ES2842526T3

ES2842526T3 - Utilización de un anticuerpo dirigido contra BDCA-2 para tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias

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Publication number: ES2842526T3
Application number: ES17159253T
Authority: ES
Inventors: Nathalie Fournier; Romeuf Christophe De
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2010-12-13
Filing date: 2011-12-12
Publication date: 2021-07-14
Anticipated expiration: 2031-12-12
Also published as: DK2651978T3; EP3438129A1; EP2651978B1; WO2012080642A1; EP3190127B1; ES2636969T3; EP3190127A1; AR084263A1; EP2651978B2; ES2823201T3; FR2968561B1; EP3438129B1; FR2968561A1; US20130315820A1; EP2651978A1

Abstract

Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización en la prevención o el tratamiento de las patologías que implican una activación de células dendríticas plasmacitoides, siendo dichas patologías unas enfermedades autoinmunes o unas enfermedades inflamatorias, presentando dicho anticuerpo un porcentaje de fucosilación inferior al 60% de las formas glicosiladas, e implicando dicho anticuerpo una destrucción de las células DC plasmacitoides por el mecanismo de ADCC.

Description

DESCRIPCIÓN

Utilización de un anticuerpo dirigido contra BDCA-2 para tratar enfermedades autoinmunes o inflamatorias

La presente invención tiene por objeto la utilización de un anticuerpo dirigido contra una proteína membranaria, y especialmente para el tratamiento de patologías.

Los anticuerpos utilizados en clínica, con el objetivo de regular una patología autoinmune o inflamatoria son, en la ^{actualidad, principalmente los anticuerpos anti-CD}20 ^{y en particular el anti-CD Rituxan. El problema asociado a este}tipo de tratamiento se debe al hecho de que los anti-CD20 eliminarán el conjunto de las células pre-B y linfocitos B maduros, pero también aproximadamente el 20% de los plasmocitos y una población de linfocitos B memoria (Gonzales-Stawinski Clin Immunol 2001,98, 175; Looney, Ann rheum dis 2002, 61, 863) pudiendo así conducir a un estado inmunodeficiente asociado a una hipogamaglobulemia.

Existe, por lo tanto, la necesidad de encontrar una alternativa a esta depleción B disminuyendo el número de células dendríticas plasmacitoides, células clave para el inicio de la respuesta inmune patológica y, por lo tanto, atenuar la respuesta inmune del paciente y, en consecuencia, de células B auto-reactivas.

Las células dendríticas (en inglés “dendritic cells” o DC) son unas células del sistema inmunitario presentadoras de antígenos (CPA) que pertenecen al sistema reticulohistiocitario. Bajo ciertas condiciones, las células DC presentan unas prolongaciones citoplásmicas similares a las dendritas de las neuronas.

Las células dendríticas tienen dos funciones principales:

- la activación de la respuesta inmunitaria adaptativa, cuyos componentes principales son los linfocitos T y los linfocitos B, dirigida contra unos antígenos del “no propios”.

- el mantenimiento de la tolerancia central al “propio organismo” en el timo, mediante el proceso que implica los linfocitos T denominado de selección negativa.

Se han caracterizado numerosas subpoblaciones de células DC en el ratón, sin que se haya identificado ninguna correspondencia en el hombre.

Las DC son capaces de diferenciarse en diversos sub-tipos, según los estímulos que reciben. Existen dos grandes tipos de células DC: las células DC convencionales, las células DC plasmacitoides y las células DC inflamatorias. Las células DC convencionales comprenden:

- las células DC migratorias que residen, en estado basal, en la periferia. Tras la fagocitosis de una partícula antigénica y/o la recepción de señales, éstas migran hacia los ganglios linfoides secundarios por medio de vasos linfáticos; llegan en estado maduro a los órganos linfoides, en los que presentan el antígeno a los linfocitos T naíve; se pueden citar, por ejemplo, unas células de Langerhans o también las células D de las mucosas;

- las células DC inmaduras residentes de los órganos linfoides; estas células recogen y presentan los antígenos del propio organismo o extraños dentro mismo de los órganos linfoides; se trata de la mayoría de las células DC del timo o del bazo.

Las células DC inflamatorias se reclutan en los tejidos tras una inflamación o una infección, pero no se presentan jamás fuera de cualquier estimulación. Se supone actualmente que las células DC inflamatorias procederían principalmente de la diferenciación de los monocitos sanguíneos.

Las células DC plasmacitoides difieren de las células DC convencionales en que son circulantes, redondas y sin dendritas en el estado basal, a pesar de que terminan por diferenciarse en DC convencionales después de la activación. Por lo tanto, son capaces de presentar el antígeno.

Después de la estimulación, en general por un antígeno viral, producen una gran cantidad de interferones (IFN) de clase I. Estas células están implicadas esencialmente en la respuesta anti-viral y en los desórdenes autoinmunes. Las células DC plasmacitoides (también denominadas células DC plasmacitoides) se han caracterizado fenotípicamente: expresan los marcadores CD4 y BDCA-2 y 4. Su fenotipo es, por lo tanto, CD4+, CD11c-, Lin-, BDCA-2+, BDCA-4+.

Las células DC plasmacitoides pueden ser el origen de tumores hematopoyéticos, en los que adquieren un marcador suplementario que es el CD56+. Es por ello que se habla de tumores hematopoyéticos CD4+/CD56+ (en inglés BPDCN: Blastic plasmacytoid dendritic cells neoplasm).

Los tumores hematopoyéticos CD4+/CD56+ son unos neoplasmas hematológicos raros (1% de las leucemias agudas), que se presentan en forma de nódulos cutáneos asociados a una linfo-adenopatía o a una inflamación del bazo y a una citopenia frecuente. Estas manifestaciones cutáneas van seguidas muy rápidamente por una infiltración de la médula ósea. Debido a la expresión del marcador CD56+, estas patologías se han clasificado, en primer lugar, en los linfomas de células NK. Pero la ausencia de marcadores de líneas mieloides, linfoides T o B o NK ha suscitado unos estudios complementarios que han permitido afinar la clasificación para finalmente revelar que las células dendríticas denominadas de tipo II o células DC plasmacitoides son el origen de los tumores hematopoyéticos CD4+/CD56+ [Chaperot L etal., 2001, Blood. 15 de mayo de 2001 ;97(10):3210-7, Herling M, Jones D., 2007, Am J Clin Pathol. Mayo de 2007;127(5):687-700].

El tratamiento actual de estas patologías se basa en la quimioterapia, que permite una remisión completa para 2 pacientes de cada tres aproximadamente, pero en los que las recaídas son frecuentes y precoces (aproximadamente 9 meses). La media de supervivencia global es de 13 meses aproximadamente. Otra alternativa de tratamiento es el aloinjerto de células hematopoyéticas, que no permite, sin embargo, tampoco una supervivencia a largo plazo.

En consecuencia, existe en la actualidad una necesidad real de encontrar un tratamiento para estas patologías CD4+/CD56+.

En la técnica anterior se proponen unos medios de tratamiento de estas patologías que implican unas células que expresan unos marcadores de las células dendríticas.

En particular, se han propuesto unas moléculas que tienen como objetivo los marcadores de diferenciación BDCA.

Se puede citar, por ejemplo, la patente europea EP 1301 539 que describe un polipéptido de secuencia particular que se une específicamente a la proteína BDCA-2 y una composición farmacéutica que lo comprende.

La solicitud de patente europea EP 1783 141 divulga una composición que permite inducir una respuesta inmunitaria en un paciente, comprendiendo dicha composición unas células dendríticas previamente tratadas con un anticuerpo anti-BDCA-2 y que expresa un antígeno (tumoral, viral, bacteriano, etc.). Esto consiste en un tratamiento por terapia celular.

La solicitud WO 01/365487 describe unos anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína BDCA-2, y en particular los clones AC144, AD5-13A11 y AD5-4B8, así como unos fragmentos derivados. Por otro lado, esta solicitud describe la utilización de los anticuerpos monoclonales para el tratamiento de patologías tales como las infecciones virales, las enfermedades autoinmunes y los tumores.

La solicitud WO 2006/037247 describe la utilización de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína BDCA-2^{, en el ámbito del tratamiento de una enfermedad autoinmune particular: la psoriasis.}

Nestle et al., (Nestle et al. 2005, J. Exp. Med, vol 202, n°1, p.: 135-143) enseñan que unos anticuerpos dirigidos contra la proteína BDCA-2 se pueden inyectar por vía intravenosa, con un objetivo terapéutico en el ámbito del tratamiento de la psoriasis.

Blomberg et al., (Blomberg et al., 2003, Arthritis and Rheumatism, vol 48, n°9, p.: 2524-2532) enseñan la utilización de anticuerpos dirigidos contra la proteína BDCA-2, utilizándose dichas vacunas para una enfermedad autoinmune: el Lupus eritematoso. Los autores muestran que dichos anticuerpos son capaces de inhibir la producción de interferón a (IFN-a).

La solicitud US 2010/1896641 describe unos anticuerpos dirigidos contra la proteína BDCA-2 en el ámbito del tratamiento de tumores.

Se constata por lo tanto que la utilización de anticuerpos dirigidos contra la proteína BDCA-2 se describe ampliamente en la técnica anterior.

Sin embargo, en la actualidad, no existe ningún tratamiento específico y eficaz que permita el tratamiento o la prevención de patologías que impliquen células dendríticas plasmacitoides.

La invención tiene, por lo tanto, como objeto paliar las carencias del estado de la técnica, y especialmente proporcionar tratamientos alternativos.

La invención tiene también por objeto unas composiciones medicamentosas para tratar y/o prevenir dichas patologías.

La invención se define mediante las reivindicaciones.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización en el ámbito de la prevención o del tratamiento de las patologías que implican una activación de las células dendríticas plasmacitoides.

La invención se basa en la constatación inesperada realizada por los inventores del efecto de anticuerpos anti-BDCA-2 ^{sobre la progresión de tumores, especialmente de tumores hematopoyéticos.}

La invención se distingue de la técnica anterior por que implica una destrucción de las células DC plasmacitoides por apoptosis o por el mecanismo de ADCC.

La utilización de anticuerpos anti-IFN-a en el tratamiento de pacientes que padecen patologías autoinmunes e inflamatorias induce una neutralización de IFN-a de manera sistémica, lo que aumenta potencialmente el riesgo de infecciones oportunistas. En efecto, esta citoquina se produce en respuesta a un agente infeccioso, en particular vírico. Para responder a esta problemática, el objeto de la invención consiste en eliminar las células DC plasmacitoides, fuente principal de IFN-a, reclutadas a nivel de las lesiones inflamatorias y responsables de la inflamación local, estando esto particularmente bien descrito en el caso de la psoriasis, por ejemplo. La ventaja de la invención se basa por lo tanto en una eliminación de IFN-a preferiblemente en lugar de la inflamación y no de manera sistémica, disminuyendo esto por lo tanto los riesgos relacionados con la inmunodeficiencia inducida por los anti-IFN-a.

Una ventaja segura y adicional se basa en la ausencia de efecto sobre los leucocitos (Papot, 2002, rev med interne, 23, sup. 4), los macrófagos (Levesque MC, 1999, Arthritis Rheum, 42, 569) y los fibroblastos (Houglum, JE, 1893, 2,20) y así preservar las fuentes de IFN-a producidas por estos tipos celulares.

Otra ventaja consiste, a través de la eliminación de las células DC plasmacitoides, em la disminución de otras ^{citoquinas proinflamatorias como la IL}-6 ^{también segregadas por las células DC plasmacitoides en un entorno}inflamatorio y que conduce a una respuesta Th1 por ejemplo.

Además, al contrario de los conceptos generalmente admitidos, el objeto de la invención consiste en aprovecharse de la hiperactivación del sistema inmunitario en el sitio de la inflamación, en particular la activación de las células efectoras, entre ellas las células NK y los macrófagos, y eso debido a la presencia de numerosas citoquinas y quimioquinas proinflamatorias para obtener al final una disminución de la inflamación. En efecto, los autores han mostrado que el anticuerpo anti-BDCA-2 citado tenía una mejor actividad citotóxica contra las pDC en presencia de moléculas, de las cuales se aumentan las cantidades en las patologías autoinmunes e inflamatorias (es decir IFN-y, TNF-a, etc.).

La proteína BDCA-2 está expresada de manera específica en la superficie de las células DC plasmacitoides, y es una proteína de tipo II que pertenece a las lectinas de tipo C.

En el ámbito de la presente invención, el término “anticuerpo” se refiere a una inmunoglobulina, proteína constituida de 4 cadenas que participan en la respuesta inmunitaria adquirida.

Las inmunoglobulinas son bien conocidas por el experto en la materia y están constituidas de un ensamblaje de dos dímeros constituidos cada uno de una cadena pesada y de una cadena ligera. El complejo multimérico está ensamblado por la unión de una cadena ligera y de una cadena pesada por un puente disulfuro entre dos cisteínas, estando las dos cadenas pesadas, por su parte, también unidas entre sí por dos puentes disulfuros.

Cada una de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras está constituida de una región constante y de una región variable. El ensamblaje de las cadenas que componen un anticuerpo permite definir una estructura tridimensional característica en Y, en la que

- la base de la Y corresponde a la región constante Fc que está reconocida por el complemento y los receptores Fc, y - los extremos de los brazos de la Y corresponden al ensamblaje respectivo de las regiones variables de la cadena ligera y variable de la cadena pesada que son reconocidas por un antígeno específico.

Más precisamente, cada cadena ligera está constituida de una región variable (Vl) y de una región constante (Cl). Cada cadena pesada está constituida de una región variable (Vh) y de una región constante constituida de tres ^{dominios constantes Ch1, Ch2, y Ch3. Los dominios Ch2 yCH}3 ^{componen el dominio Fc.}

Los anticuerpos descritos en la invención se aíslan y purifican, y son diferentes de los anticuerpos naturales. Estos anticuerpos son maduros, es decir que poseen una estructura tridimensional ad hoc que les permite reconocer el antígeno, y poseen todas las modificaciones post-traduccionales esenciales para su reconocimiento antigénico. En un aspecto de la invención, los anticuerpos son policlonales.

En otro aspecto, se trata de anticuerpos monoclonales, es decir que reconocen solamente un único determinante antigénico en BDCA-2, al contrario que los anticuerpos policlonales que corresponden a una mezcla de anticuerpos monoclonales, y por lo tanto pueden reconocer varios determinantes antigénicos en una misma proteína.

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden obtener mediante técnicas bien conocidas por el experto en la materia, y en particular mediante la técnica de fusión celular, o también la técnica de clonación de las secuencias de cadenas pesadas y ligeras, mediante la técnica de fago o visualización del ribosoma, por inmunización de ratones que tienen el repertorio de inmunoglobulinas humanas, y expresión en una célula ad hoc o un animal transgénico.

Estas técnicas son bien conocidas por el experto en la materia.

Por células dendríticas plasmacitoides, se entiende la subpoblación de células dendríticas también denominada DC2, caracterizada por los marcadores HLA-DR+, CD11c-, CD123+ y CD45RA+, presentes en los órganos linfoides y también en circulación en la sangre, y caracterizadas por su capacidad para segregar IFN de tipo I en presencia de una infección vírica.

En la invención, se entiende por activación de las células dendríticas plasmacitoides los diferentes mecanismos que tienen por efecto activar la proliferación, la secreción de citoquina determinada, especialmente los interferones de clase I, y la modificación fenotípica y morfológica de células plasmacitoides.

En un modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización definida anteriormente, en la que dichas patologías que implican unas células dendríticas plasmacitoides se seleccionan entre las enfermedades autoinmunes y las enfermedades inflamatorias.

En otro modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización tal como se ha definido anteriormente, en el que las enfermedades autoinmunes e inflamatorias se seleccionan entre la enfermedad de los tejidos conjuntivos, los diferentes tipos de esclerosis, la inflamación autoinmune pulmonar, el síndrome Guillain-Barre, la tiroiditis autoinmune, la melitis, el miastenia gravis, la enfermedad del injerto contra el hospedante, la enfermedad autoinmune inflamatoria del ojo, la psoriasis, la enfermedad de Basedow (hipertiroiditis), la tiroiditis crónica de Hashimoto (hipotiroiditis), el lupus eritematoso diseminado (LED), el síndrome de Goodpasture, el pénfigo, la miastenia, la diabetes por insulinorresistencia, la anemia hemolítica autoinmune, la púrpura trombocitopénica autoinmune, la poliartritis reumatoide, la esclerodermia, polimiositis y dermatomiositis, la anemia de Biermer, la enfermedad de Gougerot-Sjogren, la glomerulonefritis, la enfermedad de Wegner, la enfermedad de Horton, la periarteritis nodular y el síndrome de Churg y Strauss, la enfermedad de Still, la policondritis atrofiante, la enfermedad de Behget, la esclerosis múltiple, la espondilartritis, la enfermedad de Crohn, la gammapatía monoclonal, la granulomatosis de Wegner, el lupus, la enfermedad de Horton, la enfermedad de Reiter, la rectocolitis hemorrágica, el reumatismo psoriásico, la sarcoidosis, la espondilartritis anquilosante, las dermatitis bulbosas autoinmunes, la colitis colágena, la dermatitis herpetiforme, la fiebre mediterránea familiar, la glomerulonefritis con depósitos de IgA, la glomerulonefritis extra-membranosa, la hepatitis autoinmune, el síndrome miasténico de Lambert-Eaton, la oftalmia simpática, la penfigoide bulbosa, el pénfigo, la púrpura trombopénica idiopática, el síndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter, la tiroiditis autoinmune, el síndrome uveomeningo-encefálico y la dermatitis herpetiforme.

En otro modo de realización preferido de la invención, las patologías que implican unas células dendríticas plasmacitoides son unas enfermedades autoinmunes, preferentemente unas enfermedades autoinmunes caracterizadas por una secreción incrementada de IFN de tipo I.

En una realización aún más ventajosa, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según la definición anterior, en la que dicho anticuerpo se selecciona entre los anticuerpos siguientes: un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

Es bien conocido por el experto en la materia que los anticuerpos murinos son unos anticuerpos producidos por unas células de ratones, y los anticuerpos humanos son producidos por unas células humanas.

Sin embargo, se generalizarán en la invención las definiciones anteriores de anticuerpos humano y murino para cualquier anticuerpo que comprenda unas secuencias de aminoácidos de sus cadenas pesadas y de sus cadenas ligeras del hombre o de ratones. Asimismo, un anticuerpo murino es un anticuerpo cuyas secuencias de cadenas pesadas y de cadenas ligeras que lo constituyen son unas secuencias de las cuales se encuentra la correspondencia en ácido nucleico en el genoma de las células B murinas. Este anticuerpo está, por lo tanto, constituido de secuencias de aminoácidos murinos, sea cual sea el origen de la célula que permite su producción.

Por ejemplo, las secuencias de anticuerpos de ratones expresadas en unas células de macaco darán unos anticuerpos murinos.

La definición anterior se aplica mutatis mutandis a los anticuerpos humanos.

Por anticuerpo quimérico, se entiende en la invención un anticuerpo aislado, en el que la secuencia de cada cadena ligera y/o de cada cadena pesada que lo constituye comprende o consiste en una secuencia híbrida procedente de al menos dos animales distintos. En particular, los anticuerpos quiméricos de la invención son unos híbridos humano/macaco o humano/ratón, lo que significa que una región de la secuencia de las cadenas ligeras y de las cadenas pesadas procede de la secuencia de una inmunoglobulina de macaco o de ratón, y que el resto de la secuencia de dichas cadenas pesadas y de dichas cadenas ligeras procede de la secuencia de una, o eventualmente varias, inmunoglobulina humana.

Por anticuerpo humanizado, se entiende en la invención un anticuerpo procedente de un animal diferente del hombre en el que las secuencias de las cadenas pesadas y de las cadenas ligeras diferentes de los CDR se han sustituido por unas secuencias correspondientes de uno o varios anticuerpos de origen humano. El anticuerpo está por lo tanto mayoritariamente constituido de secuencias humanas, pero su especificidad para el antígeno conferida por los CDR procede de otra especie.

En también otro modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización como se ha mencionado anteriormente, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico, y preferentemente un anticuerpo quimérico seleccionado entre un anticuerpo quimérico murino/humano o un anticuerpo quimérico humano/macaco.

En también otro modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización como se ha mencionado anteriormente, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

En también otro modo de realización ventajoso, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización como se ha mencionado anteriormente, en la que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.

La invención se refiere a un anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización antes mencionada, en la que dicho anticuerpo presenta un porcentaje de fucosilación inferior al 60% de las formas glicosiladas.

Los anticuerpos según la invención presentan una baja cantidad de fucosa sobre las cadenas glicánicas portadas por dichos anticuerpos. Esta cantidad de fucosa, o porcentaje de fucosa, está definida como la proporción media de fucosa portada por todos los anticuerpos, con respecto a la cantidad máxima de fucosa que pueden portar las cadenas glicánicas.

Otro objeto de la invención es un anticuerpo, en el que dicho anticuerpo está acoplado a una molécula bioactiva seleccionada entre los radioisótopos, los metales no radioactivos, las toxinas, los ácidos nucleicos, los agentes citotóxicos o también las enzimas.

La invención se refiere además a un anticuerpo monoclonal tal como se ha definido anteriormente, en el que dicho anticuerpo está acolado a una molécula bioactiva seleccionada entre los radioisótopos, los metales no radioactivos, las toxinas (seleccionadas entre la ricina, la abrina, la toxina diftérica), los ácidos nucleicos seleccionados entre los ARNs antisentido, los agentes citotóxicos seleccionados entre la mitomicina C, el metotrexato, la adriamicina, las enzimas tales como las RNasas, la biotina, la avidina, o la estreptavidina.

Tales anticuerpos acoplados a una molécula bioactiva son capaces de dirigir específicamente un radioisótopo, una enzima, un metal pesado, o también una toxina, injertado dicho anticuerpo a una célula diana determinada, en este caso las células DC plasmacitoides.

Se pueden citar como isótopos ventajosos los radioisótopos siguientes At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, no siendo esta lista limitativa.

Las toxinas que se pueden injertar a los anticuerpos según la invención se seleccionan entre la ricina, la toxina tetánica, la abrina, la toxina diftérica.

También se pueden utilizar los agentes citotóxicos seleccionados entre los antifolatos (metotrexato, pemetrexed, raltitrexed), las antipurinas (cladribina, fludarabina, azatioprina, azatioprina, mercaptopurina, 5-fluorouracil capecitabina, citarabina, gemcitabina), los inhibidores de topoisomerasas I y II, los agentes alquilantes (clormetina, ciclofosfamida, ifosfamida, carmustina, fotemustina) y emparentados (mitomicina C, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino), los agentes intercalantes, los antraciclinas (daunorrubicina, doxorrubicina, y clorhidrato, epirrubicina, idarrubicina, bleomicina), los taxanos, los inhibidores específicos de tirosina-quinasa (imatinib, Erlotinib). El conjunto de estas moléculas o compuestos que se pueden injertar sobre los anticuerpos según la invención son bien conocidos por el experto en la materia, y le es fácil determinar la molécula a utilizar.

Leyenda de las figuras

La figura 1 representa un histograma que muestra la depleción de las células DC plasmacitoides BDCA-2+ en PBMC humanos de donante sano en presencia del anticuerpo policlonal de conejo anti-BDCA-2+. El % de células positivas se obtiene mediante un doble marcado ILT7/ CD123.

La columna negra representa el porcentaje de célula células DC plasmacitoides sin tratamiento con el anticuerpo (control negativo 1), la columna blanca representa el porcentaje de célula células DC plasmaticoides tratadas con un anticuerpo control (que no está dirigido contra BDCA-2; control negativo 2) y la columna con rayas representa el porcentaje de células DC plasmacitoides tratadas con el anticuerpo anti-BDCA-2.

La figura 2 representa un histograma que muestra la evaluación de IFN-a después de la depleción de las células DC plasmacitoides con un anticuerpo policlonal de conejo anti-BDCA-2+ y de la activación por CpG.

La columna negra representa el porcentaje de secreción de IFN-a por los PBMC totales, la columna blanca representa el porcentaje de secreción de IFN-a por los PBMC totales en depleción en células DC plasmacitoides, y la columna con rayas representa el porcentaje de secreción de IFN-a por las células DC plasmacitoides solas.

La figura 3 representa un histograma que muestra la actividad ADCC del anticuerpo policlonal anti-BDCA-2 (barras negras) sobre las células Jurkat-BDCA-2. Los resultados se expresan en porcentaje de lisis de la célula Jurkat-BDCA-2 ^{en función de la cantidad de anticuerpos añadida, expresado en factor de dilución de la disolución inicial de}anticuerpos (A: 0, B: 1/250 y C: 1/25). Promedio /- desviación estándar. En control, el porcentaje de lisis se mide con la ayuda de un anticuerpo control (barras blancas).

El eje de las Y representa el porcentaje de lisis.

Ejemplos

Ejemplo 1: preparación de líneas celulares que expresan la proteína BDCA-2.

Se amplifica el ADN complementario de BDCA-2 por PCR y se clona en el vector de expresión pcDNA3.1(-) en los sitos de restricción HindIII/BamHI.

El vector pcDNA que contiene BDCA-2 se transfecta por nucleofección o Fugeno HD la línea celular U937 o THP-1.

48h horas después de la transfección, la expresión de BDCA-2 por las células transfectadas se monitoriza por citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-BDCA-2 y un anticuerpo acoplado a un fluoróforo.

Las células BDCA-2+ se clasificarán por selección positiva con la ayuda de bolas magnéticas acopladas con el anticuerpo anti-BDCA-2 (kit myltenyi).

La clasificación se repite hasta obtener el 100% de células positivas que expresan BDCA-2.

Ejemplo 2: Medición del efecto del anticuerpo anti-BDCA-2 según la invención.

El efecto del anticuerpo anti-BDCA-2 según la invención se mide en el ratón o en el hombre según su naturaleza. Un medio para medir la actividad del anticuerpo es medir la lisis celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) en presencia de células asesinas (Natural Killer (NK) o líneas T transfectadas con unos receptores Fc).

Medición de ADCC para un anticuerpo murino o que presenta un fragmento Fc de origen murino

Las células asesinas (células efectoras de ratón o de las líneas T transfectadas con FcR murinos) se incuban con unas células diana transfectadas BDCA-2 (ejemplo 1) o unas células dendríticas plasmacitoides de pacientes leucémicos (CD4+/CD56+) o que padecen enfermedad inflamatoria y/o autoinmune, en una proporción E/T de 15/1, en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos anti-BDCA-2.

Después de 4 o 16 horas de incubación, se mide la actividad citotóxica inducida por los anticuerpos anti-BDCA-2 mediante colorimetría evaluando en los sobrenadantes la liberación de la lactato deshidrogenasa (LDH) (Roche Diagnostics - Cytotoxicity Detection Kit LDH ref 11644793001).

En caso de índices bajos de LDH intracelular, las células se marcan con un agente fluorescente y la lisis se estima midiendo la cantidad de fluorescencia liberada en el sobrenadante.

Los resultados de lisis específica se expresan en porcentaje de lisis en función de la concentración de anticuerpos. Los valores de EC50 (cantidad de anticuerpo que induce el 50% de la lisis máxima) así como los valores de Emax (porcentaje de lisis máxima) se calculan con la ayuda del programa PRISM.

Medición de ADCC para un anticuerpo que posee un fragmento Fc de origen humano

Las células asesinas (PBMC, células NK, o células T transfectadas con CD16 humano) se purifican previamente mediante la técnica de depleción negativa desarrollada por la compañía Miltenyi (Miltenyi Biotec - NK cell isolation kit human ref 130-092-657), a partir de sangre periférica de donantes sanos. La técnica ADCC consiste en incubar las células NK con unas células diana transfectadas BDCA-2 o unas células DC plasmacitoides de pacientes leucémicos (CD4+/CD56+) o que padecen enfermedad inflamatoria y/o autoinmune, a una proporción E/T de 15/1, en presencia de diferentes concentraciones de anticuerpos anti-BDCA-2.

Después de 4 o 16 horas de incubación, la actividad citotóxica inducida por los anticuerpos anti-BDCA-2 se mide por colorimetría evaluando en los sobrenadantes una enzima intracelular denominada lactato deshidrogenasa (LDH) liberada por las células diana lisadas (Roche Diagnostics - Cytotoxicity Détection Kit LDH ref 11644793001).

En caso de un índice bajo de LDH intracelular, las células se marcan con un agente fluorescente y la lisis se estima midiendo la cantidad de fluorescencia liberada en el sobrenadante.

Ejemplo 3: preparación de líneas celulares que expresan la proteína BDCA-2.

El ADN complementario de BDCA-2 se amplifica por PCR y se clona clonado en el vector de expresión pcDNA3.1 (-) en los sitos de restricción HindIII/BamHI. El vector pcDNA que contiene BDCA-2 se transfecta por nucleofección o Fugeno HD la línea celular Jurkat. 48h después de la transfección, la expresión de DCA-2 por las células transfectadas se monitoriza por citometría de flujo, utilizando un anticuerpo anti-BDCA-2 acoplado con un fluoróforo. Las células BDCA-2+ se aislaron con la ayuda de clasificaciones sucesivas realizadas por citometría de flujo con un clasificador (Altra, Becton Dickson) utilizando un anticuerpo anti BDCA-2 (Myltenyi). La clasificación se repite hasta obtener el 100% de células positivas que expresan BDCA-2.

Ejemplo 4 : Citotoxicidad.

Depleción de células DC plasmacitoides en PBMC

Los PBMC se aíslan a partir de la sangre periférica sobre un gradiente de Ficoll. La técnica consiste en incubar los PBMC en presencia de un anticuerpo policlonal de conejo anti BDCA-2 o de anticuerpo policlonal de conejo irrelevante. Después de 16 horas de incubación, se mide la depleción de las células DC plasmacitoides inducida por los anticuerpos anti BDCA-2 por citometría de flujo en base al doble marcado ILT7/CD123.

Los resultados se muestran en la figura 1.

Estos resultados muestran una disminución del número de células DC plasmacitoides de aproximadamente el 40% en presencia de anticuerpo anti-BDCA-2 en comparación con el anticuerpo control. Este resultado permite concluir que un anticuerpo anti-BDCA-2, en presencia de células efectoras, puede inducir a una depleción de las células DC plasmacitoides.

Disminución del porcentaje de IFNa asociado a la depleción de las células DC plasmacitoides

Los PBMC se aíslan a partir de la sangre periférica sobre un gradiente de Ficoll. La técnica consiste en realizar una deplelción de las células DC plasmacitoides de PBMC con la ayuda del kit Myltenyi anti-células DC plasmacitoides. Después de la activación por CpG durante 16h a 37°C, el porcentaje de IFN-a se mide por citometría de flujo y eso en comparación con los PBMC control que contienen unas células DC plasmacitoides.

Los resultados se muestran en la figura 2.

Los resultados indican una disminución de la secreción de IFN-a después de la depleción de las células DC plasmacitoides de aproximadamente el 85%, permitiendo esto concluir que la depleción de las células DC plasmacitoides por un anti-BDCA-2 puede conducir a una disminución de la secreción de IFN-a. En este experimento, las células DC plasmacitoides solas se utilizan como células positivas para la secreción de IFN-a.

ADCC

Las células asesinas (células NK) se purifican previamente mediante la técnica de depleción negativa desarrollada por la compañía Miltenyi (Miltenyi Biotec - NK cell isolation kit human ref 130-092-657), a partir de sangre periférica de donantes sanos. La técnica ADCC consiste en incubar las células NK con unas células diana de la línea Jurkat transfectadas con el receptor BDCA-2, en presencia de diferentes concentraciones de un anticuerpo policlonal de conejo anti-BDCA-2 o de anticuerpo policlonal de conejo irrelevante. Después de 16 horas de incubación, la actividad citotóxica inducida por los anticuerpos anti-BDCA-2 se mide por colorimetría evaluando en los sobrenadantes una enzima intracelular denominada lactato deshidrogenasa (LDH) liberada por las células dianas lisadas (Roche Diagnostics - Cytotoxicity Détection Kit LDH).

Los resultados se presentan en la figura 3 y muestran una actividad citotóxica del anticuerpo policlonal de conejo anti-BDCA-2 sobre las células Jurkat-BDCA-2, de manera dosis dependiente que puede alcanzar más del 60% de lisis de la célula diana.

Estos resultados indican por lo tanto que usando como diana el antígeno BDCA-2 expresado en la superficie de una célula, es posible lisar esta célula utilizando unos efectores tales como las células NK. El anticuerpo anti-BDCA-2 puede soportar otras actividades citotóxicas tales como la fagocitosis dependiente de otras células efectoras como los ^{macrófagos o los neutrófilos.}

Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización en la prevención o el tratamiento de las patologías que implican una activación de células dendríticas plasmacitoides, siendo dichas patologías unas enfermedades autoinmunes o unas enfermedades inflamatorias, presentando dicho anticuerpo un porcentaje de fucosilación inferior al 60% de las formas glicosiladas, e implicando dicho anticuerpo una destrucción de las células DC plasmacitoides por el mecanismo de ADCC.

2. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según la reivindicación 1, en el que las enfermedades autoinmunes o las enfermedades inflamatorias se seleccionan entre la enfermedad de los tejidos conjuntivos, los diferentes tipos de esclerosis, la inflamación autoinmune pulmonar, el síndrome Guillain-Barre, la tiroiditis autoinmune, la melitis, el miastenia gravis, la enfermedad del injerto contra el hospedante, la enfermedad autoinmune inflamatoria del ojo, la psoriasis, la enfermedad de Basedow (hipertiroiditis), la tiroiditis crónica de Hashimoto (hipotiroiditis), el lupus eritematoso diseminado (LED), el síndrome de Goodpasture, el pénfigo, la miastenia, la diabetes por insulinorresistencia, la anemia hemolítica autoinmune, la púrpura trombocitopénica autoinmune, la poliartritis reumatoide, la esclerodermia, polimiositis y dermatomiositis, la anemia de Biermer, la enfermedad de Gougerot-Sjogren, la glomerulonefritis, la enfermedad de Wegner, la enfermedad de Horton, la periarteritis nodular y el síndrome de Churg y Strauss, la enfermedad de Still, la policondritis atrofiante, la enfermedad de Behget, la esclerosis múltiple, la espondilartritis, la enfermedad de Crohn, la gammapatía monoclonal, la granulomatosis de Wegner, el lupus, la enfermedad de Horton, la enfermedad de Reiter, la rectocolitis hemorrágica, el reumatismo psoriásico, la sarcoidosis, la espondilartritis anquilosante, las dermatitis bulbosas autoinmunes, la colitis colágena, la dermatitis herpetiforme, la fiebre mediterránea familiar, la glomerulonefritis con depósitos de IgA, la glomerulonefritis extra-membranosa, la hepatitis autoinmune, el síndrome miasténico de Lambert-Eaton, la oftalmia simpática, la penfigoide bulbosa, el pénfigo, la púrpura trombopénica idiopática, el síndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter, la tiroiditis autoinmune, el síndrome uveo-meningo-encefálico y la dermatitis herpetiforme.

3. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según la reivindicación 1, en el que las enfermedades autoinmunes son unas enfermedades autoinmunes caracterizadas por una secreción incrementada de IFN de tipo I.

4. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según una de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se selecciona de entre los anticuerpos siguientes: un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y un anticuerpo humano.

5. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo quimérico y preferentemente un anticuerpo seleccionado entre un anticuerpo quimérico murino/humano o un anticuerpo quimérico humano/macaco.

6^{. Anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según la reivindicación 4,}en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

7. Anticuerpo monoclonal dirigido contra la proteína BDCA-2 para su utilización según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo humano.