KR20220032513A - 거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포 수준을 감소시키는 방법 - Google Patents

거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포 수준을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시내용은 LGL 및/또는 NK 세포 상의 세포 표면 단백질과 결합하고 증강된 ADCC 활성을 포함하는 항체를 사용하여 LGL 및/또는 NK 세포와 관련된 질환 또는 장애를 치료하는 방법, LGL 및/또는 NK 세포를 감소 또는 고갈시키는 방법, 및 ADCC 활성을 유도하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A 수용체와 특이적으로 결합하는 부분 및 이뮤노글로불린 Fc 부분으로 이루어진 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A 결합 분자의 투여 시 인간 대상체에서 거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포의 수를 감소 또는 고갈시키는 방법에 관한 것이다. 구체적 실시양태에서, 본 발명의 방법은 비장, 혈액, 골수, 관절, 또는 다른 조직에서 거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포의 수를 고갈 또는 감소시킨다.

Description

거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포 수준을 감소시키는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 3월 29일에 출원된 미국 가출원 번호 62/826,660; 및 2020년 2월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/982,578을 우선권 주장하며; 이들 가출원 각각의 개시내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일 상의 서열 목록의 제출
ASCII 텍스트 파일 상의 하기 제출 내용은 그 전체 내용이 본원에 참조로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 (CRF) (파일명: 186542000140SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2020년 3월 25일, 크기: 17 KB).
발명의 분야
본 개시내용은 인간에서 거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
림프구는 외래 항원을 특이적으로 인식하고 이에 반응하는 백혈구의 서브세트이다. 3가지 주요 부류의 림프구가 있다: T 림프구 (T 세포), B 림프구 (B 세포) 및 자연 살해 (NK) 세포. 거대 과립 림프구 (LGL)는 말초 혈액 림프구의 8-15%를 차지하며 (200-400/μL), 아주르친화성 과립이 있는 풍부한 세포질을 특징으로 한다 (Loughran TP Jr. Blood. 1993;82(1):1-14). 아주르친화성 과립은 세포용해 성분 예컨대 퍼포린 및 그랜자임을 함유한다. LGL은 세포독성 T 세포와 NK 세포의 2가지 주요 범주로 나뉜다. LGL T-세포는 전형적으로 CD3, CD8 및 CD57을 발현하고 TCR 유전자 재배열을 나타내는 반면; NK 세포는 CD56을 발현하고, 표면 CD3에 대해 음성이고, CD8을 발현할 수 있으며, TCR 유전자 재배열을 나타내지 않는다 (Alekshun et al., Cancer Control 2007, Vol. 14, No. 2, p141-150). NK 세포 LGL (CD3-)은 선천 면역 체계에 속하며 비-주요 조직적합성 복합체-제한된 세포독성 능력을 가지고 있다 (Alekshun et al., Cancer Control 2007, Vol. 14, No. 2, p141-150).
LGL과 관련된 3종의 별개의 질환이 있다: T-세포 LGL (T-LGL) 백혈병; NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK, 이전 명칭 NK-LGL); 및 공격성 NK-세포 백혈병, 예컨대 공격성 자연 살해 백혈병 (ANKL) 및 림프절외 NKL 비강 유형 (ENKL). T 세포 LGL 백혈병은 서구 국가에서 가장 흔한 LGL 장애이며 전체 사례의 85%를 차지한다. 진단 시 중앙값 연령은 60세이며 성별에 대한 선호도는 없다. 질환의 발병기전은 구성적 생존 신호전달로 인한 활성화 유도 세포 사멸에 저항하는 LGL의 클론 확장에 의해 지배된다 (Lamy et al., Blood, 2017, Vol. 129, No. 9, 1082-1094). T 및 NK LGL 백혈병 환자의 약 3분의 1은 진단 당시 무증상이다. 초기 증상은 주로 호중구감소증과 관련이 있으며 재발성 구강 아프타성 궤양, 박테리아성 감염에 속발성인 발열을 포함한다. 이러한 감염은 전형적으로 피부, 인두 및 직장주변 부위를 포함하지만, 심각한 패혈증이 발생할 수 있다. 그러나, 일부 환자는 매우 오랜 기간 동안 어떠한 감염도 없이 심하고 지속적인 호중구감소증을 나타낼 수 있다. 재발성 감염의 빈도는 15% 내지 39%로 시리즈별로 다양하다. 피로 및 B 증상이 사례의 20% 내지 30%에서 관찰된다. 비장비대는 20% 내지 50%로 다양한 빈도로 보고되며 림프절병증은 드물다. 환자의 절반은 4 x 109/L 내지 10 x 109/L의 림프구 계수, 및 통상적으로 1 내지 6 x 109/L의 LGL 계수를 나타낸다. 더 낮은 LGL 계수 (0.5 내지 1x109/L)가 사례의 7% 내지 36%에서 관찰될 수 있다. 중증 호중구감소증 및 중등도 호중구감소증은 각각 사례의 16% 내지 48% 및 48% 내지 80%에서 관찰된다. 빈혈이 자주 발생하며; 수혈 의존적 환자는 사례의 10% 내지 30%에서 관찰된다 (Lamy 2017).
대다수의 LGL 백혈병 환자는 질환이 진행되는 동안 언젠가는 치료가 필요할 것이다. 질환 관련 사망은 주로 환자 집단의 10%에서 발생하는 심각한 감염으로 인한 것이다. 10년의 전체 생존율은 70%이다 (Lamy 2017). 1차 요법은 단일 면역억제제 경구제, 예컨대 메토트렉세이트 (주당 10 mg/m2), 시클로포스파미드 (일당 100 mg) 또는 시클로스포린 (일당 3 mg/kg)의 사용에 의존한다. 후향적 연구에 따르면, 전체 반응 비율 (ORR) 중앙값은 50%이며 3종의 약물 각각에 대해 유사한 반응을 나타낸다. 완전 반응 (CR) 비율은 상대적으로 낮으며: 메토트렉세이트의 경우에는 21%이고, 시클로포스파미드의 경우에는 33%이며, 시클로스포린의 경우에는 5%이다. 메토트렉세이트의 경우 반응 지속 기간은 21개월이며, 재발률은 높으며, 즉 67%이다.
만성 메토트렉세이트 치료 시 간 기능 장애 (간염) 및 폐 기능 장애 (과민성 폐렴)가 발생할 수 있다. 시클로포스파미드는 돌연변이 유발 가능성이 있으므로 8 내지 12개월 후에 투여를 중단하는 것이 권장된다. 시클로스포린 치료 중 신장 기능과 혈압을 주의 깊게 모니터링해야 한다.
NK 또는 T LGL 백혈병 외에도, NK 또는 LGL 세포는 류마티스 관절염 (RA), 펠티 증후군, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 (IBM), 염증성 장 질환 (IBD) 및 다른 질환에서 중요한 역할을 한다. 펠티 증후군 (FS)은 파괴적인 관절 침범, 비장비대 및 호중구감소증을 동반한 혈청양성 류마티스 관절염 (RA)의 3종의 징후를 특징으로 한다. 완전한 3종의 징후가 절대적인 요구 사항은 아니지만, 진단을 내리기 위해서는 절대 호중구 계수 (ANC)가 일반적으로 1500/mm3 미만인 지속적인 호중구감소증이 필요한다. FS 환자의 대략 30 내지 40%는 LGL의 말초 혈액 확장이 있다. 클론 T-LGL 집단은 FS 및 T-LGLL에서 매우 유사하며, CD3+, CD28-, CD57+의 발현과 LGL 상의 억제 및 활성화 NK 수용체의 발현을 수반한다. LGLL 및 SF의 증상과 관리는 유사한다.
LGL 또는 NK 세포가 없는 정상 인간 대상체로부터의 활액 (SF)과 달리, RA 환자로부터의 SF는 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A를 발현하는 높은 수준의 LGL 및 NK 세포를 갖는다. CD94가 활액 NK 세포 시토카인 합성의 핵심 조절인자일 수 있다는 것이 밝혀졌다.
IBM은 노년층에서 가장 흔한 염증성 근육 질환이다. 이러한 질환은 원위 및 근위 근육 둘 다의 서서히 진행성 약화 및 소모를 특징으로 하며, 손가락 굴근과 무릎 신근에서 가장 분명한다. 염증은 면역 세포에 의한 근육 섬유의 침입으로부터 분명히 드러난다. 거대 과립 림프구 확장은 혈액과 근육 모두에 존재하며 IBM에 대한 부가의 바이오마커를 제공하며 신생물성 질환 T 세포 거대 과립 림프구성 백혈병과의 기계적 관계를 시사한다. IBM 환자의 대부분 (58%)은 T 세포 LGLL에 대한 표준 진단 기준을 충족하는 혈액 내 거대 과립 림프구의 비정상적인 집단을 가지고 있다. 근육 면역조직화학 분석은 근육 내로의 거대 과립 림프구의 침입이 15명의 IBM 환자 중 15명에게서 나타났지만, 피부근염 또는 다발성 근염을 동반한 환자의 경우에는 28명 중 1명에게서만 나타났다는 것을 명확하게 보여주었다.
거대 과립 림프구 (LGL)와 관련된 질환에 대한 현재 요법은 LGL 또는 NK 세포의 수준을 선택적으로 감소시키거나 고갈시키지 않는다. 따라서, LGL 및 NK 세포에 의해 매개되는 질환을 치료하기 위한 보다 효과적이고 안전한 요법을 개발하는 것이 유리할 것이다.
본 발명은 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A 수용체와 특이적으로 결합하는 부분 및 이뮤노글로불린 Fc 부분으로 이루어진 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A 결합 분자의 투여 시 인간 대상체에서 거대 과립 림프구 및 자연 살해 세포를 고갈시키거나 또는 그의 수를 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, IBM 또는 IBD를 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교 시 증강된 ADCC 활성을 갖는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다.
본 발명은 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A에 특이적인 항체 약 0.01 내지 약 25 mg/kg 또는 LGL 세포에 특이적이고 CD16에 대한 결합을 증강시키는 푸코스 또는 Fc 돌연변이를 포함하지 않는 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 부가의 세포 표면 단백질을 인간 대상체에게 투여함으로써, 이러한 인간 대상체에서 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포를 고갈시키거나 또는 그의 수를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 항체의 투여는 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포의 수를 검출 한계 미만으로 감소시키고, 그 수준이 항체의 투여 후 적어도 약 1주 동안 검출 미만으로 유지된다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 투여 후 처음 24시간 이내에 일어난다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 가역적이다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 LGL 백혈병 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 펠티 증후군 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 IBM 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 공격성 NK 백혈병 증상의 감소를 유도한다.
한 측면에서, 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, IBM 또는 IBD를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교 시 증강된 ADCC 활성을 갖는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여는 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포의 수를 검출 한계 미만으로 감소시키고/시키거나 그 수준이 항체의 투여 후 적어도 약 1주 동안 검출 미만으로 유지된다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 투여 후 처음 24시간 이내에 일어난다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 감소는 가역적이다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 상기 감소는 LGL 백혈병 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 상기 감소는 펠티 증후군 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 상기 감소는 IBM 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, LGL 또는 NK 세포의 상기 감소는 공격성 NK 백혈병 증상의 감소를 유도한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항체의 Fc 영역은 비-푸코실화되는 인간 IgG1 Fc를 포함한다.
또 다른 측면에서, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 여기서 질환 또는 장애는 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 또는 염증성 장 질환으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포의 수를 감소시킨다.
또 다른 측면에서, 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 여기서 대상체는 LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염, 또는 염증성 장 질환으로부터 선택된 질환 또는 장애가 있다.
또 다른 측면에서, 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ADCC 활성을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 여기서 대상체는 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 또는 염증성 장 질환으로부터 선택된 질환 또는 장애가 있고, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시킨다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질의 세포당 적어도 약 1,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 2,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 3,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 4,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 5,000개의 수용체, 또는 세포당 적어도 약 7,000개의 수용체가 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 표면 상에 발현된다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포 수의 감소는 항체의 투여 전 인간 대상체에서 말초 혈액 NK 세포의 수와 비교하여 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 또는 약 10% 내지 약 80%의 감소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에게 항체를 투여한 후 처음 24시간 이내에 발생한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수는 질환 또는 장애의 임상 진단을 위한 한계 미만으로 감소된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수는 (예를 들어, 대상체로부터 수득된 말초 혈액 샘플 중에서) 2x109개 세포/L 이하로 감소된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 질환 또는 장애의 임상 진단을 위한 한계 미만으로 감소시킨 것은 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안 존재한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 (예를 들어, 대상체로부터 수득된 말초 혈액 샘플 중에서) 2x109개 세포/L 이하로 감소시킨 것은 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안 대상체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포에 대한 검출 한계 미만으로 감소된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포에 대한 검출 한계 미만으로 감소시킨 것은 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안 대상체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 가역적이다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 NK 세포의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 NK 세포는 CD3 음성 및 CD56 양성, CD3 음성 및 CD16 양성, CD3 음성 및 CD57 양성, CD3 음성 및 CD94 양성, 또는 CD3 음성 및 NKG2A 양성이다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 3 ng/ml 내지 약 40 ng/ml의 EC50을 갖는다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 T 세포를 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 T 세포는 CD3 양성 및 CD4 양성 또는 CD3 양성 및 CD16 음성이다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 종양 용해 증후군을 일으키지 않는다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 항체는 비-푸코실화된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 항체는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 아미노산 잔기 위치 158에 발린 잔기 또는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 서열식별번호 (SEQ ID NO): 8 또는 9의 서열을 포함한다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 인간 CD94와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412 또는 12K45와 동일한 인간 CD94 상의 에피토프와 결합하지 않거나; (b) 인간 CD57과 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD57 항체 클론 NK-1과 동일한 인간 CD57 상의 에피토프와 결합하지 않거나; 또는 (c) 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199와 동일한 인간 NKG2A 상의 에피토프와 결합하지 않는다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 항체는: (a) 인간 CD94와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412, 및 12K45보다 더 큰 친화도로 인간 CD94와 결합하거나; (b) 인간 CD57과 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD57 항체 클론 NK-1보다 더 큰 친화도로 인간 CD57과 결합하거나; 또는 (c) 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199보다 더 큰 친화도로 인간 NKG2A와 결합한다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 펠티 증후군이고, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 펠티 증후군 증상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 봉입체 근염이며, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 봉입체 근염 증상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 공격성 NK 백혈병이며, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 공격성 NK 백혈병 증상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 류마티스 관절염이며, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 류마티스 관절염 증상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 LGL 백혈병이며, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 LGL 백혈병 증상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 CLPD-NK이며, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 CLPD-NK 증상을 감소시킨다.
또 다른 측면에서, CLPD-NK의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 CLPD-NK를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199와 동일한 인간 NKG2A 상의 에피토프와 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199보다 더 큰 친화도로 인간 NKG2A와 결합한다.
또 다른 측면에서, CLPD-NK의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 CLPD-NK를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412, 또는 12K45와 동일한 인간 CD94 상의 에피토프와 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412, 및 12K45보다 더 큰 친화도로 인간 CD94와 결합한다.
이전의 실시양태 중 임의의 것과 조합될 수 있는 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여는 항체의 투여 전 인간 대상체에서의 말초 혈액 NK 세포의 수와 비교하여 인간 대상체에서의 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포의 수를 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 10% 내지 약 90% 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서의 NK 세포는 CD3 음성 및 CD56 양성, CD3 음성 및 CD16 양성, CD3 음성 및 CD57 양성, CD3 음성 및 CD94 양성, 또는 CD3 음성 및 NKG2A 양성이다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여는 인간에서 T 세포를 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에서의 T 세포는 CD3 양성 및 CD4 양성 또는 CD3 양성 및 CD16 음성이다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여는 인간에서 종양 용해 증후군을 일으키지 않는다. 일부 실시양태에서, 항체는 비-푸코실화된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 아미노산 잔기 위치 158에 발린 잔기 또는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 서열식별번호: 8 또는 9의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여는 인간에서 1종 이상의 CLPD-NK 증상을 개선시킨다.
특허 출원 및 간행물을 포함하여 본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전체 내용이 참조로 포함된다.
본 발명의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에 구체적으로 제시되어 있다. 본 발명의 특징 및 이점에 대한 더 나은 이해는 본 발명의 원리가 활용되는 예시적인 실시양태를 제시하는 하기 상세한 설명 및 첨부 도면을 참조하여 수득될 것이다.
도 1a-1b는 건강한 공여자로부터 수득된 면역 세포 상의 CD94 수용체의 수준을 도시한다. 도 1a는 대표적인 건강한 공여자 말초 혈액 백혈구 (PBL) 샘플에서 CD94 수용체 수의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. 단일 및 살아있는 단핵구, 과립구 및 림프구 집단은 표시된 면역 세포 집단을 확인하기 위해 게이팅되었다. CD94 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. CD94-양성 세포 퍼센트는 양방향 화살표로써 표시되며; CD94 수용체 수는 각각의 히스토그램 아래에 제공된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-CD94 항체 HP-3D9에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 나타낸다. 도 1b는 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 (PBMC) 및 PBL 샘플로부터의 표시된 세포 유형에서 세포당 CD94 수용체의 평균 수를 도시한다. 6개의 건강한 공여자 PBMC 샘플에서 CD94 발현 (mAb 클론 HP-3D9를 사용함)을 평가하였고; 과립구 상에서의 CD94 발현을 2명의 공여자로부터의 PBL 샘플에서 평가하였다. 단일 및 살아있는 단핵구, 과립구 및 림프구 집단은 표시된 면역 세포 집단을 확인하기 위해 게이팅되었다. CD94 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. 항체 결합 능력은 등가 가용성 형광색소 (MESF) 비드의 APC-표지된 분자를 사용하여 표준 곡선을 피팅함으로써 계산되었다. 각각의 막대 위에 표시된 값은 세포당 CD94 수용체의 평균 수를 나타낸다. 도 1a-1b에서, Ab = 항체; "Neg" 또는 "음성"은 표적이 검출에 대한 한계치 미만이었다는 것을 표시하며 (세포당 2K 수용체); K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000).
도 2a-2b는 T-LGLL 환자로부터 수득된 면역 세포 상의 CD94 수용체의 수준을 도시한다. 도 2a는 CD94bright T-LGLL 환자로부터 수득된 샘플에서 CD94 수용체 수의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. 도 2b는 CD94dim T-LGLL 환자로부터 수득된 샘플에서 CD94 수용체 수의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. 이러한 경우, CD94bright는 약 170K 수용체인 반면 (예를 들어, 한계치는 50K 초과 수용체였다), CD94dim은 약 12K 수용체였다 (예를 들어, 한계치는 15K 미만 수용체였다). 도 2a-2b에서, 단일 및 살아있는 단핵구 및 림프구 집단을 선택적 마커와 함께 게이팅하여 표시된 면역 세포 집단을 확인하였다. CD94 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. CD3+CD16+ 백혈병 세포는 CD94bright 및 CD94dim 환자 샘플 둘 다에서 정상 PBMC에서의 <10%와 비교하여, 이러한 환자 PBMC 샘플에서 림프구의 >55%를 나타내었다. CD94-양성 세포 퍼센트는 양방향 화살표로써 표시되며; CD94 수용체 수는 각각의 히스토그램 아래에 제공된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-CD94 항체 HP-3D9에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 표시한다. Ab = 항체; "음성"은 CD94 발현이 검출되지 않았음을 나타내고; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000).
도 3은 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK) 환자로부터 수득된 면역 세포 상의 CD94 수용체 수준의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. 단일 및 살아있는 단핵구 및 림프구 집단을 선택적 마커와 함께 게이팅하여 표시된 면역 세포 집단을 확인하였다. CD94 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. CD3-CD16+ 백혈병 세포는 정상 PBMC에서의 5-10%와 비교하여, 이러한 환자 PBMC 샘플에서 림프구의 70%를 나타내었다. CD94-양성 세포의 퍼센트는 양방향 화살표로써 표시되며; CD94 수용체 수는 각각의 히스토그램 아래에 제공된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-CD94 항체 HP-3D9에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 표시한다. Ab = 항체; "음성"은 CD94 발현이 검출되지 않았음을 나타내고; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000).
도 4a-4b는 건강한 공여자로부터 수득된 NK 세포 상의 NKG2A 수용체의 수준뿐만 아니라 건강한 공여자로부터의 PBMC에서 NK 세포의 ADCC 검정을 도시한다. 도 4a는 건강한 공여자로부터 수득된 CD3-CD56bright NK 세포 상의 NKG2A 수용체 수의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. 단일 및 살아있는 림프구를 게이팅하여 CD3-CD56+ NK 세포를 확인하였다. CD3-CD56bright NK 세포는 이러한 세포 집단의 100%가 NKG2A를 발현했기 때문에 선택되었다. NKG2A 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. NKG2A 수용체 수는 히스토그램 아래에 제공된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-NKG2A Z199 항체에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 표시한다. Ab = 항체; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000). 도 4b는 건강한 공여자로부터의 PBMC를 사용한 ADCC 검정을 도시한다. PBMC를 표시된 농도의 이소형 대조군 항체, 항-NKG2A Z199 푸코실화된 항체 또는 항-NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 남아 있는 CD3-CD56bright NK 세포의 퍼센트는 이소형 대조군 웰에서의 NK 세포의 수에 대해 정규화함으로써 계산되었다. 각각의 항체의 EC50은 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism)에서 계산되었다. a-Fuco = 비-푸코실화된; Fuco = 푸코실화된; Z199 = 항-NKG2A 항체 Z199.
도 5a-5b는 건강한 공여자로부터 수득된 T 세포 상의 NKG2A 수용체의 수준뿐만 아니라 건강한 공여자로부터의 PBMC에서 T 세포의 ADCC 검정을 도시한다. 도 5a는 CD3+CD8+ T 세포를 확인하기 위해 게이팅된 단일 및 살아있는 림프구에서 NKG2A의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. NKG2A 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. NKG2A 양성 세포의 퍼센트는 양방향 화살표로써 표시되며; NKG2A 수용체 수는 히스토그램 아래에 제공된다. APC-접합된 항-NKG2A Z199 항체에 상응하는 형광은 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다. Ab = 항체; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000). 도 5b는 건강한 공여자 PBMC 샘플에서 CD3+CD8+ T 세포의 ADCC 검정을 도시한다. 세포를 표시된 농도의 이소형 대조군 항체, 항-NKG2A Z199 푸코실화된 항체 또는 항-NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체로 밤새 처리하였다. 남아 있는 T 세포 퍼센트는 이소형 대조군 웰에서의 T 세포의 수에 대해 정규화함으로써 계산되었다. a-Fuco = 비-푸코실화된; Fuco = 푸코실화된; Z199 = 항-NKG2A 항체 Z199.
도 6a-6b는 CLPD-NK 환자로부터 수득된 NK 세포 상의 NKG2A 수용체의 수준뿐만 아니라 CLPD-NK 환자 유래 PBMC에서의 ADCC 검정을 도시한다. 도 6a는 CD3-CD16+ NK 백혈병 세포를 확인하기 위해 게이팅된 단일 및 살아있는 림프구 상의 NKG2A 수용체 수의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. NKG2A 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. NKG2A 수용체 수는 히스토그램 아래에 제공된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-NKG2A Z199 항체에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 표시한다. Ab = 항체; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000). 도 6b는 CLPD-NK 환자로부터의 PBMC를 사용한 ADCC 검정을 도시한다. PBMC를 표시된 농도의 이소형 대조군 항체 또는 항-NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 남아 있는 백혈병 세포 퍼센트는 이소형 대조군 웰에서의 백혈병 세포의 수에 대해 정규화함으로써 계산되었다. EC50은 그래프패드 프리즘에서 계산되었다. Z199 a-Fuco = 항-NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체.
도 7a-7b는 CLPD-NK 환자로부터 수득된 정상 T 세포 상의 NKG2A 수용체의 수준뿐만 아니라 CLPD-NK 환자로부터의 정상 T 세포에 대한 ADCC 검정을 도시한다. 도 7a는 CD3+CD16- T 세포를 확인하기 위해 게이팅된 단일 및 살아있는 림프구에서 NKG2A의 유동 세포계수법 분석을 도시한다. NKG2A 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. NKG2A 수용체 수는 히스토그램 아래에 제공된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-NKG2A Z199 항체에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 표시한다. Ab = 항체; "음성"은 CD94 발현이 검출되지 않았음을 나타내고; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000). 도 7b는 CLPD-NK 환자 PBMC 샘플로부터의 CD3+CD16- T 세포의 ADCC 검정을 도시한다. 세포를 표시된 농도의 이소형 대조군 항체 또는 항-NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체로 밤새 처리하였다. 남아 있는 T 세포 퍼센트는 이소형 대조군 웰에서의 T 세포 수에 대해 정규화함으로써 계산되었다. Z199 a-Fuco = 항-NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체.
도 8a-8b는 대표적인 정상 간 조직에서의 CD94 및 NKG2A 수용체의 수준을 도시한다. 단일 및 살아있는 간 유래 CD45- 세포 및 림프구 집단 (CD45/CD4/CD8/CD19/CD56+)을 검사하여 CD94 및 NKG2A 발현에 관하여 스크리닝하였다. 수용체 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군 항체와 비교함으로써 결정되었다. CD94 및 NKG2A 양성 세포에서의 수용체 수는 각각의 히스토그램 아래에 제공되며; 수용체-양성 세포의 백분율은 양방향 화살표로써 표시된다. 점선 화살표는 APC-접합된 항-CD94 항체 HP-3D9 (도 8a) 또는 APC-접합된 항-NKG2A Z199 항체 (도 8b)에 상응하는 형광이 왼쪽에서 오른쪽으로 히스토그램의 x-축을 따라 증가한다는 것을 표시한다. Ab = 항체; K 표기법은 1000의 배수를 지칭한다 (예를 들어, 0.4K = 400; 4K = 4000; 40K = 40,000; 및 400K = 400,000). "음성"은 표적 발현이 검출되지 않았음을 표시한다.
도 9a 및 9b는 항-NKG2A 항체 Z199 (도 9a) 또는 이소형 대조군 (도 9b)을 사용하여 T-LGLL 환자 PBMC에서 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 검정의 결과를 도시한다.
도 10은 IL-2와 함께 배양된 정상 NK 세포에서 시간 경과에 따른 CD94의 발현을 도시한다.
예시를 위한 예시적인 적용을 참조하여 여러 측면이 하기에 기재되어 있다. 본원에 기재된 특징에 대한 완전한 이해를 제공하기 위해 수많은 구체적 세부 사항, 관계 및 방법이 제시되어 있음을 이해해야 한다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본원에 기재된 특징이 하나 이상의 구체적 세부 사항 없이 또는 다른 방법으로 실행될 수 있음을 쉽게 인식할 것이다. 일부 행위는 상이한 순서로 및/또는 다른 행위 또는 이벤트와 공동으로 발생할 수 있으므로, 본원에 기재된 특징은 행위 또는 이벤트의 예시된 순서에 의해 제한되지 않는다. 더욱이, 본원에 기재된 특징에 따라 방법론을 구현하기 위해 예시된 모든 행위 또는 이벤트가 요구되는 것은 아니다.
본원에 사용된 바와 같은, 단수형은 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 더욱이, 용어 "포함한", "포함하다", "갖는", "갖다", "함께" 또는 그의 변형이 상세한 설명 및/또는 청구범위에서 사용되는 정도로, 그러한 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포함되는 것으로 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "포함하는"은 "포함한" 또는 "함유하는"과 동의어이며, 포괄적이거나 개방적이다.
본원에서 "또는"에 대한 임의의 언급은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 포괄하도록 의도된다. 본원에 사용된 바와 같은, 숫자와 관련하여 용어 "약"은 그 숫자의 10%를 더하거나 뺀 숫자를 지칭한다. 범위와 관련하여 용어 "약"은 그의 가장 낮은 값의 10%를 뺀 값과 그의 가장 큰 값의 10%를 더한 값의 범위를 지칭한다.
I. 용도 및 치료 방법
상기 논의한 바와 같이, LGL 및 NK 세포는 수많은 질환 및 장애의 발병기전에 연루되어 있다. 이러한 장애 또는 질환의 대부분은 클론 또는 비-클론 LGL 및 NK 세포의 축적을 특징으로 한다.
일부 실시양태에서, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 여기서 질환 또는 장애는 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 또는 염증성 장 질환으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 세포의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 NK 세포의 수를 감소시킨다.
또한 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 여기서 대상체는 LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염, 또는 염증성 장 질환으로부터 선택된 질환 또는 장애가 있다.
또한 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ADCC 활성을 유도하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 여기서 대상체는 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 또는 염증성 장 질환으로부터 선택된 질환 또는 장애가 있고, 여기서 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 CD94 또는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 CLPD-NK이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 LGL 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 펠티 증후군이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 류마티스 관절염이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 공격성 NK 백혈병이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 봉입체 근염이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 염증성 장 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 T-거대 과립 림프구 백혈병 (T-LGLL)이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 자연 살해-거대 과립 림프구 백혈병 (NK-LGLL)이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 CLPD-NK이고 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 CLPD-NK이고 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 T-LGLL이고 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 T-LGLL이고 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 NK-LGLL이고 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합한다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 NK-LGLL이고 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합한다.
또한 CLPD-NK의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 CLPD-NK를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여는 인간에서 CLPD-NK 증상을 개선시킨다.
또한 CLPD-NK의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 CLPD-NK를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 여기서 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여는 인간에서 CLPD-NK 증상을 개선시킨다.
일부 실시양태에서, 용어 치료하다, 치료하는 것, 치료, 개선하다, 개선하는 것, 1종 이상의 증상을 감소시키는 것, 증상을 감소시키는 것, 1종 이상의 증상을 감소시키다, 증상을 감소시키다, 및 다른 문법적 등가물은 질환 또는 장애의 1종 이상의 증상을 완화, 경감 또는 개선하거나, 부가의 증상을 예방하거나, 증상의 근본 원인을 개선 또는 예방하거나, 질환 또는 장애를 억제하거나, 예를 들어 질환 또는 장애의 발생을 저지시키거나, 질환 또는 장애를 구제하거나, 질환 또는 장애의 퇴행을 유발하거나, 질환 또는 장애로 인한 병태를 구제하거나, 또는 질환 또는 장애의 증상을 정지시키는 것을 지칭하며, 예방을 포함하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 상기 용어는 치료적 이점 및/또는 예방적 이점을 달성하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료적 이점은 치료 중인 기저 질환 또는 장애의 근절 또는 개선을 지칭한다. 또한, 치료적 이점은 일부 실시양태에서 환자가 여전히 기저 질환 또는 장애로 고통받고 있음에도 불구하고, 환자에게서 개선이 관찰되도록 기저 질환 또는 장애와 관련된 1종 이상의 생리학적 증상의 근절 또는 개선으로 달성된다. 예방적 이점을 위해, 제약 조성물은 특정한 질환 또는 장애의 발생 위험이 있는 환자, 또는 질환 또는 장애의 진단이 내려지지 않은 경우에도 질환 또는 장애의 1종 이상의 생리학적 증상을 보고하는 환자에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 유효량, 치료상 유효량 또는 제약상 유효량은 투여 중인 적어도 하나의 제약 조성물 또는 화합물 (예를 들어, 본 개시내용의 항체)의 충분한 양일 수 있으며, 이는 치료 중인 질환 또는 병태의 1종 이상의 증상을 어느 정도 구제할 것이다.
일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A)의 세포당 적어도 약 2,000개의 수용체 (예를 들어, 세포당 적어도 약 1,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 2,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 3,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 4,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 5,000개의 수용체, 또는 세포당 적어도 약 7,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 10,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 20,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 30,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 40,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 50,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 60,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 70,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 80,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 90,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 100,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 200,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 300,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 400,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 500,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 600,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 700,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 800,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 900,000개의 수용체, 세포당 적어도 약 1,000,000개 또는 그 초과의 수용체 중 임의의 것)가 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 표면 상에 발현된다. 일부 실시양태에서, 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 표면 상의 세포 표면 단백질 (예를 들어, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A)의 수용체의 수는 건강한 (예를 들어, 정상) 대상체로부터 수득된 샘플 (예를 들어, 생체 표본)과 질환 또는 장애 (예를 들어, NK 세포 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염, 또는 염증성 장 질환)가 있는 대상체로부터 수득된 샘플 간을 비교한다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A)의 발현은 LGL 및/또는 NK 세포의 표면에 특이적이다. 일부 실시양태에서, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A)의 발현은 질환 또는 장애가 있는 대상체로부터의 샘플에서 LGL 및/또는 NK 세포의 표면에 특이적이다 (예를 들어, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A). 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 표면 상에 발현된 세포 표면 단백질 (예를 들어, 수용체)의 수는, 예를 들어 실시예 1-3에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 유동 세포계수법을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 동일한 생체 표본을 사용함으로써 본 발명자들은 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A, 및 LGL 세포에 특이적인 부가의 세포 표면 단백질의 발현을 보여줄 것이다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에게 항체를 투여한 후 처음 24시간 이내, 예를 들어, 약 1시간 이내, 약 2시간 이내, 약 3시간 이내, 약 4시간 이내, 약 5시간 이내, 약 6시간 이내, 약 7시간 이내, 약 8시간 이내, 약 9시간 이내, 약 10시간 이내, 약 11시간 이내, 약 12시간 이내, 약 13시간 이내, 약 14시간 이내, 약 15시간 이내, 약 16시간 이내, 약 17시간 이내, 약 18시간 이내, 약 19시간 이내, 약 20시간 이내, 약 21시간 이내, 약 22시간 이내, 약 23시간 이내, 또는 약 24시간 이내 중 임의의 시간 내에 발생한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 (예를 들어, 대상체로부터 수득된 말초 혈액 샘플 중에서) 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수는 질환 또는 장애의 임상 진단을 위한 한계 미만으로 감소된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수는 (예를 들어, 대상체로부터 수득된 말초 혈액 샘플 중에서) 2x109개 세포/L 이하로 감소된다. 예를 들어, 문헌 [Lamy, T. et al. (2017) Blood 129:1082-1094]을 참조한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 질환 또는 장애의 임상 진단을 위한 한계 미만으로 감소시킨 것은 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안, 예를 들어 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월 또는 그 초과 중 임의의 기간 동안 대상체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 대상체에서 (예를 들어, 대상체로부터 수득된 말초 혈액 샘플 중에서) 2x109개 세포/L 이하로 감소시킨 것은 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안, 예를 들어 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월 또는 그 초과 중 임의의 기간 동안 존재한다.
일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포에 대한 검출 한계 미만으로 감소된다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포에 대한 검출 한계 미만으로 감소시킨 것은 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안, 예를 들어 적어도 약 1주, 적어도 약 2주, 적어도 약 3주, 적어도 약 4주, 적어도 약 1개월, 적어도 약 2개월, 적어도 약 3개월, 적어도 약 4개월, 적어도 약 5개월, 적어도 약 6개월 또는 그 초과 중 임의의 기간 동안 대상체에 존재한다. 일부 실시양태에서, 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포는 하기 마커를 사용하여 (예를 들어, 대상체로부터의 말초 혈액 샘플에 대해 수행된 바와 같이) 유동 세포계수법에 의해 검출된다: CD3-CD8-CD16+CD56+CD57+ (CLPD-NK 면역표현형의 경우) 또는 CD3+CD8+CD16+CD56-CD57+ (T-LGLL 면역표현형의 경우).
일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 가역적이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에게 항체를 투여한 후 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월 또는 그 초과 중 임의의 기간 내에 가역적이다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 NK 세포는 CD3 음성 및 CD56 양성, CD3 음성 및 CD16 양성, CD3 음성 및 CD57 양성, CD3 음성 및 CD94 양성, 또는 CD3 음성 및 NKG2A 양성이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 NK 세포는 CD3 음성 및 CD56 양성이다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 NK 세포는 CD3 음성 및 CD16 양성이다. NK 세포에 의해 발현되는 바이오마커 (예를 들어, CD3, CD16, CD56)는, 예를 들어 실시예 1-3에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 유동 세포계수법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단이 특정한 마커 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD57, CD94, NKG2A 등)에 대해 양성 (+)이거나 또는 이를 발현한다는 진술은 세포 상에서 또는 세포 내에서의 특정한 마커의 검출 가능한 존재를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단이 표면 마커 (예를 들어, 세포 표면 단백질)에 대해 양성이거나, + 이거나, 또는 이를 발현한다는 진술은, 예를 들어, 상기 마커와 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 예를 들어 유동 세포계수법에 의해 검출된 바와 같이 특정한 마커의 세포 표면 발현의 존재를 지칭하며, 여기서 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소형 일치 대조군 및/또는 형광 마이너스 원 (FMO) 게이팅 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 더 높은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 실질적으로 더 높은 수준에서 유동 세포계수법에 의해 검출 가능하다.
일부 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단이 특정한 마커 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD57, CD94, NKG2A 등)에 대해 음성 (-)이거나 또는 이를 발현하지 않는다는 진술은 특정한 마커의 세포 상에 또는 세포 내에서의 검출가능한 존재의 부재를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포 또는 세포 집단이 표면 마커 (예를 들어, 세포 표면 단백질)에 대해 음성이거나, - 이거나 또는 이를 발현하지 않는다는 진술은, 예를 들어, 상기 마커와 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 예를 들어, 유동 세포계수법에 의해 검출된 바와 같이, 특정한 마커의 세포 표면 발현의 부재를 지칭하며, 여기서 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소형 일치 대조군 및/또는 형광 마이너스 원 (FMO) 게이팅 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색과 실질적으로 유사하거나 그 보다 더 낮은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 대한 것보다 더 낮은 수준에서, 및/또는 상기 마커에 대해 음성인 것으로 공지된 세포에 대한 것과 실질적으로 유사하거나 그 보다 더 낮은 수준에서 유동 세포계수법에 의해 검출 가능하다.
일부 실시양태에서, 항체는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포를 감소시키기 위한, 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml, 예를 들어, 약 1 ng/ml, 약 5 ng/ml, 약 10 ng/ml, 약 15 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 25 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 35 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 45 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 55 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 65 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 75 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 85 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 95 ng/ml, 또는 약 100 ng/ml 중 임의의 것의 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 3 ng/ml 내지 약 40 ng/ml의 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 3 ng/ml의 EC50을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 40 ng/ml의 EC50을 갖는다. EC50은, 예를 들어 본 실시예에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 T 세포를 감소시키지 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체에서의 T 세포는 CD3 양성 및 CD4 양성 또는 CD3 양성 및 CD16 음성이다. T 세포에 의해 발현되는 바이오마커 (예를 들어, CD3, CD16, CD4)는, 예를 들어 본 실시예에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 유동 세포계수법을 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간, 영장류, 비-인간 영장류 (예를 들어, 아프리카 녹색 원숭이, 붉은털 원숭이 등), 농장 포유동물, 게임 포유동물, 또는 사육 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 인간 대상체는 영아, 유아, 어린이, 젊은 성인, 성인 또는 노인이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 LGL 및/또는 NK 세포와 관련된 질환, 예를 들어 CLPD-NK, LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염, 또는 염증성 장 질환이 있다.
일부 실시양태에서, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 종양 용해 증후군을 일으키지 않는다. 종양 용해 증후군은 종양 용해 증후군에 대한 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 카이로-비숍(Cairo-Bishop) 분류 시스템에 따라 측정 또는 진단될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Cairo and Bishop (2004) Br J Haematol, 127(1):3-11] 참조).
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 LGL 및/또는 NK 세포의 수준을 고갈 및/또는 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 질환 또는 장애, 예컨대 CLPD-NK, LGL 백혈병, 류마티스 관절염, 펠티 증후군, 공격성 NK 백혈병, IBM, IBD, 및 LGL 및/또는 NK 세포와 관련된 다른 질환이 있는 환자 (예를 들어, 인간 환자)에 대해 분명한 이점을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 질환 또는 장애 (예를 들어, CLPD-NK, LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 또는 염증성 장 질환)에 대한 1차 및 2차 요법, 예컨대 화학요법, 알렘투주맙 및 비장절제술에 비해 더 나은 내약성과 더 적은 부작용을 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 비-선택적인 현재 요법, 예컨대 화학요법, 알렘투주맙 및 비장절제술과 비교하여 질환 유도 세포 (예를 들어, 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포)의 보다 선택적인 고갈을 명확하게 보여준다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 LGL 및/또는 NK 세포 상의 세포 표면 단백질, 예컨대 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A, 또는 LGL 및/또는 NK 세포에 특이적인 부가의 세포 표면 단백질과 결합하고, (a) 표적과 특이적으로 결합하는 영역 및 (b) 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 분자 (예를 들어, 본 개시내용의 항체)의 투여시 인간 대상체에서 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키거나 또는 이들 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다.
A. 투여 및 투여 요법
(i) 투여 경로
일부 실시양태에서, 투여하다, 투여하는 것, 투여 등은 생물학적 작용의 원하는 부위에 치료 또는 제약 조성물의 전달을 가능하게 하는 데 사용되는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한 본 개시내용의 항체 (및 임의의 부가의 치료제)는 비경구, 폐내, 비강내 및 병변내 투여를 포함한 임의의 적합한 수단에 의해 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 정맥내 주입에 의해 투여된다. 본 개시내용의 항체의 투여는 부분적으로 투여가 단기인지 또는 만성인지에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다.
(ii) 투여 요법
본원에 제공된 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한 본 개시내용의 항체는 다양한 시점에 걸친 단일 또는 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄 또는 요법을 사용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 투여될 본 개시내용의 항체의 구체적 투여량은 특정한 표적 특이성, 질환 또는 장애의 유형, 대상체, 및 질환의 성질 및 중증도, 대상체의 신체 상태, 치료 요법 (예를 들어, 조합 치료제가 사용되는지 여부) 및 선택된 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체의 용량은 대상체의 체중 기준 약 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg의 범위일 수 있다. 본 개시내용의 항체의 예시적인 투여 요법은, 예를 들어, 적어도 6개월의 연장된 기간에 걸쳐 다수의 투여량으로 항체의 투여를 수반한다.
B. 질환
LGL과 관련된 3종의 별개의 질환이 있다: T-세포 LGL (T-LGL) 백혈병; NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK, 이전 명칭 NK-LGL); 및 공격성 NK-세포 백혈병, 예컨대 공격성 자연 살해 백혈병 (ANKL) 및 림프절외 NKL 비강 유형 (ENKL).
NK 또는 T LGL 백혈병 외에도, NK 또는 LGL 세포는 류마티스 관절염 (RA), 펠티 증후군, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 (IBM), 염증성 장 질환 (IBD) 및 다른 질환에서 중요한 역할을 한다. LGL 및 NK 세포가 일정 역할을 하는 질환 및 장애의 비-제한적 예는 LGL 백혈병, 류마티스 관절염, 펠티 증후군, 공격성 NK 백혈병, IBM 및 IBD를 포함한다. 유리하게, 본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 본질적으로 병리학적 세포를 사용하여 서로 제거하기 위해, NK 세포를 이용하는 ADCC와 같은 메커니즘을 통해 비정상적 또는 병리학적 NK 세포 (예를 들어, CLPD-NK, ANKL 또는 ENKL 세포)의 수를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 질환의 증상에 대한 예시적인 설명을 위해, 예를 들어 문헌 [Lamy, et al., Blood, 2017 x Vol. 129, No. 9; Loughran Blood, VOI 82, NO 1 (July I), 1993: pp 1-14; Semenzato G, et al., Blood. 1997;89(1):256-260; and Bourgault-Rouxel, et al., Leuk Res.2008;32(1):45-48]을 참조한다.
(i) CLPD-NK
NK-LGL 백혈병, 만성 NK 세포 림프구증가증, 만성 NK-LGL 림프증식성 장애 (LPD), NK 세포 계통 과립 림프구 증식성 장애, NK 세포 LGL 림프구증식증, 또는 무통성 과립 NK 세포 LPD로서 지칭되기도 하는, NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK)는 일반적으로 말초 혈액 NK 세포의 지속적인 (예를 들어, 6개월 이상) 증가 (예를 들어, ≥ 2x109/L)를 특징으로 한다.
CLPD-NK의 증상은 가변성 혈구감소증, 예컨대 호중구감소증 및 빈혈, 피로, 발열, 식은 땀, 재발성 감염, 류마티스 관절염, 림프절병증, 간비장비대, 피부 병변, 혈액 신생물, 혈관염, 신경병증 및 자가면역 장애를 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 CLPD-NK이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 CLPD-NK 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 CLPD-NK 증상을 감소시킨다.
CLPD-NK의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 빈혈, 호중구감소증을 측정하기 위한 실험실 시험, 완전 혈구 계수, 및/또는 자기 공명 영상화 (MRI), CT 스캔, 촉진 또는 초음파 (예를 들어, 간비장비대를 결정하기 위함), 골수 검사 및 유동 세포계수법을 사용하여 측정될 수 있다. CLPD-NK의 증상을 측정하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Swerdlow, S.H. et al. (2016) Blood 127:2375-2390]에 기재되어 있다.
(ii) LGL 백혈병
거대 과립 림프구 (LGL) 백혈병은 말초 혈액에서 거대 과립 림프구 (LGL)의 만성 상승을 나타내는 만성 림프증식성 장애이며 T 세포 LGL 백혈병이라고 한다.
LGL 백혈병의 증상은 비장비대, B 증상 (예를 들어, 전신 증상, 예컨대 발열, 식은 땀, 및 체중 감소), 빈혈, 호중구 감소증 및 재발성 감염을 포함한다. 류마티스 관절염은 종종 T-세포 LGL 백혈병 환자에서도 발견된다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 LGL 백혈병이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 LGL 백혈병 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 LGL 백혈병 증상을 감소시킨다.
LGL 백혈병의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 빈혈, 호중구감소증 및 다른 혈구감소증을 측정하기 위한 실험실 시험, 완전 혈구 계수, 자기 공명 영상화 (MRI), CT 스캔, 촉진 또는 초음파 (예를 들어, 비장비대를 결정하기 위함), 골수 검사 및 유동 세포계수법을 사용하여 측정될 수 있다. LGL 백혈병의 증상을 측정하는 방법은, 예를 들어, 문헌 [Swerdlow, S.H. et al. (2016) Blood 127:2375-2390]에 기재되어 있다.
(iii) 펠티 증후군
펠티 증후군은 류마티스 관절염, 비장비대 (예를 들어, 염증성 비장비대) 및 혈액 내 호중구 수 감소를 특징으로 하는 자가면역 질환이다. 펠티 증후군의 증상은 통증, 경직 및/또는 부어오른 관절, 류마티스 관절염과 관련된 신체 소견, 비장비대, 호중구감소증, 감염, 건성 각막결막염, 발열, 체중 감소, 피로, 피부 변색, 상처 (예를 들어, 궤양), 간비대, 빈혈, 혈소판감소증, 비정상적인 간 기능, 림프절 비대 및 혈관염을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 펠티 증후군이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 펠티 증후군 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 펠티 증후군 증상을 감소시킨다. 펠티 증후군의 증상은 관절 염증, 관절 통증 및 비장비대를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
펠티 증후군의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 빈혈, 호중구감소증, 혈소판감소증 및 다른 혈구감소증을 측정하기 위한 실험실 시험, 완전 혈구 계수, 자기 공명 영상화 (MRI), CT 스캔 또는 초음파 (예를 들어, 비장비대 및/또는 간비대를 결정하기 위함), 비정상적인 간 기능에 대한 실험실 시험, 비장비대 및/또는 간비대를 결정하기 위한 촉진, 유동 세포계수법, 질환 활성 점수-28 (DAS-28, 예를 들어 류마티스 관절염 증상을 모니터링하기 위해 사용된 바와 같음), 및 적혈구 침강 속도 (ESR)를 나타내는 DAS-28을 사용하여 측정될 수 있다.
(iv) 류마티스 관절염
류마티스 관절염은 주로 관절에 영향을 미치는 자가면역 장애이지만, 다른 기관에도 영향을 미칠 수 있으며 심혈관 질환, 골다공증, 간질성 폐 질환, 감염, 암, 피로 및 우울증과 관련될 수 있다. 류마티스 관절염의 증상은 관절이 부어 오르고, 아프고, 따뜻한 관절, 관절 염증, 관절 통증, 관절 경직, 비장비대, 류마티스 결절 (예를 들어, 피부 내), 괴사 육아종, 혈관염, 괴저 농피증, 스위트 증후군, 약물 반응, 결절 홍반, 엽 지방층염, 손가락 피부 위축, 손바닥 홍반, 피부 취약성, 미만성 원형 탈모증, 폐 섬유증, 카플란 증후군, 삼출성 흉막 삼출, 죽상 동맥경화증, 심근 경색, 뇌졸중, 심낭염, 심내막염, 좌심실 부전, 판막염, 심장 및/또는 혈관의 섬유증, 빈혈, 혈소판 계수 증가, 백혈구 계수 감소, 신장 아밀로이드증, 상공막염, 공막염, 건성 각막결막염, 각막염, 시력 상실, 간 문제, 말초 신경병증, 다발성 단신경염, 수근관 증후군, 척수병증, 대퇴축 아탈구, 척추 미끄러짐, 피로, 미열, 권태감, 조조 경직, 식욕 부진, 체중 감소, 골다공증, 암 (예를 들어, 림프종, 피부암), 및 치주염을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 류마티스 관절염이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 류마티스 관절염 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 류마티스 관절염 증상을 감소시킨다.
일부 실시양태에서, 류마티스 관절염의 증상 및 질환 상태/진행은 2010 ACR/EULAR 류마티스 관절염 분류 기준에 따라 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Aletaha et al., (2010) Annals of Rheumatic Diseases, 69(9):1580-8] 참조). 류마티스 관절염의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 적혈구 침강 속도, C-반응성 단백질, 류마티스 인자, 항-시트룰린화 단백질 항체, 빈혈 및 다른 혈구감소증을 측정하기 위한 실험실 시험, 증가된 혈소판 계수, 낮은 백혈구 계수, 완전 혈구 계수, 신장 아밀로이드증, 의학 영상화, 예컨대 X-레이, MRI, CT 스캔, 초음파 (예를 들어, 고주파 변환기를 사용한 초음파촬영; 도플러 초음파), 유동 세포계수법, 질환 활성 점수-28 (DAS-28) 및 적혈구 침강 속도 (ESR)를 나타내는 DAS-28을 사용하여 측정될 수도 있다.
(v) 공격성 NK 백혈병
공격성 NK-세포 백혈병은 NK 세포의 전신 증식과 급속하게 감소하는 임상 경과를 보이는 공격성 질환이다. 공격성 NK 백혈병은 공격성 NK 세포 림프종으로서 지칭될 수도 있다. 공격성 NK-세포 백혈병의 증상은 전신 증상 (예를 들어, 권태감, 체중 감소, 피로), 간비장비대, 림프절병증, 응고 장애, 혈구포식성 증후군, 다기관 부전, 감염 예컨대 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스, 괴사 및 전신 증상, 예컨대 발열, 부어 오른 림프절, 복통, 설사, 및 아나필락시스를 유발할 수 있는 알레르기 반응 (예를 들어, 벌레 물림, 예컨대 모기 물림에 대한 알레르기 반응)을 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 공격성 NK-세포 백혈병이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 공격성 NK-세포 백혈병 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 공격성 NK-세포 백혈병 증상을 감소시킨다.
공격성 NK 백혈병의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예컨대 예를 들어 빈혈, 호중구감소증 및 다른 혈구감소증을 측정하기 위한 실험실 시험, 완전 혈구 계수 및/또는 자기 공명 영상화 (MRI), CT 스캔, 촉진 또는 초음파 (예를 들어, 비장비대를 결정하기 위함), 골수 검사 및 유동 세포계수법을 사용하여 측정될 수 있다. 공격성 NK 백혈병의 증상을 측정하는 방법은, 예를 들어 문헌 [Swerdlow, S.H. et al. (2016) Blood 127:2375-2390]에 기재되어 있다.
(vi) 봉입체 근염
산발성 봉입체 근염으로서 지칭되기도 한 봉입체 근염 (IBM)은 원위 및/또는 근위 근육의 점진적인 약화 및 소모를 초래하는 자가면역 및 퇴행 프로세스를 특징으로 하는 염증성 근육 질환이다. 일반적으로, IBM은 면역 세포가 근육 조직으로 침입하는 것을 특징으로 한다. 일부 경우에는, IBM 환자의 혈액 내 크레아틴 키나제 수준이 상승하였다. IBM의 증상은 진행성 근육 약화, 근육 소모/위축, 잦은 트리핑 및 넘어짐, 손가락 조작 어려움, 발처짐, 제한된 이동성, 균형 장애, 근육통, 연하곤란 및 피로를 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 IBM이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 IBM 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 IBM 증상을 감소시킨다.
IBM의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 근육 생검, 혈액 검사 (예를 들어, 크레아틴 키나제를 측정하기 위함), 근전도 (EMG) 연구, NT5C1A에 대한 항체 측정을 위한 혈액 검사, 유동 세포계수법, 및 근염 치료 의향 활동 지수 (MITAX) 및 근염 질환 활성 평가 시각적 유사 척도 (MYOACT)를 포함하나 이에 제한되지는 않는 근염 질환 활성 평가 도구에 의해 측정될 수 있다.
(vii) 염증성 장 질환
염증성 장 질환 (IBD)은 결장 및 소장의 일종의 염증성 병태를 지칭한다. IBD의 유형은 궤양성 결장염 및 크론병을 포함한다. IBD의 증상은 설사, 발열, 피로, 복통, 복부 경련, 혈변, 식욕 감소, 및 체중 감소를 포함한다.
본원에 제공된 방법의 일부 실시양태에서, 질환 또는 장애는 IBD이고, 항체의 투여는 대상체에서 1종 이상의 IBD 증상을 감소시킨다. 일부 실시양태에서, 항체의 투여 후 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소는 대상체에서 1종 이상의 IBD 증상을 감소시킨다.
IBD의 증상은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 빈혈, 다른 혈구감소증 또는 감염에 대한 실험실 혈액 검사, 분변 잠혈 검사, 대장 내시경, 굴곡 S상 결장 내시경, 상부 내시경, 캡슐 내시경, 풍선 보조 장내시경, X-레이, CT 스캔, MRI 스캔, 초음파 및 유동 세포계수법에 의해 측정될 수 있다.
Ⅱ. 항체
일부 실시양태에서, CD94, CD57, NKG2A, 또는 LGL 및/또는 NK 세포 상에 발현되는 다른 세포 표면 단백질과 결합하는 분자 (예를 들어, 항체)가 본원에 제공된다. 또한 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A와 결합하고 감소된 푸코실화, 비-푸코실화 또는 ADCC 활성을 증강시키고/시키거나 Fc 수용체 예컨대 CD16에 대한 Fc 영역의 친화도를 개선시키는 돌연변이를 포함한 변형을 갖는 이뮤노글로불린 Fc 부분을 갖는 분자 (예를 들어, 항체)가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 CD94, 인간 CD57 또는 인간 NKG2A와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 CD94, CD57 또는 NKG2A와 결합한다.
일부 실시양태에서, 용어 항체는 가장 넓은 의미로 사용되며, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 원하는 항원 결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 단리된 항체이다. "단리된" 항체는 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및/또는 회수된 항체이다. 자연 환경의 오염 성분은 항체의 연구, 진단 및/또는 치료 용도를 방해하는 물질이며 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 (1) 예를 들어, 로우리 방법에 의해 결정된 바와 같이 항체의 95 중량% 초과, 일부 실시양태에서는 99 중량% 초과로 정제되거나; (2) 예를 들어, 스피닝 컵 서열분석기를 사용함으로써 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개 잔기를 수득하기에 충분한 정도로 정제되거나; 또는 (3) 예를 들어, 쿠마시 블루 또는 은 염색을 사용하여 환원성 또는 비환원성 조건 하에 SDS-PAGE에 의해 균질한 정도로 정제된다. 단리된 항체는 항체의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에 재조합 세포 내의 계내 항체를 포함한다. 그러나, 통상적으로, 단리된 항체는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.
일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체이고, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 동일하고/하거나 동일한 에피토프와 결합하지만, 예를 들어 자연적으로 발생하는 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 중에 발생하는 가능한 변이체 항체는 제외되며, 이러한 변이체는 일반적으로 소량으로 존재한다. 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하여 유도된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와 대조적으로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대항하여 유도된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된다. 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따라 사용될 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 활용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
A. 증강된 ADCC 활성
일부 실시양태에서, 항체-의존성 세포-매개 세포독성, 항체-의존성 세포성 세포독성, 항체 유도 세포 세포독성, 또는 ADCC는 Fc 수용체를 생산하는 비-특이적 세포독성 세포, 예를 들어 자연 살해 세포 (NK 세포), 호중구, 및 대식세포가 표적 세포와 결합된 항체를 인식한 다음 표적 세포의 용해를 유발시키는 세포-매개 반응을 지칭한다. 1차 매개인자 세포는 자연 살해 (NK) 세포이다. NK 세포는 FcγRIII를 발현한다 (Ravetch et al. (1991) Annu. Rev. Immunol., 9:457-92). 일부 실시양태에서, ADCC 활성은 ADCC 반응을 유발할 수 있는 항체 또는 Fc 융합 단백질의 능력을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 증강된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC) 활성을 갖는다. 일부 실시양태에서, 증강된 ADCC 활성은 항체 또는 항체의 Fc 영역이 시험관내 또는 생체내 이펙터 세포의 존재 하에 천연 또는 야생형 항체 및/또는 항체의 천연 또는 야생형 Fc 영역보다 더 효율적으로 및/또는 더 효과적으로 ADCC를 매개하거나 유도하는 것을 지칭하며, 이는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 또는 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 바와 같이 ADCC 검정을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이펙터 세포는 하나 이상의 Fc 수용체를 생산하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 적어도 FcγRIII를 생산하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC 매개 인간 백혈구의 예는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 자연 살해 세포 (NK), 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함한다.
일부 실시양태에서, ADCC 활성은, 예를 들어 본 실시예에 기재된 바와 같이, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및/또는 NK 이펙터 세포를 사용하는 51Cr 방출 검정을 사용하는 시험관내 검정 (예를 들어, 문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604] 참조), 또는 또 다른 적절한 방법을 사용하여 직접 평가될 수 있다. ADCC 활성은 ADCC 검정 (예를 들어, 실시예 2 참조) 후 남아 있는 세포의 수, 또는 표적 세포의 용해가 최대 절반인 항체 또는 Fc 융합 단백질의 농도 (예를 들어, EC50)로서 표현될 수 있다. 일부 실시양태에서, ADCC 활성은, 예를 들어 본 실시예에 기재된 바와 같이 PBMC 및/또는 NK 세포를 사용하는 생체외 검정을 사용하여 결정되고, 본 개시내용의 항체의 ADCC 활성은 ADCC 검정 후 남아 있는 표적 세포의 퍼센트 및/또는 항체의 EC50 (즉, 최대 표적 세포 고갈 또는 세포 용해의 절반이 달성되는 본 개시내용의 항체의 농도)로서 기재된다. 항체의 EC50은, 예를 들어 본 실시예에 기재된 바와 같이, 예를 들어 투여량 반응 곡선 및 그래프패드 프리즘을 사용하여 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는, 예를 들어 본 실시예에 기재된 바와 같이 생체외 검정을 사용하여 측정된 EC50 약 1 ng/ml 내지 약 100 ng/ml (예를 들어, 약 1 ng/ml, 약 2 ng/ml, 약 3 ng/ml, 약 4 ng/ml, 약 5 ng/ml, 약 10 ng/ml, 약 15 ng/ml, 약 20 ng/ml, 약 25 ng/ml, 약 30 ng/ml, 약 35 ng/ml, 약 40 ng/ml, 약 45 ng/ml, 약 50 ng/ml, 약 55 ng/ml, 약 60 ng/ml, 약 65 ng/ml, 약 70 ng/ml, 약 75 ng/ml, 약 80 ng/ml, 약 85 ng/ml, 약 90 ng/ml, 약 95 ng/ml, 또는 약 100 ng/ml 중 임의의 것)으로 ADCC 활성을 유도한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 대조군 항체 (예를 들어, 야생형 대조군 항체, 또는 동일한 표적에 대항한 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 상업적으로 입수가능한 항체)의 EC50보다 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 더 낮은 EC50을 나타낸다.
일부 실시양태에서, EC50은 명시된 노출 시간 후 기준선과 최대치 사이의 중간 반응을 유도하는 화합물 (예를 들어, 항체)의 농도를 지칭한다. 예를 들어, EC50은 이펙터 기능, 예를 들어 ADCC 활성을 매개 및/또는 유도하기 위한 항체의 효능을 측정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 용량 반응 곡선의 EC50은 최대 효과의 50%가 관찰되는 화합물 (예를 들어, 항체)의 농도를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 대조군 항체 (예를 들어, 야생형 대조군 항체, 또는 동일한 표적에 대항한 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 상업적으로 입수가능한 항체)와 비교하여 더 높은 최대 표적 세포 용해를 갖는다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 대조군 항체 (예를 들어, 야생형 대조군 항체, 또는 동일한 표적에 대항한 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 상업적으로 입수가능한 항체)의 것보다 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 100% 더 높은 최대 표적 세포 용해를 나타낼 수 있다.
(i) Fc 수용체에 대한 증강된 결합
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 야생형 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 갖는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 수용체와 결합한다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체 (FcR)는 항체의 Fc 영역과 결합할 수 있는 수용체이다. 특정 Fc 수용체는 IgG와 결합할 수 있고 (즉, γ-수용체); 이러한 수용체는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 서브클래스 뿐만 아니라 이들의 대립형질 변이체 및 대안적 스플라이싱 이벤트를 포함한다. Fc 수용체의 개요에 관해서는, 문헌 [Ravetch and China: Annu. Port. Immunol. 9, 457 (1991); Capel et al. Immunomethods, 4, 25 (1994); and de Haas et al., J. Leg. Clin. Med. 126, 330 (1995)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 야생형 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA와 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 아미노산 잔기 위치 158에 발린 잔기 또는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 예를 들어, 유니프로트 수탁 P08637 또는 VAR_003960을 참조한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 서열식별번호: 8 또는 9의 서열을 포함한다.
인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA 158F
Figure pct00001
인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA 158V
Figure pct00002
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 항체는 IgG (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4), IgA (IgA1 또는 IgA2), IgD, IgM, 또는 IgE 이소형의 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 IgG 이소형의 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 IgG1 이소형의 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA (FcγRIIIA)와 결합한다. 일부 실시양태에서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA는 아미노산 잔기 위치 158에 발린 잔기 또는 페닐알라닌 잔기를 포함한다. 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA에 대한 결합을 결정하기 위한 예시적인 검정은 관련 기술분야에 공지되어 있고; 예를 들어, 문헌 [Lazar, G.A. et al. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. 103:4005-1010; and Ferrara, C. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. 108:12669-12674]을 참조한다.
일부 실시양태에서, Fc 영역은 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역이다. 일부 실시양태에서, Fc 영역은 천연 Fc 영역 또는 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226, 또는 Pro230에서 중쇄의 카르복실-말단까지 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 또는 불변 영역에서의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]에 기재된 바와 같이, EU 인덱스라고도 하는 EU 넘버링 시스템에 따른다. 일부 실시양태에서, 야생형 Fc 영역 또는 천연 Fc 영역은 자연에서 발견되는 Fc 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산에서 Fc 영역의 천연 또는 야생형 서열과 상이한 아미노산 서열을 포함하는 Fc 영역이다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 적어도 하나의 아미노산 치환, 예를 들어, 대략 1-10 또는 1-5개의 아미노산 치환을 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 영역 변이체는 천연 또는 야생형 서열 Fc 영역 및/또는 원래 폴리펩티드의 Fc 영역과 적어도 대략 80% (예를 들어, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%) 상동이다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역 내의 적어도 하나의 아미노산 치환은 천연 또는 야생형 Fc 영역과 비교하여 변이체 Fc 영역의 이펙터 기능을 증강시킨다. 일부 실시양태에서, 이펙터 기능은 항체 이소형에 따라 달라지는 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성이다. 항체 이펙터 기능의 예는 하기를 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC); 항체-의존성 세포 매개 식균 작용 (ADCP); 세포 표면 수용체 (예를 들어, B-세포 수용체)의 하향 조절; 및 B-세포 활성화.
Fc 수용체에 대한 항체의 결합 친화도는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 표면 플라즈몬 공명 및/또는 ELISA를 사용하여 평가될 수 있으며, 예를 들어 문헌 [Shields et al. (2001) J. Biol. Chem., 276:6591-6604]에 기재된 바와 같다. 일부 실시양태에서, FcγRIIIA에 대한 본 개시내용의 항체의 친화도는 야생형 대조군의 친화도보다 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 또는 그 초과 중 임의의 것만큼 더 클 수 있다.
일부 실시양태에서, 친화도는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원 또는 표적) 간의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 예를 들어, 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화도는 일반적으로 해리 상수 (KD)로써 나타낼 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 것을 포함하여 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 분자 (예를 들어, 항체 및/또는 Fc 영역)가 또 다른 분자 (예를 들어, 항체 및/또는 Fc 영역)보다 더 큰 정도로 결합하거나, 또는 분자 (예를 들어, 항체 및/또는 Fc 영역)이 또 다른 분자 (예를 들어, 항체 및/또는 Fc 영역), 또는 다른 문법적 등가물보다 더 큰 친화도로 결합한다는 진술은 분자 (예를 들어, 항체 및/또는 Fc 영역)가 실질적으로 동일한 조건 하에 결합 검정 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같고/같거나 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 바와 같음)에서 또 다른 분자 (예를 들어, 항체 및/또는 Fc 영역)보다 표적 (예를 들어, Fc 수용체, 세포 표면 단백질)과 더 밀접하게 결합한다는 것 (예를 들어, 더 낮은 해리 상수를 가짐)을 지칭한다. 예를 들어, 항체 "X"가 항체 "Y"보다 더 큰 정도로 Fc 수용체와 결합한다는 진술은 항체 "X"가 실질적으로 동일한 조건 하에 결합 검정 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같고/같거나 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 바와 같음)에서 항체 "Y"보다 Fc 수용체와 더 밀접하게 결합한다는 것 (예를 들어, 더 낮은 해리 상수를 가짐)을 나타낸다. 또 다른 예에서, 항체 "X"가 항체 "Y"보다 더 큰 친화도로 표적 (예를 들어, 세포 표면 단백질)과 결합한다는 진술은 항체 "X"가 실질적으로 동일한 조건 하에 결합 검정 (예를 들어, 본원에 기재된 바와 같고/같거나 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 바와 같음)에서 항체 "Y"보다 표적 (예를 들어, 세포 표면 단백질)과 더 밀접하게 결합한다는 것 (예를 들어, 더 낮은 해리 상수를 가짐)을 나타낸다.
(ii) 감소된 푸코실화
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 비-푸코실화되거나 또는 푸코스-결핍성이며, 예를 들어 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조가 감소된 푸코스를 갖거나 푸코스가 결여된 Fc 영역을 포함하는 글리코실화 항체 변이체이다. 일부 실시양태에서, 푸코스가 감소되거나 푸코스가 결여된 항체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 비-푸코실화된 항체 또는 푸코스-결핍 항체는 세포주에서 생산된 동일한 항체 상의 푸코스 양에 비해 감소된 푸코스를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 비-푸코실화된 또는 푸코스-결핍 항체 조성물은 조성물 중 항체의 Fc 영역에 부착된 N-연결된 글리칸의 약 50% 미만이 푸코스를 포함하는 조성물이다.
일부 실시양태에서, 푸코실화 또는 푸코실화된은 본 개시내용의 항체의 펩티드 골격에 부착된 올리고사카라이드 내의 푸코스 잔기를 지칭한다. 구체적으로, 푸코실화된 항체는 항체 Fc 영역에 부착된 N-연결된 올리고사카라이드 중 하나 또는 둘 다 내의 가장 안쪽 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc) 잔기, 예를 들어 인간 IgG1 Fc 도메인의 위치 Asn 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에서 α(1,6)-연결된 푸코스를 포함한다. Asn297은 또한 이뮤노글로불린에서의 사소한 서열 변이로 인해, 위치 297의 상류 또는 하류 약 ± 3개의 아미노산, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, 푸코실화 정도는, 예를 들어 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해, 예컨대 매트릭스-보조 레이저 탈착-이온화 비행 시간 질량 분석법 (MALDI-TOF MS)에 의해 평가된 N-글리코시다제 F 처리된 항체 조성물에서 확인된 바와 같이, 모든 올리고사카라이드와 비교한 푸코실화된 올리고사카라이드의 백분율이다. 완전히 푸코실화된 항체의 조성물에서, 적어도 90% 또는 본질적으로 모든 올리고사카라이드는 푸코스 잔기를 포함하며, 즉 푸코실화된다. 따라서, 이러한 조성물 내의 개별 항체는 전형적으로 Fc 영역 내의 2개의 N-연결된 올리고사카라이드 각각에 푸코스 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 완전히 비-푸코실화된 항체의 조성물에서, 올리고사카라이드의 약 10% 미만이 푸코실화되거나 또는 올리고사카라이드가 본질적으로 전혀 푸코실화되지 않으며, 이러한 조성물 내의 개별 항체는 Fc 영역 내의 2개의 N-연결된 올리고사카라이드 중 어느 하나에서 푸코스 잔기를 함유하지 않는다. 부분적으로 푸코실화된 항체의 조성물에서, 올리고사카라이드의 일부만이 푸코스를 포함한다. 조성물이 Fc 영역 내의 N-연결된 올리고사카라이드에 푸코스 잔기가 결여된 본질적으로 모든 개별 항체를 포함하지 않거나, Fc 영역 내의 N-연결된 올리고사카라이드 둘 다에 푸코스 잔기를 함유하는 본질적으로 모든 개별 항체를 포함하지 않는다면, 이러한 조성물 내의 개별 항체는 Fc 영역 내의 N-연결된 올리고사카라이드 중 하나 또는 둘 다에 푸코스 잔기를 포함할 수 있거나, 상기 올리고사카라이드 중 어느 것에도 푸코스 잔기를 포함할 수 없다. 한 실시양태에서, 부분적으로 푸코실화된 항체의 조성물은 약 10% 내지 약 80% (예를 들어, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 또는 약 70% 내지 약 80%)의 푸코실화 정도를 갖는다.
일부 실시양태에서, 글리코실화 항체 변이체는 Fc 영역을 포함하며, 여기서 Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조는 푸코스가 결여되어 있다. 이러한 변이체는 개선된 ADCC 기능을 갖는다. 탈푸코실화된 또는 푸코스-결핍 항체의 예는: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]에 기재되어 있다.
감소된 푸코실화를 수반한 항체, 또는 비-푸코실화된 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 중 적어도 1개 또는 2개는 비-푸코실화될 수 있다. 예를 들어, 감소된 푸코실화를 수반한 본 개시내용의 항체, 또는 비-푸코실화된 본 개시내용의 항체는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라제 (Fut8) 녹아웃을 갖고/갖거나 β1,4-N-아세틸글리코사미닐트랜스퍼라제 III (GnT-III)를 과다발현하고/하거나 골지 μ-만노시다제 II (ManII)를 과다발현하는 세포주에서 생산될 수 있다. 감소된 푸코실화를 수반한 항체, 또는 비-푸코실화된 항체는 또한 푸코스의 전달을 촉매하는 'FUT8', 알파-1,6 푸코실트랜스퍼라제가 결핍된 세포주를 사용하고; 예를 들어, FUT8이 결핍된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 사용하고 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al., 2004]); FUT8 유전자의 발현을 차단하기 위해 작은 간섭 RNA (siRNA)를 사용하여 (문헌 [Mori et al., 2004]) 생성될 수 있다. 비-푸코실화된 또는 탈푸코실화된 항체 또는 감소된 푸코실화를 수반한 항체를 생산하는 데 사용될 수 있는 다른 세포주는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US Pat Appl No US 2003/0157108 A1, Presta, L; 및 WO 2004/056312 A1, Adams et al., especially at Example 11]), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]), 및 β1,4-N-아세틸글리코사미닐트랜스퍼라제 III (GnT-III) 및 골지 μ-만노시다제 II (ManII)를 과다발현하는 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 야생형 CHO 세포에서 생산된 동일한 항체 상의 푸코스의 양에 비해 감소된 푸코스를 갖는다. 예를 들어, 항체는 천연 CHO 세포 (예를 들어, 천연 글리코실화 패턴을 생산하는 CHO 세포, 예컨대 천연 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포)에 의해 생산되는 경우에 가질 수 있는 것보다 더 적은 양의 푸코스를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 그 위에 N-연결된 글리칸의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 미만이 푸코스를 포함하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 그 위에 N-연결된 글리칸 중 어느 것도 푸코스를 포함하지 않는 것, 즉 항체에 푸코스가 완전히 없거나, 또는 푸코스를 갖지 않거나, 비-푸코실화거나 또는 푸코실화되지 않은 항체이다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광법에 의해 측정된 바와 같이 Asn297에 부착된 모든 당구조 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조)의 합을 기준으로 하여, 예를 들어 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균 양을 계산함으로써 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. Asn297은 Fc 영역 내의 위치 약 297에 위치한 아스파라긴 잔기 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)를 지칭하지만; Asn297은 또한 항체에서의 사소한 서열 변이로 인해, 위치 297의 상류 또는 하류 약 ± 3개의 아미노산, 즉 위치 294와 300 사이에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체의 중쇄 중 적어도 1개 또는 2개는 비-푸코실화된다.
중쇄 글리코실화에 1,6-푸코스가 결여된 항체는 FcγRIII 수용체에 대한 결합 친화도가 증강되고 ADCC 활성이 증가할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Shields et al., 2002; Shinkawa et al., 2002; Okazaki, 2004; Dall'Ozzo, 2004] 참조). 일부 실시양태에서, 본원에서 제공되는 항체는 감소된 푸코실화, 비-푸코실화, 및/또는 ADCC 활성을 증강시키고/시키거나 Fc 수용체 예컨대 FcγRIII 및 CD16에 대한 Fc 영역의 친화도를 개선시키는 돌연변이를 포함한 변형을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분자 (예를 들어, 본원에 제공된 항체)는 항체 유도 세포 세포독성 (ADCC)을 유도하고 LGL 및 NK 세포의 수를 푸코실화된 또는 야생형 항체에 비해 더 높은 정도로 고갈 또는 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 푸코실화를 감소시킴으로써 ADCC 활성을 개선하도록 조작된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 분자 (예를 들어, 본원에 제공된 항체)는 항체 유도 세포 세포독성 (ADCC)을 유도하고 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 푸코실화된 또는 야생형 항체보다 더 높은 정도로 고갈 또는 감소시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체의 중쇄 중 적어도 1개 또는 2개는 비-푸코실화된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 항체의 탄수화물이 비-푸코실화되도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 항체의 탄수화물의 약 90% 미만, 예를 들어 약 90%, 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5%, 또는 약 1% 중 임의의 것의 미만이 푸코스를 함유하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 항체의 탄수화물의 약 40% 미만이 푸코스를 함유하도록 변형된다. 일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 비-푸코실화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 분자 (예를 들어, 항체)는 항체 유도 세포 세포독성 (ADCC)을 유도하고 LGL 및 NK 세포의 수를 푸코실화된 또는 야생형 항체에 비해 더 높은 정도로 고갈 또는 감소시킬 수 있다.
(iii) ADCC 활성을 증강시키는 돌연변이
본 개시내용의 항체는 변이체 Fc 영역을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 Fc 영역은 ADCC 활성을 개선시키는 Fc 영역에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 S239D, A330L, I332E, F243L 및 G236A로부터 선택된 Fc 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 변이체 IgG1 Fc 영역을 가질 수 있다. 또 다른 예에서, 본 개시내용의 항체는 S239D, A330L, I332E, F243L 및 G236A로부터 선택된 Fc 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 인간 IgG1 Fc 변이체 영역을 가질 수 있다. ADCC 활성을 증강시키는 것으로 공지되어 있는 다른 아미노산 치환은, 예를 들어 문헌 [Lazar et al., PNAS 103, 4005-4010 (2006); Shields et al., J. Biol. Chem. 276, 6591-6604 (2001); Stewart et al., Protein Engineering, Design and Selection 24, 671-678 (2011), and Richards et al., Mol Cancer Ther 7, 2517-2527 (2008)]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
(iv) 감소된 내재화
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는, 예를 들어 야생형 대조군 항체, 또는 관련 기술분야에 공지되어 있거나 또는 동일한 표적에 대해 상업적으로 입수가능한 항체와 비교 시 낮은 정도의 수용체-유도된 내재화를 갖는다. 내재화가 더 낮은 항체는 세포 표면 상의 수용체 점유도가 더 높고 세포 표면 상의 수용체-항체 복합체 수준이 더 높으며, 이는 ADCC 활성을 증강시킬 수 있다. 본 개시내용의 항체는 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것) 내재화 능력에 대해 시험관내 시험될 수 있다. 내재화 활성이 없거나 낮은 항체 후보는 시노몰구스 원숭이 및/또는 인간으로부터의 표적 (예를 들어, 시노몰구스 및/또는 인간 CD94, 시노몰구스 및/또는 인간 CD57, 또는 시노몰구스 및/또는 인간 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 결합에 관하여 추가로 시험될 수 있다. 시노몰구스 및/또는 인간 표적과 결합하는 항체는 시험관내 및 생체내 세포 사멸 검정 (예를 들어, ADCC 검정)에 사용될 수 있다. 선택된 항체의 세포 사멸 활성 (예를 들어, ADCC 활성)은 상업적으로 입수가능한 항체 또는 관련 기술분야에 공지된 항체와 비교할 수 있다.
B. 항체의 생성
본 개시내용의 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 기술 및/또는 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 사실상 임의의 표적 항원에 대항한 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb)를 제조하는 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Koehler and Milstein, Nature 256: 495 (1975), and Coligan et al. (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, VOL. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991)]을 참조한다. 간단히 말해서, 모노클로날 항체는 항원 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것, 또는 그의 일부)을 포함하는 조성물을 마우스에 주사하고, B-림프구를 수득하기 위해 비장을 제거하고, B-림프구를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생산하고, 하이브리도마를 클로닝하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하고, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하고, 하이브리도마 배양물로부터 항체를 단리함으로써 수득될 수 있다. 통상의 기술자는 항체가 인간 대상체에게 투여되어야 하는 경우, 이러한 항체가 인간 항원 (예를 들어, 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A 중 임의의 것, 또는 그의 일부)과 결합할 것임을 인식할 것이다.
MAb는 널리 확립된 다양한 기술에 의해 하이브리도마 배양물로부터 단리 및 정제될 수 있다. 이러한 단리 기술은 단백질-A 또는 단백질-G 세파로스를 사용한 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 and pages 2.9.1-2.9.3]을 참조한다. 또한, 문헌 [Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992)]을 참조한다.
면역원 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것, 또는 그의 일부)에 대한 항체의 초기 생성 후, 항체는 시퀀싱되고 후속적으로 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 뮤린 항체 및 항체 단편의 인간화 및 키메라화는 하기 논의되는 바와 같이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 개시내용의 항체를 생성하는 예시적인 방법에서, 재조합 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)이 마우스의 면역화에 활용될 수 있다. 마우스의 면역화 후에 생성된 항체는, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, ELISA 및 유동 세포계수법에 의해 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 특이적 또는 선택적 결합에 대해 분석될 수 있다. 항체는 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)과 결합할 수 있는 능력에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 비-인간 영장류 항체가 생성될 수 있다. 개코원숭이에서 치료상 유용한 항체를 생성하기 위한 일반적인 기술은, 예를 들어 문헌 [Goldenberg et al., WO 91/11465 (1991), and Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310 (1990)]에서 찾을 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 인간 항체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간 항체는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체 코딩 서열을 활용하는 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유한다. 이러한 항체는 항원 공격, 예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것, 또는 그의 일부에 대한 반응으로 특이적 인간 항체를 생산하도록 조작된 트랜스제닉 마우스로부터 수득될 수 있다. 조합 접근법 또는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌로 형질전환된 트랜스제닉 동물을 사용하여 완전한 인간 항체를 생산하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Mancini et al., 2004, New Microbiol. 27:315-28; Conrad and Scheller, 2005, Comb. Chem. High Throughput Screen. 8:117-26; Brekke and Loset, 2003, Curr. Opin. Phamacol. 3:544-50]). 특정 실시양태에서, 청구된 방법 및 절차는 이러한 기술에 의해 생산된 인간 항체를 활용할 수 있다. 완전한 인간 항체를 생산하는 다른 방법은, 예를 들어 문헌 [Dantas-Barbosa et al., 2005, Genet. Mol. Res. 4:126-40]에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이, 예를 들어 문헌 [Dantas-Barbosa et al., 2005]에 기재된 바와 같이, 특정한 질환 상태를 나타내는 정상 인간 또는 인간으로부터의 항체 생성, 또는 예를 들어, 문헌 [Green et al., 1999, J. Immunol. Methods 231:11-23, Green et al., Nature Genet. 7:13 (1994), Lonberg et al., Nature 368:856 (1994), and Taylor et al., Int. Immun. 6:579 (1994)]에 기재된 바와 같이, 상기 논의된 바와 같은 표준 면역화 프로토콜을 사용하여 인간 항체를 생산하도록 유전적으로 조작된 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)을 사용하는 것을 포함한다.
(i) 시험관내 세포 사멸 검정
본 개시내용의 항체의 생성은 항체의 시험관내 ADCC 활성을 시험하는 것을 수반할 수 있다. 본 개시내용의 항체 (예를 들어, 비-푸코실화되고/되거나, ADCC 활성을 증강시키는 돌연변이 또는 아미노산 치환, 예를 들어 변이체 또는 돌연변이된 Fc 영역을 포함하고/하거나, 내재화 수준이 낮은 항체)의 개선된 세포 사멸 또는 ADCC 활성은 LGL 및/또는 NK 세포의 고갈에 대해 시험될 수 있다. LGL 및/또는 NK 세포의 고갈은 인간에서 활성을 반복하는 예시적인 시험관내 모델을 사용하여 시험될 수 있다 (Tomasevic, et al., Growth Factors, 2014; 32(6): 223-235; Huang, et al., JCI insight, 2016;1(7):e86689). 정상 (즉, 건강한) 공여자의 혈액으로부터 단리된 말초 혈액 림프구 (PBL)는 푸코스가 있거나 없는 인간 Fc 영역 및/또는 Fc 영역 돌연변이가 있거나 없는 항체와 함께 인큐베이션된다. PBL에서 (예를 들어, PBL 샘플에서) LGL 또는 NK 세포의 사멸 수준은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예컨대 유동 세포계수법 (예를 들어, 본 실시예에 기재된 바와 같음)을 사용하여 측정된다. 항체의 세포 사멸 활성 (예를 들어, ADCC 활성)은 질환, 예컨대 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, IBM, 및 LGL 및/또는 공격성 NK 백혈병을 동반한 RA 환자로부터의 다양한 생체 표본, 예컨대 혈액, 활액, 골수 및 비장 무손상 세포 균질물을 사용하여, 예를 들어 상기 기재된 검정을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 시험할 수 있다.
상기 기재된 세포 사멸 검정에 더하여, 본 개시내용의 항체, 예를 들어, 본 개시내용의 선택된 후보 항체, 정제된 표적 세포 (예를 들어, LGL 또는 NK 세포) 및/또는 이펙터 세포 예컨대 NK 세포 또는 단핵구/대식세포를 사용하는 시험관내 ADCC 및 항체-의존성 세포성 식균 작용 (ADCP) 검정을 수행하여 본 개시내용의 항체의 세포 사멸, ADCC 및/또는 ADCP 활성을 검정할 수 있다. 세포 사멸, ADCC 및/또는 ADCP 검정, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 검정 방법은, 예를 들어 문헌 [Kolbeck et al., J Allergy Clin Immunol. 2010;125(6):1344-1353.e2; Gomez-Roman et al., J. Immunol. Methods, 2006, 308, pp. 53-67; and Ackerman et al., J. Immunol. Methods, 2011, 366, pp. 8-19]에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 시험관내 활성은 동일한 표적에 대항한 상업적으로 입수가능한 항체 또는 관련 기술분야에 공지된 항체와 비교할 수 있다.
(ii) 생체내 세포 사멸 검정
본 개시내용의 항체의 생성은, 예를 들어 LGL 또는 NK 세포 수준의 고갈 또는 감소에 대해 생체내에서 선택된 항체 후보의 활성을 나타내기 위해, 항체의 생체내 ADCC 활성을 시험하는 것을 수반할 수 있다. 본 개시내용의 항체의 생체내 세포 사멸 활성 (예를 들어, ADCC 및/또는 ADCP 활성)은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생체내에서 LGL 또는 NK 세포를 고갈 또는 감소시킬 수 있는 본 개시내용의 항체의 능력은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 시노몰구스 원숭이에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체의 생체내 세포 사멸 활성 (예를 들어, ADCC 및/또는 ADCP 활성)을 시험하기 위한 예시적인 방법에서, 시노몰구스 원숭이 코호트에서 본 개시내용의 항체의 단일 용량의 투여, 예를 들어 항체 치료 하루 전에 채혈하여, 유동 세포계수법에 의해 LGL 및 NK 세포의 투여 전 수준을 확인한다. 본 개시내용의 항체를 투여한 후, 예를 들어 본 개시내용의 항체로 치료할 때, 원숭이는 하기 시점에서 채혈된다: 1시간, 1일, 7일, 14일 및 30일. 혈액 및 다른 생체 표본 예컨대 활액, 골수 및 비장에서의 LGL 및 NK 세포의 수준은 각각의 시점에서 유동 세포계수법에 의해 결정된다. 본 개시내용의 항체의 생체내 활성은 동일한 표적에 대항한 상업적으로 입수가능한 항체 또는 관련 기술분야에 공지된 항체와 비교할 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항-CD94 항체, 예를 들어, 항-CD94 mAb 후보는 시노몰구스 CD94와 교차 반응하는 것으로 보고된 상업적으로 입수가능한 항-CD94 mAb인 항-CD94 항체 DX22와 비교할 수 있다. 통상의 기술자는 생체내 ADCC 활성을 시험하기 위해 관련 기술분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 본 개시내용의 항체의 생체내 ADCC 활성을 검정할 수 있음을 쉽게 이해할 것이다 (예를 들어, 트랜스제닉 동물 예컨대 트랜스제닉 마우스).
표적 (예를 들어, CD94, CD57 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대항한 다른 공지된 항체가 또한 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항-CD94 mAb는 하기 항-CD94 항체와 함께 (예를 들어, 시험관내 또는 생체내 ADCC 활성에 대해, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 특징에 대해) 시험될 수 있다: HP-3D9 (LSBio 카탈로그 번호 LS-C134679-100; 압노바(Abnova) 카탈로그 번호: MAB6947); 2I2; 131412 (R&D 시스템즈 카탈로그 번호: MAB1058); 13B146 (미국 바이오로지칼(US Biological) 카탈로그 번호: 030068); 13B147 (미국 바이오로지칼 카탈로그 번호: 030069); 1H1 (압노바 카탈로그 번호: MAB10543); 3G2 (바이오비트(Biorbyt) 카탈로그 번호: orb69389); DX22 (바이오레전드(Biolegend) 카탈로그 번호 305502); REA113 (밀테니이 바이오텍(Miltenyi Biotec) 카탈로그 번호: 130-098-967); KP43; EPR21003; AT13E3 (ATGen 카탈로그: ATGA0487) 및 B-D49.
(iii) 인간화
본 개시내용의 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 따라 인간화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체는 비-인간 초가변 영역 (HVR)으로부터의 아미노산 잔기 및 인간 프레임워크 영역 (FR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)이 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 항체의 것에 상응하는, 적어도 하나, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이다. 인간화 항체는 임의로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 인간화 형태는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
예를 들어, 모노클로날 항체는 마우스 이뮤노글로불린의 가변 중쇄 및 경쇄로부터 인간 항체의 상응하는 가변 도메인으로 마우스 CDR을 전달함으로써 인간화될 수 있다. 키메라 모노클로날 항체 내의 마우스 프레임워크 영역 (FR)은 또한 인간 FR 서열로 대체될 수 있다. 인간화 모노클로날 항체의 안정성 및 항원 특이성을 보존하기 위해, 하나 이상의 인간 FR 잔기가 마우스 대응물 잔기로 대체될 수 있다. 인간화 모노클로날 항체는 대상체의 치료적 처치에 사용될 수 있다. 인간화 모노클로날 항체의 생산 기술은, 예를 들어, 문헌 [Jones et al., 1986, Nature, 321:522; Riechmann et al., Nature, 1988, 332:323; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534; Carter et al., 1992, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA, 89:4285; Sandhu, Crit. Rev. Biotech., 1992, 12:437; Tempest et al., 1991, Biotechnology 9:266; Singer et al., J. Immun., 1993, 150:2844]에 기재된 바와 같이, 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
(iv) 선택
본 개시내용의 항체는 상기 기재된 파라미터, 예컨대 증강된 시험관내 및/또는 생체내 세포 사멸 활성 (예를 들어, ADCC 및/또는 ADCP 활성), 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 증강된 결합, 푸코실화 수준 (예를 들어, 감소된 푸코실화 또는 비-푸코실화) 및/또는 그의 표적 단백질 (예를 들어, CD94, CD57 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 친화도에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 인간 및/또는 시노몰구스 원숭이 CD94, CD57, 또는 NKG2A에 대한 그의 결합 특징 (예를 들어, 친화도)에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 그의 내재화 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 생체내 및/또는 시험관내 그의 세포 사멸, ADCC 및/또는 ADCP 활성에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 그의 용해도에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 이것이 약 10 mg/mL 초과의 농도에서 가용성인 경우 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 항체의 용액에서 형성된 가용성 응집체의 수준에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 항체는 낮은 수준의 가용성 응집체 (예를 들어, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 가용성 응집체)를 갖는 경우 선택된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 약 8℃ 중 임의의 온도 하에, 저장 동안, 예를 들어 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 또는 그 초과 동안 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 결합을 유지할 수 있는 능력에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 약 2℃, 약 3℃, 약 4℃, 약 5℃, 약 6℃, 약 7℃, 또는 약 8℃ 중 임의의 온도 하에, 저장 동안, 예를 들어 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 1개월, 적어도 2개월, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 또는 그 초과 동안 그의 안정성 (예를 들어, SDS-PAGE에 의해 측정된 바와 같이, 예를 들어, 분해 산물의 결여)에 기초하여 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 그의 독성에 기초하여 선택될 수 있다. 본 개시내용의 항체의 독성학 분석은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 예시적인 독성학 분석에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 인간 대상체에서 사용될 것으로 예상되는 용량보다 5배 초과 더 높은 (예를 들어, 약 5배 더 높은, 약 10배 더 높은, 약 15배 더 높은, 약 20배 더 높은, 약 25배 더 높은, 약 30배 더 높은, 약 35배 더 높은, 약 40배 더 높은, 약 45배 더 높은, 약 50배 더 높은, 약 55배 더 높은, 약 60배 더 높은, 약 65배 더 높은, 약 70배 더 높은, 약 75배 더 높은, 약 80배 더 높은, 약 85배 더 높은, 약 90배 더 높은, 약 95배 더 높은, 약 100배 더 높은, 또는 그 초과 중 임의의 것) 용량에서 시노몰구스 원숭이에서의 독성에 대해 시험된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체, 예를 들어 본 개시내용의 인간화 항체는 시험관내 및/또는 생체내에서 LGL 및/또는 NK 세포의 수준을 고갈 또는 감소시킬 수 있는 그의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. LGL 및/또는 NK 세포의 수준의 고갈 또는 감소는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들어, LGL 및/또는 NK 세포의 고갈 또는 감소는, 예를 들어 상기 기재된 바와 같고/같거나 본 실시예에 기재된 바와 같이, 세포 사멸, ADCC, 및/또는 ADCP 검정을 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최종 mAb 후보는 인간화될 수 있고, 인간 및 시노몰구스 CD94 또는 CD57 또는 NKG2a에 대한 결합, 내재화 및 ADCC 능력, 및 생체내 활성에 대해 명확히 규명될 수 있다.
또한, 일부 실시양태에서, 최종 후보는 10 mg/mL 초과 농도에서 가용성일 필요가 있고, 가용성 응집체 수준이 낮고 (<5%), ELISA에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 결합을 유지하며 (>90% 효능), 2-8℃에서 3개월 동안 인큐베이션하였을 때 SDS PAGE에 의해 측정된 바와 같이 분해 산물이 없다. 일부 실시양태에서, 최종 인간화 후보의 독성학 분석은 인간 대상체에서 사용될 것으로 예상되는 용량보다 5배 초과 더 높은 용량에서 시노몰구스 원숭이에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD94 또는 CD57 또는 NKG2A와 결합하는 항체는 LGL 또는 NK 세포의 수준을 고갈 또는 감소시킬 수 있고, LGL 백혈병, 류마티스 관절염, 펠티 증후군, 공격성 NK 백혈병, IBM, IBD 등과 같은 환자 (예를 들어, 인간 환자)에 대해 분명한 이점을 가질 수 있다. 또한, 항체 치료는 화학요법, 알렘투주맙 및 비장절제술을 포함한 1차 및 2차 요법에 비해 내약성이 우수하고 부작용이 적을 수 있다. 항체 치료는 현재의 비-선택적인 요법과 비교하여 질환 유도 세포의 더 선택적인 고갈을 입증할 수 있다. LGL 및 NK 세포가 일정 역할을 하는 질환 및 장애의 비제한적 예는 LGL 백혈병, 류마티스 관절염, 펠티 증후군, 공격성 NK 백혈병, IBM, IBD 등이다. 따라서, 본 발명은 LGL 또는 NK 세포 상의 세포 표면 단백질, 예컨대 CD94 또는 CD57 또는 NKG2A, 또는 LGL 세포에 특이적인 부가의 세포 표면 단백질과 결합하고, (a) 표적과 특이적으로 결합하는 영역 및 (b) 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 분자의 투여 시 인간 대상체에서 LGL 또는 NK 세포의 수를 감소시키거나 또는 이들 세포를 고갈시키는 방법을 제공한다.
C. 항체 표적
본 개시내용의 항체는 CD94, CD57, 또는 NKG2A와 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, LGL 및/또는 NK 세포 상에서 발현되는 세포 표면 단백질과 결합하는 항체가 본 개시내용에 포괄된다. 사실상 임의의 표적 항원에 대항한 항체, 예를 들어 모노클로날 항체 (mAb)를 제조하기 위한 기술은, 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 따라서, LGL 및/또는 NK 세포 상에서 발현되는 세포 표면 단백질과 결합하는 항체는 본원에 개시된 방법, 조성물, 제조품 또는 키트 중 임의의 것에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 용어 결합하거나, 특이적으로 결합하거나 또는 특이적인 것은 생물학적 분자를 포함한 분자의 이종 집단의 존재 하에 표적의 존재를 결정하는, 표적과 항체 간의 결합과 같은 측정가능하고 재현가능한 상호작용을 지칭한다. 예를 들어, 표적 (에피토프일 수 있음)과 결합하거나 또는 특이적으로 결합하는 항체는 다른 표적과 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 결합력으로, 더 용이하게 및/또는 더 긴 지속 기간으로 상기 표적과 결합하는 항체이다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 표적에 대한 항체의 결합 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정된 바와 같이 표적에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, 표적과 특이적으로 결합하는 항체는 < 1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, 또는 < 0.1 nM의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항체는 상이한 종으로부터의 단백질 중에서 보존되는 단백질 상의 에피토프와 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시양태에서, 특이적 결합은 배타적 결합을 포함할 수 있지만 이를 필요로 하지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD94, 인간 CD57, 또는 인간 NKG2A와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 시노몰구스 CD94, 시노몰구스 CD57, 또는 시노몰구스 NKG2A와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 및 시노몰구스 CD94, 인간 및 시노몰구스 CD57, 또는 인간 및 시노몰구스 NKG2A와 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 CD94 (자연 살해 세포 항원 CD94; CD94 엔트레즈(Entrez) 유전자 ID: 3824; KLRD1 (HGNC 기호); 유니프로트KB 식별자: Q13241; HGNC:6378; 앙상블: ENSG00000134539 OMIM: 602894; KP43), 인간 CD57 (CD57; B3GAT1 (베타-1,3-글루쿠로닐트랜스퍼라제 1); LEU7; GLCUATP 3; GlcAT-P 4; HNK1, NK-1, NK1; HGNC: 921; 엔트레즈 유전자: 27087; 앙상블: ENSG00000109956 OMIM: 151290; 유니프로트KB: Q9P2W7) 또는 인간 NKG2A (NKG2-A/NKG2-B 유형 II 통합 막 단백질; 유전자: KLRC1, 유니프로트KB: P26715 (NKG2A_HUMAN); CD159 항원 유사 패밀리 구성원 A; HGNC:6374)와 결합한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD94 단백질 또는 그의 일부와 결합하거나, 또는 인간 CD94 단백질 또는 그의 일부와 적어도 80% (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 중 임의의 것) 상동성을 갖는 단백질과 결합한다. 예시적인 인간 CD94 단백질의 아미노산 서열은 하기 서열식별번호: 1-3의 서열에 제공된다:
Figure pct00003
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 NKG2A 단백질 또는 그의 일부와 결합하거나, 또는 인간 NKG2A 단백질 또는 그의 일부와 적어도 80% (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 중 임의의 것) 상동성을 갖는 단백질과 결합한다. 예시적인 인간 NKG2A 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 4 및 5의 서열에 제공된다:
Figure pct00004
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD57 단백질 또는 그의 일부와 결합하거나, 또는 인간 CD57 단백질 또는 그의 일부와 적어도 80% (예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 중 임의의 것) 상동성을 갖는 단백질과 결합한다. 예시적인 인간 CD57 단백질의 아미노산 서열은 서열식별번호: 6 및 7의 서열에 제공된다:
Figure pct00005
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적에 대해 관련 기술분야에 공지된 항체와 동일하거나 상이한 에피토프에서 그 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 관련 기술분야에 공지된 항체와 상이한 에피토프와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합하고, 여기서 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412, 또는 12K45와 동일한 인간 CD94 상의 에피토프와 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD57과 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD57 항체 클론 NK-1과 동일한 인간 CD57 상의 에피토프와 결합하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199와 동일한 인간 NKG2A 상의 에피토프와 결합하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체가 그의 표적에 대한 또 다른 항체, 예를 들어 상업적으로 입수가능한 항체 또는 그 표적에 대한 관련 기술분야에 공지된 항체와 동일한 에피토프에서 그 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)과 결합하지 않는 경우, 본 개시내용의 항체는 경쟁 검정에서 표적에 대한 다른 항체의 결합을, 예를 들어 50% 이상 만큼 차단하지 않는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체가 그의 표적에 대한 또 다른 항체, 예를 들어 상업적으로 입수가능한 항체 또는 그 표적에 대한 관련 기술분야에 공지된 항체와 동일한 에피토프에서 그 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)과 결합하지 않는 경우, 다른 항체는 경쟁 검정에서 표적에 대한 본 개시내용의 항체의 결합을, 예를 들어 50% 이상 만큼 차단하지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적에 대해 관련 기술분야에 공지된 항체보다 더 높은 친화도로 그 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)과 결합한다. 특정 실시양태에서, 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 항체의 친화도는 해리 상수 (KD)로써 나타낼 수 있다. 친화도는 관련 기술분야에 공지된 통상적인 방법, 예컨대 유동 세포계수법 또는 웨스턴 블롯팅에 의해 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, KD는 본 개시내용의 항체의 Fab 버전 및 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)으로 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)을 사용하여 측정된다. 일부 실시양태에서, KD는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 예시적인 검정은, 예를 들어 문헌 [Drake, A.W. and Klakamp, S.L. (2007) J. Immunol. Methods 318:147-152]에 기재되어 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412, 및 12K45보다 더 큰 친화도로 인간 CD94와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 CD57과 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD57 항체 클론 NK-1보다 더 큰 친화도로 인간 CD57과 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199보다 더 큰 친화도로 인간 NKG2A와 결합한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적에 대해 관련 기술분야에 공지된 또 다른 항체보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 4.5배, 적어도 5배, 적어도 5.5배, 적어도 6배, 적어도 6.5배, 적어도 7배, 적어도 7.5배, 적어도 8배, 적어도 8.5배, 적어도 9배, 적어도 9.5배, 적어도 10배, 또는 그 초과 중 임의의 것 더 큰 친화도로 그 표적 (예를 들어, CD94, CD57 또는 NKG2A 중 임의의 것)과 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 결합에 대해 약 10 μM 미만의 KD를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 결합에 대해 약 1 μM 미만의 KD를 갖는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 결합에 대해 약 1000 nM 미만, 약 900 nM 미만, 약 800 nM 미만, 약 700 nM 미만, 약 600 nM 미만, 약 500 nM 미만, 약 400 nM 미만, 약 300 nM 미만, 약 200 nM 미만, 약 100 nM 미만, 약 90 nM 미만, 약 80 nM 미만, 약 70 nM 미만, 약 60 nM 미만, 약 50 nM 미만, 약 40 nM 미만, 약 30 nM 미만, 약 20 nM 미만, 약 10 nM 미만, 약 9 nM 미만, 약 8 nM 미만, 약 7 nM 미만, 약 6 nM 미만, 약 5 nM 미만, 약 4 nM 미만, 약 3 nM 미만, 약 2 nM 미만, 약 1 nM 미만, 약 0.5 nM 미만, 또는 약 0.1 nM 미만 중 임의의 것의 KD를 갖는다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 그의 표적 (예를 들어, CD94, CD57, 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대한 결합에 대해 약 100 pM 미만, 약 75 pM 미만, 약 50 pM 미만, 약 25 pM 미만, 약 10 pM 미만, 약 5 pM 미만, 약 1 pM 미만, 약 0.5 pM 미만, 또는 약 0.1 pM 미만 중 임의의 것의 KD를 갖는다.
표적 (예를 들어, CD94, CD57 또는 NKG2A 중 임의의 것)에 대항한 다른 공지된 항체가 또한 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 하기 항-CD94 항체가 사용될 수 있다: HP-3D9 (LSBio 카탈로그 번호 LS-C134679-100; 압노바 카탈로그 번호: MAB6947); 2I2; 131412 (R&D 시스템 카탈로그 번호: MAB1058); 13B146 (미국 바이오로지칼 카탈로그 번호: 030068); 13B147 (미국 바이오로지칼 카탈로그 번호: 030069); 1H1 (압노바 카탈로그 번호: MAB10543); 3G2 (바이오비트 카탈로그 번호: orb69389); DX22 (바이오레전드 카탈로그 번호 305502); REA113 (밀테니이 바이오텍 카탈로그 번호: 130-098-967); KP43; EPR21003; AT13E3 (ATGen 카탈로그: ATGA0487) 및 B-D49.
III. 제약 제형
일부 실시양태에서, 제약 조성물, 조성물 또는 제약 제형은 임의로 예컨대 담체, 안정제, 희석제, 분산제, 현탁제, 증점제, 부형제 등이지만 이에 제한되지는 않는 적어도 하나의 제약상 허용되는 화학 성분과 혼합된, 생물학적 활성 화합물 (예를 들어, 본 개시내용의 항체)을 지칭한다.
본원에 기재된 바와 같은 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한 본 개시내용의 항체 중 임의의 것의 제약 조성물, 제약 제형, 및/또는 조성물은 원하는 순도를 갖는 이러한 항체를 하나 이상의 임의적 제약상 허용되는 담체와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)).
제약상 허용되는 담체는 일반적으로, 이용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며, 하기를 포함하나 그에 제한되지는 않는다: 완충제 예컨대 인산염, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸; 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 [HYLENEX®, 박스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.)]을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함한 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 부가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
본원에서의 제형은 또한 치료 중인 특정한 적응증 (예를 들어, 질환 또는 장애)에 필요한 바와 같은 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게 서로 불리한 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다.
활성 성분은 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에서, 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐에 의해 제조된 마이크로캡슐에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속 방출 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출 제제의 적합한 예는 항체 또는 면역접합체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제형은 일반적으로 멸균이다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
IV. 키트 및 제조품
본 개시내용의 또 다른 측면에서, 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 상기 기재된 질환 또는 장애의 치료, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 ADCC 활성을 유도하는 방법에 유용한 물질을 함유하는 키트 또는 제조품이 제공된다. 키트 또는 제조품은 용기, 및 용기 위에 있거나 용기와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함할 수 있다. 적합한 용기는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기, IV 용액 봉지 등을 포함한다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 그 자체로 또는 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 상기 기재된 질환 또는 장애의 치료, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 ADCC 활성을 유도하는 방법에 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 봉지이거나 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 조성물 중 적어도 하나의 활성제는 본 개시내용의 항체이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 그 조성물이 본원에 제공된 방법, 예를 들어, 상기 기재된 질환 또는 장애의 치료, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 방법, 또는 대상체에서 ADCC 활성을 유도하는 방법에 사용된다는 것을 표시한다. 더욱이, 키트 또는 제조품은 (a) 본 개시내용의 항체를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가의 치료제를 포함하는 조성물이 그 안에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서 키트 또는 제조품은 그 조성물이, 예를 들어 본원에 기재된 바와 같은 특정한 질환 또는 장애를 치료하거나, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키거나, 또는 대상체에서 ADCC 활성을 유도하기 위해 사용될 수 있다는 것을 표시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 한편으론 또는 부가적으로, 키트 또는 제조품은 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정균 주사용수 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 재료를 추가로 포함할 수 있다.
하기 설명은 관련 기술분야의 통상의 기술자가 다양한 실시양태를 만들고 사용할 수 있도록 제시된다. 구체적 장치, 기술 및 적용에 대한 설명은 예시로만 제공된다. 본원에 기재된 실시예에 대한 다양한 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 명백할 것이며, 본원에 정의된 일반적인 원리는 다양한 실시양태의 요지 및 범위를 벗어나지 않고서도 다른 실시예 및 적용에 적용될 수 있다. 따라서, 다양한 실시양태는 본원에 기재되고 제시된 실시예에 제한되도록 의도되지 않지만, 청구범위와 일치하는 범위에 따라야 한다.
실시예
실시예 1: 건강한 공여자 및 T-거대 과립 림프구 백혈병 (T-LGLL) 및 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK) 환자로부터의 면역 세포 상에서의 CD94 발현의 분석.
본 실시예는 건강한 공여자 및 T-LGLL 및 NK-LGLL 환자로부터 수득된 면역 세포 상에서의 CD94 수용체 발현 수준을 결정하기 위한 실험 결과를 설명한다.
재료 및 방법
건강한 공여자 및 환자 샘플
신선한 건강한 공여자 버피 코트는 스탠포드 혈액 센터로부터 수득하였다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 피콜-파크 [GE 헬스케어 (GE Healthcare; 미국 일리노이주 시카고)] 분리를 통해 단리하고 밤방커(Bambanker) 세포 동결 배지 [불독 바이오 (Bulldog-Bio; 미국 뉴햄프셔 포츠머스)]에서 냉동보존하였다. 간단히 말해서, 버피 코트를 인산염 완충 식염수 (PBS)에 1:1 비율로 희석한 다음, 희석된 버피 코트를 적층하고 피콜에서 760 g 하에 원심분리하였다. PBMC 층을 단리하고 하류 분석 전에 PBS에서 세척하였다. 말초 혈액 백혈구 (PBL)는 적혈구 용해를 통해 단리되었다. 동결된 환자 LGLL PBMC를 수득하였다. 조직 샘플은 협동 인간 조직 네트워크에 의해 제공되었다. 조직 해리는 제조업체의 지침에 따라 밀테니이 바이오텍 종양 해리 키트를 사용하여 수행되었다.
유동 세포계수법 분석
대략 1 x 105 - 5 x 105개 세포를 비-조직 배양 처리된 96-웰 V 바닥 플레이트에 플레이팅하고 실온에서 10분 동안 인간 FcgR 차단 항체 (바이오레전드; 미국 캘리포니아주 샌디에이고)에서 인큐베이션하였다. 세포를 얼음 위에서 30분 동안 1:1000 희석으로 이플루오르(eFluor) 506 생육력 염료 [써모피셔 (ThermoFisher; 미국 매사추세츠주 월섬)]로 후속 염색한 다음, FACS 완충액 (2% 소 태아 혈청을 포함하는 PBS)에서 세척하였다. 항체 칵테일을 세포에 부가하고 얼음 위에서 30분 동안 인큐베이션한 후, FACS 완충액에서 부가의 세척 단계를 수행하였다. 울트라콤프(Ultracomp) 비드 (써모피셔; 미국 매사추세츠주 월섬)를 항체 보상에 사용하였다. 본 연구에 사용된 항체는 표 1에 제공된다.
모든 데이터 수집 및 형광 보상은 사이토플렉스(CytoFlex) [베크만 쿨터 (Beckman Coulter; 미국 조지아주 애틀랜타)]를 사용하여 수행되었다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터 분석을 수행하였다. 단일 세포는 전방 산란 영역 및 전방 산란 높이를 사용하여 게이팅된 다음, 이플루오르 506 및 전방 산란 영역을 사용하여 살아있는 세포 게이팅하였다. 단핵구는 CD14+ 전략을 사용하여 게이팅되었고; T 세포는 CD3+/CD4+/CD8+ 전략을 사용하여 게이팅되었고; B 세포는 CD3-CD19+ 전략을 사용하여 게이팅되었고; NK 세포는 CD3-/CD56+/CD57+/CD16+ 전략을 사용하여 게이팅되었고; T-LGL 백혈병 세포는 CD3+CD16+ 전략을 사용하여 게이팅되었고; NK-LGL 백혈병 세포는 CD3-CD16+ 전략을 사용하여 게이팅되었으며; 상피 세포는 CD45- 전략을 사용하여 확인되었다. 과립구는 전방 및 측면 산란에 대해 개별적으로 게이팅되었다.
CD94, CD56 및 NKG2A 발현은 상기 기재된 마커를 사용하여 개별 면역 세포 유형에 대해 결정되었다.
수용체 정량화
CD94, CD56 및 NKG2A 수용체 수는 APC-접합된 항-표적 항체로 PBMC를 염색하여 정량화하고 적절한 면역 세포 유형 (예를 들어, 상기 기재된 바와 같음)에 기초하여 게이팅되었다. 등가 가용성 형광색소 (MESF) 보정 표준 비드의 양자 APC 분자 [뱅스 래버러토리, 인크. (Bangs Laboratories, Inc.; 미국 인디애나주 피셔스)]를 공동으로 분석하여 제조업체의 프로토콜에 따라 중앙값 형광 강도 (MFI) 측정값을 MESF 단위로 변환할 수 있었다. FMO (형광 마이너스 원) 및 이소형 대조군 MESF 값을 빼서 배경 형광을 제거하였다. MESF 값은 이후에 형광단 대 단백질 비율 (제조업체에 의해 제공됨)로 나누어 항체 결합 능력 또는 수용체 수로 변환하였다.
항체
표 1은 실시예 1-3에 기재된 실험에 사용된 항체를 제공한다.
<표 1>
형광 표지된 항체.
Figure pct00006
Figure pct00007
결과
건강한 공여자
6명의 건강한 공여자로부터의 PBMC 샘플을 사용하여 CD94 발현에 관하여 스크리닝하였다. 건강한 공여자로부터의 부가의 3개의 PBMC 샘플과 2개의 말초 혈액 백혈구 (PBL) 샘플을 사용하여 CD57 및 NKG2A 발현에 관하여 스크리닝하였다. 과립구 상에서의 표적 발현을 2개의 PBL 샘플에서 분석하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, CD94는 4개의 항-CD94 상업용 항체 클론 모두로 염색하여 나타낸 바와 같이, NK 세포 상에서 많이 발현되었다 (>50%). CD94 발현은 단핵구, CD3+CD4+ T 세포 및 B 세포 상에서 낮거나 검출되지 않았다. CD3+CD8+ T 세포의 작은 서브세트는 CD94를 발현하였다 (대략 10-30%). NK 세포 (CD3-CD56+ 및 CD3-CD16+)는 각각 60-70% 및 40-45% 범위에서 CD57 및 NKG2A를 발현하였다. CD3+CD4+ T 세포의 15% 및 CD3+CD8+ T 세포의 45%도 CD57을 발현하였다. 과립구는 어떠한 표적도 발현하지 않았다. 모든 표적 발현 결과는 하기 문헌에 보고된 결과를 요약하였다 (예를 들어, 문헌 [Loughran TP J. (1993) Blood, 82(1):1-14; Zambello R (2014) Tansl Med UniSa, 8:4-11] 참조). 전반적으로, 이들 결과는 CD94가 NK 세포 및 CD3+CD8+ T 세포의 서브세트 상에서 선택적으로 발현된다는 것을 보여주었다.
<표 2>
6개의 건강한 공여자 PBMC 및 PBL 샘플에서 CD94, CD57 및 NKG2A의 유동 세포계수법 분석. 값은 표시된 마커에 대해 양성인 세포 퍼센트를 나타내며, 괄호 안에는 공여자 PBMC 및 PBL 샘플 간의 범위가 있다.
Figure pct00008
건강한 공여자로부터의 혈액 샘플을 또한 분석하여 CD14+ 단핵구, CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포, CD3-CD19+ B 세포, 과립구 (FSC/SSC 기준) 및 CD3-CD57+, CD3-CD16+ 및 CD3-/CD56+ NK 세포 상에서의 CD94 수용체의 수를 결정하였다.
대표적인 건강한 공여자 PBL 샘플에서 CD94의 유동 세포계수법 분석 결과는 도 1a에 제공된다. CD94는 NK 세포 상에서 고도로 발현되었으며, 세포당 약 40,000개 내지 약 50,000개 범위의 CD94 수용체 수를 갖는다. CD94는 CD14+ 단핵구, 과립구 (FSC/SSC), CD3+CD4+ T-세포 및 CD3-CD19+ B 세포 상에서 검출되지 않았다. CD3+CD8+ T 세포는 15-40% 범위에서 CD94를 발현하였다. 전반적으로, 이러한 결과는 CD94가 CD8+ T 세포의 서브세트인 모든 NK 세포 상에서 선택적으로 발현되었으며, 대표적인 건강한 공여자 PBL 샘플 중의 다른 세포에서는 검출되지 않았다는 것을 보여주었다.
도 1b는 6개의 건강한 공여자 PBMC 및 PBL 샘플로부터의 샘플 중의 면역 세포 상에서의 CD94 발현을 정량화하기 위한 세포 표면 CD94 수용체 밀도의 분석을 나타낸다. 구체적으로, CD94 발현은 CD14+, CD3+CD4+, CD3-CD19+, CD3+CD8+CD94-, CD3+CD8+CD94+, CD3-CD56+, CD3-CD57+, 및 CD3-CD16+ 세포에서 항-CD94 mAb 클론 HP-3D9를 사용하여 6개의 건강한 공여자 PBMC 샘플에서 평가되었다. 또한, 2명의 건강한 공여자로부터의 PBL 샘플을 사용하여 과립구 상에서의 CD94 발현을 평가하였다. CD94 수용체 발현은 약 70,000개 내지 약 120,000개 수용체/세포 (평균 = 117,200개) 범위로 NK 세포에서 풍부하였다. CD94 발현은 단핵구 (CD14+), 과립구, T-세포 (CD3+CD4+, CD3+CD8+) 및 B-세포 (CD3-CD19+) 상에서 4000개 미만 수용체/세포였다. 대부분의 CD3+CD8+ T 세포 (60-85%)는 CD94-음성이었다. 전반적으로, 이러한 결과는 CD94 수용체 밀도가 모든 NK 세포에서 높았고, CD8+ 세포의 서브세트에서 낮았으며, 건강한 공여자 PBMC 및 PBL 샘플 중의 다른 세포 집단에서는 검출되지 않았다는 것을 보여주었다.
T-LGLL 환자
T-LGLL 환자로부터의 혈액 샘플을 분석하여 CD14+ 단핵구, CD3+CD4+ T 세포, CD3-CD19+ B 세포, CD3+CD16- T 림프구, CD3+CD16+ 백혈병 세포 및 CD3-CD16+ NK 세포 상에서의 CD94 수용체 수를 결정하였다. CD3+CD16+ 백혈병 세포는 이러한 환자 PBMC 샘플 중의 림프구의 >55%를 나타내는 반면, 건강한 개인으로부터의 PBMC 샘플에서는 <10%를 나타내었다. 도 2a는 CD94bright T-LGLL 환자 샘플로부터의 세포에서 CD94 발현 및 수용체 정량화의 분석을 제공하는 반면, 도 2b는 CD94dim T-LGLL 환자 샘플로부터의 세포에서 CD94 발현 및 수용체 정량화를 보여준다.
도 2a-2b에 도시된 바와 같이, CD94는 CD3+CD16+ 백혈병 세포 및 CD3+CD16- T 림프구 및 CD3-CD16+ NK 세포의 서브세트 상에서 발현되었다. 백혈병 세포 상에서의 CD94의 발현은 CD94bright 환자 샘플과 CD94dim 환자 샘플 간에 다양하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, CD94bright 샘플에서, CD3+CD16+ 백혈병 세포는 >170,000개 CD94 수용체 및 10,000의 MFI를 나타내었다. CD94bright 샘플에서 CD3+CD16+ 백혈병 세포 상에서의 CD94의 높은 발현은 항-CD94 항체에 의해 결합될 때 이들 세포가 ADCC에 의해 완전히 고갈될 것임을 시사하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, CD94dim 샘플에서, CD3+CD16+ 백혈병 세포는 약 12,000개의 CD94 수용체 및 1,000의 MFI를 나타내었다. 다른 사람들이 이전에, 도 2b에서 CD94dim 환자 샘플과 유사한 면역 세포 마커 프로파일을 갖는 환자를 포함한 T-LGLL 환자의 서브세트가 CD94 발현에 대해 음성인 것으로 보고하였기 때문에, 이러한 발견은 놀라운 것이었다 (예를 들어, 문헌 [Barila (2019) Leukemia] 참조). T-LGLL 환자 단핵구 (CD14+), CD3+CD4+ T 세포 및 CD3-CD19+ B 세포 상에서의 C94 발현은 CD94dim 또는 CD94bright 환자 샘플에서 검출되지 않았다. 전반적으로, 이러한 결과는 CD94가 백혈병 세포, NK 세포, CD3+CD16- T 세포의 서브세트 상에서 발현되었으며, T-LGLL 환자로부터의 PBMC에서 다른 세포 상에서는 검출되지 않았다는 것을 보여주었다. 이러한 분석은 T-LGLL 세포 상에서의 CD94 수용체 수의 첫 번째 결정을 나타내는 것으로 여겨진다. CD94dim 환자 샘플에서 CD3+CD16+ 백혈병 세포 상에서의 CD94 발현의 발견은 백혈병 세포 상에서 발현된 12,000개의 수용체가 항-CD94 항체에 의해 결합될 때 ADCC에 의해 이들 세포를 완전히 고갈시키기에 충분할 것임을 시사하였다.
CLPD-NK 환자
CD94 발현의 유동 세포계수법 분석 및 수용체 정량화는 또한 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK) 환자로부터의 혈액 샘플에서 수행되었다. CD3-CD16+ 백혈병 세포는 건강한 개인으로부터의 PBMC 샘플에서의 5-10%와 비교하여, 이러한 환자 PBMC 샘플에서 림프구의 70%를 나타내었다.
도 3에 도시된 바와 같이, CD94는 세포당 500,000개의 수용체 밀도를 갖는 CD3-CD16+ NK 백혈병 세포 상에서 발현되었다. CD94 발현은 CLPD-NK 환자 단핵구 (CD14+), CD4+ T-세포 (CD3+CD4+), 및 B 세포 (CD3-CD19+) 상에서 검출되지 않았다. CD94는 작은 백분율의 CD3+CD8+ T 세포 상에서 발현되었다 (18%). 전반적으로, 이러한 결과는 CD94 발현이 백혈병 CLPD-NK 세포 상에서 높고, CD3+CD8+ T-세포에서는 낮으며, CLPD-NK 환자로부터의 다른 PBMC 상에서는 검출되지 않았다는 것을 보여주었다. 이러한 분석은 CLPD-NK 세포 상에서의 CD94 수용체 수의 첫 번째 결정을 나타내는 것으로 여겨진다. 백혈병 세포 상에서의 CD94의 매우 높은 발현은 이들 세포가 항-CD94 항체에 의해 결합될 때 ADCC에 의해 완전히 고갈될 것임을 시사하였다.
실시예 2: 건강한 공여자 및 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK) 환자로부터의 면역 세포에서 NKG2A 발현의 분석 및 ADCC 활성에 대한 항-NKG2A 항체의 효과.
본 실시예는 건강한 공여자 및 CLPD-NK 환자로부터 수득된 면역 세포 상에서의 NKG2A 수용체 발현 수준을 결정하기 위한 실험 결과를 설명한다. 본 실시예는 또한 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)에 대한 항-NKG2A 항체의 효과를 측정한 실험 결과를 보여준다.
재료 및 방법
항체-의존성 세포성 세포독성 검정
대략 1 x 105 - 2 x 105개의 신선하거나 또는 동결된 PBMC를 10% 낮은 IgG FBS를 포함한 RPMI에서 조직 배양 처리된 96-웰 U 바닥 플레이트에 플레이팅하였다. 세포를 인간 IgG1 이소형 대조군 항체, NKG2A Z199 푸코실화된 항체, 또는 NKG2A Z199 비-푸코실화된 항체의 10배 희석액에서 밤새 인큐베이션하였고, 항체 농도는 101 - 10-6 μg/ml 범위였다. 세포를 CD3, CD56 및 CD16으로 염색하여 나머지 NK 세포를 확인하였다 (예를 들어, 실시예 1에 기재된 바와 같음). 최소 10,000개의 이벤트가 림프구 집단의 유동 세포계수기에 수집되었다. 남아 있는 NK/백혈병 세포의 퍼센트는 이소형 처리된 조건에서 세포 수로 절대 계수를 정규화함으로써 계산되었다. EC50은 그래프패드 프리즘을 통해 결정되었다.
결과
건강한 공여자
건강한 공여자로부터의 혈액을 분석하여 CD56bright NK 세포 상에서의 NKG2A 수용체 수를 결정하였다. 도 4a에 도시된 바와 같이, CD3-CD56+ NK 세포 상에서의 NKG2A 수용체 수는 800,000개였다.
NK 세포가 NK 세포에 대항한 ADCC를 매개할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, Z199 푸코실화된 및 비-푸코실화된 항-NKG2A 항체를 사용하여 건강한 공여자로부터 신선하게 단리된 PBMC에서 ADCC 검정을 수행하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이, NK 세포는 푸코실화된 Z199 항체 및 비-푸코실화된 Z199 항체에 대해 각각 40 ng/ml 및 3 ng/ml의 EC50으로 용량 의존적 방식으로 고갈되었다. 전반적으로, 이러한 결과는 Z199 NKG2A 항체가 용량 의존적 방식으로 건강한 공여자 NK 세포를 선택적으로 감소시켰고, 비-푸코실화된 항체가 푸코실화된 항체보다 약 13배 더 강력하였다는 것을 보여주었다.
건강한 공여자 PBMC 샘플로부터의 T 세포 상에서의 NKG2A 발현이 또한 분석되었다. 도 5a에 도시된 바와 같이, CD3+CD8+ T 세포의 20%가 285,000개의 수용체 수를 갖는 NKG2A를 발현하였다. NKG2A-음성 세포가 항-NKG2A Z199 항체-매개 ADCC 사멸에 대해 저항성이었는지 여부를 결정하기 위해, 건강한 공여자로부터의 신선한 PBMC를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다. 세포를 푸코실화된 및 비-푸코실화된 IgG1 이소형 대조군 및 항-NKG22A Z199 항체와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 대부분의 NKG2A-음성 CD3+CD8+ T 세포는 Z199 항체의 시험된 농도 모두에서 전혀 고갈되지 않았다. 전반적으로, 이러한 결과는 Z199 NKG2A 항체가 건강한 공여자로부터 NKG2A-음성 T 세포를 고갈시키지 않았다는 것을 보여주었다.
CLPD-NK 환자
CLPD-NK 환자로부터의 혈액을 분석하여 CD3-CD16+ NK 백혈병 세포 상에서의 NKG2A 수용체 수를 결정하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, CD3-CD16+ NK 백혈병 세포의 100%는 500,000개의 NKG2A 수용체 수를 갖는 NKG2A를 발현하였다.
NK 백혈병 세포가 NK 백혈병 세포에 대항한 ADCC를 매개할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 비-푸코실화된 IgG1 이소형 대조군 및 항-NKG2A Z199 항체를 수반하여 이전에 동결된 CLPD-NK 환자 샘플로부터의 세포를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, NK 세포는 3 ng/ml의 EC50으로 용량 의존적 방식으로 고갈되었다. NK 백혈병 세포가 이러한 환자 샘플에서 세포독성 활성을 갖는 유일한 세포였기 때문에 (CD16의 발현에 의해 입증된 바와 같음), 관찰된 백혈병 세포의 고갈은 NK 백혈병 세포가 동일한 세포 유형에 대항한 ADCC를 매개하였다는 것을 시사하였다. 전반적으로, 이들 결과는 비-푸코실화된 항-NKG2A Z199 항체가 NK 백혈병 세포 (CD3-CD16+)를 효과적으로 고갈시켰다는 것을 보여주었다.
CLPD-NK 환자로부터의 혈액을 또한 분석하여 CD3+CD16-T 세포 상에서의 NKG2A 수용체의 수를 결정하였다. 도 7a에 도시된 바와 같이, CD3+CD16- T 세포는 NKG2A 발현에 대해 음성이었다. NKG2A-음성 세포가 항-NKG2A Z199 항체-매개 ADCC 사멸에 대해 저항성이었는지 여부를 결정하기 위해, 비-푸코실화된 IgG1 이소형 대조군 및 항-NKG2A Z199 항체를 수반하여 이전에 동결된 CLPD-NK 환자 샘플을 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다. 도 7b에 도시된 바와 같이, NKG2A-음성 CD3+CD16- T 세포는 시험된 농도의 항-NKG2A Z199 항체로는 전혀 고갈되지 않았다. 이러한 결과는 비-푸코실화된 항-NKG2A Z199 항체가 CLPD-NK 환자로부터의 NKG2A-음성 T-세포를 고갈시키지 않았다는 것을 보여주었다.
실시예 3: 간 유래 세포 상에서의 NKG2A 및 CD94 발현의 분석.
본 실시예는 건강한 공여자로부터 수득된 간 유래 면역 세포 상에서의 CD94 및 NKG2A 수용체 발현의 수준을 결정하기 위한 실험 결과를 설명한다.
재료 및 방법
단일 및 살아있는 간 유래 세포 (CD45-) 및 림프구 집단 (CD45/CD4/CD8/CD19/CD56+)을 실시예 1에 기재된 바와 같이 유동 세포계수법에 의해 분석하였다.
결과
단일 및 살아있는 간 유래 세포 (CD45-) 및 림프구 집단 (CD45/CD4/CD8/CD19/CD56+)을 검사하여 CD94 및 NKG2A 발현에 관하여 스크리닝하였다. 도 8a에 도시된 바와 같이, CD94는 정상 간 샘플의 NK 세포 상에서 고도로 발현되었으며, 세포당 약 200,000개의 CD94 수용체를 갖는다. CD94 발현은 또한 T-세포의 서브세트 (CD45+CD3+CD4+/CD8+) 상에 존재하였다. CD94 발현은 상피 세포 (CD45-) 및 B 세포 (CD45+CD3-CD19+) 상에서 검출되지 않았다. 도 8b에 도시된 바와 같이, NKG2A는 NK 세포에서만 검출되었으며, 200,000개의 수용체 수를 갖는다. 전반적으로, 이들 결과는 CD94 및 NKG2A가 정상 간 샘플 중의 NK 세포 상에서 발현되었다는 것을 보여주었다. CD94 및 NKG2A 발현은 또한 정상 간 샘플 중의 T 세포 상에서 낮은 수준으로 검출되었다.
실시예 4: 항-NKG2A 항체에 의해 매개된 항체-의존성 세포성 세포독성 (ADCC)의 분석
T 백혈병 세포가 T 백혈병 세포에 대항한 ADCC를 매개할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 비-푸코실화된 IgG1 이소형 대조군 및 Z199 항체를 수반하여 이전에 동결된 T-LGLL 환자 샘플로부터의 세포 (PBMC)를 사용하여 ADCC 검정을 수행하였다.
세포를 이소형 및 비-푸코실화된 Z199 항체로 밤새 0 내지 1 ug/ml 범위의 5가지 농도로 처리하였다. Y축은 Z199 및 인간 IgG1 이소형 처리된 조건에 남아 있는 백혈병 세포 (CD3+CD16+)의 수로서 표시된다.
도 9a 및 9b에 도시된 바와 같이, T-LGLL 세포는 Z199 항체에 의해 용량 의존적 방식으로 고갈되었지만, 이소형 대조군은 그렇지 않았다. 이러한 환자 샘플에서 T-LGL 백혈병 세포가 세포독성 활성 (CD16의 발현에 의해 입증된 바와 같음)을 가진 유일한 세포였기 때문에, 백혈병 세포의 고갈은 이러한 백혈병 세포가 동일한 세포 유형에 대항한 ADCC를 매개하고 있었다는 것을 시사한다.
이러한 결과는 비-푸코실화된 항-NKG2A 항체 Z199가 T 백혈병 세포를 효과적으로 고갈시킨다는 것을 입증해준다.
실시예 5: CD94 발현에 대한 IL-2의 효과
CD94 발현은 IL-2와 함께 배양된 정상 NK 세포에서 시간 경과에 따라 측정되었다.
건강한 공여자 PBMC로부터 정제된 NK 세포를 제0일부터 제4일까지 IL-2 (50 ng/ml)에서 배양하였다. 유동 세포계수법에 의해 중앙값 형광 강도로서 표시되는 CD94 발현은 형광 마이너스 원 (FMO) 및 이소형 대조군과 비교함으로써 결정되었다.
도 10에 도시된 바와 같이, CD94 발현은 IL-2 처리와 함께 배양하는 동안 시간이 지남에 따라 증가하였다. 이러한 결과는 NK 세포 상에서의 CD94 발현이 IL-2의 존재 하에 상향조절되었다는 것을 입증해준다.
본 개시내용은 이해의 명료함을 목적으로 예시 및 예를 통해 일부 상세하게 설명되었지만, 그러한 설명 및 예는 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로서 해석되서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그 전체 내용이 참조로 명시적으로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Dren Bio, Inc. <120> METHODS OF REDUCING LARGE GRANULAR LYMPHOCYTE AND NATURAL KILLER CELL LEVELS <130> 18654-2000 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/982,578 <151> 2020-02-27 <150> US 62/826,660 <151> 2019-03-29 <160> 9 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Val Phe Lys Thr Thr Leu Trp Arg Leu Ile Ser Gly Thr Leu 1 5 10 15 Gly Ile Ile Cys Leu Ser Leu Met Ser Thr Leu Gly Ile Leu Leu Lys 20 25 30 Asn Ser Phe Thr Lys Leu Ser Ile Glu Pro Ala Phe Thr Pro Gly Pro 35 40 45 Asn Ile Glu Leu Gln Lys Asp Ser Asp Cys Cys Ser Cys Gln Glu Lys 50 55 60 Trp Val Gly Tyr Arg Cys Asn Cys Tyr Phe Ile Ser Ser Glu Gln Lys 65 70 75 80 Thr Trp Asn Glu Ser Arg His Leu Cys Ala Ser Gln Lys Ser Ser Leu 85 90 95 Leu Gln Leu Gln Asn Thr Asp Glu Leu Asp Phe Met Ser Ser Ser Gln 100 105 110 Gln Phe Tyr Trp Ile Gly Leu Ser Tyr Ser Glu Glu His Thr Ala Trp 115 120 125 Leu Trp Glu Asn Gly Ser Ala Leu Ser Gln 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Cys Ile Ala Tyr Asn Pro Asn Gly Asn Ala Leu Asp 180 185 190 Glu Ser Cys Glu Asp Lys Asn Arg Tyr Ile Cys Lys Gln Gln Leu Ile 195 200 205 <210> 4 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Asn Ser Ile Leu 20 25 30 Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala 35 40 45 Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys 65 70 75 80 Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys 100 105 110 Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn 115 120 125 Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu 130 135 140 Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu 145 150 155 160 Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly 165 170 175 Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu 180 185 190 Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys 195 200 205 Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser 210 215 220 Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu 225 230 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Asn Ser Ile Leu 20 25 30 Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala 35 40 45 Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys 65 70 75 80 Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Arg 85 90 95 His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn Ser Cys 100 105 110 Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu Leu Ala 115 120 125 Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu Glu Glu 130 135 140 Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly Val Phe 145 150 155 160 Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu Ala Phe 165 170 175 Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys Ala Val 180 185 190 Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser Ile Ile 195 200 205 Tyr His Cys Lys His Lys Leu 210 215 <210> 6 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Thr Asp Ser Val Ile Tyr Ser Met Leu Glu Leu Pro Thr Ala Thr 1 5 10 15 Gln Ala Gln Asn Asp Tyr Gly Pro Gln Gln Lys Ser Ser Ser Ser Arg 20 25 30 Pro Ser Cys Ser Cys Leu Val Ala Ile Ala Leu Gly Leu Leu Thr Ala 35 40 45 Val Leu Leu Ser Val Leu Leu Tyr Gln Trp Ile Leu Cys Gln Gly Ser 50 55 60 Asn Tyr Ser Thr Cys Ala Ser Cys Pro Ser Cys Pro Asp Arg Trp Met 65 70 75 80 Lys Tyr Gly Asn His Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu Glu Lys Asp Trp 85 90 95 Asn Ser Ser Leu Glu Phe Cys Leu Ala Arg Asp Ser His Leu Leu Val 100 105 110 Ile Thr Asp Asn Gln Glu Met Ser Leu Leu Gln Val Phe Leu Ser Glu 115 120 125 Ala Phe Cys Trp Ile Gly Leu Arg Asn Asn Ser Gly Trp Arg Trp Glu 130 135 140 Asp Gly Ser Pro Leu Asn Phe Ser Arg Ile Ser Ser Asn Ser Phe Val 145 150 155 160 Gln Thr Cys Gly Ala Ile Asn Lys Asn Gly Leu Gln Ala Ser Ser Cys 165 170 175 Glu Val Pro Leu His Trp Val Cys Lys Lys Cys Pro Phe Ala Asp Gln 180 185 190 Ala Leu Phe 195 <210> 7 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Thr Asp Ser Val Ile Tyr Ser Met Leu Glu Leu Pro Thr Ala Thr 1 5 10 15 Gln Ala Gln Asn Asp Tyr Gly Pro Gln Gln Lys Ser Ser Ser Ser Arg 20 25 30 Pro Ser Cys Ser Cys Leu Val Ala Ile Ala Leu Gly Leu Leu Thr Ala 35 40 45 Val Leu Leu Ser Val Leu Leu Tyr Gln Trp Ile Leu Cys Gln Gly Ser 50 55 60 Asn Tyr Ser Thr Cys Ala Ser Cys Pro Ser Cys Pro Asp Arg Trp Met 65 70 75 80 Lys Tyr Gly Asn His Cys Tyr Tyr Phe Ser Val Glu Glu Lys Asp Trp 85 90 95 Asn Ser Ser Leu Glu Phe Cys Leu Ala Arg Asp Ser His Leu Leu Val 100 105 110 Ile Thr Asp Asn Gln Glu Met Ser Leu Leu Gln Val Phe Leu Ser Glu 115 120 125 Ala Phe Cys Trp Ile Gly Leu Arg Asn Asn Ser Gly Trp Arg Trp Glu 130 135 140 Asp Gly Ser Pro Leu Asn Phe Ser Arg Ile Ser Ser Asn Ser Phe Val 145 150 155 160 Gln Thr Cys Gly Ala Ile Asn Lys Asn Gly Leu Gln Ala Ser Ser Cys 165 170 175 Glu Val Pro Leu His Trp Val Cys Lys Lys Val Arg Leu 180 185 <210> 8 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 9 <211> 254 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250

Claims (45)

  1. 인간 CD94, 인간 CD57 및 인간 NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 질환 또는 장애는 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항체의 투여가 대상체에서 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포의 수를 감소시키는 것인 방법.
  3. 인간 CD94, 인간 CD57 및 인간 NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 방법이며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 대상체는 LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 장애가 있는 것인 방법.
  4. 인간 CD94, 인간 CD57 및 인간 NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택된 세포 표면 단백질과 특이적으로 결합하는 항체의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 ADCC 활성을 유도하는 방법이며, 여기서 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하고, 대상체는 NK 세포의 만성 림프증식성 장애 (CLPD-NK), LGL 백혈병, 펠티 증후군, 류마티스 관절염, 공격성 NK 백혈병, 봉입체 근염 및 염증성 장 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 또는 장애가 있고, 대상체에 대한 항체의 투여는 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수를 감소시키는 것인 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면 단백질의 세포당 적어도 약 2,000개의 수용체가 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 표면 상에서 발현되는 것인 방법.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포 수의 감소가, 항체의 투여 전 인간 대상체에서 말초 혈액 NK 세포 수와 비교하여 적어도 약 25%의 감소를 포함하는 것인 방법.
  7. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소가, 대상체에게 항체를 투여한 후 처음 24시간 이내에 발생하는 것인 방법.
  8. 제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수가, 질환 또는 장애의 임상 진단을 위한 한계 미만으로 감소되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수의, 질환 또는 장애의 임상 진단을 위한 한계 미만으로의 감소가, 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안 대상체에 존재하는 것인 방법.
  10. 제2항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수가, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포에 대한 검출 한계 미만으로 감소되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포의 수의, 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포에 대한 검출 한계 미만으로의 감소가, 대상체에게 항체를 투여한 후 적어도 약 1주 동안 대상체에 존재하는 것인 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 말초 혈액 LGL 및/또는 NK 세포 수의 감소가 가역적인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 항체의 투여가, 대상체에서의 말초 혈액 NK 세포의 수를 감소시키는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 대상체에서의 NK 세포가 CD3 음성 및 CD56 양성, CD3 음성 및 CD16 양성, CD3 음성 및 CD57 양성, CD3 음성 및 CD94 양성, 또는 CD3 음성 및 NKG2A 양성인 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 항체가 약 3 ng/ml 내지 약 40 ng/ml의 EC50을 갖는 것인 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 T 세포를 감소시키지 않는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 대상체에서의 T 세포가 CD3 양성 및 CD4 양성 또는 CD3 양성 및 CD16 음성인 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 종양 용해 증후군을 일으키지 않는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가, 비-푸코실화된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA와 결합하는 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA가 서열식별번호: 8 또는 9의 서열을 포함하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가
    (a) 인간 CD94와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412 또는 12K45와 동일한 인간 CD94 상의 에피토프와 결합하지 않거나;
    (b) 인간 CD57과 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD57 항체 클론 NK-1과 동일한 인간 CD57 상의 에피토프와 결합하지 않거나; 또는
    (c) 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199와 동일한 인간 NKG2A 상의 에피토프와 결합하지 않는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가
    (a) 인간 CD94와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412 또는 12K45보다 더 큰 친화도로 인간 CD94와 결합하거나;
    (b) 인간 CD57과 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-CD57 항체 클론 NK-1보다 더 큰 친화도로 인간 CD57과 결합하거나; 또는
    (c) 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하며, 여기서 항체는 항-NKG2A 항체 클론 Z199보다 더 큰 친화도로 인간 NKG2A와 결합하는 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 펠티 증후군이고, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 1종 이상의 펠티 증후군 증상을 감소시키는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 봉입체 근염이고, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 1종 이상의 봉입체 근염 증상을 감소시키는 것인 방법.
  27. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 공격성 NK 백혈병이고, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 1종 이상의 공격성 NK 백혈병 증상을 감소시키는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 류마티스 관절염이고, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 1종 이상의 류마티스 관절염 증상을 감소시키는 것인 방법.
  29. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 LGL 백혈병이고, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 1종 이상의 LGL 백혈병 증상을 감소시키는 것인 방법.
  30. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 장애가 CLPD-NK이고, 대상체에 대한 항체의 투여가 대상체에서 1종 이상의 CLPD-NK 증상을 감소시키는 것인 방법.
  31. CLPD-NK의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 CLPD-NK를 치료하는 방법이며, 여기서 항체는 인간 NKG2A와 특이적으로 결합하고, 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 항체가 항-NKG2A 항체 클론 Z199와 동일한 인간 NKG2A 상의 에피토프와 결합하지 않는 것인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 항체가 항-NKG2A 항체 클론 Z199보다 더 큰 친화도로 인간 NKG2A와 결합하는 것인 방법.
  34. CLPD-NK의 치료를 필요로 하는 인간 대상체에게 유효량의 항체를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 인간 대상체에서 CLPD-NK를 치료하는 방법이며, 여기서 항체는 인간 CD94와 특이적으로 결합하고, 항체는 야생형 IgG1 Fc 영역과 비교하여 증강된 ADCC 활성을 포함하는 인간 이뮤노글로불린 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  35. 제34항에 있어서, 항체가 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412 또는 12K45와 동일한 인간 CD94 상의 에피토프와 결합하지 않는 것인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 항체가 항-CD94 항체 클론 HP-3D9, DX22, 131412 및 12K45보다 더 큰 친화도로 인간 CD94와 결합하는 것인 방법.
  37. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여가, 인간 대상체에서 말초 혈액 LGL 또는 NK 세포의 수를 항체의 투여 전 인간 대상체에서의 말초 혈액 NK 세포의 수와 비교하여 적어도 약 25% 감소시키는 것인 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체에서의 NK 세포가 CD3 음성 및 CD56 양성, CD3 음성 및 CD16 양성, CD3 음성 및 CD57 양성, CD3 음성 및 CD94 양성, 또는 CD3 음성 및 NKG2A 양성인 방법.
  39. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여가 인간에서 T 세포를 감소시키지 않는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 인간 대상체에서의 T 세포가 CD3 양성 및 CD4 양성 또는 CD3 양성 및 CD16 음성인 방법.
  41. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여가 인간에서 종양 용해 증후군을 일으키지 않는 것인 방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가, 비-푸코실화된 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하는 항체보다 더 큰 정도로 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA와 결합하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 인간 세포성 Fc 감마 수용체 IIIA가 서열식별번호: 8 또는 9의 서열을 포함하는 것인 방법.
  45. 제31항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 대상체에 대한 항체의 투여가 인간에서 1종 이상의 CLPD-NK 증상을 개선시키는 것인 방법.
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