ES2836811T3 - Alfa-amilasa protegida - Google Patents

Abstract

Un ingrediente para pienso animal con α-amilasa protegida resistente a la liberación de α-amilasa en el ambiente del estómago de un animal monogástrico y susceptible a la liberación de α-amilasa en el ambiente entérico, que comprende: (a) un núcleo que comprende α-amilasa; (b) un primer recubrimiento que comprende del 50 % al 85 % de un polímero entérico sensible al pH y del 15 % al 50 % de excipientes; y (c) un segundo recubrimiento que comprende del 50 % al 85 % de un polímero de liberación lenta y del 15 % al 50 % de excipientes.

Description

DESCRIPCIÓN

Alfa-amilasa protegida

Antecedentes de la invención

Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente de Estados Unidos con número de serie 61/295,444, presentada el 15 de enero de 2010.

La presente invención se refiere en general a enzimas para mejorar la digestibilidad de los alimentos y, más particularmente, a una a-amilasa que está protegida contra la inactivación por ácido o calor.

El almidón de la dieta, que es la principal fuente de energía para los animales, se degrada a glucosa por la amilasa endógena en la cavidad bucal y en el intestino delgado; es la glucosa la que proporciona energía al animal. Sin embargo, la escasez de amilasa endógena en los animales, especialmente en los animales jóvenes, limita la utilización de almidón y disminuye el potencial nutricional de los piensos. Durante décadas la amilasa exógena se ha usado para aumentar la digestibilidad del almidón y mejorar el rendimiento del crecimiento de los animales.

La cavidad bucal y el intestino delgado son los sitios en los que se digiere el almidón. En un ambiente de pH neutro, la amilasa en las secreciones salivales y la pancreatina degrada el almidón en monosacáridos, que luego son absorbidos por el intestino delgado y metabolizados para liberar energía. El alimento generalmente pasa rápidamente por la cavidad bucal y el esófago, por lo que solo se producen aquí niveles bajos de digestión del almidón. Por el contrario, el intestino delgado, donde el ambiente es mucho más acuoso y el tiempo de residencia es mucho mayor, es el sitio más importante para la degradación del almidón. Por lo tanto, para que una amilasa exógena sea eficaz, necesitaría de un buen rendimiento en el intestino delgado. Para lograr esto, la amilasa exógena necesitaría ser resistente al bajo pH del estómago para que permanezca activa al entrar en el intestino delgado.

Al mismo tiempo, no existen a-amilasas comerciales de origen bacteriano que sean resistentes a los ácidos, incluye la aamilasa Refined™ (Jiangmen China) y BAN 800® (Novozymes). Estas a-amilasas sensibles a los ácidos son inactivadas de forma irreversible por el ácido del estómago antes de llegar al intestino delgado donde tiene lugar la degradación del almidón. El desarrollo de una a-amilasa resistente a los ácidos para maximizar la efectividad de la a-amilasa exógena cubriría una necesidad en el mercado.

Las composiciones de a-amilasa recubiertas que tienen un recubrimiento de liberación prolongada y un recubrimiento neutralizante del blanqueador se describen en el documento EP 0286773A. El recubrimiento de liberación de tiempo está diseñado para retrasar la liberación de la sustancia neutralizante del blanqueador y la enzima, de modo que un blanqueador usado en combinación con la formulación pueda realizar su función limpiadora antes de que sea desactivado por la sustancia neutralizante del blanqueador. Los núcleos de pancreatina provistos de un recubrimiento gástrico disoluble se describen en el documento CN 1943783. CA 2263703 describe el recubrimiento de los gránulos de pancreatina con una solución de recubrimiento para proteger la pancreatina contra las condiciones de pH de la tableta. Las composiciones para el lavado de la piel que comprende una capa de enzima formada sobre una semilla y múltiples capas de recubrimiento formadas sobre la capa de enzima se describen en el documento KR100804096B.

Las micropartículas de copolímero de alginato/polimetacrilato para el suministro intestinal de enzimas se describen en Scocca y otros, en Current Drug Delivery, 2007, 4, 103-108.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona un ingrediente para pienso animal con a-amilasa protegida resistente a la liberación de la a-amilasa en el ambiente del estómago de un animal monogástrico y susceptible a la liberación de la a-amilasa en el ambiente entérico, que comprende:

(a) un núcleo que comprende a-amilasa;

(b) un primer recubrimiento que comprende del 50 % al 85 % de un polímero entérico sensible al pH y del 15 % al 50 % de excipientes; y

(c) un segundo recubrimiento que comprende del 50 % al 85 % de un polímero de liberación lenta y del 15 % al 50 % de excipientes.

La enzima protegida se produce con el recubrimiento de la a-amilasa normal con materiales de liberación controlada. Se usan dos mecanismos en el producto protegido. En el recubrimiento se usó un polímero con uno o más grupos carboxilo. Este material se disuelve solo a un pH superior a 5,0 y, por lo tanto, proporciona una liberación controlada por el pH. Para controlar la liberación de una manera dependiente del tiempo, se usó también copolímero metacrílico y PEG.

El producto enzimático reivindicado en la presente invención usa la tecnología de encapsulación para proporcionar resistencia al ambiente ácido del estómago y no se libera en el ambiente del estómago y se libera en el ambiente entérico.

El producto enzimático reivindicado en la presente invención usa tres mecanismos diferentes para contribuir a la liberación estrictamente controlada.

El producto enzimático reivindicado en la presente invención se puede aplicar, pero no restringirse, para aumentar la digestibilidad en animales monogástricos.

El producto enzimático reivindicado en la presente invención se puede aplicar, pero no restringirse, a piensos compuestos y suplementos dietéticos humanos.

El producto enzimático reivindicado en la presente invención se puede aplicar, pero no restringir, con alfa-amilasas normales no encapsuladas en diferente relación para propósitos diferentes.

El producto enzimático reivindicado en la presente invención se puede aplicar, pero no restringirse, a relación para aves de corral, cerdos y otros animales monogástricos para aumentar la digestión del almidón.

La dosis preferida de este producto enzimático está entre 250-1000 g/tonelada. En una modalidad preferida, la aplicación final del producto es de entre 150 y 500 unidades de actividad enzimática por cada tonelada de pienso terminado.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un gráfico del procedimiento que se usó para producir los productos enzimáticos de la presente invención. La figura 2 es un gráfico de la curva de liberación de la a-amilasa protegida de la presente invención en un entorno ácido, un entorno neutro y un entorno neutro con presencia de lipasa y pancreatina.

La figura 3 es un gráfico de la comparación de los efectos de la a-amilasa Refined ™ y la a-amilasa protegida de la presente invención en el azúcar reductor liberado de la harina de maíz.

La figura 4 es un gráfico de los efectos del suplemento de a-amilasa protegida sobre el peso corporal final del pollo de engorde (A, B, C significa que las letras diferentes difieren dentro de la columna, p<0,05; a, b significa letras diferentes dentro de la columna difieren significativamente, p<0,01).

La figura 5 es un gráfico de los efectos del suplemento de a-amilasa protegida sobre la ADFI de diferente fase de crecimiento de pollos de engorde.

La figura 6 es un gráfico de los efectos del suplemento de a-amilasa protegida sobre la ADG de diferente fase de crecimiento de pollos de engorde (A, B significa que las letras diferentes difieren dentro de la columna, p<0,05; a, b significa que las letras diferentes dentro de la columna difieren significativamente, p<0,01)

La figura 7 es un gráfico de los efectos del suplemento de a-amilasa protegida sobre la FCR de diferente fase de crecimiento de pollos de engorde (A, B, C significa que diferentes letras dentro de la columna difieren, p<0,05; a, b significa diferentes letras dentro columna difiere significativamente, p<0,01)

La figura 8 es un gráfico de los efectos del suplemento de a-amilasa protegida sobre la disponibilidad metabólica de nutrientes de los pollos de engorde (A, B, C significa que las letras diferentes dentro de la columna difieren, p<0,05; a, b significa que las letras diferentes dentro de la columna difieren significativamente, p<0,01).

Descripción detallada de las modalidades preferidas

Como se usa en la presente, la a-amilasa incluye cualquier composición que tenga actividad enzimática en la degradación del almidón que tenga vínculos o enlaces alfa. El núcleo de a-amilasa de la presente invención puede incluir excipientes, que incluye celulosa microcristalina, talco en polvo, estearato de calcio, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa, poli (glicol de etileno), glicerol y agua. El núcleo contiene preferentemente entre 50 % y 85 % de a-amilasa y entre 50 % y 15 % de uno o más excipientes y cualquier composición dentro de ese intervalo.

Como se usa en la presente, un polímero sensible al pH es un polímero que cambia sus características en respuesta a cambios de pH. Los polímeros de preferencia son polímeros entéricos que son relativamente más solubles en el ambiente menos ácido del intestino y relativamente menos solubles en el ambiente más ácido del estómago.

Un recubrimiento entérico puede ser un material de recubrimiento esencialmente convencional, por ejemplo polímeros entéricos tales como acetato ftalato de celulosa, acetato succinato de celulosa, ftalato de metilcelulosa, ftalato de etilhidroxicelulosa, polimetilacrilato, polivinilacetatoftalato, polivinilbutirato acetato, acetato de vinilo-monohidruro maleicocopolímero de maleico copolímero de éster, copolímero de acrilato de metilo-ácido metacrílico, copolímero de metacrilatoácido metacrílico-acrilato de octilo, etc. Estos pueden usarse solos o en combinación, o junto con otros polímeros distintos de los mencionados anteriormente. El recubrimiento entérico también puede incluir excipientes, tales como derivados de alquilo celulosa tales como etilcelulosa, polímeros reticulados tales como copolímero de estireno-divinilbenceno, polisacáridos que tienen grupo hidroxilo tales como dextrano, derivado de celulosa que se tratan con agentes de reticulación bifuncionales tales como epiclorhidrina, diclorhidrina 1, 2-, 3, 4-diepoxibutano, etc., talco en polvo, estearato de calcio, PEG 6000, citrato de trietilo y agua. El recubrimiento entérico también puede incluir almidón y/o dextrina.

Un recubrimiento de polímero sensible al pH de la presente invención contiene entre el 50 % y el 85 % del polímero sensible al pH y entre el 50 % y el 15 % de excipientes, incluye cualquier composición dentro del intervalo indicado.

Como se usa en la presente, los polímeros de liberación lenta incluyen polimetilacrilato, copolímero de ácido metacrílico tipo C, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilacrilato-metacrilato de metilo, cloruro de polivinilo, polímeros hidrófilos como derivado de celulosa, etilcelulosa o compuestos grasos que incluye cera de carnauba. Estos pueden usarse solos o en combinación, o junto con otros polímeros distintos de los mencionados anteriormente. El recubrimiento de polímero de liberación lenta puede incluir también excipientes, como derivado de alquilo celulosa como etilcelulosa, polímeros reticulados como copolímero de estireno-divinilbenceno, polisacáridos que tienen grupo hidroxilo como dextrano, derivado de celulosa que se trata con agentes de reticulación bifuncionales como epiclorhidrina, diclorhidrina, 1, 2-, 3, 4-diepoxibutano, etc., talco en polvo, estearato de calcio, PEG 6000, citrato de trietilo y agua. El recubrimiento de polímero de liberación lenta puede incluir también almidón y/o dextrina.

Un recubrimiento de polímero de liberación lenta de la presente invención que contiene entre 50 % y 85 % del polímero de liberación lenta y entre 50 % y 15 % de excipientes, incluye cualquier composición dentro del intervalo indicado.

Ejemplo 1

La a-amilasa protegida se preparó como la fórmula presentada en la Tabla 1.

Tabla 1. Fórmula de a-amilasa protegida

Componentes Peso, g

Núcleo

a-amilasa 650

Esterato de calcio 65

Agente de humectación/Solución de agente aglutinante

10 % w/w de PEG 6000/agua 350

Solución de recubrimiento entérico

Polimetacrilato entérico 350

Citrato de trietilo 11

Talco en polvo 25

Agua 350

Solución de recubrimiento desintegrador del estómago

Polimetacrilato desintegrador del estómago 280 Hidroxipropilmetilcelulosa de baja viscosidad 11

Talco en polvo 14

Agua 280

Ejemplo 2

Para el desarrollo de una a-amilasa de derivación gástrica y evaluar el producto, se midieron cuatro parámetros para evaluar la amilasa protegida: 1) resistencia en pH ácido y liberación efectiva en pH neutro mediante pruebas in vitro, 2) un ensayo de liberación de azúcar en dos pasos para la simulación de la digestión en el estómago y el intestino delgado, 3) un ensayo de liberación de azúcar en tres pasos para la simulación de la digestión en la cavidad bucal y el esófago, estómago e intestino delgado, y 4) termo estabilidad.

Materiales y métodos

Enzimas. Se obtuvo a-amilasa Refined ™ (de Bacillus subtilis disponible en Jiangmen, China) y BAN 800™ ((de Bacillus amyloliquefaciens, disponible en Novozymes). Ambas enzimas estaban en forma de polvo.

La a-amilasa protegida contiene aproximadamente un 30 % (p/p) de a-amilasa Refined ™. Se mezcló alfa-amilasa con polímeros, que incluye adhesivos y lubricantes, hasta la homogeneidad. Todos los materiales de recubrimiento están en la lista positiva de ingredientes para piensos publicada por el Departamento de Agricultura de China. La mezcla se extruyó en varillas largas que luego se cortaron en gránulos en forma de columnas. Los gránulos de la columna se esferonizaron en microgránulos redondos pulidos y se encapsularon con polímeros sensibles al pH, que son estables en pH bajo, pero se disuelven en pH neutro. La capa formó una membrana semipermeable alrededor de los microgránulos. Los jugos digestivos pueden ingresar lentamente al gránulo a través de la membrana semipermeable y así liberar la a-amilasa. El procedimiento se muestra en la Figura 1.

En este ensayo se usó tres tipos de preparaciones de Kemzyme® Dry (Kemin Industries, Inc.). Uno fue el actual Kemzyme® Dry mediante el uso de Refined ™ a-amilasa. La segunda preparación se preparó con el reemplazo de la aamilasa Refined ™ en Kemzyme® Dry con la a-amilasa protegida de igual peso. La tercera preparación se preparó con el reemplazo de la a-amilasa Refined ™ en Kemzyme® Dry con la a-amilasa protegida con la misma actividad enzimática. Las actividades enzimáticas de las tres preparaciones se enumeran en la Tabla 2.

Tabla 2. Actividades enzimáticas de tres preparaciones Kemzyme® Dry, U/g

Kemzyme® I Kemzyme® II Kemzyme® III

Proteasa neutral 250 250 250

Xilanasa 1,200 1,200 1,200

Celulasa 250 250 250

Beta-glucanasa 150 150 150

Pectinasa 300 300 300

Alfa-amilasa

a-amilasa Refined™ 300 -- --

a-amilasa protegida -- 70 300

Sustratos. En este ensayo se usó harina de maíz y un pienso compuesto preparado en laboratorio. El pienso compuesto consistió en 50 % de harina de maíz, 10 % de harina de trigo y 40 % de harina de soja.

Soluciones. Se usó tampones de fosfato para determinar la resistencia a los ácidos, el curso temporal de la liberación de la a-amilasa de los microgránulos y la liberación de azúcar reductor por las enzimas. La solución madre de tampón de fosfato 1 M se preparó disolviendo 200 g de NaH2PO4 y 120 g de K2HPO4 en 1000 ml de agua desionizada y se llevó el volumen a 2 L con agua desionizada. El tampón fosfato 0,01 M (pH 6,8) se preparó por dilución de 10 ml de solución madre de tampón fosfato con aproximadamente 800 ml de agua desionizada, ajustando el pH a 6,8 con NaOH 2 M y se llevó el volumen a 1 L con agua desionizada. El tampón fosfato 0,05 M (pH 2,0) se preparó por dilución de 50 ml de solución madre de tampón fosfato con aproximadamente 800 ml de agua desionizada, ajustando el pH a 2,0 con HCl 2 M y se llevó el volumen a 1 L con agua desionizada. El tampón fosfato 0,5 M (pH 7,0) se preparó por dilución de 500 ml de solución madre de tampón fosfato con aproximadamente 400 ml de agua desionizada, ajustando el pH a 7,0 con NaOH 10 M y se llevó el volumen a 1 L con agua desionizada.

Determinación de las actividades enzimáticas. La actividad de la a-amilasa se determinó mediante el uso de tabletas de Phadebas como sustrato. Las tabletas de Phadebas son un polímero de almidón de color azul insoluble reticulado, que se mezcla con albúmina de suero bovino y una sustancia tampón. Después de la suspensión en agua, el almidón se hidroliza por la alfa amilasa, dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la solución azul resultante, medida a 620 nm, es función de la actividad de la alfa amilasa. La beta-glucanasa, celulasa, proteasa, xilanasa y pectinasa se determinaron mediante ensayos como se describió sustancialmente en la solicitud de patente de los Estados Unidos.

2009/0004327, que se incorpora en la presente descripción en su totalidad por esta referencia.

Termoestabilidad. Se pusieron diez gramos de enzimas secas en cada vaso de precipitados y se trataron con vapor a 80 o 90 °C durante 5 o 10 minutos. Después del tratamiento, los vasos de precipitados se enfriaron a temperatura ambiente y se midieron las actividades antes y después del tratamiento mediante el uso el método de tableta de Phadebas. Se calculó la relación entre la actividad residual y la actividad inicial para reflejar la estabilidad térmica de las enzimas.

Estabilidad ácida. Se trataron diez gramos de a-amilasa Refined ™ y BAN 800 ™ con 100 ml de tampón fosfato (pH 3,0) en un vaso de precipitados durante 15 y 30 minutos, respectivamente. Posterior a esto la solución se ajustó a pH 7,0 y se midieron las actividades enzimáticas residuales y originales mediante el uso del método de tableta de Phadebas. Se usó la relación de las actividades residuales a las actividades originales para reflejar la estabilidad ácida.

La a-amilasa protegida se trató con tampón fosfato (pH 3,0) durante 1 hora y luego se trató con lipasa (25 U/L de tampón, Leveking Co.) y pancreatina (2,5 g/L) a pH 7,0 durante 2 horas. Las actividades restantes en el tampón se midieron mediante el uso del método de tableta de Phadebas. Las actividades enzimáticas originales se midieron triturando los microgránulos y luego se probaron mediante el uso del método de tableta de Phadebas. La relación entre la actividad residual y la actividad original se usó para reflejar la eficiencia global que se compone de la resistencia al pH ácido y la eficiencia de liberación de la enzima a pH neutro.

Cinética de liberación de la a-amilasa protegida. Se evaluó la cinética de liberación de la a-amilasa protegida en pH neutro mediante la incubación de 10 g de a-amilasa protegida en 100 ml de tampón fosfato (pH 7,0) durante 3 horas. Se tomó una muestra de un mililitro cada 30 minutos y se determinó la actividad de a-amilasa. Se calculó la relación entre la actividad liberada y la actividad inicial. Para medir la cinética de liberación en pH neutro y en presencia de lipasa y pancreatina, las condiciones fueron las mismas excepto que se incluye en la incubación lipasa (25 U/L) y pancreatina (2,5 g/L).

Para el tratamiento con tampón fosfato a pH 3,0, se incubaron 10 g de a-amilasa protegida en un vaso de precipitados con 100 ml de tampón fosfórico durante 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5 y 3,0 horas. Se recogieron los gránulos no liberados, se molieron y se determinó la actividad restante en los gránulos. La relación entre la actividad liberada y la actividad inicial se calculó como:

donde A y At son la actividad inicial y la actividad restante en gránulos en el tiempo t, respectivamente.

Métodos de prueba in vitro. Se condujeron experimentos para evaluar la protección de la a-amilasa en los entornos del estómago y el intestino delgado (dos pasos) y la cavidad bucal y el esófago más el estómago y el intestino delgado (tres pasos). En la primera ronda, mediante el uso del método de dos pasos con harina de maíz y piensos compuestos como sustrato, se evaluaron las preparaciones de a-amilasa protegida y a-amilasa Refined ™ no protegida en base a su capacidad para liberar azúcar reductor. En la segunda ronda, se probaron tres preparaciones de Kemzyme® (Tabla 1) para determinar la liberación de azúcar reductor mediante el uso del método de dos pasos con harina de maíz y pienso compuesto como sustrato. En la tercera ronda, se empleó el método de tres pasos para determinar la liberación de azúcar reductor de la harina de maíz por la a-amilasa Refined ™ y la a-amilasa protegida. La dosis de enzima que se usó en todas las pruebas in vitro fue de 10 g/kg de sustrato, que fue 10 veces la dosis recomendada de Kemzyme® Dry.

En el método de dos pasos, se incubaron 10 g de sustrato en 50 ml de solución de pepsina 1,5 g/L (se disolvió 1,5 g de pepsina en 1 L de tampón fosfato 0,05 M, pH 2,0) a 37 °C durante 1 hora. Luego se añadió 100 ml de tampón fosfórico 0,5 M (pH 7,0) y se incubó a 37 °C durante 4 horas. La reducción del contenido de azúcar en el tampón se determinó de acuerdo con el ensayo estándar de Somogyi-Nelson. En el método de tres pasos, se incubó 10 g de sustrato en 25 ml de tampón fosfórico 0,01 M (pH 6,8) a 37 °C durante 5 minutos. Luego se añadió 50 ml de solución de pepsina 1,5 g/L y el sustrato se incubó a 37 °C durante 1 hora. Finalmente, se añadió 100 ml de tampón fosfórico 0,5 M (pH 7,0) y se continuó la incubación adicionalmente por 4 horas más. El contenido de azúcar reductor se midió al final de la incubación.

Análisis de datos. Los datos fueron analizados por ANOVA mediante el uso del software estadístico SAS (v6.12, 1996). Las pruebas de comparación múltiple usaron la prueba de rango múltiple de Duncan. Se declaró significancia cuando p <0,05 y alta significancia cuando p <0,01.

Resultados

Estabilidad ácida

La evaluación de la estabilidad ácida de la a-amilasa Refined ™ o la a-amilasa BAN 800 ™ se resume en la Tabla 3. Ambas enzimas se trataron con pH bajo durante 15 o 30 minutos y luego con pH neutro para medir la actividad restante. Ni la a-amilasa Refined ™ ni la a-amilasa BAN 800 ™ fueron resistentes a los ácidos. Poco o nada de a-amilasa sobrevivió cuando se trató a pH 3 durante 15 minutos, lo que muestra que la a-amilasa en estas dos fuentes fue inactivada irreversiblemente por el bajo pH.

Tabla 3. Las actividades iniciales y restantes de la a-amilasa Refined ™ y BAN 800 ™ por tratamiento con ácido Enzimas Actividad inicial Actividad restante

(U/g) pH 3, 15 minutos y luego pH 3, 30 minutos y luego

pH 7 pH 7

a-amilasa 100,000 4,000 4 2,000 2

Refined™

BAN 800 ™ 70,000 3,500 5 1,500 2

Para evaluar la estabilidad ácida de la a-amilasa protegida, se debe tener en cuenta dos factores. El primer factor es la protección de la amilasa en el ambiente ácido y el segundo factor es la liberación de amilasa en pH neutro. No se debe separar estos dos factores, porque la enzima filtrada en el pH ácido se inactivó inmediatamente. Por lo tanto, en primer lugar, se evalúa la cinética de liberación en pH ácido y neutro. Por el contrario, con respecto a la amilasa no protegida, la a-amilasa protegida fue muy estable después del tratamiento con pH bajo, solo se liberó aproximadamente un 15 % de amilasa en 3 horas (Figura 2), lo que sugiere que ocurrió muy poca fuga a pH ácido y muy poca liberación efectiva a pH neutro.

Cuando se trató con tampón fosfato de pH 7,0 durante 3 horas, alrededor del 55 % de la a-amilasa se liberó suavemente en el tampón a una velocidad del 10 % de actividad inicial por media hora (R2 = 0,98) (Figura 2). Esto sugiere que la aamilasa protegida tiene tanto el pH controlado como el tiempo, los cuales son importantes para pasar el pH ácido y liberarse gradualmente en pH neutro. La razón por la que solo se liberó el 55 % de la enzima recubierta es que los materiales de recubrimiento contienen aceite vegetal hidrogenado, que necesita lipasa para degradarse. Dado que en este ensayo no se incluyó pancreatina, la eficiencia de liberación fue única. Por tanto, se realizó otra prueba mediante el uso de la misma condición, pero con presencia de lipasa y pancreatina. Más del 60 % de la enzima se liberó en 1 hora y aproximadamente el 85 % se liberó en 3 horas (Figura 2), lo que sugiere que la a-amilasa protegida no solo se controla en el tiempo y en el pH, sino también depende de la lipasa/pancreatina las cuales son importantes para la protección y liberación efectivas de a-amilasa en el intestino delgado en vivo.

Para examinar el comportamiento de la a-amilasa protegida en condiciones más cercanas a las condiciones in vivo, se midió la actividad total liberada después de 1 hora de tratamiento ácido y 2 horas de tratamiento con lipasa y pancreatina a pH neutro. En consistencia con el resultado de la curva de liberación, la a-amilasa estuvo bien protegida dentro de los microgránulos y no se perdió mucho de a-amilasa en pH 3 cuando se trató durante 1 hora (Tabla 4), dado que una hora es suficiente para que las partículas pequeñas pasen a través del estómago y realicen un flujo hacia el intestino. Además, la mayor parte de la amilasa derivada se liberó después de 2 horas de incubación a pH neutro con lipasa y pancreatina, muy resistente en un ambiente ácido. Aproximadamente el 98 % de la actividad se retuvo, lo que sugiere que se produjo muy poca fuga a pH ácido y una liberación muy efectiva en el intestino delgado.

Tabla 4. Las actividades iniciales y restantes de la a-amilasa protegida, U/g Enzima Actividad inicial U/g Actividad restante/liberada

U/g %

a-amilasa protegida 24,000 23,500 98

Efectos sobre la liberación de azúcar reductor mediante el método de dos pasos

Los resultados del efecto de complementar la a-amilasa sobre la liberación del azúcar reductor probado con el método de dos pasos se muestra en la Tabla 4. Con ambos tratamientos, la a-amilasa Refined ™ no mostró ningún efecto en los azúcares reductores, en comparación con el control de blanco (p>0,05). Este resultado fue consistente con los datos de estabilidad ácida, donde toda la actividad de la a-amilasa Refined ™ se perdió a pH bajo y, por lo tanto, no se observó ningún efecto sobre la producción de azúcar reductor del sustrato.

Por el contrario, la a-amilasa protegida mostró un aumento en la liberación de azúcar reductor en comparación con el control de blanco (Tabla 5). Este resultado fue consistente con los datos sobre la estabilidad ácida, donde toda la actividad se retuvo tras el tratamiento a pH bajo, por lo que la actividad restante puede trabajar sobre el sustrato a pH neutro y liberar más azúcar reductor. En comparación con el control de blanco y la muestra de a-amilasa Refined ™, la cantidad de azúcares reductores liberados mediante el uso de a-amilasa protegida, tanto en los sustratos de maíz como en los piensos compuestos, aumentó significativamente (p <0,01). Este aumento significativo se observó cuando se suplementó con la a-amilasa protegida de igual peso o igual actividad enzimática. Además, aunque la actividad enzimática de la aamilasa Refined ™ fue 4 veces mayor que la de la a-amilasa protegida, sus azúcares reductores fueron significativamente menores.

Tabla 5. Comparación de los efectos de la a-amilasa protegida y la a-amilasa Refined ™ sobre el azúcar reductor liberado de la harina de maíz y la materia prima compuesta probado por el método de dos pasos, mg/g de sustrato, n = 3

Control de a-amilasa a-amilasa protegida a-amilasa protegida SEM P blanco Refined™ (de igual peso) (de igual actividad)

Maíz 34,6Cc 34,2Cc 45,6Bb 53,8Aa 0,79 0,0001 Pienso 43,6Cc 43,7Cc 47,1Bb 51,9Aa 0,57 0,0001 compuesto

A,B,C Significa que con las diferentes letras dentro de una fila difieren significativamente (p <0,05).

a,b,c Significa que con las diferentes letras dentro de una fila difieren en gran medida de manera significativa (p <0,01).

Además de examinar la enzima individual, también se examinó el efecto de reemplazar la a-amilasa Refined™ en Kemzyme® Dry con la a-amilasa protegida. Se usaron tres formulaciones: I) Kemzyme® Dry II, regular) Kemzyme® Dry en el que la a-amilasa Refined ™ se reemplazó con un peso igual de la a-amilasa protegida, y III) Kemzyme® Dry en el que se reemplazó la a-amilasa Refined ™ con una actividad enzimática igual de la a-amilasa protegida (ver actividades enzimáticas en la Tabla 1). Los resultados se resumen en la Tabla 5. Consistente con los resultados de la Tabla 4, las formulaciones de Kemzyme® II y III que contienen la a-amilasa protegida mostraron una mayor liberación de azúcar reductor en comparación con el control de blanco y la formulación de Kemzyme® I (Tabla 5). Además, Kemzyme® III liberó significativamente más azúcar reductor que Kemzyme® II (p <0,01). Sin embargo, Kemzyme® III también contenía aproximadamente cuatro veces más a-amilasa protegida en comparación con Kemzyme® II, por lo que la mayor liberación de azúcar reductor en la formulación de Kemzyme® II probablemente fue un efecto de dosificación basado en la actividad. Por otra parte, cuando se comparó la cantidad de azúcar reductor liberado debido a Kemzyme® I (Tabla 6) y la a-amilasa Refined ™ (Tabla 5), la formulación de Kemzyme® I mostró un nivel más alto de azúcar reductor. Kemzyme® I contiene xilanasa, p-glucanasa y celulasa, y estas polisacaridasas sin almidón también pueden degradar polisacáridos sin almidón en azúcares reductores. Por lo tanto, el aumento de azúcar reductor que se observó en los tratamientos con Kemzyme® I podría atribuirse a las polisacaridasas sin almidón y al sinergismo entre ellas.

Tabla 6. Comparación de los efectos de diferentes fórmulas de Kemzyme® sobre el azúcar reductor liberado de la ______ harina de maíz y el pienso compuesto probado por el método de dos pasos, mg/g de sustrato, n = 3______ Control de blanco Kemzyme® I Kemzyme® II Kemzyme® III SEM P

Maíz 36,2Cc 36,8Cc 47,3Bb 53,5Aa 0,68 0,0001 Pienso compuesto 43,6Cc 44,8Cc 51,4Bb 57,0Aa 0,46 0,0001

ABCSignifica que con las diferentes letras dentro de una fila difieren (p <0,05).

a,b,c Significa que con las diferentes letras dentro de una fila difieren significativamente (p <0,01).

Efectos sobre la liberación de azúcar reductor mediante el método de tres pasos

La alfa-amilasa se conoce como una enzima de acción rápida; por lo tanto, puede digerir una cantidad significativa de almidón en la cavidad bucal y el esófago, haciendo potencialmente innecesaria una a-amilasa resistente a los ácidos. Por lo tanto, se diseñó un método de tres pasos, que incorporó el método de dos pasos, y también incluyó un paso de incubación para simular la cavidad bucal y el esófago con el fin de estudiar los efectos del Refined ™ y la a-amilasa protegida en la digestión de almidón en estos dos sitios adicionales.

Los resultados de la liberación de azúcar reductor a partir del sustrato de maíz probado por el método de tres pasos se presentan en la Figura 3. Por el contrario, con el ensayo de dos pasos en el que la a-amilasa Refined ™ no mostró ningún efecto, en el ensayo de tres pasos, la a-amilasa Refined ™ mostró un efecto significativo en comparación con el control (p <0,01). Estos resultados demuestran que la a-amilasa Refined ™ liberó una cantidad significativa de azúcar reductor en el primer paso, el paso que simulaba la cavidad bucal y el esófago.

El efecto de sustituir la a-amilasa Refined ™ con una cantidad igual de actividad a-amilasa protegida fue consistente con los resultados probados por el método de dos pasos. El azúcar reductor fue significativamente más alto que los otros tres tratamientos (p <0,01), lo que sugiere que la a-amilasa protegida fue más efectiva que la a-amilasa Refined ™ a pesar de que la a-amilasa Refined ™ degrada parte del almidón en la boca cavidad y esófago. La a-amilasa protegida de igual peso mostró una respuesta más débil que la a-amilasa Refined ™ y la a-amilasa protegida de igual actividad enzimática (p <0,01), lo que sugiere que la dosis de a-amilasa protegida debe optimizarse aún más.

Anteriormente, analizamos la a-amilasa Refined ™ y descubrimos que es una amilasa altamente termoestable, por lo que se usa en todas las mezclas de enzimas actuales como fuente de a-amilasa. La estabilidad térmica de la a-amilasa Refined ™ y la a-amilasa protegida se dan en la Tabla 7. La a-amilasa Refined ™ retuvo> 90 % de su actividad después de todos los tratamientos, excepto en los 90 °C durante 10 minutos, en los que la actividad fue del 87,3 %. Cuando se granuló la a-amilasa Refined ™ y se encapsuló en la a-amilasa protegida, se observaron mejoras estadísticamente significativas en la estabilidad a 80 °C durante 5 minutos, 90 °C durante 5 minutos y 90 °C durante 10 minutos (p <0,05). Por otra parte, en las condiciones de prueba más estrictas (90 °C durante 5 y 10 minutos), la significación estadística de la mejora fue aún más pronunciada (p <0,01).

______Tabla 7. Estabilidad térmica de la a-amilasa Refined ™ y la a-amilasa protegida, %______

_{90 °C}

5 min 10 min 5 min 10 min

a-amilasa Refined™ 96,6 93,5 91,8 87,3

a-amilasa protegida 99,8 93,8 95,4 92,8

SEM 0,76 1,85 0,36 0,80

P 0,0418 0,9157 0,0021 0,0083

Discusiones

Se desarrolló un proceso para proteger una a-amilasa sensible a los ácidos del entorno de pH bajo del estómago con el fin de permitir que la enzima alcance su sitio principal de actividad, el intestino delgado, en un estado completamente activo. Uno de los problemas de la aplicación de a-amilasa en animales es la baja disponibilidad de a-amilasa ácida. En los animales monogástricos, el pH en el estómago está generalmente entre 2,5 a 3,0. Desde el estómago hasta el tracto digestivo inferior, los valores del pH aumentan gradualmente a 7,8. Por lo tanto, una enzima digestiva exógena ideal necesita ser resistente al pH bajo en el estómago. Desafortunadamente, casi todas las a-amilasa en el mercado no cumplen con este requisito. Ambas la a-amilasa Refined ™ y el BAN 800 ™ se inactivaron por completo mediante el tratamiento con pH 3 por 15 minutos. Por tanto, ni la a-amilasa Refined ™ ni la a-amilasa BAN 800 ™ alcanzarían el intestino delgado en un estado activo y, por lo tanto, no podrían degradar el almidón en este sitio. La a-amilasa protegida se mantuvo estable a pH 3,0 durante al menos 3 horas, lo que indica que podía pasar de forma segura a través del estómago y llegar al intestino delgado en un estado activo.

El método de dos pasos se usó para simular los entornos del estómago/intestino delgado. En el método de dos pasos, la a-amilasa protegida, ya sea en forma de enzima única o en forma Kemzyme® Dry, liberó significativamente en comparación con la a-amilasa Refined ™ más azúcares reductores de los sustratos probados (p<0,01). Por el contrario, la a-amilasa Refined ™ no mostró ningún efecto en la liberación de azúcares reductores, lo cual fue consistente con la prueba de estabilidad ácida.

Sin embargo, en ensayos con animales, la a-amilasa Refined ™ todavía mostró cierto nivel de eficacia en el rendimiento animal, por lo que se especuló que la a-amilasa es una enzima de acción rápida y comienza a trabajar en la cavidad bucal y el esófago. Para probar esto, se diseñó un método de tres pasos para simular la digestión del almidón en los entornos de la cavidad bucal/esófago/estómago/intestino delgado. El alimento permanece en la cavidad bucal y el esófago solo por un período corto de tiempo y el entorno de la cavidad bucal y el esófago no es muy acuoso, por lo que se planteó la hipótesis de que la digestión de la cantidad de almidón digerido en estos sitios era limitada. Sin embargo, la a-amilasa Refined ™ mostró un aumento en la liberación de azúcares reductores en el modelo de tres pasos en comparación con el modelo de dos pasos, lo que sugiere que la a-amilasa degrada el almidón en la cavidad bucal y el esófago. Sin embargo, al examinar los azúcares reductores totales liberados, la a-amilasa protegida fue aún más efectiva que la a-amilasa Refined ™.

La a-amilasa también mostró una estabilidad térmica mejorada. Los resultados podrían sugerir que el procedimiento de granulación y encapsulación también se puede usar para proteger otras enzimas térmicamente inestables.

Conclusiones

En resumen, se desarrolló un proceso para proteger la a-amilasa sensible al ácido de la inactivación en el entorno ácido del estómago. Tanto la a-amilasa Refined ™ como la a-amilasa BAN 800 ™ se inactivaron irreversiblemente por un pH bajo cuando se expusieron durante 15 minutos, mientras que la a-amilasa protegida se mantuvo estable en pH 3,0 durante al menos 3 horas y se liberó completamente a pH 7,0 en el presencia de lipasa pancreatina. Los azúcares reductores liberados del maíz y los piensos compuestos cuando se trataron con la a-amilasa protegida, ya sea en forma de enzima única o en forma Kemzyme® Dry, fueron significativamente más altos que los tratados con a-amilasa Refined ™ (p <0,01). Además, la a-amilasa protegida también demostró una estabilidad térmica mejorada. En conjunto, la a-amilasa protegida es altamente estable al ácido y al calor, y puede pasar a través del estómago y liberarse en el intestino delgado para mejorar la digestibilidad del almidón.

Ejemplo 3

Se realizó un ensayo metabólico en gallos maduros para estudiar los efectos de la a-amilasa Jinzhi® sin protección, la aamilasa protegida del estómago y sus mezclas (en diferente relación) sobre la energía metabolizable aparente (AME) y la digestibilidad de los nutrientes de un Dieta a base de maíz y soja.

Un total de 36 gallos reproductores terminados Arbor Acres (AA) de peso cercano se asignaron al azar en 6 grupos, con un ave por repetición y 6 repeticiones por tratamiento. El grupo A se trató con salvado de arroz (vehículo) y se usó como control de blanco. Los grupos B a F se trataron con las mezclas de a-amilasa protegida del estómago y a-amilasa no protegida en las proporciones de 0:100, 25:75, 50:50, 75:25 y 100:0 (actividad/actividad), respectivamente. La actividad de la a-amilasa de las preparaciones fue de 300 U/g y la dosis aplicada fue de 500 g/tonelada de alimento terminado. El experimento duró 11 días, incluidos 7 días de período pre experimental y 4 días de período experimental formal. Se determinaron AME y digestibilidad de materia seca (DDM), proteína cruda (DCP) y extracto de éter (DEE). Los datos sugirieron que la suplementación de a-amilasa externa, ya sea en la forma protegida o sin protección, mejoró significativamente estos parámetros en comparación con el control de blanco. Además, la inclusión de la a-amilasa protegida por el estómago fue importante para mejorar la AME, la utilización de energía y la digestibilidad de la materia seca.

Un estudio in vitro previo indicó que la a-amilasa comercial de origen bacteriano de Jinzhi® fue inactivada irreversiblemente por el pH ácido del ambiente del estómago. La protección de la a-amilasa de la inactivación ácida proporcionó un mejor rendimiento que la a-amilasa Jinzhi sin protección en todo el tracto gastrointestinal. Sin embargo, también se encontró que la a-amilasa Jinzhi degradaba parte del almidón en la cavidad bucal y el esófago en un corto período de tiem po! Por lo tanto, la suplementación con una mezcla de a-amilasa protegida y a-amilasa no protegida puede ser más efectivo en el comportamiento animal, en comparación con la suplementación con a-amilasa protegida o a-amilasa no protegida sola.

Con el fin de determinar la relación óptima para la aplicación de la a-amilasa protegida, se condujo un ensayo metabólico para estudiar los efectos de la a-amilasa Jinzhi no protegida, la a-amilasa protegida del estómago y sus mezclas en diferente relación sobre la energía metabolizable aparente (AME) y digestibilidad de los nutrientes de una dieta a base de maíz y soja mediante el uso de un bioensayo clásico en gallos reproductores maduros como se describió anteriormente.

Materiales y métodos

Lugar del ensayo. El ensayo metabólico y el análisis químico fueron conducidos en las Granjas de Cría de Heibei en la ciudad de Fushun, provincia de Liaoning y la Universidad de Liaoning Shihua, República Popular China, respectivamente.

Animales y métodos. En este ensayo, un total de 36 gallos reproductores terminados Arbor Acres (AA) de peso cercano (7 kg de peso corporal) se asignaron al azar en 6 grupos, específicamente, Grupos A, B, C, D, E y F, un ave por repetición y 6 repeticiones por tratamiento. Los grupos A, B, C, D, E y F se trataron con preparaciones de a-amilasa I, II, III, IV, V y VI, respectivamente, a la dosis de 500 g/T de alimento terminado, respectivamente. Las preparaciones enzimáticas se prepararon en el lab de Kemin Agrifoods China y los ingredientes se enumeran en la Tabla 8. El ensayo duró 11 días, incluidos 7 días de período pre-experimental y 4 días de período de experimento formal.

Las preparaciones de alfa-amilasa fueron proporcionadas por Kemin Agrifoods China. La a-amilasa Jingzhi® desprotegida (de Bacillus subtilis) se compró en Jiangmen, China y se obtuvo del almacén de Kemin Agrifoods China. La amilasa protegida se obtuvo de SkyPharm como se describió anteriormente. La pre mezcla usada en este ensayo se compró a Wellhope Agri-Tech Co., Ltd (Tabla 9). En este ensayo se usó una dieta a base de maíz y soja, que se diseñó de acuerdo con las necesidades nutricionales de los gallos reproductores (Requisitos de nutrientes de las aves de corral: novena edición revisada (NRC 1994)). La composición de la dieta experimental y los niveles de nutrientes se enumeran en la Tabla 9.

Tabla 8. Información de las preparaciones experimentales.

Grupo Preparación Estómago protegido: enzima Actividad de a- Dosis, g/tonelada desprotegida (actividad/actividad) amilasa, preparación de alimento

de U/g terminado

--(Salvado de arroz) 300 500

0:100 300 500

25:75 300 500

50:50 300 500

75:25 300 500

100:0 300 500

Tabla 9. Composición de la dieta basada en experimentos.

Ingredientes Dieta basada

Maíz (%) 72,5.

Harina de soja (45 %PC) (%) 22,5

5 % premezcla (%) 5

Nivel de nutrientes

ME de aves de corral (KJ kg) 2833,33

CP (%) 17,45

EE (%) 4,27

Ca (%) 0,66

P disponible (%) 0,41

Lys (%) 0,87

Met (%) 0,41

Met Cys (%) 0,68

L-try (%) 0,19

Thr (%) 0,65

CP: proteína cruda

EE: extracto de éter

Manejo de animales del ensayo. Las aves del ensayo se mantuvieron en jaulas metabólicas individualmente, con libre acceso al agua e iluminación natural durante todo el período experimental. En el período previo al experimento, las aves tuvieron libre acceso a las dietas experimentales. El día 8, todas las aves se mantuvieron en ayunas durante 48 horas para vaciar los residuos de comida en el tracto gastrointestinal. El día 10, las aves fueron alimentadas a la fuerza con 70 g (aproximadamente el 1% del peso corporal) del alimento experimental como se describió anteriormente. Todas las excretas se recolectaron mediante el uso de bandejas de recolección de accesorios durante 48 horas. Inmediatamente después de la recolección, se eliminaron cuidadosamente los contaminantes como plumas, escamas y restos antes de almacenar las excretas en contenedores cerrados a 18 °C para evitar la fermentación microbiana.

Parámetros determinados. El contenido de energía, materia seca, proteína cruda y extracto de éter en la dieta y las excretas se determinó como se describió por AOAC (Métodos oficiales de análisis (15th edición), AOAC, Arlington, VA, EE. UU. (1990)). Todos los análisis se realizaron por duplicado. Todas las excretas y la dieta se secaron durante 24 horas a 80 °C. Se dejó que las excretas secas y la dieta se equilibraran a las condiciones atmosféricas antes de pesarlas. Se tomaron muestras representativas y se molieron para pasar a través de un tamiz de 0,45 mm. Las ecuaciones de la Tabla 10 se usaron para calcular AME, DDM, DCP, DEE.

Tabla 10 - Ecuación para calcular AME, DDM, DCP, DEE (FI = ingesta de alimento; EO =salida de excretas) (Fl X GE d¡eta-EO X GE excretas)

AME (KCal/kg) = ---------------------------------Materia seca Fl

GE = energía bruta

(Fl X energíaaieta- EO x energíaexcreta)xl00

Energía digestibilidad= ------------------------------------------------------(Fl X energíaaieta)

(Fl X materia secaaieta - EO X materia secaexcreta)X100

DDM (%) = -------------------------------------------------------

(Fl X materia seca dieta)

(Fl X proteína crudaa¡eta - EO X proteína crudaexcreta)X 100

DCP (%) = ----------------------------------------------------------------

(Fl X proteína cruda dieta)

(Fl X extracto de éteraieta - EO X extracto de éterexcreta)X 100

D E E (ft)=

(Fl X extracto de éter dieta)

Análisis de datos. Los datos fueron analizados por ANOVA mediante el uso del software estadístico SAS (v6.12, 1996). Las pruebas de comparación múltiple usaron la prueba de rango múltiple de Duncan. Se declaró significancia cuando p <0,05 y alta significancia cuando p <0,01.

Resultados

Los resultados se presentan en la Tabla 11. El AME del Grupo E fue de 2414 Kcal/kg, el más alto entre todos los tratamientos (p <0,01). No hubo diferencias significativas en AME entre los Grupos B, C, D y F (p> 0,05). Sin embargo, la AME de estos cuatro grupos mejoró en comparación con el control de blanco, ya sea numérica o estadísticamente. Los resultados de digestibilidad de la energía mostraron la misma tendencia que los resultados de AME.

Los grupos C y D mostraron un DDM estadísticamente más alto que los otros grupos (P <0,05). No se observaron diferencias significativas en DDM entre los otros cuatro grupos. Los cinco grupos de tratamiento mostraron una DCP mejorada en comparación con el control de blanco (Grupo A) (p <0,05), y no hubo diferencias significativas entre estos 5 grupos. El único DEE significativamente diferente del control fue el Grupo C.

Tabla 11. Efectos de las preparaciones enzimáticas sobre la AME y la digestibilidad de los nutrientes (D) de una dieta a ________________base de maíz y soja en gallos reproductores maduros de Arbor Acres (AA).________________ AME, Kcal/Kg D de energía,% DDM,% DCP,% DEE,% A 2333Cc 69,3Cc 69,5B 49,0Bb 78,9B B 23541BCbc 69,9BCbc 69,4B 51,3Aa 79,9AB C 23551BCbc 69,9BCbc 70,8a 50,8Aab 80,4A D 2375Bb 70,5Bb 70,8A 50,4Aab 79,9AB E 2414Aa 71,7Aa 69,7B 51,7Aa 79,1B F 2363Bbc 70,2Bbc 69,5B 51,7Aa 79,1B

SEM 9,1 0,27 0,34 0,45 0,36

P 0,0001 0,0001 0,0067 0,0017 0,0337

A, B, C El valor dentro de una columna difiere significativamente (p <0,05);

a, b, c El valor dentro de una columna difiere significativamente (p <0,01).

Discusión

En resumen, la suplementación con a-amilasa externa aumentó la utilización de energía dietética en comparación con un control de blanco estadísticamente o numéricamente. En comparación con la a-amilasa no protegida, la inclusión de la a-amilasa protegida mostró un beneficio aparente. La aplicación de una mezcla de a-amilasa protegida del estómago y de a-amilasa Jinzhi® sin protección en una relación de 75:25 dio el mejor valor de AME y utilización de la energía (p <0,01). La aplicación de una mezcla de a-amilasa protegida del estómago y a-amilasa de Jinzhi sin protección en las relaciones de 25:75 y 50:50 mejoró significativamente la digestibilidad de la materia seca (p <0,05). Debido a que AME es generalmente más relevante para el rendimiento del crecimiento, la relación con el valor de AME más alto (75:25) sugiere que el sitio de acción principal de la a-amilasa es el intestino delgado en lugar de la cavidad bucal y el esófago. Se diseñará un ensayo de rendimiento del crecimiento con estas proporciones para confirmar el efecto de la protección enzimática.

Ejemplo 4

Se condujo un ensayo de alimentación en pollos de engorde para estudiar los efectos de la a-amilasa protegida en el estómago sobre el rendimiento del crecimiento y la digestibilidad de los nutrientes de una dieta a base de maíz y soya.

Materiales y métodos

Materiales experimentales y métodos de análisis. La a-amilasa desprotegida y la a-amilasa de liberación lenta no protegida usadas en este experimento fueron proporcionadas por Kemin Industries (Zhu Hai), Inc. La actividad a-amilasa de ambos productos es de 300 U/g. Los productos de alfa-amilasa se mezclaron en el pienso compuesto mediante el método de dilución por etapas.

Animales de experimentación y manejo de la alimentación. En este experimento se usó 540 pollos de engorde AA sanos de 1 día con un peso corporal promedio de 42,1 g y se alojaron en la base de prueba de aves de corral del Centro Nacional de Investigación de Tecnología de Ingeniería de Alimentos. Las aves experimentales se criaron con redes enjaulas de 3 capas (90 cm x 60 cm x 40 cm) equipadas con bebedero gotero. Las aves tenían libertad para acceder al alimento y al agua. La temperatura ambiente durante los primeros 3 días de cría se mantuvo a 33 °C y luego se redujo en 3 °C hasta alcanzar los 24 °C. La iluminación (15-20 lux) y la ventilación se mantuvieron durante las 24 horas del día 1 al día 42. Todas las aves fueron vacunadas contra la nueva enfermedad de Castle los días 7 y 28; y vacunadas contra la bolsa de Fabricio los días 14 y 21. Todo el período de alimentación incluyó dos fases: fase de inicio desde el día 1 al 21 y fase de crecimiento desde el día 22 hasta el día 42. Todo el experimento se condujo de acuerdo con el estándar de bienestar animal emitido por la Universidad Agrícola de China.

Diseño experimental y dietas experimentales. Todos los pollos experimentales fueron asignados al azaren 3 tratamientos, 6 repeticiones por tratamiento y 30 pollos por repetición. Se alojaron 10 aves en una jaula y cada 3 jaulas se consideró como 1 réplica. Las dietas experimentales se diseñaron de la siguiente manera: (1) Grupo de control, dieta basal 500 g de salvado de arroz/t de dieta; (2) Grupo desprotegido (Grupo 2), dietas basales 500 g Dieta de a-amilasa/t sin protección (300 U/g de actividad de a-amilasa); (3) Grupo de mezcla (grupo 3), dietas basales 500 g de a-amilasa no protegida a-amilasa de liberación lenta/t dieta (300 U/g de actividad de a-amilasa). Las dietas basales de harina de maíz y soya se formularon de acuerdo con la recomendación de la NRC (1994) (verTabla 12) y las dietas experimentales fueron piensos en puré.

Tabla 12 Composición de las dietas basales y nivel de nutrientes

Elementos Fase de arranque (0~21 Fase de cultivo

días) (22~42dias)

Ingredientes (%)

Maíz 53,70 59,11

Harina de soja, 44 % de proteína 33,80 28,42

cruda

Harina de pescado, 64 % de 4,00 4,00

proteína cruda

Aceite de soja 4,22 4,68

Caliza 1,28 1,18

Fosfato dicálcico 1,29 1,07

Sal 0,35 0,35

Pre mezcla1 1,00 1,00

L-lisinaHCl, 78 % 0,08 0,04

DL-metionina, 98 % 0,28 0,15

Total 100,00 100,00

Niveles de nutrientes

Energía metabólica (Kcal/g) 3,00 3,10

Proteína cruda (%) 22,00 20,00

Calcio (%) 1,00 0,90

Fósforo disponible (%) 0,45 0,40

Lisina (%) 1,31 1,15

Metionina (%) 0,65 0,50

1Proporcionado por kilogramo de pienso: Zn, 60 mg; Fe, 95 mg; Mn, 80 mg; Cu, 10 mg; I, 0,35 mg; Se, 0,3 mg; VA, 10000 UI; VD3, 2750IU; VE, 30 UI; VK3, 2 mg; VB12, 12 pg; Riboflavina, 6 mg; Ácido nicotínico, 40 mg; Ácido pantoténico, 12 mg; Piridoxina, 3 mg; Biotina, 0,2 mg; Cloruro de colina, 800 mg.__________________________________________________________ Análisis de los índices y métodos. El peso corporal y el resto del alimento se midieron el día 21 y el día 42 para calcular la ganancia diaria promedio (ADG), la ingesta diaria promedio de alimento (ADFI) y la relación de conversión alimenticia (FCR). La mortalidad (%) se calculó al final del experimento.

En este experimento se aplicó la recolección total de heces y orina. Durante el día 23 al 28, todas las heces y orina se recolectaron en 5 días consecutivos y se midieron sin plumas y alimento. Después de mezclarse uniformemente, se tomaron muestras de heces fecales frescas y orina y se secaron a 65 °C hasta que la temperatura fue constante. Luego, de la absorción de agua en reposo a temperatura ambiente durante 24 horas, se midieron muestras de heces fecales y orina. Mientras que la alimentación se midió todos los días, se recogieron 100 g de muestra de dietas experimentales. Se mezclaron y separaron muestras de dieta durante 5 días consecutivos. Ambas muestras de dietas y heces fecales y orina se trituraron a través de una pantalla de 40 mallas para su posterior análisis. La materia seca (MS), la proteína cruda (PC), la energía y la grasa cruda (EE) se analizaron mediante el uso del método de secado a 100-105 °C, determinación de nitrógeno semi-micro Kjeldahl, Auto-calorímetro WZR-IA y método de extracción de grasa Tecator Soxhlet respectivamente.

Resultados y discusión

Se ha informado que el suplemento de una preparación enzimática compleja con amilasa involucrada en las dietas de aves de corral podría mejorar el aumento de peso diario y la relación de conversión alimenticia (Zenella y otros, 1999), lo cual es consistente con los efectos de la amilasa sobre el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde observados en este experimento (Figura 4).

Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo de control, el peso corporal de los pollos de engorde de 21 y 42 días en los grupos con a-amilasa sin protección o a-amilasa de liberación lenta no protegida suplementada fue significativamente mayor (P <0,01). Al día 21, la mezcla presentó un desempeño superior en comparación con la a-amilasa sin protección (p <0,05), pero la diferencia entre dos grupos no fue significativa (P> 0,05) (Figura 1). Los efectos de las dietas experimentales sobre la ingesta diaria promedio de alimento (ADFI), la ganancia de peso diaria promedio (ADGA) y el índice de conversión alimenticia (FCR) se muestran en las Figuras. 5, 6 y 7, respectivamente. Las ADFI de diferentes fases de crecimiento en los tres grupos no se vieron afectadas (P> 0,05); La ADG de diferente fase de crecimiento y todo el período en dos grupos experimentales fue extremadamente mayor que la del grupo de control (P <0,05) pero la diferencia entre dos grupos experimentales no fue significativa (P> 0,05); La FCR de la fase inicial en todos los grupos no fue diferente (P> 0,05) pero la FCR de la fase de crecimiento en los grupos con a-amilasa suplementada fue significativamente mayor que la del grupo de control (P <0,05), y FCR en Sin protección liberación lenta El grupo de aamilasa fue significativamente mayor que el del grupo de a-amilasa sin protección; La FCR de todo el período en dos grupos experimentales fue extremadamente mayor que la del grupo de control (P <0,01), pero la diferencia entre dos grupos experimentales no fue significativa (P> 0,05).

Numerosas investigaciones sugieren que la adición de amilasa exógena puede complementar la deficiencia de secreción de enzimas endógenas de animales jóvenes, asociarse con la digestión de nutrientes y así mejorar el rendimiento del crecimiento. Packy Bedford (1997) han informado, al revisar muchos experimentos de pollos de engorde, que al agregar una preparación enzimática compleja con amilasa involucrada en dietas de harina de maíz y soya, la relación de muerte promedio de los pollos de engorde se redujo del 7,9 % al 6,4 %. Jin (2002) resumió que 9 experimentos de manera similar se condujeron en países asiáticos y sugirió que el suplemento de una preparación enzimática compleja con amilasa involucrada podría aumentar la tasa de crecimiento promedio de los pollos de engorde en un 3,5 % y aumentar la FCR en un 2,5-13,9 %. Este resultado es consistente con el hallazgo de Ritz y otros, (1995), pero el suplemento de amilasa exógena no tuvo ningún efecto sobre la FCR, lo cual es consistente con el informe de Gracia y otros, (2003). Existe una gran variación de los efectos de la amilasa exógena única sobre el rendimiento del crecimiento en la fase inicial de los pollos de engorde. Gracia y otros, (2003) informaron que al agregar a-amilasa en dietas basales de maíz, la ADG de pollos de engorde de 7 días se aumentó en un 9,4 % (P <0,05) y la FCR se aumentó en 4,2 % (P <0,05). Sin embargo, Mahagna y otros, (1995) no encontraron ningún efecto del suplemento de amilasa a 250 pg/kg o del suplemento de preparación enzimática del complejo de proteasa a 1000 pg/kg en ADFI y el rendimiento de crecimiento de pollos de engorde a la edad de 1-14 días. Gracia y otros, (2003) sugirió que la diversidad de resultados de diferentes experimentos podría deberse a la diferente fuente de amilasa (Bacillus amyloliquefaciens vs. Bacillus subtilis), diferentes tipos de cereales (maíz frente a sorgo), diferente actividad de adición de amilasa y diferentes formas de alimentación (partículas frente a puré), etc. Por lo tanto, un nivel de adición diferente puede ser la causa principal que da como resultado la diferencia de efectos del suplemento de amilasa exógena en el rendimiento del crecimiento de los pollos de engorde jóvenes, y esta especulación fue aprobada por la relación lineal entre el aumento de peso y el nivel de adición.

La disponibilidad metabólica de energía y materia seca en dos grupos experimentales no fue significativamente diferente, pero fue extremadamente superior a la del grupo de control (P <0,01); la disponibilidad metabólica de la grasa cruda en dos grupos experimentales fue extremadamente mayor que en el grupo de control (P <0,01) y el del grupo de a-amilasa de liberación lenta sin protección fue significativamente mayor que el del grupo de a-amilasa sin protección (P <0,05) (Figura 8). Zanella y otros, (1999) informaron que al agregar enzimas complejas (amilasa, proteasa y xilanasa) en dietas de harina de maíz y soya, la digestibilidad del almidón en el íleon y la digestibilidad del almidón en las heces fecales de pollos de engorde de 37 días aumentaron 91,2 % a 93,0 % y 98,2 % a 98,5 % respectivamente. Gracia y otros, (2003) informaron que la a-amilasa podría mejorar enormemente la disponibilidad aparente de materia orgánica, almidón y energía bruta de pollos de engorde de 28 días. Ritz y otros, (1995) también encontraron que el suplemento de enzimas complejas con amilasa involucradas en dietas de harina de maíz y soya podría mejorar la digestibilidad de la energía ileal. Es como que el sistema digestivo de los pollos de engorde en fase de crecimiento está bien desarrollado y por lo tanto el suplemento de amilasa puede mejorar la digestibilidad del almidón y la energía mejorando así el rendimiento del crecimiento. Zenella y otros, (1999) estudiaron el nivel de adición óptimo de la preparación enzimática en dietas de pollos de engorde AA mediante el uso de un diseño combinatorio rotacional de regresión cuadrática y encontraron que los efectos de una sola enzima sobre el aumento de peso siguieron: amilasa> lipasa> proteasa neutra.

Conclusiones

El suplemento de a-amilasa protegida puede mejorar considerablemente el rendimiento de crecimiento de los pollos de engorde y aumentar la disponibilidad metabólica de energía, materia seca y grasa cruda. Además, en comparación con la a-amilasa no protegida, la mezcla de a-amilasa no protegida y de liberación lenta tiene efectos más positivos sobre la ADG, FCR y la disponibilidad de grasa cruda en pollos de engorde.

Ejemplo 5

Se condujo un ensayo de alimentación en lechones para estudiar los efectos de la a-amilasa protegida del estómago sobre el rendimiento del crecimiento de los lechones.

Materiales y métodos

Diseño y animales experimentales. En este experimento se usó un total de 200 lechones sanos de 7 días que tenían antecedentes genéticos similares de 20 camadas (10 ± 1 lechones por litro) y se asignaron a 4 tratamientos (A, B, C y D) con 5 repeticiones por tratamiento y 1 camada por repetición. El tratamiento A fue el grupo de control y las dietas experimentales fueron dietas basales; las dietas experimentales en el tratamiento B fueron dietas basales suplementadas con Porzyme® TP 100, que se compró a Danisco; Las dietas experimentales en el tratamiento C fueron dietas basales suplementadas con Kemzyme PS. La a-amilasa en Kemzyme PS es se proporciona por a-amilasa de liberación lenta y regular. Las dietas experimentales en el tratamiento D fueron dietas basales suplementadas con Kemzyme Dry. La aamilasa en Kemzyme Dry es regular. Las dietas basales incluyeron alimentación antes del destete (alimentación lenta) y alimentación posterior al destete (alimentación inicial). Los lechones experimentales fueron destetados a los 21 días de edad y fueron alimentados con pienso de arrastre desde los 7 días hasta los 28 días y con pienso post-destete desde los 28 días hasta los 42 días de edad. El diseño experimental se muestra en la Tabla 13.

Tabla 13 Diseño Experimental:

Tratamiento Aditivo y dosificación Número de Número promedio de lechones en

réplicas cada réplica

A Control de blanco 5 10

B TP 100, 1000 g/T 5 10

C Kemzyme PS, 500 5 10

g/T

D Kemzyme Dry, 1000 5 10

g/T

Composición y nivel de nutrientes de las dietas basales. La composición y el nivel de nutrientes de las dietas basales en los períodos pre y post destete se muestran en las Tablas 14 y 15.

Tabla 14 Composición y nivel de nutrientes (%) del pienso antes del destete

Elemento Componente, kg

Composición

Maíz 290,8

Maíz extruido 140

Harina de soja descascarada 109

Soja extruida 150

Harina de pescado (62,5 %) 40

Plasma porcino secado por aspersión 30

Solubles secos porcinos 40

Suero en polvo 50

Glucosa 50

Sacarosa 47

Aceite de soja 10

Sal 2

Hidrógeno fosfato de calcio 8

Caliza 9,5

Ácido cítrico 5

Óxido de zinc 3,5

Elemento Componente, kg

Sulfato de cobre 0,5

Daxiang Le 0,4

Datian Le 0,1

HCl-Lys 1,5

Met-DL 1,4

Thr 1,2

1 % de premezcla 10

Nivel de nutrientes

CP, % 21

DE, kcal/kg 3400

Lys, % 1,4

Met cys, % 0,7

Ca, % 0,8

TP, % 0,65

ola 15 Composición y nivel de nutrientes (%) del pienso post-dest

Elemento Componente, kg

Composición

Maíz 649,5

Harina de soja descascarada 130

Concentrado de proteína de soja 60

Comida de pescado 50

Aceite de soja 10

Lactosa 60

Sal 2

Caliza 9

Hidrógeno fosfato de calcio 9

Óxido de zinc 2,5

1 % de premezcla 10

Lys 3,9

Met 1,4

Thr 2,2

Trp 0,5

Total 1000

Nivel de nutrientes

CP, % 18,7

Lys, % 1,29

Met cys,% 0,70

DE, kcal/kg 3400

Ca, % 0,76

TP, % 0,6

Alimentación y manejo. Este experimento se condujo en la granja porcina de Jin Xian Central de Jiangxi Changqing Animal Husbandry Co., Ltd. Los lechones experimentales se criaron siguiendo el manejo de rutina en la granja, donde se midió el peso inicial de todos los lechones cuando tenían 7 días de edad. Todos los lechones experimentales fueron alimentados con pienso lento mediante el uso de una bandeja de alimentación especial y tuvieron acceso libre al pienso, la bebida y la lactancia. El exceso de alimento de cada día se secó al aire y se pesó y se calculó y registró el consumo de alimento todos los días. Todos los lechones experimentales fueron destetados cuando tenían 21 días y luego se desplazaron al corral de cría. Durante los primeros 7 días después del destete, los lechones todavía fueron alimentados con pienso lento y después del destete a partir de los 28 días de edad. La duración del experimento fue de 35 días.

Análisis de los índices. El pienso y el peso de los lechones se pesaron cuando los lechones tenían 7 días, 21 días, 28 días, 35 días y 42 días. El peso promedio de la camada, el aumento de peso diario (ADG), la ingesta diaria de alimento (ADFI), la conversión alimenticia (F/G) y la tasa de diarrea se calcularon mediante el uso de la repetición como una unidad. Se registró el número de muertes y sacrificios de cada tratamiento y se calculó la tasa de muertes y sacrificios al final del experimento.

Análisis de datos y estadísticas. Todos los datos se analizaron mediante análisis de varianza y comparaciones múltiples mediante el uso de SPSS 11.0. Se usó la réplica como unidad y la diferencia se consideró significativa cuando P <0,05. Los resultados de todos los índices de cada tratamiento se mostraron como "valor promedio medio ± DE".

Resultados

Los efectos del aditivo alimentario protegido sobre el rendimiento de crecimiento de lechones de 7 a 21 días se muestran en la Tabla 16. La ADG y la ADFI de 4 tratamientos no fueron significativamente diferentes (P> 0,05), pero la tasa de diarrea en el Tratamiento C y D fue significativamente menor que en el grupo de control (P <0,05) donde la tasa de diarrea de los lechones en el tratamiento C fue la más baja.

Los efectos de los aditivos protegidos sobre el rendimiento de crecimiento de lechones de 21 a 28 días de edad (dentro de los 7 días posteriores al destete) se muestran en la Tabla 17. La ADG en el tratamiento B y D fue mayor que en el tratamiento A (grupo de control) pero la diferencia no fue significativa (P> 0,05). La ADG en el tratamiento C fue mayor que en el tratamiento A (grupo de control) y B (P <0,05). La diferencia de ADFI y F/G de los 4 tratamientos no fue significativa (P> 0,05). La tasa de diarrea en el tratamiento A y C no fue significativamente diferente, pero la del tratamiento B y D fue significativamente menor que el del tratamiento A (grupo de control) (P <0,05). Tomando en consideración todo el período en el que los lechones fueron alimentados con pienso lento, no hubo un efecto significativo de los aditivos protegidos sobre el rendimiento del crecimiento.

Los efectos de los aditivos protegidos sobre el rendimiento de crecimiento de los lechones destetados se muestran en la Tabla 18-22. Se demostró en la Tabla 19 que durante los 28 a 35 días de edad, la ADG en el tratamiento C fue significativamente más alta que la del tratamiento A, B y D (P <0,05), pero la diferencia entre el Tratamiento A, B y D no fueron significativos (P> 0,05). Las diferencias de ADFI y F/G entre los 4 tratamientos no fueron significativas, pero los valores de ADFI y F/G en el tratamiento C que se muestran en la tabla fueron más altos que en otros 3 tratamientos. Las tasas de diarrea de los lechones en los tratamientos B, C y D se redujeron significativamente (P <0,05).

La Tabla 20 indica que durante los 35 a 42 días de edad, la ADG se incrementó significativamente al agregar Kemin C (P <0,05) e incluso más alta que la del tratamiento B. Hubo un aumento de la ADG en el tratamiento D, pero la diferencia fue no significativa en comparación con el grupo de control. Las diferencias de ADFI entre los 4 tratamientos no fueron significativas y F/G en el Tratamiento C fue el mejor, pero las diferencias entre los 4 tratamientos no fueron significativas. La tasa de diarrea se redujo significativamente al agregar los productos enzimáticos B, C y D (P <0,05).

La Tabla 21 muestra que los resultados del rendimiento de crecimiento de los lechones durante los 28 a 42 días de edad fueron similares a los resultados durante los 35 a 42 días de edad. La ADG en el tratamiento C aumentó significativamente (P <0,05), pero la diferencia de ADG de los otros 3 tratamientos no fue significativa y la diferencia de ADFI y F/G entre los 4 tratamientos no fue significativa.

Tomando en cuenta todo el período del experimento, no hubo un efecto significativo de los productos enzimáticos B, C y D sobre el rendimiento de crecimiento de los lechones. Sin embargo, los productos enzimáticos B, C y D tienen efectos positivos para mejorar el rendimiento de crecimiento de los lechones después del destete y reducir la tasa de diarrea de los lechones. Se indicó que el aditivo alimentario protegido C logró el mejor efecto.

Tabla 16 Efectos de los aditivos sobre el rendimiento de crecimiento de lechones antes del destete (de 7 a 21 días de _______________________________________________ edad)_______________________________________________ Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 25,05±1,11 25,34±1,08 25,02±1,23 25,17±1,34 0,,621

Peso final de la camada, kg 56,32±1,20 56,86±1,64 57,13±1,49 55,11±0,81 0 074

ADG, g 221,5±4,5 223,2±5,3 227,9±5,3 224,3±4,2 0 193 ADFI, g 11,4±2,3 11,6±2,0 12,1±2,1 12,2±2,5 0 065 Tasa de diarrea, % 8,7±0,7b 8,2±0,8ab 6,5±0,5a 7,7±0,6ab 0038 Tasa de muerte y sacrificio, % 6,0±0,5b 4,0±0,4a 6,0±0,6b 6,0±0,6b 0047

Nota: F/G no se incluyó en esta tabla porque el consumo de alimento es extremadamente bajo durante el período de vivero.

a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Tabla 17 Efectos de los aditivos sobre el rendimiento de crecimiento de lechones post-destete (21 a 28 días de edad) Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 56,32±1,20 56,86±1,64 57,13±1,49 55,11±0,81 0,074

Peso final de la camada, kg 66,34±1,12ab 65,01±0,78b 67,49±0,62a 64,58±1,03bc 0,035

Peso corporal final, kg 6,91±0,54 6,98±0,75 7,18±0,63 7,02±0,67 0,147 Elemento Tratamiento Valor de P A B C D ADG, g

0,043 ADFI, g 248,1±6,0 249,8±6,3 259,9±5,2 250,6±4,0 0,215

F/G 1,67±0,20 1,65±0,18 1,61±0,19 1,64±0,21 0,760

Tasa de diarrea, % 14,7±1,6b 12,5±1,3ab 12,2±1,1ab 11,5±1,2a 0,038 Tasa de muerte y sacrificio, % 0 2,08 2,13 0

a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Tabla 18: Efectos de A, B, C y D sobre el rendimiento de crecimiento de los lechones (de 7 a 28 días de edad) Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 25,05±1,11 25,34±1,08 25,02±1,23 25,17±1,34 0,621

Peso final de la camada, kg 66,34±1,12ab 65,01±0,78b 67,49±0,62a 64,58±1,03bc 0,035

ADG, g 187,2±4,1 189,2±5,3 190,3±8,0 190,0±6,0 0,109 ADFI, g 179,3±9,0 182,4±10,0 185,7±8,2 184,6±9,7 0,275 Tasa de diarrea, % 11,3±1,2 10,2±0,9 9,6±1,0 9,5±1,1 0,068 Tasa de muerte y sacrificio, % 6,0a 6,0a 8,0b 6,0a 0,048

a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Tabla 19: Efectos de los aditivos sobre el rendimiento de crecimiento de lechones post-destete (28 a 35 días de edad) Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 66,34±1,12ab 65,01±0,78b 67,49±0,62a 64,58±1,03bc 0,035

Peso final de la camada, kg 80,77±1,02 81,55±1,11 82,93±0,56 81,47±1,06 0,089

Peso corporal final, kg 8,06±0,87 8,11±0,90 8,21±0,93 8,14±0,99 0,481 ADG, g 208,1±3,0b 210,2±4,1b 218,4±4,0a 214,8±6,0ab 0,042 ADFI, g 349,1±7,0 343,3±5,6 350,1±6,3 349,6±6,0 0,532

F/G 1,63±0,15 1,63±0,17 1,61±0,16 1,62±0,17 0,658

Tasa de diarrea, % 7,2±0,8a 4,7±0,5b 4,2±0,5b 5,6±0,6ab 0,042 Tasa de muerte y sacrificio, % 0 0 0 0

a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Tabla 20: Efectos de los aditivos en el rendimiento del crecimiento de lechones post-destete (de 35 a 42 días) Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 80,77±1,02 81,55±1,11 82,93±0,56 81,47±1,06 0,089

Peso final de la camada, kg 94,87±6,01 98,25±5,98 101,93±5,32 92,44±6,21 0,103

Peso corporal final, kg 9,81±0,11 10,04±0,11 10,38±0,12 10,22±0,12 0,321 ADG, g 235,1±6,1 236,2±4,9 238,1±5,8 237,8±5,3 0,136 ADFI, g 401,1±4,02 400,4±4,7 402,1±4,2 401,7±4,0 0,518

F/G 1,71±0,19 1,70±0,17 1,69±0,18 1,70±0,18 0,459

Tasa de diarrea, % 5,0±0,5a 3,8±0,6b 2,7±0,7b 2,9±0,5b 0,033 Tasa de muerte y sacrificio, % 0 0 0 0

a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Tabla 21: Efectos de los aditivos en el rendimiento de crecimiento de lechones post-destete (28 a 42 días de edad) Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 66,34±1,12ab 65,01±0,78b 67,49±0,62a 64,58±1,03bc 0,035 Peso final de la camada, kg 94,87±6,01 98,25±5,98 101,93±5,32 92,44±6,21 0,103 Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso corporal final, kg 9,81±0,11 10,04±0,11 10,38±0,12 10,22±0,12 0,321 ADG, g 221,6±4,0b 223,2±3,3b 228,2±2,5a 226,3±3,9ab 0,047 ADFI, g 350,1±6,2 350,4±6,9 353,8±4,0 355,3±5,7 0,343

F/G 1,58±0,17 1,57±0,18 1,55±0,17 1,57±0,17 0,542

Tasa de diarrea, % 4,2±0,4a 2,4±0,6b 1,7±0,5b 1,7±0,7b 0,040 Tasa de muerte y sacrificio % 0 0 0 0

a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Tabla 22: Efectos de los aditivos sobre el rendimiento de crecimiento de los lechones (de 7 a 42 días de edad) Elemento Tratamiento Valor de P A B C D

Peso inicial de la camada, kg 25,05±1,11 25,34±1,08 25,02±1,23 25,17±1,34 0,621 Peso final de la camada, kg 94,87±6,01 98,25±5,98 101,93±5,32 92,44±6,21 0,103 ADG, g 204,4±4,1 206,2±5,0 209,3±3,7 208,1±3,5 0,234 ADFI, g 264,7±4,4 266,4±6,5 269,7±6,9 269,9±9,0 0,224 Tasa de diarrea, % 7,0±0,8a 6,2±0,7a 5,3±0,6b 5,5±0,6ab 0,035 Tasa de muerte y sacrificio, % 6,0a 6,0a 8,0b 6,0a 0,048 a,b Las medias con letras diferentes dentro de una fila difieren, p <0,05

Conclusiones

En resumen, las tres enzimas mostraron numéricamente un efecto positivo en la mejora del rendimiento de crecimiento de los lechones después del destete y en la reducción de la tasa de diarrea de los lechones. Entre estas tres enzimas, Kemzyme PS logró el mejor efecto.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un ingrediente para pienso animal con a-amilasa protegida resistente a la liberación de a-amilasa en el ambiente del estómago de un animal monogástrico y susceptible a la liberación de a-amilasa en el ambiente entérico, que comprende:

(a) un núcleo que comprende a-amilasa;

(b) un primer recubrimiento que comprende del 50 % al 85 % de un polímero entérico sensible al pH y del 15 % al 50 % de excipientes; y

(c) un segundo recubrimiento que comprende del 50 % al 85 % de un polímero de liberación lenta y del 15 % al 50 % de excipientes.

2. Un ingrediente para pienso como se define en la reivindicación 1, en donde el núcleo de a-amilasa comprende entre 50 % y 95 % de a-amilasa y entre 5 % y 50 % de uno o más excipientes.

3. Un ingrediente para pienso como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dichos excipientes se seleccionan de la lista que consiste en celulosa microcristalina, talco en polvo, estearato de calcio, carboximetilcelulosa de sodio, hidroxipropilmetilcelulosa, PEG 6000, glicerol y agua.

4. Un ingrediente para pienso como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el polímero sensible al pH comprende 50 % - 85 % de polimetacrilato entérico y 50 % -15 % de uno o más excipientes.

5. Un ingrediente para pienso como se define en la reivindicación 4, en donde dichos excipientes se seleccionan de la lista que consiste en talco en polvo, estearato de calcio, PEG 6000, citrato de trietilo y agua.

6. Un ingrediente para pienso como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polímero de liberación lenta comprende 50 % - 85 % de polimetacrilato que se desintegra en el estómago y 50 % -15 % de uno o más excipientes.

7. Un ingrediente para pienso como se define en la reivindicación 6, en donde dichos excipientes se seleccionan de la lista que consiste en talco en polvo, estearato de calcio, PEG 6000, carboximetilcelulosa de sodio, hipromelosa, citrato de trietilo y agua.

8. Una composición de ingrediente para pienso animal que comprende una mezcla de un ingrediente para pienso animal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y una a-amilasa no protegida.

9. Un ingrediente para pienso animal como se define en la reivindicación 8, en donde dicha a-amilasa no protegida comprende entre el 0,1 % y el 20 % de dicha composición.

10. Un método para mejorar la digestión del almidón dietético por animales monogástricos, que comprende alimentar al animal con un pienso que contiene almidón y el ingrediente para pienso animal de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.