ES2839398T3

ES2839398T3 - Purificación de partículas de virus adenoasociadas recombinantes que comprende una etapa de purificación de afinidad

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Publication number: ES2839398T3
Application number: ES16704576T
Authority: ES
Inventors: Nicole Brument
Original assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Association Francaise Contre les Myopathies
Current assignee: Universite de Nantes; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM; Association Francaise Contre les Myopathies
Priority date: 2015-02-09
Filing date: 2016-02-09
Publication date: 2021-07-05
Anticipated expiration: 2036-02-09
Also published as: US20210324343A1; EP3054007A1; US20190382733A1; PT3256574T; CA2975569A1; WO2016128408A1; EP3256574B1; US11021689B2; JP2018507707A; EP3256574A1; SI3256574T1; JP6868572B2

Abstract

Un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, que comprende las etapas de: a) tratar un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen partículas de rAAV con un detergente, dicho material de partida comprende un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo, b) realizar una filtración profunda del material de partida, por lo que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV; c) someter la composición clarificada que contiene rAAV a una etapa de purificación por inmunoafinidad, mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV; d) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a: d1) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico, en la que la elución se realiza usando un gradiente de sal y en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, con lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV; o d2) una etapa de centrifugación en gradiente de densidad, en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV; e) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas,

Description

DESCRIPCIÓN

Purificación de partículas de virus adenoasociadas recombinantes que comprende una etapa de purificación de afinidad

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la purificación de partículas de virus adenoasociados (rAAV). En particular, se refiere a métodos para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV).

Antecedentes de la invención

La administración de genes es un método prometedor para el tratamiento de enfermedades adquiridas y heredadas. Se han descrito varios sistemas basados en virus para fines de transferencia de genes, incluidos los sistemas basados en virus adenoasociados (AAV). El AAV es un parvovirus de ADN auxiliar-dependiente que pertenece al género Dependovirus. AAV requiere coinfección con un virus auxiliar no relacionado, por ejemplo, adenovirus, virus del herpes o vaccinia, para que se produzca una infección productiva. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV establece un estado latente insertando su genoma en un cromosoma de la célula huésped. La infección posterior por un virus auxiliar rescata el genoma viral integrado, que luego puede replicarse para producir una progenie viral infecciosa.

El AAV tiene una amplia gama de huéspedes y puede replicarse en células de cualquier especie en presencia de un virus auxiliar adecuado. Por ejemplo, el AAV humano se replicará en células caninas coinfectadas con un adenovirus canino. El AAV no se ha asociado con ninguna enfermedad humana o animal y no parece alterar las propiedades biológicas de la célula huésped tras la integración. Para una revisión de AAV, véase, por ejemplo, Berns y Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32: 243-307.

Le Meur et al. (“Restoration of vision in RPE65-deficient Briard dogs using an AAV serotype 4 vector that specifically targets the retinal pigmented epithelium”; Gene Therapy; Vol. 14, 292-303; 2007) enseña el uso de un rAAV para restaurar la visión en un Perro con deficiencia de RPE65.

Petit et al. (“Restoration of vision in the pde6p-deficient Dog, a Large Animal Model of Rod-cone Dystrophy”; Molecular Therapy”; Vol. 20, no. 11, 2019-2030”; 2012) enseña el uso de un rAAV para restaurar visión en un perro con deficiencia de PDE6p.

Por todas estas razones, se ha propuesto el uso de virus adenoasociados para terapia génica. Sin embargo, todavía faltan aplicaciones debido al requisito de preparaciones que tengan suficiente pureza y/o infectividad para uso clínico. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de nuevos métodos para purificar partículas de virus adenoasociado (rAAV). En particular, sigue existiendo la necesidad de métodos escalables que estén bien definidos, reproducibles y dentro de condiciones ambientales controladas de acuerdo con las Buenas Prácticas de Fabricación (GMP).

En particular, sigue existiendo la necesidad de métodos para purificar partículas de virus adenoasociados (rAAV) que requieran un número limitado de etapas.

También existe la necesidad de métodos para purificar partículas de virus adenoasociados (rAAV) que sean adecuadas para su uso como medicamento y/o terapia génica.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos escalables para purificar partículas de rAAV y composiciones de las mismas, con alta pureza e infectividad.

Se han descrito en la técnica anterior métodos para purificar partículas de virus adenoasociados. Sin embargo, esos métodos no son necesariamente satisfactorios para producir partículas de rAAV que sean directamente adecuadas para su uso como medicamento y/o para terapia génica.

El documento WO2010/148143 enseña un método para aislar partículas de AAV de contaminantes, tales como contaminantes de cultivos de producción o contaminantes en proceso, por captura y elución de resinas de apatita.

El documento WO2011/094198 enseña un método para purificar partículas de AAV, que incluye una etapa de cromatografía en columna de intercambio iónico y una etapa de filtración de flujo tangencial.

El documento WO03/097797 enseña un método para purificar partículas de virus con niveles reducidos de ADN contaminante, que puede incluir etapas de lisis celular, filtración profunda y/o centrifugación, ultracentrifugación, tratamiento con nucleasas, cromatografía de intercambio aniónico y filtración de flujo tangencial.

Por otro lado, muchas de las técnicas disponibles tienen la desventaja de requerir un tratamiento extensivo previo de los extractos celulares, incluido el gradiente de densidad, el tratamiento con nucleasas y detergentes antes de la etapa de cromatografía. Estos tratamientos adicionales hacen que todo el proceso sea menos satisfactorio a escala industrial.

Se ha informado que la cromatografía de inmunoafinidad es un método de purificación rápido en una sola etapa para purificar virus adenoasociados (AAV). Sin embargo, su uso es todavía limitado, debido a la naturaleza altamente específica de los anticuerpos, o fragmentos de los mismos, cuando se inmovilizan sobre un soporte cromatográfico. Es más, los soportes de cromatografía de inmunoafinidad, cuando se utilizan para métodos de purificación de una etapa, pueden ser propensos a generar un rAAV purificado contaminado por una gran proporción de partículas vacías y, por tanto, dificultar su uso para la administración directa en terapia génica.

Se ha informado de la purificación por afinidad de péptidos como una alternativa a la inmunoafinidad o cromatografía de afinidad basada en anticuerpos.

Pulicherla et al. (“Peptide affinity reagents for AAV capsid recognition and purification”; Gene Ther.; 18 (10): 1020 1024; 2011) informa un método para purificar las cápsidas de AAV8 que comprende una etapa de purificación por afinidad de péptidos usando un péptido basado en Pep8, seguido de una cromatografía de intercambio aniónico. Sin embargo, el método tiene la desventaja de estar restringido a las cápsidas de AAV8 y requiere una optimización significativa para producir preparaciones de partículas de rAAV de grado clínico.

En particular, la purificación por afinidad de péptidos requiere aislar y caracterizar nuevos ligandos de péptidos y generar una columna de cromatografía GMP compatible con estos ligandos; una etapa que puede llevar mucho tiempo y ser expansivo y, por lo tanto, un cuello de botella para la escalabilidad de todo el proceso.

Por tanto, sigue existiendo la necesidad de métodos novedosos que puedan ampliarse con respecto a cuestiones de buenas prácticas de fabricación, que sigan siendo aceptables desde un punto de vista económico y adecuados para su uso como medicamento o para terapia génica.

También existe la necesidad de métodos para purificar partículas de rAAV a partir de un material de partida que contenga partículas de rAAV que pertenezcan a una pluralidad de serotipos.

También existe la necesidad de métodos para purificar partículas de rAAV con cromatografía de inmunoafinidad, con partículas vacías reducidas en las partículas de rAAV purificadas.

También existe la necesidad de nuevas partículas purificadas de rAAV y composiciones de las mismas, como tales y/o para su uso como medicamento o para terapia génica, que puedan purificarse adicionalmente mediante dichos procesos y que sigan siendo adecuadas para producir partículas de rAAV en una célula huésped determinada.

Resumen de la invención

La presente divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración en profundidad de un material de partida obtenido previamente de células que producen partículas de rAAV, seleccionándose dicho material de partida en un grupo que comprende un lisado celular y un sobrenadante de cultivo, por lo que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV a una etapa de purificación por afinidad, mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

c1) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico en la que la elución se realiza usando un gradiente de sal, preferiblemente un gradiente de sal lineal, y en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV; o

c2) una etapa de centrifugación en gradiente de densidad, en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV).

En particular, la invención tal como se define en las reivindicaciones se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, que comprende las etapas de:

a) tratar un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen partículas de rAAV con un detergente, dicho material de partida comprende un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo,

b) realizar una filtración profunda del material de partida, mediante la cual se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

c) someter la composición clarificada que contiene rAAV a una etapa de purificación por inmunoafinidad, mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

d) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

d1) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico, en la que la elución se realiza usando un gradiente de sal y en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV; o

d2) una etapa de centrifugación en gradiente de densidad, en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

e) someter la segunda composición enriquecida con rAAV a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas,

en el que dicho método no comprende una etapa de cromatografía de apatita, y

en el que dichas partículas de rAAV pertenecen a un serotipo de cápsida de AAV seleccionado del grupo que consiste en AAV4, AAVrhIO, AAV2, AAV8 y AAV9.

También se divulgan en el presente documento partículas de rAAV purificadas que se obtienen mediante la realización del método descrito anteriormente; y una composición de partículas de rAAV purificada que comprende al menos una partícula de rAAV purificada como se definió anteriormente.

También se divulgan en el presente documento dichas partículas de rAAV purificadas y composiciones de las mismas, para uso en terapia génica y/o para la preparación de un medicamento para uso en terapia génica.

Breve descripción de las figuras

• Figura 1A: Cartografía del casete de expresión de un plásmido AAV que codifica PDE6p humana. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína PDE6p humana está asociada en su extremo 5' a un promotor de la rodopsina quinasa humana (RK) y en su extremo 3' a un sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (bGHpA), flanqueado por secuencias de Repetición Terminal Invertida (ITR).

• Figura 1B: Cartografía del casete de expresión de un plásmido AAV que codifica RPE65 humano. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína RPE65 humana está asociada en su extremo 5' a un promotor RPE65 humano y en su extremo 3' a un sitio de poliadenilación de la hormona del crecimiento bovino (bGHpA), flanqueado por secuencias de Repetición Terminal Invertida (ITR)

• Figura 2: Cartografía del plásmido AAV completo que comprende el casete de expresión que codifica la PDE6p humana. El casete de expresión está delimitado por secuencias ITR como se define en la figura 1. Los sitios de restricción se definen como EcoRV, SpeI y HindIII. El plásmido incluye un marcador de resistencia adicional a Kanamicina (Kan/neoR) y un origen Col1. La direccionalidad de las secuencias se indica con flechas de acuerdo con la nomenclatura estándar.

• Figura 3A: Cromatograma de la etapa completa de la columna AVB

Las curvas representan la absorbancia (eje izquierdo en mAU) a 280 nm (línea A) y 260 nm (línea B). La línea C representa la conductividad en mS/cm (eje derecho). La línea D representa el pH. Los cuadrados vacíos muestran las etapas de elución y la inyección de la muestra.

• Figura 3B: Pico de zoom del AAV eluido de la etapa de la columna AVB

Las curvas representan la absorbancia (eje izquierdo en mAU) a 280 nm (línea A) y 260 nm (línea B). La línea C representa la conductividad en mS/cm (eje derecho). La línea D representa el pH. El cuadrado vacío muestra dónde se eluyen las fracciones que contienen a Av .

Descripción detallada de la invención

La invención se dirige a las necesidades mencionadas anteriormente.

La presente invención proporciona un método de purificación de partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAv) que incluye dos características únicas que lo distinguen de los procesos actuales de purificación de partículas de AAV escalables “estándar de la industria”: 1) un proceso de plataforma modular que se puede utilizar para la purificación de diferentes serotipos de AAV/variantes de cápsida con alta pureza, y que es adecuado para producir preparaciones directamente adecuadas para aplicaciones clínicas; y 2) una secuencia única de etapas del proceso, que incluye una cromatografía de afinidad (inmunoafinidad o cromatografía de afinidad peptídica) seguida de al menos una etapa de centrifugación en gradiente de densidad, o al menos una cromatografía de intercambio aniónico preferiblemente realizada usando un gradiente de sal lineal.

Sorprendentemente, esas características confieren una escalabilidad inesperada para purificar un material de partida, como un lisado celular o un sobrenadante de cultivo. En particular, este proceso tiene la ventaja de ser adecuado para la optimización, con el fin de preparar partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas que tengan una infecciosidad óptima y que sean adecuadas para la terapia génica.

El uso de uno o más etapas adicionales, que incluye las etapas de cromatografía aniónica y/o centrifugación en gradiente de densidad, conduce a una separación óptima de partículas vacías y llenas sobre dicho soporte, y por tanto es adecuado para aislar partículas rAAV de una manera mejorada. Ventajosamente, este método de purificación de múltiples etapas permite purificar preparaciones de rAAV de grado clínico a escala industrial.

Ventajosamente, la composición se puede pasar a través del soporte de cromatografía de intercambio aniónico usando un gradiente de sal lineal. Sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, los inventores también tienen el concepto de que el gradiente de sal lineal proporciona una separación más eficaz de las especies eluidas, en comparación con los gradientes de sal escalonada. La diferencia radica en la pendiente más baja del gradiente, que permite la formación de un lento aumento en la concentración de sal y, por lo tanto, una separación óptima de las partículas de rAAV dentro del soporte cromatográfico.

Según el conocimiento de los inventores, es el primer método descrito “estándar de la industria” para purificar partículas de rAAV de grado clínico, en particular partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV4, que implica un método de purificación de múltiples etapas que comprende una etapa de afinidad de cromatografía, en particular una etapa de cromatografía de inmunoafinidad. De hecho, los métodos reportados anteriormente para purificar partículas de rAAV implicaban etapas de cromatografía de afinidad o inmunoafinidad de una sola etapa, y/o no eran métodos “estándar de la industria”.

Además, los métodos de la invención son particularmente adecuados para purificar serotipos particulares de rAAV, debido a la mayor proporción de partículas completas en el producto final.

Además, el ADN residual al final del proceso está de acuerdo con los estándares clínicos, incluso en ausencia de tratamiento con detergentes y nucleasas, incluidas las ADNasas.

Por tanto, la divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), y es particularmente adecuado para purificar partículas de rAAV que pertenecen a un serotipo de AAV seleccionado en un grupo que comprende, o consiste en, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9, AAV10 y serotipos derivados del macaco rhesus que incluyen AAVrh10 y mezclas de los mismos; en particular AAV4.

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

Una etapa de purificación por afinidad puede consistir en una etapa de purificación por afinidad de péptidos o una etapa de purificación por inmunoafinidad.

De acuerdo con una primera realización, la divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV a una etapa de purificación por inmunoafinidad, mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

El material de partida puede comprender partículas de rAAV que pertenecen a un serotipo o que pertenecen a una pluralidad de serotipos, incluidas partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV4, a AV2 y/o AAV10.

En particular, el material de partida puede comprender partículas de rAAV que pertenecen a un serotipo, o que pertenecen a una pluralidad de serotipos, incluidas partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV4.

Preferiblemente, la divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) que pertenecen al serotipo AAV4, que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración en profundidad de un material de partida obtenido previamente a partir de células que producen dichas partículas de rAAV4 pertenecientes al serotipo a AV4, seleccionándose el material de partida en un grupo que comprende un lisado celular y un sobrenadante de cultivo, por lo que se obtiene una composición clarificada que contiene rAAV previsto;

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV4 a una etapa de purificación por inmunoafinidad, mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV4;

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV4 al menos una vez a

c2) una etapa de centrifugación en gradiente de densidad, en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV4;

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV4 a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) pertenecientes al serotipo AAV4.

Las partículas de rAAV purificadas divulgadas en el presente documento comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica un producto génico deseable. Dichos productos incluyen, sin limitación, ARNip, moléculas anticodificantes, miARN, ribozimas y similares. Otros productos incluyen ácidos nucleicos que codifican hormonas, receptores de crecimiento, ligandos y proteínas útiles para la terapia génica. De acuerdo con la invención, la expresión “que comprende”, tal como en “que comprende las etapas de”, también se entiende como “que consiste en”, tal como en “que consiste en las etapas de”.

Métodos para obtener partículas de virus adenoasociadas recombinantes purificadas

La divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV a una etapa de purificación por afinidad, tal como una etapa de purificación por inmunoafinidad o una etapa de purificación por afinidad peptídica, mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

En particular, la etapa de purificación por afinidad es una etapa de purificación por inmunoafinidad.

Más particularmente, la divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

De acuerdo con algunas realizaciones, el método incluye una etapa de tratamiento con detergentes y/o nucleasas, incluidas las ADNasas.

De acuerdo con algunas realizaciones, el método no incluye una etapa de tratamiento con detergentes y/o nucleasas, incluidas las ADNasas.

De acuerdo con otra realización, las partículas de rAAV pertenecen a un serotipo de AAV seleccionado en un grupo que comprende AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV8, AAV9, AAV10 y serotipos derivados del macaco rhesus que incluyen AAVrh10 y mezclas de los mismos; en particular AAV4.

De acuerdo con una realización alternativa, las partículas de rAAV consisten en partículas de rAAV5 que contienen ADN que comprende un casete de expresión que codifica PDE6-beta humana. De acuerdo con dicha realización, dicho casete de expresión es de SEQ ID No. 1.

De acuerdo con una realización, las partículas de rAAV5 contienen un ADN que comprende la SEQ ID No. 2.

De acuerdo con otra realización alternativa, las partículas de rAAV consisten en partículas de rAAV4 que contienen ADN que comprende un casete de expresión que codifica RPE65 humano.

Los términos “virión de AAV recombinante”, “virión de rAAV”, “partícula de AAV”, “cápsidas completas” y “partículas completas” se definen en este documento como un virus infeccioso de replicación defectuosa que incluye una cubierta de proteína de AAV, que encapsula una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés que está flanqueado a ambos lados por AAV ITR. Se produce un virión de rAAV en una célula huésped adecuada que ha tenido secuencias que especifican un plásmido de AAV, funciones auxiliares de AAV y funciones accesorias introducidas en el mismo. De esta manera, la célula huésped se vuelve capaz de codificar polipéptidos de AAV que se requieren para empaquetar el plásmido de AAV (que contiene una secuencia de nucleótidos recombinante de interés) en partículas de virión recombinante infecciosas para la posterior entrega de genes.

Por “virus recombinante” se entiende un virus que ha sido alterado genéticamente, por ejemplo, mediante la adición o inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo en la partícula.

Por “virión de AAV” se entiende una partícula de virus completa, tal como una partícula de virus de AAV de tipo silvestre (wt) (que comprende un genoma de ácido nucleico de AAV de cadena sencilla lineal asociado con una cubierta de proteína de la cápsida de AAV). A este respecto, las moléculas de ácido nucleico de AAV monocatenarias de sentido complementario, por ejemplo, hebras “codificantes” o “anticodificantes”, pueden empaquetarse en cualquier virión de AAV y ambas hebras son igualmente infecciosas.

El término “célula huésped” indica, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos, que pueden ser, o se han utilizado, como estirpes celulares productoras estables transitorias o permanentes receptoras de una construcción auxiliar de AAV, un plásmido de AAV, un plásmido de función accesoria u otro ADN de transferencia. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. Por tanto, una “célula huésped” como se usa en este documento se refiere en general a una célula que ha sido transfectada con una secuencia de ADN exógena. Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en complemento de ADN genómico o total al parental original, debido a una mutación natural, accidental o deliberada.

El término “composición clarificada que contiene rAAV” abarca cualquier composición que incluya partículas de rAAV, que se obtiene después de una etapa de filtración profunda de un material de partida tal como un lisado celular o un sobrenadante de cultivo. Una “composición clarificada que contiene rAAV” es distinta de una “composición enriquecida con rAAV” y/o partículas de rAAV purificadas.

Por tanto, una “composición clarificada que contiene rAAV” puede abarcar cualquier composición que incluya partículas de rAAV que se deriven directamente de un material de partida filtrado en profundidad, como un lisado celular o un sobrenadante de cultivo, y que no se haya sometido más a una etapa de enriquecimiento y/o purificación, incluida la que no se ha sometido a una etapa de cromatografía de intercambio iónico (por ejemplo, catiónico).

De acuerdo con dicha realización, la divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

a) realizar una filtración profunda de un lisado celular y/o un sobrenadante de cultivo, mediante lo cual se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a

De acuerdo con otra realización, la divulgación se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), en el que la composición clarificada que contiene rAAV que se somete a la primera etapa de la etapa de afinidad (etapa de purificación por inmunoafinidad o etapa de purificación por afinidad peptídica), es la composición obtenida directamente al final de la etapa a). Así, de acuerdo con dicha realización, las etapas a) y b) son etapas consecutivas.

Por “etapa consecutiva” se entiende cualquier etapa que viene después de una primera etapa, para el cual se excluye cualquier etapa intermedia de la etapa de cromatografía, en particular la cromatografía de intercambio iónico (catiónico). Por otro lado, y salvo que se indique lo contrario, las “etapas consecutivas” no excluyen el intercambio de tampón y/o las etapas de dilución, con el fin de modificar las condiciones del tampón (es decir, concentración de sal; pH) de dichas composiciones.

De acuerdo con una realización, el método divulgado en este documento no comprende una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.

De acuerdo con una realización, el método de la invención no comprende una etapa de cromatografía de apatita. De acuerdo con una realización preferida, la invención se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), en el que las etapas de purificación por afinidad (inmunoafinidad o purificación por afinidad peptídica) y cromatografía de intercambio aniónico, o alternativamente purificación por afinidad (inmunoafinidad o purificación por afinidad peptídica) y centrifugación en gradiente de densidad, son etapas consecutivas. Así, de acuerdo con dicha realización, las etapas b) y c) son etapas consecutivas.

De acuerdo con otra realización, las etapas c) y d) son consecutivas.

De acuerdo con otra realización, las etapas b) y c) y d) son consecutivas.

De acuerdo con otra realización, las etapas a) y b) y c) son consecutivas.

De acuerdo con otra realización, las etapas a) y b) y c) y d) son consecutivas.

Por tanto, la divulgación también se refiere a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), que comprende las etapas de:

b) someter la composición clarificada que contiene rAAV obtenida en la etapa a) a una etapa de purificación por afinidad (etapa de purificación por inmunoafinidad o afinidad peptídica), mediante la cual se proporciona una primera composición enriquecida con rAAV;

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa b) al menos una vez a:

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa c) a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV). De acuerdo con otra realización, las etapas a) y b) y c) y d) son consecutivas y el material de partida en la etapa a) se obtiene directamente de un lisado celular o de un sobrenadante de cultivo.

c) enviar la primera composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa b) al menos una vez a

d) someter la segunda composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa c) a una etapa de filtración de flujo tangencial, mediante la cual se proporcionan partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV).

Todos los métodos mencionados anteriormente incluyen al menos: 1) una etapa de filtración en profundidad de un material de partida; 2) una primera etapa de cromatografía de afinidad (inmunoafinidad o afinidad peptídica); 3) una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico o centrifugación en gradiente de densidad; y 4) una etapa de filtración de flujo tangencial. Cada etapa individual se definirá con más detalle a continuación.

Los inventores también tienen el concepto de que cada etapa adicional contribuye a la escalabilidad y alta pureza de las partículas de virus adenoasociadas recombinantes purificadas.

Filtración profunda

La etapa de filtración en profundidad permite descartar una parte importante del ADN y las proteínas contaminantes. Esta etapa hace posible la purificación de partículas de rAAV mediante cromatografía de inmunoafinidad directamente a partir de una composición clarificada que contiene rAAV.

De acuerdo con una realización, el material de partida utilizado en la etapa a) es un lisado celular obtenido al poner en contacto un cultivo de células que producen partículas de rAAV con una composición que comprende al menos un detergente o un tensioactivo, y preferiblemente un detergente.

De acuerdo con una realización, el material de partida utilizado en la etapa a) es un lisado celular obtenido al poner en contacto un cultivo de células que producen partículas de rAAV con una composición que puede comprender o no un detergente o un tensioactivo, pero que no se trata con una nucleasa como una ADNasa.

Los ejemplos de detergentes adecuados para la lisis celular incluyen Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Brij-35, Brij-58, Tween 20, Tween 80, octil glucósido, octil tioglucósido, SDS, ChAPS y CHAPSO.

De acuerdo con una realización preferida, la etapa a) se realiza utilizando una membrana de filtro en profundidad que comprende una capa de microfibras de vidrio de borosilicato y una capa de ésteres mixtos de celulosa.

De acuerdo con una realización ejemplar, la etapa a) se realiza utilizando un filtro Polysep ™ II (Millipore®).

Cromatografía de afinidad

El término “cromatografía de afinidad” o “purificación por afinidad” como se usa en este documento designa cualquier método que use interacciones de unión específicas entre moléculas. Un ligando particular se inmoviliza químicamente o se “acopla” a un soporte sólido de modo que cuando se pasa una mezcla compleja sobre la columna, las moléculas que tienen afinidad de unión específica al ligando se unen. Después de que otros componentes de la muestra se eliminan por lavado, la molécula unida se quita del soporte, lo que resulta en su purificación de la muestra original.

El término “cromatografía de inmunoafinidad” como se usa en este documento designa cualquier método que use anticuerpos inmovilizados, o fragmentos de los mismos, en cromatografía de afinidad.

El término “anticuerpos o fragmentos de los mismos” puede incluir anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos naturales y no naturales, anticuerpos completos y fragmentos de los mismos, que incluyen fragmentos de unión a antígenos tales como regiones Fv, Fab y F(ab')2, regiones de determinación de complementariedad (CDR), anticuerpos de dominio único, nanocuerpos y mezclas de los mismos.

El término “fragmento del mismo” puede abarcar cualquier fragmento de un anticuerpo que pueda obtenerse eliminando parte del anticuerpo original, incluyendo de manera no limitativa cualquier anticuerpo del cual la región Fc o partes de la región variable (incluidas las c Dr ) se han eliminado.

El término “cromatografía de afinidad de péptidos”, como se usa en este documento, designa cualquier método que use péptido inmovilizado en cromatografía de afinidad. La cromatografía de afinidad de péptidos es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Pulicherla et al. 2011. Gen Ther 18 (10): 1020-1024). Cuando se inmoviliza sobre el soporte cromatográfico, el término abarca cualquiera de las variantes mencionadas anteriormente siempre que conserve su capacidad para unirse a al menos un epítopo en la superficie de las partículas de rAAV que se purifican.

En particular, tales anticuerpos o fragmentos de los mismos pueden incluir isotipos de las subclases IgA, IgD, IgE, IgG e IgM.

De acuerdo con una realización particular, los anticuerpos o fragmentos de los mismos son monoclonales.

Los anticuerpos que se consideran en la invención pueden ser de origen natural o no natural. Pueden ser de origen humano o no humano.

De acuerdo con una realización ejemplar, los anticuerpos son anticuerpos de cadena sencilla, como los obtenidos por inmunización de camélidos, incluidos dromedarios, camellos, llamas y alpacas; o tiburones.

Los anticuerpos y fragmentos de los mismos pueden obtenerse e inmovilizarse sobre soportes utilizando una variedad de técnicas que van desde la unión covalente a métodos basados en adsorción, como se describe, por ejemplo, en Moser & Hage («Immunoaffinity chromatography: an introduction to applications»; Bioanálisis; 2 (4): 769-790; 2010). Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpos mediante estirpes celulares continuas en cultivo. Estos incluyen, pero no se limitan a, la técnica del hibridoma, la técnica del hibridoma de células B humanas y la técnica del hibridoma EBV (Kohler, et al., 1975, Nature 256: 495-497; Kozbor, et al, 1985, J. Immunol. Methods 81: 31-42; Cote, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 2026-2030; Cole y col., 1984, MoL Cell Biol. 62: 109-120).

Se conocen varios soportes de cromatografía de inmunoafinidad adecuados para usar con la presente invención e incluyen, sin limitación, Affi-Gel (Biorad); Soportes poliméricos/agarosa Affinica (Schleicher y Schuell); AvidGel (BioProbe); Bio-Gel (BioRad); Fractogel (separaciones EM); HEMA-AFC (Alltech); Reacti-Gel (Pierce); Sephacryl (Pharmacia); Sepharose (Pharmacia); Superose (Pharmacia); Trisacryl (IBF); TSK Gel Toyopearl (TosoHaas); Ultragel (IBF); AvidGel CPG (BioProbe); HípAc (ChromatoChem); Empaque de afinidad Protein-Pak (Waters); Ultraffinity-EP (Bodman) y Emphaze (3M Corp./Pierce).

Otros soportes de cromatografía incluyen soportes de cromatografía de monolito de afinidad y soportes de cromatografía de afinidad POROS®.

Preferiblemente, los anticuerpos y sus fragmentos pueden inmovilizarse en una matriz de agarosa. Así, de acuerdo con una realización, el método comprende una etapa b) que se realiza utilizando un soporte cromatográfico sobre el cual se inmovilizan anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos a dichas partículas de rAAV.

En particular, los anticuerpos o fragmentos de los mismos se inmovilizan en una matriz de agarosa mediante un brazo espaciador hidrófilo.

De acuerdo con una realización, la etapa b) se realiza usando un anticuerpo que se une específicamente a al menos un epítopo que está presente en las partículas de AAV. En una realización, dicho epítopo pertenece al menos a serotipos seleccionados en un grupo que comprende AAV1, AAV2, AAV3, AVV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAVrh10.

En una realización, dicho epítopo pertenece al menos a serotipos seleccionados en un grupo que comprende o consiste en AAV1, AAV2, AAV3 y AAV5.

De acuerdo con una realización particular, la etapa b) se realiza usando un anticuerpo de camélido de cadena sencilla, o anticuerpo VHH, que se une específicamente a al menos un epítopo que está presente en las partículas de AAV. En una realización, dicho epítopo pertenece al menos a serotipos seleccionados en un grupo que comprende AAV1, AAV2, AAV3, AVV4, Aa V5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAVrh10, que incluye un epítopo seleccionado del grupo que comprende o consiste en: AAV1, AAV2, AAV3 y AAV5.

Aún así, de acuerdo con una realización ejemplar, la etapa b) se realiza usando un soporte de cromatografía AVB Sepharose ™ (GE Healthcare).

De acuerdo con una realización preferida, el pH de la composición clarificada que contiene rAAV, en particular la composición clarificada que contiene rAAV4, rAAVrh10 o rAAV2, está a un pH de neutro a básico, antes de cargarse en la columna de inmunoafinidad, que incluye un rango de pH de 6.0 a 8.0.

De acuerdo con uno de los más preferidos, la composición clarificada que contiene rAAV es una composición clarificada que contiene rAAV4.

Aún así, de acuerdo con una realización ejemplar, se carga una composición clarificada que contiene rAAV en una columna AVB equilibrada con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco suplementada con calcio y magnesio, o solución salina tamponada con fosfato (PBS).

Aún así, de acuerdo con una realización ejemplar, la primera composición enriquecida con rAAV se eluye de la columna de inmunoafinidad con un pH ácido. Un pH ácido puede referirse a cualquier pH por debajo de 7.0, incluso por debajo de 5.0, o incluso por debajo de 3.0.

De acuerdo con dicha realización ejemplar, la primera composición enriquecida con rAAV se eluye de la columna de inmunoafinidad con un pH ácido, en el que dicho pH es inferior a 3.0, que incluye un pH de aproximadamente 2.0.

Los soportes y métodos de inmunoafinidad mencionados anteriormente son particularmente convenientes en los métodos de la invención, para purificar partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV4, AAV10 (es decir, AAVrhIO) o AAV2; en particular, partículas de rAAV que pertenecen al serotipo AAV4.

Una vez eluido, el pH de la primera composición enriquecida con rAAV se neutraliza preferiblemente de una manera adecuada para obtener una primera composición enriquecida con rAAV con un pH neutro o básico, que incluye un pH de 8.0 o superior, que incluye 8.5. La razón es que las partículas de rAAV, incluidas las partículas de rAAV4, tienden a perder su integridad y/o infectividad si se mantienen en una composición que tiene un pH ácido.

De acuerdo con una realización ejemplar, la primera composición enriquecida con rAAV se neutraliza en un tampón Tris que tiene un pH de aproximadamente 8.5.

De acuerdo con otra realización ejemplar, la primera composición enriquecida con rAAV se neutraliza en un tampón Tris que tiene un pH de aproximadamente 8.0.

Ventajosamente, antes, durante o después de la neutralización, la primera composición enriquecida con rAAV se puede complementar con un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Pluronic® F-68 (Gibco).

El tensioactivo no iónico puede estar presente en una cantidad que varía de 0.0001 % a 0.1 % (v/v) del volumen total de la composición; que incluye en una cantidad que varía de 0.0005 % a 0.005% (v/v) del volumen total de la composición; que incluye aproximadamente el 0.001 % (v/v) del volumen total de la composición.

Ventajosamente, la composición enriquecida con partículas de virus adenoasociado (rAAV) se concentra en presencia de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Pluronic® F-68 (Gibco), y en la cantidad definida anteriormente.

También ventajosamente la composición que contiene partículas de virus adenoasociado (rAAV) se diafiltra y se concentra frente a una solución ocular salina, que puede comprender además un tensioactivo no iónico, como se definió anteriormente, y en una cantidad como también se define anteriormente. El uso de un tensioactivo no iónico, como se definió anteriormente, y en las otras etapas, contribuye además a la eficiencia y escalabilidad del método. En particular, el uso de un tensioactivo no iónico, como se definió anteriormente, evita la agregación o adherencia de las partículas de rAAV, antes, durante y después de la purificación.

Cromatografía de intercambio aniónico

Se conocen varios intercambiadores de aniones adecuados para su uso con la presente invención e incluyen, sin limitación, MACRO PREP Q (intercambiador de aniones fuerte disponible de BioRad, Hercules, CA); UNOSp He RE Q (intercambiador de aniones fuerte disponible de BioRad, Hercules, CA); POROS 50HQ (intercambiador de aniones fuerte disponible de Applied Biosystems, Foster City, California); POROS 50D (intercambiador de aniones débil disponible de Applied Biosystems, Foster City, California); POROS 50PI (intercambiador de aniones débiles disponible en Ap plied Biosystems, Foster City, California); SOURCE 30Q (intercambiador de aniones fuerte disponible en GE Healthcare, N.J.); DEAE SEPHAROSE (intercambiador de aniones débil disponible en GE Healthcare, Piscataway, N.J.); Q SEPHAROSE (intercambiador de aniones fuerte disponible en GE Healthcare Biosciences, Piscataway, N.J.), Capto Q y Capto Adhere (GE Healthcare, N.J.).

Se conocen en la técnica ejemplos de soportes cromatográficos monolíticos adecuados, e incluyen de manera no limitativa la columna monolítica CIMmultus® QA, CIM® QA, CIM DEAE y CIMmultus® DEAE (Bia Separations).

Los monolitos de cromatografía son sólidos porosos de una pieza hechos de glóbulos de sílice fusionados del tamaño de un micrómetro o un polímero orgánico que se puede sintetizar directamente dentro de un tubo de cromatografía. Esto hace que este soporte sea muy resistente y listo para usar, sin variabilidad de los parámetros del paquete.

Los monolitos son columnas homogéneas con una matriz de lecho poroso continuo, que consta de canales de perfusión interconectados. Estos canales son relativamente grandes (1-5 pm) en comparación con los tamaños de poro típicos de la cromatografía basada en partículas de lecho empacado (5-100 nm). Un beneficio de esto es que aumenta la capacidad de unión potencial de macromoléculas como virus debido a la alta superficie de accesibilidad. Estos soportes generan una contrapresión baja incluso a caudales altos y una tasa de cizallamiento baja.

En comparación con las columnas de lecho empacado, el transporte de masa mejorado de soportes monolíticos da como resultado una separación eficiente de las macromoléculas.

Desde un punto de vista práctico, el uso de estas columnas permite trabajar con un producto viral (incluso cuando se trata de un lisado celular) a alto caudal en comparación con las columnas de lecho empacado, con alta capacidad de unión y buena resolución, independiente del caudal. La alta resolución de estos soportes contribuye a la reducción de las etapas de depuración y a la escalabilidad de todo el proceso.

De acuerdo con algunas realizaciones, el método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) comprende sólo una etapa de cromatografía de intercambio aniónico.

De acuerdo con algunas realizaciones, el método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) comprende más de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, que incluye en particular dos, tres o incluso cuatro etapas de cromatografía aniónica. Cuando el método comprende más de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, las etapas mencionadas anteriormente se pueden lograr sobre el mismo tipo de soporte o sobre diferentes soportes.

De acuerdo con una realización ejemplar, el al menos un soporte cromatográfico de la etapa c1) es un soporte cromatográfico monolítico.

La columna de intercambio aniónico se equilibra primero usando tampones estándar y de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Por ejemplo, la columna se puede equilibrar con, por ejemplo, un tampón Tris de 5 a 50 mM, preferiblemente de 7-20 mM, tal como 20 mM. Luego se carga la muestra y se utilizan dos tampones de elución, uno con bajo contenido de sal y otro con alto contenido de sal.

Las fracciones se recogen siguiendo una mezcla progresiva de tampones de bajo contenido de sal y alto contenido de sal, generando un gradiente de sal, y el material eluido se detecta en las fracciones utilizando técnicas estándar, como la monitorización de la absorción de UV a 260 y 280 nm. Usando un intercambiador de aniones, los picos de proteína del eluato de sal inferior contienen cápsidas vacías de AAV y las fracciones de sal superior contienen partículas de AAV.

En particular, en la columna de intercambio aniónico, las partículas de AAV se pueden purificar adicionalmente usando un tampón apropiado a un pH de aproximadamente pH 5 a pH 12, preferiblemente pH 6 a pH 10, e incluso más preferiblemente pH 7 a pH 9.5, como pH 7.1, 7.2, 7.3, 7.4 - 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5 - 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, o cualquier pH entre los rangos establecidos.

Los tampones apropiados para usar con las columnas de intercambio aniónico son bien conocidos en la técnica y generalmente son de naturaleza catiónica o bipolar. Dichos tampones incluyen, sin limitación, tampones con los siguientes iones tampón: N-metilpiperazina; piperazina; Bis-Tris; Propano Bis-Tris; Trietanolamina; Tris; N-metildietanolamina; 1,3-diaminopropano; etanolamina; ácido acético y similares. Para eluir la muestra, se aumenta la fuerza iónica del tampón de partida utilizando una sal, como NaCl, KCl, sulfato, formiato o acetato, a un pH apropiado.

Ventajosamente, todos los tampones utilizados durante, antes o después de la cromatografía de intercambio aniónico comprenden un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Pluronic® F-68 (ThermoFisher Scientific), en una cantidad que varía de 0.0001 % a 0.1 % (v/v). del volumen total de la composición tampón; que incluye en una cantidad que varía de 0.0005 % a 0.005 % (v/v) del volumen total de la composición tampón; que incluye aproximadamente el 0.001 % (v/v) del volumen total de la composición tampón.

La naturaleza de las resinas utilizadas (es decir, intercambiadores de iones fuertes o débiles) y las condiciones de concentración de sal, tampón utilizado y pH, variarán en la variante de cápsida de AAV (es decir, serotipo o pseudotipo de cápsida de AAV). Si bien todas las variantes de cápsida de AAV conocidas comparten características como el tamaño y la forma, difieren en los detalles finos de la topología molecular y la distribución de carga superficial. Por lo tanto, si bien se espera que todas las variantes de cápsida sean susceptibles de purificación mediante cromatografía de intercambio aniónico, y los métodos pertinentes se pueden determinar de manera sistemática utilizando resina de cromatografía y experimentos de selección de tampón, se requerirán diferentes condiciones para cada variante de cápsida de AAV para lograr purificación eficiente de partículas AAV. La determinación de tales condiciones es fácilmente evidente para el experto en la materia.

Ventajosamente, al final de la etapa b), el pH de la composición clarificada que contiene rAAV se ajusta a un pH básico para asegurar una retención óptima de las partículas de rAAV en al menos un soporte de cromatografía aniónica utilizado en la etapa c).

Un pH de 8.5, o superior a 8.5, que incluye 9, es particularmente conveniente para la unión de partículas de rAAV4, o composiciones clarificadas que contienen rAAV4, a la columna de intercambio aniónico.

Por tanto, de acuerdo con una realización ejemplar, al final de la etapa b), el pH óptimo de una composición clarificada que contiene rAAV4 para unirse a la columna de intercambio aniónico se ajusta a pH 8.5, o superior a 8.5, que incluye 9.

Un pH de 8.5, o superior a 8.5, que incluye 9, es particularmente conveniente para la unión de partículas de rAAVrh10, o composiciones clarificadas que contienen rAAVrh10, a la columna de intercambio aniónico.

Por tanto, de acuerdo con una realización ejemplar, al final de la etapa b), el pH óptimo de una composición clarificada que contiene rAAVrh10 para unirse a la columna de intercambio aniónico se ajusta a pH 8.5 o superior a 8.5, que incluye 9.

Un pH de 8.5, o superior a 8.5, que incluye 9, es particularmente conveniente para la unión de partículas de rAAV2, o composiciones clarificadas que contienen rAAV2, a la columna de intercambio aniónico.

Por tanto, de acuerdo con una realización ejemplar, al final de la etapa b), el pH óptimo de una composición clarificada que contiene rAAV2 para unirse a la columna de intercambio aniónico se ajusta a pH 8.5, o superior a 8.5, que incluye 9.

Los tampones apropiados para usar con las columnas de intercambio aniónico son bien conocidos en la técnica y son generalmente de naturaleza catiónica o bipolar. Dichos tampones incluyen, sin limitación, tampones con los siguientes iones tampón: N-metilpiperazina; piperazina; Bis-Tris; Propano Bis-Tris; Trietanolamina; Tris; N-metildietanolamina; 1,3-diaminopropano; etanolamina; ácido acético y similares. Para eluir la muestra, se aumenta la fuerza iónica del tampón de partida usando una sal, como NaCl, KCl, sulfato, formiato o acetato, a un pH apropiado.

Antes de la elución, la cromatografía de intercambio aniónico también puede incluir una etapa opcional de tratamiento del soporte, o columna de intercambio aniónico, con una concentración de sal más baja que la que se usa generalmente para la etapa de elución. Dicho tratamiento también puede denominarse en el presente documento etapa de “preelución”.

Por tanto, en una realización de la invención, la columna de intercambio aniónico se trata primero con una baja concentración de sal, por ejemplo, 5-100 mM de sal, en particular 5-100 mM de NaCl, tal como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 - 100 mM, o cualquier concentración dentro de estos rangos. Por ejemplo, la concentración de sal en un “primera etapa de preelución” puede corresponder inicialmente a la concentración de sal del tampón usado para unir las partículas de rAAV a la columna después de la carga.

En algunas realizaciones, y después del tratamiento inicial, la columna se trata luego con una concentración de sal más alta para eluir las impurezas, como una concentración de NaCl más alta, o con otro tampón con una fuerza iónica mayor. Un ejemplo para usar como segundo tampón es un tampón de acetato de sodio o un tampón a base de Tris. Esta etapa adicional también puede denominarse en el presente documento una etapa de “segunda preelución”. En ese caso, se puede tener cuidado de que la concentración de sal permanezca lo suficientemente baja como para no eluir las partículas de AAV de la columna.

Después de que se eluyen más impurezas de la columna, las partículas de AAV pueden recuperarse usando una concentración más alta de sal en la etapa de elución.

En algunas realizaciones, el pH de elución en el soporte cromatográfico se ajusta dependiendo de la partícula de rAAV que se purifica. La elución a un pH óptimo tiene la ventaja de mantener la infectividad óptima de una partícula determinada.

La elución de partículas de rAAV del soporte cromatográfico en la etapa c), en particular la elución de partículas de rAAV4, también se puede ajustar a pH 8.

Preferiblemente, la elución de partículas de rAAV del soporte cromatográfico se realiza usando un gradiente de sal lineal. La sal se puede seleccionar del grupo que consiste en: NaCl, KCl, sulfato, formiato y acetato; y preferiblemente NaCl.

El término “pendiente del gradiente de sal lineal” se refiere a la pendiente entre dos puntos (A, B) del gradiente lineal, y depende tanto de la concentración de sal en el soporte cromatográfico como del volumen de columna (CV) que se eluye a lo largo del tiempo, de acuerdo con la siguiente fórmula:

pendiente (A, B) = (concentración de sal en B - concentración de sal en A)/(volumen de columna en B - volumen de columna en A).

Por tanto, la pendiente del gradiente de sal lineal se puede expresar en M/CV o en mM/CV, y es preferiblemente un gradiente de sal poco profundo según los protocolos estándar.

De acuerdo con una realización, la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c) es igual o menor que 0.1 M/CV, en particular variando de 0.015 a 0.09 M/CV.

De acuerdo con una realización, la pendiente del gradiente de sal lineal en la etapa c) es igual o menor que 0.07 M/CV, en particular variando de 0.01 a 0.06 M/CV.

Ventajosamente, el método puede incluir una etapa adicional de dilución de la composición enriquecida con rAAV antes o después de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico. Una etapa de dilución puede ser, por ejemplo, en forma de una etapa de intercambio de tampón.

De acuerdo con una realización preferida, al final de la etapa c), la segunda composición enriquecida con rAAV se almacena en forma congelada hasta su uso para realizar la etapa d).

Centrifugación en gradiente de densidad.

En la centrifugación en gradiente de densidad, la densidad del medio de suspensión varía de una manera conocida desde un extremo del recipiente del gradiente de densidad, por ejemplo, del tubo de centrífuga, hasta el otro extremo. Cuando la partícula bajo la influencia de la fuerza centrífuga alcanza el punto de su densidad isopícnica, es decir, cuando la densidad del líquido circundante es igual a la densidad de la partícula rAAV, la partícula rAAV dejará de migrar a lo largo del vector de fuerza.

Los sistemas de solutos utilizados para establecer gradientes de densidad para centrifugación considerados por la invención incluyen, de manera no limitativa, sales inorgánicas (cloruro de cesio, bromuro de potasio, cloruro de sodio), sacarosa y varios solutos disponibles comercialmente como Ficoll®, un polisacárido elaborado reticulando sacarosa; Percoll™, una suspensión de partículas de sílice recubiertas con polivinilpirrolidona; y Nycodenz®, un derivado de la molécula sintética del ácido metrizoico (metrizamida). El iodixinol o iodixanol, un dímero de Nycodenz®, también se usa ampliamente.

Por tanto, la etapa c) puede incluir una etapa de someter la primera composición enriquecida con rAAV obtenida en la etapa b) al menos una vez a una etapa de centrifugación en gradiente de densidad, en el que se recoge la fracción que contiene rAAV, por lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV;

De acuerdo con una realización, una etapa de centrifugación en gradiente de densidad se selecciona entre: centrifugación en gradiente de cloruro de cesio (CsCl); centrifugación en gradiente de iodixanol; centrifugación en gradiente de sacarosa; Centrifugación en gradiente Percoll™; Centrifugación en gradiente Ficoll®; y lo más preferiblemente centrifugación en gradiente de cloruro de cesio (CsCl).

Ventajosamente, antes de la centrifugación basada en gradiente de densidad, la primera composición enriquecida con rAAV puede precipitarse para obtener un volumen adecuado de material para realizar la etapa de centrifugación en gradiente de densidad, en particular en presencia de polietilenglicol, tal como PEG. 8000.

También se puede diafiltrar y concentrar mediante filtración de flujo tangencial (TFF).

Por tanto, de acuerdo con una realización, se precipita la primera composición enriquecida con rAAV, en presencia de PEG 8000, por ejemplo, PEG 8000 a una concentración final de aproximadamente 5 a 10 % (p/v). Además, la muestra puede luego centrifugarse antes de la centrifugación basada en gradiente de densidad, para facilitar la recogida de las partículas de rAAV precipitadas para su posterior procesamiento.

De acuerdo con una realización más general, los métodos de centrifugación basados en gradientes de densidad comprenden al menos las etapas de:

i) proporcionar una solución formadora de gradiente de densidad que incluye la muestra de interés;

ii) centrifugar la solución proporcionada en la etapa (i) de una manera adecuada para producir un gradiente de densidad que tiene al menos una capa que comprende una segunda composición enriquecida con rAAV;

iii) recuperar opcionalmente la capa que comprende la segunda composición enriquecida con rAAV.

De acuerdo con lo anterior, la muestra de interés puede comprender, o puede consistir en, la primera composición enriquecida con rAAV.

De acuerdo con la invención, una “solución formadora de gradiente de densidad” es una solución que se encuentra en forma de gradiente continuo o discontinuo antes de la centrifugación; o alternativamente para el cual el gradiente se autoforma durante la centrifugación.

Una “solución formadora de gradiente de densidad” puede seleccionarse del grupo que consiste en una solución de cloruro de cesio (CsCl), yodixanol, sacarosa, Percoll ™ y Ficoll®; y lo más preferiblemente solución de cloruro de cesio (CsCl) o yodixanol.

Se prefiere el yodixanol, incluso por razones reglamentarias.

En algunas realizaciones de la etapa i), la muestra de interés puede mezclarse simplemente con la solución formadora de gradiente de densidad.

En algunas otras realizaciones de la etapa i), la muestra de interés puede colocarse en capas sobre la parte superior de la solución de formación de gradiente de densidad, es decir, en la interfaz entre dicha solución de formación de gradiente y la atmósfera.

La etapa ii) de centrifugar la solución de una manera adecuada para producir un gradiente de densidad que tiene al menos una capa que comprende una segunda composición enriquecida con rAAV se puede lograr centrifugando una solución que forma un gradiente de densidad que está en forma de un gradiente continuo o discontinuo antes de la centrifugación; o alternativamente para el cual el gradiente se autoforma durante la centrifugación.

De acuerdo con dicha realización, la solución proporcionada en la etapa (i) ya puede estar en forma de gradiente de densidad continuo o discontinuo. Por ejemplo, la solución proporcionada en la etapa (i) puede tener la forma de un conjunto de capas que tienen, de arriba a abajo, una pluralidad de capas que tienen densidades crecientes.

La preparación de gradientes de densidad continuos y discontinuos es bien conocida en la técnica.

De acuerdo con otra realización, la solución formadora de gradiente de densidad proporcionada en la etapa (i) puede ser una solución, por ejemplo, una solución isopícnica, cuyo gradiente de densidad se autoforma durante la centrifugación.

De acuerdo con dicha realización, el gradiente de densidad se puede formar durante la etapa (ii) de centrifugación. Por ejemplo, la formación de un gradiente de densidad durante la centrifugación puede ocurrir partiendo de una solución isopícnica de cloruro de cesio (CsCl).

De acuerdo con una realización, la solución que contiene AAV proporcionada en la etapa (i) es una solución de CsCl que tiene una densidad que varía de aproximadamente de 1 a 1.6 g/cm3, que incluye 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4 y 1.5 a 1.6 g/cm3, que incluye de 1.3 a 1.5 g/cm3, que incluye 1.376 g/cm3.

De acuerdo con una realización, la muestra de interés en la etapa (i) está presente en la capa superior de dicha solución antes de la centrifugación.

La etapa ii) de centrifugar la solución es conocida en la técnica y consiste en aplicar un campo centrífugo a dicha solución, al menos hasta que se haya formado un gradiente de arriba hacia abajo.

La fuerza centrífuga se aplica generalmente girando un tubo de centrífuga que contiene la solución de la etapa (i) durante un tiempo determinado (es decir, unas pocas horas), para una intensidad determinada (estimada en vueltas por minutos o rpm; o alternativamente en g) y a una temperatura determinada en un rotor de centrífuga.

Un ejemplo de un protocolo preferido se describe en el Ejemplo 1.

Otro ejemplo de un protocolo preferido se describe en el Ejemplo 2.

De acuerdo con una realización, el rotor utilizado en la etapa (ii) es un rotor SW41.

De acuerdo con una realización, la etapa ii) consiste en centrifugar la solución proporcionada en la etapa (i) en un rotor SW41 a aproximadamente 30.000 a 50.000 rpm, que incluye 38.000 rpm, durante aproximadamente 24 a 72 horas, que incluye 48 horas, y a temperatura que varía de aproximadamente 4 °C a 20 °C de temperatura, que incluye 15 °C, para separar las partículas llenas de las “vacías”. La capa que comprende la segunda composición enriquecida con rAAV se puede recuperar en la etapa (iii) basándose en la densidad de bandas de los rAAV purificados.

La determinación de las densidades de bandas de los rAAV purificados también se conoce en la técnica y se puede determinar por comparación con un valor de referencia o empíricamente.

La densidad de las partículas de rAAV se puede expresar en g/cm3.

Como referencia, las densidades de las partículas de rAAV conocidas, ya sean llenas o vacías, se describen en Qu et al (“Separación de partículas vacías de virus adenoasociado tipo 2 de vectores que contienen genoma mediante cromatografía en columna de intercambio aniónico; Journal of Virological Methods; 2006): “ 1.32 g/ml para cápsidas vacías, 1.40 g/ml para cápsidas que contienen genoma.

Las densidades generales para una preparación determinada pueden depender tanto del serotipo del rAAV como de la presencia de partículas llenas o vacías en la preparación.

En particular, la resolución del gradiente resultante dependerá de varios parámetros, incluyendo de manera no limitativa la naturaleza de la solución utilizada en la etapa (i), los parámetros utilizados en la etapa (ii) para centrifugar la solución y las densidades de bandas. de rAAV que deben recuperarse.

Por ejemplo, Iodixanol es un medio de gradiente de densidad yodado que se conoce en la técnica y se usa para uso clínico. Debido a que la densidad aparente de macromoléculas en iodixanol es diferente de la del CsCl, la densidad de bandas de rAAV purificados debe determinarse empíricamente. Para las cápsidas de rAAV, la densidad es de aproximadamente 1.40 g/ml en CsCl y 1.266 g/ml en Iodixanol.

En la etapa (iii), y después del fraccionamiento del gradiente, las fracciones positivas también pueden identificarse mediante PCR cuantitativa y, opcionalmente, combinarse.

Opcionalmente, las fracciones que contienen partículas de rAAV también pueden concentrarse y/o dializarse adicionalmente, por ejemplo, usando la filtración de flujo tangencial.

Opcionalmente, las fracciones que contienen partículas de rAAV también se pueden someter a una centrifugación en gradiente de densidad adicional.

Los protocolos para purificar preparaciones de partículas de rAAV usando centrifugación en gradiente de densidad se conocen en la técnica y se describen adicionalmente, por ejemplo, en Zolotukhin et al. («Recombinant adenoassociated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield»; Gene Therapy (1999).

Filtración de flujo tangencial y etapas posteriores

La filtración de flujo tangencial es una etapa de pulido que permite descartar impurezas relacionadas con partículas de pequeño tamaño mediante ciclos de concentración y diafiltración a través de los poros del filtro. Esta etapa de pulido tiene la otra ventaja de ser adecuada para cambiar el tampón de las fracciones eluidas y para concentrar los rAAV.

La filtración de flujo tangencial se consigue preferiblemente utilizando, como filtro, un filtro de fibra hueca. De acuerdo con una realización, la etapa d) se realiza utilizando una membrana de filtro que tiene un valor de corte de peso molecular igual o inferior a 150 kDa, en particular que varía de 20 kDa a 150 kDa, preferiblemente de 25 kDa a 150 kDa, que incluye aproximadamente 30 kDa.

El experto en la técnica reconocerá que el corte de peso molecular debe ajustarse dependiendo del tipo de partícula de rAAV que se purifica y de los parámetros de elución (pH, sal).

De acuerdo con alguna realización, se pueden añadir sales y/o detergentes y/o tensioactivos y/o nucleasas durante, antes o después de la filtración de flujo tangencial, en particular durante o antes de la filtración de flujo tangencial.

De acuerdo con una realización, el método puede incluir además una etapa de tratamiento con detergentes, tensioactivos y/o nucleasas, incluidas las ADNasas, durante, antes o después de la filtración de flujo tangencial.

Ventajosamente, la composición que contiene partículas de virus adenoasociado (rAAV) se diafiltra y se concentra en presencia de un tensioactivo no iónico, por ejemplo, Pluronic® F-68 (Gibco).

El tensioactivo no iónico puede estar presente en una cantidad que varía de 0.0001 % a 0.1 % (v/v) del volumen total de la composición; que incluye en una cantidad que varía de 0.0005 % a 0.005 % (v/v) del volumen total de la composición; que incluye aproximadamente el 0.001 % (v/v) del volumen total de la composición.

También ventajosamente, la composición que contiene partículas de virus adenoasociado (rAAV) se diafiltra y se concentra frente a una solución ocular salina, que puede comprender además un tensioactivo no iónico como se definió anteriormente, y en una cantidad como también se describió anteriormente. De acuerdo con una realización, las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) obtenidas en la etapa c) o d) se someten a un gradiente adicional, que incluye una etapa de centrifugación diferencial, que incluye gradientes de densidad, seleccionados en particular entre: cloruro de cesio (CsCl) centrifugación en gradiente; centrifugación en gradiente de iodixanol; centrifugación en gradiente de sacarosa.

De acuerdo con una realización preferida, el método puede incluir además una etapa adicional de filtración de flujo tangencial después de dicho gradiente adicional.

De acuerdo con una realización, las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) obtenidas en la etapa d) se esterilizan.

De acuerdo con una realización, las partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV) se someten a una etapa de filtración estéril sobre una membrana de filtro que tiene un tamaño de poro de 0.2 |im o menos.

Caracterización de las partículas de rAAV purificadas

Ventajosamente, el método mencionado anteriormente se puede usar para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes (rAAV) purificadas que sean adecuadas para terapia génica y/o para preparar un medicamento para terapia génica.

De acuerdo con una realización preferida, dichas partículas de rAAV purificadas son adecuadas para su uso en terapia génica.

La pureza de las preparaciones de partículas de virus adenoasociados (AAV) también tiene implicaciones importantes tanto para la seguridad como para la eficacia de la transferencia genética clínica.

El método utilizado para purificar una partícula de rAAV puede influir drásticamente en la pureza de la preparación en términos de la cantidad de contaminación de la proteína de la célula huésped y de la proporción de partículas completas/totales.

La concentración de partículas de vector se puede evaluar mediante PCR cuantitativa (partículas que contienen genoma) o mediante ELISA (partículas de vector totales) como se muestra en el Ejemplo 1

La pureza de la preparación se evalúa más comúnmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamidadodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), como se muestra en el Ejemplo 1.

Las bandas correspondientes a las proteínas estructurales víricas (cápsida), VP1, VP2 y VP3 pueden visualizarse después de la tinción y evaluar su tamaño e intensidad relativa con respecto a las proteínas contaminantes. Como referencia, VP1, VP2 y VP3 que pertenecen a los serotipos AAV4 y AAV5 están codificados por ácidos nucleicos de secuencias SEQ ID No. 10 a 15.

VP1, VP2 y VP3 que pertenecen al serotipo AAV4 pueden ser codificados respectivamente por ácidos nucleicos de secuencias SEQ iD No. 10 a 12.

VP1, VP2 y VP3 que pertenecen al serotipo AAV5 pueden estar codificadas respectivamente por ácidos nucleicos de secuencias SEQ ID No. 13 a 15.

Las secuencias mencionadas anteriormente se dan como referencias.

Por tanto, el término “pureza” se refiere a la ausencia de impurezas generales. La pureza se expresa como un porcentaje y se relaciona con la cantidad total de proteínas VP1, VP2 y VP3, en comparación con la cantidad total de proteínas detectadas en un gel de poliacrilamida teñido con azul de Coomassie.

El término “ impurezas generales” se refiere a impurezas que estaban presentes en el material de partida pero que no se consideran impurezas relacionadas con partículas. Por tanto, las impurezas generales abarcan impurezas que se derivan de las células huésped pero que no son partículas de AAV.

El término “ impurezas relacionadas con partículas” se refiere a todos los tipos de partículas de AAV distintas de las partículas de AAV recombinantes auténticas. Las impurezas relacionadas con partículas incluyen cápsidas de AAV vacías (también denominadas “vacías” o “partículas vacías”, y partículas de AAV que contienen secuencias de polinucleótidos distintas del genoma de partículas pretendido (también denominadas “ impurezas de ácidos nucleicos encapsulados en AAV” o “AAV -Impurezas de ADN encapsidado”).

El ADN residual o el ADN de la célula huésped pueden estar presentes como contaminantes en las preparaciones de rAAV. Dado que el ADN residual puede tener efectos negativos, los fabricantes deben asegurarse de que los productos finales derivados de las células huésped contengan niveles aceptables de ADN residual.

La prueba de ADN residual se puede evaluar mediante PCR cuantitativa, incluida la PCR en tiempo real, usando el protocolo descrito en el Ejemplo 1. El ADN residual se expresa en ng por ml, o alternativamente en ng por dosis. Preferiblemente, el ADN residual se determina mediante qPCR determinando la cantidad relativa de un ADN de amplicón E1A en la composición, en comparación con una curva estándar establecida con una cantidad conocida de ADN de amplicón E1A.

Una «dosis» se define como el volumen de preparación que corresponde a 1 * 1012 genoma del vector (vg).

Ventajosamente, las composiciones descritas en el presente documento se pueden caracterizar además por su relación de partículas de rAAV vacías/partículas de rAAV completas.

Los términos “cápsida vacía” y “partícula vacía” se refieren a un virión AAV que incluye una cubierta de proteína AAV pero que carece total o parcialmente de la construcción polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés flanqueada en ambos lados por ITR AAV. De acuerdo con lo anterior, la cápsida vacía no funciona para transferir el gen de interés a la célula huésped.

La relación de partículas de rAAV vacías/partículas de rAAV llenas se puede evaluar mediante SDS-PAGE Gel, utilizando el protocolo descrito en el Ejemplo 1.

La concentración de partículas infecciosas también se puede evaluar usando el protocolo de ICA descrito en el Ejemplo 1.

Partículas de rAAV para uso en terapia génica

La invención se refiere además a un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinantes purificadas (rAAV), para uso en terapia génica.

Ventajosamente, tales partículas de rAAV y sus composiciones también son adecuadas, como tales, para uso en terapia génica y/o para uso en la preparación de un medicamento adecuado para terapia génica.

Por “terapia génica” se entiende la administración de una secuencia de ácido nucleico a un individuo, para tratar y/o prevenir y/o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad. Se han propuesto varios enfoques en la técnica. En vista de lo anterior, las partículas de rAAV se utilizan como vehículos para suministrar dicha secuencia de ácido nucleico al individuo a tratar.

Se puede reemplazar un gen mutado que causa una enfermedad por una copia sana del gen.

Uno puede inactivar (“ inactivación”) un gen mutado que está funcionando incorrectamente.

Se puede introducir un nuevo gen en el cuerpo para tratar y/o prevenir y/o reducir la probabilidad de aparición de una enfermedad.

Los métodos y plásmidos descritos son particularmente eficaces para su uso en la preparación de un medicamento para enfermedades oculares, incluida la pérdida de visión y, más particularmente, distrofias de cono-bastón debidas a defectos específicos de bastón.

En particular, dicha enfermedad puede seleccionarse de enfermedades relacionadas con la fosfodiesterasa 6 (PDE6), que incluyen enfermedades relacionadas con PDE6p y enfermedades relacionadas con la proteína de 65 kDa específica del epitelio pigmentario de la retina (RPE65).

Las enfermedades relacionadas con RPE65 incluyen la amaurosis congénita de Leber y la retinitis pigmentosa. Las enfermedades relacionadas con la PDE6 incluyen distrofia de cono bastón y retinosis pigmentaria.

El individuo a tratar incluye humanos y mamíferos no humanos.

Las partículas de AAV y sus composiciones se pueden administrar por vía tópica o parenteral, lo que incluye la administración intraorbital e intraocular. La administración intraocular incluye además la administración intravítrea, subretiniana e intracorneal.

Por tanto, las composiciones que comprenden dichas partículas de AAV son preferiblemente adecuadas para la administración tópica o parenteral, que incluye la administración intraocular (preferiblemente intravítrea y subretiniana) e intracorneal.

Las partículas de rAAV divulgadas en el presente documento incluyen preferiblemente un casete de expresión que codifica el gen PDE6p humano o RPE65 humano, respectivamente, de las secuencias SEQ ID No. 1 y 7, y como se describe adicionalmente a continuación.

De acuerdo con una realización preferida, se puede obtener una partícula de rAAV purificada realizando cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Una composición de partículas de rAAV purificada comprende al menos una de dichas partículas de rAAV purificadas. Las partículas purificadas de rAAV y sus composiciones son adecuadas para su uso en terapia génica.

Plásmido AAV

Se divulgan además plásmidos de AAV para producir dichas partículas de rAAV.

Se ha descrito la construcción de viriones de AAV recombinantes infecciosos (rAAV). Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Números 5.173.414 y 5.139.941; Números de publicación internacional WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988 3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol e Immunol. 158: 97-129; y Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801.

Por “plásmido AAV” se entiende un plásmido derivado de un serotipo de virus adenoasociado, que incluye, entre otros, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y AAV10, y serotipos derivados del macaco rhesus. incluido AAVrh10. Los plásmidos de AAV pueden tener uno o más de los genes de tipo silvestre de AAV suprimidos en su totalidad o en parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero retienen secuencias ITR flanqueantes funcionales. Las secuencias de ITR funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión AAV. Por tanto, un plásmido AAV se define aquí para incluir al menos aquellas secuencias requeridas en cis para la replicación y empaquetamiento (por ejemplo, ITR funcionales) del virus. No es necesario que las ITR sean las secuencias de nucleótidos de tipo silvestre y se pueden alterar, por ejemplo, mediante la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos, siempre que las secuencias proporcionen un rescate funcional, replicación y empaquetamiento. También por una “partícula de AAV” se entiende la cubierta o cápsida de proteína, que proporciona un vehículo eficaz para el suministro de un ácido nucleico al núcleo de las células diana.

En particular, la partícula de AAV se deriva de un virus adenoasociado seleccionado de AAV que pertenecen a los serotipos AAV4, AAV5, AAVrh10 y/o AAV2.

Preferiblemente, la partícula de AAV se deriva de un serotipo AAV4 de virus adenoasociado.

Las “funciones auxiliares de AAV” se refieren a secuencias codificantes derivadas de AAV que pueden expresarse para proporcionar productos génicos de AAV que, a su vez, funcionan en trans para la replicación productiva de AAV. Por lo tanto, las funciones auxiliares de AAV incluyen los marcos de lectura abiertos (ORF) principales de AAV, rep y cap. Se ha demostrado que los productos de expresión de Rep poseen muchas funciones, que incluyen, entre otras: reconocimiento, unión y corte del origen de la replicación del ADN del AAV; Actividad de ADN helicasa; y modulación de la transcripción de promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Cap proporcionan las funciones de embalaje necesarias. Las funciones auxiliares de AAV se utilizan aquí para complementar las funciones de AAV en trans que faltan en los plásmidos de AAV.

El término “construcción auxiliar de AAV” se refiere en general a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones de AAV suprimidas de un plásmido de AAV que se va a utilizar para producir una partícula transductora para el suministro de una secuencia de nucleótidos de interés. Las construcciones auxiliares de AAV se utilizan comúnmente para proporcionar una expresión transitoria o estable de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones de AAV faltantes que son necesarias para la replicación de AAV; sin embargo, las construcciones auxiliares carecen de ITR AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse por sí mismas. Las construcciones auxiliares de AAV pueden estar en forma de plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varias construcciones auxiliares de AAV, tales como los plásmidos pAAV/Ad y pIM29 45 de uso común que codifican productos de expresión tanto Rep como Cap. Véase, por ejemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; y McCarty et al. (1991) J. Virol. 65: 2936-2945. Se han descrito varios otros plásmidos que codifican productos de expresión Rep y/o Cap. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. No. 5,139,941 y 6,376,237.

El término “transfección” se usa para referirse a la captación de ADN extraño por una célula, y una célula ha sido “transfectada” cuando se ha introducido ADN exógeno dentro de la membrana celular. Se conocen generalmente en la técnica varias técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology, 52: 456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier y Chu et al. (1981) Gene 13: 197. Dichas técnicas se pueden utilizar para introducir uno o más restos de ADN exógenos en células huésped adecuadas.

Un “ácido nucleico”, “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de polinucleótidos” se refiere a una secuencia de ADN o ARN. El término comprende secuencias que incluyen cualquiera de los análogos de bases conocidos de ADN y ARN tales como, pero sin limitarse a, 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil) uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracil-, dihidrouracilo, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5' -metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido buracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

Una “secuencia codificante” o una secuencia que “codifica” un polipéptido seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia codificante están determinados por un codón de inicio en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia de terminación de la transcripción puede estar ubicada en 3' respecto a la secuencia codificante.

El término “secuencias de control” de ADN se refiere colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores aguas arriba, orígenes de replicación, sitios internos de entrada de ribosomas (“ IRES”), potenciadores y similares, que colectivamente proporcionan la replicación, transcripción y traducción de una secuencia codificante en una célula receptora. No es necesario que todas estas secuencias de control estén siempre presentes siempre que la secuencia codificante seleccionada sea capaz de ser replicada, transcrita y traducida en una célula huésped apropiada. El término “promotor” se usa aquí en su sentido ordinario para referirse a una región de nucleótidos que comprende una secuencia reguladora de ADN, en la que la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unirse a la ARN polimerasa e iniciar la transcripción de una secuencia de codificación en la dirección descendente (dirección 3). Los promotores de la transcripción pueden incluir “promotores inducibles” (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor es inducida por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), “promotores reprimibles” (donde la expresión de una secuencia polinucleotídica unida operativamente al promotor es inducido por un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.) y “promotores constitutivos”.

El término “heterólogo” denota secuencias que normalmente no están unidas entre sí y/o no están normalmente asociadas con una célula particular. Por tanto, una región “heteróloga” de una construcción de ácido nucleico o un plásmido es un segmento de ácido nucleico dentro o unido a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentra en asociación con la otra molécula en la naturaleza. El transgén que comprende el ácido nucleico heterólogo puede codificar varios productos útiles. Estos pueden incluir ARNip, moléculas anticodificantes y miARN, por ejemplo. Alternativamente, los transgenes pueden codificar hormonas y factores de crecimiento y diferenciación. Los plásmidos de AAV se pueden diseñar para que porten una secuencia de nucleótidos heteróloga de interés (por ejemplo, un gen seleccionado que codifica una proteína terapéutica, una molécula de ácido nucleico anticodificante, una ribozima, un miARN o similares) eliminando, en su totalidad o en parte, la porción interna del genoma de AAV e insertando la secuencia de ADN de interés entre las ITR. Las ITR siguen siendo funcionales en dichos plásmidos, lo que permite la replicación y el empaquetamiento del rAAV que contiene la secuencia de nucleótidos heteróloga de interés. La secuencia de nucleótidos heteróloga también se une típicamente a una secuencia promotora capaz de dirigir la expresión génica en las células diana del paciente en determinadas condiciones. Las señales de terminación, como los sitios de poliadenilación, también se pueden incluir en el plásmido.

El término “casete de expresión” se refiere a una secuencia de ácido nucleico de ADN que incluye al menos un gen de interés, un marco de lectura abierto y una región no traducida 3' que, en eucariotas, normalmente contiene un sitio de poliadenilación.

De acuerdo con una realización general, un casete de expresión puede comprender, o consistir en, una secuencia de ácido nucleico de ADN que tiene la fórmula general:

[5'ITR] -[Gen de interés] -[PolyA]^z-[3'ITR] -en el que [5'ITR] y [3'ITR] son repeticiones terminales invertidas (ITR),

en el que [Gen de interés] es cualquier gen que codifica una proteína de interés,

en el que [PolyA] es una señal de poliadenilación siendo z 0 o 1, y

en el que cada uno de [5'ITR], [Gen de interés], [PolyA] y [3'ITR], puede separarse opcionalmente por una secuencia ligadora adicional.

En el sentido de la presente divulgación, un “gen que codifica una proteína de interés” comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés, y preferiblemente al menos un promotor.

Preferiblemente, el gen de interés es un ácido nucleico que codifica PDE-6p humana o RPE65 humana.

De acuerdo con una realización, el plásmido de AAV comprende un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica la PDE-6p humana, de SEQ ID No. 1.

De acuerdo con una realización alternativa, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el RPE65 humano, de SEQ ID No. 7.

De acuerdo con una realización particular, el plásmido AAV comprende un ácido nucleico que codifica la PDE6-p humana, de SEQ ID No. 2.

De acuerdo con una realización, [5'ITR] y [3'ITR] son repeticiones terminales invertidas derivadas de AAV-2, que son preferiblemente y respectivamente de secuencias SEQ ID No. 3 y 4.

Ventajosamente, el plásmido AAV incluye un sitio de poliadenilación, una ITR derivada de AAV2 y un casete de expresión que codifica PDE6-beta humana.

Preferiblemente, la expresión del gen PDE6-beta humano está bajo el control del promotor de la rodopsina quinasa, preferiblemente de secuencia SEQ ID No. 5.

De acuerdo con una realización alternativa, el plásmido AAV incluye un sitio de poliadenilación, un ITR derivado de AAV2 y un casete de expresión que codifica RPE65 humano. Preferiblemente, la expresión del gen RPE65 humano está bajo el control del promotor RPE65, preferiblemente de la secuencia SEQ ID No. 8.

De acuerdo con una realización, la señal de poliadenilación se deriva de la hormona de crecimiento bovino (bGH) y es preferiblemente de secuencia SEQ ID No. 6.

Las realizaciones mencionadas anteriormente pueden considerarse individualmente o en combinación. De acuerdo con una de las realizaciones más preferidas, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende una codificación nucleica para PDE6p como se describió anteriormente y como se ilustra en la figura 1A.

De acuerdo con una realización alternativa, el plásmido AAV comprende un casete de expresión que comprende una codificación nucleica de RPE65 como se divulgó anteriormente y como se ilustra en la figura 1B.

Ejemplos

Ejemplo 1: Cromatografía de dos etapas para purificar partículas de AAV4 usando una primera etapa de cromatografía de inmunoafinidad.

A. Material y métodos

A1. Cosecha del lisado celular.

Las células transfectadas se recolectan a las 96 /- 5 horas después de la transfección golpeando las CellStacks 10 (CS10) en todos los lados. La suspensión completa se transfiere a un contenedor de bioprocesos (BPC). La mayor parte de la partícula viral se libera en el sobrenadante.

En esta etapa, la mayor parte del vector viral ya se libera en el sobrenadante, pero es necesario un tratamiento con Triton X-100 al 0.5 % (v/v) (1 hora, agitando, a temperatura ambiente) para optimizar la extracción de AAV4 células, para contribuir a separar las partículas de las impurezas, y finalmente para optimizar la recuperación de AAV4 en el sobrenadante y optimizar la siguiente etapa de la filtración en profundidad.

A2. Clarificación del lisado celular.

La suspensión obtenida tras la acción de Triton X-100 se filtra a través de un filtro de profundidad Millipore Polysep II 1/0.2 |jm para descartar los desechos celulares. Al final de la etapa de filtración, la unidad de filtración se vacía presionando con aire. Este es el lisado clarificado.

Durante esta etapa también se descarta una gran parte del ADN y las proteínas solubles.

A3. Etapa de purificación por inmunoafinidad cromatográfica

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn. El lisado clarificado se inyecta a una tasa de flujo lineal de 150 cm/h a través de una columna AVB de 185 ml de matriz empaquetada equilibrada con DPBS suplementado con calcio y magnesio. Durante esta etapa, el AAV se une específicamente a la columna. Las impurezas no se unen a la columna y se desechan en el flujo. Para lavar el material unido inespecífico, la columna se enjuaga luego con DPBS.

El AAV se eluye con un tampón PBS pH 2.0. Las fracciones eluidas se neutralizan simultáneamente con un 10 % de tampón Tris 1M, MgCh 20 mM, CaCl 10 mM, pH 8.5.

Las fracciones eluidas neutralizadas con tampón Tris se congelan a <-70 °C, o incluso <-80 °C hasta la titulación de AAV por QPCR para detectar la cantidad de AAV en cada fracción.

A4. 1a Alternativa: gradiente de CsCl después de la etapa de purificación por inmunoafinidad.

Se reúnen las fracciones eluidas de la columna AVB y que contienen el AAV. Para precipitar AAV y obtener un volumen adecuado para el gradiente, se agrega PEG 8000 para obtener un 8 % final. Después de una precipitación durante la noche con PEG al 8 % (p/v), la suspensión que contiene AAV se centrifuga a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C. El sedimento que contiene AAV se resuspende en 12 ml de CsCl de densidad de 1376 g/cm3, y se transfiere a un tubo UltraClear para rotor SW41. El gradiente se centrifuga a 38.000 rpm durante 48 horas a 15 °C para separar las partículas llenas de las “vacías”. La banda de partículas completas enriquecidas se recoge con una jeringa de 5 o 10 ml. Luego, la suspensión viral se somete a filtración de flujo tangencial (TFF).

A5. 2a alternativa: cromatografía de intercambio aniónico CIMmultus después de la etapa de purificación por inmunoafinidad.

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn.

Las fracciones eluidas de la columna AVB y que contienen AAV se combinan y se someten a una etapa de TFF para diafiltración. El objetivo de esta etapa de ^{t F f}es cambiar el tampón de fracciones eluidas neutralizadas de AVB para poder unir AAV a la columna CIMmultus QA.

El AAV diafiltrado se inyecta luego a través de una columna Monolith CIMmultus QA equilibrada con tampón 1: Tris 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8.5 para promover la unión de AAV a la columna.

Al final de la inyección de la suspensión que contiene AAV, la columna se lava con tampón 1 para descartar todo lo que pudiera unirse de forma inespecífica.

La etapa de elución es un gradiente de sal de NaCl con una pendiente muy poco profunda que es el resultado de mezclar el tampón 1 (Tris 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl22 mM, CaCl21 mM, pH 8.5) con el tampón 2 (Tris 20 mM, NaCl 1 M, MgCl2 2 mM, CaCl2 1 mM, pH 8.5). El lento aumento de sal permite eluir gradualmente el ^{A a V}y separar las subpoblaciones como partículas llenas y vacías si hay subpoblaciones presentes.

Las fracciones eluidas se recogen en botellas de polipropileno y se almacenan a <-70 °C, o incluso <-80 °C, hasta el TFF.

A6. Filtración de flujo tangencial (TFF).

Se agrupan las fracciones seleccionadas (alrededor de 1 l de volumen). La TFF se realiza utilizando una fibra hueca mPES con un corte de 30 KDa. El AAV se diafiltra y se concentra contra la Solución Ocular Salina (SOS).

Las fracciones agrupadas se concentran primero ligeramente, se diafiltran frente a 10 volúmenes de tampón y finalmente se concentran para alcanzar la concentración esperada. TFF permite descartar las impurezas restantes de pequeño tamaño, así como formular el vector viral en el tampón adecuado para inyectar y concentrar al nivel adecuado. El vector viral filtrado, purificado y concentrado se almacena a <-70 °C, o incluso <-80 °C, hasta la titulación.

A7. Filtración estéril.

El AAV se diluye con SOS (Solución Ocular Salina) para obtener la concentración precisa necesaria para la inyección a los pacientes y se esteriliza con un filtro de PES de 0.2 pm antes de ser alícuotas en el recipiente final según el volumen esperado. Las dosis se almacenan a <- 80 °C hasta la inyección.

A8. Concentración del genoma del vector por qPCR (vg/ml)

Este método consiste en la determinación de partículas que contienen genoma mediante PCR cuantitativa (qPCR) dirigida al casete de expresión del transgén (el transgén, el poli (A), el ITR o el promotor). Las muestras de rAAV se digieren primero con DNasa para eliminar el ADN no encapsidado. Posteriormente, un tratamiento con Proteinasa K degrada las cápsidas de AAV y libera el ADN viral para la cuantificación posterior de qPCR.

El vector plásmido que contiene el amplicón dirigido se usa para generar la curva estándar para la qPCR. Este plásmido se linealiza mediante digestión con endonucleasas de restricción, se divide en alícuotas y se almacena a < -18 °C para asegurar la estabilidad y reproducibilidad de la curva estándar en cada ensayo.

El cálculo de 1e 10 copias de amplicón se basa en la siguiente fórmula:

Cantidad de ADN (g) = (660 * tamaño del plásmido (bp) * 1e 10 copias)/(6.02 * 10e 23) La cantidad relativa de ADN del genoma del vector se asigna por extrapolación del número de copias por reacción de la curva estándar que contiene una cantidad conocida de ADN de amplicón.

Los resultados se informan en genoma de vector por ml.

A9. Concentración de partículas infecciosas por ICA (ip/ml)

El ensayo del centro infeccioso (ICA) permite la cuantificación de partículas infecciosas en un lote de rAAV. Este ensayo implica la infección de una estirpe celular permisiva que porta de manera estable las secuencias rep y cap de AAV2 (HeLaRC32, ATCC CRL-2972) con diluciones en serie crecientes del vector rAAV y con adenovirus de tipo silvestre (tipo 5). Por tanto, las partículas infecciosas de rAAV que entren en las células podrán replicarse. Los eventos de replicación se detectan luego por quimioluminiscencia y se cuantifican después de la hibridación con una sonda específica del transgén (Salvetti et al., Hum Gene Ther, 1998).

Veintiséis horas después de la infección, las células se recogen, se lisan y se transfieren a una membrana de nailon. Se realiza una hibridación con una sonda transgénica específica marcada con fluoresceína. A continuación, la señal se amplifica con un anticuerpo anti-fluoresceína acoplado con fosfatasa alcalina y se detecta por quimioluminiscencia. Finalmente, los eventos de replicación se cuantifican contando puntos después de la revelación en una película radiográfica.

A10. Pureza e identidad de la cápsida del vector mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie.

El método SDS-PAGE es una electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes que separa las proteínas y los demás componentes de la muestra en función de su peso molecular y sus cargas.

Después de la electroforesis, el gel se tiñe con azul de Coomassie (Imperial Protein Stain) para cuantificar solo las proteínas en las muestras. La identidad proteica del rAAV se confirma por la presencia de las tres proteínas de la cápsida del AAV denominadas VP1, VP2 y VP3 relativas a su peso molecular (87, 72 y 62 KDa). La pureza proteica del rAAV se calcula como una cantidad relativa de proteínas de la cápsida en comparación con la cantidad total de proteínas presentes en la muestra.

El gel de electroforesis se analiza después de la tinción con azul de Coomassie mediante un analizador de imágenes luminiscentes con una cámara CCD. Cada banda de proteína se detecta como un pico y el analizador integra la señal. Luego se calcula el área de cada pico; un producto 100 % puro contiene solo las tres bandas de proteínas VP1, VP2 y VP3.

A11. Cuantificación de partículas vectoriales mediante SDS-PAGE y tinción con plata

La tinción con plata, basada en la metodología de Heukeshoven y Dernick (Heukeshoven y Dernick Electrophoresis, 1985), permite la detección de proteínas y ácidos nucleicos separados por electroforesis en gel de poliacrilamida. La muestra se carga en el mismo gel que el rAAV usado para la curva estándar. La curva estándar se genera utilizando un lote de rAAV de referencia, producido y caracterizado de la misma manera que el rAAV8RSM (Ayuso et al, Hum Gene Ther. 2014), y que contiene 100 % de partículas completas.

Después de la electroforesis, se analiza el gel mediante un analizador de imágenes con cámara CCD y se integra la señal de la banda correspondiente a VP3 para cada carril. La cantidad de cápsidas totales presentes en la muestra se extrapola de la curva estándar y se informa en partículas por ml.

La relación partículas llenas/totales se basa en el siguiente cálculo: Título en el genoma del vector por ml/título en partículas por ml.

Como referencia: método simplificado para la tinción con plata de proteínas en geles de poliacrilamida y el mecanismo de tinción con plata. (Electroforesis 6 (1985) 103-112, Heukeshoven, J. y Dernick, R.) & Manufacturing and Characterization of a recombinant associated virus type 8 reference standard material, Ayuso et al, (Hum Gene Ther.

2 de octubre de 2014).

A12. ADN residual de la célula huésped por qPCR (albúmina y E1A de células HEK 293)

El ADN de la célula huésped humana residual se determina usando un método de PCR cuantitativa en tiempo real dirigido a los genes E1A de albúmina humana o adenovirus tipo 5.

Se usa un plásmido que contiene los amplicones específicos (albúmina y E1A) para generar la curva estándar para la qPCR. Este plásmido se linealiza mediante digestión con endonucleasas de restricción, se llena y se almacena a < -18 °C para asegurar la estabilidad y reproducibilidad de la curva estándar en cada ensayo. El cálculo de 1e 10 copias de la secuencia del gen de la albúmina se basa en el siguiente cálculo:

Cantidad de ADN (g) = (660 x tamaño de plásmido (bp) x 1e10 copias)/(6.02 x 10e23.

La cantidad relativa de albúmina o ADN de amplicón E1A se asigna por extrapolación del número de copias por reacción a partir de la curva estándar que contiene una cantidad conocida de albúmina o ADN de amplicón E1A.

Se realiza una segunda curva estándar con ADN genómico de la estirpe celular HEK293, de 50 pg a 5 ng por pozo. Esta curva estándar indica la correlación entre la cantidad de albúmina o copia E1A y la cantidad correspondiente en ng de ADN HEK293.

B. Resultados

Las Figuras 3A y 3B ilustran el perfil de elución de un sobrenadante clarificado que contiene partículas de AAV4, de una etapa de cromatografía de inmunoafinidad (véase la figura 3A) en una columna de AVB. El primer plano del pico del perfil de elución se divulga además en la figura 3B.

El método de purificación se logra ved a escala de 1l La titulación del genoma del vector en cada etapa y la caracterización del producto final se establecen de acuerdo con los protocolos antes mencionados y se resumen en las siguientes tablas:

Tabla 1 la de 1l

Conclusión: este protocolo es eficaz para purificar la preparación de AAV4 de grado clínico a partir de sobrenadante clarificado a una escala de 1l y con muy buenos rendimientos. Ventajosamente, la etapa de inmunocromatografía en columna de AVB solo impacta moderadamente en la cantidad del genoma del vector.

Ejemplo 2: Cromatografía de dos etapas para purificar partículas de AAV4 usando una primera etapa de cromatografía de inmunoafinidad, seguido de una segunda etapa de cromatografía de intercambio aniónico (Protocolo alternativo)

A. Material y métodos

La sección Material y métodos del Ejemplo 1 también es aplicable al Ejemplo 2 aparte de:

A3. Etapa de purificación por inmunoafinidad cromatográfica (Protocolo alternativo)

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn. El lisado clarificado se inyecta a un caudal lineal de 150 cm/h a través de una columna AVB (185 ml de matriz empaquetada) equilibrada con PBS. Durante esta etapa, el AAV se une específicamente a la columna. Las impurezas no se unen a la columna y se desechan en el flujo. Para lavar el material unido inespecífico, la columna se enjuaga luego con PBS. El AAV se eluye con un tampón p Bs pH 2.0. Las fracciones eluidas se neutralizan simultáneamente con un 10 % de tampón Tris 1M, MgCl220 mM, CaCl 10 mM, pH 8.

Las fracciones eluidas neutralizadas con tampón Tris se complementan con 0.001 % de Pluronic F68 y se congelan a <-70 °C, o incluso <-80 °C, hasta la titulación de AAV por QPCR para detectar la cantidad de AAV en cada fracción. A4. 1a alternativa: gradiente de CsCl después de la etapa de purificación por inmunoafinidad (protocolo alternativo) Se agrupan las fracciones eluidas de la columna AVB y que contienen el AAV. Para concentrar AAV y obtener un volumen adecuado para gradiente, el conjunto de fracciones de AAV se somete a una Filtración de Flujo Tangencial contra Solución Ocular Salina con 0.001 % de Pluronic F68. El AAV diafiltrado se resuspende en 12 ml de CsCl de densidad de 1376 g/cm3 y se transfiere a un tubo UltraClear para rotor SW41. El gradiente se centrifuga a 38,000 rpm durante 48 horas a 15 °C para separar las partículas llenas de las “vacías”. La banda de partículas completas enriquecidas se recoge con una jeringa de 5 o 10 ml. Luego, la suspensión viral se somete a filtración de flujo tangencial (TFF).

A5. 2a Alternativa: Cromatografía de intercambio aniónico CIMmultus después de la etapa de purificación por inmunoafinidad (Protocolo alternativo).

Las fracciones eluidas de la columna AVB y que contienen el AAV se reúnen y se someten a una etapa de TFF para diafiltración. El objetivo de esta etapa de t Ff es cambiar el tampón de fracciones eluidas neutralizadas de AVB para poder unir AAV a la columna CIMmultus QA.

Todos los tampones utilizados durante la etapa de cromatografía IEX contienen 0.001 % de Pluronic F68.

El AAV diafiltrado se inyecta a través de una columna Monolith CIMmultus QA equilibrada con tampón 1: Tris 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 9 para promover la unión de AAV a la columna.

La etapa de elución es un gradiente de sal de NaCl con una pendiente muy poco profunda que es el resultado de mezclar el tampón 1 (Tris 20 mM, NaCl 10 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8) con el tampón 2 (Tris 20 mM, NaCl 500 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8). El lento aumento de sal permite eluir gradualmente el AAV y separar las subpoblaciones como partículas llenas y vacías si hay subpoblaciones presentes.

Las fracciones eluidas se recogen en botellas de polipropileno y se almacenan a <-70 °C, o incluso <-80 °C hasta el TFF.

A6. Filtración de flujo tangencial (TFF) (protocolo alternativo).

Se agrupan las fracciones seleccionadas (alrededor de 0.5 l de volumen). La TFF se realiza utilizando una fibra hueca mPES con un corte de 100 KDa. El AAV se diafiltra y se concentra frente a una solución ocular salina (SOS) que contiene Pluronic F68 al 0.001 %.

A7. Filtración estéril (protocolo alternativo).

El AAV se diluye con SOS (Solución Ocular Salina) que contiene Pluronic F68 para obtener la concentración precisa necesaria para la inyección y se esteriliza con un filtro de PES de 0.2 pm antes de dividirse en alícuotas en el recipiente final según el volumen esperado. Las dosis se almacenan a <-70 °C, o incluso <-80 °C hasta la inyección.

B. Resultados

Resultados de B1 AAV4 a escala 1L

El método de purificación se logra a una escala de 1l. La segunda etapa es una etapa de cromatografía IEX o un gradiente de CsCl, como se indica en la Tabla 3. La titulación del genoma del vector en cada etapa se resume en la siguiente tabla:

Tabla 3: titulación del genoma del vector a partir de una purificación a escala de 1l (protocolo alternativo)

B2 Resultados de AAV4 a escala 3l

Este es un ejemplo de una escala de 3l, donde AAV4 se purifica con el proceso descrito anteriormente que comprende una extracción con Triton X-100, una filtración en profundidad, una etapa de cromatografía de afinidad, una TFF, una etapa de cromatografía IEX, una TFF y una Filtración estéril de 0.2 pm.

En la Tabla 4 se resumen los resultados de cada etapa, mediante titulación del genoma del vector.

El perfil de elución se obtiene de la etapa de cromatografía IEX. Cada fracción se analiza en un gel de poliacrilamida SDS teñido con plata. Todas las fracciones se cargaron con la misma cantidad de genoma de vector. La señal de las proteínas de la cápsida, más importante en las primeras fracciones, y la relación de las curvas de absorbancia a 280 y 254 nm, muestran que las primeras fracciones eluidas están mayoritariamente contaminadas por cápsidas vacías. Las fracciones seleccionadas comprenden principalmente cápsidas completas.

La intensidad de las proteínas de la cápsida de cada fracción se comparó con una preparación de AAV4 de referencia obtenida por purificación en un proceso de gradiente de dos CsCl y que contenía > 90 % de partículas completas.

Tabla 4: titulación del genoma del vector a partir de una purificación a escala 3l

Tabla 5: caracterización del producto final

Es de señalar que la relación vg/pi es muy alta debido a la escasa permisividad de las células HeLa para AAV4. Sin embargo, esta proporción es comparable a la proporción de la preparación de referencia AAV4.

Conclusión: este protocolo es eficaz para purificar la preparación de AAV4 de grado clínico a partir de sobrenadante clarificado a una escala de 3 l, y con muy buenos rendimientos. De manera ventajosa, la etapa de cromatografía en columna IEX afecta la cantidad de partículas completas.

Ejemplo 3: Cromatografía de dos etapas para purificar partículas de AAVrh10 usando una primera etapa de cromatografía de inmunoafinidad, seguido de una segunda etapa de gradiente de CsCl o cromatografía de intercambio aniónico (protocolo alternativo)

A. Material y métodos

La sección Material y métodos del Ejemplo 1 también es aplicable al Ejemplo 3, aparte de:

A1. Cosecha del lisado celular (Protocolo alternativo)

Se recogen células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus en un biorreactor de 2l a las 96 /- 5 horas después de la infección. La suspensión completa se trata con Triton X-100 (0.5 % v/v final, 27 °C, durante 2.5 horas). La mayor parte de la partícula viral se libera en el sobrenadante.

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn. El lisado celular clarificado se inyecta a un caudal lineal de 60 cm/h a través de una columna AVB (185 ml de matriz empaquetada) equilibrada con DPBS suplementado con calcio y magnesio. Durante esta etapa, el AAV se une específicamente a la columna. Las impurezas no se unen a la columna y se desechan en el flujo. Para lavar el material unido inespecífico, la columna se enjuaga luego con DPBS.

El AAV se eluye con un tampón de ácido cítrico 50 mM que contiene NaCl 300 mM, pH 3.4. Las fracciones eluidas se neutralizan simultáneamente con un 10 % de tampón Tris 1M, MgCh 20 mM, CaCl 10 mM, pH 8.5.

A4. 1a alternativa: gradiente de CsCl después de la etapa de purificación por inmunoafinidad (protocolo alternativo) Se agrupan las fracciones eluidas de la columna AVB y que contienen el pico de AAV (detectado mediante la medida de absorbancia a 280 y 254 nm). Para concentrar el AAV y obtener un volumen adecuado para el gradiente, el conjunto de fracciones de AAV se somete a una precipitación de PEG 8 000 durante la noche a 4°C seguido de una centrifugación a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C. El sedimento se resuspende en 12 ml de CsCl de densidad de 1.376 g/cm3 y se transfiere a un tubo UltraClear para rotor SW41. El gradiente se centrifuga a 38,000 rpm durante 48 horas a 15 °C para separar las partículas llenas de las “vacías”. La banda de partículas completas enriquecidas se recoge con una jeringa de 5 o 10 ml. A continuación, la suspensión viral se somete a diálisis frente a DPBS con calcio y magnesio. La suspensión viral dializada se complementa con un 0.001 % de Pluronic F68 y se congela a <-80 °C. A5. Segunda alternativa: cromatografía de intercambio aniónico POROS HQ después de la etapa de purificación por inmunoafinidad (protocolo alternativo).

Esta etapa se realiza con un Akta Explorer (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn.

Las fracciones eluidas de la columna AVB y que contienen el AAV se combinan, se complementan con el 0.001 % de Pluronic F68 y se almacenan a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, el grupo de AAV se somete a una etapa de TFF para diafiltración. El objetivo de esta etapa de TFF es cambiar el tampón de las fracciones eluidas neutralizadas de AVB para poder unir AAV a la columna POROS HQ. El AAV diafiltrado se inyecta a través de una columna POROS HQ equilibrada con tampón 1: Tris 20 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8.5 para promover la unión del AAV a la columna.

La etapa de elución es un gradiente de sal de citrato de Na con una pendiente muy poco profunda que es el resultado de mezclar el tampón 2 (Tris 10 mM, Citrato de Na 10 mM MgCl22 mM, CaCl21 mM, pH 8 con 0.001 % Pluronic F68) con tampón 3 (Tris 10 mM, citrato de Na 500 mM, MgCl22 mM, CaCl2 1 mM, pH 8, con Pluronic F68 al 0.001 %). El lento aumento de sal (gradiente para obtener el 70 % del tampón 3 en 40 volúmenes de columna) permite eluir gradualmente el AAV y separar subpoblaciones como partículas llenas y vacías si hay subpoblaciones presentes. Las fracciones eluidas se recogen en tubos de polipropileno y se almacenan a <-80 °C hasta el TFF.

A6. Filtración de flujo tangencial (TFF) (protocolo alternativo).

Se combinan las fracciones seleccionadas. La TFF se realiza utilizando una fibra hueca mPES con un corte de 100 KDa. El AAV se diafiltra y se concentra contra DPBS con calcio y magnesio que contiene Pluronic F68 al 0.001 %. Las fracciones agrupadas se concentran primero ligeramente, se diafiltran frente a 10 volúmenes de tampón y finalmente se concentran para alcanzar la concentración esperada. El vector viral filtrado, purificado y concentrado se almacena a <-80 °C hasta la titulación.

B. Resultados

Resultados B1 AAVrh10 a escala 1L

El método de purificación se logra a una escala de 1 l. La segunda etapa es un gradiente de CsCl o una etapa de cromatografía IEX, como se indica en la Tabla 6. La titulación del genoma del vector en cada etapa se resume en la siguiente tabla:

Tabla 6: titulación del genoma del vector equivalente a purificación a escala de 1l (protocolo alternativo)

Ejemplo 4: Cromatografía de dos etapas para purificar partículas de AAV2 usando una primera etapa de cromatografía de inmunoafinidad, seguido de una segunda etapa de gradiente de CsCl (protocolo alternativo)

A. Material y métodos

La sección de materiales y métodos del ejemplo 1 también es aplicable al ejemplo 4 aparte de:

A1. Cosecha del lisado celular (Protocolo alternativo)

Se recogen células de insecto Sf9 infectadas con baculovirus en un biorreactor de 2L a las 96 /- 5 horas después de la infección. La suspensión completa se trata con Triton X-100 (0.5 % v/v final, 27 °C, durante 2.5 horas). Se realiza una etapa adicional de digestión con nucleasa agregando Benzonasa 5U/ml durante 2 horas adicionales a 37 °C.

Esta etapa se realiza con un Akta Pilot (GE Healthcare) controlado por un software Unicorn. El lisado clarificado se inyecta a un caudal lineal de 115 cm/h a través de una columna AVB (185 ml de matriz empaquetada) equilibrada con DPBS suplementado con calcio y magnesio. Durante esta etapa, el AAV se une específicamente a la columna. Las impurezas no se unen a la columna y se desechan en el flujo. Para lavar el material unido inespecífico, la columna se enjuaga luego con DPBS.

El AAV se eluye con un tampón de ácido cítrico 50 mM que contiene NaCl 300 mM, pH 3.4. Las fracciones eluidas se neutralizan simultáneamente con un 10 % de tampón Tris 1M, MgCl220 mM, CaCl 10 mM, pH 8.5.

A4. 1a alternativa: gradiente de CsCl después de la etapa de purificación por inmunoafinidad (protocolo alternativo) Se agrupan las fracciones eluidas de la columna de AVB y que contienen el pico de AAV (detectado mediante la medida de absorbancia a 280 y 254 nm). Para concentrar el AAV y obtener un volumen adecuado para el gradiente, el conjunto de fracciones de ^{A A v}se somete a una precipitación de PEG 8000 durante la noche a 4 °C seguido de una centrifugación a 4000 rpm durante 1 hora a 4 °C. El sedimento se resuspende en 12 ml de CsCl de densidad de 1.376 g/cm3 y se transfiere a un tubo UltraClear para rotor SW41. El gradiente se centrifuga a 38.000 rpm durante 48 horas a 15 °C para separar las partículas llenas de las “vacías”. La banda de partículas completas enriquecidas se recoge con una jeringa de 5 o 10 ml. A continuación, la suspensión viral se somete a diálisis frente a DPBS con calcio y magnesio. La suspensión viral dializada se complementa con un 0.001 % de Pluronic F68 y se congela a <-80 °C. A7. Filtración estéril.

El AAV se filtra con un filtro de PES de 0.2 pm antes de dividirse en alícuotas en el recipiente final de acuerdo con el volumen esperado. Las dosis se almacenan a <-80 °C.

B. Resultados

Resultados B1 AAV2 a escala 1L

El método de purificación se logra a una escala de 1 l. La segunda etapa es un gradiente de CsCl, como se indica en la Tabla 7. La titulación del genoma del vector en cada etapa se resume en la siguiente tabla:

Tabla 7: titulación del genoma del vector equivalente a purificación a escala de 1l (protocolo alternativo)

Ejemplo 5: Comparación entre el método de la invención y un método para purificar partículas de rAAV que comprenden cromatografías de intercambio catiónico y aniónico

A. Material y métodos

Descripción del método que comprende cromatografías de intercambio catiónico y aniónico

Las células transfectadas se recolectaron entre 48 y 72 horas después de la transfección golpeando las CellStacks 5 (CS5) en todos los lados. La suspensión completa de AAV4 se lisó por homogeneización en un homogeneizador de alta presión (Emulsiflex C55, Avestin) a 900 /- 50 bares. La caída de presión en este sistema conduce a la ruptura de las células, lo que permite la extracción de partículas de AAV en el sobrenadante y la reducción del tamaño de los desechos celulares.

El lisado celular homogeneizado se filtra en profundidad a través de una unidad Millistack COHC (Merck Millipore) y un filtro de PES 0.5/0 .2 pm para descartar los desechos celulares.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para obtener partículas de virus adenoasociado recombinante (rAAV) purificadas, que comprende las etapas de:

b) realizar una filtración profunda del material de partida, por lo que se proporciona una composición clarificada que contiene rAAV;

d) enviar la primera composición enriquecida con rAAV al menos una vez a:

d1) una etapa de cromatografía de intercambio aniónico sobre un soporte cromatográfico, en la que la elución se realiza usando un gradiente de sal y en la que se recoge la fracción que contiene rAAV, con lo que se proporciona una segunda composición enriquecida con rAAV; o

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa c) se realiza utilizando un soporte cromatográfico sobre el cual se inmovilizan anticuerpos o fragmentos de los mismos dirigidos a dichas partículas de rAAV.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos son monoclonales.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en el que dichos anticuerpos o fragmentos de los mismos son anticuerpos de camélido o fragmentos de los mismos.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que en la etapa d1), el soporte cromatográfico es un soporte cromatográfico monolítico.

6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa e) se realiza usando una membrana de filtro que tiene un valor de corte de peso molecular que varía de 20 kDa a 150 kDa.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las partículas de rAAV pertenecen al serotipo AAV AAV4.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las partículas de rAAV consisten en partículas de rAAV4 que contienen ADN que comprende un casete de expresión que codifica RPE65 humano.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichas partículas de rAAV purificadas son adecuadas para su uso en terapia génica.