ELA-32 después de la inyección subcutánea.
Las Figuras 18A-18B son gráficos de barras que ilustran la reducción de PTDVI en la insuficiencia cardíaca inducida por IM en ratas después de la administración de Fc-ELA-32.
Las Figuras 19A-19B son fotografías y un gráfico de barras que muestra la supresión de la fibrosis del corazón infartado después de la administración de Fc-ELA-32.
Las Figuras 20A-20B son fotografías que muestran que la administración de Fc-ELA-32 aumenta la proliferación de cardiomiocitos.
Las Figuras 21A-21B son fotografías que muestran la reducción de la apoptosis de los cardiomiocitos después de la administración de Fc-ELA-32.
Las Figuras 22A-22B son gráficos que muestran que la administración de Fc-Apelina-13 reduce la glucosa en ratones obesos inducidos por la dieta.
La Figura 23 es un gráfico que muestra una mejora en el rendimiento cardíaco después de la administración de Fc-Apelina-13 en ratones obesos inducidos por la dieta.
Descripción detallada
1. Introducción
Más de cien proteínas y péptidos terapéuticos aprobados por la U.S. Food and Drug Administration (FDA) se utilizan para una amplia variedad de indicaciones, que van desde el dolor de la artritis reumatoide, enfermedad cardiovascular, diabetes y depresión. Muchas de estas proteínas y péptidos tienen propiedades farmacocinéticas menos que óptimas, a menudo porque son más pequeños que el límite de filtración renal. Para prácticamente todas estas proteínas y péptidos, la dosificación es parenteral, por lo que cada dosis está representada por una inyección subcutánea o intravenosa. La alta frecuencia de dosificación, un área bajo la curva (ABC) pequeña y las molestias para el paciente son limitaciones de los péptidos de acción corta. Los tiempos de semivida plasmática cortos se deben generalmente a la rápida eliminación renal, así como a la degradación enzimática que ocurre durante la circulación sistémica. Por lo tanto, en muchos casos, se desean modificaciones de segunda o tercera generación de esos fármacos proteicos o peptídicos, destinadas a disminuir su sensibilidad a las proteasas y la filtración glomerular por el riñón, para mejorar los perfiles farmacocinéticos para opciones de tratamiento más eficaces.
Para abordar estas deficiencias, en determinadas realizaciones, la fusión genética de un péptido o proteína farmacológicamente activo a una proteína o dominio de proteína de semivida larga de forma natural (por ejemplo, fusión de Fc) proporciona una semivida deseada. Debido a las ventajas obvias de los fármacos peptídicos y proteicos de acción prolongada, hay demanda de estrategias para prolongar la semivida plasmática de dichos compuestos. Por lo tanto, se proporcionan esfuerzos para buscar estas modificaciones proteicas en el desarrollo de agentes terapéuticos con propiedades más deseables.
De particular interés es el péptido ELA. ELA proporciona una función protectora cardíaca en mamíferos como se deduce de su papel de desarrollo en la formación de cardiomiocitos en el pez cebra. El péptido ELA de 54 aminoácidos de longitud completa incluye una señal secretora en su región aminoterminal. Después de la escisión del péptido señal que consta de los primeros 22 restos, la hormona ELA madura tiene 32 aminoácidos de longitud (ELA-32) (SEQ ID NO: 1) con un punto isoeléctrico superior a 12. El análisis filogenético reveló que el péptido maduro de 32 aminoácidos está altamente conservado evolutivamente, siendo los últimos 13 restos casi invariantes en todas las especies de vertebrados. Además, las rutas de señalización del receptor Elabela-Apelina ("ELA-APJ") que se encuentran en el pez cebra se conservan y son funcionales en células de mamíferos. ELA se une y activa APJ y su activación da como resultado la supresión de cAMP, la activación de ERK y la movilización de calcio intracelular de manera dependiente de la dosis, lo que establece que ELA actúe sobre APJ en el sistema humano y sea necesario para el desarrollo cardíaco normal en el pez cebra. El papel fundamental en el desarrollo de ELA en el pez cebra sugiere que el sistema cardiovascular es la principal diana de la acción de ELA.
Por lo tanto, en determinadas enseñanzas, se describen métodos para tratar a quienes padecen una afección cardíaca o que tienen un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca mediante la administración al sujeto de un péptido ELA o una proteína de fusión como se describe en el presente documento a un sujeto que lo necesite. Más particularmente, algunas realizaciones se refieren a proteínas de fusión y métodos para prepararlas que ayudan a prolongar la semivida de ELA en el torrente circulatorio y tienen propiedades mejoradas para usar como agentes terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de afecciones cardíacas. Algunas realizaciones se refieren además a métodos para producir las proteínas de fusión descritas en el presente documento, y a proteínas de fusión para usar en métodos de tratamiento de enfermedades tales como enfermedades cardiovasculares.
En la siguiente descripción, con fines explicativos, se exponen numerosos detalles específicos con el fin de proporcionar una comprensión profunda de la presente invención. Será evidente, sin embargo, para un experto en la materia que la presente invención se puede poner en práctica sin estos detalles específicos. Para que la invención pueda entenderse fácilmente y ponerse en práctica, ahora se describirán realizaciones preferidas particulares mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
2. Definiciones
A menos que se definan de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento pretenden tener el mismo significado que se entiende habitualmente en la materia a la que pertenece esta invención y en el momento de su presentación. Aunque pueden usarse varios métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Sin embargo, los expertos deben comprender que los métodos y materiales usados y descritos son ejemplos y pueden no ser los únicos adecuados para usar en la invención. Además, también debe entenderse que, dado que las mediciones están sujetas a una variabilidad inherente, cualquier temperatura, peso, volumen, intervalo de tiempo, pH, salinidad, molaridad o molalidad, intervalo, concentración y cualquier otra medición, cantidades o expresiones numéricas dadas en el presente documento tienen la intención de ser aproximadas y no cifras exactas o decisivas a menos que se indique expresamente lo contrario. Por tanto, cuando sea adecuado para la invención y como lo entiendan los expertos en la materia, es adecuado describir los diversos aspectos de la invención utilizando términos aproximados o relativos y términos de grado habitualmente empleados en las solicitudes de patente, tales como: tan dimensionado, alrededor, aproximadamente, sustancialmente, esencialmente, que consiste esencialmente en, que comprende, y cantidad eficaz.
Generalmente, las nomenclaturas usadas en conexión con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética, proteínas y química de ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento se conocen bien y se usan habitualmente en la materia. Los métodos y las técnicas en determinadas realizaciones se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la materia y como se describe en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique lo contrario. Véanse, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, y Supplements to 2002); Harlow y Lan, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Principles of Neural Science, 4a ed., Eric R. Kandel, James H. Schwartz, Thomas M. Jessell editors. McGraw-Hill/Appleton & Lange: Nueva York, N. Y. (2000). A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en el presente documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia.
Los términos "un", "uno/una", "el/la" y términos similares usados en el presente documento en el contexto de determinadas reivindicaciones (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) deben interpretarse para cubrir tanto el singular como el plural a menos que se indique de otro modo en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.
El término "apelina" como se usa en el presente documento es una preproteína de 77 restos (Secuencia de Referencia nCb I: NP-0059109.3 y codificada por la secuencia de referencia NCBI: NM-017413.3), que se transforma en formas biológicamente activas de péptidos de apelina, tales como apelina-36, apelina-17, apelina-16, apelina-13, (SEQ ID NO: 3) y apelina-12. El péptido maduro de longitud completa, conocido como "apelina-36", comprende 36 aminoácidos, pero la isoforma más potente es la forma piroglutamada de 13 mer de apelina (apelina-13), denominada "Pyr-1-apelina-13 o Pyr1-apelina-13". Se describen diferentes formas de apelina, por ejemplo, en la patente de EE.UU. n.° 6.492.324B.
Las expresiones "receptor de apelina", "receptor de angiotensina de tipo 1", "receptor de angiotensina II de tipo 1", (APJ) como se usa en el presente documento se refieren a un receptor acoplado a Gi de 380 restos, 7 dominios transmembrana, cuyo gen está localizado en el brazo largo del cromosoma 11 en seres humanos (Secuencia de referencia NCBI: NP-005152.1 y codificada por la secuencia de referencia NCBI: NM-005161). APJ se clonó por primera vez en 1993 a partir de ADN genómico humano utilizando cebadores oligonucleotídicos degenerados (O'Dowd et al. Gene, 136: 355-60, 1993) y comparte una homología significativa con el receptor de angiotensina II de tipo 1. Sin embargo, a pesar de esta homología, la angiotensina II no se une a APJ. Aunque huérfano desde hace muchos años, el ligando endógeno se ha aislado y denominado apelina (Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251,471-6 (1998)).
La expresión "tiene un factor de riesgo para" como se usa en el presente documento significa que un sujeto está en riesgo de desarrollar una afección cardíaca debido a una afección genética existente previamente, antecedentes familiares o factores de estilo de vida, incluyendo, pero sin limitación, ser posmenopáusicas para las mujeres, tener más de 45 años para los hombres, diabetes o hiperglucemia, consumo excesivo de alcohol, trastornos renales, obesidad, tabaquismo, estrés, disfunción de la glándula tiroides y la glándula suprarrenal, colesterol total en sangre por encima de 250 mg/dl, colesterol LDL por encima de 130 mg/dl (3,0 mmol/l), colestero1HDL por debajo de 35 mg/dl y nivel de lipoproteínas (a) por encima de 30 mg/dl.
La expresión "enfermedad cardíaca" o "afección cardíaca", como se usa en el presente documento, significa una afección o enfermedad del corazón en un sujeto, opcionalmente, que sea el resultado de, o se caracterice por, una cualquiera de o una combinación de los siguientes: infarto de miocardio, apoptosis de cardiomiocitos inducida por infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca inducida por infarto de miocardio, fibrosis inducida por infarto de miocardio.
Las expresiones "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usan en el presente documento tienen los significados estándar conocidos en la materia y se usan indistintamente en el presente documento para significar una cantidad suficiente para tratar a un sujeto que padece una afección o enfermedad (por ejemplo, insuficiencia cardíaca, diabetes) o para detener la progresión de la afección o enfermedad, o aliviar un síntoma o una complicación asociada con la afección o enfermedad. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y será comprobada por un experto en la materia usando materias conocidas (por ejemplo, Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery; Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992), Dekker, ISBN 0824770846, 082476918X, 0824712692, 0824716981; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); y Pickar, Dosage Calculations (1999)). Por ejemplo, en el caso de un agente para tratar la insuficiencia cardíaca, una cantidad eficaz puede ser una cantidad suficiente para dar como resultado una mejora clínica del paciente, por ejemplo, aumento de la tolerancia/capacidad al ejercicio, disminución de la presión sanguínea, disminución de la retención de líquidos y/o mejores resultados en una prueba cuantitativa de funcionamiento cardíaco, por ejemplo, fracción de eyección, capacidad de ejercicio (tiempo hasta el agotamiento).
El término Elabela ("ELA" o "Ela") como se usa en el presente documento se refiere a una hormona o forma madura que consiste en péptidos de 32 aminoácidos (SEQ ID NO: 1) así como 21 aminoácidos (SEQ ID NO: 2) encontrados en seres humanos así como en otros vertebrados y se considera que juega un papel importante en el sistema circulatorio a través del receptor de apelina (APJ).
La expresión "molécula de inmunoglobulina" como se usa en el presente documento significa una proteína que tiene la estructura de un anticuerpo de origen natural. Por ejemplo, las inmunoglobulinas de la clase IgG son glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas que están unidas por enlaces disulfuro. Desde el extremo N al extremo C, cada cadena pesada de inmunoglobulina tiene una región variable (VH), también denominada dominio pesado variable o dominio variable de cadena pesada, seguida de tres dominios constantes (CH1, CH2 y CH3) y también denominados región constante de cadena pesada. De forma similar, desde el extremo N al extremo C, cada cadena ligera de inmunoglobulina tiene una región variable (VL), también denominada dominio ligero variable o dominio variable de cadena ligera, y seguida de un dominio ligero constante (CL), también denominado región constante de cadena ligera. La cadena pesada de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de cinco tipos, denominados a, (IgA), A., £, y y M, (IgD), £, (IgE), y, (IgG) o m, (IgM), algunos de los cuales pueden dividirse adicionalmente en subclases, por ejemplo, y1 (IgG1), y2 (IgG2), Y3 (IgG3), y4 (IgG4), a1 (IgA1) y a2 (IgA2). La cadena ligera de una inmunoglobulina puede asignarse a uno de dos tipos, denominados kappa (k) y lambda (A) basado en la secuencia de aminoácidos de su dominio constante. Una inmunoglobulina consiste esencialmente en dos moléculas Fab y un dominio Fc, enlazados a través de la región de bisagra de inmunoglobulina.
Las expresiones "dominio Fc" o "región Fc" se usan en el presente documento para referirse a una región carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que contiene al menos una porción de la región constante. La expresión incluye regiones Fc de secuencia natural y regiones Fc variantes. Una región Fc de IgG comprende un domino CH2 de IgG y un dominio CH3 de IgG. El "dominio CH2" de una región Fc de IgG humana se extiende normalmente desde un resto de aminoácido aproximadamente en la posición 231 hasta un resto de aminoácido aproximadamente en la posición 340. En una realización, se une una cadena de hidrato de carbono al dominio CH2. El dominio CH2 en el presente documento puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 variante. El "dominio CH3" comprende el grupo de restos carboxiterminales a un dominio CH2 en una región Fc (es decir, desde un resto de aminoácido aproximadamente en la posición 341 hasta un resto de aminoácido aproximadamente en la posición 447 de una IgG).
La expresión "proteína de fusión" como se proporciona o se enseña en el presente documento se refiere a una molécula polipeptídica que contiene dos o más secuencias peptídicas que no están unidas entre sí de forma natural, pero que se han unido entre sí mediante enlaces peptídicos, ya sea directamente o mediante enlazadores peptídicos o regiones bisagra. Las cadenas peptídicas individuales del componente de inmunoglobulina de la proteína de fusión se pueden unir de forma no covalente, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro. Las proteínas de fusión se pueden crear mediante la unión de dos o más genes que originalmente codificaban proteínas separadas o de dos o más péptidos o proteínas diseñados artificialmente. En determinadas realizaciones o enseñanzas, las proteínas de fusión pueden incluir un péptido ELA unido a una región Fc o ELA unido a apelina, incluyendo, pero sin limitación, Fc-ELA-32 (SEQ ID NO: 4), Fc-ELA-21 (SEQ ID NO: 5) y una proteína de fusión Elabela-Apelina.
El término "fusionado" como se usa en el presente documento se refiere a componentes que están unidos mediante enlaces peptídicos, ya sea directamente o mediante uno o más enlazadores peptídicos o una región bisagra.
Las expresiones "célula hospedadora", "línea celular hospedadora", y "cultivo de células hospedadoras", como se usan en el presente documento son intercambiables y se refieren a células en las que se ha introducido ácido nucleico exógeno, incluyendo la descendencia de dichas células. Una célula hospedadora es cualquier tipo de sistema celular que se pueda usar para generar las proteínas de fusión en determinadas realizaciones. Las células hospedadoras incluyen células cultivadas, por ejemplo, células de mamífero cultivadas, tales como HEK293, HEK293T, células ChO, células BHK, células nSo , células SP2/0, células YO de mieloma, células P3X63 de mieloma de ratón, células PER, células PER.C6 o células de hibridoma, células de levadura, células de insecto y células vegetales, por nombrar solo algunas, pero también células comprendidas dentro de un animal transgénico, planta transgénica o planta cultivada o tejido animal.
Las expresiones "infarto de miocardio" (IM) o "ataque cardíaco", como se usan en el presente documento, se caracterizan por la muerte de miocitos, necrosis coagulativa, miocitólisis, necrosis de la banda de contracción o apoptosis, resultante de un desequilibrio importante entre el suministro y la demanda de oxígeno del miocardio. La causa más común de IM es la trombosis de las arterias coronarias tras la rotura de placas de ateroma. Aunque alguna vez se definió rigurosamente como falta de circulación sanguínea, la definición moderna de isquemia enfatiza el desequilibrio entre el suministro y la demanda de oxígeno, así como la eliminación inadecuada de productos de desecho metabólicos. Las expresiones "insuficiencia cardíaca después de un infarto IM" o "insuficiencia cardíaca posterior a un infarto" o "insuficiencia cardíaca posterior a un IM" se refieren a los pacientes que sobrevivieron de un IM agudo pero progresaron con insuficiencia cardíaca más tarde. Un grupo cada vez mayor de sobrevivientes de IMA podría alimentar una "epidemia" de insuficiencia cardíaca y muerte cardiovascular). Las ratas y los ratones con ligadura permanente de la arteria coronaria descendente anterior izquierda se utilizan generalmente como modelos animales de insuficiencia cardíaca posterior a IM en seres humanos.
El término "modificación", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier manipulación de la cadena principal del péptido (por ejemplo, secuencia de aminoácidos) o a las modificaciones postraduccionales (por ejemplo, glucosilación) de un polipéptido.
Las expresiones "enlazador peptídico" o "región bisagra" como se usa en el presente documento se refieren a un péptido que comprende uno o más aminoácidos, normalmente aproximadamente de 2-20 aminoácidos que se colocan entre otros péptidos en una secuencia. Los enlazadores peptídicos se conocen en la materia o se describen en el presente documento.
La expresión "composición farmacéutica", como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación que se encuentra en tal forma que permite que sea eficaz la actividad biológica de un principio activo contenido en la misma y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al que se le administre la formulación.
La expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, se refiere a un ingrediente en una composición farmacéutica, distinto del principio activo, que no es tóxico para un sujeto. Un vehículo farmacéuticamente aceptable incluye, pero sin limitación, cualquier vehículo sólido, líquido o gaseoso, incluyendo, por ejemplo, un tampón, excipiente, estabilizante o conservante.
Los términos "polipéptido" y "proteína", como se usan en el presente documento, se usan indistintamente, salvo que se especifique lo contrario, y de acuerdo con el significado convencional, significa una secuencia de aminoácidos. Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica, por ejemplo, pueden comprender una secuencia de proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína de longitud completa, y pueden incluir modificaciones postraduccionales del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares, así como otras modificaciones conocidas en la materia, tanto de origen natural como no naturales.
El término "sujeto", como se usa en el presente documento, se refiere a un animal. Normalmente, el animal es un mamífero. Un sujeto también se refiere a, por ejemplo, primates (por ejemplo, seres humanos), vacas, ovejas, cabras, caballos, perros, gatos, conejos, ratas, ratones, peces, aves y similares. En determinadas realizaciones, el sujeto es un primate. En otras realizaciones más, el sujeto es un ser humano. Un sujeto necesitado es un sujeto que padece una afección o enfermedad cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección o enfermedad cardíaca.
La expresión "agente terapéutico", como se usa en el presente documento, es un compuesto capaz de producir un efecto beneficioso y deseado.
Los términos "tratar", "tratando" o "tratamiento" de cualquier enfermedad o trastorno se refieren en una realización, a detener la progresión de la afección o enfermedad, o mejorar la enfermedad o trastorno (es decir, ralentizar o detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o al menos uno de los síntomas clínicos de la misma). En otra realización "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a aliviar o mejorar al menos un parámetro físico incluyendo los que pueden no ser discernibles por el paciente. En aún otra realización, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a modular la enfermedad o trastorno, ya sea físicamente, (por ejemplo, estabilización de un síntoma discernible), fisiológicamente, (por ejemplo, estabilización de un parámetro físico) o ambos. En aún otra realización, "tratar", "tratando" o "tratamiento" se refiere a prevenir o retrasar el inicio o desarrollo o avance de la enfermedad o trastorno. Como se usa en el presente documento, un sujeto se encuentra "con necesidad de" un tratamiento si dicho sujeto se beneficiaría biológicamente, médicamente o en su calidad de vida de tal tratamiento.
El término "vector", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula o entidad (por ejemplo, ácido nucleico, plásmido, bacteriófago o virus) usada para transferir información codificante de proteínas a una célula hospedadora. Determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de ácidos nucleicos a los que están enlazados operativamente. Dichos vectores se citan en el presente documento como "vectores de expresión". Un "vector de expresión" o "construcción de expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de control de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en una célula hospedadora particular.
3. Visión general
ELA juega un papel esencial para el desarrollo normal del sistema cardiovascular durante el desarrollo embrionario en ratones como lo hace en el pez cebra. En seres humanos adultos, las transcripciones de ELA se encuentran solo en el riñón y la próstata. El análisis de RT-PCR demostró directamente que ELA se expresa selectivamente en el riñón humano, así como en células madre pluripotentes. Por lo tanto, la expresión predominante de ELA en el riñón está en consonancia con el papel esencial de ELA en el desarrollo del sistema cardiovascular porque el riñón, junto con el corazón, funcionan para mantener el equilibrio de líquidos y la presión sanguínea. Por lo tanto, ELA puede actuar como una hormona paracrina o endocrina que regula el sistema circulatorio. Además de proteínas de fusión para usar en métodos de tratamiento de un sujeto que padece o un sujeto en riesgo de padecer una afección cardíaca, se pueden usar enseñanzas adicionales para promover la angiogénesis, relajar los vasos sanguíneos, regular la homeostasis de fluidos, mejorar el rendimiento cardíaco en un corazón infartado, mejorar la diuresis, mitigar el daño cardíaco inducido por IM, reducir la fibrosis en un corazón infartado, aumentar la proliferación de cardiomiocitos y reducir la apoptosis, todos los cuales son efectos deseables.
4. Descripción detallada de las realizaciones y enseñanzas generales
Por lo tanto, es deseable proporcionar o enseñar péptidos o proteínas de fusión para usar en métodos para tratar afecciones cardíacas mediante la administración de un péptido (por ejemplo, ELA-32, ELA-21 o Apelina-13) o una proteína de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21) a un sujeto que lo necesite (por ejemplo, SEQ ID NO: 1-5) en determinadas realizaciones como se expone a continuación.
ELA-32 (SEQ ID NO: 1)
• QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP
ELA-21 (SEQ ID NO: 2)
• SLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP
Apelina-13 (SEQ ID NO: 3)
• QRPRLSHKGPMPF
Fc-ELA-32 o "htPA-SS-Fc-ELA-32" (SEQ ID NO: 4)
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQDIDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD
TLM1SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGSGGGGSGGGGSQ
RPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP
Fc-ELA-21 o "htPA-SS-Fc-ELA-21" (SEQ ID NO: 5)
MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPSQDIDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV
VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE
MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKS R WQQGN VFSCS VMHEALHNH YTQKS LS LS PGKGGGGS GGGGS GGGG SL
RKHNCLQRRCMPLHSRVPFP
Más particularmente, las realizaciones se refieren a proteínas de fusión ELA de, composiciones y kits que las comprenden. Las proteínas de fusión exhiben propiedades mejoradas para usar como agentes terapéuticos, por ejemplo, en el tratamiento de afecciones cardíacas. Además, determinadas realizaciones se refieren a polinucleótidos que codifican dichas proteínas de fusión, vectores y células hospedadoras que comprenden dichos polinucleótidos. Las realizaciones se refieren además a métodos para producir las proteínas de fusión descritas en el presente documento así como a métodos para usarlas en el tratamiento de enfermedades.
A. Proteínas de fusión para usar en Métodos de tratamiento
a. Afecciones cardíacas
En determinadas realizaciones y enseñanzas generales, se proporcionan péptidos y proteínas de fusión para usar en métodos para tratar afecciones cardíacas en un sujeto o en un sujeto (preferentemente un mamífero tal como un ser humano) que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca mediante la administración de un péptido ELA (ELA-32, ELA-21), un péptido de apelina (por ejemplo, Apelina-13) o una proteína de fusión ELA (por ejemplo, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) como se describe en el presente documento. La afección cardíaca o factor de riesgo para la afección cardíaca es opcionalmente infarto de miocardio, apoptosis de cardiomiocitos inducida por infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca inducida por infarto de miocardio o fibrosis inducida por infarto de miocardio.
En determinadas realizaciones o enseñanzas generales, se identifica un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca. Se miden cantidades de un péptido de SEQ ID No : 1 (ELA-32), o un péptido de SEQ ID NO: 2 (ELA-21), o un péptido de SEQ ID NO: 3 (Apelina-13), en el torrente circulatorio de los sujetos que padecen una afección cardíaca o que tienen un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca. A continuación, se miden cantidades de un péptido de SEQ ID NO: 1, o un péptido de SEQ ID NO: 2, o un péptido de SEQ ID NO: 3, en el torrente circulatorio de un sujeto normal de control. Ambas cantidades del péptido de SEQ ID NO: 1, o SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 3, en el sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca se comparan con los del sujeto normal de control. Si se determina que la cantidad de péptido puede reducirse significativamente con respecto a la del sujeto de control, entonces se trata con (a) un péptido de SEQ ID NO: 1, un péptido de SEQ ID NO: 2, o un péptido de SEQ ID NO: 3, un fragmento, variante o derivado del mismo que es al menos un 95 % idéntico a los péptidos de (a), o (b) una composición que comprende una proteína de fusión ELA de SEQ ID NO: 5, de SEQ ID NO: 6, y la proteína de fusión Elabela-Apelina o un fragmento, o variante, o derivado de la misma que es al menos un 95 % idéntica a los péptidos de (b).
En otras realizaciones o enseñanzas generales, un péptido ELA o proteína de fusión descritos en el presente documento mejora el rendimiento cardíaco en sujetos con insuficiencia cardíaca inducida por IM. Como se observa en el ejemplo 8, la ligadura de arterias coronarias (LAC) es un procedimiento muy utilizado para crear un modelo de ratón de infarto de miocardio (MI) agudo y la consiguiente insuficiencia cardíaca (IC). Se infundió el péptido ELA. Se realizó una ecocardiografía de alta frecuencia para medir la geometría y la función del corazón antes y después del IM. Como cabía esperar, el IM dio como resultado dilatación del ventrículo izquierdo y disfunción contráctil, distintivos en el desarrollo de insuficiencia cardíaca congestiva después de IM, que se indicaron por un aumento del tamaño de la cámara del ventrículo izquierdo (LVDs (por sus siglas en inglés) y LVDd (por sus siglas en inglés)) y una disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF, por sus siglas en inglés) y un acortamiento fraccional (véanse la tabla 1 y la figura 7A-figura 7C). La administración de ELA mitiga el desarrollo de dilatación del ventrículo izquierdo y la disfunción contráctil (véanse la tabla 1 y la figura 7A-figura 7C), lo que sugiere una nueva estrategia cardioprotectora en ratones con insuficiencia cardíaca posterior al IM.
Además, la administración de un péptido ELA o proteína de fusión como se describe o enseña en el presente documento puede usarse para promover la angiogénesis, dilatar los vasos sanguíneos, regular la homeostasis de fluidos, mejorar la diuresis, mitigar el daño cardíaco inducido por IM, reducir la fibrosis en un corazón infartado, aumentar la proliferación de cardiomiocitos y reducir la apoptosis, todos los cuales son efectos deseables.
Por ejemplo, en otras realizaciones/enseñanzas, un péptido ELA (por ejemplo, ELA-32, ELA-21, Apelina-13) o proteína de fusión (Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) descrita en el presente documento mejora la diuresis. Durante la insuficiencia cardíaca, la disminución de la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo (VI) da como resultado una reducción del gasto cardíaco, el volumen sistólico y el volumen sanguíneo intraarterial provocando una activación compensatoria del sistema simpatoadrenal y la liberación de una cascada de neurohormonas. Los resultados generales es la retención de líquidos y el aumento de volumen, lo que a su vez sobrecarga el corazón y constituye un círculo vicioso de disfunción e insuficiencia cardíaca y renal. La vasopresina y la aldosterona son dos hormonas principales que aumentan la retención de agua y sodio durante la insuficiencia cardíaca. Se están desarrollando nuevos diuréticos de antivasopresina y antialdosterona para el tratamiento de la insuficiencia cardíaca mediante la reducción de la sobrecarga de líquidos. ELA se expresa específicamente en el riñón y puede suprimir la producción de cAMP, una molécula de señalización celular, mientras que la vasopresina aumenta el cAMP.
La aldosterona es una hormona producida en la glándula suprarrenal y funciona para provocar la reabsorción renal de sodio y la retención de agua en respuesta a la estimulación de la angiotensina II (Ang II). La antialdosterona es un enfoque terapéutico para la insuficiencia cardíaca. Dado que se encuentra que la activación de la recepción de apelina antagoniza los efectos de Ang II, ELA afecta a la síntesis de aldosterona mediada por Ang II. Células HAC15 humanas, una línea de carcinoma cortical suprarrenal. Como se muestra en el ejemplo 11, el tratamiento con ELA, apelina-13 y angiotensina II solos o en combinación, suprimió significativamente la expresión génica de la aldosterona sintasa inducida por Ang II. Sin quedar limitados a la teoría, ELA puede ejercer actividad anticardíaca mediante la reducción de los niveles de aldosterona.
En determinadas realizaciones/enseñanzas, las proteínas de fusión ELA-Fc (Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) mitiga el daño cardíaco inducido por IM. Como la mayoría de péptidos cortos, es probable que ELA tenga una semivida corta en circulación debido a la absorción tisular, degradación y eliminación renal. La fusión de proteínas es un método para prolongar la semivida de un péptido o proteína. Por lo tanto, se administran proteínas de fusión como se describe en el Ejemplo 8. La proteína de fusión Fc-ELA-32 tiene efectos cardioprotectores en la insuficiencia cardíaca causada por IM. Un corazón debilitado inducido por LAC en animales de laboratorio exhibe alteraciones en la estructura morfológica y secuelas bioquímicas como se observa en seres humanos con insuficiencia cardíaca posterior al IM, incluyendo muerte de cardiomiocitos, formación del tejido cicatricial y remodelación ventricular. El rendimiento cardíaco y las respuestas tisulares cambian durante el curso de la remodelación en la fase aguda y de remodelación.
ELA reduce la presión telediastólica del ventrículo izquierdo (PTDVI), lo que indica una mejora en la distensibilidad del ventrículo izquierdo y el rendimiento global. Después de un infarto de miocardio (IM), de hecho, a elevación de PTDVI se asoció con un mayor tamaño del infarto y un mayor volumen circulatorio. En determinadas realizaciones, la administración de Fc-ELA-32 disminuyó la PTDVI, lo que indica una mejora del corazón disfuncional (véase el ejemplo 12). ELA también reduce la fibrosis cardíaca como se describe adicionalmente en el ejemplo 13. Una característica común del corazón debilitado es la fibrosis miocárdica. La fibrosis miocárdica se asocia con un empeoramiento de la función sistólica ventricular, remodelación cardíaca y aumento de la rigidez ventricular en animales y pacientes. En determinadas realizaciones, la fracción de volumen de colágeno (FVC) está significativamente disminuida en sujetos tratados con Fc-ELA-32, lo que indica que Fc-ELA suprime la fibrosis del corazón infartado.
En determinadas realizaciones, ELA reduce la apoptosis. Como se describe en el ejemplo 14, los cardiomiocitos tratados con Fc-ELA-32 pueden aumentar la proliferación de cardiomiocitos cerca de la región del infarto y reducir la apoptosis. La apoptosis es un mecanismo principal de muerte celular causada por isquemia durante el infarto de miocardio. Un sujeto tratado con ELA está protegido contra la apoptosis de cardiomiocitos inducida por IM.
b. Diabetes (a modo de antecedentes)
También se enseñan en el presente documento métodos para tratar la diabetes. El sujeto que padece diabetes o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca debido a la diabetes se trata con la administración de una proteína de fusión con péptidos ELA (Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) como se describe en el presente documento. El péptido e La o la proteína de fusión tras la administración pueden reducir los niveles de glucosa y mejorar la sensibilidad a la insulina. Por lo tanto, se puede aumentar el volumen sistólico del corazón en sujetos obesos sin insuficiencia cardíaca.
B. Proteínas de fusión
A continuación se proporcionan y se enseñan proteínas de fusión basadas en Fc que están compuestas por un dominio Fc de inmunoglobina que está directamente unido al péptido ELA (es decir, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21).
La razón principal de la fusión de una fracción de unión con Fc es la extensión de la semivida. Los agentes terapéuticos (por ejemplo, fármacos) varían en cuanto al tiempo que se tarda en eliminarlos del cuerpo. Algunos se metabolizan con bastante rapidez, mientras que otros pueden tardar bastante tiempo en eliminarse. Esto se cuantifica con el uso del término "semivida". La semivida de un agente terapéutico dado es el tiempo que tarda el cuerpo en metabolizar o excretar la mitad de la dosis. Cuando el paciente toma un fármaco con regularidad, existe un proceso continuo de absorción del fármaco en forma de cada dosis del fármaco y, simultáneamente, un proceso continuo de eliminación del fármaco con el metabolismo y la eliminación del fármaco. Finalmente, ocurre un equilibrio o un estado estacionario. Generalmente, se necesitan entre 5 y 6 semividas para que un fármaco alcance el estado estable. Los medicamentos con semividas cortas alcanzan un estado estable relativamente rápido, mientras que aquellos con semividas largas tardan mucho en alcanzar el estado estable. Muchas proteínas y péptidos biológicamente activos tienen semividas séricas muy cortas debido a la rápida eliminación renal, que limita su exposición en el tejido diana y, en consecuencia, sus efectos farmacológicos. El dominio Fc prolonga la semivida sérica de los anticuerpos y las proteínas de fusión de Fc, debido a la unión a los receptores Fc dependiente del pH, que salva a la proteína de ser degradada en endosomas. Como beneficio adicional, la porción Fc de las proteínas de fusión de Fc permite una expresión más fácil y una purificación por afinidad con proteína A, que confiere ventajas prácticas en la producción de anticuerpos y terapias de fusión de Fc.
La presencia del dominio Fc aumenta notablemente la semivida plasmática, que prolonga la actividad terapéutica, así como la eliminación renal más lenta para moléculas de mayor tamaño. En determinadas realizaciones, desde una perspectiva biológica, el dominio Fc se pliega de forma independiente y puede mejorar la solubilidad y estabilidad de la molécula asociada tanto in vitro e in vivo, mientras que desde un punto de vista tecnológico, la región Fc permite una purificación fácil y rentable mediante cromatografía de afinidad de proteína-G/A durante la fabricación. Por lo tanto, un aumento de la avidez y con ella de la potencia, de un compañero fusionado aislado también es una ventaja significativa de las proteínas de fusión de Fc.
Las fusiones de Fc suelen ser homodímeros en los que un dominio Fc de un anticuerpo está unido covalentemente a otra proteína (es decir, una proteína Elabela). El compañero de fusión generalmente está unido directamente a la región bisagra flexible, cuya longitud y secuencia varía entre diferentes subclases de IgG.
Se pueden realizar varios cambios específicos en una proteína de fusión para mejorar la eficacia. Por ejemplo, las fusiones de Fc también se pueden polimerizar a través de puentes disulfuro genomanipulados localizados en la unión CH2-CH3 y extensiones carboxiterminales de 18 aminoácidos conocidas como piezas de cola. Las modificaciones en el dominio Fc generalmente pueden mejorar la función terapéutica, y las propiedades de unión sutiles también hacen una contribución dominante a la actividad final del compuesto en el entorno clínico. En determinadas enseñanzas, la identificación de las propiedades de unión óptimas de la proteína fusionada para su receptor pretendido puede resultar un paso esencial en el desarrollo del fármaco para una actividad clínica deseada. Además, si la proteína fusionada conserva o no su actividad biológica cuando se une a un dominio Fc depende de muchos factores que deben determinarse para cada molécula. Para mejorar las posibilidades de obtener una proteína fusionada estable, para algunas proteínas, puede ser necesario incluir una proteína "chaperona" cuya presencia estabilice la proteína deseada. En otras realizaciones, es importante que la molécula diana pueda unirse con suficiente afinidad a su proteína afín cuando se sitúa en la arquitectura de fusión de Fc homodimérica. Una forma de superar esto es mediante la genomanipulación de múltiples especificidades y/o avidez en la construcción de fusión de Fc. El desarrollo de plataformas Fc heterodiméricas basadas en heterodímeros de CH3 de dominios genomanipulados por intercambio de cadenas (SEED, por sus siglas en inglés) compuestos de segmentos alternos de secuencias de CH3 de IgA e IgG humanas puede permitir el desarrollo de múltiples especificidades dentro de la plataforma de fusión de Fc homodimérica existente.
Aparte de la fusión genética al dominio Fc de IgG, se pueden emplear varias estrategias de extensión de la semivida de las proteínas, incluida la conjugación química. La fusión de Fc aumenta la semivida de la proteína mediante el aumento del tamaño (por ejemplo, radio hidrodinámico) de la proteína modificada y, a su vez, la reducción de la eliminación renal.
En una realización particular, las proteínas de fusión de Fc comprenden un péptido ELA como se describe en el presente documento para extender la semivida de ELA. La proteína de fusión, Fc-ELA-32 de SEQ ID NO: 4, comprende el péptido ELA de 32 aminoácidos. A efectos de antecedentes, la proteína de fusión, Fc-ELA-21 de SEQ ID NO: 5, comprende el péptido ELA de 21 aminoácidos. Además, la proteína de fusión Elabela-Apelina comprende un péptido Elabela y un péptido Apelina.
En determinadas realizaciones o enseñanzas, la molécula de inmunoglobulina y los péptidos ELA-32 y ELA-21 son humanos y se fusionan con la molécula de inmunoglobulina a través de un enlazador de péptido flexible corto o región de bisagra en sus aminoácidos aminoterminales al aminoácido carboxiterminal de una de las cadenas pesadas de inmunoglobulinas. En una realización o enseñanza, cada uno de los péptidos ELA-32 o ELA-21 se fusiona con la molécula de inmunoglobulina a través de un enlazador peptídico o región bisagra que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica. En otras realizaciones o enseñanzas, el enlazador peptídico o región bisagra comprende al menos 5 aminoácidos. En una realización o enseñanza particular, el enlazador peptídico comprende al menos 10 aminoácidos. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, un péptido enlazador o región bisagra de esta longitud puede proporcionar la flexibilidad para la unión óptima de los péptidos ELA al receptor APJ.
La "región bisagra", "enlazador", o "fracción enlazadora", tal como se usa indistintamente en el presente documento, se refiere a un grupo orgánico peptidilo o no peptidilo biológicamente aceptable que está unido covalentemente a un resto de aminoácido de una cadena polipeptídica (por ejemplo, dominio Fc) contenido en la composición de la invención, cuya fracción enlazadora se une o conjuga covalentemente la cadena polipeptídica con otro péptido o cadena polipeptídica en la molécula, o con una fracción terapéutica. La presencia de cualquier región bisagra en las inmunoglobulinas en determinadas realizaciones puede ser opcional. Cuando están presentes, la estructura química no es esencial, ya que sirve principalmente como espaciador para colocar, unir, conectar u optimizar la presentación o posición de una fracción funcional en relación con una o más fracciones funcionales de una molécula de la inmunoglobulina de la invención. La presencia de una región bisagra puede ser útil para optimizar la actividad farmacológica de algunas realizaciones de la inmunoglobulina (incluyendo anticuerpos y fragmentos de anticuerpos). La región bisagra está formada preferentemente por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos. Si está presente, puede ser independientemente igual o diferente de cualquier otra región bisagra, o regiones bisagra, que puede estar presente en la inmunoglobulina de la invención.
En determinadas realizaciones o enseñanzas, la región bisagra si está presente (ya sea dentro de la secuencia de aminoácidos primaria de la inmunoglobulina, o como un enlazador para unir una fracción terapéutica o una fracción que extiende la semivida a la inmunoglobulina de la invención), puede estar formada por aminoácidos unidos entre sí mediante enlaces peptídicos y formada en longitud, preferentemente, por de 1 hasta aproximadamente 40 restos de aminoácidos, más preferentemente, de 1 hasta aproximadamente 20 restos de aminoácidos, y lo más preferentemente de 1 a aproximadamente 10 restos de aminoácidos. Preferentemente, pero no necesariamente, los restos de aminoácidos en el enlazador son cisteína, glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y/o serina. Incluso más preferentemente, un enlazador peptidil puede estar formado por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedancia estérica, tales como glicina, serina y alanina, unidos mediante un enlace peptídico. En otras realizaciones, los 1 a 40 aminoácidos de la fracción enlazadora peptidil se seleccionan de glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina y lisina. Preferentemente, un enlazador puede estar formado por una mayoría de aminoácidos que no presentan impedancia estérica, tales como glicina y alanina. Por lo tanto, los enlazadores preferidos incluyen poliglicinas, poliserinas y polialaninas, o combinaciones de cualquiera de estos.
En una realización o enseñanza específica, el enlazador peptídico o región bisagra comprende 15 aminoácidos. En una realización particular, el enlazador peptídico o región bisagra comprende la secuencia SGGGGS (SEQ ID NO: 6). Un experto en la materia tiene una variedad para elegir incluyendo, pero sin limitación, lo siguiente según lo dispuesto por http://parts.igem.org/Protein_domains/Linker.
Ejemplos de enlazadores
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La fusión de los péptidos ELA-32 y ELA-21 en una molécula de inmunoglobulina proporciona propiedades farmacocinéticas favorables, incluyendo una larga semivida en suero, en comparación con ELA-32 o ELA-21 libre (sin fusionar). Además, la presencia de una molécula de inmunoglobulina también permite la purificación simple de proteínas de fusión mediante, por ejemplo, cromatografía de afinidad. La fusión a una molécula de inmunoglobulina, es decir, un tipo de molécula de origen natural, también puede minimizar la toxicidad de la proteína de fusión mediante la formación de anticuerpos antifármaco.
Como se muestra en los ejemplos, la proteína de fusión de determinadas realizaciones activa selectivamente el receptor APJ. Por lo tanto, en un aspecto o divulgación, determinadas realizaciones/enseñanzas proporcionan una proteína de fusión que comprende una molécula de inmunoglobulina y un péptido ELA-32 o péptido ELA-21, para usar en la activación selectiva de APJ y protección de cardiomiocitos in vitro o in vivo. La tinción inmunofluorescente en preparacioens de tejido cardíaco proporciona un método para examinar las respuestas de los cardiomiocitos al tratamiento con ELA. Las células HEK293 que expresan APJ se ponen en contacto con la proteína de fusión in vitro. En una realización o enseñanza, el uso es in vitro y la proteína de fusión se usa en una concentración de aproximadamente 0,2 M o menos. En otra realización o enseñanza, el uso es in vivo y la proteína de fusión se usa en una dosis de aproximadamente 300 pg/kg de peso corporal o menos, (en donde "peso corporal" se refiere al peso corporal del individuo al que se administra la proteína de fusión). Los cardiomiocitos que responden al tratamiento con Fc-ELA-32 proliferan en una región infartada. (Véase, por ejemplo, el ejemplo 14).
C. Métodos de producción de proteínas de fusión
Las estrategias para producir proteínas de fusión que se pueden usar de acuerdo con la invención o a efectos de antecedentes incluyen: (i) fusión genética del péptido o proteína farmacológicamente activo a una proteína o dominio de proteína de semivida larga de origen natural (por ejemplo, fusión de Fc, fusión de transferrina [Tf] o fusión de albúmina), (ii) fusión genética del péptido o proteína farmacológicamente activos a un polipéptido inerte, que también se conoce como PEG recombinante o "PEGr", o un polímero de homoaminoácidos (HAP (por sus siglas en inglés); HAPilación), un polímero de prolina-alanina-serina (PAS; PASilación), o un péptido similar a elastina (ELP (por sus siglas en inglés); ELPilación). Aumento del radio hidrodinámico mediante la conjugación química del péptido o proteína farmacológicamente activo con fracciones químicas repetidas, por ejemplo, PEG (PEGilación) o el ácido hialurónico son otras opciones. Aumento significativo de la carga negativa al fusionar el péptido o proteína farmacológicamente activos mediante polisialilación o, como alternativa, fusionar un péptido altamente sialilado de carga negativa (por ejemplo, el péptido carboxiterminal (PCT; de la cadena p de la gonadotropina coriónica (GC)), conocido por prolongar la semivida de proteínas naturales tales como la subunidad p de GC humana, al fármaco biológico candidato. Unión no covalente, mediante la unión de un péptido o dominio de unión a proteínas a la proteína bioactiva, a proteínas de semivida normalmente larga tales como HSA, IgG humana, o posiblemente transferrina es una opción. Conjugación química de péptidos o moléculas pequeñas con proteínas de semivida larga tales como IgG humanas, fracciones Fc, o HAS es una opción adicional.
Determinadas realizaciones proporcionan métodos para preparar estas proteínas de fusión de péptidos ELA usando fusión de Fc. Las proteínas de fusión se pueden producir de diversas formas. Dado que muchos de los compuestos serán péptidos, o incluirán un péptido, los métodos para sintetizar péptidos son de particular relevancia en el presente documento. Por ejemplo, se pueden utilizar materias de síntesis en fase sólida. Las técnicas adecuadas son bien conocidas en la materia e incluyen las descritas en Merrifield, en Chem. Polypeptides, pág. 335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds. 1973); Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1963); Davis et al., Biochem. Intl.
10:394-414 (1985); Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1969); la patente de Estados Unidos n.° 3.941.763; Finn et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, págs. 105-253 (1976); y Erickson et al., The Proteins, 3a ed., vol. 2, págs. 257-527 (1976). La síntesis en fase sólida es la técnica preferida para producir péptidos individuales, ya que es el método más rentable para producir péptidos pequeños.
Los péptidos también se pueden preparar en células hospedadoras transformadas usando técnicas de ADN recombinante. Para ello, se prepara una molécula de ADN recombinante que codifica el péptido. Los métodos para preparar dichas moléculas de ADN y/o ARN son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las secuencias que codifican los péptidos podrían eliminarse del ADN utilizando enzimas de restricción adecuadas. Las secuencias en cuestión se pueden crear usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con la inclusión de sitios de restricción útiles para la clonación posterior. Como alternativa, la molécula de ADN/ARN podría sintetizarse usando materias de síntesis química, tales como el método de la fosforamidita. Además, se podría utilizar una combinación de estas materias.
Determinadas realizaciones también incluyen un vector que codifica las proteínas de fusión en un hospedador adecuado. El vector comprende la molécula de ADN que codifica los péptidos unidos operativamente a secuencias de control de expresión adecuadas. Los métodos para influir en esta unión operativa, ya sea antes o después de que la molécula de ADN que codifica el péptido se inserte en el vector, son bien conocidos. Las secuencias de control de expresión incluyen promotores, activadores, potenciadores, operadores, sitios de unión a ribosomas, señales de inicio, señales de parada, señales de protección con caperuza, señales de poliadenilación y otras señales implicadas en el control de la transcripción o la traducción.
El vector resultante que comprende la molécula de ADN que codifica el péptido se usa para transformar un hospedador adecuado. Esta transformación puede realizarse usando métodos bien conocidos en la materia.
Puede usarse cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas en la práctica de estas realizaciones. La selección de un hospedador determinado depende de una serie de factores reconocidos por la materia. Estos factores incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad para la célula hospedadora de los péptidos codificados por la molécula de ADN, tasa de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bioseguridad y costes. Se debe lograr un equilibrio de estos factores con el entendimiento de que no todos los hospedadores pueden ser igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN particular.
A continuación, el hospedador transformado se cultiva en condiciones para que se expresen los péptidos deseados. Dichas condiciones son bien conocidas en la materia. Finalmente, los péptidos se purifican a partir del cultivo de fermentación o a partir de las células hospedadoras en las que se expresan. Estos métodos de purificación también son bien conocidos en la materia. Las proteínas de fusión preparadas como se describe en el presente documento se pueden purificar mediante materias conocidas en la materia tales como cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel, cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaños y similares. Las condiciones reales usadas para purificar una proteína dependerán, en parte, de factores tales como la carga neta, hidrofobicidad, hidrofilia, etc. y serán evidentes para los expertos en la materia. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede usar un anticuerpo, ligando, receptor o antígeno al que se une la proteína de fusión. Por ejemplo, para la purificación por cromatografía de afinidad de proteínas de fusión en determinadas realizaciones, puede usarse una matriz con proteína A o proteína G. Pueden usarse cromatografía de afinidad a proteína A o G secuencial y cromatografía de exclusión por tamaño para aislar una proteína de fusión esencialmente como se describe en el ejemplo 1.
En una realización preferida, se proporciona un método para producir una proteína de fusión en determinadas realizaciones, en donde el método comprende cultivar una célula hospedadora que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de fusión, como se proporciona en el presente documento, en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión y recuperar la proteína de fusión de la célula hospedadora (o medio de cultivo de la célula hospedadora). En las proteínas de fusión de determinadas realizaciones/enseñanzas, los componentes (molécula de inmunoglobulina y péptido ELA-32 o péptido ELA-21) se fusionan genéticamente entre sí. Por ejemplo, desde el extremo N al extremo C, un péptido señal de secreción de activador de plasminógeno tisular (tPA, por sus siglas en inglés) humano ("htPA-ss", por sus siglas en inglés) se fusiona con un dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina. A continuación, la porción de htPA-ss-Fc se fusiona con el péptido ELA-21 o un fragmento, o variante, o derivado del mismo que es al menos un 95 % idéntico a los péptidos para llegar a un htPA-ss-Fc-ELA-32 que tiene el SEQ ID NO: 4 o proteína de fusión o proteína de fusión htPA-ss-Fc-ELA-21 de SEQ ID NO: 5. En otras realizaciones/enseñanzas, las proteínas de fusión pueden diseñarse de manera que sus componentes se fusionen directamente entre sí o indirectamente a través de una secuencia enlazadora. Como se ha analizado anteriormente, la composición y la longitud del enlazador se pueden determinar de acuerdo con métodos bien conocidos en la materia y se puede analizar su eficacia. También se pueden incluir secuencias adicionales para incorporar un sitio de escisión para separar los componentes individuales de la proteína de fusión si se desea, por ejemplo, una secuencia de reconocimiento de endopeptidasa. En cada uno de los casos anteriores, Fc es preferentemente la región Fc de la cadena pesada de inmunoglobulina IgG1 humana o un fragmento, derivado o dímero biológicamente activo de la misma.
Las fusiones de Fc se encuentran en el extremo N. Sorprendentemente se ha descubierto que los péptidos en los que una fracción Fc está ligada al extremo N son más bioactivos que las otras posibilidades, por tanto, la fusión que tiene un dominio Fc en el extremo N es apropiada. Cuando la cadena Fc se fusiona en el extremo N del péptido o enlazador, dicha fusión se producirá generalmente en el extremo C de la cadena Fc y viceversa.
Se puede usar cualquier especie animal de inmunoglobulina en realizaciones para obtener la región Fc. Las inmunoglobulinas no limitantes útiles en determinadas realizaciones pueden ser de origen murino, primate o humano. Si la proteína de fusión está destinada a uso humano, se puede usar una forma quimérica de inmunoglobulina en donde las regiones constantes de la inmunoglobulina son de una humana.
La pureza de la proteína de fusión se puede determinar mediante cualquiera de varios métodos analíticos bien conocidos que incluyen electroforesis en gel, cromatografía líquida de alta presión y similares. Por ejemplo, se demostró que las proteínas de fusión expresadas como se describe en los ejemplos estaban inalteradas y ensambladas apropiadamente, como se demostró mediante SDS-PAGE reductora y no reductora.
D. Fragmentos, Variantes y derivados de las mismas
El experto en la materia apreciará fácilmente que las realizaciones/enseñanzas no se limitan a las secuencias representadas en el presente documento, sino que también incluyen variantes de ELA. Dichas variantes son bien conocidas en la materia. Pueden contener eliminaciones, sustituciones o adiciones de uno o más aminoácidos en las secuencias de aminoácidos representadas anteriormente mientras se mantiene la actividad biológica de ELA de origen natural.
Un fragmento, variante o derivado peptídico puede diferir de un péptido natural en una o más sustituciones, eliminaciones, adiciones y/o inserciones. Dichos fragmentos o variantes pueden ser de origen natural o pueden generarse de manera sintética, por ejemplo, mediante la modificación de una o más de las secuencias peptídicas anteriores utilizadas en los métodos de determinadas realizaciones y la evaluación de sus efectos utilizando cualquiera de varias técnicas bien conocidas en la materia.
Como se usa en el presente documento, un fragmento o variante peptídica tiene secuencias de aminoácidos que son al menos un 95 %, un 97 %, un 98 % o un 99 % o más homólogas con los péptidos ELA. En determinadas realizaciones, un fragmento o variante contendrá sustituciones conservadoras. Una "sustitución conservadora" es una en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la materia de la química peptídica esperaría que la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido no cambien sustancialmente. Se pueden realizar modificaciones en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de determinadas realizaciones y aún obtener una molécula funcional que codifica un polipéptido variante o derivado con características deseables, por ejemplo, con capacidad para modular, inducir y/o mantener la pluripotencia como se describe en el presente documento.
En un péptido ELA o proteína de fusión enseñado o proporcionado en el presente documento, los expertos en la materia conocen sustituciones conservadoras adecuadas de aminoácidos y, en general, pueden realizarse sin alterar la actividad biológica de una molécula resultante. Los expertos en la materia reconocen que, en general, las sustituciones de aminoácidos individuales en regiones no esenciales de un polipéptido no alteran sustancialmente la actividad biológica (véase, por ejemplo, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4a edición, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., pág. 224). Un experto en la materia podría determinar qué restos de aminoácidos se pueden sustituir, insertar o eliminar sin suprimir la actividad biológica. Se puede encontrar ayuda usando programas informáticos bien conocidos en la materia, tales como el programa informático DNASTAR™. Un cambio de aminoácido conservador implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: aminoácidos ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) y polares sin carga (glicina, asparagina, glutamina, cistina, serina, treonina, tirosina). La fenilalanina, el triptófano y la tirosina a veces se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos.
Los fragmentos, variantes o derivados de los péptidos de determinadas realizaciones incluyen formas glucosiladas, conjugados agregantes con otras moléculas y conjugados covalentes con fracciones químicas no relacionados (por ejemplo, moléculas pegiladas). Se pueden preparar variantes covalentes mediante la unión de grupos funcionales a grupos que se encuentran en la cadena de aminoácidos o en el resto amino o carboxiterminal, como se conoce en la materia. Las variantes también incluyen variantes alélicas, variantes de especies y mutantes. Los truncamientos o eliminaciones de regiones que cambian la actividad funcional de las proteínas también son variantes.
Además, las variantes, análogos o derivados de la porción Fc pueden construirse mediante, por ejemplo, la realización de varias sustituciones de restos o secuencias. Los polipéptidos variantes (o análogos) incluyen variantes de inserción, en donde uno o más restos de aminoácidos complementan una secuencia de aminoácidos de Fc. Las inserciones pueden estar ubicadas en uno o en ambos extremos de la proteína, o pueden estar ubicadas dentro de regiones internas de la secuencia de aminoácidos de Fc. Las variantes de inserción con restos adicionales en uno o ambos extremos pueden incluir, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas que incluyen etiquetas o marcadores de aminoácidos. Por ejemplo, la molécula Fc puede contener opcionalmente una Met aminoterminal, especialmente cuando la molécula se expresa como una proteína recombinante en una célula bacteriana tal como E. coli.
En variantes de eliminación de Fc, se eliminan uno o más restos de aminoácidos en un polipéptido Fc. Se pueden realizar eliminaciones en uno o ambos extremos del polipéptido Fc, o con la eliminación de uno o más restos dentro de la secuencia de aminoácidos de Fc. Las variantes de eliminación, por lo tanto, incluyen todos los fragmentos de una secuencia de polipéptido Fc.
En variantes de sustitución de Fc, uno o más restos de aminoácidos de un polipéptido Fc se eliminan y se reemplazan con restos alternativos. En un aspecto, las sustituciones son de naturaleza conservadora, sin embargo, determinadas realizaciones abarcan sustituciones que también son no conservadoras.
Por ejemplo, se pueden eliminar o reemplazar restos de cisteína con otros aminoácidos para evitar la formación de algunas o todas las reticulaciones de disulfuro de las secuencias Fc. Se puede eliminar cada uno de estos restos de cisteína o sustituir uno o más de dichos restos de cisteína con otros aminoácidos, tales como Ala o Ser. Como otro ejemplo, también se pueden realizar modificaciones para introducir sustituciones de aminoácidos para (1) extirpar el sitio de unión a receptores de Fc; (2) extirpar el sitio de unión del complemento (Clq); y/o (3) extirpar el sitio de citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). Dichos sitios son conocidos en la materia y cualquier sustitución conocida está dentro del alcance de Fc como se usa en el presente documento. Por ejemplo, véase Molecular Immunology, Vol. 29, N.° 5, 633-639 (1992) con respecto a los sitios de ADCC en IgG1.
Análogamente, uno o más restos de tirosina también se pueden reemplazar por restos de fenilalanina. Además, también se contemplan otras variantes de inserciones, eliminaciones (por ejemplo, de 1 a 25 aminoácidos) y/o sustituciones de aminoácidos y están dentro del alcance de las presentes realizaciones. Generalmente se preferirán las sustituciones de aminoácidos conservadoras. Además, las alteraciones pueden ser en forma de aminoácidos alterados, tales como peptidomiméticos o D-aminoácidos.
E. Vectores
Se pueden obtener polinucleótidos de determinadas enseñanzas, por ejemplo, mediante síntesis peptídica en estado sólido o usando producción recombinante. Para la producción recombinante de uno o más polinucleótidos que codifican la proteína de fusión, por ejemplo, como se describe anteriormente, se aísla e inserta en uno o más vectores para la clonación y/o expresión adicional en una célula hospedadora. Este polinucleótido puede aislarse y secuenciarse usando procedimientos convencionales. Todos los fragmentos de ADN se ensamblaron mediante ligación de ADN y clonación por infusión en el vector pEntra.
Muchos vectores son conocidos en la materia. Los componentes del vector pueden incluir uno o más de los siguientes: una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores selectivos (que pueden, por ejemplo, conferir resistencia a antibióticos u otros medicamentos, complementar las deficiencias auxotróficas o suministrar nutrientes esenciales no disponibles en los medios), un elemento potenciador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción, todos de los cuales son bien conocidos en la materia.
Un "vector de expresión" o "construcción de expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de ADN recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de control de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante unida operativamente en una célula hospedadora particular. Un vector de expresión puede incluir, pero sin limitación, secuencias que afectan o controlan la transcripción, la traducción y, en caso de que haya presencia de intrones, afectan al corte y empalme de ARN de una región codificante unida operativamente a las mismas.
Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, un sitio de unión a ribosomas y posiblemente otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación. Una secuencia de péptido señal de secreción también puede, opcionalmente, estar codificado por el vector de expresión, unido operativamente a la secuencia codificante de interés, de modo que el polipéptido expresado pueda ser secretado por la célula hospedadora recombinante, para un aislamiento más fácil del polipéptido de interés a partir de la célula, si se desea. Dichas técnicas son bien conocidas en la materia. (Por ejemplo, Goodey, Andrew R.; et al., Peptide and DNA sequences, la patente de Estados Unidos n.° 5.302.697; Weiner et al., Compositions and methods for protein secretion, la patente de Estados Unidos n.° 6.022.952 y la patente de Estados Unidos n.° 6.335.178; Uemura et al., Protein expression vector and utilization thereof, la patente de Estados Unidos n.° 7.029.909; Ruben et al., 27 human secreted proteins, US 2003/0104400 A1.
Una proteína "secretada" se refiere a aquellas proteínas capaces de dirigirse al RE, a vesículas secretoras, o al espacio extracelular como resultado de una secuencia del péptido señal de secreción, así como a aquellas proteínas liberadas en el espacio extracelular sin contener necesariamente una secuencia señal. Si la proteína secretada se libera en el espacio extracelular, la proteína secretada puede sufrir un procesamiento extracelular para producir una proteína "madura". La liberación al espacio extracelular puede ocurrir mediante muchos mecanismos, incluyendo exocitosis y escisión proteolítica.
En una realización, se proporciona un vector, preferentemente un vector de expresión, que comprende uno o más de los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión de determinadas realizaciones. En otras realizaciones, el vector se introduce en células de mamíferos, por ejemplo, células HEK293 para producir la proteína de fusión en el sobrenadante para la purificación mediante cromatografía de afinidad con proteína A. La proteína de fusión resultante (es decir, Fc-ELA-32) se usó para el tratamiento.
Los métodos son bien conocidos por los expertos en la materia y pueden usarse para construir vectores de expresión lentivíricos que contienen la secuencia codificante con señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. En determinadas realizaciones/enseñanzas, y como se describe en el ejemplo 1, los lentivirus se producen en células HEK293T con transfección conjunta de vectores de empaquetamiento y se utilizan para infectar las células HEK293 para establecer líneas celulares Fc-ELA-32 o Fc-Ela-21 que secretan permanentemente la proteína de fusión en el medio de cultivo. Se preparó un vector de expresión lentivírico que contenía el casete de ADNc que codificaba el tPA-ss-Fc-bisagra-Elabela humano mediante la clonación Gateway del vector pEntra (Invitrogen, Carlsbad, CA) con un fragmento de promotor CMV-ccdB que se clonó en el vector lentivírico universal pSMPUW-CMV (Cell Biolabs, San Diego, CA)-IRES (sitio de entrada de ribosoma interno)-EGFP. Los lentivirus que contienen la secuencia del casete se fabricaron en células HEK293T mediante transfección y se utilizaron para hacer que las células HEK293 produjeran de forma estable la proteína recombinante en el medio de cultivo celular, que se purificó hasta homogeneidad mediante purificación por afinidad de la Proteína A. Todos los plásmidos de vector lentivírico se amplificaron en bacterias STBL3.
Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación/recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); y Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989).
Normalmente, los vectores proceden de virus, plásmido, elementos cromosómicos procariotas o eucariotas, o alguna combinación de los mismos, y pueden incluir opcionalmente al menos un origen de replicación, al menos un sitio para la inserción de ácido nucleico heterólogo y al menos un marcador seleccionable. También se contemplan realizaciones que expresan los polipéptidos usando cromosomas artificiales, por ejemplo, cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de mamíferos (MAC) y cromosomas artificiales humanos (HAC), por ejemplo, cuando es necesario propagar ácidos nucleicos más grandes que los que pueden acomodarse fácilmente en vectores víricos o plásmidos. Los polipéptidos se pueden expresar usando cualquier vector adecuado. Normalmente, los vectores proceden de virus, plásmido, elementos cromosómicos procariotas o eucariotas, o alguna combinación de los mismos, y pueden incluir opcionalmente al menos un origen de replicación, al menos un sitio para la inserción de ácido nucleico heterólogo y al menos un marcador seleccionable. Determinadas realizaciones también contemplan la expresión del uso de cromosomas artificiales, por ejemplo, cromosomas artificiales de bacterias (BAC), cromosomas artificiales de levaduras (YAC), cromosomas artificiales de mamíferos (MA) y cromosomas artificiales humanos (HAC), por ejemplo, cuando es necesario propagar ácidos nucleicos más grandes que los que pueden acomodarse fácilmente en vectores víricos o plásmidos.
Además, cualquier vector puede contener una sola región codificante o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo, un vector de las determinadas realizaciones puede codificar uno o más polipéptidos, que se separan post- o co-traduccionalmente en las proteínas finales mediante escisión proteolítica. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de las realizaciones puede codificar regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no fusionadas con un polinucleótido que codifica la proteína de fusión (fragmento) de determinadas realizaciones, o una variante o un derivado de la misma. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, sin limitación, elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal de secreción o un dominio funcional heterólogo. Una asociación operativa sucede cuando una región codificante para un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras, de tal modo que sitúan la expresión del producto génico bajo la influencia o el control de la secuencia reguladora (o las secuencias reguladoras). Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a esta) se "asocian operativamente" si la inducción de la función de promotor da como resultado la transcripción de ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de la expresión de las secuencias reguladoras para dirigir la expresión del producto génico o interferir con la capacidad del molde de ADN para transcribirse.
Por lo tanto, una región promotora estará asociada operativamente con un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor es capaz de efectuar la transcripción de ese ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirige la transcripción sustancial del ADN solo en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, aparte de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula. En el presente documento se divulgan promotores adecuados y otras regiones de control de la transcripción.
Los expertos en la materia conocen varias regiones de control de la transcripción. Estas incluyen, sin limitación, regiones de control de la transcripción, que funcionan en células de vertebrado, tales como, pero sin limitación, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (por ejemplo, el promotor temprano intermedio, conjuntamente con el intrón-A), virus de simio 40 (por ejemplo, el promotor temprano) y retrovirus (tales como, por ejemplo, el virus del sarcoma de Rous). Otras regiones de control de la transcripción incluyen aquellas derivadas de genes de vertebrado, tales como actina, proteína de choque térmico, hormona del crecimiento bovino y globina-a de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Las regiones de control de la transcripción adecuadas adicionales incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles (por ejemplo, promotores inducibles por tetraciclinas).
Es posible que el vector de expresión sea parte de un plásmido, un virus o puede ser incluso un fragmento de ácido nucleico. El vector de expresión incluye un casete de expresión en el que se clona el polinucleótido que codifica la proteína de fusión (fragmento) (es decir, la región codificante) en asociación operativa con un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o la traducción. Como se usa en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, si está presente, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones, regiones 5' y 3' no traducidas y similares, no forman parte de una región codificante. Pueden estar presentes dos o más regiones codificantes en una sola construcción de polinudeótido, por ejemplo, en un solo vector o en construcciones de polinucleótido separadas, por ejemplo, en vectores separados (diferentes).
F. Células hospedadoras
La expresión "célula hospedadora" significa una célula que se ha transformado o tiene la capacidad de transformarse, con un ácido nucleico y de este modo, expresa un gen de interés. El término incluye la descendencia de la célula precursora, ya sea idéntica o no la descendencia en cuanto a su morfología o composición genética a la de la célula precursora original, en tanto que esté presente el gen de interés. Puede usarse cualquiera de un gran número de células hospedadoras disponibles y bien conocidas en la práctica de estas realizaciones. La selección de un hospedador determinado depende de una serie de factores reconocidos por la materia. Estas incluyen, por ejemplo, compatibilidad con el vector de expresión elegido, toxicidad de los péptidos codificados por la molécula de ADN, tasa de transformación, facilidad de recuperación de los péptidos, características de expresión, bioseguridad y costes. Se debe lograr un equilibrio de estos factores con el entendimiento de que no todos los hospedadores pueden ser igualmente eficaces para la expresión de una secuencia de ADN particular. Dentro de estas pautas generales, las células hospedadoras microbianas útiles en cultivo incluyen bacterias (como Escherichia coli sp.), levadura (como Saccharomyces sp.) y otras células fúngicas, células de insecto, células vegetales, células de mamíferos (incluyendo las humanas), por ejemplo, células CHO y células HEK-293. Se pueden realizar modificaciones a nivel de ADN, también. La secuencia de ADN que codifica el péptido puede cambiarse por codones más compatibles con la célula hospedadora elegida. Para E. coli, los codones optimizados son conocidos en la materia. Los codones pueden sustituirse para eliminar sitios de restricción o para incluir sitios de restricción silenciosos, que pueden ayudar en el procesamiento del ADN en la célula hospedadora seleccionada. A continuación, el hospedador transformado se cultiva y purifica. Las células hospedadoras pueden cultivarse en condiciones de fermentación convencionales para que se expresen los compuestos deseados. Dichas condiciones de fermentación son bien conocidas en la materia.
Los polinucleótidos que codifican las proteínas de fusión para uso terapéutico pueden expresarse en cualquier célula hospedadora adecuada, preferentemente una célula de mamífero. La célula hospedadora puede ser procariota (bacteria) o eucariota (por ejemplo, células de levadura, insectos, vegetales y animales). Se puede elegir una cepa de célula hospedadora por su capacidad para realizar modificaciones postraduccionales deseadas de la proteína expresada. Dichas modificaciones postraduccionales del polipéptido incluyen, pero sin limitación, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, hidroxilación, sulfatación, lipidación y acilación.
Células hospedadoras de mamíferos ilustrativas son las células COS1 y COS7, células NSO, células de ovario de hámster chino (CHO), células NIH 3T3, células HEK293, células HEPG2, células HeLa, células L, MDCK, WI38, líneas de células ES murinas (por ejemplo, de las cepas 129/SV, C57/BL6, DBA-1, 129/SVJ), K562, células Jurkat, BW5147 y cualquier otra línea celular humana disponible comercialmente. Otras líneas celulares de mamíferos útiles son bien conocidas y están fácilmente disponibles en la American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va., USA) y del National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) Human Genetic Cell Repository en los Coriell Cell Repositories (Camden, N.J., EE. UU.).
En una realización adicional, se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más polinucleótidos. En determinadas realizaciones, se proporciona una célula hospedadora que comprende uno o más vectores. Los polinucleótidos y vectores pueden incorporar cualquiera de las características, por separado o en combinación, descritas en el presente documento en relación con los polinucleótidos y vectores, respectivamente. En una de dichas realizaciones, una célula hospedadora comprende (por ejemplo, se ha transformado o transfectado con) un vector que comprende un polinucleótido que codifica (parte de) una proteína de fusión de determinadas realizaciones. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier tipo de sistema celular que pueda modificarse por ingeniería genética para generar las proteínas de fusión de determinadas realizaciones o fragmentos de las mismas. Las células hospedadoras adecuadas para replicar y para soportar la expresión de proteínas de fusión se conocen bien en la materia.
Dichas células pueden transfectarse o transducirse según sea necesario con el vector de expresión concreto y pueden cultivarse grandes cantidades de células que contienen vector para sembrar fermentadores a gran escala o cultivarse en suspensión para obtener cantidades suficientes de la proteína de fusión para aplicaciones clínicas. Las células hospedadoras adecuadas incluyen células de mamíferos, incluyendo células preferidas como las células HEK 293. Por ejemplo, líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles son la línea CV1 de riñón de mono trasformada mediante SV40 (COS-7); la línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293T tal como se describen, por ejemplo, en Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), células de riñón de cría de hámster (BHK), células de Sertoli de ratón (células TM4 tal como se describen, por ejemplo, en Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), células de riñón de mono (CV1), células de riñón de mono verde africano (VERO-76), células de carcinoma de cuello de útero humano (HELA), células de riñón canino (MDCK), células de hígado de rata búfalo (BRL 3A), células de pulmón humano (W138), células de hígado humano (Rep G2), células de tumor mamario de ratón (MMT 060562), células TRI (tal como se describen, por ejemplo, en Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), células MRC 5 y células FS4. Otras líneas celulares hospedadoras de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), incluyendo células CHO dhfr-(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); y líneas celulares de mieloma, tales como YO, NS0, P3X63 y Sp2/0. Para una revisión de determinadas líneas celulares de mamífero hospedadoras adecuadas para la producción de proteínas, véase, por ejemplo, Yazaki y Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J.), págs. 255-268 (2003).
Las células hospedadoras se transforman o transfectan con los ácidos nucleicos o vectores descritos anteriormente para producir inmunoglobulinas y se cultivan en medios nutritivos convencionales modificados según sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Además, los nuevos vectores y líneas celulares transfectadas con múltiples copias de unidades de transcripción separadas por un marcador selectivo son particularmente útiles para la expresión de inmunoglobulinas.
Las células hospedadoras utilizadas para producir las inmunoglobulinas de otras realizaciones se pueden cultivar en diversos medios. Medios disponibles en el mercado tales como F10 de Ham (Sigma), medio mínimo esencial ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), medio Eagle modificado de Dulbecco ((Dm Em ), Sigma) son adecuados para cultivar las células hospedadora. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth. Enz. 58: 44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102: 255 (1980), las Patentes de Estados Unidos N.° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; el documento WO90103430; el documento WO 87/00195; o la patente de Estados Unidos Re. N.° 30.985 pueden usarse como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio y fosfato), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco Gentamycin.TM.), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. También se puede incluir cualquier otro complemento necesario en concentraciones adecuadas que serían conocidas por los expertos en la materia. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula hospedadora seleccionada para la expresión y serán evidentes para el experto en la materia.
Después de cultivar las células hospedadoras, la inmunoglobulina puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si la inmunoglobulina se produce intracelularmente, como primera etapa, los restos de partículas, ya sean células hospedadoras o fragmentos lisados, se eliminan, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración.
G. Composiciones farmacéuticas, Formulaciones y Vías de Administración
En una divulgación adicional, determinadas enseñanzas se refieren a composiciones farmacéuticas que comprenden un péptido ELA-21 o cualquiera de las proteínas de fusión descritas en el presente documento, por ejemplo, para usar en cualquiera de los métodos terapéuticos utilizados para el tratamiento de afecciones cardíacas. En una enseñanza, una composición farmacéutica comprende un péptido ELA-21 proporcionado en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra enseñanza, una composición farmacéutica comprende el péptido ELA-32 proporcionado en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación. Cardiomiocitos que expresan ELA u otros tipos de células para terapia de trasplante celular. El vector vírico que expresa proteínas de fusión ELA puede usarse para terapia génica o terapia celular de una afección cardiovascular.
En otra enseñanza, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las proteínas de fusión proporcionadas en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización, una composición farmacéutica comprende cualquiera de las proteínas de fusión proporcionadas en el presente documento y al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, como se describe a continuación.
Se proporciona además un método para producir una proteína de fusión de determinadas realizaciones en una forma adecuada para la administración. in vivo, comprendiendo el método (a) obtener una proteína de fusión de acuerdo con diversas realizaciones, y (b) formular la proteína de fusión con al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable, mediante el cual se formula una preparación de proteína de fusión para administración in vivo.
Las composiciones farmacéuticas de las enseñanzas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de una o más proteínas de fusión disueltas o dispersas en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La preparación de una composición farmacéutica que contiene al menos una proteína de fusión y opcionalmente un principio activo adicional será conocida por un experto en la materia a la luz de la presente divulgación, tal como se ejemplifica por Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990. Para administración a seres humanos, se entenderá que las preparaciones deben cumplir con la esterilidad, pirogenicidad, normas generales de seguridad y pureza según lo requiera la FDA Office of Biological Standards o las autoridades correspondientes en otros países. Composiciones preferidas son formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas.
Como se usa en el presente documento, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, tampones, medios de dispersión, recubrimientos, tensioactivos, antioxidantes, conservantes (por ejemplo, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos), agentes isotónicos, agentes de retardo de la absorción, sales, conservantes, antioxidantes, proteínas, fármacos, estabilizadores de fármacos, polímeros, geles, aglutinantes, excipientes, agentes de disgregación, lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, colorantes, tales como materiales y combinaciones de los mismos, como sabría un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, págs. 1289-1329). Excepto en la medida en donde un vehículo convencional cualquiera sea incompatible con el principio activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas o farmacéuticas.
La composición puede comprender diferentes tipos de vehículos dependiendo de si se va a administrar en forma sólida, líquida o de aerosol, y si tienen que ser estériles para dichas vías de administración como inyección. Las proteínas de fusión de determinadas realizaciones (y cualquier agente terapéutico adicional) se pueden administrar mediante cualquier método o cualquier combinación de métodos como sería conocido por un experto en la materia (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. Mack Printing Company, 1990, incorporado por referencia en el presente documento). La administración parenteral, en particular la inyección intravenosa, se usa más habitualmente para administrar moléculas polipeptídicas tales como las proteínas de fusión de determinadas realizaciones. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener compuestos que aumenten la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, dextrano o similares. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones muy concentradas. De manera adicional, se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones oleosas para inyección adecuadas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos o liposomas.
Las composiciones parenterales incluyen aquellas diseñadas para su administración mediante inyección, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intralesional, intravenosa, intraarterial, intramuscular, intratecal o intraperitoneal. Para inyección, las proteínas de fusión se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hanks, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. La solución puede contener agentes formulatorios, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, la proteína de fusión puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos, antes de su uso. Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando la proteína de fusión en la cantidad necesaria en el disolvente adecuado con otros diversos ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario. Puede lograrse fácilmente la esterilidad, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando los diferentes principios activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio básico de dispersión y/o los otros ingredientes. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones, suspensiones o emulsiones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado al vacío o criodesecación que producen un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de un medio líquido esterilizado por filtración del mismo. El medio líquido debe estar tamponado de manera adecuada en caso necesario y el diluyente líquido se hará isotónico primero, antes de la inyección con suficiente solución salina o glucosa. La composición ha de ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos.
Composiciones farmacéuticas que comprenden el péptido ELA-21 o proteínas de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) se pueden fabricar mediante mezcla convencional, disolución, emulsión, encapsulación, atrapamiento o procesos de liofilización. Las composiciones farmacéuticas se pueden formular de manera convencional usando uno o más vehículos, diluyentes, excipientes o auxiliares fisiológicamente aceptables que facilitan el procesamiento de las proteínas en preparaciones que se pueden usar farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.
El péptido ELA-21 o proteínas de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) se pueden formular en una composición en forma de ácido o base libre, neutra o sal. Las sales farmacéuticamente aceptables son sales que mantienen sustancialmente la actividad biológica del ácido o base libre. Estas incluyen las sales de adición de ácido, por ejemplo, aquellas formadas con los grupos amino libres de una composición proteica o que se forman con ácidos inorgánicos, tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos, tales como ácido acético, oxálico, tartárico o mandélico. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden proceder de bases inorgánicas, tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos; o bases orgánicas, tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina o procaína. Las sales farmacéuticas tienden a ser más solubles en disolventes acuosos y otros disolventes proteicos que las formas de base libre correspondientes.
La preparación farmacéutica de determinadas enseñanzas es una composición líquida, por ejemplo, una solución acuosa. Para propósitos de inyección, se prefiere el uso de agua pura como disolvente. Sin embargo también se puede emplear otros disolventes que son adecuados y convencionales para preparaciones farmacéuticas. En una técnica preferida, las composiciones farmacéuticas son soluciones isotónicas.
Además, no hay necesidad de reconstitución en ninguna etapa de la preparación de la formulación en solución líquida de estas realizaciones. La solución es una formulación lista para usar.
La composición farmacéutica de determinadas enseñanzas tiene un pH en el intervalo de 4,5 a 5,5. En una realización preferida, el valor de pH es de un intervalo de 4,7 a 5,3, más preferentemente, entre 4,8 y 5,2 y lo más preferentemente entre 4,9 y 5,1.
Si se requiere un ajuste para alcanzar el intervalo de pH deseado, el valor de pH se ajusta mediante soluciones adecuadas; con soluciones ácidas en caso de que se indique una reducción del valor de pH y con soluciones alcalinas en caso de que se indique un aumento del valor de pH. Las soluciones ácidas adecuadas son, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido cítrico e hidrogenofosfato de sodio o potasio. Las soluciones alcalinas adecuadas son hidróxidos alcalinos y alcalinotérreos, carbonatos alcalinos, acetatos alcalinos, citratos alcalinos e hidrogenofosfatos dialcalinos, por ejemplo, hidróxido de sodio, acetato de sodio, carbonato sódico, citrato de sodio, hidrogenofosfato disódico o dipotásico o amoniaco.
La administración de una inmunoglobulina terapéutica a las células apropiadas puede ocurrir mediante terapia génica ex vivo, in situ, o in vivo mediante el uso de cualquier enfoque adecuado conocido en la materia. Por ejemplo, para terapia in vivo, un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina o anticuerpo deseado, ya sea solo o junto con un vector, liposoma o precipitado se puede inyectar directamente en el sujeto y, en algunas realizaciones, puede inyectarse en el sitio donde se desea la expresión del compuesto de inmunoglobulina. Para el tratamiento ex vivo, se eliminan las células del sujeto, se introduce el ácido nucleico en estas células y se devuelven las células modificadas al paciente directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N.° 4.892.538 y 5.283.187.
Hay diversas técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro o in vivo en las células del hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, tratamientos químicos, DEAE-dextrano y precipitación con fosfato de calcio. Otras técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores víricos (tales como adenovirus, virus Herpes simple I, virus adenoasociado o retrovirus) y sistemas basados en lípidos. El ácido nucleico y el agente de transfección se asocian opcionalmente con una micropartícula. Ejemplos de agentes de transfección incluyen la precipitación conjunta de fosfato cálcico o cloruro cálcico, la transfección mediada por DEAE-dextrano, anfifilo de amonio cuaternario DOTMA (bromuro de (dioleoiloxipropil) trimetilamonio, comercializado como Lipofectin por GIBCO-BRL))(Felgner et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 7413-7417; Malone et al. (1989) Proc. Natl Acad. Sci. USA 866077-6081); diésteres de glutamato lipofílico con cabezas colgantes de trimetilamonio (Ito et al. (1990) Biochem. Biophys. Acta 1023, 124-132); los lípidos progenitores metabolizables, tales como el lípido catiónico dioctadecilamido glicilspermina (DOGS, Transfectam, Promega) y dipalmitoilfosfatidil etanolamilspermina (DPPES) (J. P. Behr (1986) Tetrahedron Lett. 27, 5861-5864; J. P. Behr et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 6982-6986); sales de amonio cuaternario metabolizables (DOTB, N-(1-[2,3-dioleoiloxi]propil)-N,N,N-trimetilamonio metilsulfato (DOTAP) (Boehringer Mannheim), polietilenimina (PEI), ésteres de dioleoilo, ChoTB, ChoSC, DOSC) (Leventis et al. (1990) Biochim. Inter. 22, 235-241); 3 beta [N--(N', N'-dimetilaminoetano)-carbamoil] colesterol (DC-Chol), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE)/3beta [N--(N', N'-dimetilaminoetano)-carbamoil] colesterol DC-Chol en mezclas uno a uno (Gao et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 1065, 8-14), espermina, espermidina, lipopoliaminas (Behr et al., Bioconjugate Chem, 1994, 5: 382-389), polilisinas lipófilas (LPLL) (Zhou et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), hidróxido de [[(1,1,3,3-tetrametilbutil) cre-soxi] etoxi] etil] dimetilbencilamonio (hidróxido DEBDa ) con exceso de fosfatidilcolina/colesterol (Ballas et al., (1988) Biochim. Biophys. Acta 939, 8-18), mezclas de bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB)/DOPE (Pinnaduwage et al, (1989) Biochim. Biophys. Acta 985, 33-37), diéster lipófilo de ácido glutámico (TmAG) con DOPE, CTAB, DEBDA, bromuro de didodecilamonio (DDAB) y estearilamina en mezcla con fosfatidiletanolamina (Rose et al., (1991) Biotechnique 10, 520-525), DDAB/DOPE (TransfectACE, GIBCO BRL) y lípidos que contienen oligogalactosa. Ejemplos de agentes potenciadores de la transfección que aumentan la eficacia de la transferencia incluyen, por ejemplo, DEAE-dextrano, polibreno, péptido disruptor de lisosomas (Ohmori NI et al., Biochem Biophys Res Commun. 27 de junio de 1997; 235(3):726-9), proteoglicanos a base de condroitan, proteoglucanos sulfatados, polietilenimina, polilisina (Pollard H et al. J Biol Chem, 1998 273 (13):7507-11), péptido de unión a integrina CYGGRGDTP (SEQ ID NO: 235), nonasacárido de dextrano lineal, glicerol, grupos colesterilo unidos al enlace internucleosídico 3'-terminal de un oligonucleótido (Letsinger, R. L. 1989 Proc Natl Acad Sci USA 86: (17):6553-6), lisofosfatida, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina y 1-oleoil lisofosfatidilcolina.
En algunas situaciones, puede ser deseable administrar el ácido nucleico con un agente que dirija el vector que contiene ácido nucleico a las células diana. Dichas moléculas de "direccionamiento" incluyen proteínas de unión a antígenos específicas para una proteína de la membrana de la superficie celular en la célula diana, o un ligando para un receptor en la célula diana. Cuando se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis se pueden usar para dirigir y/o para facilitar la captación. Ejemplos de dichas proteínas incluyen proteínas de la cápside y fragmentos de las mismas trópicas para un tipo celular particular, proteínas de unión a antígeno para proteínas que se someten a una internalización en ciclos, y proteínas que se dirigen a la localización intracelular y mejoran la semivida intracelular. En otras realizaciones, se puede usar endocitosis mediada por receptores. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Wu et al., 1987 o Wagner et al., 1990. Para revisar los protocolos de terapia génica y marcado genético actualmente conocidos, véase Anderson 1992. Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo. Para revisiones adicionales de la técnica de terapia génica, véanse Friedmann, Science, 244: 1275-1281 (1989); Anderson, Nature, suplemento al vol. 392, n.° 6679, págs. 25-30 (1998); Verma, Scientific American: 68-84 (1990); y Miller, Nature, 357: 455460 (1992).
H. Dosificación y administración
Cualquiera de los péptidos ELA y proteínas de fusión proporcionados en el presente documento puede usarse en métodos terapéuticos descritos en el presente documento. Para usar en los métodos terapéuticos descritos en el presente documento, los péptidos ELA y proteínas de fusión de determinadas realizaciones se formularían, dosificarían y administrarían de una forma coherente con la buena práctica médica. Los factores a tener en cuenta en este contexto incluyen el trastorno particular que se va a tratar, el sujeto particular que se va a tratar, la afección médica del sujeto, la causa de la enfermedad o afección, el sitio donde se suministra el agente, del método de administración, la pauta de administración y otros factores conocidos por los médicos o los expertos en la materia. En determinadas enseñanzas el método comprende además administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un agente terapéutico adicional, por ejemplo, una estatina cuando la afección cardíaca o la enfermedad cardíaca a tratar es hiperlipidemia. Un "sujeto" o "individuo" de acuerdo con cualquiera de las realizaciones anteriores es un mamífero, preferentemente un ser humano.
Para el tratamiento de una enfermedad cardíaca o una afección cardíaca, la dosificación adecuada de una proteína de fusión de la realización (cuando se usa sola o junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales) dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, la vía de administración, el peso corporal del paciente, el tipo de proteína de fusión, la intensidad y de la evolución de la enfermedad, si la proteína de fusión se administran con fines preventivos o terapéuticos, las intervenciones terapéuticas anteriores o concurrentes, el historial clínico del paciente y la respuesta a la proteína de fusión y del criterio del médico tratante. El médico responsable de la administración, en todo caso, determinará la concentración de principio activo (o principios activos) en una composición y la dosis adecuada para el sujeto individual. En el presente documento se contemplan varias pautas de dosificación que incluyen, pero sin limitación, administraciones únicas o múltiples en varios puntos temporales, administración en bolo e infusión por pulsos.
Los péptidos ELA (por ejemplo, ELA-32, ELA-21, Apelina-13) o proteínas de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) como se enseña o proporciona en el presente documento se administran adecuadamente al paciente de una vez o durante una serie de tratamientos por vía subcutánea, vía intravenosa, vía intramuscular, localmente o por vía aérea o debajo de la lengua. Dependiendo del tipo y de la intensidad de la enfermedad, de aproximadamente 1 mg a 100 mg de proteína de fusión o péptido puede ser una dosis inicial para la administración al paciente, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosificación diaria normal estará en el intervalo de aproximadamente 50 mg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas a lo largo de varios días o un periodo mayor, dependiendo de la dolencia, el tratamiento será generalmente sostenido hasta que se produzca una supresión deseada de los síntomas de la enfermedad.
Una dosis preferida estaría en el intervalo de aproximadamente 1 mg. En otros ejemplos no limitantes, una dosis también puede comprender de aproximadamente 1 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 100 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 pg/kg de peso corporal, aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 100mg/kg de peso corporal, aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 350 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, a aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal o más por administración y cualquier intervalo que pueda derivarse a partir de los mismos.
En ejemplos no limitantes de un intervalo derivable de los números enumerados en el presente documento, un intervalo de aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, aproximadamente 5 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, puede administrarse, basándose en los números descritos anteriormente. Por lo tanto, una o más dosis de aproximadamente 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 5,0 mg/kg o 10 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) se pueden administrar al paciente. Dichas dosis pueden administrarse de manera intermitente, por ejemplo, cada semana o cada tres semanas (por ejemplo, de tal modo que el paciente recibe de aproximadamente dos a aproximadamente veinte o por ejemplo, aproximadamente seis dosis de la proteína de fusión). Puede administrarse una dosis de carga inicial superior, seguida de una o más dosis inferiores. Sin embargo, pueden ser útiles otras pautas posológicas. El progreso de esta terapia se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales.
Los péptidos ELA (por ejemplo, ELA-32, ELA-21, Apelina-13) y proteínas de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32, FcELA-21, Elabela-Apelina) de determinadas realizaciones/enseñanzas se usarán generalmente en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Para usar en el tratamiento o prevención de una patología, los péptidos ELA y las proteínas de fusión de estas realizaciones, o composiciones farmacéuticas de las mismas, se administran o aplican en una cantidad terapéuticamente eficaz. La determinación de la cantidad terapéuticamente eficaz se encuentra dentro de las capacidades de los expertos en la materia, especialmente a la luz de la divulgación detallada proporcionada en el presente documento.
Para administración sistémica, puede estimarse inicialmente una dosis terapéuticamente eficaz a partir de ensayos in vitro, tales como ensayos de cultivo celular. Puede formularse una dosis en modelos animales para lograr un intervalo de concentración circulante que incluya la CI50 determinada en cultivo celular. Dicha información puede usarse para determinar de forma más precisa las dosis útiles en seres humanos.
Las dosis iniciales también pueden estimarse a partir de datos in vivo, por ejemplo, modelos animales, usando técnicas que se conocen bien en la materia. Un experto habitual en la materia podrá optimizar fácilmente la administración a seres humanos basándose en datos de animales.
El compuesto de la invención puede administrarse mediante un bolo inicial seguido de una infusión continua para mantener los niveles circulantes terapéuticos del fármaco. Como otro ejemplo, el compuesto de la invención se puede administrar como una dosis única. Los expertos en la materia optimizarán fácilmente las dosis y los regímenes de administración eficaces según lo determinen las buenas prácticas médicas y el estado clínico del paciente individual.
Se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen la inmunoglobulina, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinílico)), polilactidas (patente de Estados Unidos n.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y yetil-L-glutamato, etilvinilacetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tales como de Lupron Depot.TM. (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etilvinilacetato y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, determinados hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando los polipéptidos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo prolongado, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando lugar a una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Se pueden desarrollar estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de tio-disulfuro, se puede lograr estabilización modificando restos de sulfhidrilo, liofilizando a partir de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices poliméricas específicas.
Las formulaciones de otras realizaciones/enseñanzas pueden diseñarse para ser de acción corta, liberación rápida, acción prolongada o liberación sostenida como se describe en el presente documento. Por lo tanto, las formulaciones farmacéuticas también se pueden formular para la liberación controlada o para la liberación lenta.
Las dosis específicas pueden ajustarse según las condiciones de la enfermedad, la edad, el peso corporal, el estado de salud general, el sexo y la dieta del sujeto, el intervalo de dosificación, las vías de administración, la tasa de excreción y las combinaciones de fármacos. Cualquiera de las formas de dosificación anteriores que contengan cantidades eficaces está dentro de los límites de la experimentación de rutina y, por lo tanto, bien dentro del alcance de determinadas realizaciones/enseñanzas.
La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de varios factores, por ejemplo, la forma de dosificación empleada, la vía de administración utilizada, el estado del sujeto y similares. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden ser elegidas por el médico individual a la vista del estado del paciente. La cantidad y el intervalo de dosificación se pueden ajustar individualmente para proporcionar unos niveles en plasma de las proteínas de fusión que sean suficientes para mantener un efecto terapéutico. Las dosificaciones de paciente habituales para su administración mediante inyección están en el intervalo de 0,1 a 50 mg/kg/día, normalmente de aproximadamente 0,5 a 10 mg/kg/día. Los niveles en plasma terapéuticamente eficaces pueden lograrse administrando múltiples dosis cada día. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, por HPLc .
El médico tratante para pacientes tratados con proteínas de fusión de determinadas realizaciones sabrá cómo y cuándo terminar, interrumpir o ajustar la administración debido a toxicidad, disfunción orgánica y similares. A la inversa, el médico responsable también sabría cómo ajustar el tratamiento a cantidades mayores si la respuesta clínica no fuera adecuada (impidiendo la toxicidad). La magnitud de una dosis administrada en el control del trastorno de interés variará con la gravedad de la afección a tratar, con la ruta de administración y similares. La gravedad de la afección puede, por ejemplo, evaluarse, en parte, mediante métodos de evaluación pronósticos convencionales. Además, la dosis y quizá la frecuencia de dosis también variarán de acuerdo con la edad, el peso corporal y la respuesta del paciente individual.
I. Agentes Terapéuticos
Los péptidos ELA (por ejemplo, ELA-32, ELA-21, Apelina-13) y proteínas de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32, Fc-ELA-21, Elabela-Apelina) descritas o enseñadas en el presente documento pueden administrarse en combinación con uno o más de otros agentes o "agentes terapéuticos" para usar en el tratamiento de enfermedades cardíacas, afecciones cardíacas, diabetes o en factores de riesgo. Un péptido ELA (por ejemplo, ELA-32 o ELA-21) o una proteína de fusión (por ejemplo, Fc-ELA-32 o Fc-ELA-21) puede administrarse conjuntamente con al menos un agente terapéutico adicional. La expresión "agente terapéutico" abarca cualquier agente administrado para tratar un síntoma o enfermedad en un individuo que necesite dicho tratamiento. Dicho agente terapéutico adicional puede comprender cualquier principio activo adecuado para la indicación particular que se esté tratando, preferentemente los que tienen actividades complementarias que no se afectan negativamente entre sí. En determinadas realizaciones, un agente terapéutico adicional es un medicamento seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de la ECA, un antagonista de aldosterona, un bloqueante de los receptores de la angiotensina, un betabloqueante, un bloqueante del calcio, un fármaco para reducir el colesterol, una digoxina, un diurético, un fármaco para reducir la glucosa, potasio o magnesio, un antagonista de la vasopresina y warfarina.
Existe varios fármacos recetados para pacientes con cardiopatías. Es importante que tanto los pacientes que viven con cardiopatías como los que los cuidan comprendan el medicamento recetado, seguir las instrucciones de uso y ser capaces de reconocer los posibles efectos secundarios asociados con el medicamento. Los fármacos recetados con más frecuencia para las cardiopatías incluyen:
Inhibidores de la ECA: Los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ECA) son medicamentos para el corazón que ensanchan o dilatan los vasos sanguíneos para mejorar la cantidad de sangre que bombea el corazón y disminuir la presión arterial, lo que facilita que el corazón bombee sangre. También bloquean algunas de las acciones dañinas del sistema endocrino que pueden ocurrir con la insuficiencia cardíaca. Los inhibidores de la ECA también aumentan la circulación sanguínea, lo que ayuda a disminuir la cantidad de trabajo que tiene que hacer su corazón. Ejemplos de inhibidores de la ECA incluyen, pero sin limitación: Accupril® (quinapril), Aceon® (perindopril), Altace@ (ramipril), Capoten® (captopril), Lotensin® (benazepril), Mavik® (trandolapril), Monopril® (fosinopril), Prinivil®, Zestril® (lisinopril), Univasc® (moexipril) y Vasotec® (enalapril).
Inhibidor de aldosterona: Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: Inspra®, (eplerenona) y Aldactone@ (espironolactona). Son diuréticos ahorradores de potasio. Se pueden recetar para reducir la hinchazón y la acumulación de agua causada por la insuficiencia cardíaca. Los diuréticos hacen que los riñones envíen agua y sal innecesarias de los tejidos y la sangre a la orina. Pueden mejorar los síntomas de insuficiencia cardíaca que aún están presentes a pesar del uso de otros tratamientos. Estos fármacos protegen el corazón mediante el bloqueo de una sustancia química (aldosterona) en el cuerpo que causa la acumulación de sal y líquido. Este medicamento se usa para tratar a pacientes con determinados tipos de insuficiencia cardíaca grave.
Bloqueadores del receptor de la angiotensina II (BRA): Los BRA inhiben una sustancia que hace que los vasos sanguíneos se estrechen (se contraigan). Como resultado, los vasos sanguíneos se relajan y ensanchan (dilatan), facilitando que la sangre fluya a través de los vasos, lo que reduce la presión arterial. Estos medicamentos también aumentan la liberación de agua y sal (sodio) a la orina, lo que a su vez también reduce la presión arterial. Evitar que los vasos sanguíneos se contraigan ayuda a mejorar la circulación sanguínea, lo que reduce la acumulación de sangre en el corazón y los pulmones. También disminuye la presión contra la que debe bombear el ventrículo izquierdo del corazón. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: Atacand® (candesartán), Teveten® (eprosartán), Avapro® (irbesartán), Cozaar® (losartán), Benicar® (olmesartán), Micardis® (telmisartán) y Diovan® (valsartá0n). Los BRA combinados con un diurético incluyen Avalide®, (irebesartán e hidroclorotiazida) e Hyzaar® (losartán e hidroclorotiazida).
Betabloqueantes: Los betabloqueantes, también conocidos como agentes bloqueadores beta adrenérgicos, son medicamentos que reducen la presión arterial. Los betabloqueantes actúan bloqueando los efectos de la hormona epinefrina, también conocida como adrenalina. Cuando se toman betabloqueantes, el corazón late más lento y con menos fuerza, reduciendo así la presión arterial. Mejoran la capacidad del corazón para funcionar. También disminuyen la producción de sustancias nocivas producidas por el cuerpo en respuesta a la insuficiencia cardíaca. Ejemplos de betabloqueantes incluyen, pero sin limitación: Sectral @ (acebutolol), Zebeta® (bisoprolol), Brevibloc® (esmolol), Inderal® (propranolol), Tenormin® (atenolol), Normodyne®, Trandate® (labetalol), Coreg® (carvedilol), Lopressor® y Toprol-XL® (metoprolol).
Antagonistas del calcio: Los antagonistas del calcio se recetan para tratar la angina (dolor de pecho) y la presión arterial alta. Los antagonistas del calcio afectan al movimiento del calcio en las células del corazón y los vasos sanguíneos. Como resultado, los fármacos relajan los vasos sanguíneos y aumentan el suministro de sangre y oxígeno al corazón, al tiempo que reducen su carga de trabajo. Los antagonistas del calcio solo se usan para tratar la insuficiencia cardíaca causada por la presión arterial alta cuando otros medicamentos para disminuir la presión arterial no son eficaces. Determinados antagonistas del calcio se usan para determinados tipos de insuficiencia cardíaca. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: Norvasc (amlodipina), Plendil® (felodipina), Cardizem®, Cardizem CD®, Cardizem SR®, Dilacor XR®, Diltia XT®, Tiazac® (diltiazem), Calan®, Calan SR®, Covera-HS®, Isoptin®, Isoptin SR®, Verelan®, Verelan PM® (verapamilo), Adalat®, Adalat CC®, Procardia®, Procardia XL® (nifedipina), Cardene®, Cardene SR® (nicardipina), Sular® (nisoldipina) y Vascor® (bepridil). Caduet es una combinación de un fármaco de estatina para el colesterol y amlodipina (anterior).
Fármacos para reducir el colesterol: El colesterol ayuda al cuerpo a construir nuevas células, aísla los nervios y produce hormonas. Pero la inflamación puede provocar la acumulación de colesterol en las paredes de las arterias, aumentando el riesgo de ataque cardíaco y accidente cerebrovascular. Algunas personas tienen una predisposición genética a los niveles altos de colesterol. Estas personas pueden necesitar terapia con fármacos, tales como estatinas, además de una dieta más saludable para reducir el riesgo de aterosclerosis. Ejemplos de estatinas incluyen: atorvastatina (Lipitor®), fluvastatina (Lescol®), lovastatina (Altoprev®, Mevacor®), pravastatina (Pravachol®), rosuvastatina de calcio (Crestor®) y simvastatina (Zocor®). Algunos medicamentos con estatinas incluyen un fármaco complementario para ayudar a reducir los triglicéridos o aumentar el colesterol HDL. Estos incluyen: atorvastatina con amlodipina (Caduet®), lovastatina con niacina (Advicor®) y simvastatina con ezetimiba (Vytorin®).
Secuestrantes de ácidos biliares: Estos son resinas que ayudan al cuerpo a eliminar el colesterol LDL. El cuerpo usa el colesterol para crear bilis, que se utiliza en el proceso digestivo. Como el nombre sugiere, esta clase de fármacos se une a la bilis, por lo que no se puede usar durante la digestión. El cuerpo responde produciendo aún más bilis, que requiere más colesterol. Cuanta más bilis produce, más colesterol usa el cuerpo, reduciendo así la cantidad de colesterol en el torrente circulatorio. Las personas con problemas de hígado o vesícula biliar deben evitar el uso de estos medicamentos. Ejemplos de resinas de unión a ácidos biliares incluyen: colestiramina (Locholest®, Locholest Light®, Prevalite®, Questran® y Questran Light®), colesevelam HCl (WelChol®) y colestipol (Colestid®).
Fibratos: Usados solos o en combinación con otros fármacos, los fibratos actúan reduciendo los triglicéridos y, en algunos casos, aumentando el colesterol HDL "bueno". Ejemplos de fibratos incluyen: clofibrato (Atromid-S®) y gemfibrozil (Lopid®), fenofibrato (Antara®, Lofibra®, Tricor® y Triglide®).
Ácidos grasos omega-3: Un aceite de pescado de venta con receta (ácido graso omega-3) llamado Lovaza® está aprobado por la FDA para el tratamiento de triglicéridos en sangre muy altos (por encima de 500 ml/dl). Los ácidos grasos omega-3 también están disponibles como suplementos, pero en dosis más bajas. La niacina de prescripción médica, también conocida como vitamina B3, ayuda a mejorar el colesterol al aumentar e1HDL y reducir el LDL y los triglicéridos. Cuando se usa en combinación con estatinas, la niacina podría elevar los niveles de HDL en un 50 por ciento o más. Ejemplos de niacina de prescripción médica incluyen: Niacor®, Niaspan® y Slo-Niacin®.
Digoxina: La digoxina ayuda a que un corazón lesionado o debilitado funcione de manera más y envíe sangre a través del cuerpo. Fortalece la fuerza de las contracciones del músculo cardíaco y puede mejorar la circulación sanguínea. También se puede recetar si el paciente tiene fibrilación auricular (ritmo cardíaco irregular) para ayudar a disminuir la frecuencia cardíaca. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación: Lanoxin®, Lanoxincaps® y Crystodigin®
Diuréticos: Los diuréticos, habitualmente conocidos como "píldoras de agua", hacen que los riñones eliminen el agua y la sal innecesarias de los tejidos y del torrente circulatorio a la orina. Eliminar el exceso de líquido facilita el bombeo del corazón. Los diuréticos se utilizan para tratar la presión arterial alta y reducir la hinchazón y la acumulación de agua causada por diversos problemas médicos, incluyendo insuficiencia cardíaca. También ayudan a facilitar la respiración. Ejemplos de diuréticos incluyen, pero sin limitación, Aqua-Ban®, Osmitrol®, Diamox® y MZM®.
Fármacos para reducir la glucosa: Los fármacos para reducir la glucosa actúan estimulando el páncreas para que produzca insulina para reducir los niveles elevados de glucosa en sangre. Los ejemplos incluyen, pero sin limitación, los siguientes:
(i) Sulfonilureas (gliclazida, glimepirida, gliburida (también conocida como glibenclamida) que actúan para estimular al páncreas a producir insulina;
(ii) Metformina (biguanida) que actúa principalmente reduciendo la cantidad de glucosa que libera el hígado; (iii) Glinidas (Repaglinida o GlucoNorm® y Nateglinida (Starlix®), que actúan estimulando el páncreas para producir insulina;
(iv) Inhibidores de la alfa-glucosidasa (GlucoBay®) que actúan ralentizando la absorción de glucosa del intestino;
(v) tiazolidinedionas (TZD) (pioglitazona y rosiglitazona) que actúan aumentando la cantidad de glucosa absorbida por los músculos y las células grasas;
(vi) Inhibidores de DPP-4 (saxagliptina (Onglyza®), Sitagliptina (Januvia®) y Vildagliptin®) que funcionan estimulando el páncreas para que produzca insulina y reduciendo la cantidad de glucosa que libera el hígado; y (vii) análogos de GLP-1 liraglutida (Victoza®) y exenatida (Byetta®) y pramlinitida (Symlin®)) que actúan estimulando el páncreas para producir insulina, reduciendo la cantidad de glucosa que produce el hígado, ralentizando la rapidez con que el estómago vacía los alimentos en el intestino y reduciendo el apetito.
Terapia inótropa: La terapia inótropa se usa para estimular un corazón lesionado o debilitado para que bombee más fuerte para enviar sangre a través del cuerpo. Ayuda a la fuerza de las contracciones del músculo cardíaco y relaja los vasos sanguíneos constreñidos para que la sangre pueda fluir más suavemente. La terapia inótropa también puede acelerar el ritmo cardíaco. La terapia inótropa se usa en la insuficiencia cardíaca en etapa terminal para ayudar a aliviar y controlar los síntomas de la insuficiencia cardíaca. Estos medicamentos solo se usan cuando otros ya no controlan los síntomas de insuficiencia cardíaca.
Potasio o Magnesio: El potasio y el magnesio son minerales que se pueden perder debido al aumento de la micción al tomar diuréticos. Los niveles bajos en el cuerpo pueden estar asociados con ritmos cardíacos anormales. Algunos pacientes los toman como suplementos según las indicaciones de su médico.
Vasodilatadores: Los vasodilatadores se utilizan para tratar la insuficiencia cardíaca y controlar la presión arterial alta mediante la relajación de los vasos sanguíneos para que la sangre pueda fluir más fácilmente a través del cuerpo. Los vasodilatadores se recetan a pacientes que no pueden tomar inhibidores de la ECA. Ejemplos incluyen, pero sin limitación, nitrito de amilo (Vapotole®), tetranitrato de eritritilo (Cardilate®), dinitrato de isosorbida (Iso-Bid®, Isordil®, Sorbide®, Sorbitrate®), hexanitrato de manitol (Nitranitol®) y nitroglicerina (Nitro-Bid®).
Warfarina: La warfarina es un medicamento anticoagulante, que ayuda a prevenir la formación de coágulos en la sangre. A una persona se le prescribe warfarina porque el cuerpo está produciendo coágulos de sangre o porque la persona tiene una afección médica conocida por promover la formación de coágulos de sangre no deseados. Los coágulos de sangre pueden moverse a otras partes del cuerpo y causar problemas médicos graves. La warfarina no disuelve un coágulo de sangre; sin embargo, con el tiempo, el coágulo de sangre puede disolverse por sí solo. La warfarina también puede prevenir la formación de otros coágulos.
Estos agentes terapéuticos están presentes de manera adecuada en combinación en cantidades que son eficaces para el fin previsto. La cantidad eficaz de estos otros agentes depende de la cantidad de proteína de fusión empleada, del tipo de enfermedad o afección, o tratamiento y de otros factores analizados anteriormente. Las proteínas de fusión se usan generalmente con las mismas dosis y vías de administración como las descritas en el presente documento o aproximadamente de 1 al 99 % de las dosificaciones descritas en el presente documento o en cualquier dosis y por cualquier vía que se haya determinado empíricamente/clínicamente como adecuada. La dosificación depende de la intensidad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varios meses. Las personas con conocimientos ordinarios pueden determinar fácilmente las dosis óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. Las cantidades (dosis) terapéutica o profilácticamente eficaces pueden variar dependiendo de la potencia relativa de las composiciones individuales, y generalmente se pueden calcular de forma rutinaria en función del peso molecular y las CE50 en estudios en animales y/o in vitro.
Dichas terapias combinadas indicadas anteriormente abarcan administración combinada (en la que dos o más agentes terapéuticos se incluyen en la misma o en composiciones separadas) y administración por separado, en cuyo caso, la administración de la proteína de fusión de determinadas realizaciones puede ocurrir antes de, de manera simultánea y/o después de, la administración del agente terapéutico y/o adyuvante adicional.
J. Kits
En otra enseñanza divulgada, se proporciona un artículo de fabricación (por ejemplo, un kit) que contiene materiales útiles para el tratamiento de enfermedades cardíacas o afecciones cardíacas descritas anteriormente. El artículo de fabricación comprende un envase y una etiqueta o prospecto sobre o asociado al envase. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, bolsas de solución IV, etc. Los envases pueden formarse a partir de diversos materiales, tales como vidrio o plástico. El envase contiene una composición que está sola o combinada con otra composición eficaz para tratar, prevenir y/o diagnosticar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica).
La etiqueta o prospecto indica que la composición se usa para tratar la dolencia de elección. El artículo de fabricación puede comprender (a) un primer envase con una composición contenida en este, en donde la composición comprende una proteína de fusión ELA-32 o una proteína de fusión ELA-21; y (b) un segundo envase con una composición contenida en el mismo, en donde la composición comprende un agente terapéutico adicional. En determinadas enseñanzas, los kits pueden comprender además un prospecto que indique que las composiciones se pueden usar para tratar una afección particular. Como alternativa, o adicionalmente, el kit puede comprender además un segundo (o tercer) envase que comprende un tampón farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.
5. Sumario de resultados experimentales (incluyendo ejemplos de antecedentes relevantes o con fines comparativos)
El siguiente es un sumario de los resultados de los experimentos descritos en los ejemplos de la presente aplicación:
• ELA-32 activa las rutas de señalización APJ, induce la angiogénesis de las CEVUH humanas y relaja los vasos sanguíneos aórticos de ratón, estableciendo así que las rutas de señalización ELA-APJ se conservan y son funcionales en vertebrados.
ELA-32 se expresa solo en tejido renal adulto y células madre embrionarias y pluripotentes adultas inducidas. ELA-32 induce la internalización de APJ.
ELA-32 inhibe la producción de cAMP, induce la fosforilación de ERK 1/2 y provoca una rápida movilización de calcio de una manera dependiente de la dosis, lo que demuestra que los efectos de ELA sobre la señalización intracelular son dependientes de APJ.
ELA-32 se dirige a los vasos sanguíneos y ejerce un efecto angiogénico directamente a través de la activación de APJ.
ELA-32 relaja los vasos sanguíneos de una manera dependiente de la concentración con una relajación máxima del 73,7 % en los vasos con endotelio inalterado. La producción de óxido nitroso no es necesaria para la relajación mediada por ELA.
ELA-32 mitigó significativamente el grado de disfunción cardíaca y mejora el rendimiento cardíaco en un modelo de insuficiencia cardíaca inducida por IM.
El tratamiento con ELA-32 aumenta la diuresis.
El tratamiento ELA-32 protege contra la apoptosis de cardiomiocitos inducida por IM.
ELA-32 induce la relajación dependiente e independiente del endotelio en la aorta de ratón (in vivo).
ELA-32 suprimió significativamente la expresión génica de la aldosterona sintasa inducida por Ang II, que dio como resultado una reducción de los niveles de aldosterona y una mejora de la diuresis en ratones.
El tratamiento ELA-32 protege contra la apoptosis de cardiomiocitos inducida por IM.
La proteína de fusión Fc-ELA-32 mitiga el daño cardíaco inducido por IM mediante la reducción de la LFEDP y la fibrosis cardíaca.
Fc-Ela-32 y Fc-apelina-13 tienen una semivida en suero que varía entre 24 y 50 horas.
La proteína de fusión Fc-ELA-32 mitiga el daño cardíaco inducido por IM mediante la reducción de la LFEDP y la fibrosis cardíaca.
La proteína de fusión Fc-ELA-32 reduce la fibrosis cardíaca en un corazón infartado.
Fc-ELA-32 aumenta la proliferación de cardiomiocitos y reduce la apoptosis.
En estudios funcionales, Fc-Apelina-13 redujo los niveles de glucosa y mejora la sensibilidad a la insulina en ratones obesos.
6. Ejemplos
La invención se ilustra en el presente documento mediante los experimentos descritos por los siguientes ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.
Ejemplo 1: Materiales y métodos
Productos químicos
Se adquirió de GenScript (Piscataway, NJ) la forma madura del péptido ELA de 54 aminoácidos, un péptido de 32 aminoácidos, QRPVNLTMRRKLRKHNCLQRRCMPLHSRVPFP (SEQ ID NO: 1) y apelina-13, QRPRLSHKGPMPG (SEQ ID NO: 3), con más del 98 % de pureza. Otros productos químicos eran de Sigma (St. Louis, MO) a menos que se indique lo contrario.
Cultivo celular
Se obtuvieron células de ovario de hámster chino (CHO, por sus siglas en inglés) de ATCC (Manassas, VA) y se cultivaron en medio F12 de Ham complementado con suero bovino fetal (FBS) al 10 %, 100 pg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina. Se adquirieron células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH) de Lonza (Walkersville, m D) y se cultivaron en medio basal complementado con un suplemento de crecimiento de células endoteliales al 0,2 % (SCEn), 5 ng/ml de EGF humano recombinante, 50 pg/ml de ácido ascórbico, L glutamina 10 mM, 1 pg/ml de hemisuccinato de hidrocortisona, 0,75 U/ml de sulfato de heparina y FBS al 2%. Se usaron CEVUH entre los pases 3 y 5 para todos los experimentos.
Construcción de plásmidos
El ADNc de APJ humano se amplificó a partir de tejido graso humano mediante PCR con sitios de restricción NotI/SalI en el extremo 3' y se clonó en un vector pENTRa Gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA). La construcción de fusión EGFP-APJ se hizo mediante el ensamblaje de fragmentos de APJ y EGFP amplificados por PCR en pENTRa mediante clonación por infusión (Clontech, Mountain View, California). Para hacer el vector de destino lentivírico pSMPUW-CMV-DEST, se clonó un fragmento de CMV promotor-ccdB en el vector lentivírico universal pSMPUW (Cell BioLabs, San Diego, California). Se usó el protocolo de clonación estándar Gateway LR para generar pLenti-APJ o APJ marcado con EGFP usando LR Clonase II de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen). Todos los plásmidos de vectores lentivíricos se amplificaron en bacterias STBL3 (Invitrogen). Los insertos de ADNc de todas las construcciones se confirmaron mediante digestión con enzimas de restricción y análisis de secuencia de ADN.
Producción de lentivirus
Se cultivaron células HEK293T en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) que contenía FBS al 10 %, 100 pg/ml de estreptomicina y 100 U/ml de penicilina. Se permitió que las células alcanzaran el 90% de confluencia, momento en el que se transfectaron en presencia de DMEM con 1,2 pg de vector de transferencia, 1,2 pg de pCD/NL-BH*DDD (plásmido Addgene 17531) y 0,2 pg de pVSVG (Cell Biolabs) para cada pocillo de una placa de 6 pocillos usando Lipo0293 (Signal). Se eliminó el medio que contenía el complejo Lipo0293/ADN y se reemplazó con medio nuevo 16 horas después de la transfección. Se recogió el sobrenadante que contenía las partículas víricas a las 48 horas y 72 horas después de la transfección inicial, se combinó y se dividió en alícuotas para su almacenamiento a -80 °C. Los lentivirus utilizados para todos los experimentos tenían un valor mínimo de 5 X 105 UFI/ml.
Líneas celulares CHO estables que expresan APJ o APJ marcado con EGFP
Se sembraron células CHO a aproximadamente el 100% de confluencia en placas de 6 pocillos y se infectaron mediante exposición a sobrenadante lentivírico y polibreno (0,8 pg/ml, Millipore, Billerica, mA). Las células CHO se incubaron durante 16 horas, a continuación se reemplazó el sobrenadante vírico con medio de crecimiento CHO durante 8 horas. La infección vírica se realizó dos veces. Veinticuatro horas después de la segunda infección, las células se alimentaron con medio de crecimiento complementado con 1 pg/ml de puromicina y las células resistentes a puromicina se expandieron para estudios adicionales.
RT-PCR semicuantitativa
El ARN total se extrajo usando el reactivo TRJzol (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó utilizando el kit de transcriptasa inversa AMV (Promega, Madison, WI) a partir de 1 pg de ARN total y se utilizó para la detección de la expresión génica. Las secuencias del cebador y los tamaños esperados de los fragmentos fueron los siguientes: cebador directo de APJ en 5' 5-CTGGTGGTGACCTITGCCCTG-3' (SEQ ID NO: 7) y cebador inverso 5-AAAGCTGGGTCTAGAGTCGACCTAGTCAACCACAAGGGTCTCCT-3' (388 pb) (SEQ ID NO: 8), cebador directo de ELA 5-CTGAGGTITGTCACTAGAATGTGAA-3' (SEQ ID NO: 9) y cebador inverso 5'-TAAGCAATCACGCTGTTGGCATCA-3' (360 pb), (SEQ ID NO: 10) - cebador directo de actina 5'-AGAAAATCTGGCACCACACC-3' (SEQ ID NO: 11) y cebador inverso 5-GGGGTGTTGAAGGTCT CAAA-3' (142 pb) (SEQ ID NO: 12).
Ensayo de AMPc
Se midieron los niveles intracelulares de AMPc usando un ensayo de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia resuelto en el tiempo (TR-FRET, por sus siglas en inglés) con un kit de AMPc HTRF (Cisbio), como se describió anteriormente (10). Resumiendo, se sembraron células CHO que expresaban APJ a 20 pl/pocillo con 10.000 células en placas en blanco de 384 pocillos tratadas con cultivo de tejidos (Greiner BioOne). Después de la incubación durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %, se añadieron varias concentraciones de ELA sintético en el tampón de ensayo, seguido de solución de estimulación de forskolina (concentración final de 10 pM). La placa de ensayo se determinó en un modo TR-FRET utilizando el lector de placas Evision (PerkinElmer). La cantidad de AMPc se correlaciona inversamente con la relación de 665/615 nm.
Ensayo de fosforilación de ERK 1/2
Los niveles intracelulares de pERK1/2 se midieron usando el ensayo TR-FRET mediante un kit HTRF Cellular (Cisbio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se informó anteriormente (10). Resumiendo, después de la incubación durante la noche de células CHO de tipo silvestre o que sobreexpresan APJ, se reemplazó el medio de crecimiento con 100 pl/pocillo de medio Opti-MEM (ATCC) y se incubó durante 4 h adicionales. Las diversas concentraciones de e La se añadieron a la placa de ensayo y se incubaron 20 minutos a 37 °C con CO2 al 5 %, a continuación se aspiró el medio y las placas se colocaron en hielo durante 5 minutos seguido de la adición de solución de lisis celular (Triton X 100). A continuación, las placas se incubaron a temperatura ambiente con un suave balanceo (para mezclar) durante 15 minutos. Se transfirió una alícuota de 16 pl/pocillo de lisado celular a una placa en blanco de medio pocillo Greiner de 384 pocillos y 2 pl/pocillo del anticuerpo anti-ERK 1/2 conjugado con colorante d2 añadido, se incubaron en la oscuridad durante 2 horas, seguido de una adición de 2 pl/pocillo del anticuerpo anti-ERK 1/2 conjugado con criptato de europio. Después de la incubación durante la noche a temperatura ambiente en oscuridad, se midieron las placas usando el lector de placas EnVision en modo TR-FRET (excitación ~ 320 nm; emisión = 615/665).
Ensayo de calcio intracelular
Se midió el calcio intracelular usando el kit Fluo8 de ensayo de calcio sin lavado (AAT Bioquest) de acuerdo con las instrucciones del fabricante (10). Resumiendo, las células CHO que expresaban de manera estable APJ o el vector vacío se sembraron como antes y se incubaron durante la noche a 37 °C con CO2 al 5 %. Al día siguiente, se aspiró el medio de crecimiento y se añadió colorante cálcico. Después de la incubación durante 30 minutos a 37 °C y 30 minutos a temperatura ambiente, se añadió ELA a diversas concentraciones en tampón de ensayo y las placas de ensayo se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, las placas se colocaron en un lector de placas cinético de fluorescencia (uCell, Hamamatsu). La intensidad de fluorescencia basal se registró 10 veces a 1 Hz durante 10 segundos. Los resultados se normalizaron a la intensidad de fluorescencia basal promedio en proporción y se utilizó la respuesta máxima para el cálculo del resultado.
Análisis de transferencia de Western
Se homogeneizaron células CHO en tampón de lisis que contenía Tris-HCl 50 mM (pH 6,8) y SDS al 2 % con un cóctel de inhibidor de proteasa/fosfatasa recién añadido (Cell Signaling Technology, EE.UU.). El contenido de proteínas se determinó mediante un kit de ensayo de proteínas (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Cada muestra con la misma cantidad de proteínas se mezcló con 5 x tampón de muestras SDS, se hirvió durante 5 minutos y se separó en electroforesis de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio al 10 % (SDS-PAGE) antes de transferir las proteínas a una membrana de PVDF. A continuación, las membranas se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 hora con leche al 5% en solución salina tamponada con Tris-Tween (TBST), seguido de incubación posterior a 4 °C durante la noche en TBST que contenía los diferentes anticuerpos primarios (dilución 1:1000). Después de lavar tres veces con TBST, se incubaron las membranas durante 2 horas en TBST que contenía los anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (dilución 1:2000), seguido de un nuevo lavado con TBST 3 veces, a continuación, se sometió a detección mediante el sistema de quimioluminiscencia. La cinasa regulada por señales extracelulares (ERK 1/2 (por sus siglas en inglés), n.° de catálogo 9102) y la fósforo-ERK 1/2 (n.° de catálogo 9101) se adquirieron de Cell Signaling Technology (Danvers, MA), y el anticuerpo monoclonal de GAPDH conjugado con HRP (n.° de catálogo HRP-6004) de ProteinTech Corporation (Chicago, IL).
Ensayo de internalización
Las células HEK293 que expresan de forma estable el receptor de APJ marcado con EGFP se privaron de suero durante 24 horas, se trataron con ELA (500 nM) y se analizaron mediante microscopía fluorescente en directo a intervalos de tiempo después del tratamiento. Para el experimento de lavado, las células se incubaron con ELA durante 1 hora y continuación se reemplazaron con medio basal libre de suero, y se tomaron imágenes 1 hora y 4 horas después del lavado. Las imágenes confocales se realizaron con un microscopio Zeiss LSM510.
Ensayo de angiogénesis in vitro
El ensayo de formación de tubos para la angiogénesis se realizó en placas de 24 pocilios que se revistieron con 50 |j| de Geltrex (Life Technologies, A14133-02) y se dejaron para polimerización por incubación durante 1 hora a 37 °C. A continuación se sembraron CEVUH (10.000/pocillo, 3-5 pasajes) en medio basal (Lifeline, LM-0002) que contenía un complemento de crecimiento de células endoteliales (EnGS, Lifeline, LS-1018) con FGF (50 ng/ml) y/o diferente concentración de ELA (0,1, 0,5, 1 jM ) en Geltrex y se incubaron durante la noche a 30 °C con CO2 al 5 %. La cuantificación de la formación de tubos se realizó después de 10 horas de cultivo calculando el número de puntos de ramificación formados en cada pocillo bajo un fotomicroscopio de contraste de fase invertida (Olympus IX50) como se describió 37
Ensayos de vasorrelajación dependiente e independiente del endotelio
Se aislaron aortas de ratones C57BL/6 macho de tipo silvestre de 8 a 10 semanas de edad, cortadas en anillos de 3 mm y montadas en cámaras de órganos (PowerLab, AD Instruments, CO, EE.UU.) en tampón de Kreb como se describió anteriormente (11, 12). Se provocó la respuesta contráctil mediante el vasoconstrictor U46619 (30 nM) para producir la contracción. En la meseta de la contracción, se añadió ELA acumulativo o apelina-13 (10-810 M hasta 10-56 M) en el baño de órganos para inducir la relajación. En algunas preparaciones, el endotelio se eliminó mecánicamente de las arterias desnudas frotando suavemente la superficie de la íntima con una varilla de madera. Para determinar si el óxido nítrico participa en la relajación, se trató previamente la aorta con éster metílico de L-ngnitroarginina (L-NAME, por sus siglas en inglés) 1 mM durante 30 minutos, a contracción se indujo la contracción mediante U46619, seguido de ELA como se describe anteriormente. La eficacia de la eliminación del endotelio y la inhibición de la NOS se confirmaron más tarde mediante la incapacidad de la acetilcolina para relajar las arterias. Análisis estadístico
Los datos se expresaron como el promedio ± el error estándar del promedio (EEM). Los análisis estadísticos se realizaron mediante el uso de ANOVa de dos vías o la prueba t de Student. P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
Ejemplo 2. Distribución tisular de ELA y APJ en seres humanos
Se realizó análisis de RT-PCR de ELA y APJ en ADNc procedentes de múltiples tejidos humanos, incluyendo el corazón, riñón, cerebro, pulmón, estómago, páncreas y grasa con cebadores específicos para ELA o APJ y se realizó para determinar la distribución en tejidos de ELA en seres humanos, en comparación con APJ. Como se muestra en la figura 1, APJ se distribuye ampliamente y se expresa en los tejidos del corazón, cerebro, riñón, estómago, pulmón, tejidos adiposos y páncreas. Por el contrario, ELA se expresó solo en tejido renal adulto y células madre embrionarias y pluripotentes adultas inducidas (CME y CMPAi).
Ejemplo 3. Inducción de ELA de endocitosis APJ humana
Para investigar si ELA induciría la internalización de APJ, se sobreexpresó APJ como una proteína de fusión con proteína fluorescente verde mejorada (APJ-GFP, Figura 2B) mediante infección lentivírica en células HEK293. Se examinó su localización intracelular en respuesta al tratamiento con ELA. A nivel basal, la proteína de fusión se localizó principalmente en la superficie celular, con cierta expresión perinuclear detectada (Figura 2C). Después del tratamiento con ELA, las vesículas intracelulares en forma de puntos aparecieron a los 15 minutos (Figura 2C) y se hicieron más evidentes a los 30 minutos (Figura 2D). A los 60 minutos (Figura 2E), las vesículas intracelulares grandes y huecas (3-5 jm de diámetro) eran claramente visibles en el citoplasma. Las vesículas fluorescentes permanecieron en el citoplasma 1 hora (Figura 2F) y parecieron regresar a la superficie celular 4 horas (Figura 2G) después del lavado en células previamente tratadas con ELA durante 60 minutos.
Ejemplo 4. Supresión de la producción de AMPc, activación de ERK1/2 y movilización de calcio por ELA
Se sabe que la activación de APJ da como resultado una disminución de la producción de cAMP, estimulación de ERK y aumento de la movilización de calcio intercelular (13). Se investigó si ELA podría activar estas rutas de señalización. En los estudios se utilizaron células CHO-K1 de control de vector vacío y que sobreexpresan APJ. La expresión de APJ se confirmó mediante RT-PCR. Para los ensayos de AMPc, las células CHO-K1 se trataron previamente con concentraciones crecientes de ELA y, a continuación, con forskolina, agonista de adenilato ciclasa, para evaluar la actividad biológica de ELA para suprimir la producción de cAMP. Como se muestra en la figura 3A, ELA inhibió la producción de cAMP de una manera dependiente de la dosis con una CE50 de 11,1 nM. Además, se determinó en el mismo sistema celular que ELA era capaz de inducir la fosforilación de ERK 1/2 dentro de los 5 minutos de tratamiento. Este efecto duró 45 minutos como se reveló por análisis de Western (Figura 3B, panel superior). Se confirmó cuantitativamente el efecto de ELA sobre la fosforilación de ERK 1/2 mediante el ensayo de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia resuelto en el tiempo (TR-FRET). La figura 3B muestra que ELA estimuló ERK 1/2 de una manera dependiente de la dosis en el intervalo de concentración analizado de 10'1° a 10'6 M, con una CE50 de 14,3 nM. Finalmente, se investigó el efecto de ELA sobre la movilización de calcio intracelular. El tratamiento con ELA provocó una rápida movilización de calcio, alcanzó un máximo de 40 milisegundos de una manera dependiente de la dosis (Figura 3C, panel superior). La respuesta fue dependiente de la dosis hasta la concentración de 10-5 M (Figura 3C, panel inferior). Lo que es más importante, no se observaron cambios significativos en los experimentos de control en paralelo en los ensayos anteriores para células transducidas con virus de control de vector vacío. Por lo tanto, los efectos de ELA sobre la señalización intracelular eran dependientes de APJ.
Ejemplo 5. Efectos angiogénicos de ELA in vitro
ELA es una hormona secretada y expresada en el riñón y la próstata de adultos, y puede, por lo tanto, circulan en la sangre. Es necesaria para el desarrollo normal del sistema cardiovascular, sugiriendo que los vasos sanguíneos podrían ser una diana de la acción de ELA. El ensayo de formación de tubos vasculares es un estudio muy utilizado in vitro para evaluar factores y condiciones angiogénicas en las que las células vasculares, por ejemplo, células endoteliales vasculares de la vena umbilical humanas (CEVUH), pueden formar estructuras en forma de tubo en condiciones proangiogénicas en pocillos de cultivo recubiertos con Geltrex que contiene matriz extracelular. El número de puntos de ramificación fue un indicador de la fuerza de los estímulos angiogénicos. Como se ilustra en la figura 4, el tratamiento con ELA (0,5 j M) estimuló la formación de estructura tubular (Figura 4A). Cuantitativamente, el número de puntos de ramificación se incrementó de manera dependiente de la concentración en un 71,9%, 222,8% y 266,7% en presencia de ELA a las concentraciones de 0,1, 0,5 y 1 j M, respectivamente (Figura 4B). Para determinar si APJ medió el efecto angiogénico de ELA, se modularon los niveles de expresión de APJ mediante sobreexpresión o atenuación génica de APJ (Figura 4C) en CEVUH. En células que sobreexpresan APJ, ELA (0,1 j M) aumentó la formación tubular en un 190,2 % y un 63,3 %. A la inversa, ELA no fue eficaz para inducir la formación de estructuras tubulares en células con atenuación génica de APJ (Figura 4D). En conjunto, los resultados indican que ELA ejerce un efecto angiogénico directamente a través de la activación de APJ.
Ejemplo 6. Relajación de los vasos sanguíneos por ELA
Se informa que la apelina relaja el tono vascular (14) y reduce la presión arterial. Se investigó si ELA regularía el tono vascular utilizando anillos aórticos de ratón con endotelio inalterado o sin endotelio (desnudos). Se indujo la contracción de los anillos aórticos con el vasoconstrictor U46619 (concentración final, 30 nM). En la meseta de la contracción, se añadió ELA o apelina-13 (10-9 a 10-6 M) para inducir la relajación. Como se muestra en la figura 5A, la incubación con ELA relajó el vaso sanguíneo de una manera dependiente de la concentración con una relajación máxima del 73,7 % en los vasos con endotelio inalterado. De manera destacable, solo se observó aproximadamente un 20 % menos de relajación en los vasos desnudos a las concentraciones correspondientes, lo que indica una relajación independiente del endotelio por ELA.
Para determinar más a fondo si el óxido nítrico (ON) participó en la relajación, los vasos sanguíneos se trataron previamente con L-NAME, un inhibidor de la producción de ON. No se observaron diferencias significativas entre los vasos tratados con L-NAME y los no tratados, lo que indica que la producción de ON no era necesaria para la relajación mediada por ELA (Figura 5B). El efecto de la apelina-13 en los vasos sanguíneos se estudió en paralelo para su comparación. La apelina-13 indujo la relajación de los vasos sanguíneos en los vasos con endotelio inalterado con una relajación máxima del 79 % a 10-6 M, pero la eliminación del endotelio atenuó su efecto relajante en gran medida entre un 48 % y un 31 % (Figura 5C), lo que indica que la apelina-13 inducía la relajación de los vasos en gran parte de una manera dependiente del endotelio que el e La .
Ejemplo 7. Expresión de ELA en el riñón y su papel en la regulación de la homeostasis de los líquidos corporales. Se estudió la cuestión de si ELA-APJ promueve las células madre pluripotentes humanas (CMP) en derivados del mesodermo, incluyendo las células madre mesenquimales, los adipocitos y los cardiomiocitos. Se encontró que ELA es un potente inductor de la diferenciación de cardiomiocitos a partir de CMP (datos no mostrados). Curiosamente, ELA se expresó de forma selectiva y elevada en el riñón. Sin quedar limitados a la teoría, el riñón es un órgano crucial que mantiene la homeostasis de la circulación. ELA es una hormona paracrina y/o endocrina que regula el sistema circulatorio. Los estudios preliminares indicaron que la expresión de ELA se ubica en células del conducto colector cortical y la expresión de ELA es aproximadamente 100 veces mayor que la de la apelina en el riñón. Además, el tratamiento con ELA de células HAC15, una línea celular de células corticosuprarrenales suprimió y antagonizó la aldosterona sintasa CYP11B2 inducida por angiotensina. Los datos indicaron que ELA probablemente era una hormona diurética. Se encontró que la infusión exógena de ELA mejora la función cardíaca posterior a un IM. Por lo tanto, ELA es una hormona renal que regula el sistema circulatorio.
A nivel sistémico, el corazón, el riñón y la vasculatura comprenden un sistema cerrado y mantienen la homeostasis de los líquidos y la presión arterial a través de la regulación hormonal del volumen de líquidos, la tensión de la vasculatura y la contractilidad del corazón. Por ejemplo, el corazón secreta péptido natriurético auricular (PNA) para dilatar los vasos sanguíneos y reducir la carga de agua y sodio para reducir la presión arterial (13), mientras que las células renales secretan renina, que convierte el angiotensinógeno en angiotensina para elevar la presión arterial y modular la función cardíaca (14). Se informa que el receptor de apelina inhibe el receptor de angiotensina II a través de la transinhibición alostérica (15). Se encontró que ELA suprimió la aldosterona sintasa inducida por angiotensina II en líneas celulares adrenocorticales. Esta nueva hormona renal actúa en oposición a la angiotensina en el riñón.
La administración crónica de ELA mitiga los cambios en la dimensión telesistólica del VI (LVDs) y la fracción de eyección del VI (LVEF) en la semana 1 y 5 después de la ligadura coronaria crónica en ratones, lo que indica sus efectos cardioprotectores frente a la remodelación y disfunción postinfarto. Con este objetivo, se propone realizar estudios exhaustivos para determinar (1) la evolución temporal de los efectos cardioprotectores tras la ligadura coronaria. Se investigó si ELA exógeno protege al corazón en la fase de isquemia aguda y/o en la fase de remodelación crónica y (2) los mecanismos celulares subyacentes. Se planteó la hipótesis de que el ELA exógeno protege el corazón a través de sus efectos beneficiosos sobre la inflamación del miocardio, la muerte celular, la hipertrofia y la angiogénesis. Estudios anteriores han demostrado que apelina-13 activa APJ miocárdico. Por lo tanto, la apelina-13 se incluyó para la comparación.
Se indujo infarto de miocardio (IM) mediante ligadura de arterias coronarias en ratones. La operación simulada (op. simulada) se utilizó como control. Cada grupo de animales recibió ELA, vehículo o infusión de apelina-13 a través de una minibomba. Se realizó una ecocardiografía durante los estudios y al final de los estudios en animales se realizaron el análisis del circuito presión-volumen (circuito pv), la histología, las recolecciones de tejido. Para analizar la expresión de la proteína peptídica de ELA, se produjeron anticuerpos policlonales en conejos (AbboMax, San José, CA). Los estudios de iHc mostraron que los anticuerpos reaccionaron de forma cruzada con preparaciones de tejido de riñón de ratón, rata y ser humano y tiñeron las estructuras de los túbulos. Para investigar la posible función endocrina de ELA, se trató la línea celular de carcinoma cortical suprarrenal humano HAC15 con ELA, apelina-13 y angiotensina II solos o en combinación. Las figuras 6A-6C muestran la expresión y función endocrina de ELA en el riñón. En la figura 6A, la inmunohistoquímica de ELA en el riñón de rata muestra que las células teñidas positivamente incluyen túbulos colectores corticales y túbulos contorneados distales que no están en túbulos proximales. En la figura 6B, se analizó la expresión génica mediante qPCR en la línea celular de carcinoma cortical suprarrenal humano HAC15, que se había tratado con ELA (50 nM), apelina-13 (50 nM) o angiotensina II (Ang II, 10 nM) solos o en combinación durante 47 horas. *, *p < 0,05. ELA suprimió significativamente la expresión génica de la aldosterona sintasa inducida por Ang II, lo que sugiere que un antagonismo de ELA a Ang II en la glándula suprarrenal. La figura 6C revela el análisis de transferencia Western de ELA recombinante secretado en el medio de células 293 HEK que sobreexpresan ELA humano.
Ejemplo 8. ELA mejora el rendimiento cardíaco en el modelo de insuficiencia cardíaca inducida por infarto de cardiomiocitos (IM)
Se utilizaron ratones C57/BL de tipo silvestre de 14 a 16 meses de edad. Se sometieron los ratones a IM mediante ligadura permanente o tratamiento simulado con una sutura suelta de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (ADAI) proximal bajo anestesia general mediante inhalación de isoflurano al 2 % y ventilación mecánica mediante intubación oral. Se realizó toracotomía izquierda en el espacio intercostal 3-4 y se abrió el pericardio para exponer el VI y la ADAI. Se rodeó la arteria con una sutura de seda 8-0 y a continuación se ligó permanentemente o se mantuvo suelta (simulado).
Se utilizaron de doce a 14 ratones en cada grupo. Se infundió ELA a la misma dosis y velocidad que se aplicó anteriormente y se utilizó la misma cantidad molar de apelina-13 para comparar la equivalencia cardioprotectora. Se cargaron los péptidos o vehículo (PBS) con una minibomba (Modelo 1007D, Alzet), que se reemplazaron cada semana.
Se estudiaron cuatro puntos temporales, incluyendo 24 horas, semanas 1, 4 y 12 después de las cirugías de supervivencia. Este período de tiempo abarca generalmente toda la evolución natural de la remodelación posterior al infarto. Todos los ratones recibieron ecocardiografía en los cuatro puntos temporales. El análisis del circuito de presión-volumen se realizó inmediatamente después de la última ecocardiografía. Al final del análisis del circuito PV, se recogieron muestras de sangre y tejido y se sacrificó a los animales. Los corazones se extirparon rápidamente, se diseccionaron en regiones de infarto, peri-infarto y no infarto, y a continuación se congelaron instantáneamente por separado para análisis adicionales de histología, proteínas y ARN. Para el análisis inmunohistoquímico, se detuvieron corazones enteros en diástole con 1 mol/l de KCl y a continuación se fijaron en formalina al 10 % o se embebieron en un compuesto de temperatura de corte óptima (TCO) y se congelaron instantáneamente.
Ecocardiografía
Los animales se sedaron ligeramente con isoflurano al 1,2-1,5% y se obtuvieron imágenes en modo M transtorácicas guiadas en 2D del VI y la aorta ascendente, así como imágenes Doppler de onda de pulso del flujo aórtico ascendente y el flujo de entrada de la válvula mitral utilizando un sistema de ultrasonido de alta frecuencia (Vevo 2100, VisualSonics, Toronto, Canadá), respectivamente a través de vistas paraesternales largas o cortas, vista de la muesca esternal superior y vista apical de 4 cámaras. Los datos se calcularon con las fórmulas aceptadas, que han sido validadas en ratones.
Histología del tamaño del infarto y fibrosis
Los corazones se cortaron en rodajas de 5 pm tras la fijación con formalina al 10 % y la inclusión en parafina. Las secciones se desparafinaron, rehidrataron y tiñeron con tricrómico de Masson. Se obtuvieron imágenes digitales de la pared libre del VI utilizando un microscopio Zeiss equipado con el programa informático AxioVision (Carl Zeiss Imaging Solutions). Las imágenes se utilizaron para la medición del área de sección transversal de cardiomiocitos y el área de fibrosis utilizando el programa informático ImageJ. Se midieron al menos 100 cardiomiocitos seleccionados al azar por corazón y se promediaron sobre el número de células. El área de fibrosis se midió en más de 20 cuadrados de campo seleccionados al azar (1 mm2) por corazón y se presenta como un porcentaje del área total.
La ligadura de la arteria coronaria (LAC) es un procedimiento muy utilizado para crear un modelo de ratón de infarto agudo de miocardio (IM) e insuficiencia cardíaca (IC). Se investigó si ELA tendría efectos cardioprotectores en ratones C57/BL de 14-16 meses de edad. Se infundió ELA o vehículo (PBS) a los grupos de ratones LAC o de operación simulada simultáneamente a partir del procedimiento durante 5 semanas. Se realizó una ecocardiografía para acceder a la función cardíaca antes del procedimiento (situación inicial) y 1 semana y 5 semanas después del IM. Como cabía esperar, el IM dio como resultado dilatación (es decir, remodelación) del ventrículo izquierdo y disfunción contráctil, como lo indicaba un aumento del tamaño de la cámara del ventrículo izquierdo (LVDs y LVDd) y una disminución de la fracción de eyección del ventrículo izquierdo (LVEF) y el acortamiento fraccional (FS_LVD) (véanse la tabla 1 y las figura 7A-7C).
VEH ELA
Valor inicial Semana 5 Valor inicial Semana 5
PC (g) 29,29 ± 1,20 29,35 ± 0,70 32,40 ± 1,76 32,73 ± 1,38
FC (lpm) 420,22 ± 33,01 447,83 ± 31,50 474,75 ± 27,24 505,14 ± 12,73 LVDs (mm) 2,58 ± 0,13 3,95 ± 0,30** 2,68 ± 0,11 3,47 ± 0,16* LVDd (mm) 3,83 ± 0,14 4,69 ± 0,25** 3,87 ± 0,20 4,48 ± 0,17* LVPWs (mm) 1,07 ± 0,09 0,89 ± 0,06 1,01 ± 0,04 0,97 ± 0,04 LVPWd (mm) 0,78 ± 0,09 0,68 ± 0,05 0,70 ± 0,03 0,75 ± 0,05
IVS (mm) 1,16 ± 0,08 0,81 ± 0,11 0,99 ± 0,04 0,96 ± 0,11
IVSd (mm) 0,74 ± 0,06 0,61 ± 0,09 0,61 ± 0,05 0,73 ± 0,07
FS_LVD (%) 32,56 ± 2,23 16,19 ± 1,83*** 29,65 ± 4,16 22,68 ± -| 21 **
FS_LVPW (%) 28,54 ± 3,81 23,39 ± 2,54 30,36 ± 3,65 22,46 ± 4,49
LVEF (%) 61,10 ± 3,15 33,91 ± 358** 61,84 ± 7,39 45,65 ± 2,16*
De manera destacable, ELA mitigó significativamente el grado de dilatación del ventrículo izquierdo y disfunción contráctil (Tabla 1 y figuras 7A-7C). No hubo diferencia estadística en el rendimiento cardíaco en los animales de operación simulada entre el vehículo y el tratamiento con ELA. Tres de los nueve ratones de control murieron, mientras que uno de los ocho ratones tratados con ELA murió durante el período experimental de un mes, aunque no hubo diferencia estadística entre los dos grupos, probablemente debido al pequeño tamaño de la muestra estudiada. Estos resultados muestran claramente que ELA tiene efectos cardioprotectores sobre la progresión de la insuficiencia cardíaca después de un IM agudo.
Ejemplo 9. ELA es antiapoptótico en cardiomiocitos humanos diferenciados a partir de células madre pluripotentes humanas
Los mecanismos celulares de cardioprotección en IM incluyen la menor muerte celular debido a necrosis y apoptosis, aumento de la angiogénesis y reducción de la fibrosis. Se encontró que la activación de la señalización ELA-APJ es proangiogénica mediante la estimulación de la formación de túbulos en las células endoteliales de la vena umbilical humana (CEVUH). Se informa que la apelina protege contra la apoptosis inducida por la privación de glucosa en cardiomiocitos de rata neonatales y aumenta la fosforilación de Akt y mTOR. Se estudiaron las posibles actividades antiapoptóticas de ELA en cardiomiocitos en hipoxia, procedentes de la diferenciación de células madre pluripotentes humanas. El ensayo TUNEL muestra que el tratamiento de los cardiomiocitos humanos con ELA (0,5 |jM) redujo significativamente el número de células teñidas (Figura 8A-Figura 8B). Por lo tanto, ELA protege contra la apoptosis inducida por hipoxia in vitro.
Ejemplo 10. Regulación del ARNm de ELA en ratones
Se extrajeron ARN de riñón del riñón de ratón con dieta normal Chow, baja o alta en sodio (0,30 %, 0,11 % y 3,15 % de sodio respectivamente), y de ratón con IM u operación simulada. Se realizaron qPCR para ELA, apelina y/o APJ. El nivel de ARNm de ELA en el riñón disminuyó al 50 % en el grupo con bajo contenido de sal y hasta un 30 % en el grupo con alto contenido de sal en comparación con los ratones con dieta Chow normal (Figura 10). Se detectó ARNm de ELA en el corazón del ratón, pero fue significativamente menor que en el riñón. El nivel de ARNm de ELA fue significativamente más bajo en ratones con IM en comparación con ratones de la misma edad y sexo con operaciones simuladas cuando se les infundió vehículo o ELA. (Figura 11). La expresión de apelina es aproximadamente 100 veces menor que ELA en el riñón y está significativamente disminuida en ratones con IM. No se encontraron diferencias entre ratones con IM y ratones de control simulado, pero APJ tendió a disminuir en ratones tratados con ELA (Figuras 12A-12B).
Ejemplo 11. ELA mejora la diuresis en ratones
Se anestesiaron cuatro ratones C57/BL6 machos de 10 a 12 semanas de edad con pentobarbital y a continuación se colocaron sobre una mesa calentada para mantener la temperatura corporal y se traqueotomizaron. Se insertaron catéteres en las venas yugulares externas para infundir solución salina normal para reemplazar la pérdida de líquido y la anestesia, y en la arteria carótida para medir la presión arterial y la frecuencia cardíaca. La orina se recogió mediante una cistostomía suprapúbica (extremo con reborde de PE-50). Después de un período de estabilización de 30 minutos, se recogió la orina durante un período de una hora como volumen de referencia. A continuación, se inyectó ELA mediante inyección intravenosa (200 nmol/kg en 100 pl de solución salina en un minuto) y se recogió la orina durante un período adicional de una hora. Como se muestra en la figura 13, el volumen de orina aumentó aproximadamente una vez después de la administración de ELA (p < 0,05).
Se trataron células HAC15 humanas, una línea de carcinoma cortical suprarrenal, con ELA, apelina-13 y angiotensina II solos o en combinación. La figura 14 muestra que ELA suprimió significativamente la expresión génica de la aldosterona sintasa inducida por Ang II. Estos resultados indican que ELA puede ejercer una actividad anticardíaca mediante la reducción del nivel de aldosterona.
Ejemplo 12. La proteína de fusión ELA-Fc mitiga el daño cardíaco inducido por IM
Se diseñó una proteína de fusión que consistía en, desde el extremo N al extremo C, la señal secretora de plasminógeno tisular humano (htPA-SS), el dominio Fc de inmunoglobulina humana (un transportador de proteína de fusión bien utilizado) y ELA-32 o ELA-21 (Figura 15) en un vector de expresión.
El vector en cuestión se introdujo en células HEK293 para producir la proteína de fusión en el sobrenadante para purificación por cromatografía de afinidad con proteína A y la proteína de fusión resultante se usó para estudios funcionales en células y animales. Como se representa en las figuras 16A-16C, el tratamiento de las células HEK293 que sobreexpresan el receptor de apelina (APJ)-EGFP con Fc-32 (0,2 j M) o Fc-21 (0,2 j M) durante 30 minutos provocó la translocación o endocitosis del receptor en el citoplasma, lo que indicó una activación de APJ por el ligando. A continuación, se administró Fc-32 a un ratón por vía subcutánea y se recogió sangre para la medición del nivel en suero mediante transferencia Western. Los datos farmacocinéticos para Fc-ELA-32 y Fc-Apelina se muestran en las figuras 17A-17C. En la figura 18, Fc-ELA-32 se elevó de forma aguda 2 horas después de la administración subcutánea y duró hasta 72 horas a un nivel superior a 0,5 jg/ml.
Se estudió si las proteínas de fusión Fc-ELA tienen actividades cardioprotectoras en la insuficiencia cardíaca causada por infarto de miocardio (IM) en ratas. Se causó IM por la ligadura estándar de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAC) en ratas Sprague-Dawley (8 semanas de edad, machos). Una semana después de la operación, se administró proteína Fc-ELA-32 recombinada mediante inyección subcutánea a la dosis de 300 jg/kg de peso corporal/día durante dos semanas. Se usó solución salina tamponada con fosfato (PBS) como control. Una semana después de la administración o al final de las cuatro semanas del IM, se evaluó el rendimiento cardíaco mediante un transductor de presión que se insertó de manera retrógrada desde la arteria carótida derecha a la cavidad del ventrículo izquierdo. Se tomaron muestras de tejido cardíaco y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 24 horas y a continuación se embebieron en parafina y se seccionaron para examen histopatológico. Después de un infarto de miocardio (IM), la PTDVI puede estar elevada en asociación con un infarto de mayor tamaño y un aumento del volumen circulatorio. Las figuras 19A-19B muestran que la administración de Fc-ELA-32 disminuyó la PTDVI, lo que indica una mejora del corazón disfuncional.
Ejemplo 13. ELA reduce la fibrosis cardíaca
Se evaluó la apoptosis mediante el marcaje del extremo de la muesca dUTP mediado por la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL, por sus siglas en inglés) y el ensayo de actividad de caspasa-3. La tinción TUNEL y la contratinción con verde de metilo se realizaron utilizando kits de detección de apoptosis TdT-FragEL (Calbiochem, San Diego, California). Los núcleos positivos para TUNEL en la pared libre del VI se contaron dentro de un cuadrado de campo de 4 mm2. El número se promedió en cuatro campos seleccionados al azar por sección y cinco secciones por corazón.
La tinción de Masson, que tiñe específicamente los colágenos de azul, se realizó en secciones de tejido del área cardíaca infartada. La fracción de volumen de colágeno (FVC) se calcula dividiendo el área teñida de azul, que se dispersó entre los miocitos supervivientes y alrededor de los vasos sanguíneos, por el área total. Como se muestra en las figuras 20A-20B, la FVC se redujo significativamente en un 50 % en el corazón tratado con Fc-ELA-32 que en el corazón de control, lo que indica que Fc-ELA suprime la fibrosis del corazón infartado.
Ejemplo 14. ELA aumenta la proliferación de cardiomiocitos y reduce la apoptosis
Para comprender el mecanismo del efecto cardioprotector en el corazón con IM, se realizó tinción inmunofluorescente en preparaciones de tejido cardíaco para examinar las respuestas de los cardiomiocitos al tratamiento con ELA. Para examinar la proliferación de cardiomiocitos, se tiñeron las secciones de tejido con anticuerpo monoclonal de ratón contra el antígeno nuclear de células proliferantes (ANPC), un marcador de proliferación celular (síntesis y reparación de ADN) y anticuerpo policlonal de conejo contra la troponina-T, un marcador de cardiomiocitos. Como se revela en la Figura 21A-Figura 21B, se tiñeron más cardiomiocitos en los ratones tratados con Fc-ELA-32 mediante ANPC, en comparación con las ratas de control, lo que indica que ELA puede aumentar la proliferación de cardiomiocitos cerca de la región del infarto.
El marcaje del extremo de la muesca dUTP de la desoxinucleotidil transferasa terminal (TUNEL) es un método para detectar la fragmentación del ADN mediante el marcaje del extremo terminal de los ácidos nucleicos y se utiliza bien para medir la apoptosis celular. Se incubaron secciones de corazón en la proteinasa K de 20 pg/ml a 37 °C durante 30 minutos, y a continuación se incubaron en el tampón de detección TUNEL durante 60 minutos. Como resultado, las células apoptóticas se marcaron mediante fluorescencia verde. Las figuras 22A-22B muestran que el corazón tratado con ELA tiene muchas menos células marcadas en verde, lo que indica que el tratamiento con ELA protege contra la apoptosis de cardiomiocitos inducida por IM.
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Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un péptido en una forma farmacéuticamente aceptable, para usar en un método para tratar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca, estando seleccionando el péptido del grupo que consiste en:
(a) una proteína de fusión Elabela de SEQ ID NO: 4 (Fc-ELA-32),
y
(b) un fragmento, o una variante, o un derivado de la misma que es al menos un 95 % idéntico a los péptidos de (a).
2. El péptido para usar en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la afección cardíaca o el factor de riesgo para la afección cardíaca se selecciona del grupo que consiste en: infarto de miocardio, apoptosis de cardiomiocitos inducida por infarto de miocardio, insuficiencia cardíaca inducida por infarto de miocardio, fibrosis inducida por infarto de miocardio.
3. El péptido para usar en un método de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el sujeto es un mamífero, particularmente un ser humano.
4. El péptido para usar en un método de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde el péptido se administra solo o en combinación con un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en: un inhibidor de la ECA, un antagonista de aldosterona, un bloqueante de los receptores de la angiotensina, un betabloqueante, un bloqueante del canal calcio, un fármaco para reducir el colesterol, una digoxina, un diurético, un fármaco para reducir la glucosa, potasio o magnesio, un antagonista de la vasopresina y warfarina.
5. El péptido para usar en un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el sujeto que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca es diabético.
6. El péptido para usar en un método para tratar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el método:
(i) identificar a un sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca;
(ii) medir en una muestra una cantidad de un péptido de SEQ ID NO: 1, en el torrente circulatorio del sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca;
(iii) medir en una muestra una cantidad de un péptido de SEQ ID NO: 1, en el torrente circulatorio de un sujeto normal de control;
(iv) comparar las cantidades del péptido de SEQ ID NO: 1, en el sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca y en el sujeto normal de control; y
(v) tratar al sujeto con una composición que comprende una proteína de fusión Elabela de SEQ ID NO: 4 o un fragmento, o una variante o un derivado de la misma que es al menos un 95 % idéntico al SEQ ID NO: 4, cuando la cantidad de péptido del sujeto que padece una afección cardíaca o que tiene un factor de riesgo de desarrollar una afección cardíaca ha disminuido significativamente con respecto a la del sujeto normal de control.
7. Una proteína de fusión que comprende desde el extremo N al extremo C, (i) un péptido señal de secreción de plasminógeno tisular humano, (ii) un dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina, opcionalmente una molécula de inmunoglobulina humana, (iii) una región bisagra, y (iv) un péptido de SEQ ID NO: 1, o un fragmento, o una variante o un derivado del mismo que es al menos un 95 % idéntico al péptido, opcionalmente en donde dicha región bisagra comprende al menos 5, preferentemente 16 aminoácidos, como máximo 20 aminoácidos.
8. Un polinucleótido que codifica la proteína de fusión de la reivindicación 7.
9. Un vector, particularmente un vector de expresión, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.
10. Una célula hospedadora, opcionalmente una célula de mamífero, que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8 o el vector de la reivindicación 9.
11. Un método para producir la proteína de fusión de la reivindicación 7 desde el extremo N al extremo C, que comprende (i) un péptido señal de secreción de plasminógeno tisular humano, (ii) un dominio Fc de una molécula de inmunoglobulina, (iii) una región bisagra, y (iv) un péptido seleccionado del grupo que consiste en un péptido de SEQ ID NO: 1, o un fragmento, o una variante o un derivado del mismo que es al menos un 95% a los péptidos, que comprende las etapas de (a) cultivar la célula hospedadora de la reivindicación 10 en condiciones adecuadas para la expresión de la proteína de fusión, y (b) recuperar la proteína de fusión.
12. Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Un método para activar selectivamente cardiomiocitos in vitro, que comprende poner en contacto dichos cardiomiocitos con la proteína de fusión de la reivindicación 7, opcionalmente, en donde dicha activación comprende la estimulación de la proliferación de cardiomiocitos.
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